CN113980092B - 一种蛋白质亲和纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本公开中提供了一种蛋白质亲和纯化方法。具体而言，本公开提供了包括如下步骤的蛋白质亲和纯化方法：(a)用洗脱前处理缓冲液淋洗上样后的亲和层析柱；以及(b)用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白；其中，所述洗脱前处理缓冲液的缓冲能力高于所述洗脱缓冲液的缓冲能力。本公开还提供了与该方法对应的产品。采用本公开的方法和产品可提高洗脱产品的pH环境，有效提高下游工艺的稳健性且易于放大，从而可广泛应用于蛋白质(例如抗体类)药物的纯化。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质纯化和分离技术领域。具体而言，本发明涉及一种新型的蛋白质亲和纯化工艺，其尤为适于对低pH敏感的蛋白质的纯化。
背景技术
抗体类药物中所存在的多聚体主要产生于细胞培养、蛋白质纯化以及制剂储存过程中。这些存在于抗体类药物中的多聚体在抗体类药物施用时有可能会引起受体的免疫原反应。由此，多聚体被相关监管机构乃至整个抗体类药物行业公认为抗体类药物产品的一个重要质量指标。
由于下游分离纯化工艺对于去除和控制多聚体含量具有更高的灵活性和可操作空间，使得其成为去除多聚体的主力。目前的下游纯化工艺主要依靠精纯步骤来去除多聚体，例如包括离子(阴离子或阳离子)交换层析、疏水层析等方式。
在常规操作中，亲和层析的主要功能是从发酵液中直接捕获产品，而通常不具备去除多聚体的能力。不仅如此，亲和层析中剧烈的低pH洗脱条件还有可能诱导形成多聚体，且这一影响在大规模生产中可能被放大。
目前，抗体类药物(包括单抗、FC融合蛋白和双抗蛋白类药物)纯化过程中，主要以Protein A填料亲和捕获目标蛋白后再进行低pH洗脱作为工艺的第一步。例如，传统的亲和层析层析仅仅作为捕获步骤，一般采取低pH洗脱(低于pH 3.8)，洗脱产品的pH在4.0左右。但是低pH洗脱条件，容易诱导多聚体的产生甚至使得目标蛋白失活，因而不仅不适用于低pH敏感型蛋白质，也不利于杂质的去除，给后续的精纯和工艺的稳健性也增加了难度。
近年来，随着生物药物种类增加和复杂性提高，出现了越来越多对于剧烈的低pH洗脱条件敏感型的生物分子。而针对低pH敏感型蛋白质，目前主要是采用两种策略：第一种是放弃传统的protein A亲和工艺，采用其他层析模式，这种层析模式有可能会引入额外的层析和换液工艺使得锁定的工艺更加复杂；第二种是在洗脱液中加入中性的中和缓冲液，使得洗脱的pH快速的提高，该方法因为洗脱液pH在不同规模的不确定性，而不容易放大，且工艺稳健性存在风险。
本领域中迫切需要开发出新的纯化方法，来有效去除抗体类药物中的多聚体，并避免剧烈低pH洗脱条件对目标分子的影响。
发明内容
本发明正是针对现有技术中的上述技术难题，对亲和纯化工艺进行了系统优化，创新性地通过采用洗脱pH偏移的策略，提高了洗脱产品的pH环境，有效提高下游工艺的稳健性。该工艺策略打破了传统观念，工艺稳健且易于放大，已在30L生产规模上完成验证，可广泛应用于抗体类药物的纯化。
在本发明的第一方面中，提供了一种蛋白质亲和纯化方法，所述方法包括如下步骤：
(a)用洗脱前处理缓冲液淋洗上样后的亲和层析柱；以及
(b)用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白；
其中，所述洗脱前处理缓冲液的缓冲能力高于所述洗脱缓冲液的缓冲能力。
在一些实施方式中，洗脱缓冲液的缓冲能力低于同摩尔浓度的醋酸钠或醋酸-醋酸钠洗脱缓冲液。
在一些实施方式中，洗脱前处理缓冲液的pH值比洗脱缓冲液的pH值至少高2.0。
在一些实施方式中，所述蛋白质亲和纯化选自：Protein A亲和层析、Protein G亲和层析和Protein A/G亲和层析。
在一些实施方式中，所述目标蛋白为包含Fc区段的蛋白质分子。在一些实施方式中，所述目标蛋白为抗体，如多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或Fc融合蛋白等。
在一些实施方式中，所述目标蛋白对低pH敏感和/或在常规低pH洗脱中易于产生多聚体。
在一些实施方式中，所述洗脱前处理缓冲液的pH范围为5.5-8.5。
在一些实施方式中，所述洗脱前处理缓冲液的pH为5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5，优选7.0-7.5。
在一些实施方式中，所述洗脱缓冲液的pH范围为3.0-4.5，例如3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5。
在一些实施方式中，所述洗脱前处理缓冲液的pH值比所述洗脱缓冲液的pH值高2.0～4.5，例如高2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5。
在一些实施方式中，所述洗脱前处理缓冲液选自：Bis-Tris缓冲体系、Tris缓冲体系(如Tris-HCl缓冲体系)、MES缓冲体系、醋酸-醋酸钠缓冲体系、醋酸钠缓冲体系、组氨酸缓冲体系、柠檬酸缓冲体系、磷酸缓冲体系。
在一些实施方式中，当洗脱缓冲液为组氨酸缓冲体系时，所述洗脱前处理缓冲液不是组氨酸缓冲体系或具有与洗脱缓冲液不同的pH。
在一些实施方式中，所述洗脱缓冲液选自：氨基酸缓冲体系。
在一些实施方式中，所述洗脱缓冲液体系选自：Leu、Gly、Val、Thr、Met、Asn、Phe、Trp、His、Glu、Gln、Ser、Arg和Ala缓冲体系。
在一些实施方式中，所述洗脱前处理缓冲液中还包含添加剂，例如氯化钠、氯化钾、硫氰酸钠、硫氰酸钾、精氨酸盐酸、组氨酸、咪唑等。
在一些实施方式中，所述添加剂的浓度为0-2M，例如0-0.1M、0-0.2M、0-0.5M、0-1M、0-1.5M、0-1.8M、0-2M。
在一些实施方式中，相较于采用pH 3.5的对照醋酸-醋酸钠洗脱体系，所述方法：提高了洗脱产物的pH(例如使得洗脱产物的pH升高至少0.5，例如升高0.5-3)、降低了目标蛋白在低pH洗脱下的降解、减少了亲和纯化洗脱中的多聚体形成、降低了洗脱产物的电导率(例如使得洗脱产物的电导率降低至少0.3mS/cm，例如降低0.3-4mS/cm)、维持或提高了目标蛋白收率和/或有利于后续精纯步骤。
在一些实施方式中，，所述方法还包括上样前步骤(例如柱平衡、消毒)、洗脱后样品处理步骤、洗脱后柱处理步骤等常规步骤。
在一些实施方式中，亲和纯化中所用填料选自：蛋白A及其衍生方法的亲和纯化填料，例如苏州纳微科技的Unimab系列、GE的Mabselect SuRe、博格龙的Dimond系列、Milipore的Eshnuno A系列、JSR的Amsphere系列和TOSOH的AF-rProtein HC系列。
在本文的一些方面中，提供了一种亲和纯化产品，其包含了如下中的一种或多种：如本文所述的洗脱前处理缓冲液；如本文所述的洗脱缓冲液；用于配制所述洗脱前处理缓冲液的物质；用于配制所述洗脱缓冲液的物质；和/或前述的组合。
在一些实施方式中，所述产品还可任选地包含选自下组的其他物质：预填充层析柱、层析填料、平衡缓冲液、消毒液、上样溶液、容器、说明书等。
本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。
图1：实施例1中单抗蛋白1对照组的洗脱结果。
图2：实施例1中单抗蛋白1的pH偏移洗脱结果。
图3：实施例1中单抗蛋白2对照组的洗脱结果。
图4：实施例1中单抗蛋白2的pH偏移洗脱结果。
图5：实施例1中单抗蛋白3对照组的洗脱结果。
图6：实施例1中单抗蛋白3的pH偏移洗脱结果。
图7：实施例1中单抗蛋白4对照组的洗脱结果。
图8：实施例1中单抗蛋白4的pH偏移洗脱结果。
图9：实施例2中双抗蛋白1对照组的洗脱结果。
图10：实施例2中双抗蛋白1的pH偏移洗脱结果。
图11：实施例2中双抗蛋白2对照组的洗脱结果。
图12：实施例2中双抗蛋白2的pH偏移洗脱结果。
图13：实施例3中单抗蛋白3，50mM Leu-HCl，pH 3.5洗脱结果。
图14：实施例3中单抗蛋白3，50mM Gly-HCl，pH 3.5洗脱结果。
图15：实施例3中单抗蛋白3，50mM Val-HCl，pH 3.5洗脱结果。
图16：实施例3中单抗蛋白3，50mM Thr-HCl，pH 3.5洗脱结果。
图17：实施例3中单抗蛋白3，50mM Met-HCl，pH 3.5洗脱结果。
图18：实施例3中单抗蛋白3，50mM Asn-HCl，pH 3.5洗脱结果。
图19：实施例3中单抗蛋白3，50mM Phe-HCl，pH 3.5洗脱结果。
图20：实施例3中单抗蛋白3，30mM Trp-HCl，pH 3.5洗脱结果。
图21：实施例3中单抗蛋白3，50mM His-HCl，pH 3.5洗脱结果。
图22：实施例3中单抗蛋白3，50mM Glu-HCl，pH 3.5洗脱结果。
图23：实施例3中单抗蛋白3，50mM Gln-HCl，pH 3.5洗脱结果。
图24：实施例3中单抗蛋白3，50mM Ser-HCl，pH 3.5洗脱结果。
图25：实施例3中单抗蛋白3，50mM Ala-HCl，pH 3.5洗脱结果。
图26：预处理缓冲液缓冲能力图谱。
图27：洗脱缓冲液缓冲能力图谱。
注：图1～25中，“UV_1_280_Chorm.1”表示280nm下测定的吸光度；“Cond_Chrom.1”表示电导率；“Fraction_Chorm”表示收集方式；“pH_Chrom.1”表示洗脱pH。左侧纵坐标表示UV吸收值，右侧纵坐标表示电导值，横坐标表示体积CV数，1A1等数据表示收集位置。
图26和27中，横坐标表示加入的调节液的体积或者比例，纵坐标表示pH。
具体实施方式
目前，随着生物医药的发展，工艺的稳健性对于抗体类药物生产至关重要。本申请中提供了一种新颖的亲和工艺，其能够在直接捕获目的蛋白的同时，有效提高洗脱产品所在的pH，从而大大减轻后续精纯步骤的压力，提高下游工艺的稳健性。
具体而言，传统的亲和层析层析仅仅作为目的蛋白的捕获步骤，一般在较低的pH(例如低于pH 3.8)下进行洗脱，而洗脱产品的pH通常在4.0左右。这对于某些pH敏感的蛋白质而言可能会影响其稳定性，且容易形成多聚体，且对于后续精纯步骤造成了一定的压力。
为了克服这一技术难点，本申请中对亲和纯化工艺进行了系统优化，创新性地引入了pH偏移洗脱理念，柱上提高了洗脱产品所在的pH环境，解决了如上所述的低pH敏感型蛋白质在洗脱中所遇到的问题，从而减轻后续精纯步骤的压力，有效提高下游工艺的稳健性。
本申请采取pH偏移洗脱，虽然洗脱液仍然为低pH洗脱液，但是通过该pH偏移技术可使得洗脱下来的产品立即处于相对比较高的pH环境，不仅避开了低pH诱发多聚体形成的风险，而且能够有效地降低产品的电导从而有利于后续精纯步骤的开发。
本公开的方法保证了低pH敏感型蛋白质的稳定性，使得亲和捕获方法也能适用于低pH敏感型蛋白质，从而减轻后续精纯步骤的压力，有效提高下游工艺的稳健性。该工艺策略打破了传统观念，工艺稳健且易于放大，可广泛应用于抗体类药物的纯化，特别是低pH不稳定且易产生多聚体的高挑战性产品。
本申请的方法简单，可操作性强，且可放大，已经经过30L工艺放大验证。
本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
洗脱前处理缓冲液以及洗脱缓冲液
本公开中通过在亲和洗脱过程中引入相对于常规洗脱液具有较强缓冲能力的高pH洗脱前处理缓冲液和低pH洗脱缓冲液，使得洗脱过程中洗脱产品的pH在柱上出现了向上偏移，最终使得蛋白迅速处于一个比较稳定的高pH环境中。
本公开的洗脱前处理缓冲液的pH约为6.0-8.5，例如6.0-8.0、7.0-7.5、7.2-7.4等。本公开的洗脱缓冲液的pH范围为2.5-4.5，例如3.0-4.0、3.2-3.8、3.5-3.6等。在一些实施方式中，洗脱前处理缓冲液的pH值比洗脱缓冲液的pH值至少高3.0，例如至少高3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、4.0等。
缓冲液的缓冲能力可通过酸碱滴定来确定，同样的起始体积和pH的缓冲液滴定到同样的pH值加入的酸碱的量越多缓冲能力越强。
在一些实施方式中，前处理缓冲液的缓冲能力排序如下：
Na-Citrate>NaAC>His-HCl>PB>MES>Bis-Tris>Tris-HCl。
在一些实施方式中，洗脱液缓冲液的缓冲能力排序如下：
NaAc>Gly>Leu>Ala>His>Val>Met>Asn>Thr>Ser>Phe。
在一些实施方式中，洗脱前处理缓冲液的缓冲能力比所述洗脱缓冲液的缓冲能力强。
可采用本领域中已知的缓冲液作为本公开的洗脱前处理缓冲液和洗脱缓冲液，所选缓冲液应符合洗脱前处理缓冲液具有较强缓冲能力和高pH，而洗脱缓冲液具有较低缓冲能力的低pH的条件。
本公开的洗脱前处理缓冲液体系可包括但不限于：Bis-Tris缓冲体系、Tris缓冲体系、MES缓冲体系、醋酸钠缓冲体系、组氨酸缓冲体系、柠檬酸缓冲体系和磷酸缓冲体系等。
本公开的洗脱缓冲液，可包括但不限于：氨基酸缓冲体系和其他类的缓冲能力较弱的缓冲体系。氨基酸缓冲体系可包括例如Leu、Val、Met、Ala、Phe、Trp、Thr、Asn、Gln、Ser、Glu、His、Arg、Gly，以及和这些氨基酸在结构和功能分类上属于同一类的氨基酸。在一些实施方式中，当洗脱前处理缓冲液为组氨酸缓冲液时，洗脱缓冲液不为相同的组氨酸缓冲液。
在一些实施方式中，用于本文pH偏移洗脱的洗脱前处理缓冲液-洗脱缓冲液体系可包括但不限于如下组合：Bis-Tris+亮氨酸盐酸；Bis-Tris+甘氨酸盐酸；Bis-Tris+缬氨酸盐酸；Bis-Tris+苏氨酸盐酸；Bis-Tris+甲硫氨酸盐酸；Bis-Tris+苯丙氨酸盐酸；Bis-Tris+色氨酸盐酸；Bis-Tris+天冬酰胺盐酸；Bis-Tris+组氨酸盐酸；Bis-Tris+谷氨酸盐酸；Bis-Tris+谷氨酰胺盐酸；Bis-Tris+丝氨酸盐酸；Bis-Tris+丙氨酸盐酸；Tris+亮氨酸盐酸；His-HCl+亮氨酸盐酸；MES+亮氨酸盐酸；PB+亮氨酸盐酸；柠檬酸钠+亮氨酸盐酸；醋酸-醋酸钠+亮氨酸盐酸。在一些实施方式中，所述组合中洗脱前处理缓冲液的pH为5.5-7.5，洗脱缓冲液的pH为3.0-4.0，例如3.5。在一些实施方式中，所述组合中洗脱前处理缓冲液的浓度为30-60mM，例如50mM，洗脱缓冲液的浓度为30-60mM，例如30、40、50或60mM。
在洗脱前处理缓冲液和/或洗脱缓冲液中加入添加剂，以例如改变其离子强度。添加剂可包括但不限于：氯化钠、氯化钙、咪唑、硫氰酸钠、硫氰酸钾、精氨酸盐酸等。可根据需要调整添加剂的量，例如其量可为0-2M、0-1.5M、0-1.0M、0-0.8M、0-0.5M、0-0.3M或0-0.1M。
目标蛋白(多肽)
如本文所用，术语“目标蛋白(多肽)”和“样品蛋白(多肽)”可互换使用，是指可用本申请方法亲和纯化的所需蛋白质或多肽。目标蛋白可与亲和载体结合，并在洗脱条件下被洗脱收集。
目标蛋白或多肽可以是天然产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等动物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。在一些实施方式中，所述目标蛋白是包含Fc片段的蛋白质，包括但不现有：多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体或Fc融合蛋白等。
在一些实施方式中，本申请的方法尤为适合于对低pH敏感和/或在常规低pH洗脱中易于产生多聚体的目标蛋白的亲和纯化。
pH偏移亲和纯化
本采用本申请的方法对目标蛋白进行亲和纯化。如本文所述，术语“pH偏移亲和纯化”是指通过在亲和洗脱过程中采用具有较强缓冲能力的高pH洗脱前处理缓冲液，并采用具有较低缓冲能力的低pH洗脱缓冲液进行亲和纯化的方法。采用pH偏移亲和纯化，使得洗脱过程中洗脱产品的pH在柱上出现了向上偏移，且可提高洗脱产物的pH值、降低洗脱产物的电导率，从而解决了低pH敏感蛋白的问题，减轻后续精纯步骤的压力，有效提高下游工艺的稳健性。
除了采用特定的洗脱前处理缓冲液和洗脱缓冲液以及增加洗脱前处理步骤以外，可采用常用的亲和纯化步骤和条件。例如，本公开的亲和纯化过程可包括以下步骤：
(a)填装或提供层析柱，可选择例如各种市售的亲和层析柱；
(b)漂洗，例如采用平衡缓冲液(例如2-5倍柱体积)漂洗层析柱；
(c)消毒，例如采用3-7倍柱体积的NaOH消毒层析柱；
(d)平衡，例如采用3-7倍柱体积的平衡缓冲液淋洗层析柱；
(e)上样，例如让样品在柱上保留不低于5分钟；
(f)上样后平衡，例如用平衡缓冲液淋洗层析柱，冲洗出未结合的样品；
(g)洗脱前处理缓冲液淋洗，例如用3-7倍柱体积的洗脱前处理缓冲液淋洗层析柱；
(h)产品洗脱，例如用洗脱缓冲液从层析柱上洗脱产品；
(i)收集，例如基于UV280收集洗脱产品。
以上步骤可在室温下进行，或根据需要适当升高或降低温度。可根据需要选择用于漂洗、消毒、平衡、洗脱前处理、洗脱等的流体体积，通常可为柱体积的1至数倍，例如1-20倍、1-10倍、2-8倍、3-7倍、2-5倍等。
本公开的方法可适用于各种亲和填料，包括但不限于：苏州纳微科技的Unimab系列；GE的Mabselect SuRe；博格龙的Dimond系列；Millipore的Eshnuno A；JSR的Amsphere系列；TOSOH的AF-rProtein HC系列以及具有类似结构和功能的亲和填料。
在一些实施方式中，采用的亲和介质为Protein A，其可交联到例如琼脂糖、羟基化聚醚树脂、聚丙烯酸树脂、聚苯乙烯二乙烯苯基树脂、聚甲基丙烯酸树脂、聚苯乙烯树脂、羟基磷灰石、玻璃等基质上。
产品
本申请中还提供了与本公开的pH偏移亲和纯化方法相对应的产品，其中至少包含了如下中的一种或多种：如前所公开的洗脱前处理缓冲液；如前所公开的洗脱缓冲液；用于配制所述洗脱前处理缓冲液的物质；用于配制所述洗脱缓冲液的物质；或前述的组合。
本公开的产品还可根据需要包括其他物质，所述其他物质包括但不限于：预填充层析柱、层析填料、平衡缓冲液、消毒液、上样溶液、容器、说明书等。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1.pH偏移洗脱法在单抗蛋白亲和层析工艺中的作用
实验分组
实验组：用pH 7.4的50mM Tris-HAc、150mM NaCl(包含Tris-HAc和NaCl的水溶液)，作为平衡1和上样后平衡2的平衡缓冲液(下文“洗脱步骤”部分中步骤1、3和5中的平衡缓冲液均为该平衡缓冲液)平衡1和平衡2均为同一种缓冲液(即pH 7.4的50mM Tris-HAc、150mM NaCl)；将0.1M的NaOH水溶液作为消毒剂；将pH 7.2的50mM Bis-Tris用作洗脱前处理缓冲液；氨基酸缓冲体系(50mM亮氨酸盐酸，pH 3.5)作为洗脱缓冲液。上样用Protein A层析柱(GE Mabselect SuRe LX)，上样载量为20～30mg/mL。
对照组：用pH 7.4的50mM Tris-HAc、150mM NaCl，作为平衡1和上样后平衡2的平衡缓冲液；将0.1M的NaOH水溶液作为消毒剂；将pH 7.2的50mM Bis-Tris作为洗脱前处理缓冲液；醋酸钠缓冲体系(30～50mM醋酸钠水，pH 3.5)作为洗脱缓冲液。上样用Protein A层析柱(GE Mabselect SuRe LX)，上样载量为20～30mg/mL。
洗脱步骤
1.用2～5倍柱体积的平衡缓冲液平衡1漂洗层析柱；
2.用3～7倍柱体积的NaOH消毒剂消毒层析柱；
3.用3～7倍柱体积的平衡缓冲液平衡2平衡层析柱；
4.上样，让样品在柱上保留不低于5分钟；
5.用平衡3缓冲液淋洗层析柱，冲洗出未结合的发酵液；
6.用3～7倍柱体积的洗脱前处理缓冲液淋洗层析柱；
7.用洗脱缓冲液洗脱产品；
8.基于UV280收集洗脱产品。
洗脱产品的分析
收集洗脱样品，测定其中蛋白质浓度，计算得率，并测定产品pH。
其中SEC HPLC为商业化的单抗方法，Main是单体，HMW是多聚体，LMW是低聚体。
结果分析
由图1-8和表1-4可以明显看出在洗脱阶段，洗脱pH高于对照组洗脱pH，实验组的电导率低于对照电导率。
由表5中可以看出，相对于直接洗脱(仅洗脱不中和)或者洗脱后直接中和(中和至pH 5.5)，pH偏移洗脱在确保得率的情况下，使得蛋白质更稳定。其中，HMW部分代表了多聚体的分布，从数值比较可见，采用pH偏移洗脱使得多聚体的含量相对于未经中和与经过中和的对照洗脱物呈减少，分别减少了7.5％和9.8％。
体积(CV)的差异表明本发明的方案有利于提供更佳的洗脱pH和电导。
结果显示，通过pH偏移洗脱，所能获得的目标蛋白的得率基本不受影响，而洗脱液pH提高，电导率降低，并且高聚物杂质的含量也所有降低。结果表明本申请的pH偏移洗脱可有效减轻后续精纯步骤的压力，提高下游工艺的稳健性，可广泛应用于抗体药物的纯化，特别是低pH不稳定且多聚体挑战大的产品。
表1.单抗蛋白1洗脱
“CV”对应于“柱体积”
表2.单抗蛋白2洗脱
表3.单抗蛋白3洗脱
表4.单抗蛋白4洗脱
表5.单抗蛋白3洗脱质量对比
实施例2.提高亲和洗脱液pH值在双抗蛋白1和双抗蛋白2亲和层析工艺中的作用
实验组中，用50mM的Tris-HAc、150mM NaCl、pH 7.4，作为平衡1和上样后的平衡2缓冲液；0.1M的NaOH水溶液作为消毒剂；50mM的50mM Bis-Tris,pH 7.2作为洗脱前处理缓冲液；氨基酸缓冲体系(50mM亮氨酸盐酸，pH 3.5)作为洗脱缓冲液。上样用Protein A层析柱(GE Mabselect SuRe LX)，上样载量为20-30mg/mL。
对照组中，用50mM的Tris-HAc、150mM NaCl、pH 7.4，作为平衡1和上样后的平衡2缓冲液；0.1M的NaOH水溶液作为消毒剂；50mM的50mM Bis-Tris,pH 7.2作为洗脱前处理缓冲液；醋酸钠缓冲体系(30-50mM醋酸钠溶液，pH 3.5)作为洗脱缓冲液。上样用Protein A层析柱(GE Mabselect SuRe LX)，上样载量为20-30mg/mL。
用2-5倍柱体积的平衡1缓冲液漂洗层析柱后用3-7倍柱体积的NaOH消毒层析柱；用3-7倍柱体积的平衡2缓冲液平衡层析柱；上样，让样品在柱上保留不低于5分钟；用平衡3缓冲液淋洗层析柱，冲洗出未结合的发酵液；然后用3-7倍柱体积的洗脱前处理缓冲液淋洗层析柱；洗脱缓冲液洗脱产品，洗脱产品基于UV280进行收集。收集洗脱样品测定浓度计算得率，测量产品pH。
由图9-12和表6-7可以明显看到洗脱pH高于常规的对照组洗脱pH，且电导低于常规的电导。
结果显示，通过pH偏移洗脱，所能获得的目标蛋白的得率基本不受影响，而洗脱液pH提高，电导率降低。结果表明本申请的pH偏移洗脱可有效减轻后续精纯步骤的压力，提高下游工艺的稳健性，可应用于双抗药物的纯化。
表6.双抗蛋白1洗脱
表7.双抗蛋白2洗脱
实施例3.不同氨基酸洗脱缓冲液在单抗蛋白3的pH偏移洗脱亲和层析工艺中的作用
实验组中，用50mM的Tris-HAc、150mM NaCl、pH 7.4，作为平衡1和上样后的平衡2缓冲液；0.1M的NaOH水溶液作为消毒剂；50mM Bis-Tris,pH 7.2作为洗脱前处理缓冲液；氨基酸缓冲体系(30-50mM氨基酸盐酸，pH 3.5，包括Leu、Gly、Val、Thr、Met、Asn、Phe、Trp、His、Glu、Gln、Ser和Ala等氨基酸)作为洗脱缓冲液。上样用Protein A层析柱(GEMabselect SuRe LX)，上样载量为20-30mg/mL。
对照组中，用50mM的Tris-HAc、150mM NaCl、pH 7.4，作为平衡1和上样后的平衡2缓冲液；0.1M的NaOH水溶液作为消毒剂；50mM的50mM Tris-HCl,pH 7.2作为洗脱前处理缓冲液；醋酸钠缓冲体系(30-50mM醋酸钠溶液，pH 3.5)作为洗脱缓冲液。上样用Protein A层析柱(GE Mabselect SuRe LX)，上样载量为20-30mg/mL。
用2-5倍柱体积的平衡1缓冲液漂洗层析柱后用3-7倍柱体积的NaOH消毒层析柱；用3-7倍柱体积的平衡2缓冲液平衡层析柱；上样，让样品在柱上保留不低于5分钟；用平衡3缓冲液淋洗层析柱，冲洗出未结合的发酵液；然后用3-7倍柱体积的洗脱前处理缓冲液淋洗层析柱；洗脱缓冲液洗脱产品，洗脱产品基于UV280进行收集。
收集洗脱样品测定浓度计算得率，测量产品pH。由图5、图13-25和表8可以明显看到洗脱pH高于常规的对照组洗脱pH，且电导低于常规的电导。
结果显示，通过pH偏移洗脱，所能获得的目标蛋白的得率基本不受影响，而洗脱液pH提高，电导率降低。结果表明采用各种氨基酸缓冲液进行本申请的pH偏移洗脱可有效减轻后续精纯步骤的压力，提高下游工艺的稳健性，可应用于抗体药物的纯化。
表8.不同的氨基酸缓冲液洗脱
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*由于Trp的UV吸收，难以测定其得率
实施例4.洗脱前处理缓冲液在单抗蛋白3的pH偏移洗脱亲和层析工艺中的作用
实验组中，用50mM的Tris-HAc、150mM NaCl、pH 7.4，作为平衡1和上样后的平衡2缓冲液；0.1M的NaOH水溶液作为消毒剂；洗脱前处理缓冲液有50mM Tris,pH 7.2；50mMHis-HCl,pH 6.0；50mM MES,pH 6.3；50mM PB pH 7.2；50mM Na-Citrate pH 5.5和50mMNaAC-HAc,pH 5.5；以氨基酸缓冲体系(50mM亮氨酸盐酸，pH 3.5)作为洗脱缓冲液。上样用Protein A层析柱(GE Mabselect SuRe LX)，上样载量为20-30mg/mL。
对照组中，用50mM的Tris-HAc、150mM NaCl、pH 7.4，作为平衡1和上样后的平衡2缓冲液；0.1M的NaOH水溶液作为消毒剂；50mM Tris，pH 7.2作为洗脱前处理缓冲液；50mMNaAC-HAc,pH 3.5作为洗脱缓冲液。上样用Protein A层析柱(GE Mabselect SuRe LX)，上样载量为20-30mg/mL。
用2-5倍柱体积的平衡1缓冲液漂洗层析柱后用3-7倍柱体积的NaOH消毒层析柱；用3-7倍柱体积的平衡2缓冲液平衡层析柱；上样，让样品在柱上保留不低于5分钟；用平衡缓3冲液淋洗层析柱，冲洗出未结合的发酵液；然后用3-7倍柱体积的洗脱前处理缓冲液淋洗层析柱；洗脱缓冲液洗脱产品，洗脱产品基于UV280进行收集。收集洗脱样品测定浓度计算得率，测量产品pH。
由表9可以明显看到实验组洗脱pH高于对照组洗脱pH，实验组电导低于对照组洗脱电导。
表9.不同的洗脱前处理缓冲液体系在蛋白3洗脱过程的评估
实施例5.洗脱前处理缓冲液在pH偏移洗脱亲和层析工艺中的作用
实验组中，用50mM的Tris-HAc、150mM NaCl、pH 7.4，作为平衡1和上样后的平衡2缓冲液；0.1M的NaOH水溶液作为消毒剂；洗脱前处理缓冲液有50mM Tris，pH 7.2；50mMHis-HCl，pH 6.0；50mM MES，pH 6.3；50mM PB，pH 7.2；50mM Na-Citrate，pH 5.5；50mMBis-Tris，pH 7.2和50mM NaAC-HAc，pH 5.5；以氨基酸缓冲体系(50mM亮氨酸盐酸，pH 3.5)作为洗脱缓冲液。上样用Protein A层析柱(GE Mabselect SuRe LX)，上样载量为20-30mg/mL。
对照组中，用50mM的Tris-HAc、150mM NaCl、pH 7.4，作为平衡1和上样后的平衡2缓冲液；0.1M的NaOH水溶液作为消毒剂；50mM Tris,pH 7.2作为洗脱前处理缓冲液；50mMNaAC-HAc，pH 3.5作为洗脱缓冲液。上样用Protein A层析柱(GE Mabselect SuRe LX)，上样载量为20-30mg/mL。
用2-5倍柱体积的平衡1缓冲液漂洗层析柱后用3-7倍柱体积的NaOH消毒层析柱；用3-7倍柱体积的平衡1缓冲液平衡层析柱；用平衡1缓冲液代替上样，让样品在柱上保留不低于5分钟；用平衡3缓冲液淋洗层析柱，冲洗出未结合的发酵液；然后用3-7倍柱体积的洗脱前处理缓冲液淋洗层析柱；模拟洗脱缓冲液洗脱产品，每个CV分开收集，检测pH。
收集洗脱样品用UV280测定浓度计算得率，测量产品pH。由表10可以明显看出实验组洗脱pH高于的对照组洗脱pH，且电导也低于对照洗脱电导。
表10.不同的洗脱前处理缓冲液体系在pH偏移洗脱过程的评估
实施例6.不同填料在pH偏移洗脱亲和层析工艺中的评估
150mM NaCl、pH 7.4，作为平衡1和上样后的平衡2缓冲液；0.1M的水NaOH溶液作为消毒剂；50mM的50mM Bis-Tris,pH 7.2作为洗脱前处理缓冲液；氨基酸缓冲体系(50mM亮氨酸盐酸，pH 3.5)作为洗脱缓冲液。上样用Protein A层析柱(包括苏州纳微科技的Unimab系列、GE的Mabselect SuRe、博格龙的Diamond系列、Milipore的Eshnuno A、JSR的Amsphere系列和TOSOH的AF-rProtein HC系列)，上样载量为20-30mg/mL。
对照组中，用50mM的Tris-HAc、150mM NaCl、pH 7.4，作为平衡1和上样后的平衡2缓冲液；0.1M的NaOH水溶液作为消毒剂；50mM的50mM Bis-Tris,pH 7.2作为洗脱前处理缓冲液；醋酸钠缓冲体系(50mM醋酸钠溶液，pH 3.5)作为洗脱缓冲液。上样用Protein A层析柱(GE Mabselect SuRe LX)，上样载量为20-30mg/mL。
用2-5倍柱体积的平衡1缓冲液漂洗层析柱后用3-7倍柱体积的NaOH消毒层析柱；用3-7倍柱体积的平衡2缓冲液平衡层析柱；上样，让样品在柱上保留不低于5分钟；用平衡3缓冲液淋洗层析柱，冲洗出未结合的发酵液；然后用3-7倍柱体积的洗脱前处理缓冲液淋洗层析柱；模拟洗脱缓冲液洗脱产品，每个CV分开收集，检测pH。
收集洗脱样品测定浓度计算得率，测量产品pH。由表11可以明显看到在洗脱阶段，在不同填料中，洗脱pH相对于对照组都有不同程度的提高。
表11.不同的填料在pH偏移洗脱过程的评估
实施例7.洗脱前处理缓冲液中不同添加剂浓度在pH偏移洗脱亲和层析工艺中的评估
实验组中，用50mM的Tris-HAc、150mM NaCl、pH 7.4，作为平衡1和上样后的平衡2缓冲液；0.1M的NaOH溶液作为消毒剂；50mM Bis-Tris+300mM NaCl，pH 7.2和50mM Bis-Tris+1000mM NaCl，pH 7.2分别作为洗脱前处理缓冲液；氨基酸缓冲体系(50mM亮氨酸盐酸，pH 3.5)作为洗脱缓冲液。上样用Protein A层析柱(包括，GE Mabselect SuRe LX，)，上样载量为20-30mg/mL。
对照组中，用50mM的Tris-HAc、150mM NaCl、pH 7.4，作为平衡1和上样后的平衡2缓冲液；0.1M的NaOH溶液作为消毒剂；50mM的50mM Bis-Tris,pH 7.2作为洗脱前处理缓冲液；氨基酸缓冲体系(50mM亮氨酸盐酸，pH 3.5)作为洗脱缓冲液。上样用Protein A层析柱(包括，GE Mabselect SuRe LX，)，上样载量为20-30mg/mL。
用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱后用3-7倍柱体积的NaOH消毒层析柱；用3-7倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱；上样，让样品在柱上保留不低于5分钟；用平衡缓冲液淋洗层析柱，冲洗出未结合的发酵液；然后用3-7倍柱体积的洗脱前处理缓冲液淋洗层析柱；模拟洗脱缓冲液洗脱产品，每个CV分开收集，检测pH。
收集洗脱样品UV280测定浓度计算得率，测量产品pH。由表12可以明显看到在洗脱阶段，洗脱pH相对于对照组都有一定程度的提高。
表12.洗脱前处理添加剂的评估
实施例8.洗脱前处理缓冲液与洗脱缓冲液缓冲能力排序和比较
通过酸碱滴定确定洗脱前处理缓冲液和洗脱缓冲液的缓冲能力，并对其进行排序和比较。滴定具体操作如下：
同样的起始体积的缓冲液滴定到同样的pH值加入的酸碱的量越多，缓冲能力越强。滴定结果如图26和图27所示。
如图26所示，前处理缓冲液的缓冲能力排序如下：
Na-Citrate>NaAC>His-HCl>PB>MES>Bis-Tris>Tris-HCl。
如图27所示，洗脱液缓冲液的缓冲能力排序如下：
NaAc>Gly>Leu>Ala>His>Val>Met>Asn>Thr>Ser>Phe。
在本申请中，通过选择，使得洗脱前处理缓冲液的缓冲能力比所述洗脱缓冲液的缓冲能力强。如图26和图27所示，在缓冲液加入同样比例的时候，测试组的pH发生骤变(图27)，而醋酸钠或者醋酸体系或者前处理缓冲液体系都显示较缓和的变化过程(图26和图27)。该结果提示洗脱缓冲液的缓冲能力低于测试的醋酸钠或醋酸-醋酸钠洗脱缓冲液。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (21)
1. 一种蛋白质亲和纯化方法，所述方法包括如下步骤：
(a) 用pH为6.0-7.2的一种洗脱前处理缓冲液淋洗上样后的亲和层析柱；以及
(b) 用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白，其中所述洗脱缓冲液为pH 3.5-4.5的氨基酸缓冲体系；
其中，所述洗脱前处理缓冲液的缓冲能力高于所述洗脱缓冲液的缓冲能力，
且其中，所述洗脱前处理缓冲液选自：BisTris-HCl、Tris、His-HCl、MES、PB、Na-Citrate、NaAc-HAc；所述氨基酸缓冲体系中的氨基酸种类选自：Leu、Val、Thr、Met、Asn、Phe、Trp、Gln、Ser、Ala和Glu，
所述目标蛋白为对低pH敏感和/或在常规低pH洗脱中易于产生多聚体的蛋白质。
2. 如权利要求1所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，所述蛋白质亲和纯化选自：Protein A亲和层析、Protein G亲和层析和Protein A/G亲和层析。
3.如权利要求1所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，所述目标蛋白为包含Fc区段的蛋白质分子。
4.如权利要求1所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，所述目标蛋白为抗体。
5.如权利要求1所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，所述目标蛋白选自：多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
6.如权利要求1所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，所述目标蛋白为Fc融合蛋白。
7. 如权利要求1所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，
所述洗脱前处理缓冲液的pH为6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2；和/或
所述洗脱缓冲液的pH为3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5；和/或
所述洗脱前处理缓冲液的pH值比所述洗脱缓冲液的pH值高2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7。
8.如权利要求1所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，所述洗脱前处理缓冲液中还包含添加剂，所述添加剂选自：氯化钠、氯化钾、硫氰酸钠、硫氰酸钾、精氨酸盐酸、组氨酸、咪唑；和/或
所述添加剂的浓度为0-2 M。
9. 如权利要求8所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，所述添加剂的浓度为0-0.1 M。
10.如权利要求8所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，所述添加剂的浓度为0-0.2M。
11. 如权利要求8所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，所述添加剂的浓度为0-0.5 M。
12. 如权利要求8所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，所述添加剂的浓度为0-1 M。
13. 如权利要求8所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，所述添加剂的浓度为0-1.5 M。
14. 如权利要求8所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，所述添加剂的浓度为0-1.8 M。
15. 如权利要求1所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，相较于采用pH 3.5的对照醋酸-醋酸钠洗脱体系，所述方法：提高了洗脱产物的pH、降低了目标蛋白在低pH洗脱下的降解、减少了亲和纯化洗脱中的多聚体形成、降低了洗脱产物的电导率、维持或提高了目标蛋白收率和/或有利于后续精纯步骤；和/或
所述低pH洗脱的pH低于3.8；和/或
所述洗脱产物的pH为4.0。
16. 如权利要求15所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，相较于采用pH 3.5的对照醋酸-醋酸钠洗脱体系，所述方法使得洗脱产物的pH升高至少0.5，和/或使得洗脱产物的电导率降低至少0.3 mS/cm。
17. 如权利要求15所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，相较于采用pH 3.5的对照醋酸-醋酸钠洗脱体系，所述方法使得洗脱产物的pH升高0.5-3，和/或使得洗脱产物的电导率降低0.3-4 mS/cm。
18.如权利要求1所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，所述方法还包括上样前步骤、洗脱后样品处理步骤、洗脱后柱处理步骤；和/或
亲和纯化中所用填料选自：蛋白A及其衍生方法的亲和纯化填料。
19.如权利要求18所述的蛋白质亲和纯化方法，其中，所述上样前步骤选自柱平衡和消毒；和/或
所述亲和纯化填料选自下组：苏州纳微科技的Unimab系列、GE的Mabselect SuRe、博格龙的Dimond系列、Milipore 的Eshnuno A系列、JSR的Amsphere系列和TOSOH的AF-rProteinHC系列。
20.一种亲和纯化产品，其包含了如下中的一种或多种：
如权利要求1-19中任一项所涉及的洗脱前处理缓冲液；
如权利要求1-19中任一项所涉及的洗脱缓冲液；
用于配制所述洗脱前处理缓冲液的物质；
用于配制所述洗脱缓冲液的物质；或
前述的组合。
21.如权利要求20所述产品，其还包含选自下组的其他物质：预填充层析柱、层析填料、平衡缓冲液、消毒液、上样溶液、容器、说明书。
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| 边照阳等主编.《QuEChERS技术及应用》.中国轻工业出版社,2017,第93-94页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113980092A (zh) | 2022-01-28 |
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