CN112159473B - 重组人源化抗人白介素23单克隆抗体的纯化方法 - Google Patents

重组人源化抗人白介素23单克隆抗体的纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种重组人源化抗人白介素23单克隆抗体的纯化方法。本发明的重组人源化抗人白介素23单克隆抗体的纯化方法包括对包含重组人源化抗人白介素23单克隆抗体的细胞发酵液上清进行亲和层析，所述亲和层析包括使用预洗脱缓冲液对所述亲和柱进行预洗脱。本发明的纯化方法能够简单易行，能够进行放大纯化生产，细胞发酵上清液无需进行前预处理，洗脱样品得率较高，且宿主细胞蛋白(HCP)残留量不高于0.5％，从而减轻了之后纯化步骤中去除宿主细胞蛋白的压力，保证抗体最终样品的宿主细胞蛋白残留量处于极低水平。

Description

重组人源化抗人白介素23单克隆抗体的纯化方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种在重组人源化抗人白介素23 单克隆抗体生产过程中降低宿主细胞蛋白含量的亲和纯化方法。
背景技术
抗体药物生产过程中亲和纯化是非常关键的一个工艺步骤，该过程对发 酵液中的抗体进行捕获浓缩，实现抗体粗纯化的第一步。在中国仓鼠卵巢细 胞(CHO)等基因工程细胞株大批量发酵过程中，细胞在不同的生理周期会 有凋亡裂解，释放宿主细胞蛋白(Host cell protein，HCP)。HCP是指来源于宿 主细胞的蛋白成分，包括宿主细胞结构蛋白和转化蛋白(细胞分泌的促生长 蛋白)。HCP不仅有可能诱导机体产生抗HCP抗体，引起过敏反应，还有可 能有“佐剂效应”引起机体对蛋白质药物产生抗体，影响药物治疗效果，定 量测定基因工程药物中残留的HCP是质量控制的一种重要手段，有助于保持 纯化工艺的有效性和一致性。在抗体亲和纯化中，保证高效率的抗体回收率 的同时，要对发酵过程中工程细胞所产生的HCP进行有效去除。
因此，开发出一种能够在抗体大规模发酵制备中有效去除HCP的、经济 可行的抗体亲和纯化工艺，对于抗体药物的进一步产业化推广是极其有意义 的。
目前能够进行HCP残留去除的方法较多，各有特点：1)层析方式：包 括Protein A亲和层析，阴、阳离子层析，三种层析工艺中对HCP的去除能力， Protein A亲和层析为基础，去除能力较强，是HCP去除的主要步骤，阴、阳 离子层析则主要作为后续HCP的进一步再去除工艺。层析方式去除HCP的工 艺在不断完善过程中，各种层析工艺在不断的提出应用实际生产，是HCP去 除的主要手段；2)切向流超滤方式：对于HCP的去除能力有限，且不易控制残留量，工艺控制系数不高，只能作为去除HCP的辅助工艺；3)聚合物 沉淀方式：PEG、聚丙烯酸等高聚合物在较广的PH范围内带正电荷，通过电 荷作用同抗体结合形成沉淀，而HCP由于等电点较低，不易发生沉淀。沉淀 抗体样品的HCP含量明显降低，但该工艺不适于工艺放大，且沉淀对抗体 的活性可能有一定影响。因此，去除HCP的工艺方法众多，由于各项目的抗 体的样品发酵工艺及抗体性质的不同，需进行综合考虑选择工艺。
发明内容
抗人白介素(IL-23)单克隆抗体可用作治疗银屑病、银屑病关节炎等自身 免疫相关疾病的药物。申请人开发了新的重组人源化抗人白介素23单克隆 抗体(QX004N)，与现有的抗人白介素23单克隆抗体(Guselkumab和 Risankizumab)相比，其结合hIL-23的亲和力相当，但在细胞水平的拮抗活 性优于Guselkumab，而与Risankizumab相当。
为了解决该重组人源化抗人白介素23单克隆抗体生产中宿主细胞蛋白 残留的问题，本发明提供一种在该单克隆抗体的生产过程中有效降低 CHO(中国仓鼠卵巢细胞)宿主细胞蛋白(HCP)的纯化方法，该纯化方法所 使用的材料成本价格较低，易于工艺放大。
在本发明中，主要通过抗体亲和层析预洗脱淋洗来有效降低HCP含量， 满足抗体药物的大规模高质量纯化制备要求，保证抗体药物的临床使用的安 全。
即，本发明包括：
1.一种重组人源化抗人白介素23单克隆抗体的纯化方法，该方法包括 对包含重组人源化抗人白介素23单克隆抗体的细胞发酵液上清进行亲和层 析，所述亲和层析包括下述步骤：
步骤A：上样前，使用平衡缓冲液A对亲和层析柱进行平衡；
步骤B：将包含重组人源化抗人白介素23单克隆抗体的细胞发酵液上 清上样于所述亲和层析柱；
步骤C：上样后，再次使用所述平衡缓冲液A对所述亲和层析柱进行平 衡；
步骤D：使用预洗脱缓冲液对所述亲和柱进行预洗脱；
步骤E：使用平衡缓冲液B对所述亲和层析柱进行平衡；和
步骤F：使用洗脱缓冲液对所述亲和柱进行终洗脱，并收集样品；
所述抗人白介素23单克隆抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、 CDR-H2和CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)， 其中：
(a)CDR-H1(在本说明书中CDR-H1表示重链CDR1)的氨基酸序列如 SEQ ID NO：1(NHEMS)所示；
(b)CDR-H2(在本说明书中CDR-H2表示重链CDR2)的氨基酸序列如 SEQ ID NO：2(IITTSDTTYYATWAKG)所示；
(c)CDR-H3(在本说明书中CDR-H3表示重链CDR3)的氨基酸序列如 SEQ ID NO：3(VDIVLLSVTSRI)所示；
(d)CDR-L1(在本说明书中CDR-L1表示轻链CDR1)的氨基酸序列如 SEQ ID NO：4(QASQSVSTYLS)所示；
(e)CDR-L2(在本说明书中CDR-L2表示轻链CDR2)的氨基酸序列如 SEQ ID NO：5(GASNLES)所示；且
(f)CDR-L3(在本说明书中CDR-L3表示轻链CDR3)的氨基酸序列如 SEQ ID NO：6(QSGYVFAGLT)所示。
2.根据前述的纯化方法，其中，所述抗人白介素23单克隆抗体包含重 链可变区和轻链可变区，
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，其氨基酸序列为 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNHEMSWVRQAPGKGLEWIG IITTSDTTYYATWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARV DIVLLSVTSRIWGQGTLVTVSS；且，
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，其氨基酸序列为 DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSVSTYLSWYQQKPGKAPKLLIYG ASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSGYVFAGLTFGG GTKVEIK。
3.根据前述的纯化方法，其中，所述亲和层析柱为Protein A柱。
4.根据前述的纯化方法，其中，所述平衡缓冲液A为磷酸盐缓冲液、 Tris-HCl缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液，盐浓度为5mM-0.25M，pH为5.5-8.0。
所述平衡缓冲液A可以包含NaCl或Na2SO4以降低非抗体蛋白同 Protein A填料间的非特异性吸附，NaCl和/或Na2SO4的浓度优选为250mM 以下。所述平衡缓冲液A优选为磷酸盐缓冲液。所述平衡缓冲液A的盐浓 度优选为5mM-0.15M，更优选为10mM-50mM；其pH优选为pH6.5-7.5。
5.根据前述的的纯化方法，其中，所述预洗脱缓冲液为磷酸盐缓冲液、 柠檬酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液或醋酸钠-醋酸缓冲液，其盐浓度为 0.001M-0.5M，其pH为5.0-7.5。
所述预洗脱缓冲液的盐浓度优选为0.05M～0.2M。所述预洗脱缓冲液的 pH优选为5.5～6.5。
6.根据前述的纯化方法，其中，所述预洗脱缓冲液包含0.01M-1.0M的 盐酸胍。盐酸胍的浓度优选是0.05M～0.3M之间。
7.根据前述的纯化方法，其中，所述洗脱缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠 缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸-HCl缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，其盐 浓度为5～100mM，其pH为2.5-4.0。
所述洗脱缓冲液的盐浓度优选为20-50mM，其pH优选为2.9-3.8。
8.根据前述的纯化方法，其中，所述平衡缓冲液B为磷酸盐缓冲液 Tris-HCl缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液，其盐浓度为5mM-0.15M，其pH为5.5-8.0。
所述平衡缓冲液B可以包含NaCl或Na2SO4来维持电导同时保持部分 缓冲能力，NaCl和/或Na2SO4的浓度优选为250mM以下，例如可以为 10-100mM。
9.一种降低重组人源化抗人白介素23单克隆抗体制剂中宿主细胞蛋白 含量的方法，其包括采用前述中任一项所述的纯化方法对包含重组人源化抗 人白介素23单克隆抗体的细胞发酵液上清进行纯化的步骤。
本发明中的抗体Protein A亲和纯化工艺简单易行，能够进行放大纯化 生产，细胞发酵上清液无需进行前预处理，洗脱样品得率较高，同时HCP 残留量也保持在较低水平(残留控制量不高于0.5％)，从而减轻之后纯化步 骤中去除HCP的压力，从而保证抗体最终样品的HCP残留量处于极低水平。 同时，发明中经过对不同批次发酵上清液进行亲和纯化工艺验证，证明本发 明中的亲和纯化工艺具有良好的稳定性。
本发明能够实现上述技术效果的可能机制是利用在亲和层析的预洗脱 中降低HCP同抗体及填料基质间的作用，即通过活性试剂盐酸胍能够不同 程度地减弱HCP同抗体蛋白及填料介质间的作用力，而起到去除HCP的作 用。
附图说明
图1是显示构建QX004N(HZD90-32)瞬转表达质粒的核酸电泳结果的图。 其中，M：Marker；条带1：PCR产物90VH-Hu18；条带2：pHZDCH， HindIII/NheI；条带3：PCR产物90VK-Hu9；条带4：pHZDCK，HindIII/BsiWI。
图2是瞬转表达流程图。
图3是QX004N(HZD90-32)的电泳检测图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由 本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以 通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可 以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在本说明书中，人白介素23(Human interleukin 23，hIL-23)表示一种源 自人的蛋白，由p19和p40两个亚基组成的异源二聚体。p19氨基酸序列如 SEQ ID NO：9所示，p40氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，其中，下划 线部分表示信号肽。
SEQ ID NO：9：
MLGSRAVMLLLLLPWTAQGRAVPGGSSPAWTQCQQLSQKLCTLAWSAHP LVGHMDLREEGDEETTNDVPHIQCGDGCDPQGLRDNSQFCLQRIHQGLIF YEKLLGSDIFTGEPSLLPDSPVGQLHASLLGLSQLLQPEGHHWETQQIPSL SPSQPWQRLLLRFKILRSLQAFVAVAARVFAHGAATLSP
SEQ ID NO：10：
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLT CDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSH SLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTIS TDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSAC PAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQ VEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICR KNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
在本说明书中，“抗人白介素23单克隆抗体”表示这样的单克隆抗体： 其能够以足够的亲和力结合人白介素23，使得所述单克隆抗体可用作靶向人 白介素23的诊断剂和/或治疗剂。
实验结果显示，所述新的抗人白介素23(IL-23)单克隆抗体可以特异性 结合人白介素23(IL-23)的p19亚基。
所述新的抗人白介素23(IL-23)单克隆抗体在诸多生物活性方面与上市 同类单克隆抗体产品相当、或优于上市同类单克隆抗体产品。所述生物活性 例如抑制IL-23诱导的细胞中STAT3磷酸化的活性、抑制IL23诱导的小鼠 脾脏细胞释放IL-17A的活性、抑制IL-23诱导的人NK细胞释放IFN-γ活性。
在一个实施方式中，所述新的抗人白介素23(IL-23)单克隆抗体的重链的 氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：12 所示。
SEQ ID NO：11
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSNHEMSWVRQAPGKGLEWIG IITTSDTTYYATWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARV DIVLLSVTSRIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
SEQ ID NO：12
DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQSVSTYLSWYQQKPGKAPKLLIYG ASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSGYVFAGLTFGG GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC
其中，SEQ ID NO：11和12均为经人源化的序列。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明。应当理解的是，本发明 不限于这些实施例。
需要说明的是，下述实施例中的抗人白介素23单克隆抗体QX004N即 为所述新的抗人白介素23单克隆抗体。
实施例1抗人白介素23单克隆抗体QX004N的制备
从上海近岸科技有限公司采购人白介素23(IL-23)，用于免疫新西兰兔， 运用B细胞克隆技术获得抗原结合特异性抗体克隆，进而筛选出结合IL-23 并具有IL-23抑制活性的单克隆抗体。首先，用Binding ELISA检测细胞上 清，挑选出与IL-23结合的克隆；再用Blocking ELISA进行检测，挑选出具 有IL-23抑制活性的克隆。以上免疫和筛选过程委托给商业化公司完成。
挑选出5个克隆进行重组表达，并测序。对90#克隆进行人源化改造。 利用NCBIIgBlast进行人IgG胚系序列(Germline)同源性比对，选择 IGHV3-66*01作为重链CDR移植模板，将90#克隆重链的CDR区(即 CDR-H1(SEQ ID No:1)、CDR-H2(SEQ ID No:2)和CDR-H3(SEQ ID No:3))移 植入IGHV3-66*01的骨架区；选择IGKV1-39*01作为轻链CDR移植模板，将90#克隆轻链的CDR区(即CDR-L1(SEQ ID No:4)、CDR-L2(SEQ ID No:5) 和CDR-L3(SEQID No:6))移植入IGKV1-39*01的骨架区；对骨架区特定位 点进行回复突变，将重链CDR-H3中第103位甲硫氨酸(Met，M)突变亮氨酸 (Leu，L)，获得本发明的单克隆抗体QX004N可变区。最终，人源化后的重 链可变区序列如SEQ ID NO：7所示；人源化后的轻链可变区氨基酸序列如 SEQ ID NO：8所示。
上述重链可变区(SEQ ID NO：7)的基因利用PCR扩增获得；轻链可变 区(SEQ IDNO：8)的基因利用PCR扩增获得。用HindIII和NheI双酶切重 链表达质粒pHZDCH；用HindIII和BsiWI双酶切轻链表达质粒pHZDCK； 用Infusion重组酶将PCR扩增基因分别插入对应的表达质粒中，构建重链表 达质粒pHZDCH-90VH-Hu18和轻链表达质粒pHZDCK-90VK-Hu9。
通过核酸电泳检测质粒的双酶切结果如图1所示。根据图1的结果可以 看出，抗体重链可变区和轻链可变区PCR扩增结果以及双酶切重链和轻链 表达质粒的结果，其中，重链和轻链的质粒大小约10000bp，轻链可变区约 438bp，重链可变区约459bp。
将序列正确的重链表达质粒和轻链表达质粒共转染ExpiCHO-S细胞。 转染前一天，将ExpiCHO-S细胞稀释成3×106个细胞/mL进行转染前传代。 转染当天，将细胞密度稀释成6×106个细胞/mL，125mL摇瓶装25mL细胞， 等待转染。转染和表达过程如图2所示。
转染后第4-8天，收获培养上清，用ProteinA进行一步纯化。用 SDS-PAGE电泳检测纯化的抗体，将其命名为QX004N(HZD90-32)，利用蛋 白电泳检测该抗体的结果如图3所示。蛋白电泳用变性还原胶检测，图3的 结果显示出有两条带，两个条带的大小分别约50kDa和25kDa，与重链(49.1 kDa)和轻链(23.1kDa)理论分子量一致。
实施例2平衡解离常数(KD)的测定
用BiacoreT200检测QX004N(HZD90-32)与IL-23的亲和力，所有过程 都在25℃进行。采用商品化Protein A芯片，通过捕获法固定适量的抗体， 使得Rmax在50RU左右，捕获流速是10μl/min。将抗原进行梯度稀释，仪 器流速切换成30μl/min，按照浓度从低到高的顺序依次流过参比通道和固定 抗体的通道，流过缓冲液作为阴性对照。每一个结合、解离完成后用pH1.5 甘氨酸再生芯片。用仪器自带分析软件选择Kinetics选项中1:1结合模型进 行拟合，计算抗体的结合速率常数ka，解离速率常数kd以及解离平衡常数KD值。
除此之外，将QX004N(HZD90-32)与目前已经商业化的针对IL-23的单 克隆抗体，即Guselkumab和Risankizumab的亲和力进行比较，针对已知抗 体的检测方法与对QX004N进行检测的方法相同，结果如表1所示。其中 Guselkumab和Risankizumab通过购买市售的药品获得。
表1 抗体结合人IL-23的亲和力
样品名称 k<sub>a</sub>(10<sup>5</sup>M<sup>-1</sup>S<sup>-1</sup>) k<sub>d</sub>(10<sup>-5</sup>S<sup>-1</sup>) K<sub>D</sub>(10<sup>-10</sup>M)
Guselkumab 5.01 3.19 0.63
Risankizumab 7.06 3.70 0.52
QX004N(HZD90-32) 3.66 3.50 1.01
表中的数据为：每个样品检测两次，计算平均值的数据。
实施例3 QX004N、Guselkumab和Risankizumab的细胞水平生物活性的测定
在相同实验条件下测定了QX004N、Guselkumab和Risankizumab的细 胞水平生物活性，实验结果表明：
a.QX004N能够抑制IL-23诱导的HEK BlueTM IL-23细胞中STAT3磷酸 化活性，其IC50为3.21ng/mL；Guselkumab和Risankizumab也能够抑制IL-23 诱导的HEK BlueTM IL-23细胞中STAT3磷酸化活性，其IC50分别为 6.18ng/mL和3.51ng/mL，说明QX004N抑制IL-23诱导的信号转导活性与目 前已经商业化的针对IL-23的单克隆抗体即Risankizumab的活性相当，并优 于Guselkumab。
b.QX004N能够抑制IL-23诱导的小鼠脾脏细胞释放IL-17A活性，其 IC50为11.7ng/mL；Guselkumab和Risankizumab也能够抑制IL-23诱导的小 鼠脾脏细胞释放IL-17A活性，其IC50分别为13.5ng/mL和8.43ng/mL，说明 QX004N抑制IL-23诱导的小鼠脾脏细胞释放IL-17A活性较强，其与现有的 商业化产品(Guselkumab和Risankizumab)的能力相当。
c.QX004N能够抑制IL-23诱导的人NK细胞释放IFN-γ活性，其IC50为10.4ng/mL；Guselkumab和Risankizumab也能够抑制IL-23诱导的人NK 细胞释放IFN-γ活性，其IC50分别为16.8ng/mL和11.1ng/mL，说明QX004N 抑制IL-23诱导的人NK细胞释放IFN-γ活性强于目前已经商业化的产品 Guselkumab，并与Risankizumab的活性相当。
由上述可知，在测定的三项细胞水平生物活性方面，QX004N优于Guselkumab， 而与Risankizumab难分伯仲。鉴于Risankizumab
Figure BDA0002660804990000101
已在临床试验中 被证实对中度至重度斑块型银屑病的治疗效果显著，QX004N亦有望在预防 和治疗相关疾病方面展现出良好的临床效果。
实施例4不同预洗脱缓冲液对于重组人源化抗IL-23单克隆抗体(QX004N) 发酵液的HCP的清除效果比较
抗体QX004N的发酵：CHO细胞作为宿主细胞，Dynamis作为发酵基 础培养基，常规的细胞培养工艺进行细胞培养。
当细胞活率低于80％或培养至14天时开始收获，采用初级滤器 MD0HC10FS1和次级滤器MX0HC10FS1对收获液进行深层过滤，收集澄清 的细胞培养上清，记为发酵液中间体。
发酵液中间体进行亲和层析，上样于Protein A层析柱(Merck
Figure BDA0002660804990000102
A，0.15L)，上样载量设定45mg/ml。上样前，用平衡缓冲液A： 12mmol/L Na2HPO4，8mmol/LNaH2PO4，0.15mol/L NaCl平衡；上样后，再 次用平衡缓冲液A平衡，至发酵液完全流过层析柱；之后采用不同的预洗脱 缓冲液淋洗，预洗脱缓冲液组成如下表1所示；接着用平衡缓冲液B：6mmol/L Na2HPO4，4mmol/L NaH2PO4，pH7.2平衡；随后用洗脱缓冲液PB：7mmol/LNa2HPO4，15mmol/L枸橼酸，pH3.1洗脱并收集洗脱样品，对收集的洗脱样 品进行抗体浓度及HCP残留含量测定。
抗体浓度测定方法：
1.分光光度计波长调至280nm，用洗脱换冲液PB作为对照，进行 校零。
2.用洗脱缓冲液PB对待测样品进行稀释，测定样品在280nm的吸 光值(吸光值保证在0.5～1.5之间)，并按照之下公式计算样品浓度 (QX004N消光系数为1.408)。
Figure BDA0002660804990000111
HCP含量测定方法：
样品稀释：一般根据样品中HCP的估计值来进行稀释倍数选择，使最 终HCP的浓度落在标准曲线范围内即可(一般10ng/ml～80ng/ml)。样品一 步稀释倍数不超过10倍，最小取样量不低于5μl。
向取出板条每孔加入Anti-CHO HRP 100μl。
上样：按一定排列分别加入标准品、样品、加标样品(各两复孔，标 准品不需复孔)，50μl/孔，封板。室温置于水平摇床，180rpm，2小时，避 光。
洗板：弃去孔内液体，用多通道移液器加洗液300μl/孔，静置30秒后 甩尽液体，在吸水纸上拍干，洗板4次。最后一次洗板完成后，需尽量拍干孔内残留洗液。
显色及终止读数：按100μl/孔加TMB试剂(TMB Substrate)，静置显 色30分钟，避光。30分钟后加终止液(Stop Solution)100μl/孔，酶标仪 450nm读数，以650nm作为参考。
选择分析软件进行数据分析，以标准品OD值为纵坐标，浓度为横坐 标，作四参数标准曲线。将样品测得的OD值代入标准品曲线，求得所加样 品HCP的实测值。
CHO细胞蛋白残留量(％)＝样品平均实测值(ng/ml)×稀释倍数/未稀 释样品蛋白含量(mg/ml)×10-4(％)求得。
表1：预洗脱缓冲液组成
Figure BDA0002660804990000112
Figure BDA0002660804990000121
由表2结果可知，发酵液中间体中HCP残留量大于15％，经过亲和纯化工艺的处理，收率均大于95％；对于HCP的去除，采用含盐酸胍实验组， 亲和层析后样品HCP残留低于0.05％，后续纯化工艺步骤去除HCP负荷明 显降低，且样品经pH调节，进行后续层析工艺步骤(阴离子交换层析)上 样时，样品保持极为澄清，无需其他处理即可直接进样，增强了工艺的简便 性，节省了工艺时间；而采用聚山梨酯80或NaCl实验组，亲和层析后样品 HCP残留仍大于0.2％，HCP残留去除效果差于盐酸胍。
表2：QX004N亲和纯化收率及HCP残留量结果
Figure BDA0002660804990000122
实施例4不同批次重组人源化抗IL-23单克隆抗体(QX004N)发酵液的 HCP的清除效果比较
发酵液中间体的制备及亲和层析方法同实施例1，共制备三个批次的发 酵液中间体，预洗脱淋洗均采用含盐酸胍的预洗脱缓冲液：0.1mol/L枸橼酸 钠，0.1mol/L盐酸胍，11mmol/L枸橼酸，pH5.8淋洗。亲和工艺收率及HCP 残留含量测试方法如实施例1所述。
由表3结果所示，不同批次的QX004N发酵液中间体HCP残留均处于 15％以上，细胞培养工艺稳定；三批样品的亲和工艺收率均大于95％，收率 符合工艺要求；亲和层析后样品HCP残留均低于0.05％，采用盐酸胍进行与 洗脱淋洗对于HCP的去除保持稳定。
表3：不同批次QX004N亲和纯化收率及HCP残留量结果
Figure BDA0002660804990000131
序列表
<110> 江苏荃信生物医药有限公司；江苏赛孚士生物技术有限公司
<120> 重组人源化抗人白介素23单克隆抗体的纯化方法
<130> TPD01176
<141> 2020-09-01
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Asn His Glu Met Ser
1 5
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Ile Ile Thr Thr Ser Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Val Asp Ile Val Leu Leu Ser Val Thr Ser Arg Ile
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Gln Ser Gly Tyr Val Phe Ala Gly Leu Thr
1 5 10
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn His
20 25 30
Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Thr Thr Ser Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Asp Ile Val Leu Leu Ser Val Thr Ser Arg Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Tyr Val Phe Ala Gly
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 189
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr
1 5 10 15
Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln
20 25 30
Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His
35 40 45
Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr
50 55 60
Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln
65 70 75 80
Gly Leu Arg Asp Asn Ser Gln Phe Cys Leu Gln Arg Ile His Gln Gly
85 90 95
Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu
100 105 110
Pro Ser Leu Leu Pro Asp Ser Pro Val Gly Gln Leu His Ala Ser Leu
115 120 125
Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro Glu Gly His His Trp Glu Thr
130 135 140
Gln Gln Ile Pro Ser Leu Ser Pro Ser Gln Pro Trp Gln Arg Leu Leu
145 150 155 160
Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala
165 170 175
Ala Arg Val Phe Ala His Gly Ala Ala Thr Leu Ser Pro
180 185
<210> 10
<211> 328
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu
1 5 10 15
Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu
35 40 45
Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln
50 55 60
Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys
65 70 75 80
Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val
85 90 95
Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp
100 105 110
Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe
115 120 125
Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp
130 135 140
Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg
145 150 155 160
Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser
165 170 175
Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu
180 185 190
Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile
195 200 205
Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr
210 215 220
Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn
225 230 235 240
Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr
260 265 270
Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg
275 280 285
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
290 295 300
Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser
305 310 315 320
Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser
325
<210> 11
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn His
20 25 30
Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ile Ile Thr Thr Ser Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Asp Ile Val Leu Leu Ser Val Thr Ser Arg Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 12
<211> 215
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 12
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Tyr Val Phe Ala Gly
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (5)

1.一种重组人源化抗人白介素23单克隆抗体的纯化方法，该方法包括对包含重组人源化抗人白介素23单克隆抗体的细胞发酵液上清进行亲和层析，所述亲和层析包括下述步骤：
步骤A：上样前，使用平衡缓冲液A对亲和层析柱进行平衡；
步骤B：将包含重组人源化抗人白介素23单克隆抗体的细胞发酵液上清上样于所述亲和层析柱；
步骤C：上样后，再次使用所述平衡缓冲液A对所述亲和层析柱进行平衡；
步骤D：使用预洗脱缓冲液对所述亲和柱进行预洗脱；
步骤E：使用平衡缓冲液B对所述亲和层析柱进行平衡；和
步骤F：使用洗脱缓冲液对所述亲和柱进行终洗脱，并收集样品；
所述平衡缓冲液A为磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液，其盐浓度为5mM-0.25M，其pH为5.5-8.0；
所述预洗脱缓冲液为磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液或醋酸钠-醋酸缓冲液，其盐浓度为0.001M-0.5M，其pH为5.0-7.5；
所述洗脱缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸-HCl缓冲液或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，其盐浓度为5～100mM，其pH为2.5-4.0；
所述平衡缓冲液B为磷酸盐缓冲液Tris-HCl缓冲液或硼酸-硼砂缓冲液，其盐浓度为5mM-0.15M，其pH为5.5-8.0；
所述抗人白介素23单克隆抗体包含三个重链互补决定区即CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，以及三个轻链互补决定区即CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：
(a)CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
(b)CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
(c)CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
(d)CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
(e)CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；且
(f)CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述抗人白介素23单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；且，
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述亲和层析柱为Protein A柱。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述预洗脱缓冲液包含0.01M-1.0M的盐酸胍。
5.一种降低重组人源化抗人白介素23单克隆抗体制剂中宿主细胞蛋白含量的方法，其包括采用权利要求1～4中任一项所述的纯化方法对包含重组人源化抗人白介素23单克隆抗体的细胞发酵液上清进行纯化的步骤。
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Inventor before: Dai Changsong

Inventor before: Li Shuai

Inventor before: Guo Bin

Inventor before: Huang Wenjun

Inventor before: Dai Lu

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