JP7430012B2 - アダリムマブのｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ａ精製方法 - Google Patents

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Description

本発明は、親和性クロマトグラフィーであるプロテインＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）カラムを使用することなく、低費用で高純度および高収率の抗体集団を製造する方法に関する。
バイオ医薬品の研究および開発における最新傾向は、抗体断片の開発にさらに重点を置く。多数のバイオシミラー（ｂｉｏｓｉｍｉｌａｒ）治療タンパク質が以前に比べてさらに多く開発されているが、バイオシミラー製品の開発における重大な困難は、分離精製工程（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）の高い費用、工程および生成物関連不純物の非選択的消去、生成物のタンパク質分解による分解などである。抗体断片は、全長の単クローン性抗体（ｍＡｂ）治療剤に比べて特定の利点を提供するが、このような利点は、例えば、腫瘍への増進された深部への浸透、全長のｍＡｂに接近できない特異的エピトープに結合などである。高力価のクローンおよび連続的なバイオマニュファクチャリング（ｂｉｏ－ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ）のような発酵培養工程（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）での進歩は、バイオ医薬品産業の焦点を全体的な分離精製工程経済を向上させる側に移動させた。分離精製工程は、単クローン性抗体治療剤のための全体製造費用の略６０～７０％を占める。分離精製工程の捕獲段階、中間段階およびポリッシング（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）段階は、高価な多様なクロマトグラフィー操作の使用を含む。
これによって、抗体医薬品と関連して精製工程に関する多くの研究開発が行われていた。
具体的に、抗体医薬品生産のための精製工程として、プロテインＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）カラムを用いた精製工程が主に行われている。ところが、プロテインＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）カラムを用いた精製方法の場合、初期段階で高い純度で生産できる長所を有するが、価格が一般イオン交換樹脂に比べて３０倍以上と高くて、生産コストが高いという短所がある。
従来の報告によれば、プロテインＡ樹脂が抗体医薬品の生産原料コストの約３５％に該当する高い割合を占めていて、カラムから溶出される微量のプロテインＡが人体内部で免疫性または生理的に反応を起こすことができる。したがって、プロテインＡカラムを用いた精製工程の場合、残量のプロテインＡを工程別にモニタリングし、除去しなければならない困難を有する。また、生物親和性基であるプロテインＡは、化学的に安定性が弱い短所があり、カラムの再生段階でプロテインＡの活性を維持する状態で再生させなければならないので、クリーニング工程で必須的に使用される１ＭのＮａＯＨを使用できず、カラムに付着した不純物を完全に除去できず、これによって、カラムを再生して使用する回数が他の一般化学的樹脂に比べて顕著に落ちる限界を有する。
このような問題点を解決するために、陽イオン交換カラム、疎水性カラム、陰イオン交換カラムなどを用いた不純物除去および高純度抗体を開発しようとする多くの努力があった。
ところが、上記のようなプロテインＡの使用を除いたカラムを用いた抗体の製造において高収率および高純度で抗体生産に至るまで多くの問題点が発見された。
例えば、一般的に陽イオン交換カラムを使用する場合、精製工程で様々なバッファーの使用が混在される。これによって、多数のバッファーの使用による複雑な工程に起因して 溶出(Ｅｌｕｔｉｏｎ)タンパク質を収集するのに困難がある。特に、陽イオン交換カラムの使用において 洗浄(Ｗａｓｈｉｎｇ)工程は、多量の異なる成分を有するバッファー組成を用いる必要があるため、自動化および工程単純化が非常に難しい問題がある。
上記のような問題に起因して抗体生産費用および生産時間が大きく増加し、品質確保の観点からも十分な効果が得られず、また、工程の自動化を容易に達成しなかった。
このような背景下に、バイオシミラー製品、特に精製された抗体断片を収得するための便利な分離精製工程を提供することが非常に重要である。先行技術の分離精製手続きによって提起された問題点の観点から、本発明者らは、抗体集団を精製するための方法を提供しようとした。本発明によって収得された精製された抗体集団は、優れた純度および活性基準を満足させる。
本発明者らは、抗体精製に一般的に使用される高価なＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムを用いることなく、細胞を除去した培養上清液のｐＨを減少させて沈殿物を除去する前処理段階後に好適な条件下に設定された陽イオン交換カラム、疎水性相互作用カラム、および陰イオン交換カラムを順次に用い、この過程でウイルスフィルタリングおよびろ過工程を適切な時点に行う方法に変更することによって、高品質の抗体集団を製造できることを確認した。これによって、本発明では、下記の目的の発明を提供する。
本発明の一目的は、（ａ）抗体の混合液を含む試料を、平衡化された陽イオン交換カラムにローディングし、前記陽イオン交換カラムを洗浄した後、カラムに結合した抗体を溶出緩衝液で溶出させることを含む、抗体の混合液を含む試料から宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および異種抗体を除去する段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階で溶出された抗体溶出液に塩を混合した試料を疎水性相互作用カラムにローディングし、カラムに結合した抗体を溶出緩衝液で溶出させることを含む、抗体溶出液から宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および残留ＤＮＡ（Ｒｅｓｉｄｕａｌ ＤＮＡ）を除去する段階と、
（ｃ）前記（ｂ）段階の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および残留ＤＮＡが除去された抗体溶出液を陰イオン交換カラムに通過させて通過液（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）を収集することを含む、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および残留ＤＮＡ（Ｒｅｓｉｄｕａｌ ＤＮＡ）を除去する段階と、
（ｄ）前記（ｃ）段階で通過液（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）をウイルスフィルターに通過させてウイルスを除去する段階と、
（ｅ）前記（ｄ）段階で溶出された抗体溶出液を濃縮および緩衝液交換し、残留ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質の濃度をそれぞれ１０ｐｐｂおよび１０ｐｐｍ以下で含有する抗体集団を製造する段階と、を含む抗体集団の製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記方法で製造された主活性抗体を６０％以上含む抗体集団を提供することにある。
上述の目的を達成するための一様態において、本発明は、（ａ）抗体の混合液を含む試料を、平衡化された陽イオン交換カラムにローディングし、前記陽イオン交換カラムを洗浄した後、カラムに結合した抗体を溶出緩衝液で溶出させることを含む、抗体の混合液を含む試料から宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および異種抗体を除去する段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階で溶出された抗体溶出液に塩を混合した試料を疎水性相互作用カラムにローディングし、カラムに結合した抗体を溶出緩衝液で溶出させることを含む、抗体溶出液から宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および残留ＤＮＡ（Ｒｅｓｉｄｕａｌ ＤＮＡ）を除去する段階と、
（ｃ）前記（ｂ）段階の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および残留ＤＮＡが除去された抗体溶出液を陰イオン交換カラムに通過させて通過液（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）を収集することを含む、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および残留ＤＮＡ（Ｒｅｓｉｄｕａｌ ＤＮＡ）を除去する段階と、
（ｄ）前記（ｃ）段階で通過液（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）をウイルスフィルターに通過させてウイルスを除去する段階と、
（ｅ）前記（ｄ）段階で溶出された抗体溶出液を濃縮および緩衝液交換し、残留ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質の濃度をそれぞれ１０ｐｐｂおよび１０ｐｐｍ以下で含有する抗体集団を製造する段階と、を含む抗体集団の製造方法を提供する。
宿主細胞を通じて製造される抗体生成物には、主活性抗体のほかに、様々な異種抗体、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞に由来するＤＮＡおよび細胞成長のための因子を含む。前記異種抗体は、抗体中、一部のアミノ酸が脱アミンまたは酸化によって変形した形態の抗体であり、異種抗体ごとに生物学的活性に差異を示す。宿主細胞を通じて発現した抗体生成物には、このような異種抗体の比重が高く、特に抗体バイオシミラーの場合には、対照薬と類似した品質の製造が重要なので、宿主細胞から抗体を生産した後、異種抗体の含有量を調節する工程が必要である。これより、本発明では、宿主細胞タンパク質および宿主細胞に由来するＤＮＡを除去して純度を高め、宿主細胞培養液に比べて主活性抗体の割合を増加させることによって、目的とする割合の酸性異種抗体、主活性抗体および塩基性異種抗体を含む高純度および高品質の抗体集団を効果的に製造できる方法を提供する。
本発明による抗体集団の製造方法を用いると、高価なプロテインＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）カラムを使用することなく、不純物を除去して、高純度および高品質で目的とする抗体集団を製造できる。また、本発明による方法は、工程自動化を達成し、生産コストを大きく減少させたという点から優れた長所を有する方法を提供する。
本発明によるアダリムマブ抗体の製造工程を示すフロチャートである。 韓国特許登録第１０－１４９８７７１号に記載された方式と類似した方法を通じて行った陽イオン交換クロマトグラフィー実行結果を示す。 本発明の実施例２－１による陽イオン交換クロマトグラフィー実行結果を示す。 本発明の実施例２－２による陽イオン交換クロマトグラフィー実行結果を示す。 本発明による疎水性相互作用クロマトグラフィーを行った結果を示す。 本発明による陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーを行った結果を示す。
特に、本発明による方法は、上記のように高純度および高品質の抗体集団を提供しながらも、工程自動化を達成できる長所を有するだけでなく、生産コストを大きく減少させたという点から、優れた長所を有する方法を提供する。
本発明において「抗体集団（ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、主活性抗体および異種抗体を含む抗体群を意味し、本発明の目的上、前記抗体集団は、主活性抗体および異種抗体を目的とする割合で含む抗体群を意味する。前記抗体集団は、一種類の抗体だけを含むか、主活性抗体および異種抗体を共に含む抗体群を全部含む。本発明の目的上、前記抗体集団は、詳細には、宿主細胞を通じて製造した抗体生成物から宿主細胞タンパク質のような不純物および異種抗体を除去して主活性抗体の割合を高めた抗体群を意味する。
特に、抗体バイオシミラーの製造に本発明の方法を適用する場合、対照薬と同一または対応する組成で主活性抗体および異種抗体を含む抗体集団を製造できる。
前記目的とする抗体集団は、陽イオン交換樹脂カラムを用いた精製段階を通じて所望の範囲の異種抗体および主活性抗体を含むように製造でき、この場合、詳細には、主活性抗体の割合は、５０％以上であり、より詳細には、主活性抗体の割合は、６０％以上であり、塩基性異種抗体が２０％以下であり、酸性異種抗体が２０％以下であってもよい。具体的に、前記抗体集団は、６０％以上の主活性抗体（詳細には、６５％以上の主活性抗体）、２０％以下の酸性異種抗体および２０％以下の塩基性異種抗体を含んでもよい。
本発明の実施例では、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＣＯＯ－陽イオン交換カラムを用いてヒュミラ対照薬の品質と類似した含有量である、２０％以下の酸性異種抗体含有量、６０％以上の主活性抗体および２０％以下の塩基性異種抗体を含む抗体集団を製造した。
本発明において「抗体」という用語は、免疫系内で抗原の刺激によって作られる物質であり、特定の抗原と特異的に結合してリンパと血液を循環しつつ抗原－抗体反応を起こす物質を意味する。本発明の目的上、前記抗体は、高品質で精製されるためのタンパク質の一つであり、本発明による方法によって効率的に精製されることができる。
前記抗体は、一般的に等電点が他のタンパク質に比べて高いので、初期陽イオン交換樹脂を使用して培養上清液をカラムに吸着させた後、溶出させると、比較的高純度で一次精製することができる。前記等電点（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ，ｐＩ）は、タンパク質分子表面の平均実効電荷、すなわちタンパク質分子の電気二重層の電位が０となるｐＨ値であり、タンパク質の基が解離して陽イオン、陰イオン基の数が同数となって、実効電荷が０となるという点を意味する。本発明において精製されるための抗体は、これに限定されないが、等電点が、詳細には、７～１０であってもよく、より詳細には、７～９である抗体であってもよい。また、本発明の抗体は、これに限定されないが、詳細には、当該分野において通常使用される治療用抗体を全部含んでもよい。より詳細には、ＴＮＦ－α抑制剤であるアダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）でありうる。前記アダリムマブは、ヒュミラ（Ｈｕｍｉｒａ）とも言い、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬などに対する治療剤として知られている米国ＡｂｂＶｉｅ社で開発したＴＮＦ－α抑制剤抗体である。
本発明において「主活性抗体」という用語は、本発明の抗体集団に含まれる主な構成要素であり、抗体中、一部のアミノ酸が脱アミンや酸化によって変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）して、生物学的活性が低くならない状態の抗体、すなわち酸性または塩基性異種抗体でない抗体を意味する。前記主活性抗体は、目的とする抗体集団の品質を調節するために最も重要な構成要素であり、抗体の構成要素のうち生物学的活性が最も高い抗体である。
本発明において「異種抗体」という用語は、主活性抗体の一部のアミノ酸が脱アミンや酸化によって変形した抗体を意味し、酸性異種抗体および塩基性異種抗体を含む。その例として、アミノ酸のうちアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）が脱アミンして、アスパーテイト（Ａｓｐａｒｔａｔｅ）となった異種抗体、アミノ酸のうちメチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）が酸化してメチオニンサルフェート（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ）となった異種抗体などがある。また、重鎖のＮ末端にグルタメート（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）が存在する場合、前記グルタメートが五角形リング構造を形成してピログルタメート（Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ）に変形した異種抗体を含む。前記異種抗体は、ＣＨＯ細胞のような宿主細胞で抗体を生成する場合に、高い割合で宿主細胞培養液に含まれていて、クロマトグラフィーのような過程を通じて除去されて、目的とする割合で抗体集団に含まれなければならない。
したがって、抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが導入された宿主細胞で、高品質の抗体集団を製造するためには、上記のような異種抗体が適切に除去されて、主活性抗体および異種抗体が所望の含有量で含まれなければならない必要性がある。また、高純度の抗体集団を製造するためには、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞由来ＤＮＡ（ＨＣＤ）および細胞生長のための因子のような不純物が除去されなければならない。これより、本発明では、前記異種抗体の含有量調節だけでなく、宿主細胞タンパク質のような不純物が効果的に除去された、抗体集団の製造方法を開発した。
特に、本発明による方法は、上記のように高純度および高品質の抗体集団を提供しながらも、工程自動化を達成できると共に、生産コストおよび製造時間を大きく減少させたという点から、優れた長所を有する方法を提供する。また、ウイルス不活性化および除去能の観点から、本発明による精製工程を用いると、予期しないウイルス発現または汚染があっても、その除去が可能である。
本発明による抗体集団の製造方法は、（ａ）抗体の混合液を含む試料を、平衡化された陽イオン交換カラムにローディングし、前記陽イオン交換カラムを洗浄した後、カラムに結合した抗体を溶出緩衝液で溶出させることを含む、抗体の混合液を含む試料から宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および異種抗体を除去する段階を含む。
（ａ）段階の方法は、抗体の混合液を含む試料から宿主細胞タンパク質および異種抗体が除去された抗体を含む抗体溶出液を収集する段階である。
本発明において「抗体の混合液を含む試料」という用語は、抗体を生産する細胞の培養上清液または前記細胞の破砕物から部分精製された試料であり、主活性抗体、異種抗体を全部含む抗体の混合液を含む部分精製された試料を意味する。前記部分精製は、ろ過過程を行ったが、抗体以外の他のタンパク質も存在する状態を意味する。
前記抗体の混合液を含む試料は、宿主細胞を培養して目的抗体を生産させ、前記宿主細胞を除去して培養上清液を準備する段階と、前記培養上清液のｐＨを目的抗体の等電点より低いｐＨ、詳細には、ｐＨ４～６に調節して沈殿させた、沈殿物を除去する段階を順次に行うことで製造されることを特徴とする。すなわち、抗体の混合液を含む試料は、培養上清液のｐＨを４～６に調節して沈殿した沈殿物を除去する段階を含む方法で製造されたものであってもよい。
ｐＨを減少させた後、細胞を除去して試料を製造する場合、ｐＨ減少によって細胞の死滅が促進されて、宿主細胞タンパク質の含有量が高まるという短所を有する。これによって、細胞を除去した後、培養上清液のｐＨを調節する試料製造方法が宿主細胞タンパク質の含有量を低減するのに一層有利である。したがって、本発明において、詳細には、細胞を除去した後、培養上清液のｐＨを調節する試料製造方法で製造された試料を使用する。
前記細胞の除去方法は、当業界で通常使用される方法を使用でき、これに限定されないが、詳細には、フィルター、より詳細には、ろ過フィルターを使用できる。
前記抗体の混合液を含む試料は、陽イオン交換カラム注入前に５～７ｍＳ／ｃｍの伝導度を有するように調節されたものであってもよいが、これに限定されない。本発明の実施例では、カラム注入前に前処理した上清液に精製水を添加して伝導度を調節した。
本発明によれば、培養液で１次ろ過フィルターを経て細胞を除去し、回収した培養上清液をさらにｐＨ５に下げて再ろ過する過程で宿主細胞タンパク質の含有量が顕著に少なく、また、濁度分析において優れた効果を示した。
また、ｐＨを減少させて形成された前記沈殿物には、宿主細胞タンパク質が多量含有されていて、これを除去すると、宿主細胞タンパク質の含有量を低減することができる。前記沈殿物の除去は、陽イオン交換カラムに抗体を吸着させるための以前段階であり、抗体の場合、等電点が高いので、ｐＨを低くした酸性条件で凝集しないのに対し、一般的に抗体より等電点が低い宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の場合、ｐＨを低くした酸性条件で電荷が除去されて、ファンデルワールス（ｖａｎ ｄｅｒ ｗａａｌｓ）力により凝集するので、多量沈殿される。したがって、前記減少させる培養上清液のｐＨ範囲は、除去すべき宿主細胞タンパク質の沈殿を増加させるために、本発明において精製しようとする抗体の等電点より低いと同時に、前記宿主細胞タンパク質の等電点に近い値を使用できる。すなわち、前記ｐＨは、精製しようとする抗体の等電点より、詳細には、１～６小さい値であってもよく、より詳細には、２～５小さい値であってもよい。したがって、前記ｐＨは、最終的に、詳細には、３～７であってもよく、より詳細には、４～６であってもよく、さらに詳細には、４．５～５．５であってもよい。この際、沈殿物は、除菌フィルターのような当業界に通常使用されるフィルターなどを用いて除去することができる。本発明の実施例では、ｐＨを５に減少させて沈殿物を除去する場合、純度の高い前処理段階を行うことができることを確認した。上記のような前処理段階を通じて沈殿物を除去すると、以後の陽イオン交換カラム、疎水性相互作用カラム、陰イオン交換カラムを用いた精製段階でより効率的な抗体集団の精製をもたらすことができる。
（ａ）段階では、上記のように準備した抗体の混合液を含む試料を陽イオン交換カラムに注入し、陽イオン交換カラムを洗浄して異種抗体および宿主細胞タンパク質を除去した後、カラムに結合した抗体を溶出させる。
本発明において「陽イオン交換カラム」という用語は、陽イオン交換樹脂を充填したカラムを意味し、前記段階では、陽イオン交換クロマトグラフィーを行うことで、不純物、詳細には、宿主細胞タンパク質および異種抗体を除去することができる。前記陽イオン交換樹脂は、水溶液中の陽イオンと自分の陽イオンを交換する役割をする合成樹脂であり、抗体の場合、等電点が高いので、等電点値以下のｐＨ緩衝液では陽イオンを帯びることとなる。したがって、前記陽イオンを帯びる抗体を吸着できる陽イオン交換樹脂を用いて抗体集団の品質を高めることができる。前記陽イオン交換樹脂は、当業界で通常使用されるものを使用でき、これに限定されないが、詳細には、ＣＯＯ－またはＳＯ３の官能基を有しているカラムを使用でき、より詳細には、カルボキシメチル（ＣＭ）、フラクトゲル（ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ）またはスルホナート（Ｓ）などを使用でき、より詳細には、フラクトゲル（ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）ＳＯ３ －（ｓ）、ＰＯＲＯＳ ＸＳ、ＰＯＲＯＳ ＨＳ、カルボキシメチルセファロース（ＣＭ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）またはフラクトゲル（ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）ＣＯＯ－を使用できる。
前記（ａ）段階は、宿主細胞タンパク質および目的抗体の異種抗体を同時に除去することを特徴とする。
この際、前記宿主細胞タンパク質は、精製しようとする抗体を除いた不純物を全部含んでもよく、宿主細胞タンパク質自体だけでなく、宿主細胞に由来するＤＮＡおよび細胞生長のための因子などを全部含んでもよい。したがって、前記宿主細胞タンパク質を除去すると、精製しようとする抗体だけを高純度で精製することができる。
また、前記段階は、品質調節のために異種抗体を除去する段階であることを特徴とする。前記異種抗体は、酸性異種抗体および／または塩基性異種抗体であってもよい。宿主細胞を通じて発現する抗体生成物には、様々な異種抗体が存在するので、抗体バイオシミラーを製造するためには、対照薬と最も類似に品質を作ることが同質性立証の観点から重要である。前記異種抗体は、主活性抗体の数個のアミノ酸の変形した形態であり、主活性抗体、酸性異種抗体および塩基性異種抗体間に電荷（ｃｈａｒｇｅ）の微細な差異がある。したがって、この電荷の差異を用いて異種抗体を分離することができる。ただし、前記電荷差は、単に数個のアミノ酸による微細な差異であるから、分離のためには、非常に細かい条件設定が必要である。したがって、本発明では、前記酸性異種抗体および塩基性異種抗体の効果的な除去のために、陽イオン交換カラムを用いる。すなわち、本発明による方法は、アンイオン交換カラムを用いることによって、ｃｈａｒｇｅ ｖａｒｉａｎｔを所望の割合で調節できるという点から、優れた長所を有する。
また、前記異種抗体は、抗体中、一部のアミノ酸が脱アミンや酸化によって変形したものであり、異種抗体ごとに生物学的活性が差異があると知られていて、前記異種抗体の含有量分布を一定に有することが、一貫した品質を維持するために重要である。しかしながら、抗体を生産する宿主細胞培養上清液は、一般的に主活性抗体と比較したとき、酸性および塩基性異種抗体の含有量が相対的に高いので、これを一部除去して、３個の形態の抗体の含有量を合わせなければならない必要があり、本発明では、抗体集団のうち主活性抗体の割合が５０％、詳細には、６０％以上で含まれるように抗体集団を製造する。また、本発明の方法は、主活性抗体の割合が６０％以上であり、塩基性異種抗体の割合が２０％以下であり、および酸性異種抗体の割合が２０％以下となるように製造できる。
前記（ａ）段階で抗体の混合液を含む試料を、平衡化された陽イオン交換カラムにローディングする段階は、ｐＨ４．５～５．５の１５ｍＭ～３０ｍＭの酢酸塩および３５ｍＭ～４５ｍＭの塩化ナトリウムを含む、平衡緩衝液を使用するものであってもよい。
具体的に、ｐＨ４．５～５．５の１５ｍＭ～３０ｍＭの酢酸塩および３５ｍＭ～４５ｍＭの塩化ナトリウムを含む、平衡緩衝液で平衡化されたフラクトゲルＣＯＯ－カラムに、抗体の混合液を含む試料をローディングする段階であってもよい。前記平衡緩衝液の場合、５～７ｍＳ／ｃｍ、詳細には、５．５～６．５ｍＳ／ｃｍ、より詳細には、約６．０ｍＳ／ｃｍの伝導度を有するものであってもよい。このような平衡化の場合、約１１カラム体積以上、詳細には、１４カラム体積で前記緩衝液を使用することが好ましい。
本発明の実施例によれば、６．０ｍＳ／ｃｍの伝導度を有するｐＨ５．０の２０ｍＭの酢酸塩および４０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、平衡緩衝液で平衡化されたフラクトゲルＣＯＯ－カラムに、抗体の混合液を含む試料をローディングして陽イオン交換カラムで精製工程を始めた。
前記（ａ）段階で、洗浄段階は、詳細には、カラムに吸着しない抗体を付着させる第１洗浄段階と、酸性異種抗体を除去する第２洗浄段階の２段階を含んでもよい。
従来知られていた陽イオン交換カラム利用方式によれば、様々な段階の洗浄段階を含み、かつ、各段階ごとに用いられる緩衝液の組成およびｐＨと伝導度を大きく異ならさせた。
一方、本発明では、ただ２段階の洗浄段階と組成が単純な緩衝液を使用することによって、製造工程の観点から、コスト節減および製造工程の自動化を達成できるようにした。
具体的に、本発明による洗浄段階は、１）ｐＨ４．５～５．５の１５ｍＭ～３０ｍＭの酢酸塩および３５ｍＭ～４５ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で第１洗浄する段階と、２）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および５５～５９ｍＭ、詳細には、５７ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で第２洗浄する段階とで構成される。
本発明での第１洗浄工程は、ローディングする段階で使用された緩衝液と同一成分を含むｐＨ４．５～５．５の１５ｍＭ～３０ｍＭの酢酸塩および３５ｍＭ～４５ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で第１洗浄を行うものであってもよい。これによって、別途の緩衝液製造工程を必要とせず、連続的な工程を通じてカラムに吸着しない抗体をさらに付着させることができるという点から長所を有する。このような第１洗浄の場合、約３～７カラム体積、詳細には、約５カラム体積で前記緩衝液を使用することが好ましい。
本発明での第２洗浄工程は、ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および５５～５９ｍＭ、詳細には、５７ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で第２洗浄を行うものであってもよい。
本発明による第２洗浄工程および下記続く溶出（脱着）工程は、二つの緩衝液の処理割合を異ならさせて陽イオン交換カラムで精製を行うようにする。従来の先行技術で洗浄および平衡化段階を繰り返すこと、または４回以上の連続的な洗浄工程を別個の組成を有する緩衝液で行うこととは異なって、本発明では、二つの緩衝液の割合だけを調節することで、（ａ）段階の精製工程を手軽に行うことができる。これによって、製造工程の観点からコスト節減および製造工程の単純化を達成できるという長所を有する。
すなわち、本発明において（ａ）段階の洗浄および溶出工程は、ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩緩衝液を一定に含み、塩化ナトリウムのモル濃度を増加させることによって行われ得る。すなわち、ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩緩衝液にｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および定められたモル濃度の塩化ナトリウムを有する緩衝液の混合割合を変更（増加）しながら、塩化ナトリウムのモル濃度を増加させて、洗浄および脱着工程を行うようにする。
例えば、本発明の実施様態によれば、第２洗浄工程は、ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩を含む第１緩衝液；およびｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む第２緩衝液を混合したものを使用できる。具体的に、ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩を含む第１緩衝液を４１～４５重量％；およびｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む第２緩衝液を５５～５９重量％で混合して、第２洗浄工程に必要な緩衝液組成を作ることができる。このような混合の場合、機器的に設定された各段階別に混合比によって二つのそれぞれの緩衝液貯蔵空間から各緩衝液の適切な容量を提供することによって行われ得る。
本発明の具体的な実施例による第２洗浄段階は、前記第１緩衝液および第２緩衝液をそれぞれ４３重量％および５７重量％で共に処理して、ｐＨ５．５～６．５の３０ｍＭ酢酸塩および５７ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で第２洗浄工程を行うようにした。このような第２洗浄の場合、約３～１７カラム体積、詳細には、約１５カラム体積または０．１ＡＵを示す前まで前記緩衝液を使用することが好ましい。
前記（ａ）段階で溶出（脱着）段階は、詳細には、第１溶出段階と、第２洗浄段階と、第３溶出段階の３段階を含んでもよい。
具体的に、１）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および５７～６３ｍＭ、詳細には、６０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で抗体を第１溶出させる段階と、２）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および６７～７３ｍＭ、詳細には、７０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で抗体を第２溶出させる段階と、３）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および７７～８３ｍＭ、詳細には、８０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で抗体を第３溶出させる段階で行われ得る。
本発明では、先立って第２洗浄工程で確認したように、溶出工程を処理する二つの緩衝液の割合だけを調節することで手軽に行うことができる。これによって、製造工程の観点からコスト節減および製造工程の自動化を達成した。
（ａ）段階の溶出工程は、ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩緩衝液を一定に含み、塩化ナトリウムのモル濃度を増加させることによって行われ得る。すなわち、ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩緩衝液にｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および定められたモル濃度の塩化ナトリウムを有する緩衝液の混合割合を変更（増加）しながら、塩化ナトリウムのモル濃度を増加させて脱着工程を行うようにする。
例えば、本発明の実施様態によれば、溶出工程で用いられる緩衝液は、ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩を含む第１緩衝液；およびｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む第２緩衝液を混合したものであってもよい。
具体的に、第１溶出工程でｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩を含む第１緩衝液を３７～４３重量％；およびｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む第２緩衝液を５７～６３重量％で含むものであってもよい。
具体的に、第２溶出工程でｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩を含む第１緩衝液を２７～３３重量％；およびｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む第２緩衝液を６７～７３重量％で含むものであってもよい。
具体的に、第３溶出工程でｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩を含む第１緩衝液を１７～２３重量％；およびｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む第２緩衝液を７７～８３重量％で含むものであってもよい。
本発明の具体的な実施例による第１溶出段階は、前記第１緩衝液および第２緩衝液をそれぞれ４０重量％および６０重量％で共に処理して、ｐＨ５．５～６．５の３０ｍＭ酢酸塩および６０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で第１溶出工程を行うようにした。このような第１溶出の場合、約５～２０カラム体積、詳細には、約７～１７カラム体積、より詳細には、約８～１５カラム体積で前記緩衝液を使用することが好ましい。
本発明の具体的な実施例による第２溶出段階は、前記第１緩衝液および第２緩衝液をそれぞれ３０重量％および７０重量％で共に処理して、ｐＨ５．５～６．５の３０ｍＭ酢酸塩および７０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で第２溶出工程を行うようにした。このような第２溶出の場合、約７～２０カラム体積、詳細には、約８～１７カラム体積、より詳細には、９～１５カラム体積で前記緩衝液を使用することが好ましい。
本発明の具体的な実施例による第３溶出段階は、前記第１緩衝液および第２緩衝液をそれぞれ２０重量％および８０重量％で共に処理して、ｐＨ５．５～６．５の３０ｍＭ酢酸塩および８０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で第３溶出工程を行うようにした。このような第３溶出の場合、約６～１８カラム体積、詳細には、約８～１６カラム体積、より詳細には、９～１４カラム体積または０．１ ＡＵまで前記緩衝液を使用することが好ましい。
すなわち、本発明による、（ａ）抗体の混合液を含む試料を、平衡化された陽イオン交換カラムにローディングし、前記陽イオン交換カラムを洗浄した後、カラムに結合した抗体を溶出緩衝液で溶出させることを含む、抗体の混合液を含む試料から宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および異種抗体を除去する段階は、具体的に前記ローディング、洗浄および溶出段階において下記を含んでもよい：
１）ｐＨ４．５～５．５の１５ｍＭ～３０ｍＭの酢酸塩および３５ｍＭ～４５ｍＭの塩化ナトリウムを含む、平衡緩衝液で平衡化されたフラクトゲルＣＯＯ－カラムに、抗体の混合液を含む試料をローディングする段階；
２）ｐＨ４．５～５．５の１５ｍＭ～３０ｍＭの酢酸塩および３５ｍＭ～４５ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で第１洗浄する段階；
３）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および５５～５９ｍＭ、詳細には、５７ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で第２洗浄する段階；
４）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および５７～６３ｍＭ、詳細には、６０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で抗体を第１溶出させる段階；
５）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および６７～７３ｍＭ、詳細には、７０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で抗体を第２溶出させる 段階；および
６）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および７７～８３ｍＭ、詳細には、８０ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で抗体を第３溶出させる段階。
本発明の実施例では、前記段階を含む平衡化およびローディング；第１洗浄；第２洗浄；第１溶出；第２溶出；および第３溶出の段階を経て抗体を精製することによって、宿主由来タンパク質およびＤＮＡを大きく減少させ、かつ、高い主活性抗体の含有量を有する抗体を精製した。
前記方法で異種抗体の除去のための方法は、酸性異種抗体および塩基性異種抗体を同時に除去するために、詳細には、フラクトゲル（ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）ＣＯＯ－を使用できる。
酸性異種抗体とともに塩基性異種抗体が多く混ざっている場合には、塩基性異種抗体の除去において分離能を有する陽イオン交換カラムを必要とするが、この場合、合成重合体であるメタアクリレート重合樹脂を支持体として構成しているフラクトゲル（ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）ＣＯＯ－を用いて酸性異種抗体と塩基性異種抗体の除去を同時に行うことが好ましい。
また、本実施例による陽イオン交換クロマトグラフィーにおいてＦｌｏｗ ｒａｔｅは、１８０ｃｍ／ｈｒであり、従来知られていた方法に比べて１．５倍以上（例えば、１．５５倍～２．２４倍以上速い流速）の速い流速を用いることができるという長所を有する。このような速い流速の場合、従来の方法と比べて時間対比高い生産率を有することができるようにする。
本発明において、前記（ａ）段階後に、（ｂ）段階を行う前に、ウイルスを不活性化する段階を含んでもよい。
具体的に、ウイルス不活性化は、前記溶出液に含有されたウイルスが非機能性になるようにしたり、前記溶出液からウイルスを除去することを含む。ウイルスを非機能性になるようにしたり、ウイルスを除去する方法には、熱不活性化、ｐＨ不活性化、または化学的不活性化方法などが含まれ、詳細には、ｐＨ不活性化方法を使用できるが、これに限定されない。前記ｐＨ不活性化方法は、ウイルスが十分に非機能性になりうる程度のｐＨで処理する方法であり、このようなｐＨ不活性化の方法は、低ｐＨウイルス不活性化方法を含み、前記方法は、（ａ）段階で溶出された抗体溶出液を、ｐＨ３．０～４．０の範囲、詳細には、ｐＨ３．８で滴定することによって行われ得るが、これに限定されない。
具体的に、（ａ）段階で溶出された抗体溶出液は、６０％以上の主活性抗体、２０％以下の酸性異種抗体、および２０％以下の塩基性異種抗体を含むものであってもよい。
本発明による抗体集団の製造方法は、（ｂ）前記（ａ）段階で溶出された抗体溶出液に塩を混合した試料を疎水性相互作用カラムにローディングし、カラムに結合した抗体を溶出緩衝液で溶出させることを含む、抗体溶出液から宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および残留ＤＮＡ（Ｒｅｓｉｄｕａｌ ＤＮＡ）を除去する段階を含む。
本発明の方法で、（ｂ）段階の方法は、（ａ）段階で収集された抗体溶出液から宿主細胞タンパク質および残留ＤＮＡ（Ｒｅｓｉｄｕａｌ ＤＮＡ）がさらに除去された抗体溶出液を収集する段階である。
前記（ａ）段階で収集された抗体溶出液は、収集された溶出液それ自体またはさらに他の緩衝液で希釈された形態であってもよい。また、上記で言及したように、ウイルスを不活性化する段階を経た溶出液試料であってもよい。本発明において前記疎水性相互作用カラムにローディングされる試料は、（ａ）段階で溶出された抗体溶出液に塩を追加することによって製造することができる。前記疎水性相互作用カラムにローディングされる試料に含まれる塩の種類は、特に限定されないが、本発明の実施例では、クエン酸塩を使用した。また、前記試料は、（ｂ）段階の疎水性相互作用カラムの平衡緩衝液の塩濃度に対して０．８倍～１．２倍の塩濃度を有するように調節した試料であってもよく、詳細には、（ａ）段階の抗体溶出液の塩濃度を平衡緩衝液と同じ塩濃度を有するように調節した試料であってもよいが、これに限定されない。
また、前記（ｂ）段階の溶出段階は、濃度勾配方式でカラムに付着した抗体を溶出することを含む。本発明の実施例では、段階方式より濃度勾配方法が収率および溶出体積の観点から有利であることを確認した。
前記（ｂ）段階は、（ａ）段階で除去しない宿主細胞タンパク質、残留ＤＮＡ（Ｒｅｓｉｄｕａｌ ＤＮＡ）などの不純物を除去して純度をより高めるための目的を有し、（ａ）精製段階の陽イオン交換カラムと分離機序が異なる、疎水性差異によって宿主細胞タンパク質を除去できる疎水性相互作用カラムを用いた精製段階を提供する。
本発明において「疎水性相互作用カラム」という用語は、疎水性相互作用樹脂を充填したカラムを意味し、前記段階では、疎水性相互作用クロマトグラフィーを行うことで不純物、詳細には、宿主細胞タンパク質を除去できるカラムを意味する。タンパク質は、全体的に親水性であるが、親水性と共に疎水性を有している領域があり、これら領域の疎水性は、静電的相互作用が強い条件下では発現しないが、溶媒のイオン強度あるいは誘電率を高めて静電的相互作用を弱くすると、相対的に強く発現する特徴がある。ここで、疎水性リガンド（長い炭化水素鎖または芳香環）を親水性クロマトグラフィー用基材（アガロースゲルピーズ、有機系高分子支持体など）に導入して濃い塩濃度で平衡化させておくと、様々なタンパク質を吸着することができ、その後、塩濃度を下げると、タンパク質の性質によって溶出するので分離することができる。すなわち、塩を用いて疎水性環境が提供される場合、タンパク質それぞれの疎水性の差異によって特定カラムに吸着される強度の差異が示され、このような原理を用いて疎水性相互作用カラムを用いた宿主細胞タンパク質および残留ＤＮＡ（Ｒｅｓｉｄｕａｌ ＤＮＡ）を除去する前記（ｂ）段階を行うことができる。
前記疎水性相互作用樹脂は、当業界で通常使用されるものを使用でき、これに限定されないが、詳細には、フェニルカラム、ブチルカラム、フェニルセファロース（ｐｈｅｎｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）またはフラクトゲルＥＭＡフェニルカラムなどを使用でき、より詳細には、フェニルセファロースを使用できる。
また、前記（ｂ）段階は、２５ｍＭ～３５ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５．５～６．５）および０．３Ｍ～１．０Ｍクエン酸塩を含む平衡緩衝液で平衡化された疎水性相互作用カラムに、（ａ）段階で溶出された抗体溶出液を平衡緩衝液と同じクエン酸塩濃度に合わせた試料をローディングし、２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩（ｐＨ５．５～６．５）を含む溶出緩衝液を濃度勾配方式で適用して、抗体を溶出する段階を含んでもよい。
本発明は、緩衝液でｐＨ６．０条件の酢酸塩緩衝液を使用した場合に、収率が高いことを確認し、溶出方法でも緩衝液の濃度勾配を用いる方法が収率に優れていることを確認して、濃度勾配方式を用いるみた製造方法の前記段階が高純度の抗体集団の製造に有用であることを確認した。
本発明による抗体集団の製造方法は、前記（ｂ）段階後に、（ｃ）段階の前に、フィルターを用いて前記（ｂ）段階の抗体溶出液をろ過する段階を含んでもよい。
本発明において、ろ過は、例えば、限外ろ過および／または透析ろ過を行うものであってもよい。
詳細には、限外ろ過が行われ得る。本願に使用された用語「限外ろ過（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」または「ＵＦ」は、溶媒または小型溶質分子を通過させ、巨大分子を維持させる半透過性膜で溶液または懸濁液を処理する任意の技術を意味する。限外ろ過は、溶液または懸濁液で巨大分子の濃度を増加させるために使用できる。
また、詳細には、透析ろ過が行われ得る。本願に使用された用語「透析ろ過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」または「ＤＦ」は、可溶性透過物（ｐｅｒｍｅａｔｅ）成分を減少させるために、残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を溶媒で希釈して再ろ過する特化したろ過部類を意味するために使用される。透析ろ過は、例えば、タンパク質を含む保有された成分の濃度増加を誘導したり誘導しない。例えば、連続透析ろ過で、溶媒は、濾液の生成速度と同じ速度で残留物に連続的に添加される。この場合、残留物の容積および保有された成分の濃度は、工程中に変化しない。一方、不連続または順次希釈透析ろ過で、限外ろ過段階は、残留物側に溶媒の添加を伴い；残留物に添加された溶媒の容積が生成された濾液の容積以上の場合、保有された成分は、高い濃度を有する。透析ろ過は、ｐＨ、イオン強度、塩組成、緩衝剤組成、または巨大分子の溶液または懸濁液のその他特性を変更するために使用できる。
このような１次ろ過工程を通じて、宿主細胞タンパク質の含有量をさらに減少させることができる。
本発明による抗体集団の製造方法は、（ｃ）前記（ｂ）段階の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および残留ＤＮＡが除去された抗体溶出液を陰イオン交換カラムに通過させて通過液（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）を収集することを含む、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および残留ＤＮＡ（Ｒｅｓｉｄｕａｌ ＤＮＡ）を除去する段階を含む。
本発明の方法で、（ｃ）段階の方法は、（ｂ）段階で収集した抗体溶出液から不純物が除去された所望の抗体集団を収集する段階であり、具体的に、前記（ｃ）段階は、前記（ｂ）段階の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および残留ＤＮＡ（Ｒｅｓｉｄｕａｌ ＤＮＡ）が除去された抗体溶出液を陰イオン交換カラムに通過させて通過液（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）を収集する段階である。また、前記（ｂ）段階で収集された抗体溶出液は、収集された溶出液それ自体またはさらに他の緩衝液で希釈された形態、ろ過工程などをさらに行った形態などであってもよいが、これに限定されない。
本発明において「陰イオン交換カラム」という用語は、陰イオン交換樹脂を充填したカラムを意味し、前記段階では、陰イオン交換クロマトグラフィーを行うことで、不純物、詳細には、宿主細胞タンパク質を除去できるカラムを意味するが、これに限定されない。前記陰イオン交換樹脂は、水溶液中の特定の陰イオンと自分の陰イオンを交換する役割をする合成樹脂であり、陰イオン交換カラムは、等電点以上で陰イオンを帯びるタンパク質を吸着させることができる。抗体の場合、等電点が高いので、中性ｐＨの緩衝液を使用する場合、抗体が陰イオン交換樹脂に吸着せずに通過することとなるが、宿主細胞タンパク質を含む不純物は、等電点が低いので、陰イオン交換樹脂に吸着して除去されることができ、前記原理を用いて高純度の抗体集団の製造に用いられ得る。
前記陰イオン交換樹脂は、当業界で通常使用されるものを使用でき、これに限定されないが、詳細には、キューセファロース（Ｑ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、４級アミノエチルまたは４級アミン（Ｑ）などを使用でき、より詳細には、Ｑ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗを使用できる。
また、前記方法は、目的抗体のｐＩより低いｐＨを有する平衡緩衝液、詳細には、ｐＨ７．０～８．０の平衡緩衝液、より詳細には、トリス塩化水素（ｐＨ７．０～８．０）を含む平衡緩衝液を用いるものであってもよい。
前記段階で除去される宿主細胞タンパク質は、上記で言及したように、精製しようとする抗体を除いた不純物を全部含む概念であり、宿主細胞タンパク質自体だけでなく、宿主細胞に由来するＤＮＡおよび細胞生長のための因子などを全部含んでもよい。したがって、本段階で宿主細胞タンパク質を除去すると、精製しようとする抗体だけを高純度で精製することができる。また、前記陰イオン交換カラムは、宿主細胞タンパク質だけでなく、エンドトキシンの除去にも効率的なカラムであるから、最終精製段階で宿主細胞タンパク質と共にエンドトキシンを除去して、純度が高い目的とする抗体集団を精製することができる。
本発明による抗体集団の製造方法は、（ｄ）前記（ｃ）段階で通過液（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）をウイルスフィルターに通過させてウイルスを除去する段階を含む。
本発明による抗体集団の製造方法は、従来の先行技術での一般的な方法とは異なって、限外ろ過、透析ろ過および／または多層ろ過フィルターなどを用いてフィルターを行う前にウイルスフィルタリングを行う。従来の一般的な方式は、限外ろ過、透析ろ過および多層ろ過フィルターを用いてフィルタリングを行った後、ウイルスフィルタリングを行うので、高い濃度の薬物を調製するのに困難があった。一方、本発明による方法は、ウイルスフィルタリングを先に行うことによって、限外ろ過、透析ろ過および／または多層ろ過フィルター段階にＬｏａｄｉｎｇ量を減らして、タンパク質品質の確保と同時に、収率損失を低減し、高い濃度の薬物調製が容易であるという長所を有する。
具体的に、本発明においてウイルスフィルターは、Ｍｏｄｕｓ １．３（Ｍｅｒｃｋ製品）を使用できる。詳細には、当該材質は、ＰＥＳ材質を用いることが好ましい。
本発明による抗体集団の製造方法は、（ｅ）前記（ｄ）段階で溶出された抗体溶出液を濃縮および緩衝液交換し、残留ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質の濃度をそれぞれ１０ｐｐｂおよび１０ｐｐｍ以下で含有する抗体集団を製造する段階を含む。
本発明において前記製造された抗体溶出液の濃縮および緩衝液交換は、製品化、抗体の貯蔵のための通常の濃縮および緩衝液交換工程を意味し得る。
前記ウイルスフィルターが行われたフィルターされた抗体を含む溶液（溶出された抗体溶出液）は、引き続いて、限外ろ過、透析ろ過などが行われ得る。限外ろ過および透析ろ過は、上述した通りである。
上記のようなウイルス除去およびろ過工程を通じて、ウイルス不純物を除去し、ＨＣＰおよび残留ＤＮＡをさらに除去することができる。また、このような後続の限外ろ過、透析ろ過は、濃縮および／またはバッファー交換などのために用いられ得る。
緩衝液の場合、通常の抗体を貯蔵したり、剤形の製造に必要な緩衝液要件を有する成分を全部含んでもよい。例えば、緩衝液は、薬剤学的に許容される賦形剤の例として、本願に参照として引用される文献［参照：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）］に記載されている任意の非イオン性賦形剤またはイオン性賦形剤を含んで公知の濃度の賦形剤を有する剤形を製造するための一般的な緩衝液成分を含んでもよい。前記緩衝液交換は、例えば、抗体濃度などを変化させることなく、非イオン性賦形剤、例えば、ポリソルベートおよびポロキサマーなどの糖または非イオン性界面活性剤などを含む緩衝液の交換であってもよい。
本発明によって製造された濃縮および緩衝液交換がなされた本発明による抗体集団は、宿主細胞タンパク質の含有量は、１０ｐｐｍ以下、例えば、０．０００１～１０ｐｐｍであってもよく、より詳細には、０．００１～５ｐｐｍであってもよい。また、残留ＤＮＡは、１０ｐｐｂ以下、例えば、０．０００１～１０ｐｐｂ、より詳細には、０．００１～１ｐｐｂであってもよい。
本発明による実施例では、本発明の抗体精製方法によれば、９９．９％の高純度で抗体を精製することができることを確認した。特に、製造された抗体集団の場合、残留ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質の濃度をそれぞれ０．１ｐｐｂおよび５ｐｐｍ以下で含有する抗体集団を含む。
もう一様態において、本発明は、前記方法で製造された、主活性抗体を６０％以上含む抗体集団を提供する。
前記方法、抗体集団および主活性抗体を６０％以上含む抗体集団については、上記で説明した通りである。
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。ただし、下記実施例は、本発明を例示するものであり、本発明が下記実施例によって限定されるものではない。
以下、実施例による抗体の製造工程のフロチャートは、図１に具体的に示した。具体的に、本発明による抗体を含む培養液試料を回収してフィルタリング後、陽イオン交換樹脂を経る。その後、ウイルス不活性化を行い、疎水性反応樹脂を経る。次に、１次限外ろ過後、陰イオン交換樹脂を経る。最後に、ウイルスフィルターを経て２次限外ろ過後、剤形化を行う。上記に簡略に言及した具体的工程について以下の実施例において具体的に説明する。
実施例１：抗体精製のための培養液前処理方法
アダリムマブ抗体を発現させる組換えＣＨＯ細胞を培養してアダリムマブ抗体を発現させた後、陽イオン交換カラムに抗体を吸着させるためにｐＨを６以下に下げた。
本実施例において培養液前処理方法によって不純物除去程度を確認した。
本実施例では、細胞が含まれている培養液状態でｐＨを５に下げた後、ろ過フィルターを経て陽イオン交換カラムに注入するための試料を製造する方法を使用し、その具体的条件は、表１に示した。
Figure 0007430012000001
前記方法によって培養液を前処理し、順序（１）の培養液、（２）の上清液、（４）の酸処理後の培養液、（６）のろ過および除菌フィルター後の前処理培養液に対する濁度を分析した。その結果、（１）の培養液の場合、ｔｕｒｂｉｄｉｔｙが６８１０ ＮＴＵであることが確認され、（２）の上清液の場合、ｔｕｒｂｉｄｉｔｙが２．９８ ＮＴＵであることが確認された。また、（４）の酸処理後の培養液の場合、ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ：５４７５ ＮＴＵであることが確認され、最終（６）のろ過および除菌フィルター後の前処理培養液の場合、５．１３ ＮＴＵであることが確認された。
また、ろ過段階で平均Ｆｌｕｘは、１５０ＬＭＨ内外と大きいろ過容量を示し、培養液前処理段階で損失が少ないことを確認することができた。
各段階で、ろ過処理後、約９９％以上の濁度除去率を示して、後続段階の使用に適した前処理培養液が製造されたことを確認した。
前記結果は、本発明の前処理方法で初期ろ過フィルターで細胞を１次除去した後、工程を行う方法が適していることを示す。また、ｐＨ６以下（好ましくは、ｐＨ５）に下げて沈殿物を除去すると、初期培養液より非常に高い純度を有する培養上清液が得られることを示した。
実施例２：陽イオン交換クロマトグラフィー
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを用いたカラム工程を代替できる、陽イオン交換カラムのうち純度と収率の観点から有利な官能基を有するカラムとしてＦｒａｃｔｏｇｅｌ ＣＯＯ－を選定した。
前記設定された陽イオン交換カラムを用いて異種抗体を調節する実験を実施し、その過程は、下記の通りである。
平衡化のために、ｐＨ５．０、２０ｍＭ酢酸塩および４０ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で１４カラム体積を流してカラムを平衡化（６．０ｍＳ／ｃｍ）させた後、前処理が完了した上清液をＣＭの吸着容量（２５ｍｇ／ｍＬカラム）以下でローディングした。
ローディング後、洗浄１緩衝液（ｐＨ５．０、２０ｍＭ酢酸塩および４０ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液、６．０ｍＳ／ｃｍ）を５カラム体積で処理して、カラムに吸着しない抗体を付着し、残りは上清液を洗浄する洗浄１段階を行った。
その後、第１緩衝液（ｐＨ６．０、３０ｍＭ酢酸塩、２．４ｍＳ／ｃｍ）および第２緩衝液（ｐＨ６．０、３０ｍＭ酢酸塩および１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液、１２．５ｍＳ／ｃｍ）を全体１５カラム体積で第１緩衝液に対して４３重量％および第２緩衝液に対して５７重量％の割合で処理して、洗浄２段階を行った。
ここで、第１緩衝液に対して４３重量％および第２緩衝液に対して５７重量％の割合で、混ざり合った緩衝液の形態で洗浄２段階を行った。
その後、脱着段階を行うために、第１緩衝液を４０重量％、３０重量％および２０重量％；および第２緩衝液を６０重量％、７０重量％、８０重量％の３段階でそれぞれ減少および増加させて脱着段階を行った。
それぞれの混合は、前記洗浄２段階と同様に、優先的に行われた後、混ざり合った緩衝液を用いて３段階の溶出（脱着）段階を行った。
従来知られていた陽イオン交換クロマトグラフィーの一般的な方式とは異なって、本発明では、使用される緩衝液溶液の種類を３種に単純化させ、洗浄段階を２段階にして従来技術対比大きく減少させた。
また、脱着を行うための段階は、第１緩衝液および第２緩衝液の溶液の割合だけを調節しながら反応を行うことで、全体ステップの自動化および単純化を可能にした。
また、本実施例による陽イオン交換クロマトグラフィーにおいてＦｌｏｗ ｒａｔｅは、１８０ｃｍ／ｈｒであり、従来知られていた方法に比べて１．５倍以上の速い流速を用いた。このような速い流速の場合、従来の方法と比べて時間対比高い生産率を有することができるようにする。
以下、本発明による陽イオン交換樹脂Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＣＯＯ－を用いた異種抗体精製過程を表２に具体的に記載した。
Figure 0007430012000002
一方、比較のために、先行韓国特許１０－１４９８７７１号と類似した方式でＮａＣｌを含まない平衡化段階を追加して溶出を行った。具体的に、洗浄１段階で全体５カラム体積でｐＨ５．０，２０ｍＭ酢酸塩および４０ｍＭ塩化ナトリウム；洗浄２段階で全体１０カラム体積でｐＨ６．０、３０ｍＭ酢酸塩；脱着１段階で全体１０カラム体積でｐＨ６．０、３０ｍＭ酢酸塩および５０ｍＭ塩化ナトリウム；脱着２段階で１．５カラム体積でｐＨ６．０、３０ｍＭ酢酸塩；脱着３段階で８カラム体積でｐＨ６．０、３０ｍＭ酢酸塩および８０ｍＭ塩化ナトリウムを処理した（比較例）。
前記実験結果を図２～図４に示した。
図２は、前記比較例による陽イオン交換クロマトグラフィー結果を示し、図３は、本発明による実施例２－１の結果を示し、図４は、本発明による実施例２－２の結果を示す。
前記陽イオン交換クロマトグラフィーを通じて確認された酸性異種抗体、主活性抗体および塩基性異種抗体の割合および収率を下記表３に示した。
Figure 0007430012000003
上記のような陽イオン交換カラムの条件を用いた精製工程は、主活性抗体の含有量を大きく増加させ、かつ、収率も大きく増加させた。さらに、 溶出（Ｅｌｕｔｉｏｎ）されるタンパク質を収集するにあたって、ただ３種のバッファー溶液を使用することによって、工程自動化を可能にした。このような長所は、抗体の生産時にバッファーの調製およびＦｏｏｔｐｒｉｎｔの費用を減少させるさらなる長所を示す。
最も大きな長所は、前記３種のバッファーを順に注入し、溶出（Ｅｌｕｔｉｏｎ）時にタンパク質をｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅを基準として収集するので、確立された条件下に高収率で抗体を収得できる便宜性が増大し、これは、工程自動化に好適に適用されることができる。
実施例３：ウイルス不活性化
前記実施例２－１および２－２によって収得した１次溶出液を１Ｍクエン酸緩衝液を添加してｐＨ３．８で１時間の間ウイルス不活性化をさせた。不活性化が完了した後、２Ｍ Ｔｒｉｚｍａ ｂａｓｅ緩衝液を添加して試料のｐＨを６．０に調整した。ウイルス不活性化が完了した試料は、０．２μｍフィルターを通過させてろ過した。
実施例４：疎水性反応樹脂
疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＩＣ）の種類であるフェニルセファロース（ｐｈｅｎｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ｆａｓｔ ｆｌｏｗを用いて抗体の精製時に純度を高める工程を行った。
具体的に、ＨＩＣを行うために、前記実施例３の方法で製造されたそれぞれの溶出液を用いた。
酢酸塩ｐＨ６．０を基本として０．６Ｍクエン酸塩の濃度で吸着させ、溶出時に溶出緩衝液を５カラム体積まで濃度勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）を与えて溶出させる方式を用いた。
陽イオン交換樹脂における基本緩衝液が酢酸塩ｐＨ６．０以下を利用していて、ｐＨ６．０以下の利用は、緩衝液製造の観点から製造工程を単純化できるという利点がある。
溶出方法で５カラム体積濃度勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）方法が収率の観点から優れた結果を示し、緩衝液の場合、酢酸塩緩衝液ｐＨ６．０が収率および抗体のｐＨ安定性の観点から優れていた。
前記疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の具体的条件は、下記表４に示した。
Figure 0007430012000004
上記の条件下に疎水性相互作用クロマトグラフィーを行い、その結果を図５に示した。
実施例５：１次限外ろ過
Ｆｅｅｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ≦１ ｂａｒの条件で２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５、２．０ｍＳ／ｃｍ）でＰｅｌｌｉｃｏｎ ３ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ｍｅｍｂｒａｎｅ）を平衡化させ、工程液を１０ｍｇ／ｍＬに濃縮させた。その後、緩衝液で工程液のｐＨおよび伝導度を７．５および≦３．０ｍＳ／ｃｍとなるように交換して、１次限外ろ過を行った。
実施例６：陰イオン交換樹脂クロマトグラフィー
本発明の製造方法では、陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いてさらに高い純度の抗体集団を製造する工程を糾明した。
具体的に、陰イオン交換カラムは、等電点以上で陰イオンを帯びるタンパク質を吸着させるので、等電点が７以上である抗体の場合（例えば、アダリムマブの場合、等電点が７～１０、ヒュミラの場合、略８．４）、中性ｐＨの緩衝液を使用する場合、本抗体は、陰イオン交換樹脂に吸着せずに、通過液（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）として排出されるる。これによって、本発明の製造工程に適した陰イオン交換樹脂および緩衝液の条件を糾明するために、下記のような実験を行った。
具体的に、本実施例では、陰イオン交換樹脂として生産スケールで多く使用している４級アミン（Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ａｍｉｎｅ）系のＱ Ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（ＱＦＦ，ＧＥ社）を用いて精製を実施した。まず、陰イオン交換樹脂にローディングするためのサンプル準備として、培養上清液で陽イオン交換カラム、疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）および限外ろ過１次を経て緩衝液を置換して、適正の伝導度およびｐＨで準備した。緩衝液は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５の条件で純度、宿主細胞タンパク質含有量、残留ＤＮＡ含有量および収率を確認した。
陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーの結果を図６に示した。
製造された抗体集団で純度が１００％、ＨＣＰ含有量が６．８ｎｇ／ｍｇ、残留ＤＮＡ含有量が０．０４ｐｇ／ｍｇ、収率が９４～９７％を示した。その結果、陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーで緩衝液はＴｒｉｓ ＨＣｌを含む緩衝液であり、ｐＨは７～８であることが、本発明の抗体集団の製造に有利であることを示唆する。
実施例７：ウイルスフィルタリング、２次限外ろ過および透析ろ過
前記実施例６の陰イオン交換樹脂クロマトグラフィーを行ったサンプルをウイルスウイルスフィルターＭｏｄｕｓ １．３（Ｍｅｒｃｋ）を用いてフィルタリングを行った。
その後、限外ろ過フィルターＰｅｌｌｉｃｏｎ ３ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ｍｅｍｂｒａｎｅ）フィルターで２次限外ろ過を行った。具体的に、Ｆｅｅｄ ｐｒｅｓｓｕｒｅ≦１ ｂａｒの条件で１４ｍＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ緩衝液（ｐＨ５．２、≧１２．０ｍＳ／ｃｍ）でＰｅｌｌｉｃｏｎ ３ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ｍｅｍｂｒａｎｅ）を平衡化させ、工程液を５５．５ｍｇ／ｍＬに濃縮させた。その後、緩衝液で工程液のｐＨおよび伝導度を５．２および≧１１．０ｍＳ／ｃｍとなるように交換した。
上記のようなウイルスフィルタリングは、従来の先行特許韓国１０－１４９８７７１号での方法と異なって、２次限外ろ過を行う前に、ウイルスフィルタリングを行うものである。前記先行特許で、１次限外ろ過および２次限外ろ過を行った後、ウイルスフィルタリングを行うので、高い濃度の薬物を調製するのに困難があった。一方、本発明による方法は、２次限外ろ過に先立ってウイルスフィルタリングを先に行うことによって、２次限外ろ過段階にローディング量を減らして、タンパク質品質の確保と同時に、収率損失を低減し、高い濃度の薬物調製が容易であるという長所を有する。
実施例８：大量バッチで全体工程による宿主由来タンパク質（ＨＣＰ）およびＤＮＡ含有量変化の確認
前記実施例１～７の手続きによって全体工程での宿主由来タンパク質およびＤＮＡ含有量を確認し、その結果を下記の表５に示した。
下記の表５に記載された試料の場合、実施例２－２による製造工程によって収得された試料に対する結果である。
Figure 0007430012000005
前記表５から確認できるように、各段階別にＨＣＰ含有量およびＤＮＡ含有量を確認した。その結果、実施例２－２に記載した陽イオン交換クロマトグラフィーを通じて宿主細胞由来ＤＮＡの含有量を大きく減少させた。その後、ウイルス不活性化を優先的に実施し、剤形すぐに前段階での限外／透析ろ過を通じてタンパク質品質の確保と同時に、収率損失を低減し、高い濃度の薬物調製が容易にした。また、上記の一連の段階を通じて宿主由来タンパク質およびＤＮＡの含有量を最小化させた抗体集団を製造することができた
実施例９：大量バッチで全体工程によるウイルス除去能の確認
前記実施例１～７の手続きによって行われた全体工程のうち、Ｌｏｗ ｐＨ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ、Ａｎｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ｖｉｒｕｓ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ工程でのウイルス除去率を確認し、その結果を下記の表６に示した。
Figure 0007430012000006
前記表６から確認できるように、各段階別にＭＬＶ、ＰＲＶ、Ｒｅｏ ３、ＭＭＶウイルスの不活性化および除去能を確認した。前記結果の場合、本発明による工程による抗体集団でウイルスの発現が殆どないことを示す。特に、上記の各工程でウイルス不活性化および除去能を考慮するとき、本発明による精製工程に予期しないウイルス発現または汚染があっても、その除去が可能であることを示す。
以上の説明から、本発明の属する技術分野における当業者は、本発明がその技術的思想や必須特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されることができることを理解することができる。これと関連して、以上で記述した実施例は、すべての観点において例示的なものであり、限定的なものではないことを理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求範囲の意味および範囲そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解すべきである。
（付記）
本開示の発明は以下の態様を含む。
＜項１＞
（ａ）抗体の混合液を含む試料を、平衡化された陽イオン交換カラムにローディングし、前記陽イオン交換カラムを洗浄した後、カラムに結合した抗体を溶出緩衝液で溶出させることを含む、抗体の混合液を含む試料から宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および異種抗体を除去する段階と、
（ｂ）前記（ａ）段階で溶出された抗体溶出液に塩を混合した試料を疎水性相互作用カラムにローディングし、カラムに結合した抗体を溶出緩衝液で溶出させることを含む、抗体溶出液から宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および残留ＤＮＡ（Ｒｅｓｉｄｕａｌ ＤＮＡ）を除去する段階と、
（ｃ）前記（ｂ）段階の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および残留ＤＮＡが除去された抗体溶出液を陰イオン交換カラムに通過させて通過液（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）を収集することを含む、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および残留ＤＮＡ（Ｒｅｓｉｄｕａｌ
ＤＮＡ）を除去する段階と、
（ｄ）前記（ｃ）段階で通過液（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）をウイルスフィルターに通過させてウイルスを除去する段階と、
（ｅ）前記（ｄ）段階で溶出された抗体溶出液を濃縮および緩衝液交換し、残留ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質の濃度をそれぞれ１０ｐｐｂおよび１０ｐｐｍ以下で含有する抗体集団を製造する段階と、を含む抗体集団の製造方法。
＜項２＞
前記（ａ）段階の抗体の混合液を含む試料は、培養上清液のｐＨを４～６に調節して沈殿した沈殿物を除去する段階を含む方法で製造されたものである、＜項１＞に記載の方法。
＜項３＞
前記（ａ）段階の抗体の混合液を含む試料は、溶液の伝導度が５ｍＳ／ｃｍ～７ｍＳ／ｃｍである、＜項１＞に記載の方法。
＜項４＞
前記抗体は、等電点が７～１０である、＜項１＞に記載の方法。
＜項５＞
前記抗体は、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）である、＜項１＞に記載の方法。
＜項６＞
前記（ａ）段階で溶出された抗体溶出液は、６０％以上の主活性抗体、２０％以下の酸性異種抗体、および２０％以下の塩基性異種抗体を含む、＜項１＞に記載の方法。
＜項７＞
抗体の混合液を含む試料を、平衡化された陽イオン交換カラムにローディングする段階は、ｐＨ４．５～５．５の１５ｍＭ～３０ｍＭの酢酸塩および３５ｍＭ～４５ｍＭの塩化ナトリウムを含む、平衡緩衝液で平衡化されたフラクトゲルＣＯＯ － カラムに、抗体の混合液を含む試料をローディングする段階を含む、＜項１＞に記載の方法。
＜項８＞
陽イオン交換カラムを洗浄する段階は、
１）ｐＨ４．５～５．５の１５ｍＭ～３０ｍＭの酢酸塩および３５ｍＭ～４５ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で第１洗浄する段階と、
２）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および５５～５９ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で第２洗浄する段階と、を含む、＜項１＞に記載の方法。
＜項９＞
第２洗浄する段階で緩衝液は、ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩緩衝液にｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および定められたモル濃度の塩化ナトリウムを有する緩衝液を混合して、５５～５９ｍＭの塩化ナトリウムのモル濃度を有するように製造されたものである、＜項８＞に記載の方法。
＜項１０＞
カラムに結合した抗体を溶出緩衝液で溶出させる段階は、
１）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および５７～６３ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で抗体を第１溶出させる段階と、
２）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および６７～７３ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で抗体を第２溶出させる段階と、
３）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および７７～８３ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で抗体を第３溶出させる段階と、を含む、＜項１＞に記載の方法。
＜項１１＞
第１、第２および第３溶出させる段階の緩衝液は、
ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩緩衝液にｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および定められたモル濃度の塩化ナトリウムを有する緩衝液を混合して、第１、第２および第３溶出させる段階の前記定められた塩化ナトリウムのモル濃度を有するように製造されたものである、＜項１０＞に記載の方法。
＜項１２＞
前記（ａ）段階は、１）ｐＨ４．５～５．５の１５ｍＭ～３０ｍＭの酢酸塩および３５ｍＭ～４５ｍＭの塩化ナトリウムを含む、平衡緩衝液で平衡化されたフラクトゲルＣＯＯ － カラムに、抗体の混合液を含む試料をローディングする段階；
２）ｐＨ４．５～５．５の１５ｍＭ～３０ｍＭの酢酸塩および３５ｍＭ～４５ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で第１洗浄する段階；
３）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および５５～５９ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で第２洗浄する段階；
４）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および５７～６３ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で抗体を第１溶出させる段階；
５）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および６７～７３ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で抗体を第２溶出させる段階；および
６）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および７７～８３ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で抗体を第３溶出させる段階である、＜項１＞に記載の方法。
＜項１３＞
前記（ｂ）段階は、濃度勾配（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）方式で抗体を溶出する、＜項１＞に記載の方法。
＜項１４＞
前記濃度勾配方式は、２５ｍＭ～３５ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５．５～６．５）および０．３Ｍ～１．０Ｍクエン酸塩を含む平衡緩衝液で平衡化された疎水性相互作用カラムに、（ａ）段階で溶出された抗体溶出液を平衡緩衝液と同じクエン酸塩濃度に合わせた試料をローディングし、ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩を含む溶出緩衝液を濃度勾配方式で適用して、抗体を溶出する段階を含む、＜項１３＞に記載の方法。
＜項１５＞
前記（ｂ）段階の疎水性相互作用カラムは、フェニルセファロース（Ｐｈｅｎｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムである、＜項１＞に記載の方法。
＜項１６＞
前記（ｃ）段階の陰イオン交換カラムは、試料注入前にｐＨ７．０～８．０の平衡緩衝液で平衡化されたものである、＜項１＞に記載の方法。
＜項１７＞
前記平衡緩衝液は、ｐＨ７．０～８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む、＜項１６＞に記載の方法。
＜項１８＞
前記（ｃ）段階の陰イオン交換カラムは、Ｑファーストフロー（Ｑ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）カラムである、＜項１＞に記載の方法。
＜項１９＞
＜項１＞に記載の方法によって製造された抗体集団であって、
前記抗体集団は、主活性抗体を６０％以上含む抗体集団。
＜項２０＞
＜項１＞に記載の方法によって製造された抗体集団であって、
前記残留ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質の濃度がそれぞれ０．１ｐｐｂおよび５ｐｐｍ以下である抗体集団。

Claims (10)

  1. （ａ）抗体の混合液を含む試料を、平衡化された陽イオン交換カラムにローディングし、前記陽イオン交換カラムを洗浄した後、カラムに結合した抗体を溶出緩衝液で溶出させることを含む、抗体の混合液を含む試料から宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および異種抗体を除去する段階と、ここで、前記陽イオン交換カラムはＣＯＯ － の官能基を有する、
    （ｂ）前記（ａ）段階で溶出された抗体溶出液に塩を混合した試料を疎水性相互作用カラムにローディングし、カラムに結合した抗体を溶出緩衝液で溶出させることを含む、抗体溶出液から宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および残留ＤＮＡ（Ｒｅｓｉｄｕａｌ ＤＮＡ）を除去する段階と、
    （ｃ）前記（ｂ）段階の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および残留ＤＮＡが除去された抗体溶出液を陰イオン交換カラムに通過させて通過液（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）を収集することを含む、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および残留ＤＮＡ（Ｒｅｓｉｄｕａｌ ＤＮＡ）を除去する段階と、
    （ｄ）前記（ｃ）段階で通過液（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）をウイルスフィルターに通過させてウイルスを除去する段階と、
    （ｅ）前記（ｄ）段階で溶出された抗体溶出液を濃縮および緩衝液交換し、残留ＤＮＡおよび宿主細胞タンパク質の濃度をそれぞれ１０ｐｐｂおよび１０ｐｐｍ以下で含有する抗体集団を製造する段階と、を含み、
    前記（ａ）段階は、
    １）ｐＨ４．５～５．５の１５ｍＭ～３０ｍＭの酢酸塩および３５ｍＭ～４５ｍＭの塩化ナトリウムを含む、平衡緩衝液で平衡化された陽イオン交換カラムに、抗体の混合液を含む試料をローディングする段階；
    ２）ｐＨ４．５～５．５の１５ｍＭ～３０ｍＭの酢酸塩および３５ｍＭ～４５ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で第１洗浄する段階；
    ３）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および５５～５９ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で第２洗浄する段階；
    ４）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および５７～６３ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で抗体を第１溶出させる段階；
    ５）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および６７～７３ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で抗体を第２溶出させる段階；および
    ６）ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩および７７～８３ｍＭの塩化ナトリウムを含む、緩衝液で抗体を第３溶出させる段階、を含み、
    前記（ｂ）段階は、
    ２５ｍＭ～３５ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５．５～６．５）および０．３Ｍ～１．０Ｍクエン酸塩を含む平衡緩衝液で平衡化された疎水性相互作用カラムに、（ａ）段階で溶出された抗体溶出液を平衡緩衝液と同じクエン酸塩濃度に合わせた試料をローディングし、ｐＨ５．５～６．５の２５ｍＭ～３５ｍＭの酢酸塩を含む溶出緩衝液を濃度勾配方式で適用して、抗体を溶出する段階、を含み、
    前記抗体は、等電点が７～１０である、
    抗体集団の製造方法。
  2. 前記（ａ）段階の抗体の混合液を含む試料は、培養上清液のｐＨを４～６に調節して沈殿した沈殿物を除去する段階を含む方法で製造されたものである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記（ａ）段階の抗体の混合液を含む試料は、溶液の伝導度が５ｍＳ／ｃｍ～７ｍＳ／ｃｍである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記抗体は、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記（ａ）段階で溶出された抗体溶出液は、６０％以上の主活性抗体、２０％以下の酸性異種抗体、および２０％以下の塩基性異種抗体を含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記陽イオン交換カラムは、フラクトゲルＣＯＯ－カラムである、請求項１に記載の方法。
  7. 前記（ｂ）段階の疎水性相互作用カラムは、フェニルセファロース（Ｐｈｅｎｙｌ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムである、請求項１に記載の方法。
  8. 前記（ｃ）段階の陰イオン交換カラムは、試料注入前にｐＨ７．０～８．０の平衡緩衝液で平衡化されたものである、請求項１に記載の方法。
  9. 前記平衡緩衝液は、ｐＨ７．０～８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む、請求項８に記載の方法。
  10. 前記（ｃ）段階の陰イオン交換カラムは、Ｑファーストフロー（Ｑ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）カラムである、請求項１に記載の方法。
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