CN111647085A - 抗体、其制备方法和应用 - Google Patents

抗体、其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111647085A
CN111647085A CN202010770583.1A CN202010770583A CN111647085A CN 111647085 A CN111647085 A CN 111647085A CN 202010770583 A CN202010770583 A CN 202010770583A CN 111647085 A CN111647085 A CN 111647085A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
variable region
seq
chain variable
heavy chain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010770583.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111647085B (zh
Inventor
李俊
张鹏潮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fundamenta Therapeutics Inc
Original Assignee
Fundamenta Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fundamenta Therapeutics Inc filed Critical Fundamenta Therapeutics Inc
Priority to CN202010770583.1A priority Critical patent/CN111647085B/zh
Publication of CN111647085A publication Critical patent/CN111647085A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111647085B publication Critical patent/CN111647085B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors
    • G01N2333/75—Fibrin; Fibrinogen

Abstract

本发明涉及一种抗体、其制备方法和应用，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该抗体的灵敏度和特异性均能满足检测需求，且生产成本低，可大规模应用于检测试剂盒，对人疾病早期的快速诊断具有重要意义。

Description

抗体、其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种抗体、其制备方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术
人体内的纤维蛋白原在纤溶系统激活后产生的纤溶酶的作用下，降解形成Bβ1～42肽键，A、B、C、H极附属物以及X、Y、D、E碎片，称为纤维蛋白原降解产物（FgDP）。
人体内的纤维蛋白原α（A）链和β（B）链在凝血酶的作用下，先后释放出纤维蛋白肽A（FPA）和肽B（FPB），剩余部分分别称为纤维蛋白Ⅰ（Fb-Ⅰ）和纤维蛋白Ⅱ（Fb-Ⅱ）。在纤溶酶的作用下，Fb-Ⅰ被降解成Bβ1～42肽键，A、B、C、H极附属物以及X'、Y'、D、E'碎片，Fb-Ⅱ被降解成Bβ15～42肽键，A、B、C、H极附属物以及X'、Y'、D、E'碎片；同时Fb-Ⅰ和Fb-Ⅱ可自行聚合成可溶性纤维蛋白单体聚合物（sFMC）。在FXⅢa和Ca2+作用下，Fb-Ⅰ和Fb-Ⅱ形成交联纤维蛋白；在纤溶酶作用下，交联的纤维蛋白除降解产生碎片X'、Y'、D和E'外，还生成D-二聚体（D-Dimer，DD）等。
D-二聚体反映受检者体内凝血-纤溶系统活化状况，与多种疾病密切相关。在临床检测过程中，它们受到诸多因素的影响，常会造成假阳性或假阴性的结果，而降低临床应用的敏感性和特异性，直接影响临床的诊断。
因此，一种高效的检测D-二聚体的抗体对于疾病早期的快速诊断具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗体、其制备方法和应用，其灵敏度和特异性均能满足检测需求，对人疾病早期的快速诊断具有重要意义。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种抗人D-二聚体抗体，所述抗人D-二聚体抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗人D-二聚体抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述抗体作用的抗原为人D-二聚体。
进一步地，所述重链可变区具有三个高变区：HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
进一步地，所述轻链可变区具有三个高变区：LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供一种制备所述的抗人D-二聚体抗体的方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、以人D-二聚体来使小鼠产生免疫反应，得到免疫小鼠；
S2、将所述免疫小鼠的脾脏细胞和骨髓瘤细胞进行融合，得到杂交瘤细胞；
S3、对所述杂交瘤细胞进行筛选分离，得到抗人D-二聚体抗体的杂交瘤细胞株；
或者，包括以下步骤：
S1’、提供携带编码所述抗人D-二聚体抗体的DNA的宿主细胞；
S2’、逆转录所述宿主细胞的总RNA，得到cDNA；
S3’、以所述cDNA为模板，通过PCR扩增得到所述抗人D-二聚体抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA序列；
S4’、通过DNA重组得到插入了所述重链可变区和轻链可变区的DNA序列的表达载体；
S5’、通过基因转染将所述表达载体转染CHO细胞。
进一步地，步骤S3’中，所述PCR扩增过程中，所采用的引物包括：
重链F：5’-GACGGTGATATCAAGCTGCAGCAGTCTGG-3’；
重链R：5’-GATAAGGGATCCTGAGGAGACGGTGACCG-3’；
轻链F：5’-CAGATGCCATGGCGATTGTCCTGACTCAGTCTCCA-3’；
轻链R：5’-GATGACAAGCTTCGTTGGATCTCCAGCTTG-3’。
进一步地，步骤S4’中，在构建所述表达载体中，载体采用pSRNC-C质粒。
本发明还提供一种根据所述的抗人D-二聚体抗体在用于制备检测人D-二聚体含量的试剂盒中的应用。
本发明还提供一种试剂盒，其包括所述的抗人D-二聚体抗体。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明抗人D-二聚体抗体的灵敏度和特异性均能满足检测需求，且生产成本低，可大规模应用于检测试剂盒，对人疾病早期的快速诊断具有重要意义。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为本发明实施例三中抗人D-二聚体抗体的特异性检测效果图；
图2为本发明实施例五中抗人D-二聚体抗体与西门子Innovance比对拟合曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下述实施例中，“抗体”又称免疫球蛋白，是一类由B淋巴细胞分泌的大型Y形蛋白质，能够通过Y形的其中两个分叉顶端的互补位点(抗原结结合位)特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，所述靶抗原如蛋白质、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。
互补决定区(complementarity-determining region，CDR)，也叫做高变区。成型于抗体单体氨基酸的末端，是靶抗原与抗体结合的最关键区域，在免疫网络理论中，每个抗体的互补决定区又被称为独特型或者基因型。
实施例一抗人D-二聚体杂交瘤细胞株的制备
1 .动物免疫
以天然人D-二聚体(购买于Meridian公司)按照一般免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠(购自常州卡文斯实验动物有限公司)。具体免疫情况参见《抗体制备与使用实验指南》。采用间接ELISA法跟踪免疫小鼠血清滴度，选取血清效价最高的免疫小鼠，进行小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合实验。
2 .细胞融合
(1) 脾脏细胞的制备
将免疫小鼠，摘眼球取血，经断颈椎处死后置于75％(v/v)的酒精中浸泡10分钟，于无菌操作台中取出其脾脏，置于细胞筛网中，充分研磨细胞，过筛网，用无菌1640培养基(购自Gibco公司)离心洗涤数次后，重悬细胞以制成单细胞悬液，并计数，备用。
(2) 饲养细胞的制备
取8～10周龄的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球获取阴性血清，经断颈椎处死后置75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌揭开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约10mL 1640HT培养基(购自SIGMA公司)注入小鼠腹腔，轻轻按摩腹部并吹打数次。吸取含有巨噬细胞的培养基注入20％1640HAT培养基中备用；取2～3周龄的雌性BALB/c小鼠一只，经断颈椎处死后置于75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌取胸腺于细胞筛网中，研磨，过筛网，获得胸腺细胞置于上述含有巨噬细胞的20％1640HAT培养基中，备用。
(3)细胞融合
选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0，收集并计数。取约108个上述脾细胞与2×107个上述SP2/0细胞株加入融合管中混合，1000rpm离心10分钟后弃上清(尽量弃净)，将融合管置手掌上来回轻轻摩擦以使沉淀松散。60秒内先慢后快地加入1mL预热的PEG1450(聚乙二醇1450，购自SIGMA公司)，加入1640HT培养基30mL终止，1000rpm离心10分钟，去上清，轻轻摩擦使沉淀松散，加入步骤2所获得的20％的1640HAT培养基中。将上述HAT培养基充分混匀后，以200μL/孔分装至96孔细胞培养板中，置37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。一周后用10％1640HT培养基替换20％1640HAT培养基，3天后取上清进行检测。
3 .抗人D-二聚体特异性杂交瘤株筛选
(1) 检测板的准备：用CB包被液稀释天然人D-二聚体(购买于Meridian公司)至1μg/mL，包被96孔ELISA酶标板，100μL/孔，2～8℃包被过夜，洗涤一次拍干；含2％牛血清白蛋白的PBST缓冲液封闭(200ul/孔)，37℃封闭2小时；拍干，备用。
(2) 阳性克隆的筛选：将待检细胞培养上清100μL/孔加入上述检测板中，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μL/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μL/孔的TMB显色液，于37℃避光显色15分钟，每孔加入50μL的2M H2SO4终止反应，并于OD450处读取数值。阳性孔确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1。选取阳性克隆株进行细胞克隆化筛选。经过三至四轮的克隆化筛选后，单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定细胞株，对细胞株进行定株。杂交瘤细胞株LJ002具有较高的效价，遂后续进一步对上述杂交瘤细胞株进行抗体可变区序列测序分析。
实施例二杂交瘤细胞株抗体可变区序列的测定
对上述杂交瘤细胞株LJ002抗体可变区序列进行测定。
（1）RNA的提取：参照细胞总RNA抽提试剂盒(购自Roche公司)说明书对上述杂交瘤细胞株LJ002进行总RNA提取并立即进行反转录；
（2）RNA反转录成为DNA：参照Thermo Scientific Reverted First strand cDNASynthesis Kit(购自Thermo公司)对上一步骤中所提取的总RNA进行反转录，制得cDNA，冻存于-20℃备用；
（3）可变区序列的PCR扩增及回收：以上一步骤中所得cDNA为模板，以鼠IgG亚型单克隆抗体可变区序列通用引物为引物，对重链及轻链的可变区序列进行PCR扩增，将PCR产物经DNA胶回收试剂盒(购自TIANGEN公司)进行回收；
扩增过程中，所采用的的引物为：
重链F：5’-GACGGTGATATCAAGCTGCAGCAGTCTGG-3’；
重链R：5’-GATAAGGGATCCTGAGGAGACGGTGACCG-3’；
轻链F：5’-CAGATGCCATGGCGATTGTCCTGACTCAGTCTCCA-3’；
轻链R：5’-GATGACAAGCTTCGTTGGATCTCCAGCTTG-3’；
（4）可变区序列的克隆和序列测定：按照克隆载体pMD18-T kit(购自Takara公司)说明书，将重链和轻链可变区基因分别与pMD18-T载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。测序得到杂交瘤细胞株LJ002的抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。Vbase2数据库分析上述序列，其重链可变区的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：4所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：5所示的HCDR3；其轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：7所示的LCDR2和如序列SEQ ID NO：8所示的LCDR3。
实施例三抗D-二聚体人源化嵌合抗体的表达载体转染CHO细胞表达
按《分子克隆》所述进行常规DNA重组操作，将轻链可变区克隆入pSRNC-Cκ，重链可变区克隆入pSRDC-Cγ1中的相应位点，构建成完整的抗D-二聚体人源化嵌合抗体基因的真核表达载体。CHO细胞(本室保存)采用含10％FBS、0.03mmol/l次黄嘌呤(H)、0.003mmol/l胸腺嘧啶脱氧核苷(T)、0.1mmol/l脯氨酸(Pro)、0.1mmol/l甘氨酸(Gly)、100u/ml青链霉素、2mmol/l谷氨酰胺的DMEM完全培养液在5％CO2、37℃的条件下培养，常规按1∶10传代，大约3-4天传一代。上述细胞培养试剂购自Gibco公司。采用基因转染的方法，用Lipofect AMINE试剂(Gibco公司)转染，将LJ002人源化嵌合抗体的表达载体转染细胞。
采用Western印迹实验，对LJ002人源化嵌合抗体进行还原型SDS-PAGE，转膜后，分别以羊抗人IgG Fc片段-HRP或羊抗人κ链多克隆抗体进行Western印迹，结果显示(图1)在48kD处的蛋白条带可被羊抗人IgG Fc片段-HRP识别，染出单一的特异免疫染色带，大小位置对应于抗体的重链，证明所表达的LJ002人源化嵌合抗体重链含有人的恒定区。在25kD处的蛋白条带有可被羊抗人κ链多抗所识别，出现单一的特异免疫染色带，大小位置对应于抗体轻链，表明LJ002人源化嵌合抗体含有人的κ链恒定区。
实施例四抗D-二聚体人源化嵌合抗体的特异性的鉴定
采用ELISA方法，以1μg/ml D-二聚体包被酶标板，羊抗人IgG Fc片段-HRP(Sigma公司)作二抗进行直接ELISA显色，测OD490值，转染细胞上清中蛋白A亲和层析柱纯化的抗D-二聚体人源化嵌合抗体LJ002可被包被的D-二聚体抗原结合，并被羊抗人IgG Fc片段多克隆抗体所识别，呈现强阳性反应，而对照则呈阴性反应。请参见下表1，表中结果证明所表达的LJ002人源化嵌合抗体可与D-二聚体抗原特异结合。
表1
LJ002(ng/ml) OD490
200 2.602
40 2.481
8 2.361
1.6 2.145
0.32 1.454
0.064 0.347
0.0128 0.157
0.00256 0.078
实施例五准确度—方法学比对
选择同类产品中目前市场上获得良好信誉的商品化D-二聚体检测试剂作对照产品比对验证。选择120份临床病人标本，按1到120的顺序编号，用对照产品和待评价的LJ002同时进行实验。请参见下表2和图2，对照和待评价产品的检测结果相关系数R2＝0.9434，说明两种方法检测结果有较好的相关性。
表2
西门子Innovance LJ002
0.15 0.29
0.08 0.23
0.22 0.32
1.73 1.19
0.55 0.6
0.65 0.65
0.67 0.65
0.33 0.21
0.77 0.73
0.95 0.96
0.55 0.52
1.08 1.13
4.85 5.28
1.2 1.35
3.2 2.41
2.42 2.09
0.57 0.5
0.18 0.32
0.24 0.38
0.54 0.46
0.85 0.42
2.72 2.47
1.07 0.78
0.39 0.34
0.64 0.58
0.79 0.71
1.03 0.94
1.03 0.76
2.27 2.02
0.10 0.24
1.11 0.99
0.35 0.43
0.28 0.40
0.67 0.77
1.88 2.01
0.53 0.52
0.85 0.84
1.62 1.50
0.55 0.57
0.10 0.15
0.34 0.35
0.33 0.30
0.10 0.15
0.14 0.19
0.49 0.44
0.15 0.20
1.11 1.04
1.53 1.33
1.26 1.03
1.79 1.12
1.31 0.85
0.20 0.13
0.62 0.31
0.18 0.34
0.54 0.29
0.38 0.19
0.72 0.16
0.73 0.46
0.20 0.16
0.19 0.14
0.90 0.13
0.19 0.20
0.13 0.13
0.26 0.13
0.14 0.17
0.46 0.36
0.39 0.22
0.67 0.57
2.14 1.80
2.81 1.98
1.63 1.43
1.21 1.45
1.86 1.81
0.51 0.29
0.46 0.21
0.19 0.13
0.54 0.47
0.66 0.44
2.39 2.46
0.19 0.27
0.33 0.23
0.3 0.19
0.66 0.65
0.75 0.82
3.55 3.16
0.2 0.19
0.54 0.44
0.59 0.59
4 3.97
0.71 0.56
0.42 0.25
0.44 0.37
1.03 1.11
1.52 1.37
0.33 0.23
1.96 1.6
/ 8.89
1.99 1.67
0.96 0.85
/ 5.66
0.21 0.21
2.01 2.07
0.47 0.42
1.39 1.17
4.68 3.71
0.27 0.28
1.03 0.78
0.67 0.69
2.22 2.22
2.15 2.01
3.68 3.41
0.39 0.36
0.45 0.42
1.65 1.32
3.41 3.72
4.11 4.01
4.98 5.38
0.79 0.74
0.93 1.05
0.35 0.3
综上所述：本发明抗人D-二聚体抗体的灵敏度和特异性均能满足检测需求，且生产成本低，可大规模应用于检测试剂盒，对人疾病早期的快速诊断具有重要意义。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 苏州方德门达新药开发有限公司
<120> 抗体、其制备方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Leu Met Lys Pro Gly Glu Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Asn Thr Leu Thr Asp Asn
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Pro Leu Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Thr Ala Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Phe Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Lys Val Arg Val Lys Tyr Phe Ser Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Glu Trp Lys Ser Gly Pro Cys Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Asn Thr Leu Thr Asp Asn Trp
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 4
Ile Leu Pro Gly Pro Leu Gly Thr
1 5
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Arg Arg Gly Lys Val Arg Val Lys Tyr Phe Ser Tyr
1 5 10
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Ser Tyr Val Ser Tyr
1 5
<210> 7
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 7
Ser Thr Ser
1
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 8
His Glu Trp Lys Ser Gly Pro Cys Thr
1 5

Claims (7)

1.一种抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述抗体作用的抗原为人D-二聚体。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区具有三个高变区：HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链可变区具有三个高变区：LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
4.一种如权利要求1至3中任一项所述的抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1’、提供携带编码所述抗体的DNA的宿主细胞；
S2’、逆转录所述宿主细胞的总RNA，得到cDNA；
S3’、以所述cDNA为模板，通过PCR扩增得到所述抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA序列；
S4’、通过DNA重组得到插入了所述重链可变区和轻链可变区的DNA序列的表达载体；
S5’、通过基因转染将所述表达载体转染CHO细胞。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S3’中，所述PCR扩增过程中，所采用的引物包括：
重链F：5’-GACGGTGATATCAAGCTGCAGCAGTCTGG-3’；
重链R：5’-GATAAGGGATCCTGAGGAGACGGTGACCG-3’；
轻链F：5’-CAGATGCCATGGCGATTGTCCTGACTCAGTCTCCA-3’；
轻链R：5’-GATGACAAGCTTCGTTGGATCTCCAGCTTG-3’。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S4’中，在构建所述表达载体中，载体采用pSRNC-C质粒。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体在用于制备检测人D-二聚体含量的试剂盒中的应用。
CN202010770583.1A 2020-08-04 2020-08-04 抗体、其制备方法和应用 Active CN111647085B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010770583.1A CN111647085B (zh) 2020-08-04 2020-08-04 抗体、其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010770583.1A CN111647085B (zh) 2020-08-04 2020-08-04 抗体、其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111647085A true CN111647085A (zh) 2020-09-11
CN111647085B CN111647085B (zh) 2020-11-03

Family

ID=72345574

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010770583.1A Active CN111647085B (zh) 2020-08-04 2020-08-04 抗体、其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111647085B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115948342A (zh) * 2022-12-19 2023-04-11 山东大学 一种cho细胞株、d-二聚体单克隆抗体及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100842121B1 (ko) * 2004-02-09 2008-07-01 (주)바이오버드 Ｄ-다이머에 대한 단일클론 항체와 이를 이용한 ｄ-다이머및 교차결합성 피브린 또는 이를 포함하는 피브린 분해물검사용 진단시약
US20090298100A1 (en) * 2005-07-29 2009-12-03 Hyun-Ju Doh Monoclonal Antibody Against D-Dimer and Diagnosis Agent for Detecting D-Dimer, Crosslinked Fibrin and its Derivatives Containing D-Dimer by Using the Antibody
CN102010472A (zh) * 2010-10-22 2011-04-13 上海贝西生物科技有限公司 一种抗d-二聚体单克隆抗体及其用途
CN109053893A (zh) * 2018-08-15 2018-12-21 苏州智维安生物技术有限公司 一种抗d-二聚体单克隆抗体及其制备方法
CN110028582A (zh) * 2019-04-29 2019-07-19 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 抗人d-二聚体抗体及其应用
CN110078823A (zh) * 2019-04-29 2019-08-02 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 抗人D-Dimer抗体及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100842121B1 (ko) * 2004-02-09 2008-07-01 (주)바이오버드 Ｄ-다이머에 대한 단일클론 항체와 이를 이용한 ｄ-다이머및 교차결합성 피브린 또는 이를 포함하는 피브린 분해물검사용 진단시약
US20090298100A1 (en) * 2005-07-29 2009-12-03 Hyun-Ju Doh Monoclonal Antibody Against D-Dimer and Diagnosis Agent for Detecting D-Dimer, Crosslinked Fibrin and its Derivatives Containing D-Dimer by Using the Antibody
CN102010472A (zh) * 2010-10-22 2011-04-13 上海贝西生物科技有限公司 一种抗d-二聚体单克隆抗体及其用途
CN109053893A (zh) * 2018-08-15 2018-12-21 苏州智维安生物技术有限公司 一种抗d-二聚体单克隆抗体及其制备方法
CN110028582A (zh) * 2019-04-29 2019-07-19 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 抗人d-二聚体抗体及其应用
CN110078823A (zh) * 2019-04-29 2019-08-02 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 抗人D-Dimer抗体及其应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115948342A (zh) * 2022-12-19 2023-04-11 山东大学 一种cho细胞株、d-二聚体单克隆抗体及其应用
CN115948342B (zh) * 2022-12-19 2023-10-03 山东大学 一种cho细胞株、d-二聚体单克隆抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111647085B (zh) 2020-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111051347B (zh) Tigit抗体、其抗原结合片段及医药用途
CN1054609C (zh) 识别表皮生长因子受体的人源化和嵌合体单克隆抗体
CN110914304B (zh) Cd96抗体、其抗原结合片段及医药用途
AU776464B2 (en) Monoclonal antibodies, antigens and diagnosis and therapy of malignant diseases
CA3056474A1 (en) B7-h3 antibody, antigen-binding fragment thereof and medical use thereof
CN111744013B (zh) 抗tigit抗体联合pd-1抑制剂治疗疾病的方法和药物组合
CN105801701B (zh) 一种pcsk9抗体的重链和轻链可变区及其应用
CN112500485A (zh) 一种抗b7-h3抗体及其应用
CN111808193B (zh) 可结合人cd38的纳米抗体及其应用
CN114478784B (zh) 一种eno2单克隆抗体1c5及其制备方法和应用
CN111647085B (zh) 抗体、其制备方法和应用
CN109535255B (zh) 一种抗人cd26抗体及其在检测试剂盒中的应用
CN112538115A (zh) 一种抗人bcma纳米抗体及其制备方法和应用
CN109608542B (zh) 抗人ngal抗体及其在检测试纸卡中的应用
CN114057878B (zh) 降低单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法
CN114605536B (zh) 降低抗人胸腺基质淋巴细胞生成素单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法
CN113999301B (zh) 抗SARS-CoV-2(COVID-19)S蛋白RBD单克隆抗体
CN114560940B (zh) 一种抗SIRPα兔重组单克隆抗体及其制备方法和应用
CN112876562B (zh) 抗人血清白蛋白抗体及其应用
CN112159473B (zh) 重组人源化抗人白介素23单克隆抗体的纯化方法
CN109709340B (zh) 人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白定量检测卡及其临床应用
CN108359010B (zh) 抗人视黄醇结合蛋白抗体及其应用
CN109709337B (zh) 人cd26的免疫组化检测试剂盒及其临床应用
CN114478783B (zh) 一种eno2单克隆抗体及其制备方法和应用
CN114426582B (zh) 一种神经特异性烯醇化酶单克隆抗体及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant