KR102087823B1 - 친화성 크로마토그래피를 이용한 항체 또는 항체절편 정제 방법 - Google Patents

Abstract

본 출원은 친화성 크로마토그래피를 이용한 고순도의 항체 또는 항체절편의 분리 및 정제 방법에 관한 것으로서, 구체적으로, 고순도의 항체 및 항체절편을 분리하고, 안정성을 증가시키기 위하여 안정성을 증대시킬 수 있는 용출버퍼를 사용하여 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

친화성 크로마토그래피를 이용한 항체 또는 항체절편 정제 방법{A method for purifying an antibody fragment or antibody using affinity chromatography}

본 출원은 친화성 크로마토그래피를 이용한 고순도의 항체 또는 항체절편의 분리 및 정제 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 고순도의 항체 및 항체절편을 분리하고, 안정성을 증대시킬 수 있는 용출용액를 사용하여 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.

재조합 단백질은 박테리아나 세포에 목적 단백질 유전자를 삽입하여 발현, 생산한다. 발현하여 수득한 배양 원액에는 목적 단백질 외 단백질 아형, 이량체, 다량체, 단일 항체 절편, 숙주 유래 DNA, 숙주 유래 단백질, 내독소 등의 다양한 불순물들이 존재하며 목적 단백질을 제품화하기 위하여 상기 불순물을 제거하는 정제 과정이 필요하다.이런 단백질 치료제 중 항체절편은 표적과 특이적으로 결합해 약효를 나타내는데 이용하고 있으며, F_c가 없는 F_ab는 당체나 당화가 존재하지 않기 때문에 당의 종류에 따라 치료효과에 영향이 없어 매우 매력적인 치료제이다. 그러나 항체와 달리 불순물들과 분자량 차이가 크지 않아 정제 공정에서 크로마토그래피를 이용한 분리가 매우 어려운 상황이다.

현재 항체 절편을 분리하는 방법으로는 친화성 수지를 이용하여 정제를 하는 방법이 많이 이용되고 있다. 예를 들어, 항체를 정제하는 방법으로 단백질 A 친화성 크로마토그래피 방법을 이용해 목적한 제품을 불순물로부터 정제할 수 있음이 알려져 있다(국제출원 WO2011073954). 그러나 상기 방법의 경우, pH 2 내지 pH 3 정도의 산성 완충용액을 사용하여야 수지로부터 목적 단백질을 얻을 수 있으며, 이 때 용출용액의 pH가 낮아 목적 단백질이 불안정해진다는 문제가 있다. 이러한 문제를 보완하기 위해 용출용액의 pH를 높이는 완충액을 바로 섞어 주어 목적 단백질의 안정성을 확보하기도 하는데, 이러한 방법은 혼합한 완충액을 제거하기 위하여 농축 및 투석 공정이 한번 더 필요하다는 불편함과 목적 단백질의 수율 감소를 동반하는 단점이 동반된다.

이외에도 항체절편을 정제하는 방법으로 경사슬카파 경사슬 (kappa light chain)에 특이적으로 친화적인 수지를 사용한 크로마토그래피 방법을 이용해 목적한 단백질만을 특이적으로 회수 및 정제하는 방법이 알려져 있다(한국공개특허 제2016-0127317호). 그러나 상기 방법에도 단점이 있다. 구체적으로, 항체 절편의 경우 벡터 내에 중사슬과 경사슬을 각각 발현하는 시스템을 이용하는데, 두 체인이 연결된 형태 이외의 경사슬만 단독으로 존재하는 단백질이 발현될 수 있다. 즉, 카파 경사슬에 친화성이 있는 수지를 이용하면 불순물인 경사슬 단일 절편을 추가적으로 정제 및 제거시켜야 하는 문제점이 있다. 또한, 단백질 A 친화성 수지와 마찬가지로 낮은 pH(대략 pH 2~3)의 완충용액으로 용출해야 하므로 수득하는 항체절편의 안정성이 낮고, 만약 이를 보완하려면 추가적인 농축 및 투석 공정을 수행해야 하며, 공정 수율 및 순도 역시 높지 않다는 단점이 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 기존에 친화성 크로마토그래피에서 일반적으로 사용하는 pH 조건보다 높은 pH 조건에서도 순도 및 수율이 높은 목적 단백질을 정제하는 방법을 찾아내고자 노력한 결과, 중사슬 친화성 크로마토그래피를 이용하고, 최적화된 용출용액을 이용하였을 때, 고순도 및 안정성을 갖는 항체 및 항체절편을 정제하는 방법을 발굴함으로써 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 하나의 목적은 (a) 항체 또는 항체절편 함유 시료를 중사슬 친화성 수지를 포함하는 친화성 크로마토그래피에 적재(loading)하는 단계; (b) 세척용액으로 세척하는 단계; 및 (c) pH 3.8 이상부터 pH 4.7 이하 범위의 pH를 갖는 용출용액을 이용해 친화성 크로마토그래피칼럼으로부터 목적 항체 또는 항체절편을 회수하는 단계를 포함하는 목적 항체 또는 항체절편의 정제 방법을 제공하는 것이다.

이하에서는, 본 출원을 더욱 상세히 설명한다.

한편, 본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 할 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는, (a) 항체 또는 항체절편 함유 시료를 중사슬 친화성 수지를 포함하는 친화성 크로마토그래피에 적재(loading)하는 단계; (b) 세척용액으로 세척하는 단계; 및 (c) pH 3.8 이상부터 pH 4.7 이하 범위의 pH를 갖는 용출용액을 이용해 친화성 크로마토그래피칼럼으로부터 목적 항체 또는 항체절편을 회수하는 단계를 포함하는, 목적 항체 또는 항체절편의 정제 방법을 제공하는 것이다.

일반적으로, 친화성 수지를 포함하는 친화성 크로마토그래피를 이용하여 단백질을 정제하는 경우, 대부분 pH 2 내지 pH 3 범위의 용출용액을 사용하게 되므로 목적 단백질의 안정성인 측면에서 문제점이 발생하게 된다(Pim Hermans et al. Monoclonal Antibodies, vol. 1131, 297-314p; Abhinav A. Shukla et al., BioProcess International, (2005), 36-44p). 이를 해결하기 위하여 낮은 pH (pH 2-3)에서 정제를 한 후에 다시 높은 pH (4-7)로 올려주는 보정 작업이 필요하며, 이러한 추가 공정을 수행하는 과정에서 목적 단백질의 수율이 감소된다는 문제점이 있다. 그러나, 본 출원의 중사슬 친화성 수지는 일반적인 친화성 수지보다 마일드한 조건인 pH 3.8 이상부터 pH 4.7 이하 범위에서 고순도 및 안정성을 갖는 목적 단백질을 생산한다는 점에서 의의가 크다고 할 수 있다.

상기 목적 항체 또는 항체절편의 정제 방법의 각 단계에 대해 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 먼저 (a) 단계는 항체 또는 항체절편 함유 시료를 중사슬 친화성 수지를 포함하는 친화성 크로마토그래피에 적재(loading)하는 단계이다.

본 출원에서 사용된 "친화성 크로마토그래피"란 특정 단백질과 친화성이 있어 결합하는 물질을 이용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다. 특정 단백질과 친화성이 있어 결합하는 물질은 고분자 물질에 작용기 (functional group)를 결합시킨 것으로 극성, 비극성 용액중에 녹아있는 친화성이 있는 물질과 결합한다. 본 출원의 목적상 상기 친화성 크로마토그래피는 중사슬 친화성 크로마토그래피와 경사슬 친화성 크로마토그래피로 나눌수 있으나 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, "중사슬(heavy chain) 친화성 크로마토그래피"란 항체의 일부분인 중사슬과 특이적으로 결합할 수 있는 수지, 즉 중사슬 친화성 수지를 이용하는 크로마토그래피 방법을 의미하며, "경사슬(light chain) 친화성 크로마토그래피"란 항체의 일부분인 경사슬과 특이적으로 결합할 수 있는 수지, 즉 경사슬 친화성 수지를 이용하는 크로마토그래피 방법을 의미한다.

본 출원의 목적상 친화성 크로마토그래피는 중사슬 친화성 크로마토그래피일 수 있다. 구체적으로, 항체의 일부분인 중사슬과 특이적으로 결합할 수 있는 수지를 이용해 크로마토그래피를 진행할 수 있다. 일 예로 중사슬 친화성 수지로는 CaptureSelect^TM CH-1 XL Affinity Matrix (Thermo Fisher)가 있으나, 이에 제한되지 않으며, 중사슬과 특이적으로 결합할 수 있는 수지이면 어떤 것이든 가능하다.

하나의 구체예로, 상기 (a) 단계의 항체 또는 항체절편 함유 시료의 적재 전에 pH 5.5 이상 내지 pH 7.5 이하의 완충용액으로 칼럼을 평형시키는 것 일 수 있다. 상기 완충용액은 구체적으로, 인산나트륨, 염화나트륨, 트리스, MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), MOPS (3-morpholinopropane-1-sulfonic acid), PIPES, 인산칼륨, 염화칼륨, HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

하나의 구체예로, 상기 방법은 상기 (a) 단계 이전에 이온교환 크로마토 그래피, 농축 및/또는 투석 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이는 항체 또는 항체절편의 1차적인 불순물을 제거하고 시료의 순도를 높이기 위한 것이다. 구체적으로 상기 (a) 단계 이전에서 항체절편 함유 시료를 농축 및 투석을 진행하고, 음이온 크로마토그래피로 정제하는 단계를 미리 수행한 후, 중사슬 친화성 수지를 이용하는 친화성 크로마토그래피에 적재(loading)할 수 있다. 친화성 수지와 결합하지 않는 1차적인 불순물을 제거하고 시료의 순도도를 높이기 위한 작업이라면 제한되지 않고 적용될 수 있다.

상기 목적 항체 또는 항체절편의 정제 방법에서, (b) 단계는 세척용액으로 세척하는 단계로, 시료가 적재된 크로마토그래피에 세척용액을 적용하는 단계이다.

상기 세척용액은 pH 5.5 이상부터 pH 7.8 이하의 범위를 갖는 것 일 수 있으며, 염농도는 400 mM 이상부터 1 M 이하의 범위를 갖는 것 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 세척용액은 인산나트륨, 염화칼륨, 인산칼륨, 염화나트륨, 트리스, MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), MOPS (3-morpholinopropane-1-sulfonic acid), PIPES, 및 HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 목적상 (b) 단계에서는 세척용액에 의하여 중사슬 친화성 수지와 비특이적으로 결합된 불순물들이 제거될 수 있다.

하나의 구체예로 상기 정제 방법은 (a) 또는 (b) 단계 이후에 평형용액으로 수지와 친화성이 없는 불순물을 배출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 단계는 구체적으로 1회 이상 수행할 수 있으나, 일반적으로 평형이 맞춰지는 시점까지 제한없이 수행할 수 있다.

하나의 구체예로 상기 정제 방법은 상기 (a) 또는 (b) 이후에 재평형용액으로 재평형화를 하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 재평형용액은 세척단계과 용출단계 사이에서 아무것도 반응하지 않고 목적하는 항체 또는 항체절편을 용출되지 않는 (a) 단계의 평형버퍼와 동일한 조건으로 용액을 흘려주고 난 다음 다시 용출용액을 흘려주기 전에 흘려주어 세척용액과 용출용액 사이에서 브릿징을 할 수 있는 역할을 한다.

구체적으로, 상기 재평형용액은 pH 4.5 이상부터 pH 6.5 이하의 범위인 것 일 수 있으며, 염농도는 10 mM 이상부터 30 mM 이하의 범위인 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 재평형용액은 인산나트륨, 염화나트륨, 트리스, MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), MOPS (3-morpholinopropane-1-sulfonic acid), PIPES, 인산칼륨, 염화칼륨, 및 HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 목적 항체 또는 항체절편의 정제 방법에서, (c) 단계는 pH 3.8 이상부터 pH 4.7 이하의 범위를 갖는 용출용액을 이용해 친화성 크로마토그래피칼럼으로부터 목적 항체 또는 항체절편을 회수하는 단계이다.

상기 용출용액은 pH 3.8 이상부터 pH 4.7 이하의 범위인 것 일 수 있으며, 염농도는 10 mM 이상부터 100 mM 이하의 범위인 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 용출용액의 pH가 3.8 미만인 경우에도 목적 단백질이 용출되나 기존의 친화성 크로마토그래피를 이용하는 경우와 동일한 문제 즉, 낮은 pH (pH 2-3)에서 정제를 한 후에 다시 높은 pH (pH 4-7)로 올려주는 보정 작업 및 농축 및 투석 공정이 필요하다는 문제점이 있고, pH 4.7 초과인 경우 칼럼에서 중사슬을 잡는 리간드가 목적 단백질과 수소결합을 이루어 용출되지 않는 어려움이 있어 바람직하지 않다.

또한, 상기 용출용액은 염농도가 10 mM 이상부터 100 mM 이하의 범위 내에서 아세트산 나트륨, 시트르산 나트륨, 및 글라이신으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염을 포함하는 것일 수 있으나, 중사슬 친화성 크로마토그래피에서 마일드 조건에서 목적 항체 또는 항체절편을 분리시킬 수 있는 염은 제한없이 사용될 수 있다.

특히, 본 출원의 정제 방법은 (C) 단계 이후에 농축 및 투석 공정을 수행하지 않는 것을 특징으로 한다. '농축 및 투석 공정'은 일반적으로 멤브레인상의 타겟 사이즈 이하의 물질을 제거 또는 버퍼변경을 위하여 사용하는 공정으로서, 일반적인 친화성 수지를 사용하는 경우 불순물인 단일 절편을 추가적으로 정제 및 제거시키는데 사용되는 공정이다. 농축 및 투석 공정을 추가적으로 사용하는 경우 공정 수율이 높지 않은 단점이 있다. 그러나, 본 출원의 정제 방법은 중사슬 친화성 수지를 이용하고 용출용액의 최적화를 통해 농축 및 투석 공정을 추가로 수행하지 않아도, 높은 순도 및 수율로 항체 또는 항체절편을 정제할 수 있다는 점에서 경제적인 우수성을 갖는다.

본 출원에서 사용된 용어 "목적 항체 또는 항체절편"은 본 출원의 친화성 크로마토그래피로부터 분리하고자 하는 단백질의 한 종류로서, '목적 단백질'과 혼용되어 사용될 수 있다.

항체는 구체적으로, 단클론 항체일 수 있으며, 상기 "단클론항체(monoclonal antibody)"란 용어는 단일 항체 형성세포가 생성할 수 있는 항체를 말하며, 1개의 항원 결정기를 인식한다. 본 출원의 항체는 이에 제한되지는 않으며, 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 치료용 항체를 모두 포함할 수 있다.

또한, 상기 항체는 전장항체 및 항체 절편의 형태를 모두 포함하는 개념으로,

항체절편은 Fv, Fab, Fab', F(ab')₂, Fd 등을 모두 포함한다. 상기 Fv는 이중디설파이드 Fv(dsFv) 및 단쇄 Fv(scFv) 형태를 모두 포함한다. Fd는 Fab 절편에 포함되어 있는 중쇄 부분을 의미한다. Fv, scFv 및 Fab와 같이 항체 중 항원과의 결합에 필수적인 일부 절편만을 사용하여 구성되는 것을 의미하며, 표적과 특이적으로 결합해 약효를 나타내기 때문에 단백질 치료제로 많이 사용되고 있다. 또한, F_c가 없는 F_ab는 당체나 당화가 존재하지 않기 때문에 당의 종류에 따라 치료효과에 영향이 없는 것으로 알려져 있다. 그러나, 항체와 달리 불순물들과 분자량 차이가 크지 않아 정제 공정에서 크로마토그래피를 이용한 분리가 어렵다.

본 출원의 정제 방법을 이용하여 분리된 목적 항체 또는 항체절편은 순도가 88% 이상인 것을 의미할 수 있으며, 구체적으로는 순도 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 또는 98% 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용어 "순도"는 불순물이 제거된 순수한 항체 또는 항체절편을 의미하는 것으로, 일 예로 순도가 92%라고 하면 나머지 8%가 불순물인 것을 의미한다. 또한, 순도는 용출용액에서 분리된 물질의 순도를 단순히 나타내는 것일 수 있으나, 로딩한 시료의 순도가 몇 %인지에 따라서도 최종 순도의 %가 달라질 수 있다.

상기 용어 "불순물"은 목적하는 항체 또는 항체절편 이외의 어떠한 물질이어도 포함되며, 그 예로는 아형, 이량체, 다량체, 숙주 유래 DNA, 숙주 유래 단백질, 내독소 등을 들 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 목적 항체 또는 항체절편의의 순도는 용출용액으로부터 정제 후 HPLC 분석을 통해 측정할 수 있으며, 구체적으로 CEX-HPLC를 사용하여 분석 할 수 있으나, 이에 제한 되지 않는다.

또한, 본 출원의 정제 방법으로 정제된 항체 또는 항체절편은 치료용 단백질로 사용될 수 있다. 본 출원에서 사용된 용어 "치료용 단백질"은 통상적으로 바이오 의학에 사용되는 단백질을 총칭하는 개념으로서, 다양한 생리활성을 가지는 것을 의미한다. 상기 생리활성은 유전표현과 생리기능을 조정하여 생체 내에서 기능조절에 관여하는 물질의 결핍이나 과도한 분비에 의해 비정상적인 병태를 보일 때 이를 바로잡아 주는 역할을 하는 것으로서, 일반적인 단백질 치료제를 포함할 수 있다.

본 출원에서 상기 치료용 단백질은 생체 내에서 생리활성을 가지는 것이면 제한없이 포함하나, 그 예로서 항체, 항체 절편인 scFv, Fab, Fab' 또는 F(ab')2 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에 따른 친화성 크로마토그래피에 의하면, 목적하는 단백질 외의 다른 불순물을 대부분 제거할 수 있을 뿐 아니라 농축 및 투석 공정과 같은 추가적인 공정이 없이도 높은 순도 및 수율로 항체 또는 항체절편을 정제할 수 있다.

도 1은 본 출원의 실험수행 절차를 나타낸 것이다.
도 2a는 pH 3.8 내지 pH 5.6 용출용액을 pH 선형 농도 구배로 용출한 결과를 나타내는 것이다.
도 2b는 칼럼 적제 전의 로딩시료의 CEX-HPLC로 분석 결과로서, 불순물이 분리됨을 확인한 것이다.
도 2c는 중사슬과 친화성이 없어 칼럼 밖으로 나오는 물질의 CEX-HPLC로 분석 결과로서, 불순물이 분리됨을 확인한 것이다.
도 2d는 세척용액에 의한 CEX-HPLC로 분석 결과로서, 칼럼과 비특이적 결합을 갖는 일부 불순물들이 분리됨을 확인한 것이다.
도 2e는 용출용액을 이용하여 분리된 물질의 CEX-HPLC로 분석 결과로서, 분리된 물질이 목적 항체 또는 항체절편임을 확인하였으며, 순도가 92% 이상임을 확인한 것이다.
도 3a는 용출용액이 pH 4.7일 때 최적의 분리능을 가지는 것을 확인한 것이며, 목적 단백질이 분리됨을 확인한 것이다.
도 3b는 용출용액을 이용하여 분리된 물질의 CEX-HPLC로 분석 결과로서, 용출용액에서 분리된 물질이 88% 이상의 순도를 가지는 것을 확인한 것이다.
도 4a는 용출용액의 종류가 바뀌어도 동일한 pH조건에서 분리능이 유지됨을 확인한 것이다.
도 4b는 용출용액을 이용하여 분리된 물질의 CEX-HPLC로 분석 결과로서, 용출용액에서 분리된 물질이 90% 이상의 순도를 가지는 것을 확인한 것이다.
도 5a는 용출용액이 pH 4.7일 때 최적의 분리능을 가지는 것을 확인한 것이며, 항체가 분리됨을 확인한 것이다.
도 5b는 용출용액을 이용하여 분리된 물질의 CEX-HPLC로 분석 결과로서, 용출용액에서 분리된 물질이 99% 이상의 순도를 가지는 것을 확인한 것이다.
도 6은 경사슬 친화성 수지를 이용한 경우, 용출용액이 pH 4.7일 때 목적 단백질이 분리되지 않음을 확인한 것이다.
도 7a는 경사슬 친화성 수지를 이용한 경우, 용출용액이 pH 2.7일 때 최적의 분리능을 가지는 것을 확인한 것이며, 목적 단백질이 분리됨을 확인한 것이다.
도 7b, 경사슬 친화성 수지를 이용한 경우 용출용액을 이용하여 분리된 물질의 CEX-HPLC로 분석 결과로서, 용출용액에서 분리된 물질이 53% 이상의 순도를 가지는 것을 확인한 것이다.
도 7c는 실험예 2에서 나온 분리된 물질과 비교예 2에서 나온 분리된 물질을 비교한 결과이다.

이하, 본 출원의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 출원을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의하여 본 출원의 내용이 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 정제 방법이 실질적인 효과를 가질 수 있는지 여부를 확인하기 위해, 대표적인 항체절편 의약품인 라니비주맙(Ranibizumab)을 정제 대상을 선정하였다.

		실험예1	실험예2	실험예3	실험예4	비교예 1	비교예2
조건	수지	CaptureSelect CH1-XL	CaptureSelect CH1-XL	CaptureSelect CH1-XL	CaptureSelect CH1-XL	Kappa Select	Kappa Select
	평형버퍼 염 종류 및 농도	20 mM 인산나트륨	20 mM 인산나트륨	20 mM 인산나트륨	20 mM 인산나트륨	20 mM 인산나트륨	20 mM 인산나트륨
	평형버퍼pH	pH 6.2	pH 6.2	pH 6.2	pH 6.2	pH 6.2	pH 6.2
	세척버퍼염 종류 및 농도	20 mM 인산나트륨, 400 mM 염화나트륨	20 mM 인산나트륨, 400 mM 염화나트륨	20 mM 인산나트륨, 400 mM 염화나트륨	20 mM 인산나트륨, 400 mM 염화나트륨	20 mM 인산나트륨, 40 mM 염화나트륨	1X 인산염 완충 식염수
	세척버퍼pH	pH 5.8	pH 5.8	pH 5.8	pH 5.8	pH 5.8	pH 7.2
	용출버퍼염 종류 및 농도	50 mM 아세트산 나트륨	50 mM 아세트산 나트륨	50 mM 시트르산 나트륨	50 mM 아세트산 나트륨	50 mM 아세트산나트륨	0.1 M 글라이신
	용출버퍼pH	pH 5.6~3.8 (0%~100% 선형 pH 구배)	pH 4.7	pH 4.7	pH 4.7	pH 4.7	pH 2.7
결과		용출용액에서 높은 순도로 목적물질을 분리할 수 있었다. (도 2)	용출용액에서 높은 순도로 목적물질을 분리할 수 있었다. (도 3)	용출용액에서 높은 순도로 목적물질을 분리할 수 있었다. (도 4)	용출용액에서 높은 순도로 목적물질을 분리할 수 있었다. (도 5)	용출용액에서 목적 물질이 도출되지 않았다. (도 7)	용출용액에서 목적물질을 분리할 수 있으나 순도가 낮고 농축 및 투석 공정을 진행해야 다음 정제공정을 할 수 있었다. (도 6)

실시예 1: 친화성 크로마토그래피를 이용한 항체 및 항체절편의 정제

실험예 1: 항체절편 정제 조건 설정(용출용액의 조건 설정)

항체절편 함유 시료를 중사슬과 친화성이 있는 크로마토그래피 수지 (CaptureSelect CH1-XL, Thermo Fisher)에 적재하여 항체절편을 정제하였다. 크로마토그래피 조건은 하기와 같다.

*크로마토그래피 조건:

- 수지: CaptureSelect CH1-XL

- 유속: 90 cm/h

- 평형: 20 mM 인산 나트륨, pH 6.2 완충액

- 적재: 최대 3 g 단백질/L 수지 부피

- 세척: 20 mM 인산 나트륨, 400 mM 염화 나트륨, pH 5.8 완충액

- 용출: 50 mM 아세트산 나트륨, pH 5.6 내지 3.8 완충액 pH 선형 농도 구배

정제 과정은 도 1의 절차와 유사하게 진행되었으며, 용출용액 조건을 설정하기 위해 50 mM 아세트산나트륨, pH 3.8 내지 pH 5.6 용출용액을 pH 선형 농도 구배로 용출하였다.

구체적으로, 20 mM 인산나트륨, pH 6.2의 평형용액으로 칼럼을 평형시킨 후, 항체절편 함유 시료를 친화성 크로마토그래피 칼럼에 적재하였고, 칼럼에 결합된 항체절편은 재평형을 거친 후, 세척하였다. 다시 재평형을 거치고 용출하였으며, 용출 시 자외선이 1 mAU 보다 높은지점부터 다시 1 mAU가 되는 시점까지 수집하여 제균필터 후 5±3℃에 보관하였다.

pH 3.8 내지 pH 5.6 용출용액을 pH 선형 농도 구배로 용출한 결과, 용출용액이 pH 4.7일 때, 목적 항체 또는 항체절편의 분리능이 가장 우수함을 확인하였다(도 2a).

상기 정제 방법을 통해 얻은 목적 항체 또는 항체절편은 CEX-HPLC로 분석하였다. 그 결과, 칼럼 적제 전의 로딩시료(도 2b)와 중사슬과 친화성이 없어 칼럼 밖으로 나오는 물질의 분석결과(도 2c)를 보면 대부분의 불순물이 중사슬 수지와 친화성이 없어 분리 정제되는 것을 확인하였으며, 20 mM 인산 나트륨, 400 mM 염화 나트륨, pH 5.8의 세척용액을 이용한 결과, 칼럼과 비특이적 결합을 갖는 일부 불순물들이 세척용액에 의하여 분리되는 것을 확인하였다(도 2d). 이를 통해 적재 전 로딩시료나 세척단계에서는 불순물만을 제거할 수 있을 뿐, 목적 단백질은 분리되지 않음을 알 수 있었다.

이후, 용출용액을 이용하여 분리된 물질이 목적 항체 또는 항체절편임을 확인하였으며, 이의 순도가 92% 이상임을 확인하였다(도 2e). 이는 로딩시료의 제품순도가 14%인 것을 감안하면 상기 정제 공정을 통해 대부분의 불순물이 제거됐음을 의미하는 것이다. 또한, 공정 수율은 CEX-HPLC로 분석한 결과 95%임을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 항체절편 정제 조건 설정(용출용액의 적정 pH 확인)

항체절편 함유 시료를 중사슬 친화성 크로마토그래피 수지 (CaptureSelect CH1-XL, Thermo Fisher)에 적재하여 항체절편을 정제하였다. 크로마토그래피 조건은 하기와 같다.

*크로마토그래피 조건:

- 수지: CaptureSelect CH1-XL

- 유속: 90 cm/h

- 평형: 20 mM 인산 나트륨, pH 6.2 완충액

- 적재: 최대 3 g 단백질/L 수지 부피

- 세척: 20 mM 인산 나트륨, 400 mM 염화 나트륨, pH 5.8 완충액

- 용출: 50 mM 아세트산 나트륨, pH 4.7 완충액

실험예 1에서 설정된 pH 4.7의 용출용액이 목적 항체 또는 항체절편의 정제에 적절한지 확인하고자 하였다.

정제 과정은 도 1의 절차와 유사하게 진행되었으며, 용출용액 조건을 설정하기 위해 50 mM 아세트산 나트륨, pH 4.7 용출용액으로 용출하였다.

구체적으로, 20 mM 인산 나트륨, pH 6.2의 평형용액으로 칼럼을 평형시킨 후, 항체절편 함유 시료를 친화성 크로마토그래피 칼럼에 적재하였고, 칼럼에 결합된 항체절편은 재평형을 거친 후, 세척하였다. 다시 재평형을 거치고 용출하였으며, 용출 시 자외선이 1 mAU 보다 높은지점부터 다시 1 mAU가 되는 시점까지 수집하여 제균필터 후 5±3℃에 보관하였다. 세척용액은 완충액 (20 mM 인산 나트륨, 400 mM 염화 나트륨, pH 5.8)을 실험예 1과 동일하게 사용하였다.

그 결과, 도 3a에서 확인할 수 있듯이, 용출용액이 pH 4.7일 때 최적의 분리능을 가지는 것을 확인하였다. 즉, CEX-HPLC로 분석을 통하여 본 출원의 정제과정동안 단계별로 불순물과 목적 단백질 분리됨을 확인하였으며(도 3a), 용출용액에서 분리된 물질이 88% 이상의 순도를 가지는 것을 확인하였다(도 3b). 또한, 공정 수율은 CEX-HPLC로 분석한 결과 92%임을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 항체절편 정제 조건 설정(pH가 핵심조건인지 여부 확인)

항체절편 함유 시료를 중사슬 친화성 크로마토그래피 수지 (CaptureSelect CH1-XL, Thermo Fisher)에 적재하여 항체절편을 정제하였다. 크로마토그래피 조건은 하기와 같다.

*크로마토그래피 조건:

- 수지: CaptureSelect CH1-XL

- 유속: 90 cm/h

- 평형: 20 mM 인산 나트륨, pH 6.2 완충액

- 적재: 최대 3 g 단백질/L 수지 부피

- 세척: 20 mM 인산 나트륨, 400 mM 염화 나트륨, pH 5.8 완충액

- 용출: 50 mM 시트르산 나트륨, pH 4.7 완충액

친화성 크로마토그래피를 이용한 항체절편 정제 방법에서 용출용액의 pH가 핵심 조건인지 여부를 확인하기 위하여, 용출용액의 종류를 아세트산 나트륨(NaAcetate)이 아닌 시트르산 나트륨(NaCitrate)로 바꾸어 진행하였다.

정제 과정은 도 1의 절차와 유사하게 진행되었으며, 용출용액 조건을 설정하기 위해 50 mM 시트르산 나트륨, pH 4.7 용출용액으로 용출하였다.

구체적으로, 20 mM 인산 나트륨, pH 6.2의 평형용액으로 칼럼을 평형시킨 후, 항체절편 함유 시료를 친화성 크로마토그래피 칼럼에 적재하였고, 칼럼에 결합된 항체절편은 재평형을 거친 후, 세척하였다. 다시 재평형을 거치고 용출하였으며, 용출 시 자외선이 1 mAU 보다 높은지점부터 다시 1 mAU가 되는 시점까지 수집하여 제균필터 후 5±3℃에 보관하였다. 세척용액은 완충액 (20 mM 인산 나트륨, 400 mM 염화 나트륨, pH 5.8)을 실험예 1과 동일하게 사용하였다.

그 결과, 도 4a에서 확인할 수 있듯이, 용출용액이 pH 4.7일 때, 최적의 분리능을 가지는 것을 확인하였다. 이를 통해 용출용액의 종류가 바뀌어도 동일한 pH조건에서 분리능이 유지됨을 확인할 수 있었다.

또한, 용출로 얻은 결과물을 CEX-HPLC로 분석한 결과, 90%이상의 순도를 가짐을 확인할 수 있었으며(도 4b), 공정 수율은 92%임을 확인할 수 있었다.

실험예 4: 항체 정제

본 출원에 따른 정제 방법으로 항체절편뿐만 아니라 항체도 정제 가능함을 확인하고자 대표적인 항체 의약품인 얼비투스(Erbitux)를 이용하여하기와 같은 조건으로 크로마토그래피를 진행하였다.

*크로마토그래피 조건:

- 수지: CaptureSelect CH1-XL

- 유속: 90 cm/h

- 평형: 20 mM sodium phosphate, pH 6.2 완충액

- 적재: 최대 3 g 단백질/L 수지 부피

- 세척: 20 mM 인산 나트륨, 400 mM 염화 나트륨, pH 5.8 완충액

- 용출: 50 mM 아세트산 나트륨, pH 4.7 완충액

정제 과정은 도 1의 절차와 유사하게 진행되었으며, 용출용액 조건을 설정하기 위해 50 mM 아세트산 나트륨, pH 4.7 용출용액으로 용출하였다.

구체적으로, 20 mM 인산 나트륨, pH 6.2의 평형용액으로 칼럼을 평형시킨 후, 라니비주맙을 중사슬 크로마토그래피 칼럼에 적재하였고, 칼럼에 결합된 항체는 재평형을 거친 후, 세척하였다. 다시 재평형을 거치고 용출하였으며, 용출 시 자외선이 1 mAU 보다 높은지점부터 다시 1 mAU가 되는 시점까지 수집하여 제균필터 후 5±3℃에 보관하였다. 세척용액은 완충액 (20 mM 인산 나트륨, 400 mM 염화 나트륨, pH 5.8)을 실험예 1과 동일하게 사용하였다.

그 결과, 도 5a에서 확인할 수 있듯이, 용출용액이 pH 4.7일 때, 최적의 분리능을 가지는 것을 확인하였다. 또한, 용출로 얻은 결과물이 99% 이상의 순도를 가지는 것을 확인하고(도 5b), 공정 수율은 91%임을 확인하였다.

비교예 1: 항체절편 정제 조건 설정(경사슬 친화성 수지 이용)

중사슬 친화성 수지를 이용한 본 출원의 정제 방법의 우수한 효과를 다시한번 확인하고자 동일한 조건으로 수지(경사슬 친화성 수지)만을 바꾸어 하기와 같은 조건으로 크로마토그래피를 진행하였다.

*크로마토그래피 조건:

- 수지: KappaSelect

- 유속: 90 cm/h

- 평형: 20 mM 인산 나트륨, pH 6.2 완충액

- 적재: 최대 3 g 단백질/L 수지 부피

- 세척: 20 mM 인산 나트륨, 400 mM 염화 나트륨, pH 5.8 완충액

- 멸균: 10 mM 수산화 나트륨 용액

- 용출: 50 mM 아세트산 나트륨, pH 4.7 완충액

정제 과정은 도 1의 절차와 유사하게 진행하였으며, 실험예 2와 다른 조건들은 모두 동일하나, 수지의 조건을 경사슬 친화성 수지인 KappaSelect를 이용하여 실험을 수행하였다.

구체적으로, 20 mM 인산 나트륨, pH 6.2의 평형용액으로 칼럼을 평형시킨 후, 항체절편 함유 시료를 경사슬 친화성 크로마토그래피 칼럼에 적재하였고, 칼럼에 결합된 항체절편은 재평형을 재평형을 거친 후, 세척하였다. 다시 재평형을 거치고 용출하였으며, 용출 시 자외선이 1 mAU 보다 높은지점부터 다시 1 mAU가 되는 시점까지 수집하여 제균필터 후 5±3℃에 보관하였다. 세척용액은 완충액 (20 mM 인산 나트륨, 400 mM 염화 나트륨, pH 5.8)을 실험예 1과 동일하게 사용하였다. 다시 재평형을 거치고 용출하였는데, 용출시에는 중사슬 친화성 크로마토그래피 조건과 동일한 용출용액을 이용하였다.

그 결과, 도 6에서 확인할 수 있듯이, 용출용액이 pH 4.7인 경우에 목적 단백질이 용출 단계가 아닌 멸균 단계에서 분리됨을 확인하였다.

이는 기존에 알려진 바와 같이, 경사슬 친화성 크로마토그래피가 pH 2 내지 pH 3을 벗어나는 높은 범위의 pH에서는 용출이 되지 않음을 확인한 것이다.

비교예 2: 항체절편 정제 조건 설정( 경사슬 친화성 수지의 적절한 pH 조건 확인)

비교예 1에서 경사슬 친화성 수지를 이용한 결과 용출단계에서 목적 단백질이 분리되지 않는 것을 확인하고, 경사슬 친화성 수지에 적합한 용출용액을 이용하면, 목적 단백질이 용출되는지 여부를 확인하고자 하기와 같은 조건으로 크로마토그래피를 진행하였다.

*크로마토그래피 조건:

- 수지: KappaSelect

- 유속: 90 cm/h

- 평형: 20 mM 인산 나트륨, pH 6.2 완충액

- 적재: 최대 3 g 단백질/L 수지 부피

- 세척: 1X 인산염 완충 식염수, pH 7.2 완충액

- 멸균: 10 mM 수산화 나트륨 용액

- 용출: 0.1 M 글리신, pH 2.7 완충액

정제 과정은 도 1의 절차와 유사하게 진행하였다.

구체적으로, 20 mM 인산 나트륨, pH 6.2의 평형용액으로 칼럼을 평형시킨 후, 항체절편 함유 시료를 경사슬 친화성 크로마토그래피 칼럼에 적재하였고, 칼럼에 결합된 항체절편은 재평형을 재평형을 거친 후, 세척하였다. 다시 재평형을 거치고 용출하였으며, 용출용액은 0.1 M 글리신, pH 2.7 완충액을 이용하였다. 용출 시 평형상태의 자외선 값보다 1 mAU 증가하는 시점부터 다시 평형상태의 자외선 값으로 돌아올 때까지 수집하였다. 항체절편의 안정성 문제 때문에, 용출용액에서 사용한 pH 2.7의 낮은 pH를 보정하기 위해 200 mM 인산 나트륨, pH 7.0을 이용하여 pH를 올려주는 작업을 수행하였다. 보정한 용출용액은 제균필터 후 5±3℃에 보관하였다.

그 결과, 도 7a에서 확인할 수 있듯이, 경사슬 친화성 수지인 KappaSelect에서는 용출용액이 pH 2.7일 때, 최적의 분리능을 가지는 것을 확인하였다. 그러나, CEX-HPLC로 분석한 결과, 상기 용출용액에서는 목적 단백질 이외에 단일 항체 절편도 분리됨을 확인하였다. 결국 비교예 2의 크로마토그래피로는 단일 항체 절편이 제대로 분리되지 않음을 확인하였다.

용출용액에서 분리된 물질의 순도는 53%로 중사슬 친화성 크로마토그래피를 이용하는 경우보다 매우 낮음을 확인하였으며(도 7b), 실험예 2에서 나온 분리된 물질과 비교예 2에서 나온 분리된 물질을 비교해보면 순도가 중사슬 친화성 크로마토그래피를 이용했을 때 높음을 다시 한번 확인할 수 있었다(도 7c).

경사슬 친화성 크로마토그래피를 이용하는 경우 공정 수율 역시 87%로, 본 출원에 따른 중사슬 친화성 크로마토그래피를 이용하는 경우보다 수율이 낮았다. 또한, 비교예의 경우 농축 및 투석 공정을 진행해야 다음 공정으로 진행이 가능하므로 농축 및 투석 공정이 추가 수행됨을 감안할 때 비교예의 크로마트로그래피를 이용하면 실제로는 더 낮은 수율로 목적물질이 확보됨을 본 시험을 통해 확인할 수 있었다.

전술한 바와 같이, 본 출원에서는 중사슬 친화성 크로마토그래피를 이용하는 경우(실험예 1 내지 4), pH 3.8 내지 pH 4.7의 용출용액, 특히 pH 4.7에서 목적하는 항체 또는 항체절편이 잘 분리됨을 확인하였다.

그러나, 비교예 1에서는 중사슬 친화성 크로마토그래피와 동일한 조건의 용출용액을 이용하는 경우 목적 단백질이 분리되지 않고, 비교예 2에서는 본원 실험예의 조건보다 낮은 pH 2.7의 용출용액을 이용하는 경우에 낮은 수율의 목적 단백질이 분리됨을 확인하였다.

비교예 2에서 사용한 pH 2.7의 낮은 pH의 용출용액을 사용하는 경우, 단백질의 구조적, 안정성인 측면에서 문제가 있으므로, pH를 올려주는 보정작업이 반드시 필요하다. 그러나 본 출원의 정제방법을 이용하는 경우, 상기와 같은 pH를 올려주는 보정작업을 생략할 수 있을 뿐만 아니라, 농축 및 투석공정도 생략할 수 있다는 점에서, 분리된 단백질의 안정성을 보장함과 동시에 불순물이 제거된 순도가 높은 단백질을 경제성 있게 얻어낼 수 있다는 측면에서 우수성이 있다.

이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (14)

1. (a) 항체 또는 항체절편 함유 시료를 중사슬 친화성 수지를 포함하는 친화성 크로마토그래피에 적재(loading)하는 단계;
   (b) 세척용액으로 세척하는 단계; 및
   (c) pH 3.8 이상부터 pH 4.7 이하 범위의 pH를 갖는 용출용액을 이용해 친화성 크로마토그래피칼럼으로부터 목적 항체 또는 항체절편을 회수하는 단계를 포함하고,
   상기 (c) 단계 이후에 농축 및 투석 공정을 수행하지 않는 것을 특징으로 하는, 목적 항체 또는 항체절편의 정제 방법.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 (a) 단계의 중사슬 친화성 수지는 중사슬과 특이적으로 결합할 수 있는 수지인 것인, 정제 방법.
   
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 (c) 단계 에서 용출용액은 10 mM 이상부터 100 mM 이하 범위의 염농도를 갖는 것인, 정제 방법.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 (c) 단계에서 용출용액은 아세트산 나트륨, 시트르산 나트륨, 및 글라이신으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염을 포함하는 것인, 정제 방법.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 (a) 단계의 항체 또는 항체절편 함유 시료의 적재 전에 pH 5.5 이상부터 pH 7.5 이하 범위의 pH를 갖는 완충용액으로 칼럼을 평형시키는 것인, 정제 방법.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 완충용액은 MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), PIPES, 인산칼륨, 염화칼륨, MOPS (3-morpholinopropane-1-sulfonic acid), 인산나트륨, 염화나트륨, 트리스, 및 HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염을 포함하는 것인, 정제 방법.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 (a) 단계 이전에 친화성 크로마토 그래피, 이온교환 크로마토그래피, 농축 또는 투석하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 정제 방법.
   
9. 제1항에 있어서,
   상기 방법은 (a) 또는 (b) 단계 후, 평형용액으로 수지와 친화성이 없는 불순물을 배출하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 정제 방법.
   
10. 제1항에 있어서,
    상기 방법은 (a) 또는 (b) 단계 후, 완충용액으로 재평형화를 하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 정제 방법.
    
11. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서의 세척용액은 pH 4.5 이상부터 pH 6.5 이하 범위의 pH를 갖는 것인, 정제 방법.
    
12. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서의 세척용액은 400 mM 이상부터 1 M 이하 범위의 염농도를 갖는 것인, 정제 방법.
    
13. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서의 세척용액은 인산나트륨, 염화칼륨, 인산칼륨, 염화나트륨, 트리스, MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), MOPS (3-morpholinopropane-1-sulfonic acid), PIPES, 및 HEPES (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염을 포함하는 것인, 정제 방법.
    
14. 제1항에 있어서,
    상기 정제된 목적 항체 또는 항체절편은 치료용 단백질인 것인, 정제 방법.

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