JP3377556B2 - 新規タンパク質、その対応モノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を用いたその検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な癌関連物質と、
該物質に対するモノクローナル抗体及び該抗体を産生す
るハイブリドーマに関する。さらに、該物質の検出及び
定量に関する。さらに詳しくは、癌患者中に新たに見い
だされた、ガラクトース転移酵素に結合性を有するmodi
fied−α₁ −アンチトリプシン様物質、および該物質に
対するモノクローナル抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般に、細胞が癌化することにより通常
存在しないタンパク質を生成することが知られており、
それらの物質は癌マーカーとして癌の in vitro 診断に
用いられている。

【０００３】ガラクトース転移酵素のアイソザイムであ
る癌関連ヒト由来ガラクトース転移酵素も癌マーカーの
一つとして知られており（特開平２−１８６９８４
号）、そのモノクローナル抗体を用いた癌の診断につい
て報告されている（特開平３−２５９０９３号）。ガラ
クトース転移酵素（以下、ＧＴと言うことがある）は、
種々の糖タンパク質のオリゴ糖や単糖類の非還元末端へ
ウリジンホスホガラクトース（ＵＤＰ−ガラクトース）
からガラクトース残基を転移する触媒能を有する酵素で
あり、殆ど全ての組織に存在している。このＧＴ活性が
癌化により上昇することをきっかけとしてＧＴアイソザ
イムであるＧＴ−IIが発見された。このＧＴ−IIは、Bi
ochem.Biophys.Res.Common.,65(2),545-551,1975に記載
されている通り、Native-PAGE において健常人に主とし
て存在するＧＴ−Ｉに比較し移動度の小さい、ＧＴ活性
を有するバンドを定義したものである。しかしその後、
ＧＴ−IIの本質はそのＧＴ−IIを構成する癌関連ガラク
トース転移酵素であることが明らかにされた（特開平２
−１８６９８４号）。

【０００４】一方、α₁-アンチトリプシン（以下、ＡＴ
Ｔということがある）は血清中に最も多量に存在するプ
ロテアーゼインヒビターの一つであり様々なセリンプロ
テアーゼに対して阻害活性を示すが、主にエラスターゼ
による組織障害を防御する生理機能を有すると考えられ
ている。また、急性相反応性蛋白質としての性格も有し
ており、癌においても増加する傾向があることが知られ
ている（例えば、右田俊介ら：分子進化から見た急性期
タンパク，感染・炎症・免疫，14:339, 1984参照）。さ
らに、ＡＡＴと悪性腫瘍の進展との関係について見た場
合、転移・末期癌などでは一層高値を示すようになるこ
とも確認されている。しかしながら、このような傾向は
ＡＡＴに限られたものではなく、α₁-酸性糖タンパク、
α₁-アンチキモトリプシン、Ｃ反応性タンパク（ＣＲ
Ｐ）などの急性相反応性蛋白質全般に多少とも見られる
ものであり、ＡＡＴを定量することにより癌診断を可能
ならしめるものではない。プロテアーゼインヒビター活
性に関しては、癌患者中のＡＡＴの全活性の値が低いこ
とが知られている（Rajender K.Chawla et al. : Cance
r Res.,44, 2718-2723, 1984参照）。また、癌患者のＡ
ＡＴには、健常人中のＡＡＴと同じ分子量でプロテアー
ゼインヒビター活性を持たないものが存在することが報
告されている（Rajender K.Chawla et al. : Cancer Re
s.,47, 1179-1184, 1987参照）。しかしながら、この失
活したＡＡＴと正常ＡＡＴとの物質的な差異に関しては
何ら明らかにされておらず、従って特異的に検出するこ
とは困難である。

【０００５】さらに、ＡＡＴの部分分解物質については
活性部位を切断されて失活したもの（modified- ＡＴ
（修飾アンチトリプシン）；以下m-ＡＴということがあ
る）が存在することが示されているが、抗原性において
ＡＡＴと差がないとされている（日本臨床４３巻・秋期
臨時増刊号(1985)）。また、失活したｍ−ＡＴについて
の臨床的意義は明らかにされておらず、その定量法は直
接的な測定法がないため間接的な方法、例えば、一元放
射状免疫拡散法（ＳＲＩＤ）による全ＡＡＴ量と血清ト
リプシン阻害能（Serum trypsin inhibitory capacity
：ＳＴＩＣ）による活性ＡＡＴ量との比較により算出
する方法により行われている。しかし、この方法による
失活ＡＡＴの定量値は活性部位を切断されて失活したｍ
−ＡＴだけではなく活性型のＡＡＴと同じ分子量である
上述の失活したＡＡＴ量が測定値に含まれることにな
る。実際にはむしろ、m-ＡＴ自身はα１-アンチトリプ
シン−エラスターゼ複合体よりは遅いがＡＡＴよりは速
やかに代謝される（Alan E.Mastet al.：Biochemistry,
30, 1723-1730, 1991)ことから、失活ＡＡＴのごく一
部分に相当するにすぎない。また、ＳＴＩＣ値はＡＡＴ
が極めて多量に存在するため近似的にＡＡＴの活性値と
みなしているが、厳密にはＡＡＴだけではなくα１-ア
ンチキモトリプシン、α２-マクログロブリン、インタ
ーαトリプシンインヒビター、Ｃ１インヒビター等血清
中のセリンプロテアーゼインヒビターすべての活性の総
計であるため正確な定量値を与えるものではない。

【０００６】また、ＡＡＴと他のタンパク質との会合体
形成については、通常知られるセリンプロテアーゼとの
特異結合の他には、ＡＡＴとγ−セミノプロテインの複
合体が血清中に存在することが報告されている（特開昭
６２−４６２６３）。しかし、生体中に存在するｍ−Ａ
Ｔがそれ自身、または、セリンプロテアーゼ以外の他の
タンパク質と複合体を形成するという報告はなく、ガラ
クトース転移酵素について特定のタンパク質との複合体
形成に関する報告も見られない。

【０００７】以上、癌患者血清中でｍ−ＡＴ様物質が生
成し、ｍ−ＡＴ様物質とガラクトース転移酵素との複合
体とｍ−ＡＴ様物質自身の自己会合体が特異的に存在す
ること、及び、ｍ−ＡＴ様物質とガラクトース転移酵素
との会合体、ｍ−ＡＴ様物質の自己会合体をモノクロー
ナル抗体を用いて特異的に検出する方法についてはなん
ら報告はない。また、癌患者血清中でｍ−ＡＴが高濃度
に生成し、ｍ−ＡＴをモノクローナル抗体を用いて特異
的に検出する方法についてもなんら報告はない。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、腫瘍
マーカーとして高精度に測定できる新規なｍ−ＡＴ類似
物質を提供し、該物質に反応し、癌診断薬としての用途
を有する新規モノクローナル抗体と、該モノクローナル
抗体を用いた前記腫瘍マーカーの測定方法を提供するこ
とにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、ＧＴ−IIとしてNative-PAGE に認められ
るバンドに一部ｍ−ＡＴ様物質がガラクトース転移酵素
分子と多量体を形成した状態で混在していることを見い
だし、さらに、このｍ−ＡＴ様物質（このＧＴとの会合
性を有するｍ−ＡＴ様物質のことをＢＰ（Binding Prot
ein)ということがある）は、自己会合体を形成した状態
で存在しているものもあることを見いだした。また、ｍ
−ＡＴ様物質、すなわちＢＰは、分子構造上ｍ−ＡＴと
区別できず、ＧＴ分子との会合性、自己会合性を有する
という点においてのみｍ−ＡＴと区別されることも明ら
かにした。さらに、ＡＡＴとｍ−ＡＴ様物質（またはｍ
−ＡＴ）には免疫学的な（抗原性の）差があり、上記の
ＢＰに反応し、ＡＡＴに実質的に反応しないモノクロー
ナル抗体を作製することに成功し、また、該モノクロー
ナル抗体を用いて被検液中のＢＰとＧＴとの会合体、ま
たはＢＰ自己会合体を定量することにより癌の診断が可
能であることを見いだし、本発明を完成するに至った。

【００１０】すなわち、本発明は、癌患者腹水よりα−
ラクトアルブミンアフィニティクロマトグラフィーによ
りガラクトース転移酵素とのヘテロ多量体として分離さ
れ、ドデシル硫酸ナトリウム処理又は８Ｍ尿素処理によ
り単分子状態となり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元条件下電気
泳動で約４８ｋＤａの分子量を示し、等電点が約４．６
〜５．０であり、抗α₁ −アンチトリプシンポリクロー
ナル抗体と反応し、プロテアーゼ・インヒビター活性を
持たず、ガラクトース転移酵素との会合及び自己会合が
可能なタンパク質、該タンパク質とガラクトース転移酵
素との会合体及び該タンパク質の自己会合体を提供す
る。

【００１１】また、本発明は、前記本発明のタンパク質
と反応し、α₁ −アンチトリプシンと実質的に反応しな
いモノクローナル抗体及び該モノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマを提供する。なお、ここで、「実質
的に反応しない」とは、同一のＥＬＩＳＡ系で測定した
場合に、α₁ −アンチトリプシンに対する反応性が１／
１００以下であることを意味する。

【００１２】さらに、本発明は、前記本発明のモノクロ
ーナル抗体と前記本発明のタンパク質との特異的抗原抗
体反応を利用した免疫学的測定により本発明のタンパク
質又は会合体を検出又は定量する方法を提供する。すな
わち、前記タンパク質を測定するためには、本発明のモ
ノクローナル抗体と該タンパク質を認識し得る異なる抗
体とをそれぞれ固相抗体、２次抗体として用いることが
できる。また、前記タンパク質とガラクトース転移酵素
の会合体を測定するためには、本発明のモノクローナル
抗体とガラクトース転移酵素に対する特異的な抗体を固
相抗体、及び２次抗体として用いることが出来る。ある
いは、本発明のモノクローナル抗体により捕らえた該会
合体のガラクトース転移酵素活性を測定することにより
行うこともできる。前記タンパク質自己会合体を測定す
るためには、本発明のモノクローナル抗体同士を固相抗
体、及び２次抗体として用いることができる。

【００１３】以下に本発明について詳述する。

【００１４】本発明のガラクトース転移酵素とＢＰの会
合体（ＧＴ−ＢＰ）は、下記実施例に詳細に記載するよ
うに、癌患者の腹水、例えば卵巣癌患者の腹水から Can
cerResearch 48 巻、5325頁、1988年に記載の方法に従
い、α−ラクトアルブミンアフィニティクロマトグラフ
ィによりＧＴを分離することにより共存物質として分離
することができる。以後の説明より明らかとなるが、こ
れにより得られた試料中には大部分のＧＴと少量のＢＰ
とＧＴの会合体が存在するため、後者のみを得るため
に、例えば抗ＡＡＴ抗体のアフィニティクロマトグラフ
ィにより該会合体のみを吸着させて溶出し、分離するこ
とができる。この場合抗ＡＡＴ抗体は、モノクローナル
抗体、ポリクローナル抗体のいずれであってもよいが、
モノクローナル抗体の場合にはｍ−ＡＴ様物質にも反応
するものを選択する必要があることから、ポリクローナ
ル抗体が好ましい。しかし、ｍ−ＡＴ様物質に対するモ
ノクローナル抗体を作製する目的のためには後者のみを
分離する過程は必ずしも必要とされない。むしろ、溶出
条件による該会合体（特にｍ−ＡＴ様物質部分）の変性
を招く危険性を伴うため行わないことが好ましい。

【００１５】本発明のｍ−ＡＴ様物質に対するモノクロ
ーナル抗体は、上述の手順に従い分離した免疫原を用い
て、哺乳動物に一般的方法により免疫を行うことができ
る。すなわち、上記の免疫原をリビ・アジュバントシス
テム等のアジュバントとともに腹腔内又は静脈内に投与
することができる。

【００１６】次に、免疫動物から採取した脾臓細胞とミ
エローマ細胞との細胞融合により、当該分野における既
知の方法でモノクローナル抗体を得ることができる。す
なわち、免疫動物より脾細胞を摘出し骨髄腫細胞と融合
させる。融合に際して、融合促進剤としてポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）を用いることができる。融合操作
後、通常の選択培地、例えばＨＡＴ培地中で培養するこ
とにより融合細胞（ハイブリドーマ）のみを選択し、次
いで、目的とする抗体を産生するハイブリドーマをスク
リーニングし、クローニングを行う。スクリーニング
は、一般的な方法、例えば、ＥＬＩＳＡ法等により行う
ことができる。また、クローニングは、例えば、限界希
釈法により行うことができ、これによりモノクローン化
されたハイブリドーマを得ることができる。得られたハ
イブリドーマは、マウス腹腔内に投与しその腹水から回
収する方法、又は、ハイブリドーマを培養し、培養上清
から分離する方法により得ることができる。さらに、一
般的な方法、すなわち、硫酸アンモニア沈殿、ゲル濾
過、イオン交換クロマトグラフィー等を用いて精製する
ことができる。

【００１７】下記実施例において詳述するように、上記
方法により、５種類のモノクローナル抗体が得られた。

【００１８】これらモノクローナル抗体のうち、４種類
は人乳汁中のガラクトース転移酵素分子と反応した。す
なわち、ゲル（例えばアガロースゲル）に抗体を結合し
て、被検液、すなわち人乳汁と反応させた後、アクセプ
ター基質と放射標識したＧＴドナー基質液を加えて反応
させてガラクトース転移酵素活性を測定した結果、モノ
クローナル抗体Ｍ８０１を除く４種類の抗体はすべて酵
素活性を有する分子に反応していた。しかし、被検液に
卵巣癌患者腹水を用いた場合は５種類の抗体とも反応し
た物質は酵素活性を有していた。

【００１９】また、卵巣癌患者からα−ラクトアルブミ
ンアフィニティクロマトグラフィにより精製されたＧＴ
画分をシアリダーゼで処理した後、等電点電気泳動を行
い、銀染色、又は、次いでニトロセルロース膜にウェス
タン・ブロットを行い５種類の抗体によりそれぞれイム
ノステインを行った。その結果、Ｍ８０１のみがｐＩ
４．６〜５．０付近に、残る４抗体は銀染色パターンに
対応して広いｐＩ域に複数のバンドが染色された。

【００２０】これらは、癌患者腹水中にＧＴ分子とその
結合タンパク質のヘテロ多量体を形成したものが存在
し、Ｍ８０１抗体がＧＴ分子とほぼ分子量の等しい結合
タンパク質部分に反応していることを示すものである。

【００２１】ＢＰの分離は、本発明の抗体（抗ＢＰ抗
体）を用いたアフィニティクロマトグラフィにより精製
することができる。すなわち、本発明の抗体、例えば、
Ｍ８０１をアガロースゲルに固定化したアフィニティカ
ラムに、卵巣癌患者腹水のようなＢＰを含む試料液を通
してＢＰを選択的に結合させた後、溶出液により溶出す
ることにより精製される。溶出は、例えば３Ｍチオシア
ン酸カリウム溶液、酸性緩衝液、アルカリ性緩衝液によ
り行うことができる。このようにして得られた画分は、
ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）の結
果、分子量は約４万８千であり、Native-PAGE の結果、
単分子状態のものと２量体、さらにそれ以上の多量体
（２０量体又はそれ以上のものまで）の状態のものが存
在することが判明した。この様にして得られたＢＰ画分
中にはほとんどＧＴは含まれないが、これをさらに精製
するためには抗ＧＴ抗体を固定化したアフィニティカラ
ムに通して通過した画分を得れば良い。また、この画分
中には、自己会合状態のＢＰ分子の他に、単分子状態の
ｍ−ＡＴ分子が含まれるが、単分子状態のｍ−ＡＴ分子
を除去しＢＰ自己会合体のみを分離精製するためには、
ゲル濾過クロマトグラフィーを行い多量体画分のみを得
ればよい。この方法により、ＢＰ自己会合体を単離する
ことができる。すなわち、この試料を未変性ＰＡＧＥ
（Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ）にかけると、約４８ｋＤａ
の倍数の分子量に対応する複数のバンドのみが観察され
る。バンドは、２量体から２０量体までに対応するもの
が明瞭に認められるが、２０量体を超えるものも存在す
るものと考えられる。なお、上記方法において、抗ＧＴ
抗体を固定化したアフィニティカラムからＧＴ−ＢＰ会
合体を３Ｍチオシアン酸カリウム溶液、酸性緩衝液又は
アルカリ性緩衝液等で溶出することにより、ＧＴ−ＢＰ
会合体を単離することができる。すなわち、この試料を
Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥにかけると、約４８ｋＤａの倍
数の分子量に対応する複数のバンドのみが観察される。
バンドは、２量体から２０量体（ＢＰとＧＴの分子が合
計２０個会合したもの）までに対応するものが明瞭に認
められるが、２０量体を超えるものも存在するものと考
えられる。

【００２２】同様に健常人血清中から抗ＢＰ抗体のアフ
ィニティクロマトグラフィにより反応性物質の分離を試
みたところ、血清を加熱処理したものについて分子量約
５万２千の物質が得られたが、未処理条件下では分離さ
れなかった。また、いずれの条件においても電気泳動上
で４万８千の分子量を示すタンパク質はほとんど確認さ
れなかった。この分子量５万２千のタンパク質を充分に
精製後アミノ酸シークエンスの解析を行った結果、ＡＡ
Ｔと同定された。そこでＢＰについてＥＬＩＳＡ法によ
り固相抗体に抗ＢＰ抗体、標識抗体として抗ＡＡＴポリ
クローナル抗体を用いて検出を試みた結果、ＢＰは抗Ａ
ＡＴポリクローナル抗体との反応性が確認された。この
結果からＢＰとＡＡＴとの関連性が示唆されたので、Ｂ
ＰをＣＮＢｒにより限定分解してＡＡＴと比較したとこ
ろ、ＢＰは５本のフラグメントのメインバンドが確認さ
れ、ＡＡＴから得られたフラグメントとはやや短い１本
を除いて全て一致した。これはすなわちＢＰがＡＡＴの
部分分解物質と同様の一次構造であることを示すもので
ある。

【００２３】ＡＡＴとエラスターゼの反応については、
Cancer Research 47, 1179-1184, 1987 に記述されるよ
うにＡＡＴとエラスターゼの量比により反応生成物が異
なることが知られている。すなわち、ＡＡＴ＞エラスタ
ーゼの場合にはＡＡＴとエラスターゼの複合体と未反応
ＡＡＴ及びエラスターゼが生成するのに対し、ＡＡＴ＜
エラスターゼの場合には複合体の生成は確認されず、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ上でＡＡＴよりやや分子量の小さいバン
ドが生成する。ここでいうｍ−ＡＴというのはＡＡＴの
活性部位すなわちアミノ末端側から３５８番目のメチオ
ニン残基と３５９番目のセリン残基の間が切断すること
により生成したエラスターゼと複合体を形成していない
ＡＡＴのことであり、エラスターゼ過剰条件下で生成す
る、ＡＡＴよりやや分子量の小さいタンパク質のことを
言う。

【００２４】ＢＰのプロテアーゼインヒビター活性につ
いて検討を行った。測定は、セリンプロテアーゼとして
用いたエラスターゼに前述のＭ８０１抗体のアフィニテ
ィカラムから溶出したＢＰ試料を添加して、エラスター
ゼの基質 N-Succinyl-(Ala)₃-p-nitroanilide の分解度
を４１０ｎｍの吸光度で測定することにより行った。そ
の結果、対照実験として行ったＡＡＴ添加においてプロ
テアーゼインヒビター活性が認められたのに対してＢＰ
は活性が確認されなかった。同様に、αラクトアルブミ
ンカラムにより精製したＧＴ−ＢＰ結合体を添加した場
合も活性は確認されなかった。

【００２５】m-ＡＴは、Hoppe-Seyler's Z.Phisiol.Che
m. 363, 1377-1388, 1982 に記載の方法により単離する
ことができる。すなわち、精製したＡＡＴとキモトリプ
シノーゲンＡを等量モルで３７℃、４日間反応させた
後、ゲル濾過クロマトグラフィにより４８ｋＤの分子量
のm-ＡＴを分離することができる。

【００２６】また、本発明者らは別の方法により定量性
良くｍ−ＡＴを分離する方法を見出した。すなわち、Ａ
ＡＴとエラスターゼを１：１等量（モル比）で反応させ
た後陰イオン交換クロマトグラフィーによりＡＡＴ・エ
ラスターゼ複合体を単離し、該複合体に少量のエラスタ
ーゼを添加する。これを一定時間反応させた後再度陰イ
オン交換クロマトグラフィーを行いｍ−ＡＴを単離する
ことができる。

【００２７】抗ＢＰ抗体により分離したＢＰは、ＳＤＳ
条件下における分子量、等電点ともにm-ＡＴと同じ値を
示した。また、m-ＡＴについても同様にＣＮＢｒによる
限定分解を行ったところ、ＢＰと同じ分子量パターンを
示した。

【００２８】ｍ−ＡＴは活性部位が切断されてＣ末端の
３．６ｋＤａのペプチドが４８ｋＤａの分子と非共有結
合により結合した状態にあることが知られている。ＡＡ
Ｔ、ＡＡＴ・エラスターゼ複合体、単離したＢＰ分子及
びゲル濾過クロマトグラフィーにより再度精製したｍ−
ＡＴをペプチド分離用ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ったとこ
ろ、ＡＡＴ以外の全てから分子量３６００に相当する低
分子が検出された。この結果、ＢＰがm-ＡＴ分子と同様
の分子構造をとることが確認された。

【００２９】しかし、癌患者腹水から得られたＢＰは、
単離したＡＡＴをエラスターゼなどのセリンプロテアー
ゼにより処理した結果生成したｍ−ＡＴの場合とは異な
り、ＧＴ分子との会合体、または、自己会合体を形成し
たものとして存在しているという特徴を有している。こ
のことは、健常人血清中にＢＰは存在せず、エラスター
ゼをＡＡＴの等量より多く加えた場合（ｍ−ＡＴが生成
する条件）においてもＢＰは生成しないことからも確認
される。以上のことから、ＢＰはＡＡＴの分解生成物で
あり、かつ癌化を反映してＧＴとの会合性、凝集性を獲
得したものであることを示しているものであると考えら
れ、単分子状態で存在するｍ−ＡＴ分子と区別される。

【００３０】本発明の提供するＢＰに対するモノクロー
ナル抗体は、ＡＡＴに対しては実質的に反応性を有さず
その部分分解物に相当する構造（ｍ−ＡＴ）に反応する
という特徴を示している。また、他の血清タンパク質に
も反応しない。さらには、ＢＰと抗ＢＰ抗体との反応に
おいて抗原分子の立体構造が保持されやすい反応条件で
ある、抗原分子が液相に存在する場合には抗ＢＰ抗体が
ＢＰには良く反応するのに対してＡＡＴには反応せず、
抗原分子の立体構造が保持されにくい固相に抗原が固定
化された条件の反応の場合には、抗ＢＰ抗体がＢＰだけ
ではなくＡＡＴに対しても反応し得る。これらの事実
は、抗ＢＰ抗体Ｍ８０１はＡＡＴの高次構造における分
子内部が活性部位の切断により露出された部分に反応し
ている可能性があることを示すものである。

【００３１】ＢＰとＧＴの会合体は抗ＢＰ抗体を用い
て、ガラクトース転移酵素活性を測定することにより定
量することができる。すなわち、固相担体に固定化した
本発明の抗ＢＰモノクローナル抗体に被検液を接触させ
た後、非結合物質を除去し、固相の有するＧＴ活性を測
定するという手順に代表される方法により測定する。固
相担体としては、ポリスチレンやポリカーボネート等で
できたＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロタイタープレートと
ポリマーやガラスでできたビーズ、あるいはゲルなどを
用いることができる。抗体の固相担体への固定化は、物
理的吸着、または化学的、あるいはそれらを併用するこ
とにより行うことができる。物理的な吸着固定の場合
は、通常ｐＨ７〜９程度の溶液中で４℃一晩か３７℃１
時間程度の固定操作を行うことができる。物理的吸着固
定では固定量が不十分な場合には、例えばグルタルアル
デヒド等の適当な固定剤を用いた化学処理により担体へ
の固定化量を増加させることが好ましい。被検液と固相
に固定化された抗体との反応は通常の生理的条件（ｐ
Ｈ、イオン強度、温度）下で行うことができる。反応
後、結合しなかった被検液は固相担体から分離され充分
に洗浄した後、固相の有するＧＴ活性を、例えば実施例
に示した手順に従い測定することができる。

【００３２】ＢＰ−ＧＴ会合体の他の測定方法として
は、競合法、２抗体法が挙げられる。すなわち、前者は
あらかじめ単離し調製した標識抗原を被検液と固相抗体
との反応過程が共存させて標識抗原を検出する方法であ
り、後者は抗ＢＰ抗体の他にＧＴに対する抗体を用いた
当業者の間でサンドイッチ法として知られる方法であ
る。高感度測定を目的とする場合は、２抗体法が好まし
く用いられる。２抗体法により測定を行う場合、抗ＢＰ
抗体、抗ＧＴ抗体のいずれか一方を固相に固定化し、他
方をラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質等により直接
またはアビジン、ビオチン（またはそれらの誘導体）等
を介して間接的に標識することにより用いることができ
る。すなわち、該抗体を¹²⁵ Ｉ、西洋わさびペルオキシ
ダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファタ
ーゼ等により標識することにより用いることができる。
測定手順は、例えば以下のようにして行うことができ
る。抗ＢＰモノクローナル抗体を９６穴マイクロタイタ
ープレートに加えて４℃で一晩物理吸着させた後液を除
去し、非特異吸着を防止するためにＢＳＡ等のブロック
剤を加えてブロッキングを行う。固定化した抗体と被検
液との反応は、被検液をプレートのウェルに加えて一定
時間反応させる。この反応は、通常３７℃で１時間、ま
たは、４℃で一晩の条件で好ましく行われる。反応終了
後、液を除去してから洗浄し、西洋わさびペルオキシダ
ーゼ標識抗体を加えて反応させる。反応条件は抗原抗体
反応が行われ、かつ、酵素活性が保たれる条件であれば
良いが、通常室温、１時間で行うことができる。標識抗
体の反応が終了した後、充分にウェルを洗浄し酵素基質
としてｏ−フェニレンジアミンを加えて反応させ、一定
時間後に硫酸を加えることにより反応を停止させ該液の
吸光度を測定し、定量する。

【００３３】ＢＰの自己会合体については、同一の抗
体、または、同一の抗原決定基を認識しその反応部位を
競合する抗体同士を用いた２抗体法により測定すること
ができる。すなわち、該抗体を固相抗体、および、標識
抗体としてもちいることができ、これにより自己会合体
のみを測定することができる。標識抗体の標識物質につ
いては前述の物質を用いることができるし、さらに、測
定手順等についても用いる抗体を除いて前述の２抗体法
による方法に準ずることができる。

【００３４】本発明の抗ＢＰ抗体は、ｍ−ＡＴの構造を
認識することから、これを用いて被検液中のｍ−ＡＴを
測定することにより定量することができる。例えば、抗
ＢＰ抗体を固相抗体とし抗ＡＡＴ抗体を標識抗体として
用いる２抗体法により正確に定量することができる。標
識抗体の標識物質については前述の物質を用いることが
できるし、さらに、測定手順等についても用いる抗体を
除いて前述の２抗体法による方法に準ずることができ
る。この方法により、癌患者においてｍ−ＡＴが高濃度
に生成することが明らかになった。

【００３５】

【発明の効果】本発明により、癌患者被検液中からのみ
検出されるガラクートス転移酵素と会合性を有するＢＰ
および、ＢＰとガラクトース転移酵素との会合体、また
は、ＢＰの自己会合体が提供された。また、本発明によ
り、ＢＰに対する特異性の高いモノクローナル抗体及び
それを産生するハイブリドーマが提供された。さらに、
それを用いたＢＰとＧＴの会合体及び、ＢＰの自己会合
体の測定方法が提供された。また、該抗体を利用したｍ
−ＡＴの測定方法が提供された。従って、本発明は被検
液中の前記物質を測定することにより、癌の診断に貢献
するものである。

【００３６】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００３７】１．ガラクトース転移酵素（ＧＴ）画分の
分離α−ラクトアルブミンアフィニティクロマトグラフィ ＧＴ−ＢＰ会合体を含むＧＴ画分は卵巣癌患者の腹水中
から以下の手順により得た。操作は全て４℃で実施し
た。

【００３８】卵巣癌患者の腹水約１リットルを遠心分離
し、不溶物を除去した。上清を約２０倍量の蒸留水で１
晩透析した後、これを１０ｍＭ ＭｎＣｌ₂ 、５ｍＭ
N-アセチルグルコサミン、０．０１％トライトンX-１０
０（Ｔｘ−１００）を含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝
液（ｐＨ７．３）（緩衝液Ａ）に調整した。２時間静置
後、遠心分離（１６０００ｇ，３０分間）して再度不溶
物を除去した。

【００３９】この上清をあらかじめ緩衝液Ａで平衡化し
たα−ラクトアルブミン・セファロース ４Ｂ アフィ
ニティカラム（５×３０ｃｍ）に通し、同緩衝液で十分
に洗浄した。タンパク質のモニターは２８０ｎｍの吸光
度の測定により行った。カラムを通過するタンパク質が
認められなくなった後、ＧｌｃＮＡｃを除いた緩衝液Ａ
によりＧＴ画分を溶出した（約５０ｍｌ）。これにＧｌ
ｃＮＡｃを加え、最終濃度５ｍＭとした。

【００４０】これらをあらかじめ緩衝液Ａで平衡化した
ヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧアフィニティカラム（１．
５×３ｃｍ）（シグマケミカル社製）に通し、ＧＴを含
む画分を集めて透析チューブに入れアクアサイドII（カ
ルバイオケム製）を用いて約１０ｍｌに濃縮した。さら
に蒸留水で透析した後、イスコ電気泳動コンセントレイ
ターを用いて濃縮し０．５ｍｌとした。なおＧＴ画分は
ＧＴ活性測定により追跡した。なお、ＧＴ活性の測定
は、特公平３−１３８７９号に記載の方法により行っ
た。

【００４１】ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動 濃縮されたＧＴ画分試料の分子量を、ドデシル硫酸ナト
リウム・ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）により測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ファストシ
ステム（ファルマシア社製）により１２．５％ポリアク
リルアミドゲルを用いて行い銀染色を行った結果、分子
量約４８ｋＤａのバンドが確認された。

【００４２】２．抗ＢＰ抗体の調製免疫プロトコール 実施例１で調製したＧＴ画分の試料約５０μｇをリビ・
アジュバントシステム（リビ イムノケム リサーチ社
製）を用いてＢＡＬＢ／ｃ系マウス（雌、８週齢）に免
疫し、再度３週間後に同量注射した。この投与後２週間
目に採血して、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗
体価を測定して陽性であることを確認した後、ＧＴ画分
試料３００μｇをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解
して静脈注射した。３日後、該マウスより脾臓を摘出し
以下のように細胞融合を行った。

【００４３】エライザ（ＥＬＩＳＡ） ９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）のウェ
ルに、ＰＢＳに希釈したＧＴ画分試料を５μｇ／ｍｌの
濃度で５０μｌづつ分注し４℃で一晩吸着した。該液を
除去し、ウェルをＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡを含
むＰＢＳを各ウェルに１００μｌづつ加え、３７℃で１
時間インキュベートした。ＢＳＡ溶液を除去した後、抗
体を含む液（即ち、培養上清あるいは抗血清）５０μｌ
を加え、３７℃で１時間インキュベートした。抗体を含
む液を除去しＰＢＳで充分に洗浄した後、１％ＢＳＡ・
ＰＢＳ溶液に希釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウ
スイムノグロブリン（Ａ＋Ｇ＋Ｍ）（カッペル社製）溶
液を加えて、室温で１時間反応させた。溶液を除去し、
ＰＢＳで充分に洗浄した後、基質として濃度３ｍｇ／ｍ
ｌのｏ−フェニレンジアミンを溶解したクエン酸・リン
酸緩衝液（ｐＨ５．０）（０．０２％Ｈ₂ Ｏ₂ を含む）
を各ウェルに１００μｌづつ添加し発色させた。９Ｎ硫
酸５０μｌを各ウェルに加えて発色反応を停止し、波長
４９２ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーＭＰＲ
Ａ４（東ソー製）を用いて測定した。

【００４４】細胞融合 免疫されたマウスから脾臓を無菌的に摘出し、ステンレ
スメッシュにより単細胞にほぐし、脾細胞の１／５量の
マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３細
胞とＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬製）を混合し遠心
分離後、細胞のペレットに５０％ポリエチレングリコー
ル１５００（ベーリンガー社製）を加え、融合操作を行
った。その後徐々にＲＰＭＩ１６４０液で希釈し遠心分
離により上清を除去した融合細胞を、２０％牛胎児血清
（ＦＣＳ）を加えたＨＡＴ培地（０．０１ｍＭヒポキサ
ンチン、１．６μＭチミジン、０．０４μＭアミノプテ
リンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に懸濁し、９６穴マ
イクロプレートに１ウェルあたり４×１０⁵ 個の細胞を
まき込み５％ＣＯ₂ 下３７℃で培養した。２週間後、コ
ロニー生育ウェルの培養上清を用いて、ＥＬＩＳＡ法に
よりＧＴ画分試料と強く反応する抗体をスクリーニング
した。抗体産生コロニーについて限界希釈法によりクロ
ーニングを３回行い、安定した抗体産生クローンを得
た。最終的にクローン５個を得て、Ｍ８０１、Ｍ５２
４、Ｍ６２３、Ｍ１７７、Ｍ６９１と命名した。

【００４５】モノクローナル抗体の精製 ５個のクローンをそれぞれ１０％ＦＣＳを加えたＲＰＭ
Ｉ１６４０培地で培養し、遠心分離（２００ｇ，５分
間）してＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄して再度遠心分離
した後ＲＰＭＩ１６４０で１×１０⁷ 個／ｍｌの濃度に
懸濁した。これを７日前にあらかじめプリスタン（２、
６、１０、１４−テトラメチルペンタデカン）を注射し
ておいたＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔に０．５ｍｌづつ
接種した。約２週間後、腹部の膨張したマウスから腹水
を採取し、遠心分離（２００ｇ，５分間）により細胞を
除去した後、これを硫酸アンモニウムを加えて５０％飽
和溶液とし、沈殿を分離してＰＢＳに溶解した。

【００４６】Ｍ８０１，Ｍ５２４，Ｍ６２３について
は、１００倍量の２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
７．８）で十分に透析した。これらを陰イオン交換クロ
マトグラフィーにより精製した。すなわち、ＤＥＡＥ−
セファロース（ファルマシア社製）カラムを用いて上記
試料をアプライし、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
８）、塩化ナトリウム濃度０−１Ｍの条件により濃度勾
配溶出を行った。溶出液は２８０ｎｍの吸光度によりモ
ニターし、得られた各画分についてＥＬＩＳＡを行いモ
ノクローナル抗体溶出画分を同定して集めた。

【００４７】Ｍ１７７，Ｍ６９１については、ゲル濾過
法により精製した。すなわち、スーパーローズ12カラム
（２×５０ｃｍ）（ファルマシア社製）を用いて上記試
料をアプライし、ＰＢＳにより溶出した。溶出液は２８
０ｎｍの吸光度によりモニターし、得られた各画分につ
いてＥＬＩＳＡを行いモノクローナル抗体溶出画分を同
定して集めた。

【００４８】モノクローナル抗体の特徴づけ （１）モノクローナル抗体のクラス及びサブクラス 各モノクローナル抗体の抗体クラスとサブクラスは、マ
ウスモノクローナル・サブ−アイソタイピングキット
（AMERICAN QUALEX 社製）を使用して決定した。その結
果、Ｍ８０１，Ｍ５２４はＩｇＧ₁ 、Ｍ６２３はＩｇＧ
_2b、Ｍ１７７，Ｍ６９１はＩｇＭと決定された。

【００４９】（２）特異性 得られた５種類のモノクローナル抗体の特異性を以下に
示す試験により決定した。それぞれのモノクローナル抗
体を結合したゲル懸濁液２５μｌに癌患者の腹水５００
μｌを加えて４℃で一晩振盪した。２ｍｌの冷ＣＫＴ緩
衝液（２０ｍＭカコジル酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化
ナトリウム、０．０１％トリトンＸ−１００）を加えて
１ｇで５分間放置してから上澄み液を吸引した。再度Ｃ
ＫＴ緩衝液による洗浄を行った後、７０μｌのＧＴ基質
液を加え（７μｌの０．５ｍＭ［³ Ｈ］ＵＤＰ−ｇａｌ
液、全投入量150000dpm （ニューイングランドヌクレア
ー社製）、３μｌの０．２Ｍ二酸化マンガン液、６０μ
ｌのＣＫＴ緩衝液、２ｍｇの卵白アルブミン（ＯＶ
Ａ）、この混合液を３７℃で２時間振盪した。５０μｌ
の反応混合液を１インチ角の濾紙ホワットマン３ＭＭ紙
にスポットして、即座に１０％トリクロロ酢酸（ＴＣ
Ａ）で１０分間洗浄した。このＴＣＡ洗浄操作を３回行
った後、この試験紙を９５％エタノール、ジエチルエー
テルにて順次１０分間づつ洗浄した。空気中で乾燥した
後、この試験紙をシンチレーション用小ビンに入れてシ
ンチレーションカクテルを加えて、濾紙状に沈殿した放
射性タンパク質量を液体シンチレーションカウンターに
より測定した。その結果を表１に示す。

【００５０】また、健常人乳汁、癌患者腹水、卵巣癌細
胞培養上清から前記手順に従いガラクトース転移酵素を
精製して、モノクローナル抗体の反応性の試験に使用し
た。なお、乳汁は遠心分離により中間層に得られる白濁
不透明液を得た後、０．２Ｍ酢酸緩衝液を等量添加して
ｐＨ４．６に調製して３０分間静置した。これを20000r
pmで３０分間遠心分離をして上清を分離して乳清を調製
し、これを用いた。

【００５１】各モノクローナル抗体を濃度１０μｇ／ｍ
ｌにＰＢＳで希釈して、９６穴マイクロタイタープレー
ト（ヌンク社製）に１００μｌづつ加えて４℃で一晩吸
着させた。これをＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ・Ｐ
ＢＳ溶液を２００μｌづつ加えて３７℃で１時間静置し
てブロッキングしてから液を除去した。次に、上記精製
ＧＴを１％ＢＳＡ・ＰＢＳで５０倍に希釈して各々１０
０μｌづつ各ウェルに加え３７℃で１時間静置した。反
応後、ＰＢＳで３回づつ各ウェルを充分に洗浄した。次
に、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液に希釈した西洋ワサビペル
オキシダーゼ標識ＭＡｂ８６２８（特開平３−２５９０
９３号、微工研菌寄第１１２２１号）を１００μｌづつ
各ウェルに加え、室温で１時間反応させた。反応終了
後、ＰＢＳで充分に洗浄してから基質として濃度３ｍｇ
／ｍｌのｏ−フェニレンジアミンを溶解したクエン酸−
リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）（０．０２％Ｈ₂ Ｏ₂ を含
む）を各ウェルに１００μｌづつ添加して室温で１０分
間発色反応させた。９Ｎ硫酸を５０μｌづつ各ウェルに
加えて反応を停止して、波長４９２ｎｍにおける吸光度
を測定した。その結果を表２に示す。

【００５２】以上の結果から、得られた抗体はＡ（Ｍ８
０１）、Ｂ群（Ｍ５２４，Ｍ６２３）、Ｃ群（Ｍ１７
７，Ｍ６９１）に分類される。このなかでＢ群はすべて
のＧＴ分子に反応する一群であり、これらは特願平３−
２９０９１号の抗ＧＴ抗体のグループ１に相当するもの
である。また、Ｃ群は癌関連ＧＴに反応する一群であ
り、これらはグループ２に相当するものである。しかし
ながらＡのＭ８０１抗体は、その反応性の特徴からＧＴ
分子に結合した癌患者腹水中の他の分子を認識している
ものと考えられる。なお、Ｍ８０１抗体を産生するハイ
ブリドーマは工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れ、その受託番号は、微工研菌寄第１２９４２号であ
る。

【００５３】３．ＢＰ自己会合体の単離モノクローナル抗体Ｍ８０１のアフィニティカラムの作
製 アガロースゲル担体を用いたアフィ・ゲル１０（バイオ
ラッド社製）２ｍｌを冷蒸留水（４℃）ですばやく３回
洗浄し、ＰＢＳ溶液のモノクローナル抗体Ｍ８０１（２
０ｍｇ）を加えて４℃で４時間振盪した。反応終了後、
１Ｍ塩化ナトリウムを含む１００ｍＭグリシン−ＨＣｌ
緩衝液（ｐＨ２．８）、１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０
０ｍＭジエチルアミン溶液（ｐＨ１１．５）、３Ｍチオ
シアン酸カリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）で順次洗浄し、ＰＢＳで平衡化した。

【００５４】ＢＰ自己会合体の単離 癌患者の腹水約１リットルを遠心分離して不溶物を除去
した。上清を約２０倍量の蒸留水で一晩透析した後、あ
らためてＰＢＳで透析した。これを遠心分離（１６００
０ｇ，３０分間）して再度不溶物を除去した。この上清
をモノクローナル抗体Ｍ８０１アフィニティカラム（７
ｍｍ×５０ｍｍ）に通し、１Ｍ塩化ナトリウムを含むＰ
ＢＳで充分に洗浄した。次いで３Ｍチオシアン酸カリウ
ムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶出し
た。溶出タンパクのモニターは２８０ｎｍの吸光度の測
定により行った。溶出したタンパク質の画分を集めてＰ
ＢＳで充分に透析した。これを再度ＰＢＳで平衡化した
前述のアフィニティカラムに通し、同様にして再度溶出
して、ＰＢＳで透析した。この試料を透析チューブに入
れアクアサイドII（カルバイオケム社製）を用いて約１
０ｍｌに濃縮し、さらに蒸留水で透析した後イスコ電気
泳動コンセントレイターを用いて濃縮し０．５ｍｌとし
た。この濃縮液をさらにスーパーロース１２カラム（１
ｘ３０ｃｍ）（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過ク
ロマトグラフィーを行い単量体画分を除去し、得られた
試料を同様の方法により濃縮して１ｍｌとした。

【００５５】健常人由来Ｍ８０１反応物質の単離 健常人血清１０ｍｌをＰＢＳで透析した後、遠心分離
（１６０００ｇ，３０分間）により不溶物を除去した。
この上清をモノクローナル抗体Ｍ８０１のアフィニティ
カラム（７ｍｍ×５０ｍｍ）に通し、上記と同様にして
３Ｍチオシアン酸カリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．２）で溶出したところ溶出タンパクは検出さ
れなかった。

【００５６】次に、健常人血清１０ｍｌをＰＢＳで希釈
して１００ｍｌとした後、８０℃で１０分間加熱処理を
行った。これをＰＢＳで透析した後遠心分離（１６００
０ｇ，３０分間）により不溶物を除去した。この上清を
モノクローナル抗体Ｍ８０１のアフィニティカラム（７
ｍｍ×５０ｍｍ）に通し、以下、ＢＰ自己会合体の単離
の場合と同様にして溶出タンパク質を得た。

【００５７】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 得られた試料の分子量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認
した。測定は、ファストシステム（ファルマシア社製）
により１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いて行
い、染色は銀染色法により行った。その結果、癌患者腹
水由来の試料は分子量約４８ｋＤａと約３．６ｋＤａの
バンド、健常人加熱血清由来の試料は分子量約５２ｋＤ
ａの単一バンドが確認された。さらにこの健常人加熱血
清由来の試料をアミノ酸シークエンスの解析を行った結
果、α１-アンチトリプシンと同定された。

【００５８】ｍ−ＡＴの単離・精製 ＡＡＴ（アテンズ・リサーチ社製）１ｍｇ（１ｍｌ）を
エラスターゼ（エラスチン・プロダクツ社製）０．５ｍ
ｇ（０．５ｍｌ）を混合し、３７℃で１時間反応させ
た。これを陰イオン交換クロマトグラフィー（カラム：
モノ−Ｑ５／５ＨＲ、ファルマシア社製）によりｐＨ
７．８トリス−塩酸緩衝液のＮａＣｌグラジエント溶出
（０〜１Ｍ）を行った。１００ｍＭＮａＣｌ付近で溶出
されるＡＡＴ・エラスターゼ複合体を集め、これに０．
０５ｍｇのエラスターゼを添加して３７℃で６時間反応
させた。再度混合物を陰イオン交換クロマトグラフィー
（同カラム）により同緩衝液でグラジエント溶出を行
い、２００ｍＭＮａＣｌ付近で溶出されるｍ−ＡＴ画分
を分離し１ｍｌに濃縮した。

【００５９】ＣＮＢｒ分解 得られたＢＰ自己会合体試料とＡＡＴ、そして調製して
得たｍ−ＡＴ３０μｇを凍結乾燥して、７０％蟻酸３５
μｌに溶解してから５ｍｇ／ｍｌＣＮＢｒを含む７０％
蟻酸を等量加えた。室温で２０時間反応させた後、１０
０μｌ蒸留水を加えて反応を停止し、窒素ガス気流下に
３０分間静置した。これを冷凍乾燥して少量の蒸留水に
溶解後、前述の方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行っ
た。染色は、銀染色法により行った。その結果、ＢＰと
ｍ−ＡＴは同様の５本のフラグメントのメインバンドを
得た。ＡＡＴについては４本のバンドについては一致し
ており最長の分子量のバンドがＢＰ、ｍ−ＡＴよりもや
や大きかった。

【００６０】未変性ポリアクリルアミド電気泳動 得られたＢＰ自己会合体試料およびｍ−ＡＴについて未
変性条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
た。ＰＡＧＥはファストシステム（ファルマシア社製）
により８−２５％グラジエントポリアクリルアミドゲル
を用いて行い、染色は銀染色法により行った。また、泳
動後のゲルをニトロセルロース膜上に緩和な条件（３７
℃、４時間）でウェスタンブロットした。このメンブレ
ンを１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）・ＰＢＳ溶液に浸
漬してブロッキングした後、前記モノクローナル抗体を
希釈した１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液に接触させ反応させ
た。ＰＢＳで充分に洗浄した後、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶
液に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウスイムノグロ
ブリン（Ａ＋Ｇ＋Ｍ）（カッペル社製）溶液中で、室温
で１時間反応させた。溶液を除去しＰＢＳで充分に洗浄
した後、コニカイムノステインキットＨＲＰ ＩＳ−５
０Ｂ（コニカ社製）により発色させた。銀染色の結果、
α₁-アンチトリプシンと同じ移動度のものと移動度の少
ない複数のバンドが観察された。免疫染色の結果は、モ
ノクローナル抗体Ｍ８０１では銀染色に対応していた
が、他の４種類の抗体については染色されなかった。

【００６１】等電点電気泳動 得られたＢＰ自己会合体試料とｍ−ＡＴについてファス
トシステム（ファルマシア社製）を用いて等電点電気泳
動を行った。泳動後、銀染色および前述と同様にして免
疫染色を行った。その結果、銀染色においてＢＰ自己会
合体とｍ−ＡＴはｐＩ ４．６〜５．０の複数のバンド
が確認された。免疫染色は、Ｍ８０１では対応していた
が他の４種類の抗体においては染色されなかった。

【００６２】４．ＢＰのプロテアーゼインヒビター活性
の測定 ２ｍＭのN-Succinyl-(Ala)₃-p-nitroanilide（シグマ社
製）を加えた５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）（０．５Ｍ塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍｌＢＳ
Ａを含む）にエラスターゼ（エラスチンプロダクト社
製）５μｇ／ｍｌと、ＢＰ試料（ＧＴ−ＢＰ、ＢＰ自己
会合体）またはＡＡＴを加えて３７℃で３０分間インキ
ュベーションした。反応を停止させるために８Ｍ酢酸を
１００μｌ／ｍｌ加えて、４１０ｎｍの吸光度を測定し
た。その結果を図１に示す。この結果から、セリンプロ
テアーゼ（エラスターゼ）インヒビター活性を有するＡ
ＡＴは約２倍当量でほぼ完全に阻害しているのに対し
て、ＧＴ−ＢＰおよびＢＰ自己会合体ではさらに高い濃
度においても阻害は認められずこれらＢＰ試料はプロテ
アーゼインヒビター活性を持たないことが確認された。

【００６３】５．ＧＴ−ＢＰのＳＤＳ処理、および尿素
処理 実施例１で分離したＧＴに会合したＢＰ試料を２．５％
ドデシル硫酸ナトリウムを加えたＰＢＳに希釈して、３
７℃で１時間静置した。同様に、最終濃度８Ｍ尿素を加
えたＰＢＳに希釈して、３７℃で１時間静置した。モノ
クローナル抗体Ｍ８０１、Ｍ１７７をそれぞれに濃度１
０μｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈して、９６穴マイクロタイ
タープレート（ヌンク社製）に１００μｌづつ加えて４
℃で一晩吸着させた。これをＰＢＳで洗浄した後、１％
ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液を２００μｌづつ加えて３７℃で１
時間静置してブロッキングしてから液を除去した。次
に、それぞれＳＤＳ処理、尿素処理したＧＴ−ＢＰ試料
を１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液で１００倍に希釈したものか
ら、さらに同液により５倍づつ希釈した希釈系列を作成
し各々１００μｌづつ各ウェルに加え３７℃で１時間静
置反応させた。反応後、ＰＢＳで３回づつ各ウェルを充
分に洗浄した。次に、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液に希釈し
た西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ＭＡｂ８６２８、同
標識抗α₁ −アンチトリプシン・ポリクローナル抗体、
または同標識Ｍ８０１を１００μｌづつ各ウェルに加
え、室温で１時間反応させた。反応終了後、ＰＢＳで充
分に洗浄してから基質として濃度３ｍｇ／ｍｌのｏ−フ
ェニレンジアミンを溶解したクエン酸−リン酸緩衝液
（ｐＨ５．０）（０．０２％Ｈ₂ Ｏ₂ を含む）を各ウェ
ルに１００μｌづつ添加して室温で１０分間発色反応さ
せた。９Ｎ硫酸を５０μｌづつ各ウェルに加えて反応を
停止して、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。
その結果を図２ないし図５に示す。Ｍ８０１−標識ＭＡ
ｂ８６２８はＧＴ−ＢＰ会合体のみを、Ｍ８０１−標識
Ｍ８０１はＢＰ多量体のみを、Ｍ８０１−標識抗ＡＡＴ
抗体はＢＰの単一分子を検出することができ、Ｍ１７７
−標識ＭＡｂ８６２８はＧＴ分子を検出することが出来
る測定系である。したがってこの結果は、ＧＴ−ＢＰ又
はＢＰ自己会合体をＳＤＳ処理または尿素処理をするこ
とによりＧＴ分子とＢＰ分子の会合が開裂してＢＰは単
分子状態になっていることを示すものである。

【００６４】６．抗ＢＰ抗体の特異性 Ｍ８０１を濃度１０μｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈して、９
６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）に１００
μｌづつ加えて４℃で一晩吸着させた。これをＰＢＳで
洗浄した後、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液を２００μｌづつ
加えて３７℃で１時間静置してブロッキングしてから液
を除去した。次に、試料としてＡＡＴ、加熱変性（１０
０℃５分間の加熱処理を行った）ＡＡＴ、ｍ−ＡＴ（実
施例３にて調製）を１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液で１００倍
から５倍づつ希釈系列を作製し各々１００μｌづつ各ウ
ェルに加え３７℃で１時間静置した。反応後、ＰＢＳで
３回づつ各ウェルを充分に洗浄した。次に、１％ＢＳＡ
・ＰＢＳ溶液に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標
識抗ＡＡＴポリクローナル抗体を１００μｌづつ各ウェ
ルに加え、室温で１時間反応させた。反応終了後、ＰＢ
Ｓで充分に洗浄してから基質として濃度３ｍｇ／ｍｌの
ｏ−フェニレンジアミンを溶解したクエン酸−リン酸緩
衝液（ｐＨ５．０）（０．０２％Ｈ₂ Ｏ₂ を含む）を各
ウェルに１００μｌづつ添加して室温で１０分間発色反
応させた。９Ｎ硫酸を５０μｌづつ各ウェルに加えて反
応を停止して、波長４９２ｎｍにおける吸光度を測定し
た。その結果を図６に示す。

【００６５】図６より、抗ＢＰモノクローナル抗体Ｍ８
０１は、ＢＰ分子及びＢＰ分子と同様の分子構造を示す
ｍ−ＡＴに対してより特異性高く反応し、ＡＡＴ分子に
は実質的に反応しないことがわかる。また、加熱変性Ａ
ＡＴに対しても強く反応していることから、ＢＰはｍ−
ＡＴと同様の立体構造をしているか、あるいはＡＴにお
ける分子内部に位置するペプチド鎖と同じまたは相同性
の高い部位を有しそれが露出された構造をとるものと考
えられる。

【００６６】７．ＧＴ−ＢＰ会合体の検出ガラクトース転移酵素活性測定法によるＧＴ−ＢＰ会合
体の測定 ２５μｌのＭ８０１が結合したゲル懸濁液に健常人およ
び癌患者の血清１００μｌを加えて４℃で一晩振盪し
た。２ｍｌの冷ＣＫＴ緩衝液を加えて１ｇで５分間放置
してから上澄み液を吸引した。再度ＣＫＴ緩衝液による
洗浄を行った後、７０μｌのＧＴ基質液を加え（７μｌ
の０．５ｍＭ［³ Ｈ］ＵＤＰ−ｇａｌ液、全投入量1500
00dpm （ニューイングランドヌクレアー社製）、３μｌ
の０．２Ｍ二酸化マンガン液、６０μｌのＣＴＫ緩衝
液、２ｍｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ）、この混合液を
３７℃で２時間振盪した。５０μｌの反応混合液を１イ
ンチ角の濾紙ホワットマン３ＭＭ紙にスポットして、即
座に１０％ＴＣＡで１０分間洗浄した。このＴＣＡ洗浄
操作を３回行った後、この試験紙を９５％エタノール、
ジエチルエーテルにて順次１０分間づつ洗浄した。空気
中で乾燥した後、この試験紙をシンチレーション用小び
んに入れてシンチレーションカクテルを加えて、濾紙状
に沈殿した放射性タンパク質量を液体シンチレーション
カウンターにより測定した。

【００６７】健常人血清２４検体と癌患者血清２１検体
について測定した結果、健常人血清ではすべて1400cpm
以下であったのに対して癌患者血清試料では、３検体を
除いていずれも1400cpm 以上の高い値を示した。

【００６８】８．ＢＰ自己会合体の検出 ＢＰ自己会合体を測定する方法として、同一抗体による
２抗体酵素免疫測定法を用いた。その操作手順を以下に
示す。

【００６９】本法に用いることのできる抗体としては抗
ＢＰ抗体とその標識抗体であり、例えばモノクローナル
抗体Ｍ８０１が挙げられる。また標識抗体は、前述の過
ヨウ素酸法に従い西洋ワサビペルオキシダーゼ標識した
ものを使用した。

【００７０】Ｍ８０１を濃度１０μｇ／ｍｌにＰＢＳで
希釈して、９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社
製）に１００μｌづつ加えて４℃で一晩吸着させた。こ
れをＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液を２
００μｌづつ加えて３７℃で１時間静置してブロッキン
グしてから液を除去した。次に、健常人、良性腫瘍患者
および癌患者の血清をＰＢＳで５倍づつ希釈した希釈系
列を作製し各々１００μｌづつ各ウェルに加え３７℃で
１時間静置した。反応後、ＰＢＳで３回づつ各ウェルを
充分に洗浄した。次に、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液に希釈
した西洋ワサビペルオキシターゼ標識Ｍ８０１を１００
μｌづつ各ウェルに加え、室温で１時間反応させた。反
応終了後、ＰＢＳで充分に洗浄してから基質として濃度
３ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミンを溶解したクエ
ン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）（０．０２％Ｈ₂ Ｏ
₂ を含む）を各ウェルに１００μｌづつ添加して室温で
１０分間発色反応させた。９Ｎ硫酸を５０μｌづつ各ウ
ェルに加えて反応を停止して、波長４９２ｎｍにおける
吸光度を測定した。その結果（検体の希釈は５倍）を図
７に示す。

【００７１】９．m-ＡＴの検出 m-ＡＴの総量を測定する方法として、抗ＢＰモノクロー
ナル抗体と抗ＡＡＴ抗体による２抗体法を用いた。Ｍ８
０１を濃度１０μｇ／ｍｌにＰＢＳで希釈して、９６穴
マイクロタイタープレート（ヌンク社製）に１００μｌ
づつ加えて４℃で一晩吸着させた。これをＰＢＳで洗浄
した後、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液を２００μｌづつ加え
て３７℃で１時間静置してブロッキングしてから液を除
去した。次に、健常人、良性腫瘍患者および癌患者の血
清をＰＢＳで５倍づつ希釈した希釈系列を作成し各々１
００μｌづつ各ウェルに加え３７℃で１時間静置した。
反応後、ＰＢＳで３回づつ各ウェルを充分に洗浄した。
次に、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液に希釈した西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ標識抗ＡＡＴポリクローナル抗体（カッ
ペル社製）を１００μｌづつ各ウェルに加え、室温で１
時間反応させた。反応終了後、ＰＢＳで充分に洗浄して
から基質として濃度３ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジア
ミンを溶解したクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）
（０．０２％Ｈ₂ Ｏ₂ を含む）を各ウェルに１００μｌ
づつ添加して室温で１０分間発色反応させた。９Ｎ硫酸
を５０μｌづつ各ウェルに加えて反応を停止して、波長
４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果（検体
の希釈は１２５倍）を図８に示す。

【００７２】

【表１】

【００７３】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＢＰのプロテアーゼインヒビター活性の測定結
果を示す図である。

【図２】ＧＴ−ＢＰ試料をＳＤＳ又は８Ｍ尿素で処理し
た試料のＭ８０１−Ｍ８０１標識体測定系による免疫測
定の結果を示す図である。

【図３】ＧＴ−ＢＰ試料をＳＤＳ又は８Ｍ尿素で処理し
た試料のＭ８０１−Ｍ８６２８標識体測定系による免疫
測定の結果を示す図である。

【図４】ＧＴ−ＢＰ試料をＳＤＳ又は８Ｍ尿素で処理し
た試料のＭ１７７−Ｍ８６２８標識体測定系による免疫
測定の結果を示す図である。

【図５】ＧＴ−ＢＰ試料をＳＤＳ又は８Ｍ尿素で処理し
た試料のＭ８０１−抗ＡＡＴ抗体標識体測定系による免
疫測定の結果を示す図である。

【図６】抗ＢＰ抗体の特異性を調べるために行った免疫
測定の結果を示す図である。

【図７】抗ＢＰモノクローナル抗体と抗ＡＡＴ抗体によ
る２抗体法を用いた、健常人、癌患者及び良性腫瘍患者
の血清中のｍ−ＡＴの総量の測定結果を示す図である。

【図８】Ｍ８０１を用いて、これと結合する、健常人、
癌患者及び良性腫瘍患者の血清中の成分の量を測定した
結果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ．Ｓ ｅｙｌｅｒ 373（７），ｐ．581−588 （1992 Ｊｕｌｙ) Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ 47 ｐ．1179 −1184（1987) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/47 C12N 15/06

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 癌患者腹水よりα−ラクトアルブミンア
   フィニティクロマトグラフィーによりガラクトース転移
   酵素とのヘテロ多量体として分離され、ドデシル硫酸ナ
   トリウム処理又は８Ｍ尿素処理により単分子状態とな
   り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元条件下電気泳動で約４８ｋＤ
   ａの分子量を示し、等電点が約４．６〜５．０であり、
   抗α₁ −アンチトリプシンポリクローナル抗体と反応
   し、プロテアーゼ・インヒビター活性を持たず、ガラク
   トース転移酵素との会合及び自己会合が可能なタンパク
   質。
2. 【請求項２】 請求項１記載のタンパク質とガラクトー
   ス転移酵素との会合体。
3. 【請求項３】 請求項１記載のタンパク質の自己会合
   体。
4. 【請求項４】 請求項１記載のタンパク質と反応し、α
   ₁ −アンチトリプシンと実質的に反応しないモノクロー
   ナル抗体。
5. 【請求項５】 Ｍ８０１である請求項４記載のモノクロ
   ーナル抗体。
6. 【請求項６】 請求項４又は５記載のモノクローナル抗
   体を産生するハイブリドーマ。
7. 【請求項７】 請求項４又は５記載のモノクローナル抗
   体を用いたアフィニティ・クロマトグラフィーにより、
   α−ラクトアルブミンカラムを通過させた癌患者腹水よ
   り分離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元条件下で４８ｋＤａ
   と３．６ｋＤａの分子量の位置にバンドを示し、等電点
   が約４．６〜５．０であり、抗α１ −アンチトリプシ
   ンポリクローナル抗体と反応し、プロテアーゼ・インヒ
   ビター活性を有せず、２量体以上の自己会合状態にある
   タンパク質。
8. 【請求項８】 請求項４記載のモノクローナル抗体と請
   求項１記載のタンパク質との特異的抗原抗体反応を利用
   した免疫学的測定により請求項１記載のタンパク質を検
   出又は定量する方法。
9. 【請求項９】 請求項４記載のモノクローナル抗体と請
   求項１記載のタンパク質との特異的抗原抗体反応を利用
   した免疫学的測定により請求項２記載の会合体を検出又
   は定量する方法。
10. 【請求項１０】 前記モノクローナル抗体と結合した物
    質のガラクトース転移酵素活性を測定することにより前
    記会合体を定量することを含む請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】 請求項４記載のモノクローナル抗体と
    請求項１記載のタンパク質との特異的抗原抗体反応を利
    用した免疫学的測定により請求項３記載の会合体を検出
    又は定量する方法。
12. 【請求項１２】 請求項４記載のモノクローナル抗体
    と、 α _１ −アンチトリプシン活性部位を切断されて失活
    した修飾アンチトリプシンとの特異的抗原抗体反応を利
    用した免疫学的測定により修飾アンチトリプシンを検出
    又は定量する方法。