JP2023523823A - タンパク質の精製の改善されたプロセス - Google Patents
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Abstract
「タンパク質の精製の改善されたプロセス」本発明は、生成物及びプロセスに関連する不純物を含むタンパク質混合物から、抗体又は融合タンパク質を精製するプロセスを提供する。前記プロセスは、低分子量不純物と塩基性バリアントを分離するために、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用する。また、本発明は、更に、生成物及びプロセスに関連する不純物を除去するスケーラブルな精製プロセスを提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、低分子量不純物及び塩基性バリアントを含むタンパク質混合物から、少なくとも１つの抗体又は融合タンパク質を精製するためのハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーに関する。
更に、本発明は、クロマトグラフィー工程を使用することによる、抗体又は融合タンパク質のスケーラブルな精製プロセスを提供する。より詳細には、本発明は、薬学的に許容され、生成物及びプロセスに関連する不純物を実質的に含まない、精製された抗体組成物を提供する。
治療用分子のクラスとしてのモノクローナル抗体は、疾患の治療用に、バイオテクノロジー産業でますます需要が高まっている。また、これらの抗体は、製造中に生じる複数の翻訳後修飾及び分解事象により、生化学的及び生物物理学的性質が不均一である。上流における技術の進歩に伴い、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生産能力は、１リットル当たり数ミリグラムから数グラムになっている。これらの力価は、下流プロセス（ＤＳＰ）に多大なプレッシャーをもたらし、下流プロセスは、利用可能なリソースの、より高い効率とより良好な利用性を達成するために手直しされる必要がある。これらの重要なパラメータのいずれかが、設備設計の段階で決まっていないと、プロセスが崩壊し、更に商業的損失をもたらすと共に製品の市場への参入が遅れる。
抗体及び融合タンパク質の商品化の成功に関連する重要な課題は、規制要件に準拠するために、生成物及びプロセスに関連する不純物が許容量まで除去された純粋な製品を開発することである。生成物及びプロセスに関連する不純物は、規制機関によって設定された、承認のための許容限度内である必要がある。各種不純物は、しばしば、サイズバリアントやチャージバリアントなどの望ましくない成分を含む。サイズバリアント、チャージバリアント、及びその他の望ましくない種、例えば、低分子量凝集体（ＬＭＷ）及び塩基性バリアントなどの形成は、投与時に補体活性化又はアナフィラキシーを引き起こすことにより、製品の安全性に悪影響を及ぼすことがある。更に、凝集体及びチャージバリアントの形成は、生成物の収量の減少、ピークの広がり、及び活性の喪失を引き起こすことにより、製造プロセスを妨げ得る。
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）をクロマトグラフィーで精製するための方法であることが示されている。セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）クロマトグラフィーは、塩化ナトリウム又は塩化カルシウムを使用することによる、ＨＭＷの分離について報告されている。
本発明においては、セラミックハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて、抗体調製物から低分子量凝集体（ＬＭＷ）及び塩基性バリアント（ＢＶ）を分離する試みに成功した。
本発明において、本発明者らは、プロセス及び生成物に関連する他の不純物、例えば、高分子量凝集体（ＨＭＷ）及び酸性バリアントを分離するための他のクロマトグラフィー技術にも注目している。
例えば、イオン交換及び疎水性相互作用クロマトグラフィーは、タンパク質濃度の上昇、又は溶出中のバッファー濃度及び／又はｐＨの必要な変化により、凝集体の形成を誘発し得ることが報告されている。更に、いくつかの例においては、抗体は、イオン交換クロマトグラフィーによる分離が可能になるには小さ過ぎる等電点の違いを示す（非特許文献１）。しかし、本発明は、高分子量不純物及び酸性バリアントを有意に低減するアニオン交換を用いる。
サイズ排除クロマトグラフィーは面倒であり、生成物を高度に希釈することになり、このことは、大規模な効率ベースの製造プロセスの障害である。アフィニティークロマトグラフィーカラムからのリガンドの漏れも生じることがあり、溶出された生成物に望ましくない汚染がもたらされる（非特許文献２）
製薬用途に適した十分に純粋な形態で目的の抗体を産生及び精製する方法が、現在、必要とされている。本発明は、この必要性に対処する。
本発明は、抗体又は融合タンパク質に関連する不純物を有意に低減させる、スケーラブルで堅牢な精製プロセスを提供する。
Ｔａｒｄｉｔｉ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ５９９：１３－２０ （１９９２）
Ｓｔｅｉｎｄｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３５：６１－６９ （２０００）
一実施形態においては、本発明は、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、又はその他の添加剤を使用せずにリン酸塩溶出勾配を使用することにより、ＬＭＷ及び塩基性バリアントから選択される少なくとも１つの不純物を除去する、簡単でスケーラブルなＣＨＴプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、精製されたタンパク質混合物は、宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、浸出タンパク質、半抗体、欠損抗体（ｃｌｉｐｐｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、二量体、四量体、酸性又は塩基性のチャージバリアント、凝集体、低分子量（ＬＭＷ）種、及び高分子量（ＨＭＷ）種などの、プロセス及び生成物に関連する不純物を含まない、又は最低限の許容可能な量で含む。
一実施形態においては、精製プロセスは、９０％、又は９１％、又は９２％、又は９３％、又は９４％、又は９５％、又は９６％、又は９７％、又は９８％、又は９９％を超える純度から選択されるモノマーの純度を提供する。
一実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、１以上の低分子量（ＬＭＷ）バリアントとを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、ＬＭＷが０．４％未満であるプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、ＬＭＷが０．４％未満であるプロセスを提供する。
別の実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、１以上の塩基性バリアント（ＢＶ）とを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、前記塩基性バリアントが１５％未満であるプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、前記塩基性バリアントが１５％未満であるプロセスを提供する。
一実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、１以上の低分子量（ＬＭＷ）バリアントと、１以上の塩基性バリアント（ＢＶ）とを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、ＬＭＷが０．４％未満であり、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、前記塩基性バリアントが１５％未満であるプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、ＬＭＷが０．４％未満であり、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、前記塩基性バリアントが１５％未満であるプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物は、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、約０．３％以下のＬＭＷ、０．２％以下のＬＭＷ、０．１％以下のＬＭＷから選択されるＬＭＷを含む。
かかる実施形態の一態様においては、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物は、約１４％以下のＢＶ、１３％以下のＢＶ、１２％以下のＢＶ、１１％以下のＢＶ、１０％以下のＢＶ、９％以下のＢＶ、８％以下のＢＶ、７％以下のＢＶ、６％以下のＢＶ、５％以下のＢＶ、４％以下のＢＶ、３％以下のＢＶ、２％以下のＢＶ、１％以下のＢＶから選択される低いＢＶを含む。
一実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、低分子量（ＬＭＷ）バリアント２Ｈ１Ｌとを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、２Ｈ１Ｌが３％未満であるプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、２Ｈ１Ｌが３％未満であるプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物は、約３％以下、２．６％以下、２．５％以下、２．３％以下、２％以下、１．７％以下、１．５％以下、１．４％以下から選択される低い２Ｈ１Ｌを含む。
一実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、低分子量（ＬＭＷ）バリアントＨＨとを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＨＨが０．２％未満であるプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＨＨが０．２％未満であるプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物は、約０．２％以下、０．２４％以下、０．２１％以下、０．１５％以下、０．１２％以下、０．０９％以下、又は０．０８％以下、０．０６％以下、又は０．０４％以下、及び０．０３％以下から選択される低いＨＨを含む。
一実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、低分子量（ＬＭＷ）バリアントＨＣとを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＨＣが０．４未満であるプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＨＣが０．４未満であるプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物は、約０．４％以下、０．１６％以下、０．１５％以下、０．１２％以下、及び０．１８％以下から選択される低いＨＣを含む。
一実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、低分子量（ＬＭＷ）バリアントＬＣとを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＬＣが０．５％まで低減されるプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＬＣが０．５％まで低減されるプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物は、約０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、及び０．２以下から選択される低いＬＣを含む。
一実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、低分子量（ＬＭＷ）バリアントＬＣ、ＨＣ、ＨＨ、及び２Ｈ１Ｌとを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＬＣ、ＨＣ、ＨＨ、及び２Ｈ１Ｌが３％まで低減されるプロセスを提供する。かかる実施形態の一態様においては、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物は、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＬＣ、ＨＣ、ＨＨ、及び２Ｈ１Ｌから選択されるＬＭＷを２．２％～２．６％含む。
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＬＣ、ＨＣ、ＨＨ、及び２Ｈ１Ｌが３％まで低減されるプロセスを提供する。かかる実施形態の一態様においては、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物は、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＬＣ、ＨＣ、ＨＨ、及び２Ｈ１Ｌから選択されるＬＭＷを２．２％～２．６％含む。
別の実施形態においては、前記プロセスは、リン酸塩の濃度を約３２ｍＭから８８ｍＭまで徐々に上昇させて、約２３ｋＤａ～約１２５ｋＤａの分子量を有するＬＭＷを分離又は低減し、塩基性バリアントを約３３％低減する、ＣＨＴカラムの線形溶出勾配を提供する。
別の実施形態においては、前記プロセスは、リン酸塩の濃度を約４０ｍＭから９６ｍＭまで徐々に上昇させて、約２３ｋＤａ～約１２５ｋＤａの分子量を有するＬＭＷを分離又は低減し、塩基性バリアントを約３３％低減する、ＣＨＴカラムの線形溶出勾配を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、抗体又は融合タンパク質の実質的に純粋な単量体の形態と、宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、浸出タンパク質、半抗体、二量体、四量体、酸性又は塩基性チャージバリアント、凝集体、低分子量（ＬＭＷ）種、及び高分子量（ＨＭＷ）種から選択される低い許容量の不純物とを提供することができる、５０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌでスケーラブルな精製プロセスを提供する。
別の実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、その酸性種又はバリアントとを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィープロテインＡ又はプロテインＧによって精製することと；
ｂ．アフィニティークロマトグラフィーで得られた前記タンパク質混合物を、ウイルス不活化に付すことと；
ｃ．工程（ｂ）で得られた前記タンパク質混合物を、ｐＨ７．０～７．５から選択される適切なｐＨにて、適切なバッファーでアニオン交換樹脂にロードすることと；
ｄ．前記タンパク質混合物をフロースルーモードで溶出して、前記目的のタンパク質の酸性種又はバリアントを前記アニオン交換樹脂に結合させることと、
を含み、
工程（ｄ）で得られた、溶出された前記タンパク質混合物が、実質的に精製された目的のタンパク質と、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、１５％未満の酸性種又はバリアントとを含むプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィープロテインＡ又はプロテインＧによって精製することと；
ｂ．アフィニティークロマトグラフィーで得られた前記タンパク質混合物を、ウイルス不活化に付すことと；
ｃ．工程（ｂ）で得られた前記タンパク質混合物を、ｐＨ７．０～７．５から選択される適切なｐＨにて、適切なバッファーでアニオン交換樹脂にロードすることと；
ｄ．前記タンパク質混合物をフロースルーモードで溶出して、前記目的のタンパク質の酸性種又はバリアントを前記アニオン交換樹脂に結合させることと、
を含み、
工程（ｄ）で得られた、溶出された前記タンパク質混合物が、実質的に精製された目的のタンパク質と、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、１５％未満の酸性種又はバリアントとを含むプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、前記プロセスは、前記酸性バリアントを、約１４％以下のＡＶ、１３％以下のＡＶ、１２％以下のＡＶ、１１％以下のＡＶ、１０％以下のＡＶ、９％以下のＡＶ、８％以下のＡＶ、７％以下のＡＶ、６％以下のＡＶ、５％以下のＡＶ、４．５％以下のＡＶ、４％以下のＡＶ、３％以下のＡＶ、２％以下のＡＶ、１％以下未満のＡＶを含む前記タンパク質混合物を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、高分子量（ＨＭＷ）不純物とを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィープロテインＡ又はプロテインＧによって精製することと；
ｂ．アフィニティークロマトグラフィーで得られた前記タンパク質混合物を、ウイルス不活化に付すことと；
ｃ．工程（ｂ）で得られた前記タンパク質混合物を、ｐＨ７．０～７．５から選択される適切なｐＨにて、適切なバッファーでアニオン交換樹脂にロードすることと；
ｄ．前記タンパク質混合物をフロースルーモードで溶出して、ＨＭＷ不純物を前記アニオン交換樹脂に結合させることと、
を含み、
工程（ｄ）で得られた、溶出された前記タンパク質混合物が、実質的に精製された目的のタンパク質と、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、０．５％未満のＨＭＷ不純物とを含むプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィープロテインＡ又はプロテインＧによって精製することと；
ｂ．アフィニティークロマトグラフィーで得られた前記タンパク質混合物を、ウイルス不活化に付すことと；
ｃ．工程（ｂ）で得られた前記タンパク質混合物を、ｐＨ７．０～７．５から選択される適切なｐＨにて、適切なバッファーでアニオン交換樹脂にロードすることと；
ｄ．前記タンパク質混合物をフロースルーモードで溶出して、ＨＭＷ不純物を前記アニオン交換樹脂に結合させることと、
を含み、
工程（ｄ）で得られた、溶出された前記タンパク質混合物が、実質的に精製された目的のタンパク質と、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、０．５％未満のＨＭＷ不純物とを含むプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、前記プロセスは、０．５％以下、約０．４％以下、又は０．３％以下、又は０．２％以下、又は０．１％以下未満のＨＭＷを含むタンパク質混合物を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、タンパク質混合物から目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記目的のタンパク質と、酸性バリアント、塩基性バリアント、低分子量（ＬＭＷ）、高分子量（ＨＭＷ）から選択される少なくとも１つの不純物とを含む哺乳動物発現系からタンパク質混合物を得ることと；
ｂ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィーカラムにアプライすることと；
ｃ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出することと；
ｄ．工程（ｃ）で得られた前記タンパク質混合物のウイルス不活化を行うことと；
ｅ．工程（ｄ）で得られた前記タンパク質混合物を、アニオン交換クロマトグラフィーにアプライすることと；
ｆ．前記タンパク質混合物を、フロースルーモードで溶出することと；
ｇ．工程（ｆ）で得られた前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムにアプライすることと；
ｈ．任意に、前記ＣＨＴカラムを、適切な洗浄バッファーで洗浄することと；
ｉ．前記タンパク質混合物を、適切なバッファーで前記ＣＨＴカラムから溶出することとを含むプロセスを提供する。特定の実施形態においては、前記目的のタンパク質は、ＩｇＧ１抗体又は融合タンパク質である。ここで、溶出された前記タンパク質混合物は、目的のタンパク質で濃縮されており、不純物であるＨＭＷ、ＬＭＷ、酸性及び塩基性バリアント（ＢＶ）を実質的に含まない。
ａ．前記目的のタンパク質と、酸性バリアント、塩基性バリアント、低分子量（ＬＭＷ）、高分子量（ＨＭＷ）から選択される少なくとも１つの不純物とを含む哺乳動物発現系からタンパク質混合物を得ることと；
ｂ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィーカラムにアプライすることと；
ｃ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出することと；
ｄ．工程（ｃ）で得られた前記タンパク質混合物のウイルス不活化を行うことと；
ｅ．工程（ｄ）で得られた前記タンパク質混合物を、アニオン交換クロマトグラフィーにアプライすることと；
ｆ．前記タンパク質混合物を、フロースルーモードで溶出することと；
ｇ．工程（ｆ）で得られた前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムにアプライすることと；
ｈ．任意に、前記ＣＨＴカラムを、適切な洗浄バッファーで洗浄することと；
ｉ．前記タンパク質混合物を、適切なバッファーで前記ＣＨＴカラムから溶出することとを含むプロセスを提供する。特定の実施形態においては、前記目的のタンパク質は、ＩｇＧ１抗体又は融合タンパク質である。ここで、溶出された前記タンパク質混合物は、目的のタンパク質で濃縮されており、不純物であるＨＭＷ、ＬＭＷ、酸性及び塩基性バリアント（ＢＶ）を実質的に含まない。
一実施形態においては、目的のタンパク質は、ＩｇＥに結合するＩｇＧ１抗体である。好ましい実施形態においては、ＩｇＧ１抗体は、オマリズマブのバイオシミラーである。
本発明は、生成物及びプロセスに関連する各種不純物を低減することができる精製プロセスを提供する。
特定の実施形態においては、本発明は、ＣＨＴクロマトグラフィーを使用することにより、少数の生成物関連不純物の低減を提供する。
特定の実施形態においては、本発明は、アニオン交換クロマトグラフィーを使用することにより、少数の生成物関連不純物の低減を提供する。
特定の実施形態においては、本発明は、ＣＨＴ及びアニオン交換クロマトグラフィーを使用することにより、生成物関連不純物の低減を提供する。
特定の実施形態においては、本発明は、アフィニティークロマトグラフィー、ＣＨＴ、及びアニオン交換クロマトグラフィーを使用することにより、生成物関連不純物の低減を提供する。
用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、即ち、２個の重鎖（Ｈ）及び２個の軽鎖（Ｌ）がジスルフィド結合によって相互に結合されて構成される免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中、ＨＣＶＲ又はＶＨと略す）と重鎖定常領域（ＣＨ）とから構成される。重鎖定常領域は、３個のドメイン、即ち、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中、ＬＣＶＲ又はＶＬと略す）と軽鎖定常領域とから構成される。軽鎖定数領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨ領域とＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域に更に細分化することができ、前記超可変性領域には、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が点在している。ＶＨとＶＬは、それぞれ、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４の順に配列された３個のＣＤＲと４個のＦＲから構成される。
オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））は、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＥ）に選択的に結合する組換えＤＮＡ由来ヒト化ＩｇＧｌＫモノクローナル抗体である。前記抗体の分子量は、約１４９ｋＤである。Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）は、抗生物質であるゲンタマイシンを含む栄養培地で、チャイニーズハムスター卵巣細胞の懸濁培養によって製造される。ゲンタマイシンは、最終生成物中に検出されない。Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）は、単回使用のバイアルに含まれる、滅菌された白色の、保存料を含まない凍結乾燥粉末で、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）ＵＳＰで再構成され、皮下（ＳＣ）注射剤として投与される。
本明細書で使用される用語「酸性バリアント」又は「酸性種」及び「ＡＶ」は、全体的に酸性の電荷によって特徴付けられる、タンパク質、例えば、抗体又はその抗原結合部分のバリアントを意味する。例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）製剤では、かかる酸性種は、イオン交換、例えば、ＷＣＸ－１０ ＨＰＬＣ（弱カチオン交換クロマトグラフィー）又はＩＥＦ（等電点電気泳動）などの各種方法で検出することができる。抗体の酸性バリアントは、脱アミド化及びシアル化などの化学修飾及び酵素修飾によってそれぞれ形成され、その結果、抗体の正味の負電荷が増加し、ｐＩ値が低下するため、酸性バリアントが形成される。Ｃ末端リジンの分解は、正味の正電荷を失わせ、酸性バリアントの形成がもたらされる。酸性バリアントを生成する別のメカニズムは、各種共有結合付加体の生成であり、例えば、糖化が挙げられ、糖化では、グルコース又はラクトースが、グルコースが豊富な培地における製造中又は製剤中に還元糖が存在する場合は保管中に、リジン残基の第一アミンと反応し得る（ＭＡｂｓ． ２０１０ Ｎｏｖ－Ｄｅｃ； ２（６）：６１３－６２４）。
用語「酸性バリアント」は、プロセスに関連する不純物は含まない。本明細書においては、用語「プロセスに関連する不純物」は、タンパク質を含む組成物中に存在するが、タンパク質自体には由来しない不純物を意味する。プロセスに関連する不純物としては、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞核酸、クロマトグラフィー材料、及び培地成分が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書においては、用語「アニオン交換クロマトグラフィー」、又は「アニオン交換カラム」、又は「ＡＥＸ」は、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）の一形態であり、正味の表面電荷に基づいて分子を分離するために使用される。アニオン交換クロマトグラフィーは、より具体的には、正味の負の表面電荷を有する分子に親和性を持つ正に帯電したイオン交換樹脂を使用する。アニオン交換クロマトグラフィーは、分取及び分析目的の両方で使用され、アミノ酸及びヌクレオチドから大きなタンパク質まで、広範囲の分子を分離することができる。ここでは、本発明者らは、タンパク質の分取アニオン交換クロマトグラフィーに着目している。
本明細書においては、用語「ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ」は、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ ＰＯＲＯＳＴＭ強アニオン交換樹脂（ＰＯＲＯＳ ＡＥＸ樹脂）であり、組換えタンパク質、モノクローナル抗体を含む生体分子の電荷ベースのクロマトグラフィーによる分離用に設計されている。Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ ＰＯＲＯＳＴＭ５０ＨＱ樹脂は、四級化ポリエチレンイミン基で官能化されている。
「強アニオン交換」をフロースループロセスで使用すると、平衡が変化し、不純物が目的のタンパク質から区別される。即ち、強アニオン交換は、抗体精製におけるプロテインＡ混入物質、ＨＣＰ、ＤＮＡ、又はウイルスの除去用として一般に知られている。フロースループロトコルでは、サンプルと平衡化バッファーは、混入分子が樹脂に依然として結合するが、目的のタンパク質は（電荷のため）結合しない条件に調整される。これは、塩濃度を上げる、及び／又はバッファーのｐＨを目的の分子のｐＩよりも低い点まで上げることによって達成される。
本明細書においては、用語「フロースルーモード」又は「フロースルー」は、目的の抗体がクロマトグラフィー樹脂に結合しない精製プロセスを意味する。特定の実施形態においては、少なくとも５０％の目的の抗体がクロマトグラフィー樹脂に結合しない。特定の実施形態においては、少なくとも６０％、７０％、又は８０％の目的の抗体がクロマトグラフィー樹脂に結合しない。しかし、プロセス及び生成物に関連する不純物は、クロマトグラフィー樹脂に結合する。特定の実施形態においては、少なくとも５０％の、プロセス及び生成物に関連する不純物がクロマトグラフィー樹脂に結合する。特定の実施形態においては、少なくとも６０％、７０％、又は８０％の、プロセス及び生成物に関連する不純物がクロマトグラフィー樹脂に結合する。
本明細書においては、用語「カラム」、又は「樹脂」、又は「クロマトグラフィー樹脂又はクロマトグラフィーカラム」は、相互変換可能である。
用語「ＣＨＴ」又は「セラミックハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー」は、生体分子のクロマトグラフィー分離に使用されるリン酸カルシウムの一形態である。５個のカルシウムダブレット（Ｃサイト）と－ＯＨ含有リン酸トリプレット（Ｐサイト）のペアとのセットが、繰り返し幾何学的パターンで配置される。この物質の電子顕微鏡写真には、繰り返しの六角形構造がみられる。また、ラマン分光法による空間充填モデルと繰り返し構造も構築されている。ハイドロキシアパタイトは特異な分離特性と、比類ない選択性及び分解能とを有する。多くの場合、電気泳動やその他のクロマトグラフィー技術によって均一であることが示されたタンパク質を分離する。
ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの応用としては、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の各種サブクラス、軽鎖の組成が異なる抗体、抗体断片、アイソザイム、直鎖デュープレックスからのスーパーコイルＤＮＡ、及び二本鎖ＤＮＡからの一本鎖の精製が挙げられる。ＣＨＴセラミックハイドロキシアパタイトは、球状のマクロポーラス状のハイドロキシアパタイトである。高温で焼結すると、結晶性からセラミック形態に変化する。
本明細書においては、用語「実質的に純粋な抗体」は、生成物又はプロセスに関連する不純物から選択される不純物を実質的に含まない抗体を含む。特定の実施形態においては、抗体が、酸性バリアント、塩基性バリアント、低分子量、及び高分子量を含まず、実質的に純粋な抗体は、約９９％未満、又は約９８％未満、又は約９７％未満、又は約９５％未満、又は約９２％未満、又は約９０％未満、又は約８８％未満、又は約８５％未満、又は約８２％未満、又は約８０％未満、又は約７５％未満、又は約７０％未満、又は約６５％未満、又は約６０％未満、又は５０％未満の純度を有する。
「サイズバリアント」として使用される用語は、ＬＭＷ、ＨＭＷ、又は凝集体を意味する。
「低分子量」又は「ＬＭＷ」種として使用される用語は、タンパク質骨格が切断された断片であり、抗体のサイズ不均一性の要因となる生成物関連不純物と考えられる。多くの場合、ＬＭＷ種は、単量体の抗体に対して活性が低い又は著しく低下しており、免疫原性をもたらす、又はインビボでの薬物動態学的特性に影響を与える可能性がある。その結果、ＬＭＷ種は、医薬品開発中に、製造時の精製医薬品の放出試験の一部として定期的にモニターされる重要な品質特性と考えられる。ＬＭＷは、２３ｋＤａ、２４ｋＤａ、２５ｋＤａ、２６ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、８０ｋＤａ、８５ｋＤａ、９０ｋＤａ、９５ｋＤａ、１００ｋＤａ、１０５ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１１５ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１２５ｋＤａ、１２６ｋＤａ、及び１２７ｋＤａから選択される分子量を有する。特定の実施形態においては、ＬＭＷは、ＬＣ、ＨＣ、ＨＨ、及び２ＨＬ１から選択される。
２５ｋＤａの重量を有する、抗体の「軽鎖」又は「ＬＣ」という用語は、軽鎖又はＬ鎖である。典型的な抗体は、２個の軽鎖、即ち、ラムダ（λ）とカッパ（κ）を含む。抗体は、κ鎖又はλ鎖のいずれかを有し、いずれかを１個ずつ有することはない。λ軽鎖又はκ軽鎖を有する抗体の間には機能的な違いはみられず、いずれのタイプの軽鎖も５つの主要クラスのいずれの抗体にもみられる。２種類の軽鎖の比率は、種によって異なる。しかし、タンパク質混合物が、ＬＭＷ不純物と考えられるＬＣを１個だけ含むこともある。
それぞれ５０ｋＤａの重量を有する、抗体の「重鎖」又は「ＨＣ」という用語は、重鎖又はＨ鎖である。抗体のクラス又はアイソタイプを定義する重鎖には、いくつかの異なるタイプがある。これらの重鎖のタイプは動物によって異なる。重鎖は、抗原と結合するための１個の可変ドメイン（ＶＨ）と、定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２など）とを有する一連の免疫グロブリンドメインを含む。αとγの重鎖は、約４５０アミノ酸を有し、μとεの重鎖は、約５５０アミノ酸を有する。しかし、タンパク質混合物が、ＬＭＷ不純物と考えられるＨＣを１個だけ含むこともある。
抗体種における用語「Ｔｗｏ Ｈｅａｖｙ Ｏｎｅ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎ」、又は「２Ｈ１Ｌ」、又は「Ｈ２Ｌ」は、単一の軽鎖を有する。抗体の２Ｈ１Ｌ種は、Ｈ２Ｌ種の形成をもたらす、重鎖軽鎖間ジスルフィド結合を形成する重鎖システイン残基のβ脱離により形成される。
「高分子量」又は「ＨＭＷ」として用いられる用語は、抗体生成物のサイズ不均一性をもたらす生成物関連不純物である。タンパク質凝集の結果として、治療用抗体医薬品にＨＭＷ種が生成すると、薬剤の有効性及び安全性の両方が損なわれる可能性がある（例えば、望ましくない免疫原性応答を誘発する）。ＨＭＷは、医薬品開発中に、製造時の精製医薬品の放出試験の一部として定期的にモニターされる重要な品質特性と考えられる。特定の実施形態においては、ＨＭＷは、凝集体に関する。
「凝集体」として使用される用語は、相互作用の種類と溶解度とに基づいて分類される。可溶性の凝集体は目に見えない粒子であり、フィルターで除去することができない。不溶性の凝集物はろ過によって除去することができ、人の目に見えることが多い。いずれの種類の凝集体も、バイオ医薬品の開発において問題を引き起こす。共有結合性凝集体は、所定ペプチドの複数のモノマー間に共有結合が形成されることによって生じる。遊離チオールのジスルフィド結合の形成は、共有結合性凝集の一般的な機構である。チロシン残基の酸化は、しばしば凝集をもたらすビチロシンの形成をもたらし得る。可逆的なタンパク質凝集は通常、二量体、三量体、多量体などの、より弱いタンパク質相互作用に起因する。
「塩基性バリアント」として使用される用語は、更なる正電荷を導入する又は負電荷を除去する、Ｃ末端リジンの存在又はグリシンのアミド化、スクシンイミドの形成、アミノ酸の酸化、若しくはシアル酸の除去によって生じるバリアントを意味し、いずれの種類の修飾でも、ｐＩ値を上昇させる。
「高塩バッファー」として使用される用語は、高強度又は高モル濃度バッファーを意味する。
「バッファーＡ」及び「バッファーＢ」として使用される用語は、それぞれ、ＣＨＴクロマトグラフィーにおける「第１のバッファー」又は「第２のバッファー」と相互変換可能である。
本明細書においては、「ウイルスの低減／不活化」という表現は、特定サンプル中のウイルス粒子の数の低下（「低減」）、及び特定サンプル中のウイルス粒子の活性の低下、例えば、限定されるものではないが、感染能力又は複製能力の低下（「不活化」）を意味することが意図される。かかるウイルス粒子の数及び／又は活性の低下は、約１％～約９９％、好ましくは約２０％～約９９％、より好ましくは約３０％～約９９％、より好ましくは約４０％～約９９％、更により好ましくは約５０％～約９９％、更により好ましくは約６０％～約９９％、更により好ましくは約７０％～約９９％、更により好ましくは約８０％～９９％、更により好ましくは約９０％～約９９％のオーダーであり得る。
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、他の要素又は工程を排除しない。本発明の目的において、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｆ）」の任意の実施形態であると考えられる。以下、群が、少なくとも一定の数の実施形態を含むように定義される場合、これはまた、これらの実施形態のみからなっていてもよい群を開示すると理解される。
明細書及び添付の請求項全体を通して、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は複数への言及を含むが、文脈上、明確に複数ではないことが示されている場合は、この限りでない。
本明細書においては、用語「約」は、参照値よりも約１０～２０％大きい又は小さい範囲を意味することが意図される。特定の状況においては、当業者は、参照値の性質により、用語「約」は、その値から１０～２０％の偏差より大きい又は小さい値を意味し得ることを認識する。
本明細書においては、用語「ＣＥ－ＳＤＳ」は、ＬＣ、ＨＣ、ＨＨ、及び２ＨＬ１から選択されるＬＭＷを分析するために用いられる。
用語「分析ＨＰＬＣ」は、チャージバリアントの推定に使用されるＣＥＸ ＨＰＬＣと、ＨＭＷ及びＬＭＷの推定に使用されるＳＥ－ＨＰＬＣとを含む。
一実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、１以上の低分子量（ＬＭＷ）バリアントとを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーで前記タンパク質混合物をロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．適切な勾配のリン酸バッファーで、精製された前記目的のタンパク質を溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、ＬＭＷが０．４％未満であるプロセスを提供する。
ａ．セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーで前記タンパク質混合物をロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．適切な勾配のリン酸バッファーで、精製された前記目的のタンパク質を溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、ＬＭＷが０．４％未満であるプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、ＣＨＴカラムから溶出するタンパク質混合物は、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、約０．３％以下のＬＭＷ、０．２％以下のＬＭＷ、０．１％以下のＬＭＷから選択されるＬＭＷを含む。
一実施形態においては、ＬＭＷは、２３ｋＤａ、２４ｋＤａ、２５ｋＤａ、２６ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、４０ｋＤａ、４５ｋＤａ、５０ｋＤａ、５５ｋＤａ、６０ｋＤａ、６５ｋＤａ、７０ｋＤａ、７５ｋＤａ、８０ｋＤａ、８５ｋＤａ、９０ｋＤａ、９５ｋＤａ、１００ｋＤａ、１０５ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１１５ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１２５ｋＤａ、１２６ｋＤａ、及び１２７ｋＤａから選択される分子量を有する。
別の実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、１以上の塩基性バリアント（ＢＶ）とを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、前記塩基性バリアントが１５％未満であるプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、前記塩基性バリアントが１５％未満であるプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物は、約１４％以下のＢＶ、１３％以下のＢＶ、１２％以下のＢＶ、１１％以下のＢＶ、１０％以下のＢＶ、９％以下のＢＶ、８％以下のＢＶ、７％以下のＢＶ、６％以下のＢＶ、５％以下のＢＶ、４％以下のＢＶ、３％以下のＢＶ、２％以下のＢＶ、１％以下のＢＶから選択される低いＢＶを含む。
一実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、１以上の低分子量（ＬＭＷ）バリアントと、１以上の塩基性バリアント（ＢＶ）とを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、ＬＭＷが０．４％未満であり、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、前記塩基性バリアントが１５％未満であるプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、ＬＭＷが０．４％未満であり、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、前記塩基性バリアントが１５％未満であるプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物は、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、約０．３％以下のＬＭＷ、０．２％以下のＬＭＷ、０．１％以下のＬＭＷから選択されるＬＭＷを含む。
かかる実施形態の一態様においては、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物は、約１４％以下のＢＶ、１３％以下のＢＶ、１２％以下のＢＶ、１１％以下のＢＶ、１０％以下のＢＶ、９％以下のＢＶ、８％以下のＢＶ、７％以下のＢＶ、６％以下のＢＶ、５％以下のＢＶ、４％以下のＢＶ、３％以下のＢＶ、２％以下のＢＶ、１％以下のＢＶから選択される低いＢＶを含む。
一実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、低分子量（ＬＭＷ）バリアント２Ｈ１Ｌとを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、２Ｈ１Ｌが３％未満であるプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、２Ｈ１Ｌが３％未満であるプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物は、約３％以下、２．６％以下、２．５％以下、２．３％以下、２％以下、１．７％以下、１．５％以下、１．４％以下から選択される低い２Ｈ１Ｌを含む。
一実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、低分子量（ＬＭＷ）バリアントＨＨとを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＨＨが０．２％未満であるプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＨＨが０．２％未満であるプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物は、約０．２％以下、０．２４％以下、０．２１％以下、０．１５％以下、０．１２％以下、０．０９％以下、又は０．０８％以下、０．０６％以下、又は０．０４％以下、及び０．０３％以下から選択される低いＨＨを含む。
一実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、低分子量（ＬＭＷ）バリアントＨＣとを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＨＣが０．４未満であるプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＨＣが０．４未満であるプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物は、約０．４％以下、０．１６％以下、０．１５％以下、０．１２％以下、及び０．１８％以下から選択される低いＨＣを含む。
一実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、低分子量（ＬＭＷ）バリアントＬＣとを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＬＣが０．５％まで低減されるプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＬＣが０．５％まで低減されるプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物は、約０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、及び０．２以下から選択される低いＬＣを含む。
一実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、低分子量（ＬＭＷ）バリアントＬＣ、ＨＣ、ＨＨ、及び２Ｈ１Ｌとを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＬＣ、ＨＣ、ＨＨ、及び２Ｈ１Ｌが３％まで低減されるプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＬＣ、ＨＣ、ＨＨ、及び２Ｈ１Ｌが３％まで低減されるプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物は、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、ＬＭＷであるＬＣ、ＨＣ、ＨＨ、及び２Ｈ１Ｌを２．２％～２．６％含む。
別の実施形態においては、前記プロセスは、リン酸塩の濃度を約３２ｍＭから８８ｍＭまで徐々に上昇させて、約２３ｋＤａ～約１２５ｋＤａの分子量を有するＬＭＷを分離又は低減し、塩基性バリアントを約３３％低減する、ＣＨＴカラムの線形溶出勾配を提供する。
別の実施形態においては、前記プロセスは、リン酸塩の濃度を約４０ｍＭから９６ｍＭまで徐々に上昇させて、約２３ｋＤａ～約１２５ｋＤａの分子量を有するＬＭＷを分離又は低減し、塩基性バリアントを約３３％低減する、ＣＨＴカラムの線形溶出勾配を提供する。
一実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、１以上の低分子量（ＬＭＷ）バリアントと、１以上の塩基性バリアント（ＢＶ）とを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、ＬＭＷが０．４％未満であるプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、ＬＭＷが０．４％未満であるプロセスを提供する。
一実施形態においては、前記精製プロセスは、ＬＭＷを、少なくとも約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、約９０％、約８９％、約８８％、約８７％、約８６％、約８５％、約８４％、約８３％、約８２％、約８１％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、及び約５０％以下未満程度低減する。
一実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、１以上の塩基性バリアント（ＢＶ）とを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、前記塩基性バリアントが１５％未満であるプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、前記塩基性バリアントが１５％未満であるプロセスを提供する。
一実施形態においては、前記精製プロセスは、塩基性バリアントを、少なくとも、約５％、又は約１０％、又は約１５％、又は約２０％、又は約２５％、又は約３０％、又は約３１％、又は約３２％、又は約３３％、又は約３４％、約３５％、約４０％、又は約４５％、及び約５０％低減する。
好ましい実施形態においては、前記精製プロセスは、塩基性バリアントを、少なくとも約３３％低減する。
別の実施形態においては、前記精製プロセスは、５Ｌ、又は５０Ｌ、又は１００Ｌ、又は２００Ｌのスケールで、塩基性バリアントを少なくとも約３３％低減する。
別の実施形態においては、本発明は、抗体又は融合タンパク質の実質的に純粋な単量体の形態と、宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、浸出タンパク質、半抗体、二量体、四量体、酸性又は塩基性チャージバリアント、凝集体、低分子量（ＬＭＷ）種、及び高分子量（ＨＭＷ）種から選択される低い許容量の不純物とを提供することができる、５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、及び２００Ｌでスケーラブルな精製プロセスを提供する。
本発明は、小スケール（５Ｌ）から５０Ｌ～２００Ｌ以上の大スケールまで同一効率で利用でき、均一な結果を提供することができる堅牢な標準化された精製プロセスを提供することによって、信頼性の高い製品品質も提供する。ここで、更なる利点は、抗体又は融合タンパク質などの、効果的で高信頼性の、規制（米国ＦＤＡ及び／又はＥＭＡ基準の観点など）に準拠した目的のタンパク質を開発できることである。
特定の実施形態においては、ＣＨＴカラムのロード、洗浄、及び溶出の各工程は、約３０分間～約１０５分間以内に完了する。特定の実施形態においては、ＣＨＴカラムのロード、洗浄、及び溶出の各工程は、１０４分間以内に完了する。
特定の実施形態においては、前記哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞である。
一実施形態においては、ロード、洗浄、溶出バッファーは、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、及びグリシンから選択される添加剤を含まない。
一実施形態においては、前記適切なバッファーは、極性プロトン性分子、リン酸ナトリウム、トリス、ＨＥＰＥＳなどである。
一実施形態においては、前記ロード、洗浄、及び溶出バッファーは、約６．５～約７．２の範囲のｐＨを有する。
一実施形態においては、前記ロード、洗浄、及び溶出バッファーは、約７．０±０．２のｐＨを有する。
一実施形態においては、前記ロード及び洗浄バッファーは、約３～約７ｍＳ／ｃｍの範囲の導電率を有する。
好ましい実施形態においては、前記ロード及び洗浄バッファーは、約６ｍＳ／ｃｍの導電率を有する。
別の実施形態においては、溶出リン酸塩勾配は、リン酸塩の濃度が、バッファーＢが約５％から２５％まで徐々に増加する線形勾配である。
別の実施形態においては、前記リン酸塩の濃度が、約８％から２２％まで徐々に増加するプロセスである。
別の実施形態においては、前記リン酸塩の濃度が、約１０％から２４％まで徐々に増加するプロセスである。
かかる実施形態の一態様においては、前記ＣＨＴカラムから溶出された前記タンパク質混合物は、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、０．４％未満のＬＭＷを含む。
かかる実施形態の一態様においては、前記ＣＨＴカラムから溶出された前記タンパク質混合物は、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、約０．３％以下のＬＭＷ、０．２％以下のＬＭＷ、０．１％以下のＬＭＷから選択されるＬＭＷを含む。
かかる実施形態の一態様においては、前記ＣＨＴカラムから溶出された前記タンパク質混合物は、約１４％以下のＢＶ、１３％以下のＢＶ、１２％以下のＢＶ、１１％以下のＢＶ、１０％以下のＢＶ、９％以下のＢＶ、８％以下のＢＶ、７％以下のＢＶ、６％以下のＢＶ、５％以下のＢＶ、４％以下のＢＶ、３％以下のＢＶ、２％以下のＢＶ、１％以下のＢＶから選択される低いＢＶを含む。
かかる実施形態の一態様においては、前記ＣＨＴカラムから溶出された前記タンパク質混合物は、１０％未満のＢＶを含む。
別の実施形態においては、前記プロセスは、前記リン酸塩の濃度が、約２４ｍＭから１００ｍＭまで徐々に増加する線形溶出勾配を提供する。
別の実施形態においては、前記プロセスは、前記リン酸塩の濃度が、約３２ｍＭから８８ｍＭまで徐々に増加する、ＣＨＴカラムの線形溶出勾配を提供する。
別の実施形態においては、前記プロセスは、前記リン酸塩の濃度が、約４０ｍＭから９６ｍＭまで徐々に増加する、ＣＨＴカラムの線形溶出勾配を提供する。
一実施形態においては、本発明は、ＩｇＥと結合する抗体と、１以上の低分子量（ＬＭＷ）バリアントと、１以上の塩基性バリアント（ＢＶ）とを含むタンパク質混合物から前記抗体を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された抗体が実質的に純粋であり、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、ＬＭＷが０．４％未満であり、
前記精製された抗体が実質的に純粋であり、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、塩基性バリアントが１５％未満であるプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された抗体が実質的に純粋であり、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、ＬＭＷが０．４％未満であり、
前記精製された抗体が実質的に純粋であり、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、塩基性バリアントが１５％未満であるプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、前記ＣＨＴカラムから溶出された前記抗体は、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、約０．３％以下のＬＭＷ、０．２％以下のＬＭＷ、０．１％以下のＬＭＷから選択されるＬＭＷを含む。
かかる実施形態の一態様においては、前記ＣＨＴカラムから溶出された前記抗体は、約１４％以下のＢＶ、１３％以下のＢＶ、１２％以下のＢＶ、１１％以下のＢＶ、１０％以下のＢＶ、９％以下のＢＶ、８％以下のＢＶ、７％以下のＢＶ、６％以下のＢＶ、５％以下のＢＶ、４％以下のＢＶ、３％以下のＢＶ、２％以下のＢＶ、１％以下のＢＶから選択される低いＢＶを含む。
特定の実施形態においては、前記目的のタンパク質は、ＩｇＧ１抗体又は融合タンパク質である。一実施形態においては、前記目的のタンパク質は、ＩｇＥに結合するＩｇＧ１抗体である。好ましい実施形態においては、ＩｇＧ１抗体は、オマリズマブのバイオシミラーである。
一実施形態においては、前記精製プロセスは、９０％、又は９１％、又は９２％、又は９３％、又は９４％、又は９５％、又は９６％、又は９７％、又は９８％、又は９９％超から選択されるモノマーの純度を提供する。
一実施形態においては、本発明は、前記オマリズマブの実質的に精製された単量体と、ＳＥ－ＨＰＬＣによって測定したときに、約０．２％未満のＬＭＷとを含む、オマリズマブの医薬用精製組成物を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、前記オマリズマブの実質的に精製された単量体と、ＳＥ－ＨＰＬＣによって測定したときに、約０．２％未満のＬＭＷとを含む、ＣＨＴクロマトグラフィーによって精製されたオマリズマブの医薬用精製組成物を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、前記オマリズマブの実質的に精製された単量体と、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、２．２％～２．６％の、ＬＣ、ＨＣ、ＨＨ、及び２Ｈ１Ｌから選択されるＬＭＷとを含む、ＣＨＴクロマトグラフィーによって精製されたオマリズマブの医薬用精製組成物を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、前記オマリズマブの実質的に精製された単量体と、ＣＥＸ－ＨＰＬＣによって測定したときに、５％未満の塩基性バリアントとを含む、オマリズマブの医薬用精製組成物を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、前記オマリズマブの実質的に精製された単量体と、ＣＥＸ－ＨＰＬＣによって測定したときに、５％未満の塩基性バリアントとを含む、ＣＨＴクロマトグラフィーによって精製されたオマリズマブの医薬用精製組成物を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、酸性種又はそのバリアントとを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、ｐＨ７．０～７．５から選択される適切なｐＨにて、適切なバッファーでアニオン交換樹脂にロードすることと；
ｂ．前記タンパク質混合物をフロースルーモードで溶出して、前記目的のタンパク質の酸性種又はバリアントを前記アニオン交換樹脂に結合させることと、
を含み、
溶出された前記タンパク質混合物が、前記目的のタンパク質の実質的に純粋な単量体と、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、１５％未満の酸性種又はバリアントとを含むプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、ｐＨ７．０～７．５から選択される適切なｐＨにて、適切なバッファーでアニオン交換樹脂にロードすることと；
ｂ．前記タンパク質混合物をフロースルーモードで溶出して、前記目的のタンパク質の酸性種又はバリアントを前記アニオン交換樹脂に結合させることと、
を含み、
溶出された前記タンパク質混合物が、前記目的のタンパク質の実質的に純粋な単量体と、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、１５％未満の酸性種又はバリアントとを含むプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、前記プロセスは、約１４％以下のＡＶ、１３％以下のＡＶ、１２％以下のＡＶ、１１％以下のＡＶ、１０％以下のＡＶ、９％以下のＡＶ、８％以下のＡＶ、７％以下のＡＶ、６％以下のＡＶ、５％以下のＡＶ、４．５％以下のＡＶ、４％以下のＡＶ、３％以下のＡＶ、２％以下のＡＶ、１％以下未満のＡＶである前記酸性バリアントを含む前記タンパク質混合物を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、前記オマリズマブの実質的に精製された単量体と、ＣＥＸ－ＨＰＬＣによって測定したときに、１２％未満の酸性バリアントとを含む、オマリズマブの医薬用精製組成物を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、前記オマリズマブの実質的に精製された単量体と、ＣＥＸ－ＨＰＬＣによって測定したときに、１２％未満の酸性バリアントとを含む、ＡＥＸクロマトグラフィーによって精製されたオマリズマブの医薬用精製組成物を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、前記オマリズマブの実質的に精製された単量体と、ＣＥＸ－ＨＰＬＣによって測定したときに、１０％未満の酸性バリアントとを含む、ＡＥＸクロマトグラフィーによって精製されたオマリズマブの医薬用精製組成物を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、高分子量（ＨＭＷ）不純物とを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．得られた前記タンパク質混合物を、ｐＨ７．０～７．５から選択される適切なｐＨにて、適切なバッファーでアニオン交換樹脂にロードすることと；
ｂ．前記タンパク質混合物をフロースルーモードで溶出して、前記ＨＭＷ不純物を前記アニオン交換樹脂に結合させることと、
を含み、
溶出された前記タンパク質混合物が、前記目的のタンパク質の実質的に純粋な単量体と、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、０．５％未満の前記ＨＭＷ不純物とを含むプロセスを提供する。
ａ．得られた前記タンパク質混合物を、ｐＨ７．０～７．５から選択される適切なｐＨにて、適切なバッファーでアニオン交換樹脂にロードすることと；
ｂ．前記タンパク質混合物をフロースルーモードで溶出して、前記ＨＭＷ不純物を前記アニオン交換樹脂に結合させることと、
を含み、
溶出された前記タンパク質混合物が、前記目的のタンパク質の実質的に純粋な単量体と、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、０．５％未満の前記ＨＭＷ不純物とを含むプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、前記プロセスは、０．５％以下、約０．４％以下、又は０．３％以下、又は０．２％以下、又は０．１％以下未満のＨＭＷを含むタンパク質混合物を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、前記オマリズマブの実質的に精製された単量体と、ＳＥ－ＨＰＬＣによって測定したときに、０．５％未満のＨＭＷとを含む、ＡＥＸクロマトグラフィーによって精製されたオマリズマブの医薬用精製組成物を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、酸性種又はそのバリアントとを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィープロテインＡ又はプロテインＧによって精製することと；
ｂ．アフィニティークロマトグラフィーで得られた前記タンパク質混合物を、ウイルス不活化に付すことと；
ｃ．工程（ｂ）で得られた前記タンパク質混合物を、ｐＨ７．０～７．５から選択される適切なｐＨにて、適切なバッファーでアニオン交換樹脂にロードすることと；
ｄ．前記タンパク質混合物をフロースルーモードで溶出して、前記目的のタンパク質の酸性種又はバリアントを前記アニオン交換樹脂に結合させることと、
を含み、
工程（ｄ）で得られた、溶出された前記タンパク質混合物が、前記目的のタンパク質の実質的に純粋な単量体と、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、１５％未満の酸性種又はバリアントとを含むプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィープロテインＡ又はプロテインＧによって精製することと；
ｂ．アフィニティークロマトグラフィーで得られた前記タンパク質混合物を、ウイルス不活化に付すことと；
ｃ．工程（ｂ）で得られた前記タンパク質混合物を、ｐＨ７．０～７．５から選択される適切なｐＨにて、適切なバッファーでアニオン交換樹脂にロードすることと；
ｄ．前記タンパク質混合物をフロースルーモードで溶出して、前記目的のタンパク質の酸性種又はバリアントを前記アニオン交換樹脂に結合させることと、
を含み、
工程（ｄ）で得られた、溶出された前記タンパク質混合物が、前記目的のタンパク質の実質的に純粋な単量体と、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、１５％未満の酸性種又はバリアントとを含むプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、前記プロセスは、約１４％以下のＡＶ、１３％以下のＡＶ、１２％以下のＡＶ、１１％以下のＡＶ、１０％以下のＡＶ、９％以下のＡＶ、８％以下のＡＶ、７％以下のＡＶ、６％以下のＡＶ、５％以下のＡＶ、４．５％以下のＡＶ、４％以下のＡＶ、３％以下のＡＶ、２％以下のＡＶ、１％以下未満のＡＶである前記酸性バリアントを含む前記タンパク質混合物を提供する。
かかる実施形態の一態様においては、前記精製プロセスは、強アニオン交換のフロースルーモードで得られるタンパク質混合物において、酸性バリアントを少なくとも４０％、好ましくは５０％低減する。
別の実施形態においては、本発明は、目的のタンパク質と、高分子量（ＨＭＷ）不純物とを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィープロテインＡ又はプロテインＧによって精製することと；
ｂ．アフィニティークロマトグラフィーで得られた前記タンパク質混合物を、ウイルス不活化に付すことと；
ｃ．工程（ｂ）で得られた前記タンパク質混合物を、ｐＨ７．０～７．５から選択される適切なｐＨにて、適切なバッファーでアニオン交換樹脂にロードすることと；
ｄ．前記タンパク質混合物をフロースルーモードで溶出して、前記ＨＭＷ不純物を前記アニオン交換樹脂に結合させることと、
を含み、
工程（ｄ）で得られた、溶出された前記タンパク質混合物が、前記目的のタンパク質の実質的に純粋な単量体と、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、０．５％未満のＨＭＷ不純物とを含むプロセスを提供する。
ａ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィープロテインＡ又はプロテインＧによって精製することと；
ｂ．アフィニティークロマトグラフィーで得られた前記タンパク質混合物を、ウイルス不活化に付すことと；
ｃ．工程（ｂ）で得られた前記タンパク質混合物を、ｐＨ７．０～７．５から選択される適切なｐＨにて、適切なバッファーでアニオン交換樹脂にロードすることと；
ｄ．前記タンパク質混合物をフロースルーモードで溶出して、前記ＨＭＷ不純物を前記アニオン交換樹脂に結合させることと、
を含み、
工程（ｄ）で得られた、溶出された前記タンパク質混合物が、前記目的のタンパク質の実質的に純粋な単量体と、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、０．５％未満のＨＭＷ不純物とを含むプロセスを提供する。
かかる実施形態の一態様においては、前記プロセスは、０．５％以下、約０．４％以下、又は０．３％以下、又は０．２％以下、又は０．１％以下未満のＨＭＷを含むタンパク質混合物を提供する。
かかる実施形態の一態様においては、前記精製プロセスは、強アニオン交換のフロースルーモードで得られるタンパク質混合物において、ＨＭＷを少なくとも８０％、好ましくは９０％低減する。
一実施形態において、本発明は、驚くべきことに、バッファー溶液のｐＨがオマリズマブのｐＩより僅かに低い７．０～７．３であるフロースルーモードで、強アニオン交換カラムを実行することによって、前記カラムを通して酸性バリアント及びＨＭＷが除去されることを見出した。バッファーの望ましいｐＨを最適化することによって、酸性バリアント又はＨＭＷの少なくとも４０％超が強アニオン交換に実質的に結合する。特定の実施形態においては、８０％超のＨＭＷが強アニオン交換に結合する。
一実施形態において、本発明は、酸性バリアントが１５％未満、好ましくは１２％未満であり、ＨＭＷが０．５％未満、好ましくは、規制機関の許容限界未満である０．３％である、強アニオン交換から得られる精製抗体組成物を提供する。
一実施形態においては、本発明は、複数のカラムを使用しないことにより、下流での処理の負担を軽減する上で非常に有用である。特定の実施形態においては、本発明は、ＨＩＣ、及びマルチモーダルクロマトグラフィーを使用しない。
別の実施形態においては、本発明は、タンパク質混合物から目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記目的のタンパク質と、酸性バリアント、塩基性バリアント、低分子量（ＬＭＷ）、高分子量（ＨＭＷ）から選択される少なくとも１つの不純物とを含む哺乳動物発現系からタンパク質混合物を得ることと；前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィーカラムにアプライすることと；
ｂ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出することと；
ｃ．工程（ｃ）で得られた前記タンパク質混合物のウイルス不活化を行うことと；
ｄ．工程（ｄ）で得られた前記タンパク質混合物を、アニオン交換クロマトグラフィーにアプライすることと；
ｅ．前記タンパク質混合物を、フロースルーモードで溶出することと；
ｆ．工程（ｆ）で得られた、ＨＭＷと酸性バリアントとを実質的に含まない前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムにアプライすることと；
ｇ．任意に、前記ＣＨＴカラムを、適切な洗浄バッファーで洗浄することと；
ｈ．前記タンパク質混合物を、適切なバッファーで前記ＣＨＴカラムから溶出することと、
を含み、
溶出された前記タンパク質混合物が、前記目的のタンパク質で濃縮されており、不純物であるＨＭＷ、ＬＭＷ、塩基性バリアント（ＢＶ）を実質的に含まないプロセスを提供する。
ａ．前記目的のタンパク質と、酸性バリアント、塩基性バリアント、低分子量（ＬＭＷ）、高分子量（ＨＭＷ）から選択される少なくとも１つの不純物とを含む哺乳動物発現系からタンパク質混合物を得ることと；前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィーカラムにアプライすることと；
ｂ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出することと；
ｃ．工程（ｃ）で得られた前記タンパク質混合物のウイルス不活化を行うことと；
ｄ．工程（ｄ）で得られた前記タンパク質混合物を、アニオン交換クロマトグラフィーにアプライすることと；
ｅ．前記タンパク質混合物を、フロースルーモードで溶出することと；
ｆ．工程（ｆ）で得られた、ＨＭＷと酸性バリアントとを実質的に含まない前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムにアプライすることと；
ｇ．任意に、前記ＣＨＴカラムを、適切な洗浄バッファーで洗浄することと；
ｈ．前記タンパク質混合物を、適切なバッファーで前記ＣＨＴカラムから溶出することと、
を含み、
溶出された前記タンパク質混合物が、前記目的のタンパク質で濃縮されており、不純物であるＨＭＷ、ＬＭＷ、塩基性バリアント（ＢＶ）を実質的に含まないプロセスを提供する。
一実施形態においては、本発明は、目的の抗体が濃縮され、且つ酸性バリアント及びＨＭＷ又は凝集体が実質的に低減された抗体組成物を製造するアニオン交換プロセスを提供する。
一実施形態においては、本発明は、目的の抗体が濃縮され、且つ酸性バリアントが実質的に低減され、約１４％以下のＡＶ、１３％以下のＡＶ、１２％以下のＡＶ、１１％以下のＡＶ、１０％以下のＡＶ、９％以下のＡＶ、８％以下のＡＶ、７％以下のＡＶ、６％以下のＡＶ、５％以下のＡＶ、４．５％以下のＡＶ、４％以下のＡＶ、３％以下のＡＶ、２％以下のＡＶ、１％以下のＡＶを含む抗体組成物を製造する、ネガティブモードで行われるアニオン交換プロセスを提供する。
一実施形態においては、本発明は、目的の抗体が濃縮され、且つＨＭＷが実質的に低減され、約０．５％以下のＨＭＷを含む抗体組成物を製造する、ネガティブモードで行われるアニオン交換プロセスを提供する。この実施形態の一態様においては、低ＨＭＷ組成物は、約０．４％以下のＨＭＷ、０．３％以下のＨＭＷ、０．２％以下のＨＭＷ、０．１％以下のＨＭＷを含む。
一実施形態においては、本発明は、目的の抗体が濃縮され、且つ塩基性バリアント及びＬＭＷ不純物が低減された抗体組成物を製造する、ＣＨＴカラムクロマトグラフィープロセスを提供する。
一実施形態においては、本発明は、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、約０．３％以下のＬＭＷ、０．２％以下のＬＭＷ、０．１％以下のＬＭＷから選択されるＬＭＷを含む、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物を提供する。
一実施形態においては、本発明は、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、０．４％未満のＬＭＷを含む、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物を提供する。
一実施形態においては、本発明は、約１４％以下のＢＶ、１３％以下のＢＶ、１２％以下のＢＶ、１１％以下のＢＶ、１０％以下のＢＶ、９％以下のＢＶ、８％以下のＢＶ、７％以下のＢＶ、６％以下のＢＶ、５％以下のＢＶ、４％以下のＢＶ、３％以下のＢＶ、２％以下のＢＶ、１％以下のＢＶから選択される低いＢＶを含む、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物を提供する。
一実施形態においては、本発明は、１０％未満のＢＶを含む、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物を提供する。
一実施形態においては、本発明は、５％未満のＢＶを含む、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、タンパク質混合物から、５０Ｌのスケール又は２００Ｌのスケールで、オマリズマブを精製するプロセスであって、
ａ．目的のタンパク質と、酸性バリアント、塩基性バリアント、低分子量（ＬＭＷ）、高分子量（ＨＭＷ）から選択される少なくとも１つの不純物とを含む哺乳動物発現系からタンパク質混合物を得ることと；
ｂ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィーカラムにアプライすることと；
ｃ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出することと；
ｄ．工程（ｃ）で得られた前記タンパク質混合物のウイルス不活化を行うことと；
ｅ．工程（ｄ）で得られた前記タンパク質混合物を、アニオン交換クロマトグラフィーにアプライすることと；
ｆ．前記タンパク質混合物を、フロースルーモードで溶出することと；
ｇ．工程（ｆ）で得られた、ＨＭＷと酸性バリアントとを実質的に含まない前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムにアプライすることと；
ｈ．適切な洗浄バッファーで、前記ＣＨＴカラムを洗浄することと；
ｉ．適切なバッファーで、前記ＣＨＴカラムから前記タンパク質混合物を溶出することと、
を含み、
溶出された前記タンパク質混合物が、オマリズマブで濃縮されており、不純物であるＬＭＷ、及び塩基性バリアント（ＢＶ）を実質的に含まないプロセスを提供する。
ａ．目的のタンパク質と、酸性バリアント、塩基性バリアント、低分子量（ＬＭＷ）、高分子量（ＨＭＷ）から選択される少なくとも１つの不純物とを含む哺乳動物発現系からタンパク質混合物を得ることと；
ｂ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィーカラムにアプライすることと；
ｃ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出することと；
ｄ．工程（ｃ）で得られた前記タンパク質混合物のウイルス不活化を行うことと；
ｅ．工程（ｄ）で得られた前記タンパク質混合物を、アニオン交換クロマトグラフィーにアプライすることと；
ｆ．前記タンパク質混合物を、フロースルーモードで溶出することと；
ｇ．工程（ｆ）で得られた、ＨＭＷと酸性バリアントとを実質的に含まない前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムにアプライすることと；
ｈ．適切な洗浄バッファーで、前記ＣＨＴカラムを洗浄することと；
ｉ．適切なバッファーで、前記ＣＨＴカラムから前記タンパク質混合物を溶出することと、
を含み、
溶出された前記タンパク質混合物が、オマリズマブで濃縮されており、不純物であるＬＭＷ、及び塩基性バリアント（ＢＶ）を実質的に含まないプロセスを提供する。
一実施形態においては、ＣＨＴ洗浄は、緩く結合した不純物を除去する。
一実施形態においては、本発明は、目的の抗体が濃縮され、且つ酸性バリアント及びＨＭＷ又は凝集体が実質的に低減されたオマリズマブ組成物を製造する、アニオン交換プロセスを提供する。
一実施形態においては、本発明は、オマリズマブが濃縮され、且つ酸性バリアントが実質的に低減され、約１４％以下のＡＶ、１３％以下のＡＶ、１２％以下のＡＶ、１１％以下のＡＶ、１０％以下のＡＶ、９％以下のＡＶ、８％以下のＡＶ、７％以下のＡＶ、６％以下のＡＶ、５％以下のＡＶ、４．５％以下のＡＶ、４％以下のＡＶ、３％以下のＡＶ、２％以下のＡＶ、１％以下のＡＶを含む抗体組成物を製造する、ネガティブモードで行われるアニオン交換プロセスを提供する。
一実施形態においては、本発明は、オマリズマブが濃縮され、且つＨＭＷが実質的に低減され、約０．５％以下のＨＭＷを含む抗体組成物を製造する、ネガティブモードで行われるアニオン交換プロセスを提供する。この実施形態の一態様においては、低ＨＭＷ組成物は、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析で分析したときに、約０．４％以下のＨＭＷ、０．３％以下のＨＭＷ、０．２％以下のＨＭＷ、０．１％以下のＨＭＷを含む。
一実施形態においては、本発明は、オマリズマブが濃縮され、且つ塩基性バリアント及びＬＭＷ不純物が低減された抗体組成物を製造する、ＣＨＴカラムクロマトグラフィープロセスを提供する。
一実施形態においては、本発明は、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、約０．３％以下のＬＭＷ、０．２％以下のＬＭＷ、０．１％以下のＬＭＷから選択されるＬＭＷを含む、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物を提供する。
一実施形態においては、本発明は、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、０．４％未満のＬＭＷを含む、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物を提供する。
一実施形態においては、本発明は、約１４％以下のＢＶ、１３％以下のＢＶ、１２％以下のＢＶ、１１％以下のＢＶ、１０％以下のＢＶ、９％以下のＢＶ、８％以下のＢＶ、７％以下のＢＶ、６％以下のＢＶ、５％以下のＢＶ、４％以下のＢＶ、３％以下のＢＶ、２％以下のＢＶ、１％以下のＢＶから選択される低いＢＶを含む、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物を提供する。
一実施形態においては、本発明は、１０％未満のＢＶを含む、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物を提供する。
一実施形態においては、本発明は、５％未満のＢＶを含む、ＣＨＴカラムから溶出されたタンパク質混合物を提供する。
一実施形態においては、前記抗体は、ＩｇＥに結合することができ、それによって、アレルギー疾患、喘息、鼻茸、及び蕁麻疹を治療することができる。好ましい実施形態においては、前記抗体は、オマリズマブである。
一実施形態においては、実質的に精製された単量体と、不純物である１２％未満の酸性バリアント、５％未満の塩基性バリアント、０．４％未満のＬＭＷ、及び０．５％未満のＨＭＷとを含むオマリズマブのバイオシミラーの精製医薬組成物である。
一実施形態においては、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及び融合タンパク質から選択される。特定の実施形態においては、前記抗体は、エタネルセプト、リツキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、オマリズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、エクリズマブ、セルトリズマブペゴル、ウステキヌマブ、カナキヌマブ、ゴリムマブ、オファツムマブ、トシリズマブ、デノスマブ、ベリムマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブベドチン、ペルツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、ラキシバクマブ、オビヌツズマブ、シルツキシマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、ブリナツモマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ダルシズマブ、ネシツムマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、メポリズマブ、アリロクマブ、エボロクマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、イキセキズマブ、レスリズマブ、オララツマブ、ベズロトクスマブ、アテゾリズマブ、オビルトキサキシマブ、サリルマブ、オクレリズマブ、チルドラキズマブ、ロモソズマブ、ブロルシズマブ、クリザンリズマブから選択される。
一実施形態においては、前記目的のタンパク質は、ＩｇＥに結合するＩｇＧ１抗体である。好ましい実施形態においては、前記ＩｇＧ１抗体は、オマリズマブのバイオシミラーである。
一実施形態においては、アフィニティークロマトグラフィーの後に連続して行われるクロマトグラフィー工程は、相互に調整又は交換可能である。特定の実施形態においては、アフィニティークロマトグラフィーの後に、ＣＨＴクロマトグラフィーを行うことができる。特定の実施形態においては、アフィニティークロマトグラフィーとＡＥＸクロマトグラフィーとの間に、ＣＨＴを行うことができる。
特定の実施形態においては、アフィニティークロマトグラフィーの後に、ＣＨＴを行うことができる。
特定の実施形態においては、アフィニティークロマトグラフィーとＡＥＸクロマトグラフィーとの間に、ＣＨＴを行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーの条件：
一実施形態においては、前記アフィニティークロマトグラフィーは、プロテインＡ又はプロテインＧから選択される。
一実施形態においては、前記アフィニティークロマトグラフィー樹脂は、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ ＬＸ、Ｐｒｏｓｅｐ Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓ、Ｅｓｈｍｕｎｏ Ａから選択される。好ましい実施形態においては、前記アフィニティークロマトグラフィー樹脂は、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸである。
一実施形態においては、平衡化バッファー、又はロードバッファー、又は洗浄バッファーは、リン酸ナトリウム、トリス－ＨＣｌ、トリス－アセテート、ＨＥＰＥＳ、グリシン－ＮａＯＨから選択される。
好ましい実施形態においては、前記ロードバッファーは、トリス－アセテート又はトリス－ＨＣｌである。
特定の実施形態においては、前記平衡化バッファー、又はロードバッファー、又は洗浄バッファーは、塩と組み合わせて使用される。特定の実施形態においては、前記塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウムから選択される。好ましい実施形態においては、前記塩は、塩化ナトリウムである。
一実施形態においては、前記平衡化バッファーは、約５ｍＭ～約４０ｍＭの濃度範囲を有する。特定の実施形態においては、前記平衡化バッファーは、約１０ｍＭ～約２５ｍＭの濃度範囲を有する。好ましい実施形態においては、前記平衡化バッファーの濃度は、約２０ｍＭである。
特定の実施形態においては、前記平衡化バッファー、又はロードバッファー、又は洗浄バッファーは、任意に、約５０ｍＭ～約４００ｍＭから選択される塩を含む。一実施形態においては、前記平衡化バッファーは、約１００ｍＭ～約２００ｍＭから選択される塩バッファー濃度を含む。一実施形態においては、前記平衡化バッファーの濃度は、約１５０ｍＭである。別の実施形態においては、前記平衡化バッファーの濃度は、約１００ｍＭである。
一実施形態においては、前記平衡化バッファー、又はロードバッファー、又は洗浄バッファーは、約１０ｍＳ／ｃｍ～約２０ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。一実施形態においては、前記平衡化バッファー、又はロードバッファー、又は洗浄バッファーの導電率は、約１５．０ｍＳ／ｃｍ～１８．０ｍＳ／ｃｍである。別の実施形態においては、前記平衡化バッファー、又はロードバッファー、又は洗浄バッファーの導電率は、約１０．０ｍＳ／ｃｍ～１３．０ｍＳ／ｃｍである。
一実施形態においては、前記平衡化バッファー、又はロードバッファー、又は洗浄バッファーのｐＨは、約６．５～約７．５から選択される。好ましい実施形態においては、前記平衡化バッファーのｐＨは、約７．０である。
一実施形態においては、前記ロードバッファーは、約５ｍＭ～約４０ｍＭの濃度範囲を有する。一実施形態においては、前記ロードバッファーは、約１０ｍＭ～約３０ｍＭの濃度範囲を有する。好ましい実施形態においては、前記ロードバッファーの濃度は、約２０ｍＭである。
特定の実施形態においては、前記アフィニティークロマトグラフィーは、少なくとも１種の洗浄バッファーを有する。別の実施形態においては、前記アフィニティークロマトグラフィーは、３種の洗浄バッファーを有する。
一実施形態においては、第１の洗浄バッファーは、約５ｍＭ～約４０ｍＭの濃度範囲を有する。特定の実施形態においては、第１の洗浄バッファーは、約１０ｍＭ～約２５ｍＭの濃度範囲を有する。好ましい実施形態においては、第１の洗浄バッファーの濃度は、約２０ｍＭである。
一実施形態においては、第２の洗浄バッファーは、リン酸ナトリウム、トリス－ＨＣｌ、トリス－アセテート、ＨＥＰＥＳ、及びグリシン－ＮａＯＨから選択される。
特定の実施形態においては、第２の洗浄バッファーは、塩と組み合わせて使用される。
特定の実施形態においては、前記塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウムから選択される。好ましい実施形態においては、前記塩は、塩化ナトリウムである。
一実施形態においては、第２の洗浄バッファーは、約５ｍＭ～約４０ｍＭの濃度範囲を有する。特定の実施形態においては、第２の洗浄バッファーは、約１０ｍＭ～約２５ｍＭの濃度範囲を有する。好ましい実施形態においては、第２の洗浄バッファーの濃度は、約２０ｍＭである。
一実施形態においては、第２の洗浄バッファーは、約０．５Ｍ～約１．５Ｍの塩バッファー濃度範囲を有する。好ましい実施形態においては、第２の洗浄バッファーの濃度は、約１．０Ｍである。
一実施形態においては、第２の洗浄バッファーは、約７０ｍＳ／ｃｍ～約１２０ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。一実施形態においては、第２の洗浄バッファーは、約８０ｍＳ／ｃｍ～約１００ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。好ましい実施形態においては、、第２の洗浄バッファーの導電率は、約９０ｍＳ／ｃｍである。
一実施形態においては、第２の洗浄バッファーのｐＨは、約６．５～約７．５から選択される。好ましい実施形態においては、第２の洗浄バッファーのｐＨは、約７．０である。
一実施形態においては、第２の洗浄バッファーは、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、及びトリトンＸ－１００から選択される界面活性剤を更に含む。一実施形態においては、好ましい界面活性剤は、ポリソルベート２０である。
一実施形態においては、第２の洗浄バッファー中の界面活性剤の割合は、約０．０１％～約１％である。好ましい実施形態においては、第２の洗浄バッファー中の界面活性剤は、０．１％（ｗ／ｖ）である。
一実施形態においては、第３の洗浄バッファーは、約５ｍＭ～約４０ｍＭの濃度範囲を有する。特定の実施形態においては、第３の洗浄バッファーは、約１０ｍＭ～約３０ｍＭの濃度範囲を有する。好ましい実施形態においては、第３の洗浄バッファーの濃度は、約２０ｍＭである。
一実施形態においては、第３の洗浄バッファーは、約５ｍＭ～約４０ｍＭの濃度範囲を有する。特定の実施形態においては、第３の洗浄バッファーは、約１０ｍＭ～約４０ｍＭの濃度範囲を有する。好ましい実施形態においては、第３の洗浄バッファーの濃度は、約３０ｍＭである。
一実施形態においては、第３の洗浄バッファーは、約０．５ｍＳ／ｃｍ～約２．５ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。好ましい実施形態においては、第３の洗浄バッファーの導電率は、２．５ｍＳ／ｃｍ未満である。
一実施形態においては、第３の洗浄バッファーのｐＨは、約５～約６から選択される。好ましい実施形態においては、第３の洗浄バッファーのｐＨは、約５．５である。
一実施形態においては、前記溶出バッファーは、酢酸、リン酸、酢酸ナトリウム、及びＨＣｌから選択される。好ましい実施形態においては、前記溶出バッファーは、酢酸である。
一実施形態においては、前記溶出バッファーは、酢酸、リン酸、酢酸ナトリウム、及びＨＣｌから選択される。好ましい実施形態においては、前記溶出バッファーは、酢酸ナトリウムである。
一実施形態においては、前記溶出バッファーは、約２５ｍＭ～約２５０ｍＭから選択される濃度範囲を有する。
一実施形態においては、前記溶出バッファーは、約１００ｍＭ～約２５０ｍＭから選択される濃度範囲を有する。一実施形態においては、前記溶出バッファーは、約１２５ｍＭ～２００ｍＭから選択される濃度範囲を有する。
一実施形態においては、前記溶出バッファーは、約０．２ｍＳ／ｃｍ～約１．０ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。一実施形態においては、前記溶出バッファーは、約０．５ｍＳ／ｃｍ～約１．０ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。一実施形態においては、前記溶出バッファーは、約０．５ｍＳ／ｃｍ～約０．６ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。一実施形態においては、前記溶出バッファーは、約０．２ｍＳ／ｃｍ～約０．３ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。
一実施形態においては、前記溶出バッファーのｐＨは、２．５～約３．５から選択される。好ましい実施形態においては、前記溶出バッファーのｐＨは、約３．５である。
一実施形態においては、前記溶出バッファーは、約０．２ｍＳ／ｃｍ～約０．３ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。一実施形態においては、前記溶出バッファーのｐＨは、２．５～約３．５から選択される。好ましい実施形態においては、前記溶出バッファーのｐＨは、約３．０である。
特定の実施形態においては、前記溶出は、線形勾配で行われる。特定の実施形態においては、前記溶出は、段差勾配で行われる。
一実施形態においては、溶出ピークの回収は、約２．５ＡＵ／ｃｍ上方値で開始し、約２．５ＡＵ／ｃｍ下方値で終了する。
一実施形態においては、溶出ピークの回収は、約０．２５ＡＵ／ｃｍ上方値で開始し、約０．２５ＡＵ／ｃｍ下方値で終了する。
一実施形態においては、本発明は、前記溶出バッファーが約２００ｍＭの濃度を有するアフィニティークロマトグラフィーから得られる、約１００ＮＴＵ未満、約５０ＮＴＵ未満、約３０ＮＴＵ未満、約１０ＮＴＵ未満から選択される濁度を有する抗体組成物を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、低塩濃度で溶出を行うアフィニティークロマトグラフィーを用いることによる、抗体又はその断片の精製プロセスを提供する。
別の実施形態においては、本発明は、低塩濃度で溶出を行うアフィニティークロマトグラフィーを用いることによる、抗体又はその断片の精製プロセスであって、ウイルス不活化中に、溶出したタンパク質混合物の高塩濃度で行われる溶出と比較して濁度が低下しない精製プロセスを提供する。
一実施形態においては、前記平衡化は、約３ＣＶ～約１０ＣＶで行われる。好ましい実施形態においては、前記平衡化は、約５ＣＶで行われる。一実施形態においては、前記平衡化は、前記平衡化バッファーの導電率のエンドポイントが達成されるまで行われる。
一実施形態においては、ロード時にカラムにロードされるタンパク質量は、約１０ｇ／Ｌ～約４５ｇ／Ｌである。一実施形態においては、ロード時にカラムにロードされるタンパク質量は、約１０ｇ／Ｌ～約５０ｇ／Ｌである。
一実施形態においては、第１の洗浄は、少なくとも１～約５ＣＶで行われる。好ましい実施形態においては、第１の洗浄は、３ＣＶで行われる。一実施形態においては、第１の洗浄は、バッファー導電率のエンドポイントが達成されるまで行われる。
一実施形態においては、第２の洗浄は、少なくとも１ＣＶ～約５ＣＶで行われる。好ましい実施形態においては、第２の洗浄は、３ＣＶで行われる。一実施形態においては、第２の洗浄は、バッファー導電率のエンドポイントが達成されるまで行われる。
一実施形態においては、第３の洗浄は、少なくとも４ＣＶ～約８ＣＶで行われる。好ましい実施形態においては、第３の洗浄は、５ＣＶで行われる。一実施形態においては、第３の洗浄は、バッファー導電率のエンドポイントが達成されるまで行われる。
一実施形態においては、プロテインＡ精製時のカラム内のタンパク質の滞留時間は、約２分間～約６分間の範囲を有する。好ましい実施形態においては、カラム内のタンパク質の滞留時間は、約４分間である。
ＡＥＸクロマトグラフィーの条件：
一実施形態においては、アニオン交換クロマトグラフィー樹脂は、Ｃａｐｔｏ Ｑ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥ（Ｍ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ － ６５０、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＰＯＲＯＳ ＸＱ、ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ、ＰＯＲＯＳ ５０ ＰＩ、及びＰＯＲＯＳ ５０ Ｄから選択される。特定の実施形態においては、アニオン交換クロマトグラフィー樹脂は、強アニオン交換ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱである。
一実施形態においては、アニオン交換クロマトグラフィー樹脂は、Ｃａｐｔｏ Ｑ、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ ＤＥＡＥ（Ｍ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ － ６５０、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＰＯＲＯＳ ＸＱ、ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ、ＰＯＲＯＳ ５０ ＰＩ、及びＰＯＲＯＳ ５０ Ｄから選択される。特定の実施形態においては、アニオン交換クロマトグラフィー樹脂は、強アニオン交換ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱである。
一実施形態においては、前記平衡化バッファー又はロードバッファーは、リン酸ナトリウム、トリス－ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、グリシン－ＮａＯＨ、及びトリス－アセテートから選択される。特定の実施形態においては、前記平衡化バッファー又はロードバッファーは、トリスアセテート又はトリス－ＨＣｌである。
一実施形態においては、前記平衡化バッファーは、約４０ｍＭ～約６０ｍＭの濃度範囲を有する。特定の実施形態においては、前記ロードバッファーの濃度は、約５０ｍＭである。特定の実施形態においては、前記ロードバッファーの濃度は、約２０ｍＭである。
一実施形態においては、前記平衡化バッファーは、約１．５ｍＳ／ｃｍ～約３．５ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。特定の実施形態においては、前記平衡化バッファーの導電率は、２．６ｍＳ／ｃｍ未満である。
一実施形態においては、前記平衡化バッファーのｐＨは、約６．５～約７．５から選択される。特定の実施形態においては、前記ロードバッファーのｐＨは、約７．０～約７．５である。一実施形態においては、前記ロードバッファーのｐＨは、７．２～７．４である。
特定の実施形態においては、前記平衡化バッファーの導電率は、≦２．０ｍＳ／ｃｍである。
一実施形態においては、前記平衡化バッファーのｐＨは、約６．５～約７．５から選択される。
特定の実施形態においては、前記ロードバッファーのｐＨは、約７．０～約７．５である。一実施形態においては、前記ロードバッファーのｐＨは、７．２～７．３である。
一実施形態においては、前記ロードバッファーは、約４０ｍＭ～約６０ｍＭの濃度範囲を有する。特定の実施形態においては、前記ロードバッファーの濃度は、約５０ｍＭである。
一実施形態においては、前記ロードバッファーは、約１０ｍＭ～約３０ｍＭの濃度範囲を有する。特定の実施形態においては、前記ロードバッファーの濃度は、約２０ｍＭである。
一実施形態においては、前記ロードバッファーは、約１．５ｍＳ／ｃｍ～約３．５ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。特定の実施形態においては、前記ロードバッファーの導電率は、２．６ｍＳ／ｃｍ未満である。
一実施形態においては、前記ロードバッファーのｐＨは、約６．５～約７．５から選択される。
特定の実施形態においては、前記ロードバッファーのｐＨは、約７．０～約７．５である。一実施形態においては、前記ロードバッファーのｐＨは、７．２～７．３である。
特定の実施形態においては、前記ロードバッファーの導電率は、約≦３．０ｍＳ／ｃｍである。
一実施形態においては、前記ロードバッファーのｐＨは、約６．５～約７．５から選択される。
特定の実施形態においては、前記ロードバッファーのｐＨは、約７．０～約７．５である。一実施形態においては、前記ロードバッファーのｐＨは、７．２～７．３である。
一実施形態においては、本発明は、約２．５ＡＵ／ｃｍ上方値、及び約１．５ＡＵ／ｃｍ下方値で終了することから選択されるタンパク質ピーク回収基準を提供する。
一実施形態においては、本発明は、約１．５ＡＵ／ｃｍ上方値、及び約１．５ＡＵ／ｃｍ下方値で終了することから選択されるタンパク質ピーク回収基準を提供する。
一実施形態においては、本発明は、ピーク回収基準が約２．５ＡＵ／ｃｍ～約１．５ＡＵ／ｃｍから選択されるＡＥＸクロマトグラフィーから得られる目的の抗体と、約１０％～１２％の酸性バリアントとを含む抗体組成物を提供する。
別の実施形態においては、本発明は、約１．５ＡＵ／ｃｍ上方値、及び約１．５ＡＵ／ｃｍ下方値で終了することから選択されるタンパク質ピーク回収基準を提供する。
一実施形態においては、前記洗浄バッファーは、リン酸ナトリウム、トリス－ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、グリシン－ＮａＯＨ、及びトリス－アセテートから選択される。
一実施形態においては、前記洗浄バッファーは、約４０ｍＭ～約６０ｍＭの濃度範囲を有する。特定の実施形態においては、前記洗浄バッファーの濃度は、約５０ｍＭである。
別の実施形態においては、前記洗浄バッファーは、約１０ｍＭ～約３０ｍＭの濃度範囲を有する。特定の実施形態においては、前記洗浄バッファーの濃度は、約２０ｍＭである。
一実施形態においては、前記洗浄バッファーは、約１．５ｍＳ／ｃｍ～約３．５ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。好ましい実施形態においては、前記洗浄バッファーの導電率は、２．６ｍＳ／ｃｍ未満である。
特定の実施形態においては、前記洗浄バッファーの導電率は、≦２．０ｍＳ／ｃｍである。
一実施形態においては、前記洗浄バッファーのｐＨは、約６．５～約７．５から選択される。特定の実施形態においては、前記洗浄バッファーのｐＨは、約７．２である。
一実施形態においては、前記再生バッファーは、リン酸ナトリウム、トリス－ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、グリシン－ＮａＯＨ、及びトリス－アセテートから選択される。
一実施形態においては、前記再生バッファーは、約５ｍＭ～約３０ｍＭの濃度範囲を有する。特定の実施形態においては、前記再生バッファーの濃度は、約２０ｍＭである。
一実施形態においては、前記再生バッファーは、また、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化カルシウムから選択される塩も含む。特定の実施形態においては、前記再生バッファー中の塩は、塩化ナトリウムである。
一実施形態においては、前記再生バッファー中の前記塩は、約０．５Ｍ～約１．５Ｍの濃度範囲を有する。特定の実施形態においては、前記再生バッファー中の前記塩は、約１．０Ｍの濃度を有する。
一実施形態においては、前記再生バッファーは、約８０ｍＳ／ｃｍ～約９０ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。特定の実施形態においては、前記再生バッファーの導電率は、約８５ｍＳ／ｃｍである。
一実施形態においては、前記再生バッファーは、約９０ｍＳ／ｃｍ～約１１０ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。特定の実施形態においては、前記再生バッファーの導電率は、約１００ｍＳ／ｃｍである。
一実施形態においては、前記再生バッファーのｐＨは、約６．５～約７．５から選択される。好ましい実施形態においては、前記再生バッファーのｐＨは、約７．０である。
一実施形態においては、前記再生バッファーのｐＨは、約６．５～約７．５から選択される。好ましい実施形態においては、前記再生バッファーのｐＨは、約７．２である。
一実施形態においては、前記溶出は、フロースルーモードで行われる。
一実施形態においては、前記サニタイゼーションバッファーは、ＮａＯＨ、イソプロピルアルコール、ベンジルアルコールから選択される。特定の実施形態においては、前記サニタイゼーションバッファーは、ＮａＯＨである。
一実施形態においては、前記サニタイゼーションバッファーは、約３００ｍＭ～約１５００ｍＭの濃度範囲を有する。特定の実施形態においては、前記再生バッファーの濃度は、約５００ｍＭである。
一実施形態においては、前記ロードは、少なくとも約５ＣＶ以上で行われる。特定の実施形態においては、前記ロードは、約３０ＣＶで行われる。
一実施形態においては、前記平衡化は、少なくとも約３ＣＶ～約１０ＣＶで行われる。特定の実施形態においては、前記平衡化は、約５ＣＶで行われる。
一実施形態においては、前記平衡化は、前記平衡化バッファーの導電率のエンドポイントが達成されるまで行われる。
一実施形態においては、ロード時にカラムにロードされるタンパク質量は、約１５０ｇ／Ｌ未満、約１３０ｇ／Ｌ未満、約１２０ｇ／Ｌ未満、約１１０ｇ／Ｌ未満、約１００ｇ／Ｌ未満から選択される。
一実施形態においては、前記洗浄は、少なくとも約５ＣＶで行われる。
一実施形態においては、前記洗浄は、少なくとも約２ＣＶで行われる。
一実施形態においては、前記再生は、少なくとも２ＣＶ～約５ＣＶで行われる。特定の実施形態においては、前記再生は、約３ＣＶで行われる。
一実施形態においては、前記再生は、不純物の大部分を除去する。好ましい実施形態においては、前記再生は、ＨＭＷ、及び酸性チャージバリアントベースの不純物の大部分を除去する。
一実施形態においては、前記サニタイゼーションは、少なくとも２ＣＶ～約５ＣＶで行われる。特定の実施形態においては、前記サニタイゼーションは、約３ＣＶで行われる。
一実施形態においては、前記サニタイゼーションバッファーは、約１５分間～約６０分間、カラム内に保持される。特定の実施形態においては、前記サニタイゼーションバッファーは、約２０分間、カラム内に保持される。
一実施形態においては、ＡＥＸ精製時のカラム内のタンパク質の滞留時間は、約２分間～約６分間の範囲を有する。特定の実施形態においては、カラム内のタンパク質の滞留時間は、約４分間である。
セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）の条件：
一実施形態においては、セラミックハイドロキシアパタイトは、ＣＨＴ（セラミックハイドロキシアパタイト）－タイプ１及びＣＨＴ（セラミックハイドロキシアパタイト）ＸＴである。
一実施形態においては、セラミックハイドロキシアパタイトは、ＣＨＴ（セラミックハイドロキシアパタイト）－タイプ１及びＣＨＴ（セラミックハイドロキシアパタイト）ＸＴである。
一実施形態においては、バッファーＡとバッファーＢとを組み合わせて、前記ロードバッファー、洗浄バッファー、平衡化バッファー、及び溶出バッファーを調製する。
特定の実施形態においては、バッファーＡは、極性プロトン性分子である。特定の実施形態においては、前記極性プロトン分子は、水（Ｈ－ＯＨ）、酢酸（ＣＨ３ＣＯ－ＯＨ）、メタノール（ＣＨ３－ＯＨ）、エタノール（ＣＨ３ＣＨ２－ＯＨ）、ｎ－プロパノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２－ＯＨ）、ｎ－ブタノール（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－ＯＨ）から選択される。
好ましい実施形態においては、前記極性プロトン分子は、水である。
一実施形態においては、バッファーＢは、リン酸ナトリウム、トリス、ＨＥＰＥＳ、グリシン－ＮａＯＨから選択される。好ましい実施形態においては、前記バッファーＢは、リン酸ナトリウムである。
一実施形態においては、バッファーＢの濃度範囲は、約２０ｍＭ～約４０ｍＭである。特定の実施形態においては、バッファーＢの濃度は、約３２ｍＭである。
一実施形態においては、バッファーＢの濃度範囲は、約２０ｍＭ～約４０ｍＭである。特定の実施形態においては、バッファーＢの濃度は、約４０ｍＭである。
一実施形態においては、平衡化バッファーとロードバッファーの濃度範囲は、約２０ｍＭ～約４０ｍＭである。特定の実施形態においては、平衡化バッファーとロードバッファーの濃度は、約３２ｍＭである。
特定の実施形態においては、前記平衡化バッファー、ロードバッファー、及び洗浄バッファーの強度は同一である。一実施形態においては、溶出バッファーの強度は、ロードバッファーより高い。
一実施形態においては、前記平衡化バッファー及びロードバッファーは、約２０～約５０ｍＭの濃度範囲を有する。特定の実施形態においては、前記平衡化バッファーの濃度は、約４０ｍＭである。
一実施形態においては、前記平衡化バッファーは、約２０ｍＭ～５０ｍＭの濃度を有する。特定の実施形態においては、前記平衡化バッファーは、約３２ｍＭの濃度を有する。一実施形態においては、前記平衡化バッファー、又はロードバッファー、又は洗浄バッファー、又は溶出バッファーのｐＨは、約６．５～約７．５から選択される。
一実施形態においては、前記バッファーのｐＨは、約７．０±０．２である。
一実施形態においては、前記平衡化バッファーは、約３．０～約７．０ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。好ましい実施例においては、前記平衡化バッファーの導電率は、約６．０ｍＳ／ｃｍである。
一実施形態においては、前記平衡化バッファーのｐＨは、約６．５～約７．５から選択される。
一実施形態においては、前記平衡化バッファーのｐＨは、約７．０±０．２である。
一実施形態においては、バッファーＡの濃度がバッファーＢの濃度の少なくとも１０％である、少なくとも２種類のバッファーの組合せを使用することによって、前記平衡化をアイソクラティック勾配で行う。好ましい実施形態においては、バッファーＡの濃度は、バッファーＢの濃度の少なくとも８％である。
一実施形態においては、前記ロードバッファーは、約３０～約６０ｍＭの濃度範囲を有する。好ましい実施例においては、前記ロードバッファーは、約４０ｍＭである。
一実施形態においては、前記ロードバッファーは、約１０ｍＭ～４０ｍＭの濃度を有する。特定の実施形態においては、前記ロードバッファーは、約３２ｍＭの濃度を有する。
一実施形態においては、前記ロードバッファーは、約３．０～約７．０ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。好ましい実施例においては、前記ロードバッファーの導電率は、約６．０ｍＳ／ｃｍである。
一実施形態においては、前記ロードバッファーのｐＨは、約６．５～約７．５から選択される。
一実施形態においては、前記ロードバッファーのｐＨは、約７．０±０．２である。
一実施形態においては、バッファーＡの濃度がバッファーＢの濃度の少なくとも１０％である、少なくとも２種類のバッファーの組合せを使用することによって、前記ロードをアイソクラティック勾配で行う。好ましい実施形態においては、バッファーＡの濃度は、バッファーＢの少なくとも８％である。
一実施形態においては、前記洗浄バッファーは、約３０ｍＭ～約６０ｍＭの濃度範囲を有する。好ましい実施形態においては、前記洗浄バッファーの濃度は、約４０ｍＭである。
一実施形態においては、前記洗浄バッファーは、約１０ｍＭ～４０ｍＭの濃度を有する。特定の実施形態においては、前記洗浄バッファーは、約３２ｍＭの濃度を有する。
一実施形態においては、前記洗浄バッファーは、約３．０ｍＳ／ｃ～約７．０ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。好ましい実施例においては、前記洗浄バッファーの導電率は、約６．０ｍＳ／ｃｍである。
一実施形態においては、前記洗浄バッファーのｐＨは、約６．５～約７．５から選択される。
一実施形態においては、前記洗浄バッファーのｐＨは、約７．０±０．２である。
一実施形態においては、バッファーＡの濃度がバッファーＢの少なくとも１０％以下である、少なくとも２種類のバッファーの組合せを使用することによって、前記洗浄をアイソクラティック勾配で行う。好ましい実施形態においては、バッファーＡの濃度は、バッファーＢの濃度の少なくとも１０％である。
一実施形態においては、前記溶出バッファーは、約１０ｍＭ～約４００ｍＭの濃度範囲を有する。好ましい実施形態においては、前記溶出バッファーは、約３２ｍＭ～約１０４ｍＭの濃度範囲を有する。
一実施形態においては、前記溶出バッファーは、約１０ｍＭ～約４００ｍＭの濃度範囲を有する。好ましい実施形態においては、前記溶出バッファーは、約２４ｍＭ～約１００ｍＭの濃度範囲を有する。
一実施形態においては、前記溶出バッファーは、約１０ｍＭ～約４００ｍＭの濃度範囲を有する。好ましい実施形態においては、前記溶出バッファーは、約３２ｍＭ～約８８ｍＭの濃度範囲を有する。
一実施形態においては、前記溶出バッファーは、約１０ｍＭ～約４００ｍＭの濃度範囲を有する。好ましい実施形態においては、前記溶出バッファーは、約４０ｍＭ～約９６ｍＭの濃度範囲を有する。
一実施形態においては、前記溶出バッファーは、約６ｍＳ／ｃｍ～約１２ｍＳ／ｃｍの導電率範囲を有する。
一実施形態においては、前記溶出バッファーのｐＨは、約６．５～約７．５から選択される。一実施形態においては、前記溶出バッファーのｐＨは、約７．０±０．２である。
一実施形態においては、前記溶出は、線形勾配で行われる。特定の実施形態においては、前記溶出は、段差勾配で行われる。
一実施形態においては、バッファーＡの濃度がバッファーＢの濃度の少なくとも１０％である、少なくとも２種類のバッファーの組合せを使用することによって、前記溶出を線形勾配で行う。かかる実施形態においては、バッファーＡの濃度はバッファーＢの濃度の少なくとも１０％である。かかる実施形態においては、バッファーＢを約１０％から約２４％まで徐々に増加させ、それに応じて、バッファーＢの濃度を最適化する。
更に、当業者であれば、ランタイムと、除去すべき具体的な不純物に関して勾配が僅かに変化することを理解するであろう。
かかる実施形態においては、１５％のバッファーＢで、アイソクラティック勾配にて溶出を行う。かかる実施形態においては、２０％のバッファーＢで、アイソクラティック勾配にて溶出を行う。かかる実施形態においては、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％のバッファーＢで、アイソクラティック勾配にて溶出を行う。
別の実施形態においては、バッファーＡの濃度がバッファーＢの濃度の少なくとも８％である、少なくとも２種類のバッファーの組合せを使用することによって、前記溶出を線形勾配で行う。かかる実施形態においては、バッファーＡの濃度は、バッファーＢの％濃度の少なくとも８である。かかる実施形態においては、バッファーＢを約８％から約２２％まで徐々に増加させ、それに応じて、バッファーＢの濃度を最適化する。
一実施形態においては、ＬＭＷを最低限にするために、前記溶出ピークの回収は、約１．５ＡＵ／ｃｍ上方値で開始し、約２．０ＡＵ／ｃｍ下方値で終了する。
一実施形態においては、ＬＭＷを最低限にするために、前記溶出ピークの回収は、約１．０ＡＵ／ｃｍ上方値で開始し、約１．５ＡＵ／ｃｍ下方値で終了する。
特定の実施形態においては、前記ＣＨＴは、結合及び溶出モードで行われる。
特定の実施形態においては、前記ＣＨＴは、塩化カルシウムを含まないバッファー又は溶媒で行われる。
特定の実施形態においては、前記溶出バッファーの濃度は、洗浄バッファーより高い。
一実施形態においては、前記溶出バッファーは、４００ｍＭの塩バッファーの濃度の少なくとも８％を含む。一実施形態においては、前記溶出バッファーは、４００ｍＭの塩バッファーの濃度の少なくとも１０％を含む。一実施形態においては、前記溶出バッファーは、４００ｍＭの塩バッファーの濃度の少なくとも１５％を含む。一実施形態においては、前記溶出バッファーは、４００ｍＭの塩バッファーの濃度の少なくとも２０％を含む。一実施形態においては、前記溶出バッファーは、４００ｍＭの塩バッファーの濃度の少なくとも２６％を含む。
一実施形態においては、前記溶出は、約５ＣＶ～約１０ＣＶで行われる。
一実施形態においては、前記溶出は、約１０ＣＶ～約１５ＣＶで行われる。
一実施形態においては、前記溶出は、約１５～約２０ＣＶ以上で行われる。好ましい実施形態においては、前記溶出は、約１９ＣＶで行われる。
一実施形態においては、前記平衡化は、約３～約１０ＣＶで行われる。好ましい実施形態においては、前記平衡化は、約５ＣＶで行われる。
一実施形態においては、前記平衡化は、前記平衡化バッファーの導電率のエンドポイントが達成されるまで行われる。
一実施形態においては、ロード時にカラムにロードされるタンパク質量は、約５ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌの範囲である。一実施形態においては、ロード時にカラムにロードされるタンパク質量は、１２．５ｇ／Ｌである。
一実施形態においては、前記洗浄は、約２ＣＶ～約５ＣＶで行われる。好ましい実施形態においては、前記洗浄は、約３ＣＶで行われる。一実施形態においては、前記洗浄は、前記バッファーの導電率のエンドポイントが達成されるまで行われる。
一実施形態においては、平衡化、洗浄、及びロード中のＣＨＴカラムにおけるタンパク質の滞留時間は、約２分間～約６分間の範囲である。好ましい実施形態においては、平衡化、洗浄、及びロード中のカラム内のタンパク質の滞留時間は、約４分間である。
一実施形態においては、溶出中のカラム内のタンパク質の滞留時間は、約２分間～約６分間の範囲である。好ましい実施形態においては、溶出中のカラムにおけるタンパク質の滞留時間は、約４分間である。
本発明は、例示のみを目的として以下に実施例を提供するが、本発明は、以下の実施例に限定されると解釈されるべきではない。
実施例１－アフィニティーカラムと、それに続くアニオン交換カラムを行うことによる、モノクローナル抗体の精製：
クロマトグラフィープロセスはいずれも、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ １５０システムを用いて行った。タンパク質試料の濃度は、島津分光光度計を用いて、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ樹脂メディアを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。Ｖａｎｔａｇｅカラム及びＣ１０／２０カラムは、それぞれ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。濁度測定は、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手したものを用いて測定した。化学薬品はいずれも、ＪＴＢ又はＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手し、ＧＭＰグレードであった。
クロマトグラフィープロセスはいずれも、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ １５０システムを用いて行った。タンパク質試料の濃度は、島津分光光度計を用いて、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ樹脂メディアを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。Ｖａｎｔａｇｅカラム及びＣ１０／２０カラムは、それぞれ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。濁度測定は、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手したものを用いて測定した。化学薬品はいずれも、ＪＴＢ又はＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手し、ＧＭＰグレードであった。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株に発現するＩｇＥ分子に結合できるモノクローナル抗体分子を、ＶＬ１１／２５０又はＣ１０／２０カラムに充填したプロテインＡ（Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて捕捉する。滞留時間は、全ての段階において４分間である。トリスアセテート＋１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８～７．２で平衡化した後、清澄化ハーベストを、樹脂≦４５ｍｇ／ｍＬでロードする。ロード後、表１に記載するように、カラムを平衡化バッファー（洗浄１）で洗浄し、その後、洗浄２及び洗浄３バッファーで洗浄する。アフィニティークロマトグラフィー工程は、結合及び溶出モードで行い、ピークの５０ｍＡＵ（０．２５ＡＵ／ｃｍ）上方から５０ｍＡＵ（０．２５ＡＵ／ｃｍ）下方まで回収を行う。プロテインＡアウトプットを、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＣＥＸ－ＨＰＬＣを用い、サイズ及びチャージバリアントについて分析する。プロテインＡ工程の実験デザインを、表１にまとめる。
表１：プロテインＡの実験デザイン
表１：プロテインＡの実験デザイン
溶出したタンパク質を、更に、ウイルス不活化と中和に付す。中和後、タンパク質を、０．２μｍフィルターでろ過する。
ウイルス不活化及び中和工程の後、溶出したタンパク質混合物を、Ｃ１０／２０カラムに充填したアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、更に精製する。
滞留時間は、全ての段階において４分間である。トリスアセテート、ｐＨ７．０～７．３で平衡化した後、中和プロテインＡアウトプットを、樹脂に対して≦１００ｍｇ／ｍＬでロードする。前記ロード物は、ＡＥＸカラム導入前に、（ｍＳ／ｃｍ）導電率の仕様、即ち、≦３．０ｍＳ／ｃｍを満たすように水で希釈する。
ＡＥＸ工程は、フロースルー（ネガティブ）モードで行い、ピークの５００ｍＡＵ上方から３００ｍＡＵ下方まで回収を行う。カラムは、トリスアセテート、ｐＨ７．０～７．３を用いて洗浄する。ＡＥＸアウトプットは、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＣＥＸ－ＨＰＬＣを用い、サイズ及びチャージバリアントについて分析する。ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ工程の実験デザインを、表２にまとめる。
表２：ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱの実験デザイン（ＡＥＸ）
表３：ＳＥ（サイズ排除）－ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー分析）
表２：ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱの実験デザイン（ＡＥＸ）
表３は、ＳＥ－ＨＰＬＣで決定される、メインピークの９９％の純度及びＨＭＷの９８％の低減を示す。
表４は、メインピークを酸性バリアントと比較する、カチオン交換－高速液体クロマトグラフィーの結果を示す。
表４は、ＣＥＸ－ＨＰＬＣで決定される、メインピークの７４％の純度及び酸性バリアントの約５５％の低減を示す。
実施例２－アフィニティークロマトグラフィー後のＡＥＸクロマトグラフィーと、それに続くＣＨＴタイプ１樹脂を行うことによる、モノクローナル抗体の精製：
クロマトグラフィープロセスはいずれも、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ １５０システムを用いて行った。タンパク質試料の濃度は、島津分光光度計を用いて、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。ＣＨＴタイプ１樹脂メディアを、Ｂｉｏ－ｒａｄから入手した。Ｖａｎｔａｇｅカラム及びＣ１０／２０カラムは、それぞれ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。濁度測定は、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手したものを用いて測定した。化学薬品はいずれも、ＪＴＢ又はＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手し、ＧＭＰグレードであった。
クロマトグラフィープロセスはいずれも、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ １５０システムを用いて行った。タンパク質試料の濃度は、島津分光光度計を用いて、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。ＣＨＴタイプ１樹脂メディアを、Ｂｉｏ－ｒａｄから入手した。Ｖａｎｔａｇｅカラム及びＣ１０／２０カラムは、それぞれ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。濁度測定は、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手したものを用いて測定した。化学薬品はいずれも、ＪＴＢ又はＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手し、ＧＭＰグレードであった。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株に発現するＩｇＥ分子に結合できるモノクローナル抗体分子を、ＶＬ１１／２５０カラムに充填したプロテインＡ（Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて捕捉する。溶出したタンパク質を、更に、ウイルス不活化と中和に付す。中和後、タンパク質を、０．２μｍフィルターでろ過する。
ウイルス不活化及び中和工程の後、タンパク質混合物を、Ｃ１０／２０カラムに充填したアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、更に精製する。
アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）から溶出したタンパク質は、ＶＬ１１／２５０カラムに充填された混合モード樹脂（ＣＨＴタイプＩ、Ｂｉｏ－ｒａｄ）を使用して、更にポリッシュする。滞留時間は、全ての段階において４分間／３分間である。リン酸ナトリウム、ｐＨ６．８で平衡化した後、アニオン交換（ＡＥＸ）アウトプットを、樹脂に対して１２．５ｍｇ／ｍＬでロードする。カラムは、３ＣＶの、リン酸ナトリウム、ｐＨ６．８を使用して洗浄する。結合した目的タンパク質は、３２ｍＭリン酸ナトリウム～４００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８の線形勾配を用いて溶出する。目的の溶出ピークは、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＣＥＸ－ＨＰＬＣを用い、サイズ及びチャージバリアントについて分析する。ＣＨＴタイプＩ工程の実験デザインとプロセスを、表５にまとめる。
表５：ＣＨＴタイプＩの実験デザイン
表５：ＣＨＴタイプＩの実験デザイン
実施例３－アフィニティークロマトグラフィー後のＡＥＸクロマトグラフィーと、それに続くＣＨＴ ＸＴ樹脂を行うことによる、モノクローナル抗体の精製：
クロマトグラフィープロセスはいずれも、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ １５０システムを用いて行った。タンパク質試料の濃度は、島津分光光度計を用いて、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。ＣＨＴ ＸＴ樹脂メディアを、Ｂｉｏ－ｒａｄから入手した。Ｖａｎｔａｇｅカラム及びＣ１０／２０カラムは、それぞれ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。濁度測定は、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手したものを用いて測定した。化学薬品はいずれも、ＪＴＢ又はＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手し、ＧＭＰグレードであった。
クロマトグラフィープロセスはいずれも、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ １５０システムを用いて行った。タンパク質試料の濃度は、島津分光光度計を用いて、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。ＣＨＴ ＸＴ樹脂メディアを、Ｂｉｏ－ｒａｄから入手した。Ｖａｎｔａｇｅカラム及びＣ１０／２０カラムは、それぞれ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。濁度測定は、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手したものを用いて測定した。化学薬品はいずれも、ＪＴＢ又はＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手し、ＧＭＰグレードであった。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株に発現するＩｇＥに結合できるモノクローナル抗体を、ＶＬ１１／２５０カラムに充填したプロテインＡ（Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ、ＧＥヘルスケア）を用いて捕捉する。
溶出したタンパク質を、更に、ウイルス不活化と中和に付す。中和後、タンパク質を、０．２μｍフィルターでろ過する。
ウイルス不活化及び中和工程の後、溶出したタンパク質混合物を、Ｃ１０／２０カラムに充填したアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、更に精製する。
アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）から溶出したタンパク質は、ＶＬ１１／２５０カラムに充填された混合モード樹脂（ＣＨＴ ＸＴ、Ｂｉｏ－ｒａｄ）を使用して、更にポリッシュする。滞留時間は、全ての段階において４分間／３分間である。リン酸ナトリウム、ｐＨ６．８で平衡化した後、アニオン交換（ＡＥＸ）アウトプットを、樹脂に対して１２．５ｍｇ／ｍＬでロードする。カラムは、３ＣＶの、リン酸ナトリウム、ｐＨ６．８を使用して洗浄する。結合した目的タンパク質は、４０ｍＭリン酸ナトリウム～４００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８の線形勾配を用いて溶出する。目的の溶出ピークは、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＣＥＸ－ＨＰＬＣを用い、サイズ及びチャージバリアントについて分析する。ＣＨＴ ＸＴ工程の実験デザインとプロセスを、表６～９にまとめる。
表６：ＣＨＴ ＸＴの実験デザイン
表７：ＣＨＴタイプＩ／ＸＴカラムの溶出液のＳＥ－ＨＰＬＣ分析
ＳＥ－ＨＰＬＣによるデータから、ＣＨＴから得られた組成物は、大幅に低減された（約１００％）ＬＭＷを有し、タンパク質の純度が９９．９９％であることが明らかである。
表８：サイズ関連バリアント：ＣＥ－ＳＤＳ
データから、ＣＨＴから得られた組成物は、大幅に低減された（約８１％）ＬＭＷを有することが明らかである。
表９：電荷関連バリアント：ＣＥＸ－ＨＰＬＣ
表６：ＣＨＴ ＸＴの実験デザイン
表８：サイズ関連バリアント：ＣＥ－ＳＤＳ
表９：電荷関連バリアント：ＣＥＸ－ＨＰＬＣ
表９は、ＣＥＸ－ＨＰＬＣで決定される、メインピークの８４％の純度及びＬＭＷの約５６％の低減を示す。
実施例４－アフィニティーカラムと、それに続くアニオン交換カラムを行うことによる、モノクローナル抗体の精製（５０Ｌスケール）
クロマトグラフィープロセスはいずれも、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡ Ｐｉｌｏｔ又はＡＫＴＡ Ｐｒｏｃｅｓｓを用いて行った。タンパク質試料の濃度は、分光光度計を用いて、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ樹脂メディアを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。クロマトグラフィー１００／２５０カラムは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、又はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、又はＲｅｐｌｉｇｅｎから入手した。製造プロセスで使用した化学薬品はいずれも、ＧＭＰグレードであった。
クロマトグラフィープロセスはいずれも、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡ Ｐｉｌｏｔ又はＡＫＴＡ Ｐｒｏｃｅｓｓを用いて行った。タンパク質試料の濃度は、分光光度計を用いて、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ樹脂メディアを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。クロマトグラフィー１００／２５０カラムは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、又はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、又はＲｅｐｌｉｇｅｎから入手した。製造プロセスで使用した化学薬品はいずれも、ＧＭＰグレードであった。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株に発現するＩｇＥ分子に結合できるモノクローナル抗体分子を、クロマトグラフィー１００／２５０カラムに充填したプロテインＡ（Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて捕捉する。滞留時間は、全ての段階において４分間である。トリスＨＣｌ＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８～７．２で平衡化した後、清澄化ハーベストを、樹脂に対して≦４５ｍｇ／ｍＬでロードする。ロード後、表１０に記載するように、カラムを平衡化バッファー（洗浄１）で洗浄し、その後、洗浄２及び洗浄３バッファーで洗浄する。アフィニティークロマトグラフィー工程は、結合及び溶出モードで行い、ピークの０．２５ＡＵ／ｃｍ上方から０．２５ＡＵ／ｃｍ下方まで回収を行う。プロテインＡアウトプットを、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＣＥＸ－ＨＰＬＣを用い、サイズ及びチャージバリアントについて分析する。プロテインＡ工程の実験デザインを、表１０にまとめる。
表１０：プロテインＡの実験デザイン
表１０：プロテインＡの実験デザイン
溶出したタンパク質を、クロマトグラフィー１００／２５０カラムに充填したアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（Ｐｏｒｏｓ ５０ ＨＱ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、更に精製する。滞留時間は、全ての段階において４分間である。トリスＨＣｌ、ｐＨ７．１～７．３で平衡化した後、中和プロテインＡアウトプットを、樹脂に対して７０～１４５ｍｇ／ｍＬでロードする。前記ロード物は、ＡＥＸカラム導入前に、（ｍＳ／ｃｍ）導電率の仕様、即ち、≦２．０ｍＳ／ｃｍを満たすように水で希釈する。
ＡＥＸ工程は、フロースルー（ネガティブ）モードで行い、ピークの２．０ＡＵ／ｃｍ上方から２．５ＡＵ／ｃｍ下方まで回収を行う。カラムは、トリスＨＣｌ、ｐＨ７．１～７．３を用いて洗浄する。ＡＥＸアウトプットは、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＣＥＸ－ＨＰＬＣを用い、サイズ及びチャージバリアントについて分析する。ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ工程の実験デザインを、表１１にまとめる。
表１１：ＡＥＸの実験デザイン
表１２：ＳＥ（サイズ排除）－ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー分析）
表１１：ＡＥＸの実験デザイン
表１２は、ＳＥ－ＨＰＬＣで決定される、メインピークの９９％の純度及びＨＭＷの９６％の低減を示す。
表１３：メインピークを酸性バリアントと比較する、カチオン交換－高速液体クロマトグラフィーの結果を示す。
表１３：メインピークを酸性バリアントと比較する、カチオン交換－高速液体クロマトグラフィーの結果を示す。
表１３は、ＣＥＸ－ＨＰＬＣで決定される、メインピークの６７％の純度及び酸性バリアントの約２５％の低減を示す。
実施例５－アフィニティークロマトグラフィー後のＡＥＸクロマトグラフィーと、それに続くＣＨＴ ＸＴ樹脂を行うことによる、モノクローナル抗体の精製：
クロマトグラフィープロセスはいずれも、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡ Ｐｉｌｏｔ又はＡＫＴＡ Ｐｒｏｃｅｓｓシステムを用いて行った。タンパク質試料の濃度は、分光光度計を用いて、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。ＣＨＴ ＸＴ樹脂メディアを、Ｂｉｏ－ｒａｄから入手した。クロマトグラフィー１００／２５０カラムは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、又はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、又はＲｅｐｌｉｇｅｎから入手した。製造プロセスで使用した化学薬品はいずれも、ＧＭＰグレードであった。
クロマトグラフィープロセスはいずれも、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡ Ｐｉｌｏｔ又はＡＫＴＡ Ｐｒｏｃｅｓｓシステムを用いて行った。タンパク質試料の濃度は、分光光度計を用いて、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。ＣＨＴ ＸＴ樹脂メディアを、Ｂｉｏ－ｒａｄから入手した。クロマトグラフィー１００／２５０カラムは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、又はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、又はＲｅｐｌｉｇｅｎから入手した。製造プロセスで使用した化学薬品はいずれも、ＧＭＰグレードであった。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株に発現するＩｇＥに結合できるモノクローナル抗体を、クロマトグラフィー１００／２５０カラムに充填したプロテインＡ（Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて捕捉する。溶出したタンパク質を、更に、ウイルス不活化と中和に付し、次いで、深層ろ過を行う。深層ろ過後、タンパク質を、０．２μｍフィルターでろ過する。
深層ろ過工程後、タンパク質混合物を、クロマトグラフィー１００／２５０カラムに充填したアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、更に精製する。
アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）から溶出したタンパク質は、クロマトグラフィー１００／２５０カラムに充填された混合モード樹脂（ＣＨＴ ＸＴ、Ｂｉｏ－ｒａｄ）を使用して、更にポリッシュする。滞留時間は、全ての段階において４分間／５分間である。リン酸ナトリウム、ｐＨ６．８で平衡化した後、アニオン交換（ＡＥＸ）アウトプットを、樹脂に対して１２．５ｍｇ／ｍＬでロードする。カラムは、３ＣＶの、リン酸ナトリウム、ｐＨ６．８を使用して洗浄する。結合した目的タンパク質は、４０ｍＭリン酸ナトリウム～４００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８の線形勾配を用いて溶出する。目的の溶出ピークは、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＣＥＸ－ＨＰＬＣを用い、サイズ及びチャージバリアントについて分析する。ＣＨＴ ＸＴ工程の実験デザインとプロセスを、表１４～１７にまとめる。
表１４：ＣＨＴ ＸＴの実験デザイン
表１５：ＬＭＷのＳＥ ＨＰＬＣ分析
表１６：ＣＥＸ ＨＰＬＣ－ＢＶ分析
表１７：ＣＥ－ＳＤＳによるＬＭＷの分析
結果：表は、ＬＭＷが、合計４０％低減したことを示す。
表１４：ＣＨＴ ＸＴの実験デザイン
実施例６－アフィニティーカラムと、それに続くアニオン交換カラムを行うことによる、モノクローナル抗体の精製（２００Ｌスケール）
クロマトグラフィープロセスはいずれも、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡ Ｐｉｌｏｔ又はＡＫＴＡ Ｐｒｏｃｅｓｓを用いて行った。タンパク質試料の濃度は、分光光度計を用いて、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ樹脂メディアを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。クロマトグラフィー２５０／２５０カラムは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、又はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、又はＲｅｐｌｉｇｅｎから入手した。製造プロセスで使用した化学薬品はいずれも、ＧＭＰグレードであった。
クロマトグラフィープロセスはいずれも、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡ Ｐｉｌｏｔ又はＡＫＴＡ Ｐｒｏｃｅｓｓを用いて行った。タンパク質試料の濃度は、分光光度計を用いて、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ樹脂メディアを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手した。クロマトグラフィー２５０／２５０カラムは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、又はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、又はＲｅｐｌｉｇｅｎから入手した。製造プロセスで使用した化学薬品はいずれも、ＧＭＰグレードであった。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株に発現するＩｇＥ分子に結合できるモノクローナル抗体分子を、クロマトグラフィー２５０／２５０カラムに充填したプロテインＡ（Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて捕捉する。滞留時間は、全ての段階において４分間である。トリスＨＣｌ＋１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８～７．２で平衡化した後、清澄化ハーベストを、樹脂に対して≦４５ｍｇ／ｍＬでロードする。ロード後、表１８に記載するように、カラムを平衡化バッファー（洗浄１）で洗浄し、その後、洗浄２及び洗浄３バッファーで洗浄する。アフィニティークロマトグラフィー工程は、結合及び溶出モードで行い、ピークの０．２５ＡＵ／ｃｍ上方から０．２５ＡＵ／ｃｍ下方まで回収を行う。プロテインＡアウトプットを、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＣＥＸ－ＨＰＬＣを用い、サイズ及びチャージバリアントについて分析する。プロテインＡ工程の実験デザインを、表１８にまとめる。
表１８：プロテインＡの実験デザイン
表１８：プロテインＡの実験デザイン
溶出したタンパク質を、クロマトグラフィー３５０／２５０又は２００／３５０カラムに充填したアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、更に精製する。滞留時間は、全ての段階において４分間である。トリスＨＣｌ、ｐＨ７．１～７．３で平衡化した後、中和プロテインＡアウトプットを、樹脂に対して７０～１４５ｍｇ／ｍＬでロードする。前記ロード物は、ＡＥＸカラム導入前に、（ｍＳ／ｃｍ）導電率の仕様、即ち、≦２．０ｍＳ／ｃｍを満たすように水で希釈する。
ＡＥＸ工程は、フロースルー（ネガティブ）モードで行い、ピークの２．０ＡＵ／ｃｍ上方から２．５ＡＵ／ｃｍ下方まで回収を行う。カラムは、トリスＨＣｌ、ｐＨ７．１～７．３を用いて洗浄する。ＡＥＸアウトプットは、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＣＥＸ－ＨＰＬＣを用い、サイズ及びチャージバリアントについて分析する。ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱ工程の実験デザインを、表１９にまとめる。
表１９：ＡＥＸの実験デザイン
表２０：ＳＥ（サイズ排除）－ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー分析）
表１９：ＡＥＸの実験デザイン
表２０は、ＳＥ－ＨＰＬＣで決定される、メインピークの９９％の純度及びＨＭＷの９１％の低減を示す。
表２１：メインピークを酸性バリアントと比較する、カチオン交換－高速液体クロマトグラフィーの結果を示す。
表２１：メインピークを酸性バリアントと比較する、カチオン交換－高速液体クロマトグラフィーの結果を示す。
表２１は、ＣＥＸ－ＨＰＬＣで決定される、メインピークの７４％の純度及び酸性バリアントの約４６％の低減を示す。
実施例７－アフィニティークロマトグラフィー後のＡＥＸクロマトグラフィーと、それに続くＣＨＴ ＸＴ樹脂を行うことによる、モノクローナル抗体の精製（２００Ｌスケールの場合）：
クロマトグラフィープロセスはいずれも、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡ Ｐｉｌｏｔ又はＡＫＴＡ Ｐｒｏｃｅｓｓシステムを用いて行った。タンパク質試料の濃度は、分光光度計を用いて、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。ＣＨＴ ＸＴ樹脂メディアを、Ｂｉｏ－ｒａｄから入手した。クロマトグラフィー３００／２５０カラムは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、又はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、又はＲｅｐｌｉｇｅｎから入手した。製造プロセスで使用した化学薬品はいずれも、ＧＭＰグレードであった。
クロマトグラフィープロセスはいずれも、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡ Ｐｉｌｏｔ又はＡＫＴＡ Ｐｒｏｃｅｓｓシステムを用いて行った。タンパク質試料の濃度は、分光光度計を用いて、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。ＣＨＴ ＸＴ樹脂メディアを、Ｂｉｏ－ｒａｄから入手した。クロマトグラフィー３００／２５０カラムは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、又はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、又はＲｅｐｌｉｇｅｎから入手した。製造プロセスで使用した化学薬品はいずれも、ＧＭＰグレードであった。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株に発現するＩｇＥに結合できるモノクローナル抗体を、クロマトグラフィー２５０／２５０カラムに充填したプロテインＡ（Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ ＬＸ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて捕捉する。溶出したタンパク質を、更に、ウイルス不活化と中和に付し、次いで、深層ろ過を行う。深層ろ過後、タンパク質を、０．２μｍフィルターでろ過する。
深層ろ過工程後、タンパク質混合物を、クロマトグラフィー３５０／２５０又は２００／２５０カラムに充填したアニオン交換クロマトグラフィー樹脂（Ｐｏｒｏｓ ＨＱ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、更に精製する。
アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）から溶出したタンパク質は、クロマトグラフィー３００／２５０カラムに充填された混合モード樹脂（ＣＨＴ ＸＴ、Ｂｉｏ－ｒａｄ）を使用して、更にポリッシュする。滞留時間は、全ての段階において４分間／５分間である。リン酸ナトリウム、ｐＨ６．８で平衡化した後、アニオン交換（ＡＥＸ）アウトプットを、樹脂に対して最大１２．５ｍｇ／ｍＬでロードする。カラムは、３ＣＶの、リン酸ナトリウム、ｐＨ６．８を使用して洗浄する。結合した目的タンパク質は、４０ｍＭリン酸ナトリウム～４００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８の線形勾配を用いて溶出する。目的の溶出ピークは、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＣＥＸ－ＨＰＬＣを用い、サイズ及びチャージバリアントについて分析する。ＣＨＴ ＸＴ工程の実験デザインとプロセスを、表２２～２４にまとめる。
表２２：ＣＨＴ ＸＴの実験デザイン
表２３：ＬＭＷのＳＥ ＨＰＬＣ分析
表２４：ＣＥＸ ＨＰＬＣ－ＢＶ分析
表２２：ＣＨＴ ＸＴの実験デザイン
Claims (48)
- 目的のタンパク質と、１以上の低分子量（ＬＭＷ）バリアントとを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、ＬＭＷが０．４％未満であることを特徴とするプロセス。 - 目的のタンパク質と、１以上の低分子量（ＬＭＷ）バリアントと、１以上の塩基性バリアント（ＢＶ）とを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、前記塩基性バリアントが１５％未満であることを特徴とするプロセス。 - 前記精製された前記目的のタンパク質が、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって測定したときに、少なくとも９７％低減されたＬＭＷを含む、請求項１又は請求項２に記載のプロセス。
- 前記精製された前記目的のタンパク質が、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって測定したときに、少なくとも９５％低減されたＬＭＷを含む、請求項１又は請求項２に記載のプロセス。
- 前記ＣＨＴカラムから溶出された前記タンパク質混合物が、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、約０．３％以下のＬＭＷ、０．２％以下のＬＭＷ、０．１％以下のＬＭＷから選択されるＬＭＷを含む、請求項１又は請求項２に記載のプロセス。
- 前記ＣＨＴカラムから溶出された前記タンパク質混合物が、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、０．４％未満のＬＭＷを含む、請求項１又は請求項２に記載のプロセス。
- 前記ＬＭＷが、ＬＣ、ＨＣ、ＨＨ、及び２Ｈ１Ｌから選択される、請求項１又は請求項２に記載のプロセス。
- 前記２Ｈ１Ｌの量が、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、約３％以下、２．６％以下、２．５％以下、２．３％以下、２％以下、１．７％以下、１．５％以下、１．４％以下から選択される、請求項７に記載のプロセス。
- 前記ＨＨの量が、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、約０．２％以下、０．２４％以下、０．２１％以下、０．１５％以下、０．１２％以下、０．０９％以下、又は０．０８％以下、０．０６％以下、又は０．０４％以下、及び０．０３％以下から選択される、請求項７に記載のプロセス。
- 前記ＨＣの量が、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、約０．４％以下、０．１６％以下、０．１５％以下、０．１２％以下、及び０．１８％以下から選択される、請求項７に記載のプロセス。
- 前記ＬＣの量が、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、約０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、及び０．２以下から選択される、請求項７に記載のプロセス。
- 前記ＬＣ、ＨＣ、ＨＨ、及び２Ｈ１Ｌが、ＣＥ－ＳＤＳによって測定したときに、約２．２％～約２．６％の量で存在する、請求項７に記載のプロセス。
- 目的のタンパク質と、１以上の塩基性バリアント（ＢＶ）とを含むタンパク質混合物から前記目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムに、適切なバッファーでロードすることと；
ｂ．前記ＣＨＴカラムを、適切なバッファーで洗浄することと；
ｃ．精製された前記目的のタンパク質を、適切な勾配のリン酸バッファーで溶出することと、
を含み、
前記精製された前記目的のタンパク質が実質的に純粋であり、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、前記塩基性バリアントが１５％未満であることを特徴とするプロセス。 - 前記ＣＨＴカラムから溶出された前記タンパク質混合物が、約１４％以下のＢＶ、１３％以下のＢＶ、１２％以下のＢＶ、１１％以下のＢＶ、１０％以下のＢＶ、９％以下のＢＶ、８％以下のＢＶ、７％以下のＢＶ、６％以下のＢＶ、５％以下のＢＶ、４％以下のＢＶ、３％以下のＢＶ、２％以下のＢＶ、１％以下のＢＶから選択される低いＢＶを含む、請求項２又は請求項１３に記載のプロセス。
- 前記ＣＨＴカラムから溶出された前記タンパク質混合物が、１０％未満のＢＶを含む、請求項１４に記載のプロセス。
- 前記ＣＨＴカラムから溶出された前記タンパク質混合物が、５％のＢＶを含む、請求項１４に記載のプロセス。
- 溶出リン酸塩勾配が、リン酸塩の濃度を、約２４ｍＭから１０４ｍＭまで徐々に増加させる線形勾配である、請求項１、請求項２、又は請求項１３に記載のプロセス。
- 前記リン酸塩の濃度を、約４０ｍＭから９６ｍＭまで徐々に増加させる、請求項１７に記載のプロセス。
- 前記リン酸塩の濃度を、約３２ｍＭから８８ｍＭまで徐々に増加させる、請求項１７に記載のプロセス。
- 前記溶出リン酸塩勾配が、前記リン酸塩の濃度が、バッファーＢを約５％から２５％まで徐々に増加させる線形勾配である、請求項１７に記載のプロセス。
- 前記溶出リン酸塩勾配が、前記リン酸塩の濃度が、バッファーＢを約１０％から２４％まで徐々に増加させる線形勾配である、請求項２０に記載のプロセス。
- 前記リン酸塩の濃度が、バッファーＢを約８％から２２％まで徐々に増加させる、請求項２１に記載のプロセス。
- 勾配溶出が、１９ＣＶで行われる、請求項１、請求項２、又は請求項１３に記載のプロセス。
- 前記溶出が、約１．０ＡＵ／ｃｍ上方値で開始し、約１．５ＡＵ／ｃｍ下方値で終了する、請求項１、請求項２、又は請求項１３に記載のプロセス。
- 前記ＣＨＴカラムが、ロードバッファーによる処理の前に、平衡化バッファーで処理される、請求項１、請求項２、又は請求項１３に記載のプロセス。
- 前記ロード及び洗浄バッファーが、同一の導電率及びｐＨを有する、請求項１、請求項２、又は請求項１３に記載のプロセス。
- 前記ロード、洗浄、及び溶出バッファーが、ｐＨ７．０±０．２を有する、請求項１、請求項２、又は請求項１３に記載のプロセス。
- 前記ロード、洗浄、及び溶出バッファーは、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、及びグリシンから選択される添加剤を含まない、請求項１、請求項２、又は請求項１３に記載のプロセス。
- 前記ＣＨＴカラムが、プロテインＡクロマトグラフィーの後に行われる、請求項１、請求項２、又は請求項１３に記載のプロセス。
- 前記ＣＨＴカラムが、アニオン交換クロマトグラフィーの後に行われる、請求項１、請求項２、又は請求項１３に記載のプロセス。
- タンパク質混合物から目的のタンパク質を精製するプロセスであって、
ａ．前記目的のタンパク質と、酸性バリアント、塩基性バリアント、低分子量（ＬＭＷ）、高分子量（ＨＭＷ）から選択される少なくとも１つの不純物とを含む哺乳動物発現系からタンパク質混合物を得ることと；
ｂ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィーカラムにアプライすることと；
ｃ．前記タンパク質混合物を、アフィニティークロマトグラフィーカラムから溶出することと；
ｄ．工程で得られた前記タンパク質混合物のウイルス不活化を行うことと；
ｅ．工程（ｄ）で得られた前記タンパク質混合物を、アニオン交換クロマトグラフィーにアプライすることと；
ｆ．前記タンパク質混合物を、フロースルーモードで溶出することと；
ｇ．工程（ｆ）で得られた前記タンパク質混合物を、セラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムにアプライすることと；
ｈ．任意に、前記ＣＨＴカラムを、適切な洗浄バッファーで洗浄することと；
ｉ．前記タンパク質混合物を、適切なバッファーで前記ＣＨＴカラムから溶出することと、
を含み、
溶出された前記タンパク質混合物が、前記目的のタンパク質で濃縮されており、酸性バリアント、塩基性バリアント、低分子量（ＬＭＷ）、及び高分子量（ＨＭＷ）から選択される不純物が実質的に低減されていることを特徴とするプロセス。 - 前記ＣＨＴカラムから溶出された前記タンパク質混合物が、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、約０．３％以下のＬＭＷ、０．２％以下のＬＭＷ、０．１％以下のＬＭＷから選択されるＬＭＷを含む、請求項３１に記載のプロセス。
- 前記ＣＨＴカラムから溶出された前記タンパク質混合物が、ＳＥ－ＨＰＬＣ分析によって分析したときに、０．４％未満のＬＭＷを含む、請求項３２に記載のプロセス。
- 前記ＣＨＴカラムから溶出された前記タンパク質混合物が、約１４％以下のＢＶ、１３％以下のＢＶ、１２％以下のＢＶ、１１％以下のＢＶ、１０％以下のＢＶ、９％以下のＢＶ、８％以下のＢＶ、７％以下のＢＶ、６％以下のＢＶ、５％以下のＢＶ、４％以下のＢＶ、３％以下のＢＶ、２％以下のＢＶ、１％以下のＢＶから選択される低いＢＶを含む、請求項３１に記載のプロセス。
- 前記ＣＨＴカラムから溶出された前記タンパク質混合物が、１０％未満のＢＶを含む、請求項３４に記載のプロセス。
- 前記ＣＨＴカラムから溶出された前記タンパク質混合物が、５％のＢＶを含む、請求項３５に記載のプロセス。
- アニオン交換クロマトグラフィーにより、酸性バリアントが実質的に除去される、請求項３１に記載のプロセス。
- 前記酸性バリアントが、約１４％以下のＡＶ、１３％以下のＡＶ、１２％以下のＡＶ、１１％以下のＡＶ、１０％以下のＡＶ、９％以下のＡＶ、８％以下のＡＶ、７％以下のＡＶ、６％以下のＡＶ、５％以下のＡＶ、４．５％以下のＡＶ、４％以下のＡＶ、３％以下のＡＶ、２％以下のＡＶ、１％以下未満のＡＶである、請求項３７に記載のプロセス。
- アニオン交換クロマトグラフィーにより、高分子量不純物（ＨＭＷ）が実質的に除去される、請求項３１に記載のプロセス。
- 前記高分子量不純物が、約０．５％以下、約０．４％以下、又は０．３％以下、又は０．２％以下、又は０．１％以下から選択される、請求項３９に記載のプロセス。
- 前記目的のタンパク質が、ＩｇＧ１抗体又はその断片、及び融合タンパク質から選択される、請求項１から４０のいずれかに記載のプロセス。
- 前記ＩｇＧ１抗体又は融合タンパク質が、６～９の等電点を有する、請求項４１に記載のプロセス。
- 前記ＩｇＧ１抗体又は融合タンパク質が、エタネルセプト、リツキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、イブリツモマブ、オマリズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、エクリズマブ、セルトリズマブペゴル、ウステキヌマブ、カナキヌマブ、ゴリムマブ、オファツムマブ、トシリズマブ、デノスマブ、ベリムマブ、イピリムマブ、ブレンツキシマブベドチン、ペルツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、ラキシバクマブ、オビヌツズマブ、シルツキシマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ダルシズマブ、ネシツムマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、メポリズマブ、アリロクマブ、エボロクマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、イキセキズマブ、レスリズマブ、オララツマブ、ベズロトクスマブ、アテゾリズマブ、オビルトキサキシマブ、サリルマブ、オクレリズマブ、チルドラキズマブ、ロモソズマブ、ブロルシズマブ、クリザンリズマブから選択される、請求項４１に記載のプロセス。
- 前記ＩｇＧ１抗体が、ＩｇＥに結合する、請求項４１に記載のプロセス。
- 前記結合するＩｇＧ１抗体が、オマリズマブである、請求項４４に記載のプロセス。
- ＩｇＥに結合する抗体の医薬組成物であって、少なくとも９０％の純度を有する前記抗体の実質的に精製された単量体と、ＳＥ－ＨＰＬＣによって測定したときに、約０．２％未満のＬＭＷとを含むことを特徴とする医薬組成物。
- オマリズマブの医薬組成物であって、少なくとも９０％の純度を有する前記オマリズマブの実質的に精製された単量体と、ＳＥ－ＨＰＬＣによって測定したときに、約５％未満のＬＭＷとを含むことを特徴とする医薬組成物。
- 前記単量体の純度が、９０％、又は９１％、又は９２％、又は９３％、又は９４％、又は９５％、又は９６％、又は９７％、又は９８％、又は９９％を超える純度から選択される、請求項４６又は請求項４７に記載の医薬組成物。
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