KR102154952B1 - 아달리무맙의 Non-Protein A 정제방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 고가의 단백질 A(protein A) 컬럼을 사용하지 않고 불순물을 제거하여 고순도 및 고품질로 목적하는 항체 집단을 제조할 수 있으며, 특히 공정 자동화를 이루며 생산 단가를 크게 감소시킬 수 있는 항체 집단의 제조 방법 및 상기 방법으로 제조된 항체 집단에 관한 것이다.

Description

아달리무맙의 Non-Protein A 정제방법 {Non-Protein A Purification of Adalimumab}
본 발명은 친화성 크로마토그래피인 단백질 A(protein A) 컬럼의 사용 없이, 저비용으로 고순도 및 고수율의 항체 집단을 제조하는 방법에 관한 것이다.
생물의약품 연구 및 개발에 있어서의 최신 경향은 항체 단편의 개발에 더욱 중점을 둔다. 다수의 바이오시밀러(biosimilar) 치료 단백질이 이전에 비해 더 많이 개발되고 있지만, 바이오시밀러 제품 개발에 있어서의 중대한 어려움은 분리 정제 공정(downstream processing)의 높은 비용, 공정 및 생성물 관련된 불순물의 비-선택적 소거, 생성물의 단백질 분해에 의한 분해 등이다. 항체 단편은 전체 크기의 단일클론성 항체(mAb) 치료제에 비해 특정한 이점을 제공하는데, 이러한 이점은 예컨대 종양으로의 증진된 심부로의 침투, 전체 크기의 mAb에 접근할 수 없는 특이적 에피토프로 결합 등이다. 고 역가 클론 및 연속적인 바이오-제조(bio-manufacturing)와 같은 발효 배양 공정(upstream processes)에서의 진보는, 생물의약품 산업의 초점을 전체적인 분리 정제 공정 경제를 향상시키는 쪽으로 옮겨 놓았다. 분리 정제 공정은 단일클론성 항체 치료제를 위한 전체 제조 비용의 대략 60 내지 70%를 차지한다. 분리 정제 공정의 포획 단계, 중간 단계 및 폴리싱(polishing) 단계는 고가의 다양한 크로마토그래피 조작의 사용을 포함한다.
이에 따라, 항체 의약품과 관련하여 정제 공정에 대한 많은 연구 개발이 진행된 바 있다.
구체적으로, 항체 의약품 생산을 위한 정제 공정으로, 단백질 A(Protein A) 컬럼을 이용한 정제 공정이 주로 이루어지고 있다. 그런데, 단백질 A(Protein A) 컬럼을 이용한 정제 방법의 경우, 초기 단계에서 높은 순도로 생산할 수 있는 장점을 가지나, 가격이 일반 이온 교환수지에 비해 30배 이상 높아 생산단가가 높다는 단점이 있다.
기존에 보고된 바에 따르면, 단백질 A 수지가 항체 의약품 생산 원료 단가의 약 35%에 해당하는 높은 비율을 차지하고 있으며, 컬럼에서 용출되는 미량의 단백질 A가 인체 내부에서 면역성 또는 생리적으로 반응을 일으킬 수 있다. 따라서, 단백질 A 컬럼을 이용한 정제 공정의 경우, 잔량의 단백질 A를 공정 별로 모니터링하고 제거해야 하는 어려움을 지닌다. 또한, 생물친화기인 단백질 A는 화학적으로 안정성이 약한 단점이 있어 컬럼의 재생 단계에서 단백질 A의 활성을 유지하는 상태에서 재생시켜야 하기 때문에, 클리닝 공정에서 필수적으로 사용되는 1 M NaOH를 사용할 수 없어, 컬럼에 붙은 불순물을 완전하게 제거할 수 없으며, 이에 따라 컬럼을 재생하여 사용하는 횟수가 다른 일반 화학적 수지에 비하여 현저하게 떨어지는 한계를 지닌다.
이러한 문제점을 해결하고자, 양이온 교환 컬럼, 소수성 컬럼, 음이온 교환 컬럼 등을 이용한 불순물 제거 및 고순도 항체를 개발하고자 하는 많은 노력들이 있었다.
그런데, 위와 같은 단백질 A의 사용을 제외한 컬럼들을 이용한 항체의 제조에 있어서 고수율 및 고순도로 항체 생산에 이르기까지 많은 문제점들이 발견되었다.
예를 들어, 일반적으로 양이온 교환 컬럼을 사용하는 경우 정제 공정에서 여러 버퍼의 사용이 혼재된다. 이에 따라, 다수의 버퍼를 사용함에 따른 복잡한 공정으로 인해 Elution 되는 단백질을 수집하는 데 어려움이 있다. 특히, 양이온 교환 컬럼의 사용에 있어서 Washing 공정은 많은 양의 상이한 성분을 가지는 버퍼 조성을 이용할 필요가 있기 때문에, 자동화 및 공정 단순화가 매우 어려운 문제가 있다.
위와 같은 문제로 인하여 항체 생산 비용 및 생산 시간이 크게 증가하며, 품질 확보 측면에서도 충분한 효과를 이루지 못하였으며, 공정의 자동화 또한 쉽게 이루지 못하였다.
이러한 배경 하에, 바이오시밀러 제품, 특히 정제된 항체 단편을 수득하기 위한 편리한 분리 정제 공정을 제공하는 것이 매우 중요하다. 선행 기술의 분리 정제 절차에 의해 제기된 문제점의 견지에서, 본 발명자들은 항체 집단을 정제하기 위한 방법을 제공하고자 하였다. 본 발명에 의해 수득된 정제된 항체 집단은 우수한 순도 및 활성 기준을 만족시키고 충족시킨다.
본 발명자들은 항체 정제에 일반적으로 사용되는 고가의 Protein A 컬럼을 이용하지 않고, 세포를 제거한 배양 상등액의 pH를 감소시켜 침전물을 제거하는 전처리 단계 후에 적합한 조건 하에 설정된 양이온 교환 컬럼, 소수성 상호작용 컬럼, 및 음이온 교환 컬럼을 순차적으로 이용하고, 이 과정에서 바이러스 필터링 및 여과 공정을 적절한 시점에 수행하는 것으로 방법을 변경함으로써, 고품질의 항체 집단을 제조할 수 있음을 확인하였다. 이에 따라, 본 발명에서는 하기 목적의 발명을 제공한다.
본 발명의 하나의 목적은 (a) 항체의 혼합액을 포함하는 시료를, 평형화된 양이온 교환 컬럼에 로딩하고, 상기 양이온 교환 컬럼을 세척한 후, 컬럼에 결합된 항체를 용출 완충액으로 용출시키는 것을 포함하는, 항체의 혼합액을 포함하는 시료로부터 숙주세포 단백질(HCP) 및 이성질 항체를 제거하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 용출된 항체 용출액에 염을 혼합한 시료를 소수성 상호작용 컬럼에 로딩하고, 컬럼에 결합된 항체를 용출 완충액으로 용출시키는 것을 포함하는, 항체 용출액으로부터 숙주세포 단백질(HCP) 및 잔류 DNA (Residual DNA)를 제거하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 숙주세포 단백질(HCP) 및 잔류 DNA가 제거된 항체 용출액을 음이온 교환 컬럼에 통과시켜 통과액(flow-through)을 수집하는 것을 포함하는, 숙주세포 단백질(HCP) 및 잔류 DNA (Residual DNA)을 제거하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 통과액(flow-through)을 바이러스 필터에 통과시켜 바이러스를 제거하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계에서 용출된 항체 용출액을 농축 및 완충액 교환하고, 잔류 DNA 및 숙주세포 단백질의 농도를 각각 10 ppb 및 10 ppm 이하로 함유하는 항체 집단을 제조하는 단계;를 포함하는 항체 집단의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 주활성 항체를 60% 이상 포함하는 항체 집단을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 항체의 혼합액을 포함하는 시료를, 평형화된 양이온 교환 컬럼에 로딩하고, 상기 양이온 교환 컬럼을 세척한 후, 컬럼에 결합된 항체를 용출 완충액으로 용출시키는 것을 포함하는, 항체의 혼합액을 포함하는 시료로부터 숙주세포 단백질(HCP) 및 이성질 항체를 제거하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 용출된 항체 용출액에 염을 혼합한 시료를 소수성 상호작용 컬럼에 로딩하고, 컬럼에 결합된 항체를 용출 완충액으로 용출시키는 것을 포함하는, 항체 용출액으로부터 숙주세포 단백질(HCP) 및 잔류 DNA (Residual DNA)를 제거하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 숙주세포 단백질(HCP) 및 잔류 DNA가 제거된 항체 용출액을 음이온 교환 컬럼에 통과시켜 통과액(flow-through)을 수집하는 것을 포함하는, 숙주세포 단백질(HCP) 및 잔류 DNA (Residual DNA)을 제거하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 통과액(flow-through)을 바이러스 필터에 통과시켜 바이러스를 제거하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계에서 용출된 항체 용출액을 농축 및 완충액 교환하고, 잔류 DNA 및 숙주세포 단백질의 농도를 각각 10 ppb 및 10 ppm 이하로 함유하는 항체 집단을 제조하는 단계;를 포함하는 항체 집단의 제조 방법을 제공한다.
숙주세포를 통해 제조되는 항체 생성물에는 주활성 항체 외에도 여러 이성질 항체, 숙주세포 단백질(HCP), 숙주세포에서 유래한 DNA 및 세포 성장을 위한 인자들을 포함한다. 상기 이성질 항체는 항체에서 일부 아미노산이 탈아민 또는 산화에 의하여 변형된 형태의 항체로서, 이성질 항체마다 생물학적 활성에 차이를 나타낸다. 숙주세포를 통하여 발현된 항체 생성물에는 이러한 이성질 항체의 비중이 높으며, 특히 항체 바이오시밀러의 경우에는 대조약과 유사한 품질의 제조가 중요하므로, 숙주세포로부터 항체를 생산한 다음, 이성질 항체의 함량을 조절하는 공정이 필요하다. 이에, 본 발명에서는 숙주세포 단백질 및 숙주세포에서 유래한 DNA를 제거하여 순도를 높이고, 숙주세포 배양액에 비하여 주활성 항체의 비율을 증가시킴으로써, 목적하는 비율의 산성 이성질 항체, 주활성 항체 및 염기성 이성질 항체을 포함하는 고순도 및 고품질의 항체 집단을 효과적으로 제조할 수 있는 방법을 제공한다.
특히, 본 발명에 따른 방법은 위와 같이 고순도 및 고품질의 항체 집단을 제공하면서도, 공정 자동화를 이룰 수 있는 장점을 가질 뿐만 아니라 생산 단가를 크게 감소시켰다는 점에서 우수한 장점을 가지는 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "항체 집단(a population of antibodies)"은 주활성 항체 및 이성질 항체를 포함하는 항체군을 의미하며, 본 발명의 목적상 상기 항체 집단은 주활성 항체 및 이성질 항체를 목적하는 비율로 포함하는 항체 군을 의미한다. 상기 항체 집단은 한 종류의 항체만을 포함하거나, 주활성 항체 및 이성질 항체를 모두 포함하는 항체 군을 모두 포함한다. 본 발명의 목적상 상기 항체 집단은 상세하게는 숙주세포를 통해 제조한 항체 생성물로부터 숙주세포 단백질과 같은 불순물 및 이성질 항체를 제거하여 주활성 항체의 비율을 높인 항체군을 의미한다.
특히, 항체 바이오시밀러의 제조에 본 발명의 방법을 적용하는 경우, 대조약과 동일 또는 대응하는 조성으로 주활성 항체 및 이성질 항체를 포함하는 항체 집단을 제조할 수 있다.
상기 목적하는 항체 집단은 양이온 교환 수지 컬럼을 이용한 정제 단계를 통하여 원하는 범위의 이성질 항체 및 주활성 항체를 포함하도록 제조될 수 있으며, 이 경우 상세하게는 주활성 항체의 비율은 50% 이상이며, 더욱 상세하게는 주활성 항체의 비율은 60% 이상이며, 염기성 이성질 항체가 20% 이하이며, 산성 이성질 항체가 20 % 이하인 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 항체 집단은 60% 이상의 주활성 항체 (상세하게는 65 % 이상의 주활성체), 20% 이하의 산성 이성질 항체 및 20% 이하의 염기성 이성질 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 Fractogel COO- 양이온 교환 컬럼을 이용하여 휴미라 대조약 품질과 유사한 함량인, 20% 이하의 산성 이성질 항체 함량, 60% 이상의 주활성 항체 및 20% 이하의 염기성 이성질 항체를 포함하는 항체 집단을 제조하였다.
본 발명에서 용어, "항체"는 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질로서, 특정한 항원과 특이적으로 결합하여 림프와 혈액을 떠돌며 항원-항체반응을 일으키는 물질을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 항체는 고품질로 정제되기 위한 단백질의 하나로서, 본 발명에 따른 방법에 의하여 효율적으로 정제될 수 있다.
상기 항체는 일반적으로 등전점이 다른 단백질에 비하여 높으므로, 초기 양이온 교환수지를 사용하여 배양 상등액을 컬럼에 흡착시킨 후 용출시키면 비교적 고순도로 일차 정제할 수 있다. 상기 등전점(isoelectric point, pI)은 단백질 분자표면의 평균 실효 하전, 즉 단백질 분자의 전기 이중 층의 전위가 0이 되는 pH 값으로서, 단백질의 기가 해리하여 양, 음이온기의 수가 동수로 되어 실효 하전이 0이 되는 점을 의미한다. 본 발명에서 정제되기 위한 항체는 이에 제한되지는 않으나, 등전점이 상세하게는 7 내지 10일 수 있으며, 보다 상세하게는 7 내지 9인 항체일 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 이에 제한되지는 않으나, 상세하게는 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 치료용 항체를 모두 포함할 수 있다. 보다 상세하게는 TNF-α 억제제인 아달리무맙(Adalimumab) 일 수 있다. 상기 아달리무맙은 휴미라(Humira) 라고도 하며, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 크론병, 궤양성 대장염, 건선 등에 대한 치료제로 알려져 있는 미국 AbbVie사에서 개발한 TNF-α 억제제 항체이다.
본 발명에서 용어, "주활성 항체"는 본 발명의 항체 집단에 포함되는 주요 구성요소로서, 항체 중에서 일부 아미노산이 탈아민이나 산화에 의해 변형(modification)되어 생물학적 활성이 낮아지지 않은 상태의 항체, 즉 산성 또는 염기성 이성질 항체가 아닌 항체를 의미한다. 상기 주활성 항체는 목적하는 항체 집단의 품질을 조절하기 위해 가장 중요한 구성요소로, 항체의 구성요소 중 생물학적 활성이 가장 높은 항체이다.
본 발명에서 용어, “이성질 항체”는 주활성 항체의 일부 아미노산이 탈아민이나 산화에 의해 변형된 항체를 의미하며, 산성 이성질 항체 및 염기성 이성질 항체를 포함한다. 그 예로, 아미노산 중 아스파라긴(Asparagine)이 탈아민되어 아스파테이트(Aspatate)가 된 이성질 항체, 아미노산 중 메치오닌(methionine)이 산화되어 메치오닌셀페이트(Methionine sulfate)가 된 이성질 항체 등이 있다. 또한, 중쇄의 N 말단에 글루타메이트(glutamate)가 존재하는 경우, 상기 글루타메이트가 오각형 링 구조를 형성하여 파이루글루타메이트(Pyruglutamate)로 변형된 이성질 항체를 포함한다. 상기 이성질 항체들은 CHO 세포와 같은 숙주세포에서 항체를 생성하는 경우에 높은 비율로 숙주세포 배양액에 포함되어 있어, 크로마토그래피와 같은 과정을 통하여 제거되어 목적하는 비율로 항체 집단에 포함되어야 한다.
따라서, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 도입된 숙주세포에서, 고품질의 항체 집단을 제조하기 위해서는 상기와 같은 이성질 항체가 적절히 제거되어 주활성 항체 및 이성질 항체가 원하는 함량으로 포함되어야 할 필요성이 있다. 또한, 고순도의 항체 집단을 제조하기 위해서는 숙주세포 단백질(HCP), 숙주세포 유래 DNA(HCD) 및 세포생장을 위한 인자와 같은 불순물이 제거되어야 한다. 이에 본 발명에서는 상기 이성질 항체의 함량 조절뿐만 아니라, 숙주세포 단백질과 같은 불순물이 효과적으로 제거된, 항체 집단의 제조 방법을 개발하였다.
특히, 본 발명에 따른 방법은 위와 같이 고순도 및 고품질의 항체 집단을 제공하면서도, 공정 자동화를 이룰 수 있을 뿐만 아니라 생산 단가 및 제조 시간을 크게 감소시켰다는 점에서 우수한 장점을 가지는 방법을 제공한다. 또한, 바이러스 불활성화 및 제거능 측면에서 본 발명에 따른 정제 공정을 이용하면 예기치 않은 바이러스 발현 또는 오염이 있더라도 이의 제거가 가능하다.
본 발명에 따른 항체 집단의 제조 방법은 (a) 항체의 혼합액을 포함하는 시료를, 평형화된 양이온 교환 컬럼에 로딩하고, 상기 양이온 교환 컬럼을 세척한 후, 컬럼에 결합된 항체를 용출 완충액으로 용출시키는 것을 포함하는, 항체의 혼합액을 포함하는 시료로부터 숙주세포 단백질(HCP) 및 이성질 항체를 제거하는 단계;를 포함한다.
(a) 단계의 방법은 항체의 혼합액을 포함하는 시료로부터 숙주세포 단백질 및 이성질 항체가 제거된 항체를 포함하는 항체 용출액을 수집하는 단계이다.
본 발명에서 용어, "항체의 혼합액을 포함하는 시료"는 항체를 생산하는 세포의 배양 상등액 또는 상기 세포의 파쇄물로부터 부분 정제된 시료로서, 주활성 항체, 이성질 항체를 모두 포함하는 항체의 혼합액을 포함하는 부분 정제된 시료를 의미한다. 상기 부분정제는 여과 과정을 수행하였으나 항체 외의 다른 단백질도 존재하는 상태를 의미한다.
상기 항체의 혼합액을 포함하는 시료는 숙주세포를 배양하여 목적 항체를 생산시키고, 상기 숙주세포를 제거하여 배양 상등액을 준비하는 단계; 및 상기 배양 상등액의 pH를 목적 항체의 등전점보다 낮은 pH, 상세하게는 pH 4 내지 6으로 조절하여 침전시킨, 침전물을 제거하는 단계를 순차적으로 수행하여 제조되는 것을 특징으로 한다. 즉, 항체의 혼합액을 포함하는 시료는, 배양 상등액의 pH를 4 내지 6으로 조절하여 침전된 침전물을 제거하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것일 수 있다.
pH를 감소시킨 다음 세포를 제거하여 시료를 제조하는 경우, pH 감소에 의하여 세포의 사멸이 촉진되어, 숙주세포 단백질 함량이 높아지는 단점을 지닌다. 이에 따라, 세포를 제거한 다음 배양 상등액의 pH를 조절하는 시료 제조 방법이 숙주세포 단백질의 함량을 낮추는데 보다 유리하다. 따라서, 본 발명에서 상세하게는 세포를 제거한 다음 배양 상등액의 pH를 조절하는 시료 제조 방법으로 제조된 시료를 사용한다.
상기 세포의 제거 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 상세하게는 필터, 보다 상세하게는 여과 필터를 사용할 수 있다.
상기 항체의 혼합액을 포함하는 시료는 양이온 교환 컬럼 주입 전에 5 내지 7mS/cm의 전도도를 가지도록 조절된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 실시예에서는 컬럼 주입 전에 전처리한 상등액에 정제수를 첨가하여 전도도를 조절하였다.
본 발명에 따르면, 배양액에서 1차 여과필터를 거쳐 세포를 제거하고 회수된 배양 상등액을 다시 pH 5로 낮추어 재여과하는 과정에서 숙주세포 단백질의 함량이 현저히 적고 탁도 분석에서도 우수한 효과를 나타내었다.
또한, pH를 감소시켜 형성된 상기 침전물에는 숙주세포 단백질이 다량 함유되어 있어 이를 제거하면 숙주세포 단백질의 함량을 낮출 수 있다. 상기 침전물의 제거는 양이온 교환 컬럼에 항체를 흡착시키기 위한 이전 단계로서, 항체의 경우 등전점이 높으므로 pH를 낮춘 산성 조건에서 응집이 되지 않는 반면, 일반적으로 항체보다 등전점이 낮은 숙주세포 단백질(HCP)들의 경우 pH를 낮춘 산성 조건에서 전하가 제거되어 반 데르 발스(van der waals) 힘에 의해 응집이 되므로 다량 침전될 수 있다. 따라서, 상기 감소시키는 배양 상등액의 pH 범위는 제거해야 하는 숙주세포 단백질의 침전을 증가시키기 위해 본 발명에서 정제하고자 하는 항체의 등전점보다 낮음과 동시에 상기 숙주세포 단백질의 등전점에 가까운 값을 사용할 수 있다. 즉, 상기 pH는 정제하고자 하는 항체의 등전점보다 상세하게는 1 내지 6 작은 값일 수 있으며, 보다 상세하게는 2 내지 5 작은 값일 수 있다. 따라서, 상기 pH는 최종적으로 상세하게는 3 내지 7일 수 있으며, 보다 상세하게는 4 내지 6일 수 있으며, 더욱 상세하게는 4.5 내지 5.5일 수 있다. 이때, 침전물은 제균 필터와 같은 당업계에 통상적으로 사용되는 필터 등을 이용하여 제거될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 pH를 5로 감소시켜 침전물을 제거할 경우 순도가 높은 전처리 단계를 수행할 수 있음을 확인하였다. 상기와 같은 전처리 단계를 통하여 침전물을 제거하면 이후의 양이온 교환 컬럼, 소수성 상호작용 컬럼, 음이온 교환 컬럼을 이용한 정제 단계에서 보다 효율적인 항체 집단의 정제를 가져올 수 있다.
(a) 단계에서는 위와 같이 준비된 항체의 혼합액을 포함하는 시료를 양이온 교환 컬럼에 주입하고, 양이온 교환 컬럼을 세척하여 이성질 항체 및 숙주세포 단백질을 제거한 다음, 컬럼에 결합된 항체를 용출시킨다.
본 발명에서 용어, "양이온 교환 컬럼"은 양이온 교환 수지를 충진한 컬럼을 의미하며, 상기 단계에서는 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 불순물, 상세하게는 숙주세포 단백질 및 이성질 항체를 제거할 수 있다. 상기 양이온 교환 수지는 수용액 속의 양이온과 자신의 양이온을 교환하는 역할을 하는 합성수지로서, 항체의 경우 등전점이 높으므로 등전점 값 이하의 pH 완충액에서는 양이온을 띠게 된다. 따라서, 상기 양이온을 띠는 항체를 흡착할 수 있는 양이온 교환 수지를 이용하여 항체 집단의 품질을 높일 수 있다. 상기 양이온 교환 수지는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 상세하게는 COO- 또는 SO3의 작용기를 가지고 있는 컬럼을 사용할 수 있으며, 보다 상세하게는 카복시메틸(CM), 프락토젤(fractogel), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 또는 설포네이트(S) 등을 사용할 수 있으며, 보다 더 상세하게는 프락토젤(fractogel) SO3 -(s), POROS XS, POROS HS, 카복시메틸 세파로오스(CM sepharose) 또는 프락토젤(fractogel) COO-를 사용할 수 있다.
상기 (a) 단계는 숙주세포 단백질 및 목적 항체의 이성질 항체를 동시에 제거하는 것을 특징으로 한다.
이때 상기 숙주세포 단백질은 정제하고자 하는 항체를 제외한 불순물을 모두 포함할 수 있으며, 숙주세포 단백질 자체만이 아닌 숙주세포에서 유래한 DNA 및 세포생장을 위한 인자 등을 모두 포함할 수 있다. 따라서, 상기 숙주세포 단백질을 제거하면 정제하고자 하는 항체만을 고순도로 정제할 수 있다.
또한, 상기 단계는 품질조절을 위하여 이성질 항체를 제거하는 단계임을 특징으로 한다. 상기 이성질 항체는 산성 이성질 항체 및/또는 염기성 이성질 항체일 수 있다. 숙주세포를 통해 발현되는 항체 생성물에는 여러 이성질 항체들이 존재하므로, 항체 바이오시밀러를 제조하기 위해서는 대조약과 가장 유사하게 품질을 만드는 것이 동질성 입증 측면에서 중요하다. 상기 이성질 항체들은 주활성 항체의 몇 개의 아미노산의 변형된 형태로, 주활성 항체, 산성 이성질 항체 및 염기성 이성질 항체 간에 전하(charge)의 미세한 차이가 있다. 따라서, 이 전하 차이를 이용하여 이성질 항체를 분리할 수 있다. 다만, 상기 전하차는 단지 몇 개의 아미노산에 의한 미세한 차이이므로 분리를 위해서는 매우 세밀한 조건 설정이 필요하다. 따라서, 본 발명에서는 상기 산성 이성질 항체 및 염기성 이성질 항체의 효과적인 제거를 위하여 양이온 교환 컬럼을 이용하는 것이다. 즉, 본 발명에 따른 방법은 앙이온 교환 컬럼을 이용함으로써, charge variant를 원하는 비율로 조절할 수 있다는 점에서 또한 우수한 장점을 가진다.
또한, 상기 이성질 항체들은 항체에서 일부 아미노산이 탈아민이나 산화에 의해 변형된 것으로서, 이성질 항체마다 생물학적 활성이 차이가 있다고 알려져 있어, 상기 이성질 항체들의 함량 분포를 일정하게 가져가는 것이 일관된 품질을 유지하기 위해 중요하다. 그러나, 항체를 생산하는 숙주세포 배양 상등액은 일반적으로 주활성 항체와 비교했을 때 산성 및 염기성 이성질 항체의 함량이 상대적으로 높게 나오므로, 이를 일부 제거하여 3개 형태 항체의 함량을 맞추어야 하는 필요가 있으며, 본 발명에서는 항체 집단 중에서 주활성 항체의 비율은 50%, 상세하게 60% 이상으로 포함되도록 항체 집단을 제조한다. 또한, 본 발명의 방법은 주활성 항체의 비율은 60% 이상이며, 염기성 이성질 항체의 비율은 20% 이하이며, 및 산성 이성질 항체의 비율은 20% 이하가 되도록 제조할 수 있다.
상기 (a) 단계에서 항체의 혼합액을 포함하는 시료를, 평형화된 양이온 교환 컬럼에 로딩하는 단계는 pH 4.5 내지 5.5의 15mM 내지 30mM의 아세트산염 및 35 mM 내지 45 mM의 염화나트륨을 포함하는, 평형 완충액을 사용하는 것일 수 있다.
구체적으로, pH 4.5 내지 5.5의 15mM 내지 30mM의 아세트산염 및 35 mM 내지 45 mM의 염화나트륨을 포함하는, 평형 완충액으로 평형화된 프락토젤 COO- 컬럼에, 항체의 혼합액을 포함하는 시료를 로딩하는 단계일 수 있다. 상기 평형 완충액의 경우 5 내지 7 mS/cm, 상세하게 5.5 내지 6.5 mS/cm, 보다 상세하게 약 6.0 mS/cm의 전도도를 가지는 것일 수 있다. 이러한 평형화의 경우 약 11 컬럼 부피 이상, 상세하게는 14 컬럼 부피로 상기 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 실시예에 따르면, 6.0 mS/cm의 전도도를 가지는 pH 5.0의 20 mM의 아세트산염 및 40 mM의 염화나트륨을 포함하는, 평형 완충액으로 평형화된 프락토젤 COO- 컬럼에, 항체의 혼합액을 포함하는 시료를 로딩하여 양이온 교환 컬럼으로 정제 공정을 시작하였다.
상기 (a) 단계에서 세척 단계는 상세하게는 컬럼에서 붙지 않은 항체를 부착시키는 제1 세척 단계; 및 산성 이성질 항체를 제거하는 제2 세척 단계; 의 2 단계를 포함할 수 있다.
기존에 알려진 양이온 교환 컬럼 이용 방식에 따르면, 여러 단계의 세척 단계를 포함하면서 각 단계마다 이용되는 완충액의 조성 및 pH와 전도도를 크게 달리하였다.
반면, 본 발명에서는 오직 2 단계의 세척 단계와 조성이 단순한 완충액들을 사용함으로써 제조 공정 측면에서 단가 절감 및 제조 공정의 자동화를 이룰 수 있게 하였다.
구체적으로, 본 발명에 따른 세척 단계는 1) pH 4.5 내지 5.5의 15mM 내지 30mM의 아세트산염 및 35mM 내지 45mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 제1 세척하는 단계; 및 2) pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 55 내지 59mM, 상세하게는 57mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 제2 세척하는 단계;로 이루어질 수 있다.
본 발명에서의 제1 세척 공정은 로딩하는 단계에서 사용된 완충액과 동일 성분을 포함하는 pH 4.5 내지 5.5의 15mM 내지 30mM의 아세트산염 및 35mM 내지 45mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 제1 세척을 수행하는 것일 수 있다. 이에 따라, 별도의 완충액 제조 공정이 필요하지 않으며, 연속적인 공정을 통해 컬럼에서 붙지 않은 항체를 추가로 부착시킬 수 있다는 점에서 장점을 가진다. 이러한 제1 세척의 경우 약 3 내지 7 컬럼 부피, 상세하게는 약 5 컬럼 부피로 상기 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서의 제2 세척 공정은 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 55 내지 59 mM, 상세하게는 57mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 제2 세척을 수행하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 제2 세척 공정 및 하기 이어지는 용출(탈착) 공정은 2가지 완충액의 처리 비율을 달리하면서 양이온 교환 컬럼에서 정제를 수행하게 한다. 기존 선행기술들에서 세척 및 평형화 단계를 반복하는 것, 또는 4회 이상의 연속적인 세척 공정을 별개의 조성을 가지는 완충액들로 수행하는 것과 달리, 본 발명에서는 2가지 완충액의 비율만을 조절하는 것으로 (a) 단계의 정제 공정을 간편하게 진행할 수 있다. 이에 따라, 제조 공정 측면에서 단가 절감 및 제조 공정의 단순화를 이룰 수 있는 장점을 가진다.
즉, 본 발명에서 (a) 단계의 세척 및 용출 공정은 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 완충액을 일정하게 포함하고, 염화나트륨의 몰농도를 증가시키면서 수행될 수 있다. 즉, pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 완충액에 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 정해진 몰농도의 염화나트륨을 가지는 완충액의 혼합 비율을 변경(증가)하면서, 염화나트륨의 몰농도를 증가시켜 세척 및 탈착 공정을 수행하도록 한다.
예컨대, 본 발명의 실시양태에 따르면, 제2 세척 공정은 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염을 포함하는 제1 완충액; 및 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 100 mM의 염화나트륨을 포함하는 제2 완충액을 혼합한 것을 사용할 수 있다. 구체적으로, pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35 mM의 아세트산염을 포함하는 제1 완충액을 41 내지 45 중량%; 및 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 100mM의 염화나트륨을 포함하는 제2 완충액을 55 내지 59중량%로 혼합하여 제2 세척 공정에 필요한 완충액 조성을 만들 수 있다. 이러한 혼합의 경우 기기적으로 설정된 각 단계 별 혼합비에 따라 두 각각의 완충액 저장 공간으로부터 각 완충액의 적절한 용량을 제공함으로써 이루어질 수 있다.
본 발명의 구체적일 실시예에 따른 제2 세척 단계는 상기 제1 완충액 및 제2 완충액을 각각 43 중량% 및 57 중량%로 함께 처리하여, pH 5.5 내지 6.5의 30 mM 아세트산염 및 57mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 제2 세척 공정을 수행하게 하였다. 이러한 제2 세척의 경우 약 3 내지 17 컬럼 부피, 상세하게는 약 15 컬럼 부피 또는 0.1 AU를 나타내기 전까지 상기 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 (a) 단계에서 용출(탈착) 단계는 상세하게는 제1 용출단계; 제2 세척단계; 및 제3 용출 단계의 3 단계를 포함할 수 있다.
구체적으로, 1) pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 57 내지 63 mM, 상세하게는 60mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 항체를 제1 용출시키는 단계; 2) pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 67 내지 73 mM, 상세하게는 70mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 항체를 제2 용출시키는 단계; 및 3) pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 77 내지 83 mM, 상세하게는 80mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 항체를 제3 용출시키는 단계로 이루어질 수 있다.
본 발명에서는 앞서 제2 세척 공정에서 확인한 바와 같이, 용출 공정을 처리하는 2가지 완충액의 비율만을 조절하는 것으로 간편하게 진행할 수 있다. 이에 따라, 제조 공정 측면에서 단가 절감 및 제조 공정의 자동화를 이루었다.
(a) 단계의 용출 공정은 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 완충액을 일정하게 포함하고, 염화나트륨의 몰농도를 증가시키면서 수행될 수 있다. 즉, pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 완충액에 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 정해진 몰농도의 염화나트륨을 가지는 완충액의 혼합 비율을 변경(증가)하면서, 염화나트륨의 몰농도를 증가시켜 탈착 공정을 수행하도록 한다.
예컨대, 본 발명의 실시양태에 따르면, 용출 공정에서 이용되는 완충액은 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염을 포함하는 제1 완충액; 및 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 100 mM의 염화나트륨을 포함하는 제2 완충액을 혼합한 것일 수 있다.
구체적으로, 제1 용출 공정에서 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염을 포함하는 제1 완충액을 37 내지 43 중량%; 및 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 100 mM의 염화나트륨을 포함하는 제2 완충액을 57 내지 63 중량%로 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 제2 용출 공정에서 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염을 포함하는 제1 완충액을 27 내지 33 중량%; 및 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 100 mM의 염화나트륨을 포함하는 제2 완충액을 67 내지 73 중량%로 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 제3 용출 공정에서 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염을 포함하는 제1 완충액을 17 내지 23 중량%; 및 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 100 mM의 염화나트륨을 포함하는 제2 완충액을 77 내지 83 중량%로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적일 실시예에 따른 제1 용출 단계는 상기 제1 완충액 및 제2 완충액을 각각 40 중량% 및 60 중량%로 함께 처리하여, pH 5.5 내지 6.5의 30 mM 아세트산염 및 60 mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 제1 용출 공정을 수행하게 하였다. 이러한 제1 용출의 경우 약 5 내지 20 컬럼 부피, 상세하게는 약 7 내지 17 컬럼 부피, 보다 상세하게는, 약 8 내지 15 컬럼 부피로 상기 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적일 실시예에 따른 제2 용출 단계는 상기 제1 완충액 및 제2 완충액을 각각 30 중량% 및 70 중량%로 함께 처리하여, pH 5.5 내지 6.5의 30 mM 아세트산염 및 70 mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 제2 용출 공정을 수행하게 하였다. 이러한 제2 용출의 경우 약 7 내지 20 컬럼 부피, 상세하게는 약 8 내지 17 컬럼 부피, 보다 상세하게는 9 내지 15 컬럼 부피로 상기 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적일 실시예에 따른 제3 용출 단계는 상기 제1 완충액 및 제2 완충액을 각각 20 중량% 및 80 중량%로 함께 처리하여, pH 5.5 내지 6.5의 30 mM 아세트산염 및 80 mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 제3 용출 공정을 수행하게 하였다. 이러한 제3 용출의 경우 약 6 내지 18 컬럼 부피, 상세하게는 약 8 내지 16 컬럼 부피, 보다 상세하게는 9 내지 14 컬럼 부피 또는 0.1 AU까지 상기 완충액을 사용하는 것이 바람직하다.
즉, 본 발명에 따른, (a) 항체의 혼합액을 포함하는 시료를, 평형화된 양이온 교환 컬럼에 로딩하고, 상기 양이온 교환 컬럼을 세척한 후, 컬럼에 결합된 항체를 용출 완충액으로 용출시키는 것을 포함하는, 항체의 혼합액을 포함하는 시료로부터 숙주세포 단백질(HCP) 및 이성질 항체를 제거하는 단계는 구체적으로 상기 로딩, 세척 및 용출 단계에 있어서 하기를 포함할 수 있다:
1) pH 4.5 내지 5.5의 15mM 내지 30mM의 아세트산염 및 35 mM 내지 45 mM의 염화나트륨을 포함하는, 평형 완충액으로 평형화된 프락토젤 COO- 컬럼에, 항체의 혼합액을 포함하는 시료를 로딩하는 단계;
2) pH 4.5 내지 5.5의 15mM 내지 30mM의 아세트산염 및 35mM 내지 45mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 제1 세척하는 단계;
3) pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 55 내지 59 mM, 상세하게는 57mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 제2 세척하는 단계;
4) pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 57 내지 63 mM, 상세하게는 60mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 항체를 제1 용출시키는 단계;
5) pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 67 내지 73 mM, 상세하게는 70mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 항체를 제2 용출시키는 단계; 및
6) pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 77 내지 83 mM, 상세하게는 80mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 항체를 제3 용출시키는 단계.
본 발명의 실시예에서는 상기 단계를 포함하는 평형화 및 로딩; 제1 세척; 제2 세척; 제1 용출; 제2 용출; 및 제3 용출의 단계를 거쳐 항체를 정제함으로써 숙주 유래 단백질 및 DNA을 크게 감소시키면서 높은 주활성 항체의 함량을 가지는 항체를 정제하였다.
상기 방법에서 이성질 항체의 제거를 위한 방법은, 산성 이성질 항체 및 염기성 이성질 항체를 동시에 제거하기 위해 상세하게는 프락토젤(fractogel) COO-를 사용할 수 있다.
산성 이성질 항체와 함께 염기성 이성질 항체가 많이 섞여 있는 경우에는 염기성 이성질 항체의 제거에도 분리능을 가지는 양이온 교환 컬럼을 필요로 하는데, 이 경우 합성 중합체인 메타 아크릴레이트 중합수지를 지지체로 구성하고 있는 프락토젤(fractogel) COO-를 이용하여 산성 이성질 항체와 염기성 이성질 항체의 제거를 동시에 수행하는 것이 바람직하다.
본 실시예에 따른 양이온 교환 크로마토크래피에 있어서 Flow rate 역시 180 cm/hr로 기존에 알려진 방법들에 비해 1.5 배 이상(예를 들어, 1.55 배 내지 2.24 배 이상 빠른 유속)의 빠른 유속을 이용할 수 있다는 장점을 가진다. 이러한 빠른 유속의 경우 기존 방법과 대비하여 시간 대비 높은 생산율을 가질 수 있도록 하게 한다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계 이후 (b) 단계를 수행하기 전에 바이러스를 불활성화 하는 단계를 포함할 수 있다.
구체적으로, 바이러스 불활성화는 상기 용출액에 함유된 바이러스가 비기능성이 되도록 하거나, 상기 용출액에서 바이러스를 제거하는 것을 포함한다. 바이러스를 비기능성이 되게 하거나 바이러스를 제거하는 방법에는 열 불활성화, pH 불활성화, 또는 화학적 불활성화 방법 등이 포함되며, 상세하게는 pH 불활성화 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 pH 불활성화 방법은, 바이러스가 비기능성이 충분히 될 수 있을 정도의 pH로 처리하는 방법으로, 이러한 pH 불활성화의 방법은 저-pH 바이러스 불활성화 방법을 포함하며, 상기 방법은 (a)단계에서 용출된 항체 용출액을, pH 3.0 내지 4.0의 범위, 상세하게는 pH 3.8에서 적정함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, (a) 단계에서 용출된 항체 용출액은 60% 이상의 주활성 항체, 20% 이하의 산성 이성질 항체, 및 20% 이하 염기성 이성질 항체를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 항체 집단의 제조방법은 (b) 상기 (a) 단계에서 용출된 항체 용출액에 염을 혼합한 시료를 소수성 상호작용 컬럼에 로딩하고, 컬럼에 결합된 항체를 용출 완충액으로 용출시키는 것을 포함하는, 항체 용출액으로부터 숙주세포 단백질(HCP) 및 잔류 DNA (Residual DNA)를 제거하는 단계;를 포함한다.
본 발명의 방법에서, (b) 단계의 방법은 (a) 단계에서 수집된 항체 용출액으로부터 숙주세포 단백질 및 잔류 DNA (Residual DNA)가 더 제거된 항체 용출액을 수집하는 단계이다.
상기 (a) 단계에서 수집된 항체 용출액은 수집된 용출액 그 자체 또는 추가로 다른 완충액으로 희석된 형태일 수 있다. 또한, 앞서 언급한 바와 같이, 바이러스를 불활성화하는 단계를 거친 용출액 시료일수도 있다. 본 발명에서 상기 소수성 상호작용 컬럼에 로딩되는 시료는 (a) 단계에서 용출된 항체 용출액에 염을 추가함으로써 제조될 수 있다. 상기 소수성 상호작용 컬럼에 로딩되는 시료에 포함되는 염의 종류는 특별히 제한되지 않으나, 본 발명의 실시예에서는 시트르산염을 사용하였다. 또한, 상기 시료는 (b) 단계의 소수성 상호작용 컬럼의 평형 완충액의 염 농도에 대해 0.8배 내지 1.2배의 염 농도를 가지도록 조절한 시료일 수 있으며, 상세하게는 (a) 단계의 항체 용출액의 염 농도를 평형 완충액과 동일한 염 농도를 가지도록 조절한 시료일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 (b) 단계의 용출 단계는 농도 구배 방식으로 컬럼에 부착된 항체를 용출하는 것을 포함한다. 본 발명의 실시예에서는 단계 방식보다 농도 구배 방법이 수율 및 용출 부피 면에서 유리함을 확인하였다.
상기 (b) 단계는 (a) 단계에서 제거하지 못한 숙주세포 단백질, 잔류 DNA (Residual DNA) 등의 불순물을 제거하여 순도를 보다 높이기 위한 목적을 가지며 (a) 정제 단계의 양이온 교환 컬럼과 분리기전이 다른, 소수성 차이에 의해 숙주세포 단백질을 제거할 수 있는 소수성 상호작용 컬럼을 이용한 정제단계를 제공한다.
본 발명에서 용어, "소수성 상호작용 컬럼"은 소수성 상호작용 수지를 충진한 컬럼을 의미하며, 상기 단계에서는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하여 불순물, 상세하게는 숙주세포 단백질을 제거할 수 있는 컬럼을 의미한다. 단백질은 전체적으로 친수성이지만 친수성과 함께 소수성을 가지고 있는 영역이 있으며, 이들 영역의 소수적 성질은 정전적 상호작용이 강한 조건하에서는 발현되지 않지만 용매의 이온강도 혹은 유전율을 높여 정전적 상호작용을 약하게 하면 상대적으로 강하게 발현되는 특징이 있다. 여기서 소수성 리간드(긴 탄화수소사슬 또는 방향환)를 친수성 크로마토그래피용 기재(아가로오스겔피즈, 유기계 고분자지지체 등)에 도입하여 진한 염농도로 평형화시켜 두면 여러 가지 단백질을 흡착할 수 있으며, 그 후 염농도를 내리면 단백질의 성질에 따라 용출하기 때문에 분리할 수 있다. 즉, 염을 이용하여 소수성 환경이 제공될 경우 단백질 각각의 소수성의 차이에 의해 특정 컬럼에 흡착되는 강도의 차이가 나게 되며, 이러한 원리를 이용하여 소수성 상호작용 컬럼을 이용한 숙주세포 단백질 및 잔류 DNA (Residual DNA)를 제거하는 상기 (b) 단계를 수행할 수 있다.
상기 소수성 상호작용 수지는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 상세하게는 페닐 컬럼, 부틸 컬럼, 페닐 세파로오스(phenyl sepharose) 또는 프락토젤 EMA 페닐 컬럼 등을 사용할 수 있으며, 보다 상세하게는 페닐 세파로오스를 사용할 수 있다.
또한, 상기 (b) 단계는 25mM 내지 35mM 아세트산염(pH 5.5 내지 6.5) 및 0.3M 내지 1.0M 시트르산염을 포함하는 평형 완충액으로 평형화된 소수성 상호작용 컬럼에, (a) 단계에서 용출된 항체 용출액을 평형 완충액과 동일한 시트르산염 농도로 맞춘 시료를 로딩하고, 25mM 내지 35mM의 아세트산염(pH 5.5 내지 6.5)을 포함하는 용출 완충액을 농도 구배 방식으로 적용하여, 항체를 용출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 완충액으로 pH 6.0 조건의 아세트산염 완충액을 사용하였을 경우에 수율이 높음을 확인하였으며, 용출방법에서도 완충액의 농도 구배를 이용하는 방법이 수율이 우수함을 확인하여, 농도 구배 방식을 이용하는 본 제조 방법의 상기 단계가 고순도의 항체 집단의 제조에 유용함을 확인하였다.
본 발명에 따른 항체 집단의 제조 방법은 상기 (b) 단계 이후 (c) 단계 이전에 필터를 이용하여 상기 (b) 단계의 항체 용출액을 여과하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 여과는 예를 들어 한외여과 및/또는 정용여과를 수행하는 것일 수 있다.
상세하게는 한외여과가 수행될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "한외여과(ultrafiltration)" 또는 "UF"는 용매 또는 소형 용질 분자를 통과시키면서 거대분자를 유지시키는 반투과성 막으로 용액 또는 현탁액을 처리하는 임의의 기술을 의미한다. 한외여과는 용액 또는 현탁액에서 거대분자의 농도를 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
또한, 상세하게는 정용여과가 수행될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "정용여과(diafiltration)" 또는 "DF"는, 가용성 투과물(permeate) 성분을 감소시키기 위해 잔류물(retentate)을 용매로 희석하여 재여과하는 특화된 여과 부류를 의미하기 위해 사용된다. 정용여과는, 예를 들면, 단백질을 포함하는 보유된 성분의 농도 증가를 유도하거나 유도하지 않을 수 있다. 예를 들면, 연속 정용여과에서, 용매는 여액의 생성 속도와 동일한 속도로 잔류물에 연속적으로 첨가된다. 이 경우, 잔류물 용적 및 보유된 성분의 농도는 공정 동안 변화되지 않는다. 한편, 불연속 또는 순차 희석 정용여과에서, 한외여과 단계는 잔류물 측에 용매의 첨가를 수반하고; 잔류물에 첨가된 용매의 용적이 생성된 여액의 용적 이상인 경우, 보유된 성분은 높은 농도를 가질 것이다. 정용여과는 pH, 이온 강도, 염 조성, 완충제 조성, 또는 거대 분자의 용액 또는 현탁액의 기타 특성을 변경하기 위해 사용될 수 있다.
이러한 1차 여과 공정을 통하여, 숙주세포 단백질의 함량을 더 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따른 항체 집단의 제조 방법은 (c) 상기 (b) 단계의 숙주세포 단백질(HCP) 및 잔류 DNA가 제거된 항체 용출액을 음이온 교환 컬럼에 통과시켜 통과액(flow-through)을 수집하는 것을 포함하는, 숙주세포 단백질(HCP) 및 잔류 DNA (Residual DNA)을 제거하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에서, (c) 단계의 방법은 (b) 단계에서 수집한 항체 용출액으로부터 불순물이 제거된 원하는 항체 집단을 수집하는 단계로, 구체적으로 상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계의 숙주세포 단백질(HCP) 및 잔류 DNA (Residual DNA)이 제거된 항체 용출액을 음이온 교환 컬럼에 통과시켜 통과액(flow-through)을 수집하는 단계이다. 또한, 상기 (b) 단계에서 수집된 항체 용출액은 수집된 용출액 그 자체 또는 추가로 다른 완충액으로 희석된 형태, 여과 공정 등을 추가로 수행한 형태 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "음이온 교환 컬럼"은 음이온 교환 수지를 충진한 컬럼을 의미하며, 상기 단계에서는 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 불순물, 상세하게는 숙주세포 단백질을 제거할 수 있는 컬럼을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 음이온 교환 수지는 수용액 속의 특정 음이온과 자신의 음이온을 교환하는 역할을 하는 합성수지로서, 음이온 교환 컬럼은 등전점 이상에서 음이온을 띠는 단백질을 흡착시킬 수 있다. 항체의 경우 등전점이 높으므로 중성 pH의 완충액을 사용할 경우 항체가 음이온 교환 수지에는 붙지 않고 빠져나오게 되나, 숙주세포 단백질을 포함한 불순물들은 등전점이 낮으므로 음이온 교환 수지에 흡착되어 제거될 수 있어, 상기 원리를 이용하여 고순도의 항제 집단의 제조에 이용될 수 있다.
상기 음이온 교환 수지는 당업계에서 통상적으로 사용되는 것을 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 상세하게는 큐 세파로오스(Q sepharose), 4급 아미노에틸 또는 4급 아민(Q) 등을 사용할 수 있으며, 보다 상세하게는 Q Fast Flow를 사용할 수 있다.
또한, 상기 방법은 목적 항체의 pI보다 낮은 pH를 갖는 평형 완충액, 상세하게는 pH 7.0 내지 8.0의 평형 완충액, 더욱 상세하게는 트리스 염화수소(pH 7.0 내지 8.0)를 포함하는 평형 완충액을 이용하는 것일 수 있다.
상기 단계에서 제거되는 숙주세포 단백질은 상기에서 언급한 바와 같이 정제하고자 하는 항체를 제외한 불순물을 모두 포함하는 개념이며, 숙주세포 단백질 자체만이 아닌 숙주세포에서 유래한 DNA 및 세포생장을 위한 인자 등을 모두 포함할 수 있다. 따라서, 본 단계에서 숙주세포 단백질을 제거하면 정제하고자 하는 항체만을 고순도로 정제할 수 있다. 또한, 상기 음이온 교환 컬럼은 숙주세포 단백질뿐만 아니라 엔도톡신의 제거에도 효율적인 컬럼이므로, 최종 정제 단계에서 숙주세포 단백질과 함께 엔도톡신을 제거하여 순도가 높은 목적하는 항체 집단을 정제할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 집단의 제조 방법은 (d) 상기 (c) 단계에서 통과액(flow-through)을 바이러스 필터에 통과시켜 바이러스를 제거하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 항체 집단의 제조 방법은 기존의 선행기술에서의 일반적인 방법들과 달리 한외여과, 정용여과 및/또는 다층여과 필터 등을 이용하여 필터를 수행하기 전에 바이러스 필터링을 수행하는 것이다. 기존의 일반적인 방식들은 한외여과, 정용여과 및 다층여과 필터를 이용하여 필터링을 수행한 후 바이러스 필터링을 수행하기 때문에 높은 농도의 약물을 조제하는데 어려움이 있었다. 반면, 본 발명에 따른 방법은 바이러스 필터링을 먼저 수행함으로써 한외여과, 정용여과 및/또는 다층여과 필터 단계에 Loading 양을 줄여 단백질 품질 확보와 동시에 수율 손실을 낮추고, 높은 농도의 약물 조제가 용이하다는 장점을 가진다.
구체적으로, 본 발명에서 바이러스 필터는 Modus 1.3 (Merck 제품)을 사용할 수 있다. 상세하게는 해당 재질은 PES 재질을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 항체 집단의 제조방법은 (e) 상기 (d) 단계에서 용출된 항체 용출액을 농축 및 완충액 교환하고, 잔류 DNA 및 숙주세포 단백질의 농도를 각각 10 ppb 및 10 ppm 이하로 함유하는 항체 집단을 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 상기 제조된 항체 용출액의 농축 및 완충액 교환은 제품화, 항체의 저장을 위한 통상의 농축 및 완충액 교환 공정을 의미할 수 있다.
상기 바이러스 필터가 수행된 필터된 항체를 포함하는 용액(용출된 항체 용출액)은 이어서 한외여과, 정용여과 등이 수행될 수 있다. 한외여과 및 정용여과는 앞서 살핀 바와 같다.
위와 같은 바이러스 제거 및 여과 공정을 통하여, 바이러스 불순물을 제거하고, HCP 및 잔류 DNA를 보다 더 제거할 수 있다. 또한, 이러한 후속의 한외여과, 정용여과는 농축 및/또는 버퍼 교환 등을 위해 이용될 수 있다.
완충액의 경우 통상의 항체를 저장하거나 제형 제조에 필요한 완충액 요건을 가지는 성분들을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 완충액은 약제학적으로 허용되는 부형제의 예로 본원에 참조로서 인용되는 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있는 임의의 비이온성 부형제(들) 또는 이온성 부형제(들)을 포함하여 공지된 농도의 부형제(들)를 갖는 제형을 제조하기 위한 일반적인 완충액 성분을 포함할 수 있다. 상기 완충액 교환은 예를 들면, 항체 농도 등을 변화시키지 않으면서, 비이온성 부형제, 예를 들면, 폴리소르베이트 및 폴록사머 등의 당 또는 비이온성 계면활성제 등을 포함하는 완충액으로 교환일 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 농축 및 완충액 교환이 이루어진 본 발명에 따른 항체 집단은 숙주세포 단백질의 함량은 10 ppm 이하, 예를 들어 0.0001 내지 10 ppm일 수 있으며, 보다 상세하게는 0.001 내지 5 ppm일 수 있다. 또한, 잔류 DNA는 10 ppb 이하, 예를 들어 0.0001 내지 10 ppb, 보다 상세하게는 0.001 내지 1 ppb일 수 있다.
본 발명의 따른 실시예에서는 본 발명의 항체 정제 방법에 따르면 99.9%의 고순도로 항체를 정제할 수 있음을 확인하였다. 특히, 제조된 항체 집단의 경우 잔류 DNA 및 숙주세포 단백질의 농도를 각각 0.1 ppb 및 5 ppm 이하로 함유하는 항체 집단을 포함하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된, 주활성 항체를 60% 이상 포함하는 항체 집단을 제공한다.
상기 방법, 항체 집단 및 주활성 항체를 60% 이상 포함하는 항체 집단에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에 따른 항체 집단의 제조 방법을 이용하면, 고가의 단백질 A(protein A) 컬럼을 사용하지 않고 불순물을 제거하여 고순도 및 고품질로 목적하는 항체 집단을 제조할 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 방법은 공정 자동화를 이루며 생산 단가를 크게 감소시켰다는 점에서 우수한 장점을 가지는 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명에 따른 아달리무맙 항체 제조 공정을 나타내는 흐름도이다.
도 2는 대한민국 등록특허 제10-1498771호에 기재된 방식과 유사한 방법을 통해 수행한 양이온 교환 크로마토그래피 수행 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예 2-1에 따른 양이온 교환 크로마토그래피 수행 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예 2-2에 따른 양이온 교환 크로마토그래피 수행 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 수행한 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명에 따른 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 수행한 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
이하 실시예에 따른 항체의 제조 공정의 흐름도는 도 1에 구체적으로 기재하였다. 구체적으로, 본 발명에 따른 항체를 포함하는 배양액 시료를 회수하여 필터링 후, 양이온 교환 수지를 거친다. 그리고 나서, 바이러스 불활성화를 수행하고 소수성 반응 수지를 거친다. 다음으로 1차 한외여과 후 음이온 교환 수지를 거친다. 마지막으로 바이러스 필터를 거치고 2차 한외여과 후 제형화를 수행한다. 위 간략하게 언급한 구체적 공정에 대해 이하 실시예에서 구체적으로 설명한다.
실시예 1: 항체 정제를 위한 배양액 전처리 방법
아달리무맙 항체를 발현시키는 재조합 CHO 세포를 배양하여 아달리무맙 항체를 발현시킨 후, 양이온 교환컬럼에 항체를 흡착시키기 위해 pH를 6 이하로 낮추었다.
본 실시예에서 배양액 전처리 방법에 따라 불순물 제거 정도를 확인하였다.
본 실시예에서는 세포가 포함되어 있는 배양액 상태에서 pH를 5로 낮춘 다음, 여과필터를 거쳐 양이온 교환 컬럼에 주입하기 위한 시료를 제조하는 방법을 사용하였으며, 그 구체적 조건은 표 1에 나타내었다.
순서 방법
1 배양액
2 1차 여과필터(Depth Filter) 및 2차 여과필터(제균 필터) 로 세포를 제거하여 상등액을 회수함
3 전도도 조절
4 상등액에 10% 초산을 첨가하여 pH 5로 낮춤
5 1시간 동안 상온(약 25℃)에서 저속으로 교반함
6 여과 및 제균 필터로 침전물 제거 및 제균
상기 방법에 따라 배양액을 전처리하고, 순서 (1)의 배양액, (2)의 상등액, (4)의 산 처리 후 배양액, (6)의 여과 및 제균 필터 후 전처리 배양액에 대한 탁도를 분석하였다.
그 결과, (1)의 배양액의 경우 turbidity가 6810 NTU로 확인되었고, (2)의 상등액의 경우 turbidity가 2.98 NTU로 확인되었다. 또한, (4) 산 처리 후 배양액의 경우 turbidity: 5475 NTU로 확인되었고, 최종 (6)의 여과 및 제균 필터 후 전처리 배양액의 경우 5.13 NTU로 확인되었다.
또한, 여과 단계에서 평균 Flux는 150 LMH 내외로 큰 여과 용량을 보여 배양액 전처리 단계에서 손실이 적은 것을 확인할 수 있었다.
각 단계에서 여과 처리 후 약 99% 이상의 탁도 제거율을 나타내어, 후속 단계 사용에 적합한 전처리 배양액이 제조되었음을 확인하였다.
상기 결과는 본 발명의 전처리 방법으로 초기 여과필터로 세포를 1차 제거한 후 공정을 진행하는 방법이 적합한 것을 보여준다. 또한, pH 6 이하(바람직하게는 pH 5)로 하강하여 침전물을 제거하면 초기 배양액보다 훨씬 높은 순도를 가진 배양 상등액을 얻을 수 있음을 나타내었다.
실시예 2: 양이온 교환 크로마토그래피
Protein A를 이용한 컬럼 공정을 대체할 수 있는, 양이온 교환 컬럼 중 순도와 수율 측면에서 유리한 작용기를 가진 컬럼으로 Fractogel COO-를 선정하였다.
상기 설정된 양이온 교환 컬럼을 이용하여 이성질 항체를 조절하는 실험을 실시하였으며, 그 과정은 하기와 같았다.
평형화를 위해 pH 5.0, 20 mM 아세트산염 및 40 mM 염화나트륨을 포함하는 완충액으로 14 컬럼 부피를 흘려주어 컬럼을 평형화 (6.0 mS/cm)시킨 다음, 전처리가 완료된 상등액을 CM의 흡착 용량(25mg/mL 컬럼) 이하로 로딩하였다.
로딩 후, 세척 1 완충액(pH 5.0, 20 mM 아세트산염 및 40 mM 염화나트륨을 포함하는 완충액, 6.0 mS/cm)을 5 컬럼 부피로 처리하여 컬럼에 붙지 않은 항체를 붙이고 나머지는 상등액을 세척하는 세척 1 단계를 진행하였다.
그리고 나서, 제1 완충액 (pH 6.0, 30 mM 아세트산염, 2.4 mS/cm) 및 제2 완충액(pH 6.0, 30 mM 아세트산염 및 100 mM 염화나트륨을 포함하는 완충액, 12.5 mS/cm)를 전체 15 컬럼부피로 제1 완충액에 대해 43 중량% 및 제2 완충액에 대해 57 중량%의 비율로 처리하여 세척 2단계를 수행하였다.
여기서 제1 완충액에 대해 43 중량% 및 제2 완충액에 대해 57 중량%의 비율로, 혼합된 완충액 형태로 세척 2 단계를 수행하였다.
그리고 나서, 탈착 단계를 수행하기 위하여 제1 완충액을 40 중량%, 30 중량% 및 20 중량%; 및 제2 완충액을 60 중량%, 70 중량%, 80 중량%의 3 단계로 각각 감소 및 증가시키면서 탈착 단계를 수행하였다.
각각의 혼합은 위 세척 2단계에서와 같이 우선적으로 수행된 후 혼합된 완충액을 이용하여 3단계의 용출(탈착) 단계를 수행하였다.
기존에 알려진 양이온 교환 크로마토그래피의 일방적인 방식과 다르게 본 발명에서는 사용되는 완충액 용액의 종류를 3 종으로 단순화시키면서, 세척 단계를 2 단계로 종래 기술 대비 크게 감소시켰다.
또한, 탈착을 진행하기 위한 단계 역시 제1 완충액 및 제2 완충액의 용액의 비율만을 조절하면서 반응을 수행하여, 전체 스텝의 자동화 및 단순화를 가능하게 하였다.
또한, 본 실시예에 따른 양이온 교환 크로마토크래피에 있어서 Flow rate 역시 180 cm/hr로 기존에 알려진 방법들에 비해 1.5 배 이상의 빠른 유속을 이용하였다. 이러한 빠른 유속의 경우 기존 방법과 대비하여 시간 대비 높은 생산율을 가질 수 있도록 하게 한다.
이하 본 발명에 따른 양이온 교환 수지 Fractogel COO-을 이용한 이성질 항체 정제 과정을 표 2에 구체적으로 기재하였다.
순서 완충액 단계 실시예 2-1 실시예 2-2
평형화 pH 5.0, 20 mM 아세트산염 및 40 mM 염화나트륨 14 컬럼 부피 14 컬럼 부피
로딩 전도도Con 6.4mS/cm이하, 흡착용량: 25mg/컬럼mL 이하
세척 1 pH 5.0, 20 mM 아세트산염 및 40 mM 염화나트륨 5 컬럼 부피 5 컬럼 부피
세척 2 pH 6.0, 30 mM 아세트산염 (43 %);pH 6.0, 30 mM 아세트산염 및 100 mM 염화나트륨 (57 %) 15 컬럼 부피 15 컬럼 부피
탈착 1 pH 6.0, 30 mM 아세트산염 (40 %);pH 6.0, 30 mM 아세트산염 및 100 mM 염화나트륨 (60 %) 15 컬럼 부피 8 컬럼 부피
탈착 2 pH 6.0, 30 mM 아세트산염 (30 %);pH 6.0, 30 mM 아세트산염 및 100 mM 염화나트륨 (70 %) 9 컬럼 부피 15 컬럼 부피
탈착 3 pH 6.0, 30 mM 아세트산염 (20 %);pH 6.0, 30 mM 아세트산염 및 100 mM 염화나트륨 (80 %) 14 컬럼 부피 9 컬럼 부피
스트립 2M NaCl 2 컬럼 부피 2 컬럼 부피
컬럼 재생 1M NaOH 3 컬럼 부피 3 컬럼 부피
한편, 비교를 위하여 선행 대한민국 특허 10-1498771호와 유사한 방식으로 NaCl을 포함하지 않는 평형화 단계를 추가하여 용출을 수행하였다. 구체적으로 세척 1 단계에서 전체 5 컬럼 부피로 pH 5.0, 20 mM 아세트산염 및 40 mM 염화나트륨; 세척 2 단계에서 전체 10 컬럼 부피로 pH 6.0, 30 mM 아세트산염; 탈착 1 단계에서 전체 10 컬럼 부피로 pH 6.0, 30 mM 아세트산염 및 50 mM 염화나트륨; 탈착 2 단계에서 1.5 컬럼 부피로 pH 6.0, 30 mM 아세트산염; 탈착 3 단계에서 8 컬럼 부피로 pH 6.0, 30 mM 아세트산염 및 80 mM 염화나트륨을 처리하였다(비교예).
위 실험 결과를 도 2 내지 도 4에 나타내었다.
도 2는 상기 비교예에 따른 양이온 교환 크로마토그래피 결과를 나타내며, 도 3은 본 발명에 따른 실시예 2-1의 결과를 나타내며, 도 4는 본 발명에 따른 실시예 2-2의 결과를 나타낸다.
상기 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 확인된 산성 이성질항체, 주활성 항체 및 염기성 이성질항체의 비율 및 수율을 하기 표 3에 나타내었다.
실시예 2-1 실시예 2-2 비교예
산성이성질항체 피크(%) 16~19 14~19 15~16
주활성 항체 피크(%) 66~69 65~69 68
염기성이성질 항체 피크(%) 13~15 13~19 16
수율 (%) 60~67 67~89 52~56
상기와 같은 양이온 교환 컬럼의 조건을 이용한 정제 공정은 주 활성 항체의 함량을 크게 증가시키면서 수율 또한 크게 증가시켰다.
더욱이, Elution 되는 단백질을 수집하는데까지 있어서 오직 3종의 버퍼 용액을 사용함으로써 공정 자동화를 가능하게 하였다. 이러한 장점은 항체 생산시에 버퍼의 조제 및 Footprint의 비용을 감소시키는 추가의 장점을 나타낸다.
가장 큰 장점은 위 3종의 버퍼를 순서대로 주입하며 Elution 시에 단백질을 column volume 기준으로 수집하기 때문에, 확립된 조건 하에 고수율로 항체를 수득할 수 있는 편이성이 증대되고 이는 공정 자동화에 적합하게 적용될 수 있는 것이다.
실시예 3: 바이러스 불활성화
상기 실시예 2-1 및 2-2에 따라 수득한 1차 용출액을 1M Citric acid 완충액을 첨가하여 pH 3.8에서 1시간 동안 바이러스 불활성화를 시켰다. 불활성화가 완료된 후, 2M Trizma base 완충액을 첨가하여 시료의 pH를 6.0으로 조정하였다. 바이러스 불활성화가 완료된 시료는 0.2㎛ 필터를 통과시켜 여과하였다.
실시예 4: 소수성 반응 수지
소수성 상호작용 크로마토그래피(Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)의 종류인 페닐 세파로오스(phenyl sepharose) fast flow를 이용하여 항체 정제시 순도를 높이는 공정을 수행하였다.
구체적으로, HIC를 수행하기 위하여, 상기 실시예 3의 방법으로 제조된 각각의 용출액을 이용하였다.
아세트산염 pH 6.0을 기본으로 하며 0.6M 시트르산염 농도에서 흡착시키고, 용출시 용출완충액을 5 컬럼 부피까지 농도구배(gradient)를 주어 용출시키는 방식을 이용하였다.
양이온 교환수지에서의 기본 완충액이 아세트산염 pH 6.0 이하를 이용하고 있어 pH 6.0 이하의 이용은 완충액 제조측면에서 제조공정을 단순화할 수 있는 이점이 있다.
용출방법에서 5 컬럼 부피 농도구배(gradient) 방법이 수율 면에서 우수한 결과를 나타내었고, 완충액의 경우 아세트산염 완충액 pH 6.0이 수율 및 항체의 pH 안정성 면에서도 우수하였다.
위 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC)의 구체적 조건은 하기 표 4에 나타내었다.
HIC 로딩액: Fractogel COO- (M) 용출액+
용출액과 동부피의, 60mM 아세트산염 pH 6.0 및 1.2M 시트르산염을 포함하는 완충액
평형완충액: 30mM 아세트산염 pH 6.0 +0.6M 시트르산염
용출조건: 30mM 아세트산염
(5컬럼부피 Gradient 용출)
위 조건 하에 소수성 상호 작용 크로마토그래피를 수행하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
실시예 5: 1차 한외여과
Feed pressure ≤ 1 bar 조건에서 25 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5, 2.0 mS/cm)으로 Pellicon 3 Cassette (membrane)을 평형화시키고 공정액을 10 mg/mL로 농축시켰다. 이후 완충액으로 공정액의 pH와 전도도를 7.5와 ≤ 3.0 mS/cm가 되도록 교환하여, 1차 한외여과를 수행하였다.
실시예 6: 음이온 교환 수지 크로마토그래피
본 발명의 제조 방법에서는 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 이용하여 보다 높은 순도의 항체 집단을 제조하는 공정을 규명하였다.
구체적으로, 음이온 교환 컬럼은 등전점 이상에서 음이온을 띠는 단백질을 흡착시키므로, 등전점이 7 이상인 항체의 경우(예컨대 아달리무맙의 경우, 등전점이 7 내지 10, 휴미라의 경우 대략 8.4), 중성 pH의 완충액을 사용하는 경우 본 항체는 음이온 교환 수지에는 붙지 않고 통과액(flow-through)으로 빠져나오게 된다. 이에, 본 발명의 제조 공정에 적합한 음이온 교환 수지 및 완충액 조건을 규명하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 본 실시예에서는 음이온 교환수지로서 생산스케일에서 많이 사용하고 있는 4급 아민(Quaternary amine) 계열의 Q Fast flow(QFF, GE사)를 이용하여 정제를 실시하였다. 우선, 음이온 교환수지에 로딩하기 위한 샘플준비로 배양 상등액에서 양이온 교환 컬럼, 소수성 상호작용 컬럼(HIC) 및 한외여과 1차를 거쳐 완충액을 치환하여 적정 전도도 및 pH로 준비하였다. 완충액은 25mM Tris HCl pH 7.5의 조건으로 하여 순도, 숙주세포 단백질 함량, 잔류 DNA 함량 및 수율을 확인하였다.
음이온 교환 수지를 이용한 크로마토그래피의 결과를 도 6에 나타내었다.
제조된 항체집단에서 순도는 100%, HCP 함량은 6.8 ng/mg, 잔류 DNA 함량은 0.04 pg/mg, 수율은 94 내지 97%를 나타내었다. 그 결과, 음이온 교환 수지 크로마토그래피에서 완충액은 Tris HCl을 포함하는 완충액으로서, pH는 7 내지 8인 것이 본 발명의 항체 집단의 제조에 유리하다는 것을 시사하였다.
실시예 7: 바이러스 필터링, 2차 한외여과 및 정용여과
상기 실시예 6의 음이온 교환 수지 크로마토그래피를 수행한 샘플을 바이러스 바이러스 필터 Modus 1.3 (Merck)를 이용하여 필터링을 수행하였다.
그리고 나서, 한외여과 필터 Pellicon 3 Cassette (membrane)필터로 2차 한외여과를 수행하였다. 구체적으로, Feed pressure ≤ 1 bar 조건에서 14 mM Phosphate 완충액(pH 5.2, ≥ 12.0 mS/cm)으로 Pellicon 3 Cassette (membrane)을 평형화시키고 공정액을 55.5 mg/mL로 농축시켰다. 이후 완충액으로 공정액의 pH와 전도도를 5.2와 ≥ 11.0 mS/cm가 되도록 교환하였다.
상기와 같은 바이러스 필터링은 기존의 선행특허 대한민국 10-1498771호에서의 방법과 상이하게 2차 한외여과를 수행하기 전에 바이러스 필터링을 수행하는 것이다. 위 선행특허에서, 1차 한외여과 및 2차 한외여과를 수행한 후 바이러스 필터링을 수행하기 때문에 높은 농도의 약물을 조제하는데 어려움이 있었다. 반면, 본 발명에 따른 방법은 2차 한외여과에 앞서 바이러스 필터링을 먼저 수행함으로써 2차 한외여과 단계에 Loading 양을 줄여 단백질 품질 확보와 동시에 수율 손실을 낮추고, 높은 농도의 약물 조제가 용이하다는 장점을 가진다.
실시예 8: 대량 배치에서 전체 공정에 따른 숙주 유래 단백질 (HCP) 및 DNA 함량 변화 확인
상기 실시예 1 내지 7의 절차에 따라 전체 공정에서의 숙주 유래 단백질 및 DNA 함량을 확인하였으며, 이의 결과를 아래 표 5에 나타내었다.
아래 표 5에 기재된 시료의 경우 실시예 2-2에 따른 제조 공정에 따라 수득된 시료에 대한 결과이다.
아달리무맙 시험항목 부피(kg) 농도(mg/ml) HCP함량(ng/mg) DNA함량(pg/mg)
본배양 13일차 HCP,엔도톡신,미생물 　 4.945268 17.3 N/A
본배양 Depth Filter 후 HCP,엔도톡신,미생물 187.2 3.746587 20.5 N/A
본배양 Micro Filtration 후 HCP,엔도톡신,미생물 217.9 3.788743 20.3 N/A
CEX Pool(실시예 2) HCP, Resiudal DNA 624.7 0.7 N/A 0.1
Virus Inactivation(실시예 3) HCP 655.8 0.7 N/A 0.73
HIC 공정 용출액(실시예 4) HCP, Resiudal DNA 172.6 2.4 29.4 0.09
UF/DF1 공정액(실시예 5) HCP, Resiudal DNA 48 8.1 N/A 0.11
AEX 용출액(실시예 6) HCP, Resiudal DNA 56.1 6.5 6.8 0.04
VF 공정액(실시예7 바이러스 필터) HCP, Resiudal DNA 56.8 6.2 8.1 0.03
UF/DF2 공정액(실시예7 한외여과) HCP, Resiudal DNA 6.4 54.4 1.7 0.02
DS(실시예7 최종 항체 집단) 　 7 49.2 1.6 0
상기 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 각 단계별로 HCP 함량 및 DNA 함량을 확인하였다.
그 결과, 실시예 2-2에 기재한 양이온 교환 크로마토그래피를 통하여 숙주세포 유래 DNA의 함량을 크게 감소시켰다. 그리고 나서, 바이러스 불활성화를 우선적으로 실시하고 제형 바로 전 단계에서의 한외/정용여과를 통해 단백질 품질 확보와 동시에 수율 손실을 낮추고, 높은 농도의 약물 조제가 용이하게 하였다. 또한, 상기의 일련의 단계를 통해 숙주 유래 단백질 및 DNA의 함량을 최소화시킨 항체 집단을 제조할 수 있었다
실시예 9: 대량 배치에서 전체 공정에 따른 바이러스 제거능 확인
상기 실시예 1 내지 7의 절차에 따라 진행된 전체 공정 중 Low pH treatment, Anion exchange chromatography, virus reduction filtration 공정에서의 바이러스 제거율을 확인하였으며, 이의 결과를 아래 표 6에서 나타내었다.
LOG REDUCTION FACTORS
LOW pH TREATMENT RUN 1 RUN 2
MLV(Murine leukemia virus) 6.57 ± 0.35 log10 6.61 ± 0.40 log10
PRV (Pseudorabies virus) ≥ 6.51 ± 0.34 log10 ≥6.51 ± 0.29 log10
ANION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY RUN 1 RUN 2
MLV ≥ 6.47 ± 0.38 log10 ≥ 6.55 ± 0.28 log10
PRV ≥ 6.28 ± 0.34 log10 ≥ 6.46 ± 0.38 log10
Reo 3 (Reovirus type-3) ≥ 8.47 ± 0.29 log10 ≥ 8.21 ± 0.31 log10
MMV (Mouse Minute virus) ≥ 6.49 ± 0.25 log10 ≥ 6.49 ± 0.32 log10
VIRUS REDUCTION FILTRATION RUN 1 RUN 2
MLV ≥ 5.52 ± 0.36 log10 ≥ 5.44 ± 0.25 log10
PRV ≥ 5.60 ± 0.25 log10 ≥ 5.52 ± 0.31 log10
Reo 3 ≥ 5.60 ± 0.31 log10 ≥ 5.34 ± 0.30 log10
MMV ≥ 6.05 ± 0.23 log10 ≥ 6.40 ± 0.36 log10
상기 표 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 각 단계 별로 MLV, PRV, Reo 3, MMV 바이러스의 불활성화 및 제거능을 확인하였다.
상기 결과의 경우 본 발명에 따른 공정에 의한 항체 집단에서 바이러스의 발현이 거의 없음을 보여준다. 특히, 위 각 공정들에서 바이러스 불활성화 및 제거능을 고려할 때, 본 발명에 따른 정제 공정에 예기치 않은 바이러스 발현 또는 오염이 있더라도 이의 제거가 가능함을 보여준다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (20)

  1. (a) 항체의 혼합액을 포함하는 시료를, 평형화된 양이온 교환 컬럼에 로딩하고, 상기 양이온 교환 컬럼을 세척한 후, 컬럼에 결합된 항체를 용출 완충액으로 용출시키는 것을 포함하는, 항체의 혼합액을 포함하는 시료로부터 숙주세포 단백질(HCP) 및 이성질 항체를 제거하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 용출된 항체 용출액에 염을 혼합한 시료를 소수성 상호작용 컬럼에 로딩하고, 컬럼에 결합된 항체를 용출 완충액으로 용출시키는 것을 포함하는, 항체 용출액으로부터 숙주세포 단백질(HCP) 및 잔류 DNA (Residual DNA)를 제거하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 숙주세포 단백질(HCP) 및 잔류 DNA가 제거된 항체 용출액을 음이온 교환 컬럼에 통과시켜 통과액(flow-through)을 수집하는 것을 포함하는, 숙주세포 단백질(HCP) 및 잔류 DNA (Residual DNA)을 제거하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 통과액(flow-through)을 바이러스 필터에 통과시켜 바이러스를 제거하는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계에서 용출된 항체 용출액을 농축 및 완충액 교환하고, 잔류 DNA 및 숙주세포 단백질의 농도를 각각 10 ppb 및 10 ppm 이하로 함유하는 항체 집단을 제조하는 단계;를 포함하는 항체 집단의 제조 방법으로서,
    상기 (a) 단계의 양이온 교환 컬럼 세척은 1) pH 4.5 내지 5.5의 15mM 내지 30mM의 아세트산염 및 35mM 내지 45mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 제1 세척하는 단계; 2) pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 55 내지 59 mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 제2 세척하는 단계를 포함하며,
    상기 (a) 단계의 항체 용출은 1) pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 57 내지 63 mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 항체를 제1 용출시키는 단계; 2) pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 67 내지 73 mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 항체를 제2 용출시키는 단계; 및 3) pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 77 내지 83 mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 항체를 제3 용출시키는 단계를 포함하는, 항체 집단의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 항체의 혼합액을 포함하는 시료는, 배양 상등액의 pH를 4 내지 6으로 조절하여 침전된 침전물을 제거하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 항체의 혼합액을 포함하는 시료는 용액의 전도도가 5mS/cm 내지 7mS/cm인 것인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 등전점이 7 내지 10인 것인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 아달리무맙(Adalimumab)인 것인 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 용출된 항체 용출액은 60% 이상의 주활성 항체, 20% 이하의 산성 이성질 항체, 및 20% 이하 염기성 이성질 항체를 포함하는 것인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 항체의 혼합액을 포함하는 시료를, 평형화된 양이온 교환 컬럼에 로딩하는 단계는, pH 4.5 내지 5.5의 15mM 내지 30mM의 아세트산염 및 35 mM 내지 45 mM의 염화나트륨을 포함하는, 평형 완충액으로 평형화된 프락토젤 COO- 컬럼에, 항체의 혼합액을 포함하는 시료를 로딩하는 단계를 포함하는, 방법.
  8. 삭제
  9. 제 1 항에 있어서, 제2 세척하는 단계에서 완충액은 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 완충액에 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 정해진 몰농도를 가지는 염화나트륨을 가지는 완충액을 혼합하여, 55 내지 59 mM의 염화나트륨의 몰농도를 가지도록 제조된 것인, 방법.
  10. 삭제
  11. 제 1 항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 용출시키는 단계의 완충액은
    pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 완충액에 pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 정해진 몰농도를 가지는 염화나트륨을 가지는 완충액을 혼합하여, 제1, 제2 및 제3 용출시키는 단계의 상기 정해진 염화나트륨의 몰농도를 가지도록 제조된 것인, 방법.
  12. 제 1 항에 있어서,
    상기 (a) 단계는 1) pH 4.5 내지 5.5의 15mM 내지 30mM의 아세트산염 및 35 mM 내지 45 mM의 염화나트륨을 포함하는, 평형 완충액으로 평형화된 프락토젤 COO- 컬럼에, 항체의 혼합액을 포함하는 시료를 로딩하는 단계;
    2) pH 4.5 내지 5.5의 15mM 내지 30mM의 아세트산염 및 35mM 내지 45mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 제1 세척하는 단계;
    3) pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 55 내지 59 mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 제2 세척하는 단계;
    4) pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 57 내지 63 mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 항체를 제1 용출시키는 단계;
    5) pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 67 내지 73 mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 항체를 제2 용출시키는 단계; 및
    6) pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염 및 77 내지 83 mM의 염화나트륨을 포함하는, 완충액으로 항체를 제3 용출시키는 단계인, 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 (b) 단계는 농도 구배(linear gradient) 방식으로 항체를 용출하는 것인 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 농도 구배 방식은 25mM 내지 35mM 아세트산염(pH 5.5 내지 6.5) 및 0.3M 내지 1.0M 시트르산염을 포함하는 평형 완충액으로 평형화된 소수성 상호작용 컬럼에, (a) 단계에서 용출된 항체 용출액을 평형 완충액과 동일한 시트르산염 농도로 맞춘 시료를 로딩하고, pH 5.5 내지 6.5의 25mM 내지 35mM의 아세트산염을 포함하는 용출 완충액을 농도 구배 방식으로 적용하여, 항체를 용출하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 소수성 상호작용 컬럼은 페닐 세파로오스 (Phenyl sepharose) 컬럼인 것인 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 (c) 단계의 음이온 교환 컬럼은 시료 주입 전에 pH 7.0 내지 8.0의 평형 완충액으로 평형화된 것인 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 평형 완충액은 pH 7.0 내지 8.0의 Tris-HCl을 포함하는 것인 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 (c) 단계의 음이온 교환 컬럼은 Q 패스트 플로우(Q Fast Flow) 컬럼인 것인 방법.
  19. 삭제
  20. 삭제
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