CN114605536B

CN114605536B - 降低抗人胸腺基质淋巴细胞生成素单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法

Info

Publication number: CN114605536B
Application number: CN202111455042.0A
Authority: CN
Inventors: 戴长松; 李帅; 朱华杰; 戴璐; 唐宇杰; 李梦茹; 何勇梅; 吴亦亮
Original assignee: Jiangsu Quanxin Biomedical Co ltd
Current assignee: Jiangsu Quanxin Biomedical Co ltd
Priority date: 2021-11-01
Filing date: 2021-12-01
Publication date: 2023-08-29
Anticipated expiration: 2041-12-01
Also published as: CN114605536A

Abstract

本申请公开一种降低抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法，包括如下步骤：制备抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的发酵液；将第一缓冲溶液和亲和层析介质混合，从而得到平衡好的亲和层析介质，然后将抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的发酵液与平衡好的亲和层析介质混合，得到混合溶液；将混合溶液进行第一次洗脱，接着进行第二次洗脱，从而除去宿主细胞蛋白，得到抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体。该方法简单易行，能够进行放大纯化生产，细胞发酵上清液无需进行前处理，洗脱样品得率较高，同时HCP残留量也保持在较低水平，从而减轻之后纯化步骤中去除HCP的压力。

Description

降低抗人胸腺基质淋巴细胞生成素单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法

技术领域

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种降低抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法。

背景技术

抗体药物生产过程中亲和纯化是非常关键的一个工艺步骤，该过程对发酵液中的抗体进行捕获浓缩，实现抗体粗纯化的第一步。在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等基因工程细胞株大批量发酵过程中，细胞在不同的生理周期会有凋亡裂解，释放宿主细胞蛋白(Hostcell protein，HCP)。HCP是指来源于宿主细胞的蛋白成分，包括宿主细胞结构蛋白和转化蛋白(细胞分泌的促生长蛋白)。HCP不仅有可能诱导机体产生抗HCP抗体，引起过敏反应，还有可能有“佐剂效应”引起机体对蛋白质药物产生抗体，影响药物治疗效果，定量测定基因工程药物中残留的HCP是质量控制的一种重要手段，有助于保持纯化工艺的有效性和一致性。在抗体亲和纯化中，保证高效率的抗体回收率的同时，要对发酵过程中工程细胞所产生的HCP进行有效去除。因此，研究出一种能广泛应用于抗体大规模发酵后较为经济可行的抗体亲和纯化工艺，对于抗体药物的进一步产业化推广是极其有意义的，

目前能够进行HCP残留去除的方法较多，各有特点：1)层析方式：包括ProteinA亲和层析，阴、阳离子层析，三种层析工艺中对HCP的去除能力，ProteinA亲和层析为基础，去除能力较强，是HCP去除的主要步骤，阴、阳离子层析则主要作为后续HCP的进一步再去除工艺。层析方式去除 HCP的工艺在不断完善过程中，各种层析工艺在不断的提出应用实际生产，是HCP去除的主要手段；2)切向流超滤方式：对于HCP的去除能力有限，且不易控制残留量，工艺控制系数不高，只能作为去除HCP的辅助工艺；3) 聚合物沉淀方式：PEG、聚丙烯酸等高聚合物在较广的PH范围内带正电荷，通过电荷作用同抗体结合形成沉淀，而HCP由于等电点较低，不易发生沉淀。沉淀抗体样品的HCP含量明显降低，但该工艺不适于工艺放大，且沉淀对抗体的活性可能有一定影响。因此，目前去除HCP的工艺方法虽然众多，但是由于各项目的抗体的样品发酵工艺及抗体性质的不同，需进行综合考虑选择工艺。

发明内容

为了解决抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白(HCP)残留问题，本申请提供了一种抗体纯化生产中有效降低 CHO宿主细胞蛋白(HCP)的新方法，可以广泛适用于抗体亲和纯化工艺中，且所使用的材料成本价格较低，易于工艺放大。在本申请中，主要通过抗体亲和层析第一次洗脱来有效降低HCP含量，满足抗体药物的大规模高质量纯化制备要求，保证抗体药物的临床使用的安全。

本申请具体技术方案如下：

本申请提供一种降低抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法，包括下述步骤：

制备抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的发酵液；

将第一缓冲溶液和亲和层析介质混合，从而得到平衡好的亲和层析介质，然后将所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的发酵液与所述平衡好的亲和层析介质混合，得到混合溶液；

将所述混合溶液进行第一次洗脱，接着进行第二次洗脱，从而除去宿主细胞蛋白，得到抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体；

所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3)和三个轻链互补决定区 (CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3)，其中：

CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；

CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

在本申请中，所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

在本申请中，所述亲和层析介质选自配基交联到琼脂糖、聚乙烯醚、羟基化聚醚树脂、聚丙烯酸树脂、聚苯乙烯二乙烯苯基树脂、聚甲基丙烯酸树脂、聚苯乙烯树脂、羟基磷灰石或玻璃基质上的层析介质中的一种，优选为配基交联到聚乙烯醚的层析介质；

优选地，所述配基为Protein A、Protein G或Protein L，进一步优选为ProteinA。

在本申请中，所述第一缓冲溶液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液中的一种，所述第一缓冲溶液中的盐浓度为5mM-0.25M， pH为5.5-8.0。

在本申请中，所述混合溶液进行第一次洗脱时，采用第一次洗脱溶液进行洗脱；

所述第一次洗脱溶液为中性缓冲液和/酸性缓冲液；

优选地，所述中性缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种；

优选地，所述酸性缓冲液选自柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液或柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中的一种；

优选的，所述第一次洗脱溶液的pH为5.0-7.5。

在本申请中，在所述第一次洗脱溶液中加入预洗脱活性剂；

所述预洗脱活性剂选自盐酸胍、聚山梨酯80或氯化钠中的一种，优选为盐酸胍。

在本申请中，所述盐酸胍的浓度为0.01-1M。

在本申请中，在所述第一次洗脱后，在进行第二次洗脱之前还包括使用第二缓冲溶液进行平衡所述第一洗脱后溶液。

在本申请中，所述第二缓冲溶液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液中的一种。

在本申请中，在进行第二次洗脱时，采用第二次洗脱溶液进行洗脱；

所述第二次洗脱溶液选自柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸-HCl缓冲液和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的一种或两种以上，优选为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；

所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的pH为2.9-3.8。

本申请所述的亲和工艺简单易行，能够进行放大纯化生产，细胞发酵上清液无需进行前预处理，洗脱样品得率较高，同时HCP残留量也保持在较低水平(残留控制量不高于0.1％)，从而减轻之后纯化步骤中去除HCP的压力，从而保证抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体最终样品的HCP残留量处于极低水平。同时，在本申请中，经过对不同批次发酵上清液进行亲和纯化工艺验证，证明本申请中的亲和纯化工艺具有良好的稳定性。

所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体与现有技术中的抗人TSLP单克隆抗体(Tezepelumab为安进/阿斯利康公司研发的靶向 TSLP的单克隆抗体药物，Tezepelumab治疗重度哮喘的三期临床 NAVIGATOR获得成功)相比，结合TSLP的亲和力相当，且细胞水平的中和活性优于Tezepelumab。

本申请的抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体，在细胞水平显示出优于Tezepelumab(根据专利公开序列表达制备)的中和活性，其有望在预防和治疗相关疾病方面展现出良好的临床效果。

附图说明

图1是显示构建HZD8G2-57瞬转表达质粒的核酸电泳结果的图。其中， M：Marker；条带1：PCR产物8G2VH-Hu27；条带2：pHZDCH，HindIII/NheI；条带3：PCR产物8G2VK-Hu14；条带4：pHZDCK，HindIII/BsiWI。

图2是瞬转表达流程图。

图3是QX008N(HZD8G2-57)的电泳检测图。

图4是显示QX008N和Tezepelumab中和人TSLP诱导 SW756-STAT5-Luciferase细胞中STAT5磷酸化的活性图。

图5是显示QX008N和Tezepelumab中和天然TSLP诱导的 SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性图。

图6是显示QX008N和Tezepelumab中和食蟹猴TSLP诱导的 SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性图。

图7是显示QX008N和Tezepelumab中和人TSLP诱导人全血释放TARC (CCL17)活性图。

图8是显示QX008N和Tezepelumab中和人TSLP诱导人PBMC细胞释放TARC(CCL17)活性图。

具体实施方式

以下对本申请的示范性实施例做出说明，其中包括本申请实施例的各种细节以助于理解，应当将它们认为仅仅是示范性的。因此，本领域普通技术人员应当认识到，可以对这里描述的实施例做出各种改变和修改，而不会背离本申请的范围和精神。同样，为了清楚和简明，以下的描述中省略了对公知功能和结构的描述。

需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

在本申请中，“单克隆抗体”表示得自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其它示例性的制备单克隆抗体的方法。

在本申请中，“亲和力”表示分子(例如，抗体)的单个结合位点和它的结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则本说明书中使用的“结合亲和力”表示反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力通常可以由平衡解离常数(K_D)表示。通过本领域已知的常见方法，可以测量亲和力。

哺乳动物细胞

本申请所述单克隆抗体体外发酵生产使用的哺乳动物细胞包括但不限于目前通用的各种杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，优选的是CHO 细胞。

本申请提供了一种降低抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法，包括下述步骤：

步骤一：制备抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的发酵液；

步骤二：将第一缓冲溶液和亲和层析介质混合，从而得到平衡好的亲和层析介质，然后将所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的发酵液与所述平衡好的亲和层析介质混合，得到混合溶液；

步骤三：将所述混合溶液进行第一次洗脱，接着进行第二次洗脱，从而除去宿主细胞蛋白，得到抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体。

CDR-H1(在本说明书中CDR-H1表示重链CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1(SYYMS)所示；

CDR-H2(在本说明书中CDR-H2表示重链CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2(FISYGGSAYHATWAQG)所示；

CDR-H3(在本说明书中CDR-H3表示重链CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：3(EFRSMTYGAEWGI)所示；

CDR-L1(在本说明书中CDR-L1表示轻链CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：4(QASESIYDTLA)所示；

CDR-L2(在本说明书中CDR-L2表示轻链CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO：5(SASSLAS)所示；

CDR-L3(在本说明书中CDR-L3表示轻链CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：6(QQGYTMPDVDKNP)所示。

所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其氨基酸序列为 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYYMSWVRQAPGKGLEWV GFISYGGSAYHATWAQGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR EFRSMTYGAEWGIWGQGTLVTVSS；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，其氨基酸序列为 AYQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASESIYDTLAWYQQKPGKAPKLLIYS ASSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYTMPDVDKN PFGGGTKVEIK。

在本申请中，人胸腺基质淋巴细胞生成素(Human Thymic StromalLymphopoietin，TSLP)表示一种源自人的细胞因子，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，其中，下划线部分表示信号肽。

SEQ ID NO：9：

MFPFALLYVLSVSFRKIFILQLVGLVLTYDFTNCDFEKIKAAYLSTISKDLI TYMSGTKSTEFNNTVSCSNRPHCLTEIQSLTFNPTAGCASLAKEMFAMKT KAALAIWCPGYSETQINATQAMKKRRKRKVTTNKCLEQVSQLQGLWRR FNRPLLKQQ

在本申请中，“抗人TSLP单克隆抗体”表示这样的单克隆抗体：其能够以足够的亲和力结合人TSLP，使得所述单克隆抗体可用作靶向人TSLP的诊断剂和/或治疗剂。

本申请的抗人TSLP单克隆抗体与靶标无关的蛋白不结合。这里，“无关的蛋白”是指除作为靶标的人TSLP以外的其他蛋白；这里，“不结合”是指：在将本申请的抗人TSLP单克隆抗体与作为其靶标的人TSLP的结合能力作为100％的情况下，本申请的抗人TSLP单克隆抗体与所述无关蛋白的结合能力小于10％，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。

本申请的抗人TSLP单克隆抗体与其他动物种属的TSLP可以不结合。这里，“其他动物种属”是指除人以外的其他动物种属，例如狨猴、食蟹猴、猪、犬、兔、大鼠、小鼠、豚鼠等；这里，“不结合”是指：在将本申请的抗人TSLP单克隆抗体与作为其靶标的人TSLP的结合能力作为100％的情况下，本申请的抗人TSLP单克隆抗体与其他动物种属的TSLP的结合能力小于10％，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。

本申请的人TSLP单克隆抗体具有≤1μM、≤100nM、≤50nM、≤40nM 的平衡解离常数(KD)。

实验结果显示，本申请的抗人TSLP单克隆抗体可以特异性结合人TSLP。

本申请的抗人TSLP单克隆抗体在诸多生物活性方面与上市同类单克隆抗体产品相当、或优于上市同类单克隆抗体产品。所述生物活性例如中和人、天然、食蟹猴TSLP诱导细胞中STAT5磷酸化的活性、中和人TSLP诱导人全血、人PBMC细胞释放TARC(CCL17)的活性等。

在一个具体实施方式中，本申请的抗人TSLP单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。

SEQ ID NO：10

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSYYMSWVRQAPGKGLEWV GFISYGGSAYHATWAQGRFTISKDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR EFRSMTYGAEWGIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPGK

SEQ ID NO：11

AYQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASESIYDTLAWYQQKPGKAPKLLIYS ASSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYTMPDVDKN PFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

其中，SEQ ID NO：10和11均为经人源化的序列。

在本申请中，“分离的”核酸表示已经与它的天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但是所述核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置。

在本申请中，“分离的编码抗TSLP单克隆抗体的核酸”表示编码抗体重链和轻链的一个或多个核酸分子，包括在单个载体或分开的载体中的这样的核酸分子、以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置的这样的核酸分子。

在本申请中，“载体”表示能够扩增与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及整合进它已经引入其中的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这样的载体在本文被称为“表达载体”。

在本申请中，“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养”可互换使用，且表示其中已经引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和由其来源的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内容物方面可以与亲本细胞不完全相同，但是可以含有突变。针对最初转化的细胞筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体后代被包括在本说明书中。

在本申请中，“药物组合物”表示这样的制品：其呈现使得包含在其中的活性成分的生物活性能够发挥效果的形式，并且所述组合物不含有对所述制剂要施用的受试者有不可接受的毒性的额外组分。

在本申请中，“药学上可接受的载体”表示药物组合物中除了活性成分之外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的载体包括、但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

在本申请书中，“单克隆抗体”一般为人抗体，其可以使用本领域技术人员公知的技术来制备，例如，人抗体一般描述于van Dijk,M.A.andvande Winkel,J.G.,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-374(2001)及Lonberg,N.,Curr. Opin.Immunol.20:450-459(2008)。

可以通过向已经经过修饰而对抗原攻击刺激生产完整人抗体或具有人类可变区的完整抗体的转基因动物施用免疫原来制备抗体，这些动物通常含有一部分或全部的人类免疫球蛋白基因座，其替换了内源免疫球蛋白基因座，或者存在于染色体外或随机整合于动物体内。在此类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座一般已经失活，关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,N.,Nat.Biotech.(自然生物技术)23:1117-1125(2005)。还可参见例如美国专利No.6,075,181和No.6,150,584描述的XENOMOUSE^TM技术；美国专利No.5,770,429描述的技术；美国专利No.7,041,870 描述的/>技术，和美国专利申请公开文本No.US 2007/0061900 描述的/>技术。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。

还可以通过基于杂交瘤的方法来制备人抗体。已描述了用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人杂交骨髓瘤细胞(参见例如Kozbor,D.,J. Immunol.133:3001-3005(1984)；Brodeur,B.R.等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987), pp.51-63；Boerner,P.等，J.Immunol.147:86-95(1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生产的人抗体也记载于Li,J.等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA103:3557-3562(2006)。其他方法包括那些记载于例如美国专利No. 7,189,826(其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)以及Ni,XiandaiMianyixue,26(4)；265-268(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma 技术)也记载于Vollmers,H.P.and Brandlein,S.,Histology and Histopathology 20:927-937(2005)；Vollmers,H.P.and Brandlein,S.,Methods and Findings in ExperimentalandClinical Pharmacology 27:185-191(2005)。

还可通过分离选自来源于人的噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来生成人抗体，然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。

还可以基于自抗体文库选择人抗体，即可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离人抗体。例如，用于生产噬菌体展示文库及对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域已知的。这种方法综述于例如Hoogenboom,H.R.等，Methods in Molecular Biology 178:1-37(2001)，并且进一步记载于例如McCafferty,J.等，Nature 348:552-554(1990)；Clackson,T.等，Nature 352:624-628(1991)；Marks,J.D. 等，J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks,J.D.andBradbury,A.,Methods in Molecular Biology 248:161-175(2003)；Sidhu,S.S.等，J.Mol.Biol. 338:299-310(2004)；Lee,C.V.等，J.Mol.Biol.340:1073-1093(2004)；Fellouse, F.A.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:12467-12472(2004)；及Lee,C.V.等，J. Immunol.Methods284:119-132(2004)。

在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆VH和 VL基因的全集，并在噬菌体文库中随机重组，然后在所述噬菌体文库中筛选抗原结合性噬菌体，如记载于Winter,G.等，Ann.Rev.Immunol. 12:433-455(1994)。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆未免疫全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由 Griffiths,A.D.等，EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由 Hoogenboom,H.R.andWinter,G.,J.Mol.Biol.227:381-388(1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如：美国专利No.5,750,373 及美国专利公开文本No.2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、 2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。

所述抗体也可以是多特异性抗体，例如双特异性抗体。双特异性抗体是对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链的重组共表达(参见Milstein,C.and Cuello,A.C.,Nature305:537-540(1983)；WO 93/08829；及Traunecker,A.等，EMBO J.10:3655-3659(1991))和“节-入-穴”工程化(参见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO 2009/089004)；交联两种或更多种抗体或片段(参见例如美国专利No.4,676,980及Brennan,M.等，Science 229:81-83(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(参见例如Kostelny,S. A.等，J.Immunol.148:1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(参见例如Holliger,P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(scFv)二聚体(参见例如Gruber,M.等，J. Immunol.152:5368-5374(1994))；及制备三特异性抗体(如例如Tutt,A.等，J. Immunol.147:60-69(1991)中所描述的)来生成多特异性抗体。

本申请中所述的单克隆抗体还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576)。

本申请中的抗体还可以包括WO 2009/080251、WO 2009/080252、 WO2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、 WO2010/136172、WO 2010/145792、及WO 2010/145793、WO 2011/117330、 WO 2012/025525、WO 2012/025530、WO 2013/026835、WO2013/026831、 WO 2013/164325、或WO 2013/174873中记载的多特异性抗体。

本申请中所述的单克隆抗体也可以是抗体变体，例如，可能期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将适宜的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如抗原结合。因此，在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体，用于置换突变的感兴趣的位点包括HVR 和FR，例如，可将氨基酸置换引入感兴趣的抗体中并筛选具有所需活性的产物，例如，保留/改善的抗原结合性，降低的免疫原性，或改善的ADCC 或CDC。

所述配基可与单克隆抗体特异性地结合。

在本申请中，对亲和填料没有限制，其可以根据本领域技术人员的需要进行确认，例如，亲和填料可以为GE healthcare的Mabselect、Mabselect Sure，博格隆生物技术有限公司的ProteinADiamond、MERCK的A。

在本申请中，所述第一缓冲溶液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液中的一种。对于第一缓冲溶液中的盐浓度，本申请不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如所述第一缓冲溶液中的盐浓度为5mM-0.25M，pH为5.5-8.0。

具体地，所述第一缓冲溶液中的盐浓度可以为5mM、10mM、20mM、 50mM、0.1M、0.15M、0.2M或0.25M等。

具体地，pH可以为5.5、6、7或8等。

在本申请中，所述第一缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或Tris-盐酸缓冲液，更优选的，在所述第一缓冲溶液中加入NaCl或Na₂SO₄来降低非抗体蛋白同填料间的非特异性吸附。

具体地，所述第一缓冲溶液中的盐浓度为5mM-0.15M，优选为 10mM-50mM，进一步优选为20mM。

对于所述第一缓冲溶液的pH值，本申请不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如所述第一缓冲溶液的pH为6.5-7.5，优选为 6.9。

对于NaCl或Na₂SO₄的加入量，其可以根据本领域技术人员的需要进行确定，对于NaCl或Na₂SO₄的浓度，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，NaCl或Na₂SO₄的浓度可以为0-250mM，优选为150mM。

具体地的，所述磷酸盐缓冲液可以为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的缓冲液。

在本申请中，当将抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体发酵液与所述平衡好的亲和层析介质结合时，使用第一缓冲溶液进行平衡。

在本申请中，所述混合溶液进行第一次洗脱时，采用第一次洗脱溶液进行洗脱。所述第一次洗脱溶液为中性缓冲液和/或酸性缓冲液。

具体地，所述中性缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种。

具体地，所述酸性缓冲液选自柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液或柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中的一种。

对于所述第一次洗脱溶液的pH值，本申请不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，所述第一次洗脱溶液的pH为5.0-7.5，优选为5.8.。

具体地，所述第一次洗脱溶液的pH可以为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0或 7.5等。

在本申请中，在所述第一次洗脱溶液中加入预洗脱活性剂。

具体地，所述预洗脱活性剂选自盐酸胍、聚山梨酯80或氯化钠中的一种，优选地，所述预洗脱活性剂为盐酸胍。

对于盐酸胍的浓度，本申请不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，所述盐酸胍的浓度为0.01-1M，优选为0.05-0.15M，进一步优选为0.1M。

具体地，所述盐酸胍的浓度可以为0.01M、0.05M、0.1M、0.15M、0.2M、 0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M或1M。

对于第一次洗脱溶液中的盐浓度，本申请不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，在一个实施方案中，所述第一次洗脱溶液中的盐浓度为0-0.5M，优选为0.1M。

例如，所述第一次洗脱溶液中的盐浓度可以为0、0.1M、0.2M、0.3M、 0.4M、0.5M等。

所述第二缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液。

优选的，所述第二缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或硼酸- 硼砂缓冲液中的一种。

优选的，在第二缓冲溶液中加入NaCl或Na₂SO₄来维持电导同时保持部分缓冲能力。

对于第二缓冲溶液中的盐浓度、第二缓冲溶液的pH以及NaCl或Na₂SO₄的浓度，本申请不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择。

具体地，所述第二缓冲溶液中的盐浓度为5mM-0.15M，优选为 10mM-50mM，进一步优选为20mM；优选的，pH值为5.5-8.0，优选为6.5-7.5，进一步优选为7.2；优选的，NaCl或Na₂SO₄的浓度为0-250mM，优选为10mM。

所述磷酸盐缓冲液例如可以为磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的缓冲液。

所述第二次洗脱溶液选自柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸-HCl缓冲液和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的一种或两种以上，优选为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。

对于第二次洗脱溶液的pH，本申请不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，在一个实施方案中，所述第二次洗脱溶液的pH 为2.9-3.8。

具体地，所述第二次洗脱溶液的pH可以为2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、 3.5、3.6、3.7或3.8等。

对于第二次洗脱溶液中的盐浓度，本申请不作任何限制，本领域技术人员可以根据需要进行选择，例如，在一个实施方案中，所述第二次洗脱溶液中的盐浓度为5-100mM，优选为10-50mM。

例如，所述第二次洗脱溶液中的盐浓度可以为5mM、10mM、20mM、 30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM等。

在本申请中，进行第二次洗脱后可以将亲和介质再生，优选的，再生缓冲液包括但不限于柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、盐酸、甘氨酸、NaOH，优选为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液及NaOH溶液。

本申请使用Protein A亲和纯化工艺简单易行，能够进行放大纯化生产，细胞发酵上清液无需进行前预处理，洗脱样品得率较高，同时HCP残留量也保持在较低水平(残留控制量不高于0.1％)，从而减轻之后纯化步骤中去除HCP的压力，从而保证抗体最终样品的HCP残留量处于极低水平。同时，申请中经过对不同批次发酵上清液进行亲和纯化工艺验证，证明本申请中的亲和纯化工艺具有良好的稳定性。

在一个实施方案中，所述单克隆抗体体外发酵生产使用的哺乳动物包括但不限于目前使用的各种杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，优选的是CHO细胞。

实施例

本申请对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1抗人TSLP单克隆抗体QX008N的制备

从上海近岸科技有限公司采购人胸腺基质淋巴细胞生成素(hTSLP)，用于免疫新西兰兔，运用B细胞克隆技术获得抗原结合特异性抗体克隆，进而筛选出结合人TSLP并具有人TSLP抑制活性的单克隆抗体。通过Binding ELISA和Blocking ELISA检测细胞上清，挑选出目标克隆。以上免疫和筛选过程委托给商业化公司完成。

先后挑选出7个克隆进行重组表达，并测序。经测定，8G2的细胞中和活性最好。因此，对8G2克隆进行人源化改造。利用NCBI IgBlast进行人 IgG胚系序列(Germline)同源性比对，选择IGHV3-66*01作为重链CDR移植模板，将8G2克隆重链的CDR区(即CDR-H1(SEQ IDNo:1)、CDR-H2(SEQ ID No:2)和CDR-H3(SEQ ID No:3))移植入IGHV3-66*01的骨架区；选择IGKV1-12*01作为轻链CDR移植模板，将8G2克隆轻链的CDR区(即 CDR-L1(SEQ ID No:4)、CDR-L2(SEQ ID No:5)和CDR-L3(SEQ ID No:6))移植入IGKV1-12*01的骨架区；对骨架区特定位点进行回复突变，获得本申请的单克隆抗体QX008N可变区。最终，人源化后的重链可变区序列如SEQ ID NO：7所示；人源化后的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

上述重链可变区(SEQ ID NO：7)的基因和轻链可变区(SEQ ID NO：8) 的基因，利用PCR扩增获得。用HindIII和NheI双酶切重链表达质粒pHZDCH；用HindIII和BsiWI双酶切轻链表达质粒pHZDCK；用Infusion重组酶将PCR 扩增基因分别插入对应的表达质粒中，构建重链表达质粒 pHZDCH-8G2VH-Hu27和轻链表达质粒pHZDCK-8G2VK-Hu14。

通过核酸电泳检测PCR扩增的可变区基因片段和双酶切的质粒结果如图1所示。根据图1的结果可以看出，抗体重链可变区和轻链可变区PCR 扩增结果以及双酶切重链和轻链表达质粒的结果，其中，重链和轻链的质粒大小约10000bp，重链可变区约477bp，轻链可变区约447bp。

将序列正确的重链表达质粒pHZDCH-8G2VH-Hu27(所表达的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示)和轻链表达质粒pHZDCK-8G2VK-Hu14(所表达的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示)共转染ExpiCHO-S细胞。转染前一天，将ExpiCHO-S细胞稀释成3×10⁶个细胞/ml进行转染前传代。转染当天，将细胞密度稀释成6×10⁶个细胞/ml，125ml摇瓶装25ml细胞，等待转染。转染和表达过程如图2所示。

转染后第6天，收获培养上清，用ProteinA进行一步纯化。用SDS-PAGE 电泳检测纯化的抗体，将其命名为QX008N(HZD8G2-57)，利用蛋白电泳检测该抗体的结果如图3所示。蛋白电泳用变性还原胶检测，图3的结果显示出有两条带，两个条带的大小分别约50kDa和25kDa，与重链(49.3kDa)和轻链(23.6kDa)理论分子量一致。

实施例2平衡解离常数(KD)的测定

用Biacore T200检测QX008N(HZD8G2-57)与人TSLP的亲和力，所有过程都在25℃进行。采用商品化Protein A芯片，通过捕获法固定适量的抗体，使得Rmax在50RU左右，捕获流速是10μl/min。将抗原进行梯度稀释，仪器流速切换成30μl/min，按照浓度从低到高的顺序依次流过参比通道和固定抗体的通道，流过缓冲液作为阴性对照。每一个结合、解离完成后用pH1.5甘氨酸再生芯片。用仪器自带分析软件选择Kinetics选项中1:1结合模型进行拟合，计算抗体的结合速率常数ka，解离速率常数kd以及解离平衡常数KD值。

除此之外，将QX008N(HZD8G2-57)与目前已经处于临床III期的针对人 TSLP的单克隆抗体，即Tezepelumab的亲和力进行比较，针对已知抗体的检测方法与对QX008N进行检测的方法相同，结果如表1所示。其中Tezepelumab根据专利US20110274687A1提供的A5序列，构建表达质粒，瞬转ExpiCHO-S细胞自制获得。

表1抗人TSLP单克隆抗体结合人TSLP的亲和力

样品名称	k_a(10⁶M^-1S^-1)	k_d(10^-5S^-1)	K_D(10^-11M)
				QX008N	1.74	2.99	1.75
Tezepelumab	2.70	6.46	2.38

表中的数据为：每个样品检测三次，计算平均值的数据。

实施例3QX008N和Tezepelumab中和人TSLP诱导的 SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性利用SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞系测定QX008N拮抗人TSLP 通过TSLPR-IL-7R介导的胞内信号分子STAT5磷酸化活性：将培养液中的细胞以每孔4×10⁴细胞加入到96孔内，然后在37℃和5％CO₂条件下培养过夜。向细胞中加入提前孵育的抗体和人TSLP混合液，其中QX008N的终浓度范围为0至50ng/ml，Tezepelumab的终浓度范围为0至400ng/ml，TSLP 的终浓度为0.5ng/ml。然后在37℃和5％CO₂条件下培养24小时，弃除细胞培养上清液，每孔加入120μl ONE-Glo-Luciferase Reagent检测试剂，作用 30min，每孔取100μl至白色96孔板，检测Luminescence荧光信号值并绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，剂量效应曲线如图4所示。

图4所示的结果显示，QX008N能够抑制人TSLP诱导 SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化，QX008N抑制人 TSLP诱导的SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性的 IC₅₀为0.837ng/ml，而Tezepelumab抑制人TSLP诱导的 SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性的IC₅₀为 3.8ng/ml。

实施例4QX008N和Tezepelumab中和天然TSLP诱导的 SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性利用SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞系测定QX008N拮抗天然TSLP 通过TSLPR-IL-7R介导的胞内信号分子STAT5磷酸化活性：将培养液中的细胞以每孔4×10⁴细胞加入到96孔内，然后在37℃和5％CO₂条件下培养过夜。向细胞中加入提前孵育的抗体和天然TSLP混合液，其中QX008N的终浓度范围为0至50ng/ml，Tezepelumab的终浓度范围为0至400ng/ml，天然TSLP的终浓度为原液稀释62.5倍。然后在37℃和5％CO₂条件下培养 24小时，弃除细胞培养上清液，每孔加入120μl ONE-Glo-Luciferase Reagent 检测试剂，作用30min，每孔取100μl至白色96孔板，检测Luminescence 荧光信号值并绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，剂量效应曲线如图5所示。

图5所示的结果显示，QX008N能够抑制天然TSLP诱导 SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化，QX008N抑制天然TSLP诱导的SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性的 IC₅₀为0.462ng/ml，而Tezepelumab抑制天然TSLP诱导的 SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性的IC₅₀为 1.45ng/ml。

实施例5 QX008N和Tezepelumab中和食蟹猴TSLP诱导的SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性利用SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞系测定QX008N拮抗食蟹猴 TSLP通过TSLPR-IL-7R介导的胞内信号分子STAT5磷酸化活性：将培养液中的细胞以每孔4×10⁴细胞加入到96孔内，然后在37℃和5％CO₂条件下培养过夜。向细胞中加入提前孵育的抗体和食蟹猴TSLP混合液，其中 QX008N的终浓度范围为0至50ng/ml，Tezepelumab的终浓度范围为0至 400ng/ml，食蟹猴TSLP的终浓度为0.5ng/ml。然后在37℃和5％CO₂条件下培养24小时，弃除细胞培养上清液，每孔加入120μl ONE-Glo-LuciferaseReagent检测试剂，作用30min，每孔取100μl至白色96孔板，检测 Luminescence荧光信号值并绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，剂量效应曲线如图6所示。

图6所示的结果显示，QX008N能够抑制食蟹猴TSLP诱导 SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化，QX008N抑制食蟹猴TSLP诱导的SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性的IC₅₀为0.889ng/ml，而Tezepelumab抑制食蟹猴TSLP诱导的SW756-STAT5-Luciferase报告基因细胞STAT5磷酸化活性的IC₅₀为 1.88ng/ml。

实施例6QX008N和Tezepelumab中和人TSLP诱导人全血释放TARC (CCL17)活性

利用人全血测定QX008N拮抗人TSLP通过TSLPR-IL-7R诱导的TARC (CCL17)释放活性：将全血按照100μl/孔加入到96孔板中，暂存于37℃和5％CO₂条件下，向全血中加入提前孵育的抗体和人TSLP混合液，其中抗体的终浓度范围为0至10μg/ml，人TSLP的终浓度为0.5ng/ml，并加入终浓度为0.5ng/ml的IL-33。然后在37℃和5％CO₂条件下培养48小时，收集细胞培养上清采用夹心ELISA法检测上清中TARC(CCL17)的表达及绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，其剂量效应曲线如图7所示。

从图7所示的结果显示，QX008N能够抑制人TSLP诱导的全血释放 TARC(CCL17)，QX008N抑制人TSLP诱导的全血释放TARC(CCL17) 活性的IC₅₀为0.839ng/ml，而Tezepelumab抑制人TSLP诱导的全血释放 TARC(CCL17)活性的IC₅₀为23.9ng/ml。

实施例7 QX008N和Tezepelumab中和人TSLP诱导人PBMC细胞释放TARC(CCL17)活性利用人PBMC细胞测定QX008N拮抗人TSLP通过TSLPR-IL-7R诱导的 TARC(CCL17)释放活性：按密度梯度离心法分离出PBMC，将PBMC按照300000个/孔加入到96孔板中，暂存于37℃和5％CO₂条件下，向PBMC 中加入提前孵育的抗体和人TSLP混合液，其中抗体的终浓度范围为0至 10μg/ml，人TSLP的终浓度为0.5ng/ml，并加入终浓度为0.5ng/ml的IL-33。然后在37℃和5％CO₂条件下培养48小时，收集细胞培养上清采用夹心 ELISA法检测上清中TARC(CCL17)的表达及绘制剂量效应曲线，进而分析抗体的拮抗活性，其剂量效应曲线如图8所示。

从图8所示的结果显示，QX008N能够抑制人TSLP诱导的PBMC细胞释放TARC(CCL17)，QX008N抑制人TSLP诱导的PBMC细胞释放TARC (CCL17)活性的IC₅₀为77.1ng/ml，而Tezepelumab抑制人TSLP诱导的 PBMC细胞释放TARC(CCL17)活性的IC₅₀为216ng/ml。

实施例8不同第一缓冲溶液对于重组人源化抗TSLP单克隆抗体 (QX008N)发酵液的HCP的清除效果比较

制备抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的发酵液：

使用CHO细胞作为宿主细胞，Dynamis作为发酵基础培养基，生产实施例1所得到的抗体QX008N。使用常规的细胞培养工艺进行细胞培养，当细胞活率低于80％或培养至18天时开始收获，采用初级滤器MD0HC10FS1 和次级滤器MX0HC10FS1对收获液进行深层过滤，收集澄清的细胞培养上清，从而获得抗人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)单克隆抗体的发酵液 (简称发酵液中间体)。

具体如下：

采用第一缓冲溶液(12mmol/L Na₂HPO₄、8mmol/LNaH₂PO₄和0.15mol/L NaCl)平衡Protein A层析柱(Merck0.15L)，并将QX008N 发酵液中间体上样于平衡后的Protein A层析柱，以与其结合，然后再使用第一缓冲溶液进行平衡，至发酵液完全流过层析柱；

然后进行第一次洗脱，所述第一次洗脱采用的第一次洗脱溶液的组成如表2所示，随后使用第二缓冲溶液(6mmol/L Na₂HPO₄、4mmol/L NaH₂PO₄， pH7.2)进行平衡；

接着进行第二次洗脱来收集样品，并对收集的样品进行抗体浓度和宿主蛋白(HCP)残留含量进行测定，其中，所述第二次洗脱采用的第二次洗脱溶液为5mmol/LNa₂HPO₄，6.5mmol/L柠檬酸，pH为3.6，并采用再生缓冲液100mmol/L NaOH，1mol/L NaCl对层析柱进行再生。

抗体浓度的测定方法如下：

1.分光光度计波长调至280nm，用第二缓冲溶液作为对照，进行校零。

2.用第二缓冲溶液对待测样品进行稀释，测定样品在280nm的吸光值 (吸光值保证在0.5～1.5之间)，并按照之下公式计算样品浓度(QX008N消光系数为1.554)。

所得到的结果如表3所示。

HCP含量的测定方法：

1.样品稀释：一般根据样品中HCP的估计值来进行稀释倍数选择，使最终HCP的浓度落在标准曲线范围内即可(一般10ng/ml～80ng/ml)。样品一步稀释倍数不超过10倍，最小取样量不低于5μl。

2.向取出板条每孔加入Anti-CHO HRP 100μl。

3.上样：按一定排列分别加入标准品、样品、加标样品(各两复孔，标准品不需复孔)，50μl/孔，封板。室温置于水平摇床，180rpm，2小时，避光。

4.洗板：弃去孔内液体，用多通道移液器加洗液300μl/孔，静置30秒后甩尽液体，在吸水纸上拍干，洗板4次。最后一次洗板完成后，需尽量拍干孔内残留洗液。

5.显色及终止读数：按100μl/孔加TMB试剂(TMB Substrate)，静置显色30分钟，避光。30分钟后加终止液(Stop Solution)100μl/孔，酶标仪 450nm读数，以650nm作为参考。

6.选择分析软件进行数据分析，以标准品OD值为纵坐标，浓度为横坐标，作四参数标准曲线。将样品测得的OD值代入标准品曲线，求得所加样品HCP的实测值。

7.CHO细胞蛋白残留量(％)＝样品平均实测值(ng/ml)×稀释倍数/未稀释样品蛋白含量(mg/ml)量求得^-4(％)，其结果如表3所示。

表2第一次洗脱溶液的组成

实验	第一次洗脱溶液
		1	0.1mol/L枸橼酸钠，0.1mol/L盐酸胍，11mmol/L枸橼酸，pH5.8
2	12mmol/LNa₂HPO₄，8mmol/LNaH₂PO₄，0.15mol/LNaCl，0.5％Tween80，pH7.0
		3	0.1mol/L枸橼酸钠，0.5mol/L氯化钠，7mmol/L枸橼酸，pH5.8

表3 QX008N浓度及HCP残留含量结果

实验	细胞培养上清HCP含量％(w/w)	收率％	亲和层析后HCP残留量％(w/w)
				1	25.3	96.9	0.052
2	25.1	97.3	0.186
				3	25.0	96.8	0.236

由表3结果可知，发酵液中间体中HCP残留量大于25％，经过亲和纯化工艺的处理，收率均大于95％；对于HCP的去除，采用含盐酸胍实验组，亲和层析后样品HCP残留低于0.1％，后续纯化工艺步骤去除HCP负荷明显降低，且样品经pH调节，进行后续层析工艺步骤(阴离子交换层析)上样时，样品保持极为澄清，无需其他处理即可直接进样，增强了工艺的简便性，节省了工艺时间；而采用聚山梨酯80或NaCl实验组，亲和层析后样品HCP 残留仍大于0.1％，HCP残留去除效果差于盐酸胍。

实施例9不同批次重组人源化抗TSLP单克隆抗体(QX008N)发酵液的HCP的清除效果比较

发酵液中间体的制备及亲和层析方法同实施例8，共制备三个批次的发酵液中间体，第一次洗脱均采用含盐酸胍的预洗脱缓冲液：0.1mol/L柠檬酸钠，0.1mol/L盐酸胍，11mmol/L柠檬酸，pH5.8淋洗。亲和工艺收率及HCP 残留含量测试方法如实施例8所述，其结果如表4所示。

表4不同批次QX008N浓度及HCP残留含量结果

批次	细胞培养上清HCP含量％(w/w)	收率％	亲和层析后HCP残留量％(w/w)
				1	26.3	98.5	0.068
2	27.9	96.3	0.045
				3	29.4	97.5	0.054

由表4结果所示，不同批次的QX008N发酵液中间体HCP残留均处于 25％以上，细胞培养工艺稳定；三批样品的亲和工艺收率均大于95％，收率符合工艺要求；亲和层析后样品HCP残留均低于0.1％，采用盐酸胍进行预洗脱淋洗对于HCP的去除保持稳定。

综上所述，本申请采用上述所述的亲和纯化方法，所得到的单克隆抗体中HCP的残留量保持在较低的水平，残留控制量不高于0.1％，从而减轻了之后纯化步骤中去除HCP的压力，并且本申请所述的亲和纯化工艺具有良好的稳定性。

以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。

序列表

<110> 江苏荃信生物医药股份有限公司

<120> 降低抗人胸腺基质淋巴细胞生成素单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法

<130> TPE01808

<150> 2021112849531

<151> 2021-11-1

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 1

Ser Tyr Tyr Met Ser

1 5

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 2

Phe Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Ala Tyr His Ala Thr Trp Ala Gln Gly

1 5 10 15

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 3

Glu Phe Arg Ser Met Thr Tyr Gly Ala Glu Trp Gly Ile

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 4

Gln Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Asp Thr Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 5

Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 6

Gln Gln Gly Tyr Thr Met Pro Asp Val Asp Lys Asn Pro

1 5 10

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Phe Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Ala Tyr His Ala Thr Trp Ala Gln

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Phe Arg Ser Met Thr Tyr Gly Ala Glu Trp Gly Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 8

Ala Tyr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Asp Thr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Met Pro Asp

85 90 95

Val Asp Lys Asn Pro Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 159

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 9

Met Phe Pro Phe Ala Leu Leu Tyr Val Leu Ser Val Ser Phe Arg Lys

1 5 10 15

Ile Phe Ile Leu Gln Leu Val Gly Leu Val Leu Thr Tyr Asp Phe Thr

20 25 30

Asn Cys Asp Phe Glu Lys Ile Lys Ala Ala Tyr Leu Ser Thr Ile Ser

35 40 45

Lys Asp Leu Ile Thr Tyr Met Ser Gly Thr Lys Ser Thr Glu Phe Asn

50 55 60

Asn Thr Val Ser Cys Ser Asn Arg Pro His Cys Leu Thr Glu Ile Gln

65 70 75 80

Ser Leu Thr Phe Asn Pro Thr Ala Gly Cys Ala Ser Leu Ala Lys Glu

85 90 95

Met Phe Ala Met Lys Thr Lys Ala Ala Leu Ala Ile Trp Cys Pro Gly

100 105 110

Tyr Ser Glu Thr Gln Ile Asn Ala Thr Gln Ala Met Lys Lys Arg Arg

115 120 125

Lys Arg Lys Val Thr Thr Asn Lys Cys Leu Glu Gln Val Ser Gln Leu

130 135 140

Gln Gly Leu Trp Arg Arg Phe Asn Arg Pro Leu Leu Lys Gln Gln

145 150 155

<210> 10

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Phe Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Ala Tyr His Ala Thr Trp Ala Gln

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Phe Arg Ser Met Thr Tyr Gly Ala Glu Trp Gly Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 11

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列说明：人工合成的序列

<400> 11

Ala Tyr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Asp Thr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Met Pro Asp

85 90 95

Val Asp Lys Asn Pro Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

Claims

1.一种降低抗人胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

制备抗人胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）单克隆抗体的发酵液；

将第一缓冲溶液和亲和层析介质混合，从而得到平衡好的亲和层析介质，然后将所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）单克隆抗体的发酵液与所述平衡好的亲和层析介质混合，得到混合溶液；

将所述混合溶液进行第一次洗脱，接着进行第二次洗脱，从而除去宿主细胞蛋白，得到抗人胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）单克隆抗体；

所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）单克隆抗体包含三个重链互补决定区CDR-H1、CDR-H2以及CDR-H3和三个轻链互补决定区CDR-L1、CDR-L2以及CDR-L3，其中：

CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；

CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；

CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；

CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

2.根据权利要求1所述的亲和纯化方法，其特征在于，所述抗人胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中，

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

3.根据权利要求1或2所述的亲和纯化方法，其特征在于，所述亲和层析介质选自配基交联到琼脂糖、聚乙烯醚、羟基化聚醚树脂、聚丙烯酸树脂、聚苯乙烯二乙烯苯基树脂、聚甲基丙烯酸树脂、聚苯乙烯树脂、羟基磷灰石或玻璃基质上的层析介质中的一种。

4.根据权利要求3所述的亲和纯化方法，其特征在于，所述亲和层析介质为配基交联到聚乙烯醚的层析介质。

5. 根据权利要求3所述的亲和纯化方法，其特征在于，所述配基为Protein A、ProteinG或Protein L。

6. 根据权利要求3所述的亲和纯化方法，其特征在于，所述配基为Protein A。

7.根据权利要求1或2所述的亲和纯化方法，其特征在于，所述第一缓冲溶液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液中的一种，所述第一缓冲溶液中的盐浓度为5mM-0.25M，pH为5.5-8.0。

8.根据权利要求1或2所述的亲和纯化方法，其特征在于，所述混合溶液进行第一次洗脱时，采用第一次洗脱溶液进行洗脱；

所述第一次洗脱溶液为中性缓冲液或酸性缓冲液。

9.根据权利要求8所述的亲和纯化方法，其特征在于，所述中性缓冲液选自磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液或甘氨酸缓冲液中的一种。

10.根据权利要求8所述的亲和纯化方法，其特征在于，所述酸性缓冲液选自柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液或柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中的一种。

11.根据权利要求8所述的亲和纯化方法，其特征在于，所述第一次洗脱溶液的pH为5.0-7.5。

12.根据权利要求8所述的亲和纯化方法，其特征在于，在所述第一次洗脱溶液中加入预洗脱活性剂；

所述预洗脱活性剂选自盐酸胍、聚山梨酯80或氯化钠中的一种。

13.根据权利要求12所述的亲和纯化方法，其特征在于，所述预洗脱活性剂为盐酸胍。

14.根据权利要求12所述的亲和纯化方法，其特征在于，所述盐酸胍的浓度为0.01-1M。

15.根据权利要求1或2所述的亲和纯化方法，其特征在于，在所述第一次洗脱后，在进行第二次洗脱之前还包括使用第二缓冲溶液进行平衡所述第一洗脱后溶液。

16.根据权利要求15所述的亲和纯化方法，其特征在于，所述第二缓冲溶液选自磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液中的一种。

17.根据权利要求1或2所述的亲和纯化方法，其特征在于，在进行第二次洗脱时，采用第二次洗脱溶液进行洗脱；

所述第二次洗脱溶液选自柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸-HCl缓冲液和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的一种或两种以上。

18.根据权利要求17所述的亲和纯化方法，其特征在于，所述第二次洗脱溶液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。

19.根据权利要求17所述的亲和纯化方法，其特征在于，所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的pH为2.9-3.8。