KR101683415B1 - 단일클론항체에 대한 정제 방법 - Google Patents

단일클론항체에 대한 정제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 배양으로부터 단일클론항체의 정제를 위한 개선된 방법을 제공한다. 원하는 단일클론항체의 정제 방법은 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 임의의 이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 포함한다. 그것은 원하는 단일클론항체의 99% 보다 높은 순도를 제공한다.

Description

단일클론항체에 대한 정제 방법{PURIFICATION PROCESS FOR MONOCLONAL ANTIBODIES}
본 발명은 세포 배양으로부터 단일클론항체의 정제를 위한 개선된 방법을 제공한다. 원하는 단일클론항체의 정제 방법은 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 임의의 이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 포함한다. 그것은 원하는 단일클론항체의 99% 보다 높은 순도를 제공한다.
세포 배양 배지로부터 약제학적 등급의 단일클론항체 단백질의 정제는 수확/청징(harvest/clarification) 뒤이어 막 한외여과 (ultrafiltration) 및 투석여과(diafiltration)를 조합한 일련의 컬럼 크로마토그래피 단계를 이용하는 정제를 포함한다. 정제 후, 원하는 항체 제제는 적합하게 제제화되고 적절한 조건에서 저장된다. 그러나, 여러 경우에, 이들 단계는 그의 약제학적 용도를 위해 요구되는 순도 및 품질의 원하는 수준을 갖는 항체를 제공하지 못한다. 때때로, 공정-관련 및 생성물-관련 불순물이 컬럼 정제 동안 원하는 항체를 갖는 동시-용출 (co-elute)에서 관찰된다. 따라서, 원하는 제제로부터 이러한 불순물을 감소시키거나 제거하는 것이 중요하다. 게다가, 단백질 응집은 단일클론항체 (mAb) 생산 동안의 주요 관심사이다. 응집체의 존재는 단일클론항체의 치료적 효능을 감소시킬 수 있고, 인간에서 면역원성 (immunogenic) 반응을 촉발시키는 것으로 알려져있다. 따라서, 주로 컬럼 크로마토그래피에 의한 다운스트림 정제 (downstream purification)동안 단일클론항체의 원하는 제제로부터 응집체를 제거하는 것이 필요하다. 이러한 문제를 해결하기 위한 목적을 가지고, 본 발명은 항체 정제의 신규한 방법을 제공하는데, 이것은 특정 방식에서 일련의 컬럼 크로마토그래피를 이용함으로써 관심 항체를 포함하는 유리-세포 배양 (cell-free culture) 배지로부터 원하는 수준까지 고분자량 응집체와 함께 공정-관련 및 생성물-관련 불순물의 제거를 돕는다. 본 발명에서, 상기 항체 정제 방법은 간단한 (straight-forward) 방식에서 잘-제어된 정제 방법을 입증하였는데, 이것은 80% 보다 높은 회수율을 갖는 고도로 정제된 항체 제제를 생산한다. 본 발명에서 고도로 정제된 항체 제제는 99% 이상의 순도와 실질적으로 공정-관련 및 생성물-관련 불순물이 없고 본질적으로 단백질의 고분자량 응집체가 없는 항체 제제를 의미한다. 더욱이, 본 발명은 단일클론항체의 정제 방법의 높은 확장 가능성(scalable)과 재현 가능성(reproducible)을 제공한다. 기재된 신규한 정제 방법은 치료적 용도를 위한 경제적 및 산업적 실행 가능성 면에서 다양한 항체의 정제를 위한 공통 플랫폼(common platform)을 제공한다.
이러한 기술 중 일부는 하기 특허들에 개시된다:
US 6417335는 하기 단계를 포함하는 항체 및 오염물을 포함하는 조성물로부터 항체를 정제하는 방법을 개시한다: (a) 양이온 교환 수지 상에 조성물을 로딩하는 단계로, 여기서 양이온 교환 수지 상에 로딩된 항체의 양은 양이온 교환 수지의 항체 mL 당 약 20 mg 내지 약 35 mg인 단계; 및 (b) 양이온 교환 수지로부터 항체를 용출시키는 단계.
US 7863426은 항체 및 하나 이상의 숙주 세포 단백질-(HCP)를 포함하는 혼합물로부터 HCP 감소된 항체 제제의 제조 방법을 개시하는데, 그 방법은 이온 교환 분리 단계를 포함하며 여기서 그 혼합물은 제 1 이온 교환 물질이 되고, 이렇게 하여 HCP-감소된 항체 제제를 얻는다.
본 발명의 분야의 기타 관련 특허들로 US 6489447; EP 1075488; EP1308455; EP1308456B 등이 있다. 이들 각각은 그 전체가 참조에 의해 삽입된다.
본 발명은 공정-관련 및 생성물-관련 불순물 특히 단백질 응집체를 제거하는 동안 고도로 정제된 원하는 항체 제제를 얻도록 특별한 방식으로 종래의 컬럼 크로마토그래피 기술을 사용함으로써 항체의 신규한 정제 방법을 제공한다. 본 발명자들은 본 명세서에 이러한 정제 방법을 개시한다.
본 발명은 세포 배양 유래의 조(crude) 혼합물로부터 단일클론항체의 정제 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 일련의 크로마토그래피 및 한외여과 - 투석여과 단계를 포함하는 조 혼합물로부터의 단일클론항체의 정제 방법을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계의 사용을 포함하는 조 혼합물로부터의 단일클론항체의 정제 방법을 제공한다. 단백질 G 또는 단백질 L은 친화성 크로마토그래피 단계에서 컬럼 매트릭스로 사용될 수 있다.
추가의 측면에서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계는 결합을 위한 적합한 pH 및/또는 전도도에서 컬럼으로 원하는 항체를 포함하는 조 혼합물의 로딩 (loading), 뒤이어 단일 피크의 형태로 원하는 항체의 용출 (elution) 이전에 컬럼 세척을 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명에 따른 방법은 3단계의 컬럼 세척을 포함한다: (i) 평형 완충제 (equilibration buffer)를 이용한 제 1 세척, (ii) 제 1 세척 완충제와 동일한 pH 및/또는 제 1 세척 완충제 보다 높은 전도도에서 제 2 세척 (iii) 제 2 세척 완충제 보다 낮은 pH 및/또는 전도도에서 제 3 세척 (ⅳ) 제 3 세척 완충제 보다 낮은 pH 및/또는 제 3 세척 완충제 보다 높은 전도도에서 항체의 용출.
다른 측면에서, 본 발명에 따른 소수성 상호작용 크로마토그래피는 아래로의 구배 염 농도 (down-the-gradient salt concentration)를 이용하여 수행된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 단백질 A 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 이온교환 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 조 혼합물로부터의 단일클론항체의 정제 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 단백질 용액의 재조정 (reconditioning)을 위해 한외여과 - 투석여과를 조합하여 단백질 A 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 이온교환 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 조 혼합물로부터의 단일클론항체의 정제 방법을 제공한다. 본 명세서에서 단백질 용액이란 오염시키는 단백질과 원하는 항체의 혼합물 또는 본 명세서에 기재된 방법을 통해 얻어진 원하는 항체의 상대적으로 순수한 제제 중 어느 하나를 지칭한다.
추가의 측면에서, 본 발명에 따른 이온교환 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피로부터 선택된다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 단일클론항체의 정제 방법을 제공한다:
1. 단백질 A 크로마토그래피
2. 소수성 상호작용 크로마토그래피
3. 음이온 교환 크로마토그래피
소수성 상호작용 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 임의의 순서로 수행될 수 있다.
단백질 A 컬럼 단계는 조 혼합물로부터 단일클론항체를 포획하기 위해 그리고 결합-용출 방식(bind-elute mode)에서 높은 수준의 순도를 갖는 컬럼으로부터 원하는 단일클론항체를 용출하기 위해 유용하다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계는 결합-용출 방식에서 공정-관련 및 생성물-관련 불순물의 추가의 제거를 위해 사용된다. 음이온 교환 크로마토그래피는 플로우-스루 방식 (유통 방식: flow-through mode)에서 공정-관련 불순물의 추가의 제거를 위해 사용된다.
측면 중 하나에서, 본 발명에 따라 정제될 수 있는 항체들은 항-HER2 항체, 항-TNF 알파 항체, 항-VEGF 항체, 항-CD20 항체, 항-CD52, 항-RANKL, 항-IgE 항체, 등을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계 이후에 5% 이하의 응집체의 양을 갖는 항체 제제를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 1% 이하, 더욱 바람직하게는 0.5% 이하의 응집체의 양을 갖는 항체 제제를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 약어는 아래와 같이 정의된다:
단백질 A: 단백질 A 가교-결합된 아가로오스 컬럼.
HIC: 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피.
AEX: 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피.
HP-SEC: 고성능-사이즈 배제 크로마토그래피.
MWCO: 분획분자량 (Molecular weight cut-off).
NaCl: 염화나트륨.
WFI: 주사용 증류수.
도 1은 단백질 A 친화성 컬럼 크로마토그래피를 통한 아달리무맙의 용출 프로파일을 도시한다.
도 2는 분석 HP-사이즈 배제 크로마토그래피 (HP-SEC)에 의한 단백질 A 친화성 정제된 아달리무맙의 순도를 도시한다. 상기 도면은 제 1 컬럼 정제 이후에 얻어진 아달리무맙의 99% 보다 높은 순도를 나타낸다.
도 3은 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피를 통한 아달리무맙의 용출 프로파일을 도시한다.
도 4는 분석 HP-사이즈 배제 크로마토그래피 (HP-SEC)에 의한 HIC 정제된 아달리무맙의 순도를 도시한다. 상기 도면은 제 2 컬럼 정제 이후에 얻어진 아달리무맙의 99% 보다 높은 순도를 나타낸다.
도 5는 아달리무맙의 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피 프로파일을 도시한다.
도 6은 분석 HP-사이즈 배제 크로마토그래피 (HP-SEC)에 의한 AEX 컬럼 정제된 아달리무맙의 순도를 도시한다. 상기 도면은 AEX 컬럼 정제 이후에 얻어진 아달리무맙의 99% 보다 높은 순도를 나타낸다.
도 7은 분석 HP-사이즈 배제 크로마토그래피 (HP-SEC)에 의한 정제된 아달리무맙의 순도를 도시한다. 상기 도면은 최종 제제에서 정제의 말기에 얻어진 아달리무맙의 99% 보다 높은 순도를 나타낸다.
도 8은 분석 HP-사이즈 배제 크로마토그래피 (HP-SEC)에 의한 HIC 정제된 리툭시맙의 순도를 도시한다. 상기 도면은 제 2 컬럼 정제 이후에 얻어진 리툭시맙의 99% 보다 높은 순도를 나타낸다.
도 9는 분석 HP-사이즈 배제 크로마토그래피 (HP-SEC)에 의한 HIC 정제된 트라스투주맙의 순도를 도시한다. 상기 도면은 제 2 컬럼 정제 이후에 얻어진 트라스투주맙의 99% 보다 높은 순도를 나타낸다.
본 발명은 친화성 컬럼, 소수성 상호작용 컬럼 및 이온교환 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 일련의 컬럼 크로마토그래피 단계와 한외여과 및 투석여과를 조합하여 사용함으로써 세포 배양 유래의 단일클론항체의 정제 방법을 개시한다.
실시 형태 중 하나에서, 본 발명은 우선 포획을 위해, 그리고 그 후에 낮은 pH에서, 임의로 첨가제/염의 존재 하에서 높은 수준의 순도로 컬럼으로부터 단백질을 용출하기 위하여 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 사용함으로써 조 혼합물로부터 세포 배양 유래의 단일클론항체의 정제 방법을 제공한다. 조 혼합물은 관심 단백질의 그것에 더하여 숙주-세포 유래의 오염시키는 단백질, 생성물-관련 물질 및 추가적인 기타 불순물을 포함할 수 있다. 단백질 G 또는 단백질 L이 친화성 크로마토그래피 단계에서 컬럼 매트릭스로 사용될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 본 발명에 따른 방법은 3단계의 컬럼 세척을 포함한다: (i) 평형 완충제를 이용한 제 1 세척, (ii) 제 1 세척 완충제와 동일한 pH 및/또는 제 1 세척 완충제 보다 높은 전도도에서 제 2 세척 (iii) 제 2 세척 완충제 보다 낮은 pH 및/또는 전도도에서 제 3 세척 (ⅳ) 제 3 세척 완충제 보다 낮은 pH 및/또는 제 3 세척 완충제 보다 높은 전도도에서 항체의 용출.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 컬럼 세척 단계는 하기를 포함한다: (i) 약 pH 7.4 및/또는 약 20 mS/cm, 바람직하게는 1mS/cm 내지 30 mS/cm 범위 내의 전도도에서 평형 완충제를 이용한 제 1 세척 (ii) 약 pH 7.4 및/또는 20 mS/cm 보다 높은 전도도에서 제 2 세척 (iii) pH 7.4 보다 낮은, 바람직하게는 pH 5 내지 pH 6.5 범위 내의 pH 및/또는 20 mS/cm 보다 낮은, 바람직하게는 1 mS/cm 내지 5 mS/cm 범위 내의 전도도에서 제 3 세척 (iv) 약 pH 3.5 및/또는 5 mS/cm 보다 높은 전도도에서 항체의 용출.
실시 형태 중 하나에서, 단백질 A 크로마토그래피 정제 단계를 위한 완충제 성분은 트리스 (Tris), 아세트산염 및 시트르산염 완충제로부터 선택된다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 항체의 용출은 약 pH 3.5 내지 pH 4, 바람직하게는 pH 3.5 내지 pH 3.7의 범위의 pH에서 수행된다.
실시 형태 중 하나에서, 본 발명에 따른 방법은 염화나트륨, 아르기닌, 글리신, 바람직하게는 염화나트륨으로부터 선택되는 첨가제/염을 포함한다.
본 발명은 또한 최대 회수율로 염의 존재 하에서 낮은 완충제 pH 조건에서 컬럼으로부터 관심 단백질을 용출하면서, 단백질 A 컬럼 크로마토그래피에 의해 숙주 세포 오염시키는 단백질의 대다수의 제거를 입증하였다.
실시 형태 중 하나에서, 본 발명은 또한 산성 pH 조건 하에서, 단백질 A 컬럼으로부터 용출 후에 원하는 단일클론항체의 분자 완전성 (molecular integrity)이 분석 HP-SEC에 의한 평가에서 적어도 약 1 시간 동안 계속 변하지 않는 것을 입증하였다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 결합-용출 방식에서 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피를 이용함으로써 원하는 단백질 분획으로부터 잔류 공정-관련 및 생성물-관련 불순물의 제거를 제공한다. 원하는 단백질의 용출은 주요 피크 (major peak)의 형태로 아래로의 구배 염 농도를 이용하여 수행된다.
추가의 실시 형태에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 위한 컬럼 매트릭스는 페닐 세파로오스, 부틸 세파로오스, 옥틸 세파로오스, 바람직하게는 페닐 세파로오스로부터 선택된다.
더 추가의 실시 형태에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계에서 원하는 단백질의 용출을 위한 염은 황산암모늄, 염화나트륨, 염화암모늄 및 황산나트륨, 바람직하게는, 황산암모늄으로부터 선택된다.
다른 실시 형태에서, 소수성 상호작용 크로마토그래피는 pH 5 내지 pH 7의 범위 내의 pH 및/또는 100 mS/cm 보다 높은 전도도에서 수행된다.
실시 형태 중 하나에서, 본 발명에 따른 이온교환 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피로부터 선택된다.
다른 실시 형태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 위한 컬럼 매트릭스는 DEAE 세파로오스, 모노 Q (Mono Q) 및 Q 세파로오스 XL (Q sepharose XL), 바람직하게는 Q 세파로오스로부터 선택된다.
실시 형태 중 하나에서, 본 발명은 또한 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 통한 플로우-스루-앤드-워시 (flow-through-and-wash) 방식에서 또는 양이온 교환 크로마토그래피를 통한 결합-용출 방식에서 원하는 단일클론항체의 정제를 도시한다.
바람직한 실시 형태에서, 세포 배양으로부터 유래된 원하는 단일클론항체의 정제는 하기에 따라 수행된다:
1. 단백질 A 크로마토그래피
2. 소수성 상호작용 크로마토그래피
3. 음이온 교환 크로마토그래피
소수성 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 단백질 A 컬럼 크로마토그래피 단계 이후에 임의의 순서에서 수행될 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 세포 배양으로부터 유래된 원하는 단일클론항체의 정제는 하기에 따라 수행된다:
1. 단백질 A 크로마토그래피
2. 낮은-pH 배양
3. 중화 및 재조정
4. 소수성 상호작용 크로마토그래피
5. 한외여과 - 투석여과
6. 음이온 교환 크로마토그래피
7. 나노-여과
8. 한외여과 - 투석여과
여기서 소수성 크로마토그래피에서, 한외여과 - 투석여과 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 단백질 A 크로마토그래피 단계 이후에 임의의 순서에서 수행될 수 있다.
추가의 실시 형태에서, 투석여과 배지는 물, 시트르산염 완충제, 인산염 완충제, 숙신산염 완충제, 아세트산염 완충제 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
실시 형태 중 하나에서, 본 발명에 따른 컬럼으로부터 항체의 회수는 염화나트륨, 아르기닌, 글리신, 바람직하게는 염화나트륨으로부터 선택되는 첨가제/염을 이용하여 수행된다.
실시 형태 중 하나에서, 본 발명에 따른 항체의 전회수 (overall recovery)는 초기 양(initial amount)의 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 내지 90% 범위 내이다.
바람직한 실시 형태에서, 항체는 항-HER 항체, 항-TNF 항체, 항-VEGF 항체, 항-CD20 항체, 항-CD52 항체, 항-RANKL, 항-IgE 항체, 등으로부터 선택된다.
더욱 바람직한 실시 형태에서, 항체는 트라스투주맙 (trastuzumab), 퍼투주맙 (pertuzumab), 인플릭시맙 (infliximab), 아달리무맙 (adalimumab), 베바시주맙 (bevacizumab), 라니비주맙 (ranibizumab), 리툭시맙 (rituximab), 베크투모맙 (bectumomab), 에프라투주맙 (epratuzumab) 등으로부터 선택된다.
추가의 실시 형태에서, 본 발명은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계 이후에 응집체 (aggregates)의 양이 5% 이하, 바람직하게는 2% 이하를 갖는 정제된 항체 제제를 제공한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 1% 이하, 더욱 바람직하게는 0.5% 이하인 응집체 양을 갖는 항체 제제를 제공한다.
원하는 단일클론항체의 정제 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 세포 분리 및 원심분리에 의한 배양 상층액의 청징 및 심층-여과 (depth-filtration) 뒤이은 재조정
- 단백질 A 컬럼 크로마토그래피
- 낮은-pH 배양
- 중화 및 재조정
- 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피
- 한외여과 - 투석여과
- 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피
- 나노-여과
- 한외여과 - 투석여과
- 정밀여과 (Microfiltration)
본 발명에 따른 정제 단계는 하기에 추가 사항을 기재한다:
I) 단백질 A 컬럼 크로마토그래피:
원하는 단일클론항체 및 기타 오염물을 포함하는 세포 배양 유래의 청징된 (clarified) 상층액을 중성에 가까운 pH에서 적절한 완충제로 평형화시킨 단백질 A 컬럼 상에 로드하였다. 원하는 단일클론항체는 친화성 매트릭스에 결합하지만, 다수의 오염물은 플로우-스루에서 컬럼을 통과해나갔다. 원하는 단백질의 용출 이전에, 상기 컬럼은 다수의 세척 단계들로 세척되었다. 제 1 세척은 동일한 평형 완충제를 이용한 컬럼-로딩의 완료 후에 수행되었다. 제 2 세척은 제 1 세척 완충제의 전도도 보다 높은 전도도를 갖는 동일한 pH의 완충제를 이용하여 수행되었다. 제 3 세척은 제 1 세척 및 제 2 세척 단계의 pH 및 전도도와 상이한 pH 및 전도도의 완충제에서 수행되었다. 원하는 단백질의 용출은 제 3 세척 단계의 pH 보다 낮은 pH, 그러나 전도도는 제 3 세척 단계의 전도도 보다 높은 전도도에서 수행되었다. 최종적으로 컬럼 세정은 알칼리성 용액을 이용하여 수행되었다.
II) 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피:
하나 이상의 원하지 않는 오염물을 포함하는 혼합물로부터 원하는 단일클론항체 단백질의 정제는 결합-용출 방식에서 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피에 의해 실시되었다. 컬럼 상에 단백질-로딩의 완료 후에, 원하는 단일클론항체가 아래로의 구배 염 농도 (즉, 평형 완충제 전도도와 비교하여 감소된 전도도를 가짐) 를 이용하여 컬럼으로부터 용출되었다. 원하는 단일클론항체 단백질의 용출은 단일의 넓은 피크 (single broad peak) 형태로 일어난다. 용출된 단백질을 분획에서 수집하였고 원하는 수준의 순도를 포함하는 분획이 함께 모아졌다.
III) 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피:
원하는 단일클론항체를 포함하는 단백질 용액이 음이온 교환 컬럼 평형화 조건의 pH 및 전도도까지 실질적으로 맞춰지도록 재조정되었다. 컬럼은 pH 약 6.5의 완충제를 이용하여 평형화되었다. 플로우-스루-앤드-워시 분획에서 컬럼으로부터 원하는 단백질이 회수되었다. 본 발명에 따른 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 것에 대하여, DEAE 세파로오스, 모노 Q, Q 세파로오스 XL 등으로부터 선택되는 다른 음이온 교환체가 또한 사용될 수 있다. 음이온 교환체 Q 세파로오스가 본 발명에서 사용되었다.
분석 기술: 분석 사이즈-배제 크로마토그래피 (HP-SEC)가 300 mM NaCl 존재 하에서 pH 6.8의 인산나트륨 완충제를 이용하여 평형화된 TSK-3000 컬럼을 이용함으로써 수행되었다. 단백질은 등용매-방식 (isocratic-mode)에서 0.5 mL/분으로 용출되었다.
실시예
여기에서, 본 발명은 하기 비-제한적인 실시예에 의해 예시되고, 이들은 어떤 방식으로라도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다:
실시예 1: 아달리무맙의 정제 (항- TNF α 항체)
단계 1: 세포 분리 / 청징 / 재조정
배치(batch)를 수확한 후, 기타 수용성 오염물과 함께 관심 단백질을 포함하는 맑은 상층액을 얻기 위하여 우선 원심분리 뒤이어 심층 여과로 세포들을 배양액으로부터 분리하였다. 원심분리는 10,000 g × 30 분에서 수행하였다. 심층 여과는 0.45 → 0.22 μm 막(membrane)을 이용하여 수행하였다. 청징된 상층액은 pH 및 전도도에 대한 단백질 A 컬럼 평형 완충제 조건과 조율되도록 재조정되었다.
단계 2: 단백질 A 컬럼 크로마토그래피
재조정 후 청징된 상층액을 친화성 매트릭스에 의해 아달리무맙을 포획하도록 단백질 A 친화성 컬럼에 통과시켰고, 뒤이어 낮은 pH에서 그 컬럼으로부터 용출시켰다. 로딩 전에, 그 컬럼은 10 - 25 mS/cm 범위 내의 전도도에서 pH 7.4의 적절한 완충제를 이용하여 평형화되었다. 로딩 후에, 그 컬럼을 동일한 완충제 (제 1 세척)를 이용하여 세척하였다. 제 1 세척 단계 다음에, 그 컬럼을 pH 7.4의 동일한 완충제로, 그러나 전도도는 제 1 세척 단계의 전도도 보다 높은 (> 25 mS/cm) 전도도에서 세척하였다. 제 3 세척 단계는 1 - 5 mS/cm 범위 내의 전도도를 갖는 pH 5.5의 적절한 완충제를 이용하여 수행하였다. 제 3 세척 단계 후에, 원하는 단백질인, 아달리무맙의 용출을 도 1에 나타낸 바와 같이 5 mS/cm 보다 높은 전도도에서 pH 3.5 - 3.7 의 적절한 완충제를 이용하여 수행하였다. 이 단계 이후에 용출된 아달리무맙은 도 2에 나타낸 바와 같이 분석 HP-SEC에 의해 분석하는 경우 98% 이상의 순도를 나타낸다.
단계 3: 낮은-pH 배양
단백질 A 컬럼-용출된 원하는 단백질 분획을 바이러스 불활성화를 위한 실온 조건 하에서 약 45 - 60분 동안 동일한 용출 pH 조건에서 배양하였고, 그 후에 그 단백질 용액을 0.22 μm 필터로 통과시켰다.
단계 4: 중화 및 재조정
낮은-pH 처리 이후에, 중화 단계는 제어된 방식에서 알칼리성 용액의 첨가로 수행하였다. 그 단백질 용액은 다음의 컬럼 평형화 조건까지 조정되도록 30 kDa MWCO 막 필터를 사용한 UF / DF에 의해 pH 및 전도도의 조정으로 재조정되었다. 전도도의 조정을 위해, 농축 황산암모늄 용액을 그 단백질 용액에 첨가하였다. 재조정 후에, 단백질 용액을 0.22 μm 막 필터로 통과시켰고 소수성 상호작용 컬럼 상에 로드하였다.
단계 5: 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피
재조정 후에, 결합-용출 방식에서 추가 정제를 위해 아달리무맙을 포함하는 그 단백질 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피 매트릭스인 페닐 세파로오스로 통과시켰다. 그 컬럼을 90 mS/cm 보다 높은 전도도를 갖는 pH 약 6.5 내지 pH 7.0의 적절한 완충제로 평형화하였다. 컬럼 매트릭스에 결합한 이후, 아달리무맙이 도 3에 나타낸 바와 같이 아래로의 염 구배 (down the salt gradient)로 동일한 완충제에서 컬럼으로부터 용출되었다. 도 4에서 나타낸 HP-SEC에 의한 평가에서, 99% 보다 높은 순도의 아달리무맙이 이 컬럼 단계 이후에 얻어졌다.
단계 6: 한외여과 - 투석여과 ( UF /DF)
소수성 컬럼-용출된 모아진 분획을, 실질적으로 다음 컬럼 (Q 컬럼) 단계의 평형 완충제 조건(예를 들면, pH 및 전도도)으로 맞춰지도록 pH 6.5의 낮은 이온 강도 Na-시트르산염 완충제 용액에 대하여 30 kDa MWCO 막 필터를 사용한 UF / DF에 의해 재조정하였다. 투석여과된 단백질 용액을 0.22 μm 필터로 통과시켰고 Q-컬럼 상에 로드하였다.
단계 7: 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피
원하는 단일클론항체를 포함하는 투석여과된 단백질 용액을 도 5에 나타낸 바와 같이 10 mS/cm 보다 낮은 전도도에서 pH 6.5의 적절한 완충제를 이용한 플로우-스루-앤드-워시 방식에서 Q-세파로오스 컬럼으로 통과시켰다. Q-컬럼 단계 이후에, 아달리무맙의 순도는 도 6에서 나타낸 HP-SEC에 의한 평가에 따라, > 99% 가 되는 것을 관찰하였다.
단계 8: 나노-여과
Q-컬럼 단계 이후에, 원하는 단일클론항체를 포함하는 단백질 용액은 나노-여과 단계를 수행하였다. 나노-여과 이후에, 아달리무맙의 순도는 99% 보다 높음을 유지하는 것으로 관찰되었다.
단계 9: 한외여과 - 투석여과
나노-여과 이후에, 단백질 용액은 벌크 약물 성분 (bulk drug substance)의 제제용으로 원하는 배지를 이용하여 나노여과되었다.
단계 10: 정밀여과
최종적으로, 원하는 단일클론항체를 포함하는 정제된 제제를 0.22 μm 막 필터로 통과시켰고, 무균적으로, 저장을 위하여 저온 조건 하 또는 냉동 조건 하 중 어느 하나에서 액체 형태로 저장하였다. 최종 제제에서 단백질의 농도는 1 mg / mL 내지 60 mg / mL로 변화할 수 있다. 최종 정제된 단일클론항체 아달리무맙은 도 7에서 나타낸 HP-SEC에 의한 평가에 따라 99% 보다 높은 순도를 나타내었다.
실시예 2: 리툭시맙의 정제 (항-CD20 항체)
항-CD20 항체인 리툭시맙에 대한 정제 방법을 실시예 1에 기재된 방식에 따라 수행하였다. 최종 정제된 단일클론항체는 도 8에서 나타낸 HP-SEC에 의한 평가에 따라 99% 보다 높은 순도를 나타내었다.
실시예 3: 트라스투주맙의 정제 (항- HER2 항체)
항-HER2 항체인 트라스투주맙에 대한 정제 방법을 실시예 1에 기재된 방식에 따라 수행하였다. 최종 정제된 단일클론항체는 도 9에서 나타낸 HP-SEC에 의한 평가에 따라 99% 보다 높은 순도를 나타내었다.
정제된 제제는 이후 인간 용도를 위한 약제학적 성분으로서 사용을 위해 적절하게 제제화될 수 있다.

Claims (34)

  1. 하기 순차적인 단계를 포함하는 세포 배양으로부터, 항-HER 항체, 항-TNFα 항체, 및 항-CD20 항체로부터 선택되는 단일클론항체의 정제 방법으로서:
    (a) 친화성 크로마토그래피
    (b) 소수성 상호작용 크로마토그래피, 임의로 뒤이은 다른 적합한 정제 단계, 여기서 소수성 상호작용 크로마토그래피는 결합-용출 방식(bind-elute mode)으로 수행됨
    상기 단계 (a)는 결합을 위한 적합한 pH 또는 전도도에서 컬럼으로 원하는 항체를 포함하는 조(crude) 혼합물의 로딩 (loading), 뒤이어 단일 피크의 형태로 원하는 항체의 용출 (elution) 이전에 컬럼 세척을 포함하고, 상기 컬럼 세척은:
    (i) pH 7.4 또는 1mS/cm 내지 30 mS/cm 범위 내의 전도도에서 평형 완충제를 이용한 제 1 세척
    (ii) pH 7.4 또는 30 mS/cm 보다 높은 전도도에서 제 2 세척
    (iii) pH 5 내지 pH 6.5 범위 내의 pH 또는 1 mS/cm 내지 5 mS/cm 범위 내의 전도도에서 제 3 세척
    (iv) pH 3.5 또는 5 mS/cm 보다 높은 전도도에서 항체의 용출
    을 포함하는, 정제 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 친화성 크로마토그래피 매트릭스 (matrix)는 단백질 A, 단백질 G 및 단백질 L로부터 선택되는, 정제 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 친화성 크로마토그래피 매트릭스는 단백질 A인, 정제 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 청구항 1에 있어서, 완충제 성분은 트리스 (Tris), 아세트산염 및 시트르산염 완충제로부터 선택되는, 정제 방법.
  8. 삭제
  9. 청구항 1에 있어서, 용출은 염화나트륨, 아르기닌, 또는 글리신으로부터 선택된 완충제 내의 첨가제를 이용하여 수행되는, 정제 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 단계 (a) 이후에 항체 제제에서 응집체 (aggregates)의 양은 5% 이하인, 정제 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 단계 (b)는 pH 5 내지 pH 7의 범위 내의 pH 또는 100 mS/cm 보다 높은 전도도에서 수행되는, 정제 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 단계 (b)에서 항체는 아래로의 구배 염 농도 (down-the-gradient salt concentration)로 컬럼으로부터 용출되는, 정제 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 염은 황산암모늄, 염화나트륨, 염화암모늄 및 황산나트륨으로부터 선택되는, 정제 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 소수성 컬럼 매트릭스는 페닐 세파로오스, 부틸 세파로오스, 옥틸 세파로오스로부터 선택되는, 정제 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 하기 단계를 포함하는 정제 방법:
    (a) 단백질 A 친화성 크로마토그래피
    (b) 결합-용출 방식(bind-elute mode)으로 수행되는 소수성 상호작용 크로마토그래피
    (c) 이온교환 크로마토그래피
  16. 청구항 15에 있어서, 단계 (a)는 청구항 1 내지 청구항 3, 청구항 7, 청구항 9, 및 청구항 10 중 어느 한 항에 기재된 것과 같이 수행되는, 정제 방법.
  17. 청구항 15에 있어서, 단계 (b)는 청구항 11 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 기재된 것과 같이 수행되는, 정제 방법.
  18. 청구항 15에 있어서, 이온교환 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피로부터 선택되는, 정제 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 이온교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피인, 정제 방법.
  20. 청구항 15에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피용 컬럼 매트릭스는 DEAE 세파로오스, 모노 Q (Mono Q) 및 Q 세파로오스 XL (Q sepharose XL)로부터 선택되는, 정제 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 컬럼 매트릭스는 Q 세파로오스인, 정제 방법.
  22. 청구항 15에 있어서, 단계 (c)에서 항체의 용출은 플로우-스루-앤드-워시 (flow-through-and-wash) 방식 또는 결합-용출 (bind-elute) 방식으로 수행되는, 정제 방법.
  23. 청구항 1에 있어서, 하기 단계로 이루어진 정제 방법:
    a) 세포 분리
    b) 단백질 A 친화성 크로마토그래피
    c) 낮은-pH 배양
    d) 중화 및 재조정 (reconditioning)
    e) 결합-용출 방식(bind-elute mode)으로 수행되는 소수성 상호작용 크로마토그래피
    f) 한외여과 (Ultrafiltration) - 투석여과 (diafiltration)
    g) 음이온 교환 크로마토그래피
    h) 나노-여과
    i) 한외여과 - 투석여과
    j) 정밀여과 (Microfiltration)
  24. 청구항 23에 있어서, 단계 b)는 청구항 1, 청구항 7, 및 청구항 9 중 어느 한 항에 기재된 것과 같이 수행되는, 정제 방법.
  25. 청구항 23에 있어서, 단계 e)는 청구항 11 또는 청구항 12에 기재된 것과 같이 수행되는, 정제 방법.
  26. 청구항 23에 있어서, 투석여과 배지 (medium)는 인산염, 아세트산염, 시트르산염, 숙신산염 및 이들의 조합으로부터 선택되는, 정제 방법.
  27. 청구항 1 내지 청구항 3, 청구항 7, 청구항 9 내지 청구항 15, 청구항 18 내지 청구항 23, 및 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 시트르산염, 아세트산염, 인산염으로부터 선택되는 완충제 성분을 가진 컬럼으로부터 회수되는, 정제 방법.
  28. 청구항 1 내지 청구항 3, 청구항 7, 청구항 9 내지 청구항 15, 청구항 18 내지 청구항 23, 및 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 염화나트륨, 아르기닌, 글리신으로부터 선택되는 첨가제를 가진 컬럼으로부터 회수되는, 정제 방법.
  29. 청구항 1 내지 청구항 3, 청구항 7, 청구항 9 내지 청구항 15, 청구항 18 내지 청구항 23, 및 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토크래피에서 항체의 용출은 pH 5 내지 pH 7의 범위 내의 pH에서 수행되는, 정제 방법.
  30. 청구항 1 내지 청구항 3, 청구항 7, 청구항 9 내지 청구항 15, 청구항 18 내지 청구항 23, 및 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 전회수 (overall recovery)는 초기 양(initial amount)의 50% 이상 범위 내인, 정제 방법.
  31. 청구항 1 내지 청구항 3, 청구항 7, 청구항 9 내지 청구항 15, 청구항 18 내지 청구항 23, 및 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 항체 제제는 1 % 이하의 응집체를 포함하는, 정제 방법.
  32. 삭제
  33. 청구항 1 내지 청구항 3, 청구항 7, 청구항 9 내지 청구항 15, 청구항 18 내지 청구항 23, 및 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 트라스투주맙 (trastuzumab), 퍼투주맙 (pertuzumab), 인플릭시맙 (infliximab), 아달리무맙 (adalimumab), 리툭시맙 (rituximab)으로부터 선택되는, 정제 방법.
  34. 청구항 1 내지 청구항 3, 청구항 7, 청구항 9 내지 청구항 15, 청구항 18 내지 청구항 23, 및 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 아달리무맙, 트라스투주맙 및 리툭시맙인, 정제 방법.
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