TW201900257A - 使用親和力層析術純化抗體或其抗體片段的方法 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容有關使用親和力層析術分離和純化成高純度抗體或其抗體片段之方法，具體地，有關分離成高純度抗體和其抗體片段，且使用能夠增加安定性的洗析緩衝液純化該抗體及其抗體片段以增強安定性之方法。

Description

使用親和力層析術純化抗體或其抗體片段的方法
本揭示內容有關使用親和力層析術分離和純化成高純度抗體或其抗體片段的方法，並且具體地有關分離成高純度抗體和其抗體片段，且使用能夠增強安定性的洗析緩衝液分離該抗體和其抗體片段的方法。
重組蛋白質係藉由將目標蛋白質基因插入細菌或細胞中而表現和產生。除了目標蛋白外，在表現時獲得的原種培養物中還存在多種雜質，例如蛋白質同種型、二聚體、多聚體、單一抗體片段、衍生自宿主的DNA、衍生自宿主的蛋白質、內毒素等，以及需要用於除去雜質的純化程序以使目標蛋白質商業化。此等蛋白質治療劑的抗體片段用於藉由特異性結合靶標來顯示藥物成效。另外，由於沒有Fc的Fab沒有糖基或糖基化，因此它是非常有吸引力的治療劑，因為治療效果不受糖類型的影響。然而，與抗體不同，因為雜質和抗體片段的分子量之間的差異不大，難以使用層析術在整個純化程序中分離該雜質和抗 體。
使用親和樹脂的純化方法廣泛用於分離抗體片段的方法。例如，已知對於純化抗體的方法，可以藉由使用蛋白質A親和力層析術(國際專利申請號WO2011073954)純化目標產物中的雜質。然而，在該方法中，只要使用pH為約2至3的酸性緩衝溶液，就可以從樹脂中獲得目標蛋白質；也就是說，該方法的問題在於，由於洗析液的pH值低，目標蛋白質變得不安定。為了克服此問題，立即加入增加洗析緩衝液pH的緩衝溶液並將其混合到所得物中，以確保目標蛋白質的安定性。因為混合緩衝溶液以確保目標蛋白的安定性，該方法需要額外的濃縮/透析過程以除去混合的緩衝溶液，而伴隨不便和產率降低。
另外，對於純化抗體片段的方法，已知使用對位於輕鏈中的κ具有特異性親和性的樹脂的層析術方法來特異性地回收和純化目標蛋白質的方法(韓國專利申請號2016-0127317)。然而，這方法也具有缺點。具體地，抗體片段使用在載體中表現重鏈和輕鏈各者的系統，其中除了兩個鏈結的類型外，可表現其中僅存在輕鏈的蛋白質。即，存在如下問題：當使用對位於輕鏈中的κ具有親和性的樹脂時，應進一步純化和除去諸如輕鏈的單一片段的雜質。另外，類似於蛋白質A親和樹脂，需要用具有低pH(約pH2至pH3)的緩衝溶液洗析，因此獲得的抗體片段的安定性低。也就是說，該方法之缺點在於必需進行額外的濃縮/ 透析過程以補償缺陷。另外，該方法的純度和產率不高。
在此背景下，本案發明人已努力尋找一種即使在較高於傳統用於親和力層析術的pH條件下，也可用於純化成具有高純度和產率的目標蛋白質的方法。結果，他們已發現一種用於在使用重鏈親合力層析術和利用最佳化的洗析緩衝液時，純化成具有高純度和安定性的抗體和抗體片段的方法。
本揭示內容的目的是提供目標抗體或其抗體片段，其包含：(a)將含有抗體或其抗體片段的樣本加載到含有重鏈親和樹脂之親和力層析管柱；(b)用洗析緩衝液洗析管柱；(c)使用pH範圍為pH3.8至pH4.7的洗析緩衝液從親和力層析管柱回收目標抗體或其抗體片段。
在後文中，將詳細描述本揭示內容。
同時，本文揭露的各說明和例示性具體實施例可以應用於其他說明和例示性具體實施例。亦即，本文揭露的各種因素的所有組合都屬於本揭示內容的範疇。此外，本揭示內容的範疇不應受限於後文提供的具體揭示內容。
另外，彼等發明所屬技術領域中的技術人員將能夠基於例行實驗識別或確認本申請案中描述的本揭示內容的具體實施例的許多等效物，並且這些等效物旨在包括在本揭示內容中。
本發明的一個態樣是提供目標抗體或其抗體片段，其包含：(a)將含有抗體或其抗體片段的樣本加載到含有重鏈親和樹脂的親和力層析管柱；(b)用洗析緩衝液洗析管柱；(c)使用pH範圍為pH3.8至pH4.7的洗析緩衝液從親和力層析管柱回收目標抗體或其抗體片段。
通常，當使用含有親和樹脂的親和力層析術純化蛋白質時，主要使用pH2至pH3範圍的洗析緩衝液，導致目標蛋白質之安定性方面的問題(Pim Hermans等人，Monoclonal Antibodies，vol.1131，297-314p；Abhinav A.Shukla等人，BioProcess International，2005，36-44p)。為了解決此問題，需要進行校準工作以在低pH(pH 2至pH 3)下純化後將pH增加至pH 4至pH 7，並且存在進行這種額外過程的步驟中減少目標蛋白質的問題。然而，本揭示內容的重鏈親和樹脂的重要性在於，在pH3.8至pH4.7之pH範圍內產生具有高純度和安定性的目標蛋白質，這比一般親和樹脂所需的條件更為溫和。
用於純化目標抗體或其抗體片段的方法的每個步驟將詳細描述如下。首先，步驟(a)是將含有抗體或其抗體片段的樣本加載到含有重鏈親和樹脂的親和力層析管柱中的步驟。
如本文所用，術語“親和力層析術”是指使用對特定蛋白質具有親和力的結合物質的層析方法。對特定蛋白質具有親和力的結合物質是與官能基結合的聚合型物質；亦即，該結合物質與具有親和力的物質結合，該物質 溶解於極性和非極性溶液中。為了本揭示內容的目的，親和力層析術可以分為重鏈親和力層析術和輕鏈親和力層析術，但不限於此。具體地，重鏈親和力層析術是指使用能夠特異性地結合作為抗體一部分的重鏈的樹脂(例如，重鏈親和樹脂)的層析方法。另外，輕鏈親和力層析術是指使用能夠特異性地結合作為抗體一部分的輕鏈的樹脂(例如，輕鏈親和樹脂)的層析方法。
為了本揭示內容的目的，親和力層析術可為重鏈親和力層析術。具體地，可以使用能夠特異性地結合作為抗體一部分的重鏈的樹脂進行層析術。例如，CaptureSelectTM CH-1 XL Affinity Matrix(Thermo Fisher)可用於重鏈親和樹脂，但不限於此。任何能夠特異性地結合重鏈的樹脂均可用於重鏈親和樹脂。
在本揭示內容的一個具體實施例中，在加載步驟(a)的樣本(其含有抗體或其抗體片段)之前，可以使用pH範圍為pH5.5至pH7.5的緩衝液平衡管柱。緩衝液可以具體地包含選自下列所成群組之一種或多種鹽：磷酸鈉、氯化鈉、Tris、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、3-嗎啉基丙烷-1-磺酸(MOPS)、PIPES、磷酸鉀、氯化鉀及2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)，但不限於此。
在本揭示內容的一個具體實施例中，該方法可以進一步包括在步驟(a)之前進行離子交換層析術、濃縮及/或透析。其目的在於除去抗體或其抗體片段的主要雜質，並提高樣本的純度。具體地，在步驟(a)之前對含抗體片段 的樣本進行濃縮和透析，預先進行使用陰離子交換層析術純化樣本的步驟，然後可以利用重鏈親和樹脂將樣本加載至親合力層析術。可以無限制地應用任何操作，只要其除去不與親和樹脂接合的主要雜質，並且可以提高樣本的純度。
在用於純化目標抗體或其抗體片段的方法中，步驟(b)是用洗滌緩衝液洗滌管柱的步驟，其中該洗滌緩衝液施用於其中樣本經加載的層析術。
洗滌緩衝液可具有pH範圍為pH5.5至pH7.8，並且具有400mM至1M的鹽濃度，但pH和鹽濃度的範圍不限於此。
另外，洗滌緩衝液可包含選自下列所成群組之一種或多種鹽：磷酸鈉、氯化鉀、磷酸鉀、氯化鈉、Tris、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、3-嗎啉基丙烷-1-磺酸(MOPS)，PIPES及2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)，但不限於此。
為了本揭示內容的目的，在步驟(b)中，可以藉由洗滌緩衝液除去與重鏈親和樹脂非特異性地結合的雜質。
在本揭示內容的一個具體實施例中，純化方法可以進一步包括在步驟(a)或步驟(b)之後使用平衡緩衝液排出對樹脂沒有親和力的雜質。具體地，該步驟可以執行至少一次，但是通常，可以在沒有限制的情況下執行該步驟，直到建立平衡為止。
在本揭示內容的一個具體實施例中，純化方法可以進一步包括在步驟(a)或步驟(b)之後使用再平衡緩衝液再平衡管柱。再平衡緩衝液在與步驟(a)的平衡緩衝液相同的條件下流動，其中沒有反應，並且在洗滌和洗析的過程之間沒有洗析目標抗體或其抗體片段，然後在洗析緩衝液流動之前再次流動。因此，再平衡緩衝液用作清洗緩衝液和洗析緩衝液之間的橋接。
具體地，再平衡緩衝液可以具有pH範圍為pH4.5至pH6.5，並且具有10mM至30mM的鹽濃度，但pH和鹽濃度的範圍不限於此。
另外，再平衡緩衝液可包含選自下列所成群組之一種或多種鹽：磷酸鈉、氯化鈉、Tris、2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、3-嗎啉基丙烷-1-磺酸(MOPS)、PIPES、磷酸鉀、氯化鉀以及2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)，但不限於此。
在純化目標抗體或其抗體片段的方法中，步驟(c)是使用pH範圍為pH3.8至pH4.7的洗析緩衝液，從親合力層析管柱回收目標抗體或其抗體片段的步驟。
洗析緩衝液可以具有pH範圍為pH3.8至pH4.7，並且具有10mM至100mM的鹽濃度，但pH和鹽濃度的範圍不限於此。
即使當洗析緩衝液的pH低於pH3.8時，目標蛋白質仍然經洗析。然而，存在需要濃縮/透析過程和在低pH(pH 2至pH 3)下純化後增加pH(pH 4至pH7)的校準作 業的問題；及當使用傳統親和力層析術時也會發生這個問題。另外，不為高於pH4.7之pH不較佳，因為在管柱中維持重鏈的配位體與目標蛋白質形成氫鍵，因此不會被洗析。
另外，洗析緩衝液可以包含選自下列所成群組之鹽濃度範圍為10mM至100mM的一種或多種鹽：乙酸鈉、檸檬酸鈉及甘胺酸，但是可以無限制使用任何鹽，只要它們可以在重鏈親和力層析術的溫和條件下分離目標抗體或其抗體片段。
特別地，本揭示內容的純化方法的特徵在於在步驟(c)之後不進行濃縮/透析過程。“濃縮/透析過程”是通常用於去除尺寸小於膜上的目標物或用於更換緩衝液的物質的過程，因此為使用通用親和樹脂時用於進一步純化和去除單一片段(即，雜質)的過程。當另外使用濃縮/透析過程時，過程產率不高。然而，本揭示內容的純化方法具有經濟優勢，在於即使不進行額外的濃縮/透析過程，也可以藉由使用重鏈親和樹脂和洗析緩衝液的最佳化，而純化成高純度和產率的抗體或其抗體片段。
如本文所用，術語“目標抗體或其抗體片段”是指要從本揭示內容的親和力層析術分離的一種蛋白質，因此可與“目標蛋白”互換使用。
抗體可以特異性地為單株抗體。如本文所用，術語“單株抗體”是指可以由具有抗體編碼序列的細胞形成，並識別特定抗原的抗體。本揭示內容的抗體，可以較佳包 括發明所屬技術領域中傳統使用的所有治療性抗體，但不限於此。
另外，抗體是包含全長抗體和抗體片段的概念，抗體片段的實例包括全部的Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd等。Fv包括兩種形式的二硫化物安定的Fv(dsFv)和單鏈Fv(scFv)。Fd是指Fab中包含的重鏈組分。抗體片段是指僅使用對於結合抗體抗原必需的一些片段(例如，Fv，scFv和Fab)構成的抗體片段。此外，抗體片段廣泛用作蛋白質治療劑，因為它特異性地結合目標物以顯示藥效。此外，沒有Fc的Fab對取決於糖類型的治療效果沒有影響，因為其中不存在糖基或糖化。然而，與抗體不同，由於抗體片段與雜質相比沒有展現出大的分子量差異，因此難以使用純化方法中的層析術分離抗體片段。
使用本揭示內容的純化方法分離的目標抗體或其抗體片段是指純度為88%或更高的抗體或其抗體片段，具體地，純度可以是90%或更高，91%或更高，92%或更高，93%或更高，94%或更高，95%或更高，96%或更高，97%或更高，或98%或更高，但不限於此。術語“純度”是指已從其中除去雜質的純的抗體或其抗體片段。例如，若純度為92%，則意味著剩餘的8%是雜質。另外，純度可以簡單地表示從洗析緩衝液中分離的材料的純度，但最終純度百分比可以取決於加載的樣本的純度百分比而變化。
如本文所用，術語“雜質”包括目標抗體或其 抗體片段之外的任何材料。雜質的實例包括同型體、二聚體、多聚體、衍生自宿主的DNA、宿主衍生的蛋白質、內毒素等，但不限於此。
另外，目標抗體或其抗體片段的純度可以在從洗析緩衝液純化後藉由HPLC分析測量，並且具體地可以藉由CEX-HPLC分析，但不限於此。
另外，藉由本揭示內容的純化方法純化的抗體或其抗體片段可以用作治療性蛋白質。如本文所用，術語“治療性蛋白質”是統稱為生物醫學中傳統使用的蛋白質的概念，因此是指具有各種生理活性的蛋白質。生理活動調節遺傳表現和生理功能以矯正涉及體內功能調節的物質的缺乏或過度分泌所用引起的異常狀況，因此可包括在一般蛋白質治療劑中。
在本揭示內容中，可包括的治療性蛋白質沒有限制，只要該蛋白質在體內具有生理活性即可。治療性蛋白質的實例可以是其抗體或抗體片段的scFv、Fab、Fab'或F(ab')2，但不限於此。
根據本揭示內容的親和力層析術，除了目標蛋白質之外的大多數雜質不僅可以被除去，而且抗體或其抗體片段可以無需額外的過程(例如，濃度/透析)過程純化成高純度和產率。
第1圖顯示了進行本發明實驗的程序。
第2a圖顯示了在pH線性濃度梯度洗析的洗析緩衝液(pH3.8至pH5.6)的結果。
第2b圖顯示了在加載到管柱之前樣本的CEX-HPLC分析結果，證實了雜質被分離。
第2c圖顯示了由於對重鏈沒有親和力而離開管柱的物質的CEX-HPLC分析結果，證實了雜質經分離。
第2d圖顯示了使用洗滌緩衝液分離的物質的CEX-HPLC分析結果，證實了一些非特異性地結合管柱的雜質經分離。
第2e圖顯示了使用洗析緩衝液分離的物質的CEX-HPLC分析結果，證實分離的物質是目標抗體或其抗體片段，並且其純度為92%或更高。
第3a圖顯示洗析緩衝液在pH4.7具有最佳分離能力，並且分離了目標蛋白質。
第3b圖顯示了使用洗析緩衝液分離的物質的CEX-HPLC分析結果，證實從洗析緩衝液中分離的物質具有88%或更高的純度。
第4a圖顯示即使當洗析緩衝液的類型改變時，分離能力在相同的pH條件保持。
第4b圖顯示了使用洗析緩衝液分離的物質的CEX-HPLC分析。
結果，證實從洗析緩衝液中分離的物質具有90%或更高的純度。
第5a圖顯示洗析緩衝液在pH4.7具有最佳分離能力，並且分離了抗體。
第5b圖顯示了使用洗析緩衝液分離的物質的CEX-HPLC分析結果，證實從洗析緩衝液中分離的物質具有99%或更高的純度。
第6圖顯示當使用輕鏈親和樹脂時，當洗析緩衝液的pH為4.7時，不分離目標蛋白質。
第7a圖顯示當使用輕鏈親和樹脂時，洗析緩衝液在pH 2.7具有最佳分離能力，證實目標蛋白質被分離。
第7b圖顯示當使用輕鏈親和樹脂時使用洗析緩衝液分離的物質的CEX-HPLC分析結果，證實從洗析緩衝液分離的物質具有53%或更高的純度。
第7c圖顯示了實驗實施例2中分離的物質和比較例2中分離的物質的結果。
在下文中，將參考以下實施例更詳細地描述本揭示內容。然而，提供這些實施例是為了幫助進一步理解本發明，並且本發明不受這些實施例的限制。
為了確認本揭示內容的純化方法是否可以展現出實質性效果，選擇雷珠單抗(ranibizumab)(其為代表性抗體片段藥物)進行純化。
實施例1：使用親和力層析術純化抗體和抗體片段
實驗例1：設定抗體片段的純化條件(洗析緩衝液的條件設定)
將含有抗體片段的樣本加載到對重鏈具有親和力的層析樹脂(CaptureSelectTM CH1-XL，Thermo Fisher)中，然後進行純化。層析條件如下：
*層析條件：
-樹脂：CaptureSelect CH1-XL
-流速：90厘米/小時
-平衡：20mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.2)
-加載：最大為3公克蛋白質/公升(樹脂容積)
-洗滌：緩衝液(20mM磷酸鈉，400mM氯化鈉；pH 5.8)
-洗析：線性pH濃度梯度之醋酸鈉(50mM)緩衝液(pH 3.8至pH 5.6)
以類似於第1圖的步驟進行純化過程。為了設定洗析緩衝液的條件，將乙酸鈉(50mM)洗析緩衝液(pH3.8至pH5.6)用線性pH濃度梯度洗析。
具體而言，用平衡緩衝液(磷酸鈉(20mM)；pH6.2)平衡管柱，將含有抗體片段的樣本加載至親和力層析管柱。此後，在再平衡後洗滌與管柱結合的抗體片段。通過再平衡再次洗析所得物，並從洗析時紫外線高於1mAU的點收集，直到紫外線再次達到1mAU，然後在抗菌過濾後於5±3℃儲存。
用線性pH濃度梯度的洗析緩衝液(pH3.8至pH5.6)洗析的結果證實洗析緩衝液在pH4.7具有目標抗體或其抗體片段的最佳分離能力(第2a圖)。
以CEX-HPLC分析通過純化方法獲得的目標抗體或其抗體片段。考慮到物質因與加載至管柱的重鏈和加載樣本沒有親和力(第2b圖)，而從管柱釋放出來分析結果(第2c圖)，證實大多數雜質對重鏈親和樹脂沒有親和力，因此經分離和純化。另外，由於使用洗析緩衝液(磷酸鈉(20mM)和氯化鈉(400mM)；pH5.8)，證實藉由洗析緩衝液分離了與管柱非特異性結合的一些雜質(第2d圖)。因此，從上述結果證實，僅可在加載之前或藉由洗滌步驟從樣本中除去雜質，但是沒有分離目標蛋白質。
此後，證實使用洗析緩衝液分離的物質是目標抗體或其抗體片段，並且其純度為92%或更高(第2e圖)。考慮到加載樣本的產物純度為14%，證實通過此純化過程除去了大多數雜質。另外，證實了用CEX-HPLC分析的結果是製程產率為95%。
實驗例2：設定抗體片段的純化條件(洗析緩衝液的適當pH的測定)
將含有抗體片段的樣本加載至重鏈親和力層析樹脂(CaptureSelect CH1-XL，Thermo Fisher)，然後純化抗體片段。層析條件如下：
*層析條件：
-樹脂：CaptureSelect CH1-XL
-流速：90厘米/小時
-平衡：20mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.2)
-加載：最大為3公克蛋白質/公升(樹脂容積)
-洗滌：緩衝液(20mM磷酸鈉，400mM氯化鈉；pH 5.8)
-洗析：緩衝液(50mM乙酸鈉；pH 4.7)
進行實驗以確定實驗例1中設定的洗析緩衝液(pH4.7)是否適合純化目標抗體或其抗體片段。
以類似第1圖的流程進行純化過程。為了設定洗析緩衝液的條件，以乙酸鈉(50mM)緩衝液(pH4.7)洗析。
具體而言，用平衡緩衝液(磷酸鈉(20mM)；pH6.2)平衡管柱，並將含有抗體片段的樣本加載到親和力層析管柱。此後，在再平衡後洗滌與管柱結合的抗體片段。通過再平衡再次洗析所得物，並從洗析時的紫外線高於1mAU的點收集，直到紫外線再次達到1mAU，然後在抗菌過濾後於5±3℃儲存。對於洗析緩衝液，使用如實驗例1中的緩衝液(磷酸鈉(20mM)和氯化鈉(400mM)；pH 5.8)。
結果，如第3a圖所示，證實洗析緩衝液在pH4.7具有最佳分離能力。亦即，藉由CEX-HPLC分析證實，在本揭示內容的純化過程的每個步驟中分離雜質和目標蛋白質(第3a圖)，並且從洗析緩衝液中分離的物質具有純度88%或更高(第3b圖)。另外，作為用CEX-HPLC分 析的結果，證實製程產率為92%。
實驗例3：設定抗體片段的純化條件(確定pH是否為必需條件)
將含有抗體片段的樣本加載至親和力層析樹脂(CaptureSelect CH1-XL，Thermo Fisher)，然後純化抗體片段。層析術條件如下：
*層析條件：
-樹脂：CaptureSelect CH1-XL
-流速：90厘米/小時
-平衡：20mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.2)
-加載：最大為3公克蛋白質/公升(樹脂量)
-洗滌：緩衝液(20mM磷酸鈉，400mM氯化鈉；pH 5.8)
-洗析：50mM檸檬酸鈉緩衝液(pH 4.7)
為了使用親和力層析術確定洗析緩衝液的pH是否是抗體片段的純化方法中的必需條件，藉由將洗析緩衝液的類型改為檸檬酸鈉(NaCitrate)來代替乙酸鈉而進行實驗(NaAcetate)。
以類似第1圖的流程進行純化過程。為了設定洗析緩衝液的條件，以作為洗析緩衝液的檸檬酸鈉(50mM)緩衝液(pH4.7)洗滌。
具體地，用平衡緩衝液(磷酸鈉(20mM)；pH6.2) 平衡管柱，然後將含有抗體片段的樣本加載至親和力層析管柱。此後，在再平衡後洗析與管柱結合的抗體片段。通過再平衡再次洗析所得物，並從洗析時的紫外線高於1mAU的點收集，直到紫外線再次達到1mAU，然後在抗菌過濾後於5±3℃儲存。對於洗析緩衝液，使用如實驗例1中的緩衝液(磷酸鈉(20mM)和氯化鈉(400mM)；pH 5.8)。
結果，如第4a圖所示，證實洗析緩衝液在pH4.7具有最佳分離能力。因此，證實即使洗析緩衝液的類型改變，分離能力仍然在相同的pH條件下維持。
另外，分析藉由CEX-HPLC洗析獲得的結果的結果，證所得物具有90%或更高的純度(第4b圖)，並且其製程產率為92%。
實驗實施例4：抗體的純化
為了確定是否可以藉由根據本發明的純化方法純化不僅是抗體片段而且還包括抗體，使用代表性抗體藥物爾必得舒(Erbitux)在以下條件下進行層析分析：
*層析條件：
-樹脂：CaptureSelect CH1-XL
-流速：90厘米/小時
-平衡：20mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.2)
-加載：最大為3公克蛋白質/公升(樹脂容積)
-洗滌：緩衝液(20mM磷酸鈉，400mM氯化鈉；pH 5.8)
-洗析：50mM乙酸鈉緩衝液(pH 4.7)
以類似第1圖的流程進行純化過程。為了設定洗析緩衝液的條件，以作為洗析緩衝液(pH4.7)的乙酸鈉(50mM)洗析。
具體地，用平衡緩衝液(磷酸鈉(20mM)；pH 6.2)平衡管柱，並將雷珠單抗加載至含有重鏈結構域的親和力層析樹脂。此後，在再平衡後洗滌與管柱結合的抗體。通過再平衡再次洗析所得物，並從洗析時的紫外線高於1mAU的點收集，直到紫外線再次達到1mAU，然後於抗菌過濾後在5±3℃儲存。對於洗滌緩衝液，使用如實驗例1中的緩衝液(磷酸鈉(20mM)和氯化鈉(400mM)；pH 5.8)。
結果，如第5a圖所示，證實洗析緩衝液在pH4.7具有最佳分離能力。另外，證實藉由洗析獲得的所得物具有99%或更高的純度(第5b圖)，並且其製程產率為91%。
比較例1：設定抗體片段的純化條件(使用輕鏈親和樹脂)
為了使用重鏈親和樹脂再度確認本揭示內容的純化方法的優異效果，除了將樹脂改變為輕鏈親和樹脂之外，在相同條件下進行層析。層析條件如下：
*層析條件：
-樹脂：KappaSelect
-流速：90厘米/小時
-平衡：20mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.2)
-加載：最大3克蛋白質/升(樹脂容積)
-洗滌：緩衝液(20mM磷酸鈉，400mM氯化鈉；pH 5.8)
-滅菌：10mM氫氧化鈉溶液
-洗析：50mM乙酸鈉緩衝液(pH 4.7)
以類似第1圖的流程進行純化過程。除了使用輕鏈親和樹脂KappaSelect作為樹脂之外，在與實驗例2相同的條件下進行實驗。
具體地，用平衡緩衝液(磷酸鈉(20mM)；pH 6.2)平衡管柱。此後，將含有抗體片段的樣本加載至輕鏈親和層析管柱，然後在再平衡後洗析與管柱結合的抗體片段。通過再平衡再次洗析所得物，並從洗析時的紫外線高於1mAU的點收集，直到紫外線再次達到1mAU，然後於抗菌過濾後於5±3℃儲存。對於洗析緩衝液，使用如實驗例1中的緩衝液(磷酸鈉(20mM)和氯化鈉(400mM)；pH 5.8)。通過再平衡再次洗析所得物。在洗析時，使用與重鏈親和力層析術相同的洗析緩衝液。
結果，如第6圖所示，證實當洗析緩衝液的pH為4.7時，在滅菌步驟中分離目標蛋白質，而不是在洗析步驟中。
該結果證實，如發明所屬技術領域中已知，當輕鏈親和力層析術中的洗析緩衝液具有超過pH2至pH3 的高pH時，不會發生洗析。
比較例2：設定抗體片段的純化條件(輕鏈親和樹脂的適宜pH條件的測定)
在比較例1中證實，當使用輕鏈親和樹脂時，在洗析步驟中未分離目標蛋白質。另外，為了確認在使用適合於輕鏈親和樹脂的洗析緩衝液時是否分離目標蛋白質，在以下條件下進行層析分析：
*層析條件：
-樹脂：KappaSelect
-流速：90厘米/小時
-平衡：20mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.2)
-加載：最大為3公克蛋白質/公升(樹脂容積)
-洗滌：1X磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.2)
-滅菌：10mM氫氧化鈉溶液
-洗析：甘胺酸(0.1M)緩衝液(pH 2.7)
以類似於第1圖的流程進行純化過程。
具體地，用平衡緩衝液(磷酸鈉(20mM)；pH 6.2)平衡管柱。將含有抗體片段的樣本加載至輕鏈親和層析管柱，並於再平衡後洗滌與管柱結合的抗體片段。通過再平衡再次洗析所得物。對於洗析緩衝液，使用緩衝液(甘胺酸(0.1M)；pH 2.7)。從洗析期間處於平衡狀態的紫外線 值增加1mAU的點收集所得物，直到該值恢復到平衡狀態下的UV值。為了解決抗體片段的安定性問題，使用磷酸鈉(200mM；pH7.0)增加洗析緩衝液的低pH(pH2.7)。校正的洗析緩衝液在抗菌過濾後在5±3℃儲存。
結果，如第7a圖所示，證實在作為輕鏈親和樹脂的KappaSelect中，洗析緩衝液在pH2.7具有最佳分離能力，並且使用CEX-HPLC分析獲得的所得物。結果證實，在洗析緩衝液中，除了目標蛋白質外，還分離了單一抗體片段。因此，證實了使用比較例2的層析術未適當分離單一抗體片段。
從洗析緩衝液分離的物質的純度為53%，證實純度遠低於使用重鏈親和力層析術所得的純度(第7b圖)。另外，將實驗例2中分離的物質與比較例2中分離的物質進行比較的結果為，再次證實當使用重鏈親和力層析術時純度更高(第7c圖)。
當使用輕鏈親和力層析術時，製程產率為87%，這也低於使用根據本揭示內容的重鏈親和力層析術的情況。另外，在比較例中，必須進行濃縮/透析程序以進行下一程序。因此，考慮到需要另外進行濃縮/透析程序的事實，藉由使用比較例的層析術確認確保實際上較低產率的目標物質。
如上所述，在本揭示內容中，證實當使用重鏈親和力層析術時(實驗例1至4)，當洗析緩衝液在pH3.8至pH4.7，特別是在pH 4.7時，適當分離目標抗體或其抗 體片段。
然而，在比較例1中證實，當使用具有與重鏈親和力層析術相同條件的洗析緩衝液時，不分離目標蛋白質。另外，在比較例2中證實，當使用pH為2.7的洗析緩衝液(其低於本揭示內容的實驗例中的洗析緩衝液)時，以較低產率分離出目標蛋白質。
在使用比較例2中使用具有pH值為2.7的低pH的洗析緩衝液的情況下，在蛋白質的結構和安定性方面存在問題。因此，需要用於增加pH的校準過程。然而，在使用本揭示內容的純化方法的情況下，可以省略這種用於增加pH的校準過程，以及濃縮/透析程序；因此，本揭示內容的純化方法在確保分離的蛋白質的安定性和省錢地獲得高純度的蛋白質方面是優越的，由其除去了雜質。
雖然已經參考特定的闡釋性具體實施例描述了本揭示內容，但是本揭示內容所屬領域的技術人員將理解，本揭示內容可以其他特定形式實施而不悖離本揭示內容之技術精神或必要技術特徵。本揭示內容的特徵。因此，上述具體實施例在所有方面都被認為是闡釋性，而非限制性的。此外，本揭示內容的範疇係由所附申請專利範圍限定，而不是由實施方式，並且應當理解，從本揭示內容的含義和範疇及其等效物得出的所有修飾或變化都包括在本附申請專利範圍的範疇內。

Claims (14)

  1. 一種用於純化目標抗體或其抗體片段之方法，包括：(a)將包含抗體或其抗體片段的樣本加載至包括重鏈親和樹脂之親和力層析術管柱；(b)用洗滌緩衝液洗滌管柱；及(c)使用洗析緩衝液從該親和力層析術管柱回收目標抗體或其抗體片段，該洗析緩衝液的pH範圍為pH3.8至pH4.7。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該重鏈親和樹脂係能夠特異性地結合重鏈之樹脂。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其在步驟(c)之後不進行濃縮/透析程序。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，步驟(c)中之該洗析緩衝液具有範圍為10mM至100mM的鹽濃度。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，步驟(c)中之該洗析緩衝液包括選自由下列所成群組之一種或多種鹽：乙酸鈉、檸檬酸鈉和甘胺酸。
  6. 如上述申請專利範圍第1項所述之方法，其中，在加載步驟(a)之該樣本之前，用pH範圍為pH5.5至pH7.5之緩衝液平衡管柱，該樣本包括抗體或其抗體片段。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中，該緩衝劑包含選自由下列所成群組之一種或多種鹽：2-( N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、PIPES、磷酸鉀、氯化鉀、3-嗎啉基丙 烷-1-磺酸(MOPS)、磷酸鈉、氯化鈉、Tris及2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其進一步包括在步驟(a)之前進行親和力層析術、離子交換層析術、濃縮或透析。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其進一步包括在步驟(a)或步驟(b)之後，使用平衡緩衝劑排出對樹脂沒有親和力的雜質。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其進一步包括在步驟(a)或步驟(b)之後，使用再平衡緩衝液再平衡該管柱。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，步驟(b)中之該洗滌緩衝液具有pH範圍為pH4.5至pH6.5。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，步驟(b)中之該析滌緩衝液具有鹽濃度範圍為400mM至1M。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該緩衝劑包含選自由下列所成群組之一種或多種鹽：磷酸鈉、氯化鉀、磷酸鉀、氯化鈉、2-( N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、PIPES、3-嗎啉基丙烷-1-磺酸(MOPS)、Tris及2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之目標抗體或其抗體片段，其中純化之目標抗體或其抗體片段是治療性蛋白質。
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