KR100842121B1

KR100842121B1 - Ｄ-다이머에 대한 단일클론 항체와 이를 이용한 ｄ-다이머및 교차결합성 피브린 또는 이를 포함하는 피브린 분해물검사용 진단시약

Info

Publication number: KR100842121B1
Application number: KR1020040008487A
Authority: KR
Inventors: 도현주; 김두식; 정광회
Original assignee: (주)바이오버드
Priority date: 2004-02-09
Filing date: 2004-02-09
Publication date: 2008-07-01
Also published as: KR20050080399A

Abstract

본 발명은 마우스에서 생산된 사람의 D-다이머(dimer) 및 해당 에피톱을 포함하는 고분자량의 교차결합성 피브린에 대한 단일클론 항체, 이를 분비하는 세포주 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 항 D-다이머 단일클론항체는 사람의 피브리노겐, 피브린에는 결합하지 않고 D-다이머 및 D-다이머를 포함한 교차결합성 피브린 또는 이를 포함하는 피브린 분해물에만 특이적으로 반응하며 높은 역가로 제조되어 생체 내 D-다이머 및 이를 포함한 교차결합성 피브린(high molecular weight crosslinked fibrin) 또는 이를 포함하는 피브린 분해물의 탐색 및 검사용 진단시약으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

Ｄ-다이머에 대한 단일클론 항체와 이를 이용한 Ｄ-다이머 및 교차결합성 피브린 또는 이를 포함하는 피브린 분해물 검사용 진단시약{Monoclonal antibody against D-dimer and diagnosis agent for detecting D-dimer, crosslinked fibrin and its derivatives containing D-dimer by using the antibody}

도 1은 도면1 D-다이머의 분리 정제 사진이다. 도 1의 레인 1은 가용성 피브린, 레인2는 피브리노겐의 α, β, γ 체인, 레인 3은 단백질 마커(분자량, 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 15, 10KD), 레인 4는 분리 정제한 D-다이머의 α, β, γ 체인, 레인 5는 불용성 피브린을 나타낸다.

도2는 단일항체의 아이소타입 결정에 대한 표이다.

도3은 단일항체 B4의 D-다이머에 대한 교차반응성 확인한 그래프이다.

도4는 B4, B2를 이용하여 검사한 정상인과 D-다이머 고위 수준인 환자의 혈장 검사에 대한 그래프이다.

도5는 C3/B4를 이용한 ELISA 방법으로 혈전증-의심환자 혈장내의 D-다이머를 검사한 그래프이다.

도6은 단일항체가 인지하는 에피토프의 결정을 나타낸 사진이다. 도6에서 맨 좌측 레인은 단백질 분자량 마커(250. 150, 100, 75, 50, 37, 25, 15, 10 KDa)이고, C1: 트립신 처리한 D-다이머 조각들(Coomassie blue 염색), C2: 키모트립신 처 리한 D-다이머 조각들(Coomassie blue 염색)을 나타내며, WB1: 트립신 처리한 D-다이머 조각들(웨스턴 블러팅), WB2: 키모트립신 처리한 D-다이머 조각들(웨스턴 블러팅)이다.

도7은 38, 37KD 조각의 아미노산 서열 분석으로 알게 된 B4의 epitope 부위에 관한 그림이다.

도8은 본 발명의 ELISA 방법과 상업용 진단시약의 결과가 상이한 환자 혈장을 대상으로 각 항체를 고착시킨 칼럼을 통과시킨 후 그 용리 액을 SDS-전기영동으로 분석한 그림이다. #1, 2, 3은 ELISA 결과가 상이했던 환자 혈장들이고 #4는 결과가 같았던 환자 혈장들의 칼럼 용리 액이다. 도에서 s는 단백질 마커(분자량,100, 75, 50, 37, 25KD), 화살표시들은 교차결합된 감마-감마 체인들을 나타낸다.

도 9는 파종성혈관내응고(DIC, Disseminated intravascular coagulation) 의심 환자들의 혈장 내에 존재하는 분해되지 않은 교차결합성 피브린을 인위적으로 플라스민을 첨가하여 분해시켰을 때 그 시그널이 증가되는 양상을 보여주는 표이다.

본 발명은 마우스에서 생산된 D-다이머 및 해당 에피톱을 포함하는 고분자량의 교차결합성 피브린에 대한 단일클론 항체와 이를 이용한 D-다이머 및 D-다이머 를 포함한 교차결합성 피브린 또는 이를 포함하는 피브린 분해물 검사용 진단시약에 관한 것이다.

보다 상세하게는 사람의 D-다이머(dimer)에 특이적으로 반응하며, 높은 역가로 제조되어 D-다이머 및 D-다이머를 포함한 교차결합성 피브린 또는 이를 포함하는 피브린 분해물의 정량을 위한 진단시약으로 유용하게 이용될 수 있는 단일클론 항체로서 D 도메인 베타 체인의 N-말단 134-142번 또는 N-말단 134-142번과 알파체인 124-214번으로 이루어진 아미노산서열에 특이적으로 결합하는 마우스의 단일클론 항체 및 이를 이용한 D-다이머 및 D-다이머를 포함한 교차결합성 피브린 또는 이를 포함하는 피브린 분해물 검사용 진단시약에 관한 것이다.

혈액은 응고와 용해라는 두 가지의 기작에 의하여 조절된다. 전자는 혈전 형성을 이끄는 기작이고 후자는 혈전 용해를 이끄는 기작이다. 피브린은 혈전을 구성하는 주요 성분으로서 피브리노라이시스에 의하여 여러 개의 피브린 조각(fibrin degradation products, FDP)으로 절단된다. 피브린 형성과 피브린 분해는 실제적으로 동시에 발생하며 피브린 분해 과정에서 생성되는 FDP 중 최종의 중요한 표지가 D-다이머이다. D-다이머는 인자 13번(Factor XIII)에 의하여 감마 사슬이 서로 교차 결합된 비 용해성 피브린이 플라스민에 의하여 분해 될 때 생성되는 분해산물이다. 폐 경색, 심부정맥 혈전증, 종양 수술, 파종성혈관내응고, 심근 경색, 외상, 암, 신장, 간 기능 저하 등 질환자의 경우, 그 혈장에서 정상인 보다 높은 농도의 FDP와 D-다이머가 검출되는 것으로 알려져 있고 특히 현재 폐 경색, 심부정맥 혈전증의 진단에 가장 많이 이용되고 있다. 이들 경우는 보통 심각한 자각 증상이 없 어 방치하다가 생성된 혈전에 의하여 폐경색이나 심근경색으로 이어지게 되어 사망하게 될 수도 있는 위험성이 있다. 또한 이들의 진단을 위하여 폐조영술이나 정맥초음파 등의 시술이 필요한데 이러한 시술을 받는 환자의 20% 미만만이 양성으로 판정되고 있다. 현재 D-다이머를 이용한 여러 가지 검사 방법이 중간에 도입되면서 이러한 증상이 의심되어 시술을 요하던 환자들의 최고 40% 까지를 임상 검사만으로 진단해 낼 수 있게 되었다. 현재 가장 널리 알려져 있는 키트는 빠른 검사시약으로서 에이젠(AGEN)사의 SimpliRED와 디아그노스티카 스태고(Diagnostica Stago)의 Asserchrom D-Di 키트와 자동화 기기를 이용한 STA-Liatesr D-Di, 바이오메리엑스(bioMerieux SA, France)사의 VIDAS 등을 들 수 있다. 이들 외에도 다수의 D-다이머 진단 시약들이 있는데 이들 대부분은 공통적으로 민감성은 높으나 특이성이 낮은 문제점을 가지고 있다. 또한 각 진단시약에서 사용하고 있는 단일항체에 따라 교차결합성피브린을 선호적으로 인지하기도 하고 저분자량의 피브린분해산물(D-다이머)이나 고분자량의 피브린 복합체 등을 선호적으로 인지하기도 하므로 각 진단시약 간의 검사 결과에 상당한 차이가 있게 된다. 실제로, D-다이머 단백질은 혈전증에 의한 원인 외에도 염증성 질환이나 환자의 연령, 임신, 항응고제의 복용 등과 같은 여러 요인에 의하여도 영향을 받으며, 특히 장기간 DIC증상을 가지고 있거나 항응고 치료 중인 경우에는 혈장 내의 피브린 유도체들이 D-다이머 형태라기보다 분해가 덜된 교차결합성 피브린 형태로 존재하게 되어 D-다이머에 특이적인 몇 몇 진단 시약은 결과가 잘못 나오는 경향이 있다(참조:Abraham Konberg, Blood 1992, vol 80, No 3, 709-717).

본 발명에서 제조된 단일항체는 정상인의 피브리노겐에 대하여는 반응하지 않으며 교차 결합된 피브린이 플라스민(plasmin)에 의하여 분해되어 형성되는 D-다이머 및 D-다이머를 포함한 교차결합성 피브린 또는 이를 포함하는 피브린 분해물에만 특이적으로 반응한다. 본 발명에서 형성된 단일항체를 이용하여 제조된 ELISA 진단 방법은 다른 진단시약과 비교하여 DIC 환자 혈장 내의 D-다이머 및 D-다이머를 포함한 교차결합성 피브린 또는 이를 포함하는 피브린 분해물을 검사하였을 때 보다 우수한 정량 결과를 나타내었다.

본 발명에서는, 형성된 D-다이머 특이적 단일항체를 분비하는 하이브리도마세포를 배양하여 세포가 분비하는 단일항체를 분리 정제한 후 환자들의 혈장 내의 D-다이머 및 D-다이머를 포함한 교차결합성 피브린 또는 이를 포함하는 피브린 분해물을 정량하기 위한 ELISA, LIA 등에 응용할 수 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 D-다이머에 대하여 높은 역가로 제조되어 D-다이머 및 D-다이머를 포함한 교차결합성 피브린 또는 이를 포함하는 피브린 분해물의 발현 탐색 및 검사를 위한 진단시약으로 유용하게 이용될 수 있는 마우스의 단일클론 항체를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 트롬빈 효소를 이용하여 사람의 피브리노겐을 피브린으로 만든 후 플라스민 효소로 잘라서 생성된 D-다이머 및 D- 다이머를 포함한 교차결합성 피브린 또는 이를 포함하는 피브린 분해물에 특이적으로 반응하는 모노클로날항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 D-다이머와 교차결합성 피브린 또는 D-다이머를 포함한 피브린 분해산물을 동시에 인지한다. D-다이머는 교차결합성 피브린이 플라스민에 의하여 완전히 잘라져서 생성되는 물질이다. 혈전증의 발생 여부를 확인하기 위하여 혈장내의 D-다이머 양을 검사할 때 사용되는 항체가 단지 독립적인 D-다이머 만을 인지하는 항체라면 플라스민에 의하여 교차결합성 피브린이 분해되지 못하였거나 덜 분해된 경우에는 해당 항체에 의하여 인지되지 못할 것이므로 실제의 D-다이머 양보다 낮게 측정되게 된다. 따라서, D-다이머 뿐만 아니라 D-다이머가 포함된 교차결합성 피브린도 함께 인지하면서, 피브리노겐이나 그 유도체들과는 반응하지 않는 단일항체가 혈장내의 D-다이머 검사를 위하여는 가장 바람직하다.

본 발명의 항체는 서열번호 1에 기재된 베타 체인의 N-말단 134번-142번 아미노산 서열을 포함하는 부위 또는 서열번호 2에 기재된 N-말단 124번(공식적으로 124임)부터 214번 아미노산 서열을 포함하는 부위와 반응하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 1차 항체로는 D-다이머 및 교차결합성 피브린 또는 그 분해산물에 특이적으로 반응하는 모노클로날항체; 2차 항체로는 표시체를 접합시켜 제작된 상기의 모노클로날항체; 및 상기 표시체와의 반응으로 발색을 유도하는 물질을 포함하는 기질을 포함하는 D-다이머 및 교차결합성 피브린 검사용 진단시약을 제공한다.

본 발명에서 상기의 표시체는 고추냉이 과산화효소(HRP) 또는 알칼라인 탈인 산화효소(Alkaline phophatase)인 것이 바람직하고, 상기의 기질은 o-페닐렌디아민 또는 과산화수소수 발색제를 포함하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 사람의 피브리노겐으로부터 D-다이머를 형성시켜 정제하고 이를 마우스에 면역화 시켜 항 D-다이머 단일항체를 분비하는 융합세포주를 제공한다.

상기와 같은 방법에 의하여 정제된 D-다이머 단백질은 SDS-PAGE를 수행하여 순도를 확인하였다.

단일클론 항체를 생산하는 융합세포주는 상기의 D-다이머 단백질을 이용하여 마우스의 면역화 작업을 수행하고, 면역화된 마우스로부터 추출한 비장세포를 마우스 골수종(myeloma) 세포주와 혼합함으로써 제조한다. 본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주의 양성클론 선별은 정제한 D-다이머를 항원으로 하여 민감도가 높은 효소-매개 면역측정법(Enzyme-linked immunoassay, ELISA)을 이용하며, 선택된 양성 클론으로부터 단일클론을 분리해내기 위해서 제한희석법(Limiting dilution)을 실시한다. 최종적으로 항-D-다이머 특이성이 검증된 단일클론항체는 'B2, C3, B4, C5이라 명명하였다.

상기 융합세포주로부터 생산되는 본 발명의 단일클론 항체들은 역가가 높은 IgG1 타입의 카파 라이트 체인(kappa light chain)으로 사람의 D-다이머에 대하여 높은 특이성을 가진다. 또한, 구조적으로 유사한 피브리노겐, 피브리노겐 분해산물들과는 교차 반응성이 나타나지 않는다. 정제한 D-다이머 단백질의 트립신, 키모 트립신, CNBr 분해 조각을 이용하여 규명한 단일항체 B4의 항원인식부위는, 베타 체인의 N-말단 134번-142번 아미노산 서열과 알파 체인의 N-말단 124번-214번으로 이루어지는 부위로 나타났다. 이것의 근거로는 베타 체인의 143번-431번 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 B4에 의하여 전혀 인식되지 않는 반면 베타체인의 134번-431번 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 B4에 의하여 인식된다는 실험적 증거에 의한 것이다. 또한 알파 체인의 N-말단 124번-214번 단백질도 B4에 의하여 인식되는데 알파 체인과 베타체인이 떨어져 있을 경우 D-다이머 전체 단백질에 비하여 그 인지도가 현저히 떨어지는 것으로 보아 알파 체인과 베타체인 또는 감마체인이 서로 꼬여서 특이한 줄(string) 구조를 형성하고 있고 B4는 이 구조적인 부분을 인지하고 있음을 확인할 수 있다(참조; Brown J.H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000 97: 85-90; Evers S.J., Biochemistry 1999 38(10): 2941-2946).

또한, 본 발명은 상기로부터 생산된 항-D-다이머 단일클론 항체를 이용한 혈장내의 D-다이머 및 D-다이머를 포함한 교차결합성 피브린 또는 이를 포함하는 피브린 분해물 탐색 및 검사용 진단시약을 제공한다.

본 발명의 진단 시약은 1차 항체로서 항-D-다이머 단일클론 항체, 2차 항체로서 고추냉이 과산화효소 등의 표시체를 접합시켜 제작된 D-다이머 단일클론 항체, 그리고 상기 표시체와의 반응으로 발색을 유도하는 물질을 포함하는 기질 용액으로 구성된다.

2차 항원 접합체로 이용하는 D-다이머 단일클론항체는 표시체가 접합되어 있으며, 표시체로는 고추냉이 과산화효소(HRP), 알칼라인 탈인산화효소(Alkaline phophatase) 등이 사용될 수 있는데, 상기 2차 항원 접합체는 항체의 변이가 거의 없는 부분인 Fc(fragment crystallizable)에 결합하므로 써 항체의 존재를 측정할 수 있게 한다.

상기 2차 항원 접합체의 표시체와 반응하여 발색을 유발하는 기질용액은 o-페닐렌디아민, 과산화수소수 등의 발색제와 완충용액으로 구성된다. 기질용액은 단일클론항체에 접합된 표시체를 분해하여 발색시키고 그 정도를 측정함으로써 항원의 존재 및 양을 확인할 수 있게 한다.

궁극적으로는 조직절편(tissue section)이나 혈장, 또는 세포 등을 샘플상태 그대로, 혹은 ELISA나 웨스턴 블랏, 혹은 면역침전법등을 이용하여, 혈관 또는 혈액내의 D-다이머 및 고분자량의 교차결합성 피브린의 농도를 상기 진단 시약을 통해 정량, 정성적으로 분석할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예1: 사람의 D-다이머 단백질의 제조 및 정제

항원으로 사용된 D-다이머는 트롬빈 효소를 이용하여 사람의 피브리노겐을 피브린으로 만든 후 플라스민 효소로 잘라서 정제하여 사용하였다. 즉, 반응 완충용액으로서 50mM Tris-HCl(pH7.5), 0.1M NaCl, 16mM CaCl₂에 녹인 후 Factor XIII의 공급원으로 사람의 혈장을 5% 첨가하였다. 소의 트롬빈을 피브리노겐 1g 당 500 unit으로 첨가하고 상온에서 16시간 반응시켜 피브린 덩어리를 만든 후 이것을 2%의 아세트산 용액에 16시간 동안 담가 교차결합이 안된 피브린을 제거하였다. 피브린 덩어리를 증류수로 충분히 세척한 후 액체 질소로 얼려서 분쇄시키고 반응 완충용액에 담가 놓는다. 1unit의 플라스미노겐에 1 unit의 유로카이나제를 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시켜 활성 플라스민으로 만든 후 500mg의 피브린 당 1 unit의 플라스민을 첨가하고 반응 완충 용액에 담그고 37℃에서 24시간마다 1unit의 활성 플라스민을 첨가하면서 72시간 동안 반응시켰다. 72시간 후 400 unit의 aprotinin을 첨가하여 반응을 정지시켰다. SDS-PAGE를 수행시 80KD 부근에서 교차결합된 감마 체인이 관찰되었으므로 D-다이머가 생성되었음을 확인할 수 있다.(도 1).

생성된 피브린 분해 산물들 중에서 D-다이머 만을 분리 정제하기 위하여 겔투과 크로마토그라피를 이용하였다. 이 때 사용된 완충용액은 6M urea가 포함된 50mM Phosphate(pH7.5)이며 Budzynski 등의 방법에 따라 수행하였다. D-다이머가 분리 정제된 결과는 SDS-전기영동과 ELISA를 통하여 확인하였으며 순도 90% 이상의 정제도를 갖는 D-다이머를 항원으로서 사용하였다.(도 1)

실시예2:D-다이머에 특이적인 단일클론 항체를 생산하는 융합세포주의 제조

단일클론 항체를 생산하는 융합세포주의 제조를 위하여, 8주된 실험용 암컷 마우스(BALB/c mouse)를 이용하여 면역화 작업을 수행하였다. 우선 150 ㎕의 완전 보조항원(Complete Freund's Adjuvant; Sigma사)에 상기 실시 예 1에서 발현 정제한 D-다이머 단백질 50 ㎍을 동일부피로 섞어 유상화한 다음, 복강주사 하였다. 첫 주사 후, 10일 간격으로 첫 번째, 두 번째 주사 시에는 동일 량의 D-다이머 단백질을 불완전 보조항원(Incomplete Freund's Adjuvant, Sigma사)에 유상화하여 재차 복강 주사하고, 세 번째와 네 번째 복강 주사 시에는 특이적 면역반응의 증폭을 위하여, 20㎍ D-다이머 단백질을 주사하였다. 최종적으로 융합세포주 제작 3일 전 복강에 20 ㎍의 D-다이머 단백질만을 주사하였다. 융합세포주 제작을 위해서는 상기 면역화한 마우스로부터 비장세포를 추출하여 마우스 골수종(myeloma) 세포주인 Sp2/0-Ag14(미국 ATCC사)의 세포수가 2:1의 비율이 되도록 혼합하였다. 이후, 혼합세포액을 원심 분리하여 상등액을 제거한 후에 플라스틱 파스퇴르 피펫을 이용하여 PEG-1500(polyethylene glycol-1500, Boehringer Mannheim사) 1 ㎖을 첨가하여 1분간 잘 혼합하고, 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배양액(Gibco사) 15 ㎖을 10분에 걸쳐 천천히 첨가하여 잘 혼합한 뒤, 같은 부피의 20% 소 태아혈청을 함유하는 DMEM 배지를 첨가하고서, 37℃에서 30분간 방치하였다. 상기의 세포 현탁액을 원심 분리하여 침전된 세포를 20% 소 태아혈청이 포함된 DMEM 배지에 다시 첨가한 뒤, 이를 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주하여, 37℃ 및 5% 의 CO2 대기 조건하에서 하루 동안 배양하였다. 하루 뒤에는 2X HAT 배지(Sigma사)를 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 배양했고, 콜로니가 형성된 후 정제한 D-다이머를 대상으로 효소-매개 면역측정법(Enzyme-linked immunoassay, ELISA)을 수행하여 양성 결과가 나타나는 클론들을 선별하였으며 한 편, 피브리노겐과 피브리노겐 분해조각에 대하여 양성결과가 나타나는 클론들은 제외하였다.

구체적으로는, 정제한 D-다이머, 피브리노겐, 피브리노겐 분해조각을 코팅 완충액(0.1M Na-carbonate, pH 9.5)에 잘 혼합하여, 96-웰 ELISA 플레이트(Maxisorp, Nunc사)에 각 웰당 1 ㎍ 씩 되도록 첨가한 후 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음 날, 블로킹 완충용액(blocking buffer, 1% 소 혈청 알부민/PBS)를 첨가하여 상온에서 2시간 동안 방치하였다. 이 후 상기 용액을 제거하고, 웰을 세척액으로 세척한 후 융합 세포주들의 배양액을 100 ㎕씩 각 웰에 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 반응하지 않은 과량의 항체를 제거하고, 고추냉이 과산화효소(horse radish peroxidase, HRP)가 결합된 염소유래 항-마우스 IgG 항체(KPL사)와 HRP의 기질인 o-페닐렌디아민(phrnylenediamine; Sigma사)과 과산화수소 용액(H₂O₂)를 차례로 첨가하여 특이적으로 결합된 항체의 존재 유무를 확인하였다. 그 결과, D-다이머 단백질과는 반응성을 나타내지만, 피브리노겐 및 피브리노겐 분해조각들과는 반응하지 않는 하이브리도마 클론들을 D-다이머에 대한 항체를 분비하는 양성클론으로서 선별하였다.

상기 과정에서 선택된 양성 클론으로부터 단일클론을 분리해내기 위해서는 제한희석법(Limiting dilution)을 실시하였다.

이를 위하여, 96-웰 상에 들어 있는 세포주를 모두 취하여 현탁하여 그 세포수를 측정한 후, 96-웰 플레이트의 각 웰당 평균 0.3개의 세포가 들어가도록 세포를 분주하고, 다음으로는 각기 웰당 평균 1개, 10개의 세포 순으로 96-웰 플레이트 한 개씩을 만들었다. 여기에서 가장 작은 세포수로 분주한 플레이트에서 자란 클론을 다시 지정하여 이를 증식시키고 필요에 따라 위의 과정을 재차 반복하였다. 여기에서 최종적으로 가장 희석된 세포농도의 플레이트로부터 자란 클론을 단일클론으로 간주하였다.

상기한 과정을 거쳐, 최종적으로 항-D-다이머 특이성이 검증된 단일클론항체는 B2, C3, B4, C5 라 명명하였다.

실시예 3: 제조된 단일클론 항체 B2-C5의 특성결정

단일클론 항체들의 면역글로불린 항체 타입을 결정하기 위해서는 마우스 면역글로불린 타입결정 키트(Pierce사)를 이용하였다. 상기 키트는 단일클론항체에 근거한 키트로서, ELISA 플레이트의 웰에 먼저 항원을 코팅시킨 후, 정제된 단일 클론 항체를 첨가하고, 이 후 마우스의 각 면역글로불린 타입에 특이적인 6종류의 토끼 유래의 항-마우스 면역 글로불린 항체들을 첨가한 후 고추냉이 과산화효소(horse radish peroxidase, HRP)가 결합된 염소 유래의 항 토끼 면역 글로불린 항체를 첨가하여 양성 반응 유무를 검색하게 된다. 그 결과, 도 2에서 보듯이 상기 단일클론 항체들은 모두 IgG1의 카파 라이트 체인(kappa light chain)으로 확인되었다.

실시예 4: B4의 항원 특이성 검증.

a.단일클론항체 B4의 항원 특이성을 확인

효소 매개 면역 측정법(Enzyme-linked immunoassay)을 이용한 단일클론항체 B4의 항원 특이성을 확인하기 위하여 경쟁적 억제 효소 매개 면역 측정법(Competitive inhibition ELISA)을 수행하였다. 이를 위하여, 실시예 1에서와 같이 제조된 사람의 D-다이머를 코팅 완충액(0.1M Na-carbonate, pH 9.5)에 잘 혼합하여 96-웰 ELISA 플레이트(Maxisorp, Nunc사)의 각 웰 당 1 ㎍ 씩 되도록 첨가한 후 4℃에서 하루 동안 반응시켰다. 코팅 항원 용액을 제거하고 블로킹 완충용액(blocking buffer, 1% 소 혈청 알부민/PBS)를 첨가하여 상온에서 2시간 동안 방치하였다. 이 후 상기 용액을 제거하고, 각 웰들을 PBST(Phosphate-buffered saline에 0.1% Tween 20 첨가) 완충용액으로 세척하였다. B4에 반응하는 항원의 특이성을 알아보기 위하여 25ug/ml의 D-다이머, D 모노머, E 도메인, 피브리노겐을 각각 고추냉이 과산화효소(horse radish peroxidase, HRP)가 결합된 B4 단일클론 항체와 37℃에서 1시간 동안 먼저 반응시킨 후 그 반응 액을 D-다이머가 코팅되어 있는 플레이트에 첨가하였다. 추가로 37℃에서 1시간 더 반응시킨 후, 용액을 제거하고 세척 후 HRP의 기질인 o-페닐렌디아민(phenylenediamine; Sigma사)과 과산화수소 용액(H₂O₂)를 차례로 첨가하여 특이적으로 결합된 항체의 존재 유무를 확인하였다. 그 결과, 단일클론항체 B4는 9.8X10^-10 M의 높은 해리 상수 값을 가지는 것을 알 수 있었으며 D 모노머에 대하여는 5X10^-6M의 낮은 반응성을 가졌으며 피브리노겐, E 도메인과 같은 피브리노겐 조각들과는 교차 반응성이 전혀 없는 D-다이머에 특이적인 항체임을 확인할 수 있었다(도 4).

b.웨스턴 블러팅(Western blotting) 이용한 단일클론 항체들의 항원 특이성

이들의 항원특이성을 검증하기 위해서 D-다이머, D 모노머, E 도메인, 피브리노겐을 SDS-PAGE 상에서 전기 영동시킨 다음 트리스-글리신-메탄올 완충액내에서 0.45 ㎛ 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane; Bio-rad사)으로 이동시켜 블러팅 하였다. 비 특이적인 반응을 제거하기 위해서 상기 나이트로 셀룰로오스 막을 상온에서 2시간 동안 5% 탈지분유로 블로킹한 뒤, 항-D-다이머 특이 항체인 B4을 적정량으로 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 그 뒤 트윈-20(Tween-20)이 0.1%로 포함된 PBS 완충용액으로 세척한 후, 고추냉이 과산화효소(HRP)가 결합된 항-마우스 IgG 항체(Sigma사)를 1:2500으로 희석하여 1시간 동안 반응시키고, 시약을 다시 상기와 동일한 PBS 완충용액으로 씻어낸 후, 4-클로로-1-나프톨과 H₂O₂로 발색 반응하였다. 그 결과, B4가 D-다이머와만 반응하는 것으로 나타났다.

실시예 5: B4의 상세 항원인식 부위(fine epitope)의 규명

a. B4의 상세 항원인식 부위의 확인

D-다이머 단백질을 이용하여 B4의 상세 항원인식 부위를 확인하기 위하여 여러 분해 효소로 분해시킨 후 웨스턴 블러팅을 실시하였다. 동량의 D-다이머 단백질을 1: 10에서 1: 100의 비율로 트립신, 키모트립신, 펩신 및 CNBr로 37℃에서 30분에서 4시간 동안 분해 시켰다. 그 분해 산물들을 비 환원 겔과 환원 겔로 나누어 전기영동하고 니트로셀룰로오스 막으로 이동시킨 후, 실시예 4b와 동일한 방법으로 B4를 이용하여 각 각 웨스턴 블러팅을 수행하였다. 그 결과 비 환원 겔에서는 D-다이머 단백질, 트립신, 키모트립신 분해 조각들이 단일항체 B4에 의하여 인식되었으나 환원 상태의 경우에는 단지 베타체인 만 또는 트립신에 의하여 분해 된 38KDa의 조각만 단일항체 B4에 의하여 인지되었다(도 6, C1, WB1). 반면 키모트립신에 의하여 분해 된 37KDa의 조각은 인지되지 못하였다(도 6, C2, WB2). 이 두 조각으로부터 나타나는 반응성의 차이가 단백질의 어떤 부위 때문인지를 알아보기 위하여 N-말단 아미노산 서열 분석과 MS/MS분석을 통하여 확인하였다. 두 단백질조각의 C-말단은 동일한 반면 N-말단은 서로 달랐는데 도 7에서 보이는 바와 같이 베타 체인의 N-말단으로부터 9개로 이루어진 펩타이드 조각 즉, B134~B142 조각을 B4가 인지하는 것으로 밝혀졌다. 또한 CNBr처리하여 분해시킨 조각들을 웨스턴블랏 한 경우에도 13KDa의 조각을 B4 항체가 인지하였는데(도 6, C3, WB3) 이 조각을 MS/MS분석한 결과 알파 체인 124번부터 214번으로 이루어진 단백질에 해당하였다. 이 두 부위는 알파, 베타, 감마 체인이 서로 꼬여서 형성되는 줄 구조의 일부로서 피브리노겐에서는 가려져 드러나지 않다가 교차결합이 형성된 후 플라스민에 의하여 잘라지면 새롭게 드러나는 부분으로 널리 알려져 있다(참조: Brown J.H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000 97: 85-90; Evers S.J., Biochemistry 1999 38(10): 2941-2946)

실시예6: C3/B4를 이용하여 사람의 혈장내의 D-다이머 농도 측정

D-다이머에 특이적인 단일항체 B4를 이용하여 사람의 혈장내 존재하는 D-다이머 혹은 D-다이머를 포함한 피브린 분해 조각들의 농도를 측정 할 수 있었다. 측정 방법은 이중 항체 샌드위치 효소 매개 면역 측정법(Double antibody sandwich ELISA)으로 수행하였다. 단일항체 C3를 코팅 완충액(0.1M Na-carbonate, pH 9.5)에 잘 혼합하여 96-웰 ELISA 플레이트(Maxisorp, Nunc사)의 각 웰 당 1 ㎍ 씩 되도록 첨가한 후 4℃에서 하루 동안 반응시켰다. 코팅이 안 된 항체는 제거하고 블로킹 완충용액(blocking buffer, 1% 소 혈청 알부민/PBS)를 첨가하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다가 각 웰들을 PBST(Phosphate -buffered saline, 0.1% Tween 20 첨가) 완충용액으로 세척하였다. 사람의 혈장을 1% 소 혈청 알부민/PBST 완충용액을 이용하여 20배 희석하여 웰 당 100㎕씩 첨가 하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 37℃에서 1시간 반응시킨 후, 용액을 제거하고, 세척액으로 4회 세척 후 고추냉이 과산화효소(horse radish peroxidase, HRP)가 결합된 D-다이머에 특이적인 단일 항체 B4를 1:2000으로 1% 소 혈청 알부민/PBST 완충용액을 이용하여 희석시켜 웰 당 100㎕씩 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 추가로 반응시켰다. HRP의 기질인 o-페닐렌디아민(phenylenediamine; Sigma사)과 과산화수소 용액(H₂O₂)를 차례로 첨가하여 특이적으로 결합된 항체의 존재 유무를 확인하였다. 그 결과, 환자 혈장내 존재하는 D-다이머의 양에 따라 정량적으로 흡광도가 증가하였으며 이 결과에 따라 정상군과 환자군으로의 판별도 가능하였다.(도 4)

실시예7: C3/B4를 이용하여 제조한 ELISA 진단방법과 기존의 상업용 진단시약의 비교

a. DIC 의심 환자군과 정상인 군의 D-다이머 비교 검사

상기 실시예6에서와 같은 방법으로 DIC 의심환자 군과 정상환자 군의 혈장을 대상으로 검사하였으며 상업용 진단시약(AGEN사)도 설명서에 기술되어 있는 방법에 의거하여 실험하여 각 환자 시료들의 검사 결과인 흡광도를 비교함으로서 linearity를 구하였다(도5). 그 결과 두 측정방법이 동일한 물질, 즉 D-다이머를 대상으로 검사하고 있으며 그 상관성도 매우 높음을 알 수 있었다. 다만 몇 종류의 DIC 의심 환자의 경우, 우리의 ELISA 결과가 상업용 진단시약 결과보다 상당히 높게 측정되었는데, 이 환자 시료들은 모두 PTT 지연 증상과 혈소판, 피브리노겐 양의 감소, D-다이머 양성 등의 결과에 근거하여 급성 DIC 환자로 판정된 환자 시료들이었으므로 우리의 검사 결과가 더 신뢰 할 만 하다고 판단되었다.

b.단일항체 DD3B6/22와 B4 칼럼을 이용한 상업용진단시약과의 차이 분석

실시예7 에서 언급한 바와 같이 상업용진단시약과 우리의 ELISA 방법 간에 비교적 큰 차이를 나타내는 경우에 관하여 연구하였다. 상업용 진단시약에서 사용되고 있는 DD3B6/22 단일항체와 B4 단일항체를 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)로 활성화시킨 세파로스(sepharose) 수지에 van Sommeren의 방법에 의거하여 고착화시켜 각각 칼럼을 제조하였다. 이렇게 제조한 칼럼에 실시예6에서 상이한 결과를 나타내었던 3종류의 혈장(도 8, 도 9의 혈장시료 1, 2, 3)을 통과시킨 후 그 용리(elution) 분획을 SDS-PAGE하여 각 단일항체가 인지하는 D-다이머의 양상을 확인하여 보았다. 도 8에서와 같이 B4 칼럼에 의하여 용리된 시료 1, 2, 3의 분획에는 교차결합된 감마-감마 체인들, 베타체인들의 밴드가 확연히 나타나는 반면DD3B6/22칼럼에 의하여 용리된 분획에서는 이러한 밴드들이 존재하지 않거나 매우 희미하였다. 80KDa 이상의 감마-감마 체인이 나타난 것으로 보아 교차결합성 피브린이 완전히 분해되지 않은 형태로 존재함을 의미한다. 두 검사 방법 의 ELISA 결과가 거의 동일한 혈장시료 4의 경우 역시 같은 방법으로 두 칼럼에 의하여 용리된 분획을 확인하여 보았는데 이 경우는 두 칼럼 모두 유사한 밴드 양상을 보였다. 이 결과를 근거로 일부 환자 혈장들 내에는 피브린 분해산물들이 D-다이머로 완전히 분해되지 않고 교차결합성 피브린 또는 그 분해조각들로 존재하고 있어서 이런 단백질들을 인지하지 못하는 DD3B6/22의 경우 또는 이를 이용한 진단시약의 경우 D-다이머의 양이 실제보다 낮게 측정되는 결과를 초래한다(참조, Carl E.D., Thromb Haemost 2001 85:671-678)..

c. 플라스민 처리한 DIC 의심 환자 혈장 내의 ELISA 시그널 변화

실시예1에서 예시한 방법대로 플라스민을 환자혈장 1, 2, 3, 4에 처리하여 분해가 덜 된 교차 결합성 피브린을 인위적으로 분해시킨 후 다시 ELISA 진단시약을 통해 검사하여 보았다. 도 9에 명시한 바와 같이 플라스민이 처리된 환자 혈장 1, 2, 3의 경우에는 상업용 진단시약으로 검사하였을 때 그 시그널이 상당히 증가하였으나 우리의 C3/B4 ELISA 방법으로 진단하였을 때는 비슷한 거나 감소하는 것을 알 수 있다. 따라서 우리의 ELISA 진단방법은 D-다이머 뿐만 아니라 교차결합성 피브린 및 그 분해산물도 검출할 수 있는 특성을 가지고 있으며 이것은 장기간 혈전증을 가지고 있는 환자나 혈전 치료 초기의 환자와 같이 혈장내에 고분자량의 교차결합성 피브린이 다량 존재하는 개체의 진단에 특히 유용하다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 항-D-다이머 단일 클론항체는 IgG1 타입의 카파 라이트체인(kappa light chain)으로 사람의 D-다이머에 특이적으로 반 응하며 구조적으로 유사한 다른 단백질과는 교차 반응성이 나타나지 않으며, 당 에피톱을 포함하고 있는 고분자량의 교차결합성 피브린과도 특이적으로 반응하므로 단지 D-다이머에 특이적인 기존의 항체들에 비하여 DIC 의심 환자들의 진단에 보다 유용한 항체이다. 본 발명의 단일클론항체는 높은 역가로 제조되었으며 D-다이머에 매우 특이적으로 결합하므로 조직이나 혈관내의 탐색 및 검사를 위한 진단시약으로 유용하게 이용될 수 있으며 특히 파종성혈관내응고(Disseminated intravascular coaulation, DIC), 폐경색(pulmonary embolism, PE), 각종 혈전증(thrombosis)의 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

<110> Biobud Co., Ltd. <120> Monoclonal antibody against D-dimer and diagnosis agent for detecting D-dimer, crosslinked fibrin and its derivatives containing D-dimer by using the antibody <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Asn Glu Asn Val Val Asn Glu Tyr 1 5 <210> 2 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Asn Thr Tyr Asn Arg Val Ser Glu Asp Leu Arg Ser Arg Ile Glu 1 5 10 15 Val Leu Lys Arg Lys Val Ile Glu Lys Val Gln His Ile Gln Leu Leu 20 25 30 Gln Lys Asn Val Arg Ala Gln Leu Val Asp Met Lys Arg Leu Glu Val 35 40 45 Asp Ile Asp Ile Lys Ile Arg Ser Cys Arg Gly Ser Cys Ser Arg Ala 50 55 60 Leu Ala Arg Glu Val Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Asp Gln Gln Lys Gln 65 70 75 80 Leu Glu Gln Val Ile Ala Lys Asp Leu Leu Pro 85 90

Claims

트롬빈 효소를 이용하여 사람의 피브리노겐을 피브린으로 만든 후 플라스민 효소로 잘라서 생성된 D-다이머 및 D-다이머를 포함하는 교차결합성 피브린 또는 그 분해산물에 특이적으로 반응하며, 서열번호 1에 기재된 베타 체인의 N-말단 134번-142번 아미노산 서열을 포함하는 부위 또는 서열번호 2에 기재된 N-말단 124번-214번 아미노산 서열을 포함하는 부위와 반응하는 것을 특징으로 하는 모노클로날항체.
삭제
삭제
a) 1차 항체로 제 1항의 모노클로날항체;

b) 2차 항체로 표시체를 접합시켜 제작된 상기의 모노클로날항체; 및

c) 상기 표시체와의 반응으로 발색을 유도하는 물질을 포함하는 기질을 포함하는 D-다이머 및 교차결합성 피브린 검사용 진단시약.
제 4항에 있어서, 상기의 표시체는 고추냉이 과산화효소(HRP) 또는 알칼라인 탈인산화효소(Alkaline phophatase)인 것을 특징으로 하는 진단시약.
제 5항에 있어서, 상기의 기질은 o-페닐렌디아민 또는 과산화수소수 발색제를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단시약.