CN115427425A - 阿达木单抗的非蛋白a纯化方法 - Google Patents

阿达木单抗的非蛋白a纯化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115427425A
CN115427425A CN202180015238.XA CN202180015238A CN115427425A CN 115427425 A CN115427425 A CN 115427425A CN 202180015238 A CN202180015238 A CN 202180015238A CN 115427425 A CN115427425 A CN 115427425A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
buffer
acetate
column
sodium chloride
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180015238.XA
Other languages
English (en)
Inventor
梁宰荣
朴志成
沈载
严润晶
李文载
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Presti Biopharma Pte Ltd
Original Assignee
Presti Biopharma Pte Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Presti Biopharma Pte Ltd filed Critical Presti Biopharma Pte Ltd
Publication of CN115427425A publication Critical patent/CN115427425A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/16—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the fluid carrier
    • B01D15/166—Fluid composition conditioning, e.g. gradient
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/18—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns
    • B01D15/1864—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns using two or more columns
    • B01D15/1871—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns using two or more columns placed in series
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/32—Bonded phase chromatography
    • B01D15/325—Reversed phase
    • B01D15/327—Reversed phase with hydrophobic interaction
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/362—Cation-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/363—Anion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
    • B01D15/424—Elution mode
    • B01D15/426—Specific type of solvent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/20—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the sorbent material
    • B01D15/203—Equilibration or regeneration

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及抗体群的制备方法及通过上述方法制备的抗体群，其可不使用昂贵的蛋白A(protein A)柱，可通过去除杂质来制备高纯度及高质量的所需的抗体群，尤其，可实现工艺自动化，并大大减少生产成本。

Description

阿达木单抗的非蛋白A纯化方法
技术领域
本发明涉及在不使用作为亲和层析的蛋白A(protein A)柱的情况下以低费用制备高纯度及高收率的抗体群的方法。
背景技术
生物制药研究研发的最新趋势在于，重点在于抗体片段的开发。相比于以往，开发了更多的生物类似药(biosimilar)治疗蛋白质，但在开发生物类似药产品时的重大难点有分离纯化工艺(downstream processing)的高费用、工艺及与生成物关联的杂质的非选择性清除、生成物的蛋白质分解等。相比于全尺寸的单克隆抗体(mAb)治疗剂，抗体片段提供特定优点，这优点为如增强对肿瘤的深度渗透、无法接近全尺寸的mAb的特异性表位结合等。如高效价克隆及连续性生物-制备(bio-manufacturing)的发酵培养工艺(up streamprocesses)中的进步将生物制药产品的重点转移到提高整体分离纯化工艺的经济性。分离纯化工艺占用于单克隆抗体治疗剂的整体制备费用的约60％至70％。分离纯化工艺的捕获程序、中间程序及打磨(polishing)程序包括使用昂贵的各种层析操作。
由此，关于抗体药物，对纯化工艺进行更多的研究研发。
具体地，作为用于生产抗体药物的纯化工艺，主要进行利用蛋白A柱的纯化工艺。但是，在利用蛋白A柱的纯化方法的情况下，具有可在初始步骤中能够以高纯度生产的优点，但是，价格相比于普通离子交换树脂高30倍以上，从而具有生产成本高的缺点。
根据以往的报告，蛋白A树脂占相当于抗体药品生产原料成本的约35％的高比例，在柱中洗脱的微量的蛋白A可在人体内部引起免疫反应或生理反应。因此，在利用蛋白A柱的纯化工艺的情况下，具有按照工艺监控并去除残留的蛋白A的困难。并且，作为生物相容性基团的蛋白A具有化学稳定性弱的缺点，在柱的再生步骤中，需在保持蛋白A的活性的状态下再生，因此，无法使用在洗涤工艺中必须使用的1M的NaOH，因此，无法完全去除附着在柱的杂质，从而，具有再生柱来使用的次数相比于其他普通化学数值显著降低的局限。
为了解决这种问题，已经进行了许多努力以使用阳离子交换柱、疏水性柱、阴离子交换柱等来去除杂质并研发高纯度抗体。
但是，当利用除了使用如上所述的蛋白A之外的柱制备抗体时，直到实现以高收率及高纯度生产抗体为止发现了诸多问题。
例如，在通常使用阳离子交换柱的情况下，在纯化工艺中混合使用各种缓冲液。由此，由于使用多个缓冲液而引起的复杂的工艺，难以收集洗脱(E lution)的蛋白质。尤其，当使用阳离子交换柱时，洗涤(Washing)工艺需要使用具有大量的不同成分的缓冲液组成成分，因此，具有自动化及工艺简化非常难的问题。
由于如上所述的问题，抗体生产费用及生产时间大大增加，在品质确保方面，难以实现充分的效果，也不易进行工艺的自动化。
在这种背景下，提供便于获得生物类似药产品，尤其，纯化的抗体片段的分离纯化工艺非常重要。在坚持现有技术的分离纯化步骤而提出的问题中，本发明人所要提供用于纯化抗体群的方法。通过本发明获得的纯化的抗体群满足优秀的纯度及活性标准。
发明内容
要解决的技术问题
本发明人在不使用通常用于抗体纯化的昂贵的蛋白A柱，依次利用在减少去除细胞的培养上清液的pH来去除沉淀物的预处理步骤后的适合条件下设置的阳离子交换柱、疏水相互作用柱及阴离子交换柱，在此过程中，将方法变更为在适当的时间点执行病毒过滤及过滤工艺，从而确认了可制备高质量的抗体群。由此，本发明提供下述目的的发明。
本发明的一目的在于，提供一种抗体群的制备方法，其包括：步骤(a)，将包含抗体的混合液的试料加载到平衡化的阳离子交换柱，洗涤上述阳离子交换柱后，利用洗脱缓冲液对与柱结合的抗体进行洗脱，从而从包含抗体的混合液的试料去除宿主细胞蛋白(HCP)及异构抗体；
步骤(b)，将向在上述步骤(a)中洗脱的抗体洗脱液混合盐的试料加载到疏水相互作用柱，利用洗脱缓冲液对与柱结合的抗体进行洗脱，从而从抗体洗脱液去除宿主细胞蛋白(HCP)及残留DNA(Residual DNA)；
步骤(c)，使上述步骤(b)的去除宿主细胞蛋白(HCP)及残留DNA的抗体洗脱液通过阴离子交换柱来收集通过液(flow-through)，从而去除宿主细胞蛋白(HCP)及残留DNA(Residual DNA)；
步骤(d)，使上述步骤(c)中的通过液(flow-through)通过病毒过滤器来去除病毒；以及
步骤(e)，对在上述步骤(d)中洗脱的抗体洗脱液进行浓缩及缓冲液交换，制备分别以10ppb及10ppm以下的浓度包含残留DNA及宿主细胞蛋白的抗体群。
本发明的另一目的在于，提供一种抗体群，其包含60％以上的通过上述方法制备的主要活性抗体。
用于解决问题的手段
作为用于实现上述目的的一种实施方式，本发明提供一种抗体群的制备方法，其包括：步骤(a)，将包含抗体的混合液的试料加载到平衡化的阳离子交换柱，洗涤上述阳离子交换柱后，利用洗脱缓冲液对与柱结合的抗体进行洗脱，从而从包含抗体的混合液的试料去除宿主细胞蛋白(HCP)及异构抗体；
步骤(b)，将向在上述步骤(a)中洗脱的抗体洗脱液混合盐的试料加载到疏水相互作用柱，利用洗脱缓冲液对与柱结合的抗体进行洗脱，从而从抗体洗脱液去除宿主细胞蛋白(HCP)及残留DNA(Residual DNA)；
步骤(c)，使上述步骤(b)的去除宿主细胞蛋白(HCP)及残留DNA的抗体洗脱液通过阴离子交换柱来收集通过液(flow-through)，从而去除宿主细胞蛋白(HCP)及残留DNA(Residual DNA)；
步骤(d)，使上述步骤(c)中的通过液(flow-through)通过病毒过滤器来去除病毒；以及
步骤(e)，对在上述步骤(d)中洗脱的抗体洗脱液进行浓缩及缓冲液交换，制备分别以10ppb及10ppm以下的浓度包含残留DNA及宿主细胞蛋白的抗体群。
除主要活性抗体之外，通过宿主细胞制备的抗体生成物还包含各种异构抗体、宿主细胞蛋白(HCP)、源自宿主细胞的DNA及用于细胞生长的因子。上述异构抗体为抗体中的一部分氨基酸通过脱氨基或氧化而修饰的形态的抗体，每种异构抗体的生物活性不同。在通过宿主细胞表达的抗体生成物中，这种异构抗体的比重高，尤其，在抗体生物类似药的情况下，制备与对照药相似的质量非常重要，因此，利用宿主细胞生产抗体之后，需进行调节异构抗体的含量的工艺。因此，本发明提供如下的方法：通过去除宿主细胞蛋白及源自宿主细胞的DNA来提高纯度，相比于宿主细胞培养液，增加主要活性抗体的比例，并可有效地制备包含所要比例的酸性异构抗体、主要活性抗体及碱性异构抗体的高纯度及高质量的抗体群。
尤其，本发明的方法提供具有如下优秀优点的方法：在提供如上所述的高纯度及高质量的抗体群的同时实现工艺自动化，还大大减少生产成本。
在本发明中，术语“抗体群(a population of antibodies)”是指包含主要活性抗体及异构抗体的抗体组，出于本发明的目的，上述抗体群是指以所要的比例包含主要活性抗体及异构抗体的抗体组。上述抗体群仅包含一种抗体，或者包含所有包含主要活性抗体及异构抗体两者的抗体组。出于本发明的目的，详细地，上述抗体群是指从通过宿主细胞制备的抗体生成物去除如宿主细胞蛋白的杂质及异构抗体来提高主要活性抗体的比例的抗体组。
尤其，在制备抗体生物类似药时引用本发明的方法的情况下，可制备以与对照药相同或相应的组成成分包含主要活性抗体及异构抗体的抗体群。
上述所要的抗体群能够以通过利用阳离子交换树脂柱的纯化步骤包含所要范围的异构抗体及主要活性抗体的方式制备，在此情况下，详细地，主要活性抗体的比例为50％以上，更详细地，主要活性抗体的比例为60％以上，碱性异构抗体为20％以下，酸性异构抗体可以为20％以下。具体地，上述抗体群可包含60％以上的主要活性抗体(详细地，65％以上的主要活性物质)、20％以下的酸性异构抗体及20％以下的碱性异构抗体。
在本发明的实施例中，通过利用Fractogel COO-阳离子交换柱来制备了包含与修美乐对照药质量相似的含量——20％以下的酸性异构抗体含量、60％以上的主要活性抗体及20％以下的碱性异构抗体的抗体群。
在本发明中，术语“抗体”为通过刺激免疫系统中的抗原而产生的物质，是指通过与特定抗原特异性结合来在淋巴和血液中循环以引起抗原-抗体反应的物质。出于本发明的目的，上述抗体为用于高质量纯化的蛋白质之一，可通过本发明的方法有效纯化。
通常，上述抗体的等电点比其他蛋白质高，因此，通过使用初始阳离子交换树脂将培养上清液吸附在柱后，当进行洗脱时，能够以较高的纯度进行第一次纯化。上述等电点(isoelectric point，pI)为蛋白质分子表面的平均有效电荷，即，蛋白质分子的双电层的电势成为0的pH，意味着蛋白质的基团解离而使阳离子基团、阴离子基团的数变得相同，从而使有效电荷变为0的点。在本发明中用于纯化的抗体并不局限于此，详细地，等电点可以为7至10，更详细地，可以为7至9的抗体。并且，本发明的抗体并不局限于此，详细地，可包括所有在本领域中通常使用的用于治疗的抗体。更详细地，可以为作为TNF-α抑制剂的阿达木单抗(Adalimumab)。上述阿达木单抗还称为修美乐(Humira)，是在对于类风湿关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、银屑病等的治疗剂而周知的美国AbbVie公司开发的TNF-α抑制剂抗体。
在本发明中，术语“主要活性抗体”为包括在本发明的抗体群的主要成分，是指抗体中的一部分氨基酸通过脱氨基或氧化而修饰(modification)而不降低生物活性的状态的抗体，即，并不是酸性或碱性异构抗体的抗体。上述主要活性抗体为用于调节所要的抗体群的质量的最重要的成分，是抗体的成分中生物活性最高的抗体。
在本发明中，术语“异构抗体”是指主要活性抗体的一部分氨基酸通过脱氨基或氧化而修饰的抗体，包括酸性异构抗体以及碱性异构抗体。例如，有氨基酸中的天冬酰胺(Asparagine)被脱氨基而成为天冬氨酸盐(Aspatate)的异构抗体、氨基酸中的蛋氨酸(methionine)被氧化而成为蛋氨酸硫酸(Methionine sulfate)的异构抗体等。并且，当在重链的N末端存在谷氨酸盐(glutamate)的情况下，包含上述谷氨酸盐形成五边形环结构而修饰为丙酮谷氨酸(Pyruglutamate)的异构抗体。在如CHO细胞的宿主细胞中生成抗体的情况下，上述异构抗体以高比例包含在宿主细胞培养液，由此，应通过如层析的过程被去除而以所要的比例包含在抗体群。
因此，在引入包含编码抗体的多核苷酸的载体的宿主细胞中，为了制备高质量的抗体群，需要适当的去除如上所述的异构抗体而以所要的含量包含主要活性抗体及异构抗体。并且，为了制备高纯度的抗体群，需去除如宿主细胞蛋白(HCP)、源自宿主细胞的DNA(HCD)及用于细胞生长的因子的杂质。因此，在本发明中开发了一种抗体群的制备方法，其不仅调节上述异构抗体的含量，还有效地去除了如宿主细胞蛋白的杂质。
尤其，本发明的方法提供具有如下优秀优点的方法：在提供高纯度及高质量的抗体群的同时实现工艺自动化，还大大减少生产成本及制备时间。并且，在病毒失活及去除能力方面，当利用本发明的纯化工艺时，即使发生意想不到的病毒表达或污染，也可将其去除。
本发明的抗体群的制备方法包括步骤(a)，其将包含抗体的混合液的试料加载到平衡化的阳离子交换柱，洗涤上述阳离子交换柱后，利用洗脱缓冲液对与柱结合的抗体进行洗脱，从而从包含抗体的混合液的试料去除宿主细胞蛋白(HCP)及异构抗体。
步骤(a)的方法为收集包含如下的抗体的抗体洗脱液的步骤，即，从包含抗体的混合液的试料去除宿主细胞蛋白及异构抗体的抗体。
在本发明中，术语“包含抗体的混合液的试料”为从生产抗体的细胞的培养上清液或上述细胞的破碎物部分纯化的试料，是指包含含有主要活性抗体、异构抗体两者的抗体的混合液的部分纯化的试料。上述部分纯化执行了过滤过程，但还存在抗体之外的其他蛋白质的状态。
上述包含抗体的混合液的试料依次执行如下的步骤而制备：培养宿主细胞来生产目标抗体，去除上述宿主细胞来准备培养上清液；以及将上述培养上清液的pH调节为低于目标抗体的等电点的pH，详细地，去除通过将pH调节为4至6来沉淀的沉淀物。即，包含抗体的混合液的试料可通过包含将培养上清液的pH调节为4至6来去除沉淀的沉淀物的步骤的方法来制备。
在减少pH后去除细胞来制备试料的情况下，具有通过减少pH来促进细胞凋亡并提高宿主细胞蛋白含量的缺点。由此，去除细胞后调节培养上清液的pH的试料制备方法更有利于降低宿主细胞蛋白的含量。因此，详细地，在本发明中，使用通过去除细胞后调节培养上清液的pH的试料制备方法制备的试料。
上述细胞的去除方法可使用本领域通常使用的方法，并不局限于此，但详细地，可使用过滤器，更详细地，可使用屏障过滤器。
上述包含抗体的混合液的试料可在注入阳离子交换柱之前以具有5mS/cm至7mS/cm的导电率的方式进行调节，但并不局限于此。在本发明的实施例中，在注入柱之前，可向预处理的上清液添加纯化水来调节导电率。
根据本发明，在将在培养液中经过一次过滤过滤器来去除细胞并回收的培养上清液再次降低至pH 5来再过滤的过程中，宿主细胞蛋白的含量显著少，且浊度分析中示出优秀的效果。
并且，减少pH而形成的上述沉淀物中含有大量的宿主细胞蛋白，当去除其时，可降低宿主细胞蛋白的含量。上述沉淀物的去除是用于在阳离子交换柱吸附抗体之前的步骤，在抗体的情况下，等电点高，因此，在降低pH的酸性条件下不会发生凝聚，相反，通常，在等电点低于抗体的宿主细胞蛋白(HCP)的情况下，在降低pH的酸性条件下去除电荷，并通过范德华力(van der waals)凝聚而大量沉淀。因此，上述需降低的培养上清液的pH范围可使用低于下述的值：为了增加需去除的宿主细胞蛋白的沉淀而在本发明中所要纯化的抗体的等电点的同时接近上述宿主细胞蛋白的等电点的值。即，上述pH可以为比所要纯化的抗体的等电点，更详细地，低1至6的值，更详细地，可以为低2至5的值。因此，详细地，上述pH最终可以为3至7，更详细地，可以为4至6，更加详细地，可以为4.5至5.5。此时，沉淀物可利用如除菌过滤器的本领域通常使用的过滤器等去除。在本发明的实施例中，在将pH减少至5来去除沉淀物的情况下，确认可执行纯度高的预处理步骤。当通过如上所述的预处理步骤去除沉淀物时，在之后的利用阳离子交换柱、疏水相互作用柱、阴离子交换柱的步骤中可更有效地纯化抗体群。
在步骤(a)中，将通过如上所述的方式准备的包含抗体的混合液的试料注入至阳离子交换柱，洗涤阳离子交换柱来去除异构抗体及宿主细胞蛋白后，对与柱结合的抗体进行洗脱。
在本发明中，术语“阳离子交换柱”是指填充阳离子交换树脂的柱，在上述步骤中，可通过执行阳离子交换层析来去除杂质，详细地，可去除宿主细胞蛋白及异构抗体。上述阳离子交换树脂为起到交换水溶液中的阳离子与自身的阳离子的作用的合成树脂，在抗体的情况下，等电点高，因此，在等电点值以下的pH缓冲液中带阳离子。因此，可利用能够吸附带上述阳离子的抗体的阳离子交换树脂来提高抗体群的质量。上述阳离子交换树脂可使用本领域通常使用的，虽并不限定于此，详细地，可使用具有COO-或SO3的官能团的柱，更详细地，可使用羧甲基(CM)、Fractogel、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸盐(P)或磺酸盐(S)等，更详细地，可使用Fractogel SO3 -(s)、POROS XS、POROS HS、羧甲基琼脂糖(CM sepharose)或Fractogel COO-。
上述步骤(a)同时去除宿主细胞蛋白及目标抗体的异构抗体。
此时，上述宿主细胞蛋白可包含除所要纯化的抗体之外的所有杂质，不仅可包含宿主细胞蛋白，还可包含源自宿主细胞的DNA及用于细胞生长的因子等。因此，当去除上述宿主细胞蛋白时，能够以高纯度仅纯化所要纯化的抗体。
并且，上述步骤是为了调节质量而去除异构抗体的步骤。上述异构抗体可以为酸性异构抗体和/或碱性异构抗体。在通过宿主细胞表达的抗体生成物中存在各种异构抗体，因此，为了制备抗体生物类似药，就证明同质性而言，使质量与对照药最相似是很重要的。上述异构抗体为主要活性抗体的几个氨基酸的修饰形态，主要活性抗体、酸性异构抗体及碱性异构抗体之间的电荷(charge)略有不同。因此，可利用该电荷差来分离异构抗体。但是，上述电荷差仅为几个氨基酸引起的微小差异，因此，为了分离，需要设置非常详细的条件。因此，在本发明中，为了有效地去除上述酸性异构抗体及碱性异构抗体，利用阳离子交换柱。即，本发明的方法还在通过利用阳离子交换柱以所要的比例调节电荷变体(chargevariant)方面具有优秀的优点。
并且，上述异构抗体是抗体中的一部分氨基酸通过脱氨基或氧化而修饰而成的，每个异构抗体具有生物活性差异而周知，使上述异构抗体的含量分布恒定是保持一致的质量的重要因素。但是，通常，相比于主要活性抗体，生产抗体的宿主细胞培养上清液的酸性及碱性异构抗体的含量相对高，因此，需要去除其的一部分来调整3个形态的抗体的含量，在本发明中，以在抗体群中以50％，详细地，60％以上的比例包含主要活性抗体的方式制备抗体群。并且，在本发明的方法中，能够以使主要活性抗体的比例成为60％以上、碱性异构抗体的比例成为20％以下且酸性异构抗体的比例成为20％以下的方式制备。
在上述步骤(a)中，在将包含抗体的混合液的试料加载到平衡化的阳离子交换柱的步骤中，可使用包含pH 4.5至5.5的15mM至30mM的醋酸盐及35mM至45mM的氯化钠的平衡缓冲液。
具体地，可以为向利用包含pH 4.5至5.5的15mM至30mM的醋酸盐及35mM至45mM的氯化钠的平衡缓冲液平衡化的Fractogel COO-柱加载包含抗体的混合液的试料的步骤。在上述平衡缓冲液的情况下，可具有5mS/cm至7mS/cm的导电率，详细地，可具有5.5mS/cm至6.5mS/cm的导电率，更详细地，可具有约6.0mS/cm的导电率。在这种平衡化的情况下，优选地，以约11柱体积以上，详细地，14柱体积使用上述缓冲液。
根据本发明的实施例，通过向利用包含具有6.0mS/cm的导电率的pH 5.0的20mM的醋酸盐及40mM的氯化钠的平衡缓冲液平衡化的Fractogel COO-柱加载包含抗体的混合液的试料，并利用阳离子交换柱开始纯化工艺。
详细地，上述步骤(a)中的洗涤步骤可包括如下的两个步骤：附着未附着在柱的抗体的第一次洗涤步骤；以及去除酸性异构抗体的第二次洗涤步骤。
根据以往周知的阳离子交换柱利用方式，包括多个步骤的洗涤步骤，并且，使在各步骤中利用的缓冲液的组成成分、pH及导电率显著不同。
相反，在本发明中，使用仅两个步骤的洗涤步骤及组成成分简单的缓冲液，从而可在制备工艺方面实现成本节减及制备工艺的自动化。
具体地，本发明的洗涤步骤可包括：1)，利用包含pH 4.5至5.5的15mM至30mM的醋酸盐及35mM至45mM的氯化钠的缓冲液进行第一次洗涤；以及2)，利用包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及55mM至59mM，详细地，57mM的氯化钠的缓冲液进行第二次洗涤。
在本发明中的第一次洗涤工艺中，可利用包含与在加载步骤中使用缓冲液相同的成分的包含pH 4.5至5.5的15mM至30mM的醋酸盐及35mM至45mM的氯化钠的缓冲液执行第一次洗涤。由此，在如下方面具有优点：无需额外的缓冲液制备工艺，可通过连续工艺追加附着未附着在柱的抗体。在这种第一次洗涤的情况下，能够以约3柱体积至7柱体积，详细地，约5柱体积使用上述缓冲液。
在本发明中的第二次洗涤工艺中，可利用包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及55mM至59mM，详细地，57mM的氯化钠的缓冲液执行第二次洗涤。
本发明的第二次洗涤工艺及下述随后的洗脱(解吸)工艺可使两种缓冲液的处理设置得不同来在阳离子交换柱中执行纯化。与以往的现有技术中的重复执行洗涤及平衡步骤或者利用具有不同的组成成分的缓冲液执行4次以上的连续工艺不同地，在本发明中，可通过仅调节两种缓冲液的比例来简单地执行步骤(a)的纯化工艺。由此，在制备工艺方面，具有可实现成本节减及制备工艺的简化的优点。
即，在本发明中，步骤(a)的洗涤及洗脱工艺可通过下述方式执行：包含规定的pH5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐缓冲液，增加氯化钠的摩尔浓度。即，对于pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐缓冲液，变更(增加)pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及具有预设摩尔浓度的氯化钠的缓冲液的混合比例，并增加氯化钠的摩尔浓度来执行洗涤及解吸工艺。
例如，根据本发明的实施方式，在第二次洗涤工艺中，可使用混合包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐的第一缓冲液及包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及100mM的氯化钠的第二缓冲液的。具体地，可混合41重量百分比至45重量百分比的包含pH5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐的第一缓冲液及55重量百分比至59重量百分比的包含pH5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及100mM的氯化钠的第二缓冲液来制备第二次洗涤工艺所需的缓冲液组成。在这种混合的情况下，根据按照机械设定的各步骤的混合比，可从两个缓冲液储存空间提供适当容量的各缓冲液来完成。
在本发明具体一实施例的第二次洗涤步骤中，将上述第一缓冲液及第二缓冲液分别以43重量百分比及57重量百分比一同处理，并利用包含pH 5.5至6.5的30mM的醋酸盐及57mM的氯化钠的缓冲液执行第二次洗涤工艺。在这种第二次洗涤的情况下，优选地，在示出约3柱体积至17柱体积，详细地，示出约15柱体积或0.1AU之前为止使用上述缓冲液。
上述步骤(a)可包括洗脱(解吸)步骤，详细地，可包括第一次洗脱步骤、第二次洗涤步骤以及第三次洗脱步骤的三个步骤。
具体地，可由下述步骤实现，即，步骤1)，利用包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及57mM至63mM，详细地，60mM的氯化钠的缓冲液对抗体进行第一次洗脱；步骤2)，利用包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及67mM至73mM，详细地，70mM的氯化钠的缓冲液对抗体进行第二次洗脱；以及步骤3)，利用包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及77mM至83mM，详细地，80mM的氯化钠的缓冲液对抗体进行第三次洗脱。
在本发明中，如在之前的第二次洗涤工艺中所确认，可通过仅调节处理洗脱工艺的两种缓冲液的比例来简单地进行。由此，在制备工艺方面，实现了成本降低及制备工艺的自动化。
步骤(a)的洗脱工艺可通过规定的pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐缓冲液且增加氯化钠的摩尔浓度来执行。即，对于pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐缓冲液，变更(增加)pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及具有预设的摩尔浓度的氯化钠的缓冲液的混合比例，并增加氯化钠的摩尔浓度来执行解吸工艺。
例如，根据本发明的实施方式，用于洗脱工艺的缓冲液可以为混合包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐的第一缓冲液及包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及100mM的氯化钠的第二缓冲液。
具体地，在第一次洗脱工艺中，可包含37重量百分比至43重量百分比的包含pH5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐的第一缓冲液及57重量百分比至63重量百分比的包含pH5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及100mM的氯化钠的第二缓冲液。
具体地，在第二次洗脱工艺中，可包含27重量百分比至33重量百分比的包含pH5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐的第一缓冲液及67重量百分比至73重量百分比的包含pH5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及100mM的氯化钠的第二缓冲液。
具体地，在第三次洗脱工艺中，可包含17重量百分比至23重量百分比的包含pH5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐的第一缓冲液及77重量百分比至83重量百分比的包含pH5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及100mM的氯化钠的第二缓冲液。
在本发明具体一实施例的第一次洗脱步骤中，将上述第一缓冲液及第二缓冲液分别以40重量百分比及60重量百分比一同处理，并利用包含pH 5.5至6.5的30mM的醋酸盐及60mM的氯化钠的缓冲液执行第一次洗脱工艺。优选地，在这种第一次洗脱的情况下，以约5柱体积至20柱体积，详细地，约7柱体积至17柱体积，更详细地，约8柱体积至15柱体积使用上述缓冲液。
在本发明具体一实施例的第二次洗脱步骤中，将上述第一缓冲液及第二缓冲液分别以30重量百分比及70重量百分比一同处理，并利用包含pH 5.5至6.5的30mM的醋酸盐及70mM的氯化钠的缓冲液执行第二次洗脱工艺。优选地，在这种第二次洗脱的情况下，以约7柱体积至20柱体积，详细地，约8柱体积至17柱体积，更详细地，9柱体积至15柱体积使用上述缓冲液。
在本发明具体一实施例的第三次洗脱步骤中，将上述第一缓冲液及第二缓冲液分别以20重量百分比及80重量百分比一同处理，并利用包含pH 5.5至6.5的30mM的醋酸盐及80mM的氯化钠的缓冲液执行第三次洗脱工艺。优选地，在这种第三次洗脱的情况下，以约6柱体积至18柱体积，详细地，约8柱体积至16柱体积，更详细地，9柱体积至14柱体积或者0.1AU为止使用上述缓冲液。
即，本发明的步骤(a)，将包含抗体的混合液的试料加载到平衡化的阳离子交换柱，洗涤上述阳离子交换柱后，利用洗脱缓冲液对与柱结合的抗体进行洗脱，从而从包含抗体的混合液的试料去除宿主细胞蛋白及异构抗体，具体地，上述加载、洗涤及洗脱步骤中，可包括：
步骤1)，向利用包含pH 4.5至5.5的15mM至30mM的醋酸盐及35mM至45mM的氯化钠的平衡缓冲液平衡化的Fractogel COO-柱加载包含抗体的混合液的试料；
步骤2)，利用包含pH 4.5至5.5的15mM至30mM的醋酸盐及35mM至45mM的氯化钠的缓冲液进行第一次洗涤；
步骤3)，利用包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及55mM至59mM，详细地，57mM的氯化钠的缓冲液进行第二次洗涤；
步骤4)，利用包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及57mM至63mM，详细地，60mM的氯化钠的缓冲液对抗体进行第一次洗脱；
步骤5)，利用包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及67mM至73mM，详细地，70mM的氯化钠的缓冲液对抗体进行第二次洗脱；以及
步骤6)，利用包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及77mM至83mM，详细地，80mM的氯化钠的缓冲液对抗体进行第三次洗脱。
在本发明的实施例中，经过包含上述步骤的平衡化及加载、第一次洗涤、第二次洗涤、第一次洗脱、第二次洗脱及第三次洗脱的步骤来纯化抗体，并大大减少源自宿主细胞的蛋白质及DNA来纯化具有高主要活性抗体的含量的抗体。
在上述方法中的用于去除异构抗体的方法中，为了同时去除酸性异构抗体及碱性异构抗体，详细地，可使用Fractogel COO-。
在混合大量酸性异构抗体及碱性异构抗体的情况下，当去除碱性异构抗体时，也需要具有分离能力的阳离子交换柱，在此情况下，优选地，利用构成作为合成聚合物的甲基丙烯酸酯聚合树脂作为载体的Fractogel COO-同时去除酸性异构抗体及碱性异构抗体。
在本实施例的阳离子交换层析中，流速(Flow rate)也为180cm/hr，具有可利用与以往周知的方法相比快1.5倍以上(例如，快1.55倍至2.24倍以上的流速)的流速的优点。在这种快流速的情况下，相对于现有的方法，可具有相对于时间高的生产率。
在本发明中，在上述步骤(a)之后执行步骤(b)之前，可包括使病毒失活的步骤。
具体地，病毒失活包括使包含在上述洗脱液的病毒失去功能或从上述洗脱液去除病毒。在使病毒失去功能或去除病毒的方法中，包括热失活、pH失活或化学失活方法等，详细地，可使用pH失活方法，但并不局限于此。上述pH失活方法为利用可使病毒充分失去功能的程度的pH处理的方法，这种pH失活方法包括低-pH病毒失活方法，上述方法可在pH 3.0至4.0的范围，详细地，pH 3.8中滴定在步骤(a)中洗脱的抗体洗脱液来执行，但并不局限于此。
具体地，在步骤(a)中洗脱的抗体洗脱液可包含60％以上的主要活性抗体、20％以下的酸性异构抗体及20％以下的碱性异构抗体。
本发明的抗体群的制备方法包括步骤(b)，将向上述步骤(a)中洗脱的抗体洗脱液混合盐的试料加载到疏水相互作用柱，利用洗脱缓冲液对与柱结合的抗体进行洗脱，从而从抗体洗脱液去除宿主细胞蛋白(HCP)及残留DNA(Residual DNA)。
在本发明的方法中，步骤(b)的方法为收集还从在步骤(a)中收集的抗体洗脱液去除宿主细胞蛋白(HCP)及残留DNA(Residual DNA)的抗体洗脱液的步骤。
在上述步骤(a)中收集的抗体洗脱液可以为收集的洗脱液本身或还利用其他缓冲液稀释的形态。并且，如前所述，还可以为经过使病毒失活的步骤的洗脱液试料。在本发明中，加载到上述疏水相互作用柱的试料还可通过向在步骤(a)中洗脱的抗体洗脱液添加盐来制备。包含在加载到上述疏水相互作用柱的试料的盐的种类并没有特别限制，在本发明的实施例中，使用柠檬酸盐。并且，上述试料可以为以相对于步骤(b)的疏水相互作用柱的平衡缓冲液的盐浓度具有0.8倍至1.2倍的盐浓度的方式调节的试料，详细地，可以为以将步骤(a)的抗体洗脱液的盐浓度具有与平衡缓冲液相同的盐浓度的方式调节的试料，但并不局限于此。
并且，在上述步骤(b)的洗脱步骤中，以浓度梯度方式对附着在柱的抗体进行洗脱。在本发明的实施例中，确认了，相比于阶梯方式，浓度梯度方法在收率及洗脱体积方面更有利。
上述步骤(b)具有去除未在步骤(a)中去除的宿主细胞蛋白、残留DNA(ResidualDNA)等的杂质来提高纯度的目的，并提供利用分离机制与(a)纯化步骤的阳离子交换柱不同的疏水性差异而可去除宿主细胞蛋白的疏水相互作用柱的纯化步骤。
在本发明中，术语“疏水相互作用柱”是指填充疏水相互作用树脂的柱，上述步骤中是指可执行疏水相互作用层析来去除杂质，详细地，可去除宿主细胞蛋白的柱。蛋白质整体上为亲水性，但包括具有亲水性及疏水性的区域，这些区域的输水特性在静电相互作用强的条件下不表达，但具有当通过提高溶剂的离子强度或介电常数来减弱静电相互作用时，相对表达的强的特征。其中，若将疏水性配体(长烃链或芳香环)引入至用于亲水层析的基材(琼脂糖凝胶，有机聚合物载体等)来以浓的盐浓度进行平衡化，则可吸附各种蛋白质，之后，若降低盐浓度，则根据蛋白质的特性进行洗脱，从而可分离。即，在利用盐提供疏水性环境的情况下，由于蛋白质各自的疏水性差异，出现吸附在特定柱的强度差异，利用这种原理，可执行利用疏水相互作用柱去除宿主细胞蛋白及残留DNA(Residual DNA)的上述步骤(b)。
上述疏水相互作用树脂可使用本领域通常周知的，但并不局限于此，详细地，可使用苯基柱、丁基柱、苯基琼脂糖凝胶(phenyl sepharose)或Fractogel EMA苯基柱等，更详细地，可使用苯基琼脂糖凝胶。
并且，上述步骤(b)可包括如下的步骤：向利用包含25mM至35mM的醋酸盐(pH 5.5至6.5)及0.3M至1.0M的柠檬酸盐的平衡缓冲液进行平衡化的疏水相互作用柱，加载将在步骤(a)中洗脱的抗体洗脱液配置成与平衡缓冲液相同的柠檬酸盐浓度的试料，将包含25mM至35mM的醋酸盐(pH 5.5至6.5)的洗脱缓冲液以浓度梯度方式应用来对抗体进行洗脱。
在本发明中，确认在使用pH 6.0条件的醋酸盐缓冲液作为缓冲液的情况下，收率高，在洗脱方法中，也确认利用缓冲液的浓度梯度的方法的收率优秀，从而确认利用浓度梯度方式的本制备方法的上述步骤可有效制备高纯度的抗体群。
在本发明的抗体群的制备方法中，可包括在上述步骤(b)后且步骤(c)前利用过滤器来过滤上述步骤(b)的抗体洗脱液的步骤。
例如，本发明中的过滤可执行超滤和/或渗滤。
详细地，可执行超滤。在本申请中使用的术语“超滤(ultrafiltration)”或“UF”是指利用在使溶剂或溶质分子通过的同时保持大分子的半透膜处理溶液或悬浮液的任意技术。超滤可以为了在溶液或悬浮液中增加大分子的浓度而使用。
并且，详细地，可执行渗滤。在本申请中使用的术语“渗滤(diafiltration)”或“DF”是指为了减少可溶性渗透物(permeate)成分而利用溶剂稀释残留物(retentate)并再过滤的特化的过滤分类而使用。例如，渗滤可诱导或不诱导包含蛋白质的保留成分的浓度增加。例如，在连续渗滤中，溶剂以与滤液的生成速度相同的速度连续添加至残留物。在此情况下，残留物容积及保留的成分的浓度在工艺过程中不会变化。另外，在非连续或依次稀释渗滤中，超滤步骤伴随向残留物侧添加溶剂；在添加至残留物的溶剂的容积为生成的滤液的容积以上的情况下，保留的成分可具有高浓度。渗滤可为了变更pH、离子强度、盐组成成分、缓冲剂组成或大分子的溶液或悬浮液的其他特性而使用。
可通过这种一次过滤工艺进一步减少宿主细胞蛋白的含量。
本发明的抗体群的制备方法包括步骤(c)，使上述步骤(b)的去除宿主细胞蛋白(HCP)及残留DNA的抗体洗脱液通过阴离子交换柱来收集通过液(flow-through)，从而去除宿主细胞蛋白(HCP)及残留DNA(Residual DNA)。
在本发明的方法中，步骤(c)的方法为从在步骤(b)中收集的抗体洗脱液收集去除杂质的所要的抗体群的步骤，具体地，上述步骤(c)为使上述步骤(b)的去除宿主细胞蛋白及残留DNA(Residual DNA)的抗体洗脱液通过阴离子交换柱来收集通过液(flow-through)的步骤。并且，在上述步骤(b)中收集的抗体洗脱液可以为所收集的洗脱液本身或还利用其他缓冲液稀释的形态、还执行过滤工艺等的形态等，但并不局限于此。
在本发明中，术语“阴离子交换柱”是指填充阴离子交换树脂的柱，在上述步骤中，是指可执行阴离子交换层析来去除杂质的柱，详细地，可去除宿主细胞蛋白的柱，但并不局限于此。上述阴离子交换树脂为执行与水溶液中的特定阴离子交换自身阴离子的作用的合成树脂，阴离子交换柱可在等电点以上吸附带阴离子的蛋白质。对于抗体，等电点高，因此，在使用中性pH的缓冲液的情况下，抗体并不附着于阴离子交换树脂并溢出，但包含宿主细胞蛋白的杂质的等电点低，可吸附于阴离子交换树脂而被去除，从而可利用上述原理用于制备高纯度的抗体群。
上述阴离子交换树脂可使用本领域通常使用的，虽并不局限于此，详细地，可使用Q sepharose、季氨基乙基或季氨(Q)等，更详细地，可使用Q Fast Flow。
并且，上述方法可以利用具有低于目标抗体的pI的pH的平衡缓冲液，详细地，可利用pH 7.0至8.0的平衡缓冲液，更详细地，可利用包含Tris氯化氢(pH 7.0至8.0)的平衡缓冲液。
在上述步骤中去除的宿主细胞蛋白是包括除在上述中提及的所要纯化的抗体之外的所有杂质的概念，不仅包括宿主细胞蛋白本身，还可包括源自宿主细胞的DNA及用于细胞生长的因子等。因此，若在本步骤中去除宿主细胞蛋白，则能够以高纯度仅纯化所要纯化的抗体。并且，上述阴离子交换柱不仅可有效去除宿主细胞蛋白，还可有效去除内毒素，因此，在最终纯化步骤中，即使与宿主细胞蛋白一同去除内毒素，也可纯化高纯度的目标抗体群。
本发明的抗体群的制备方法包括步骤(d)，使上述步骤(c)中的通过液(flow-through)通过病毒过滤器来去除病毒。
与现有技术中的通常方法不同地，本发明的抗体群的制备方法在利用超滤、渗滤和/或多层过滤器等执行过滤之前执行病毒过滤。在现有的常规方式中，在利用超滤、渗滤及多层过滤器执行过滤后执行病毒过滤，因此，难以制备高浓度的药物。相反，在本发明的方法中，先执行病毒过滤，由此在超滤、渗滤和/或多层过滤器步骤中减少加载(Loading)量来确保蛋白质质量的同时降低收率损失，并具有容易制备高浓度的药物的优点。
具体地，在本发明中，病毒过滤可使用Modus 1.3(Merck产品)。详细地，相应材质优选使用PES材质。
本发明的抗体群的制备方法包括步骤(e)，对在上述步骤(d)中洗脱的抗体洗脱液进行浓缩及缓冲液交换，制备分别以10ppb及10ppm以下的浓度包含残留DNA及宿主细胞蛋白的抗体群。
在本发明中，所制备的上述抗体洗脱液的浓缩及缓冲液交换可以是指产品化、用于储存抗体的常规浓缩及缓冲液交换工艺。
接着，包含执行上述病毒过滤的所过滤的抗体的溶液(洗脱的抗体洗脱液)可执行超滤、渗滤等。超滤及渗滤如前所述。
通过如上所述的病毒去除及过滤工艺，去除病毒杂质，并可进一步去除HCP及残留DNA。并且，这种后续的超滤、渗滤可用于浓缩和/或缓冲液交换等。
对于缓冲液，可储存常规的抗体，或者可包含所要具有剂型制备所需的缓冲液条件的成分。例如，作为药剂学上可接受的赋形剂的例，缓冲液可包含在本申请中作为参照引用的文献[参照：Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)]中记载的包括任意(多个)非离子赋形剂或(多个)离子赋形剂在内的用于制备具有公知浓度的(多个)赋形剂的常规缓冲液成分。上述缓冲液交换可以为例如在不改变抗体浓度等的同时交换为非离子赋形剂，如包括聚山梨醇酯及泊洛沙姆等的糖或非离子表面活性剂等的缓冲液。
根据本发明制备的进行浓缩及缓冲液交换的本发明的抗体群的宿主细胞蛋白的含量可以为10ppm以下，例如，可以为0.0001ppm至10ppm，更详细地，可以为0.001ppm至5ppm。并且，残留DNA可以为10ppb以下，例如，可以为0.0001ppb至10ppb，更详细地，可以为0.001ppb至1ppb。
在本发明的实施例中，根据本发明的抗体纯化方法，确认能够以99.9％的高纯度纯化抗体。尤其，在制备的抗体群的情况下，包含分别以0.1ppb及5ppm以下的浓度包含残留DNA及宿主细胞蛋白的抗体群。
根据另一实施方式，本发明提供一种抗体群，其通过上述方法制备，包含60％以上的主要活性抗体。
对于上述方法、抗体群及包含60％以上的主要活性抗体的抗体群如上所述。
发明效果
若利用本发明的抗体群的制备方法，则不使用昂贵的蛋白A(protein A)柱来去除杂质，从而能够以高纯度及高质量制备目标抗体群。尤其，本发明的方法提供具有如下优秀优点的方法：在实现工艺自动化的同时大大减少生产成本。
附图说明
图1为示出本发明的阿达木单抗抗体的制备工艺的流程图。
图2示出通过与在韩国授权专利第10-1498771号中记载的方式相似的方法执行的阳离子交换层析执行结果。
图3示出本发明实施例2-1的阳离子交换层析的执行结果。
图4示出本发明实施例2-2的阳离子交换层析的执行结果。
图5示出执行本发明的疏水相互作用层析的结果。
图6示出执行本发明的阴离子交换树脂层析的结果。
具体实施方式
以下，通过实施例详细说明本发明。但是，下述实施例仅例示本发明，本发明并不限定于下述实施例。
以下，在图1具体记载实施例的抗体的制备工艺的流程图。具体地，回收本发明的包含抗体的培养液试料并过滤后，进行阳离子交换树脂处理。之后，执行病毒失活并进行疏水反应树脂。之后，进行一次超滤后进行阴离子交换树脂处理。最后，进行病毒过滤，并二次超滤后执行剂型化。在以下实施例中具体说明在上文中简要提及的具体工艺。
实施例1：用于纯化抗体的培养液预处理方法
培养表达阿达木单抗抗体的重组CHO细胞并表达阿达木单抗抗体后，将pH降低至6以下来将抗体吸附在阳离子交换柱。
在本实施例中，根据培养液预处理方法确认杂质去除程度。
在本实施例中，使用了如下的方法，即，在包含细胞的培养液状态下将pH降低至5后，并进行过滤来制备用于注入至阳离子交换柱的试料，在表1示出其具体条件。
表1
Figure BDA0003802839180000201
根据上述方法对培养液进行预处理，并分析顺序(1)的培养液、(2)的上清液、(4)的酸处理后的培养液、(6)的通过过滤及除菌过滤器后的预处理培养液的浊度。结果，在(1)的培养液的情况下，确认浊度(turbidity)为6810NTU，在(2)的上清液的情况下，确认浊度为2.98NTU。并且，在(4)酸处理后的培养液的情况下，确认浊度为5475NTU，在最终(6)的通过过滤及除菌过滤器后的预处理培养液的情况下，确认为5.13NTU。
并且，在过滤步骤中，平均Flux示出150LMH左右的大过滤容量，由此，可确认培养液预处理步骤中的损失少。
在各步骤中过滤处理后示出约99％以上的浊度去除率，由此，确认制备了适合在后续步骤中使用的预处理培养液。
上述结果示出通过本发明的预处理方法且利用初始过滤器一次去除细胞后进行工艺的方法是适合的。并且，示出若下降至pH 6以下(优选地，pH 5)来去除沉淀物，则可获取具有与初始培养液相比更高纯度的培养上清液。
实施例2：阳离子交换层析
选择Fractogel COO-作为可代替利用蛋白A的柱工艺的阳离子交换柱中的具有在纯度及收率方面有利的官能团的柱。
利用所设置的上述阳离子交换柱实施了调节异构抗体的实验，其过程如下。
为了平衡化，利用包含pH 5.0、20mM的醋酸盐及40mM的氯化钠的缓冲液流过14柱体积来使柱平衡化(6.0mS/cm)后，以CM的吸附容量(25mg/mL柱)以下加载完成预处理的上清液。
加载后，进行如下的第一次洗涤步骤，即，处理5柱体积的用于洗涤的第一缓冲液(包含pH 5.0、20mM的醋酸盐及40mM的氯化钠的缓冲液，6.0mS/cm)，以将未附着在柱的抗体附着，并利用上清液洗涤剩余部分。
之后，进行如下的第二次洗涤步骤，即，以总15柱体积的第一缓冲液(pH 6.0、30mM的醋酸盐，2.4mS/cm)及第二缓冲液(包含pH 6.0、30mM的醋酸盐及100mM的氯化钠的缓冲液，12.5mS/cm)，以43重量百分比的第一缓冲液及57重量百分比的第二缓冲液的比例处理来进行第二次洗涤步骤。
其中，以43重量百分比的第一缓冲液及57重量百分比的第二缓冲液的比例并以混合的缓冲液形态执行第二次洗涤步骤。
之后，为了执行解吸步骤，将第一缓冲液以40重量百分比、30重量百分比及20重量百分比的3个阶段减少及增加且将第二缓冲液以60重量百分比、70重量百分比及80重量百分比的3个阶段减少及增加来执行解吸步骤。
如上述第二次洗涤步骤，各个混合优先执行后利用混合的缓冲液执行了3个阶段的洗脱(解吸)步骤。
与以往周知的阳离子交换层析的常规方式不同地，将在本发明中使用的缓冲液的溶液类型简化为3种，并与现有技术相比，将洗涤步骤大大减少至2个步骤。
并且，用于进行解吸的步骤也仅调节第一缓冲液及第二缓冲液的溶液的比例来执行反应，从而可实现整个步骤的自动化及简化。
并且，在本实施例的阳离子交换层析中，流速(Flow rate)也利用180cm/hr的与以往周知的方法相比1.5倍以上的快流速。在这种快流速的情况下，与现有方法相比，可具有相对于时间高的生产率。
以下，在表2具体记载本发明的利用阳离子交换树脂Fractogel COO-的异构抗体纯化过程。
表2
Figure BDA0003802839180000221
另外，为了比较，通过与在先韩国专利10-1498771号相似的方式追加不含NaCl的平衡化步骤来执行洗脱。具体地，在第一次洗涤步骤中，以总5柱体积处理pH 5.0、20mM的醋酸盐及40mM的氯化钠；在第二次洗涤步骤中，以总10柱体积处理pH 6.0、30mM的醋酸盐；在第一次解吸步骤中，以总10柱体积处理pH 6.0、30mM的醋酸盐及50mM的氯化钠；在第二次解吸步骤中，以1.5柱体积处理pH 6.0、30mM的醋酸盐；在第三次解吸步骤中，以8柱体积处理pH 6.0、30mM的醋酸盐及80mM的氯化钠(比较例)。
在图2至图4示出上述实验结果。
图2示出上述比较例的阳离子交换层析结果，图3示出本发明的实施例2-1的结果，图4示出本发明的实施例2-2的结果。
在下述表3示出通过上述阳离子交换层析确认的酸性异构抗体、主要活性抗体及碱性异构抗体的比例及收率。
表3
实施例2-1 实施例2-2 比较例
酸性异构抗体峰(％) 16～19 14～19 15～16
主要活性抗体峰(％) 66～69 65～69 68
碱性异构抗体峰(％) 13～15 13～19 16
收率(％) 60～67 67～89 52～56
利用如上所述的阳离子交换柱的条件的纯化工艺在增加主要活性抗体的含量的同时大大增加收率。进而，仅使用3种缓冲溶液来收集洗脱(Elution)的蛋白质，从而实现工艺自动化。这种优点示出当生产抗体时，减少缓冲液的配置及足迹(Footprint)的费用的追加优点。
最大优点在于，按照顺序注入上述3种缓冲液，当进行洗脱时，以柱体积(columnvolume)为基准收集蛋白质，因此，可在确立的条件下以高收率获取抗体的便利性增加，且其可适当地适用于工艺自动化。
实施例3：病毒失活
将根据上述实施例2-1及实施例2-2获取的一次洗脱液添加至1M的柠檬酸(Citricacid)缓冲液来在pH 3.8中进行病毒失活1小时。在失活完成后，添加2M的Trizma base缓冲液来将试料的pH调整至6.0。将病毒失活完成的试料通过0.2μm的过滤器来进行过滤。
实施例4：疏水反应树脂
利用作为疏水相互作用层析(Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC)的种类的苯基琼脂糖凝胶(phenyl sepharose)fast flow来执行纯化抗体时提高纯度的工艺。
具体地，为了执行HIC，利用了通过上述实施例3的方法制备的各个洗脱液。
基于pH 6.0的醋酸盐，在0.6M的柠檬酸盐浓度中吸附，当进行洗脱时，利用了提供浓度梯度(gradient)直至洗脱缓冲液高达5柱体积为止来进行洗脱的方式。
阳离子交换树脂中的基本缓冲液利用pH 6.0以下的醋酸盐，因此，pH 6.0以下的利用具有如下的优点，即，可在缓冲液制备方面简化制备工艺。
洗脱方法中的5柱体积浓度梯度方法在收率方面示出优秀的结果，在缓冲液的情况下，pH 6.0的醋酸盐缓冲液在收率及抗体的pH稳定性方面也优秀。
在下述表4示出上述疏水相互作用层析(HIC)的具体条件。
表4
Figure BDA0003802839180000241
在上述条件下执行疏水相互作用层析，在图5示出其结果。
实施例5：一次超滤
进料压力(Feed pressure)≤1bar的条件下，利用25mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.5，2.0mS/cm)使Pellicon 3盒(Pellicon 3Cassette)(膜(membrane))平衡化，并使工艺液浓缩至10mg/mL。之后，利用缓冲液以使工艺液的pH及导电率成为7.5及≤3.0mS/cm的方式进行交换，并执行一次超滤。
实施例6：阴离子交换树脂层析
在本发明的制备方法中，确定了利用阴离子交换树脂层析来制备更高纯度的抗体群的工艺。
具体地，阴离子交换柱在等电点以上吸附带阴离子的蛋白质，因此，在等电点为7以上的抗体的情况下(例如，在阿达木单抗的情况下，等电点为7至10，在修美乐的情况下，约8.4)，当使用中性pH的缓冲液时，本抗体并不附着在阴离子交换树脂且溢出至通过液(flow-through)。由此，为了确认适合于本发明的制备工艺的阴离子交换树脂及缓冲液条件，执行了如下的实验。
具体地，在本实施例中，利用在生产规模中广泛使用的季氨(Quaternary amine)系列的Q Fast flow(QFF，GE公司)作为阴离子交换树脂来实施纯化。首先，作为用于加载至阴离子交换树脂的样品准备，在培养上清液中进行阳离子交换柱、疏水相互作用柱及一次超滤来取代缓冲液，由此，以合适的导电率及pH准备。在缓冲液的25mM Tris HCl pH 7.5的条件下确认纯度、宿主细胞蛋白的含量、残留DNA含量及收率。
在图6示出利用阴离子交换树脂的层析的结果。
在所制备的抗体群中示出纯度为100％、HCP含量为6.8ng/mg、残留DNA含量为0.04pg/mg、收率为94％至97％。结果，在阴离子交换树脂层析中，教示了缓冲液为包含TrisHCl的缓冲液、pH 7至8有利于制备本发明的抗体群。
实施例7：病毒过滤、二次超滤及渗滤
利用病毒过滤器Modus 1.3(Merck)来对上述实施例6的执行阴离子交换树脂层析的样品进行过滤。
之后，利用超滤过滤器Pellicon 3Cassette(membrane)执行二次超滤。具体地，在进料压力≤1bar的条件下，利用14mM的磷酸盐(Phosphate)缓冲液(pH 5.2，≥12.0mS/cm)使Pellicon 3Cassette(membrane)平衡化，并使工艺液浓缩至55.5mg/mL。之后，利用缓冲液以使工艺液的pH及导电率成为5.2及≥11.0mS/cm的方式进行交换。
在现有在先专利韩国10-1498771号中的方法不同地，如上所述的病毒过滤在执行二次超滤之前执行病毒过滤。在上述在先专利中，执行一次超滤及二次超滤后执行病毒过滤，因此，难以配置高浓度的药物。相反，在本发明的方法中，在执行二次超滤之前先执行病毒过滤，由此，二次超滤步骤具有如下的优点，即，减少加载量来确保蛋白质质量，同时，降低收率损失，容易配置高浓度的药物。
实施例8：根据大批量的整个工艺的源自宿主细胞的蛋白质及DNA含量变化确认
根据上述实施例1至实施例7的步骤，确认了整个工艺中的源自宿主细胞的蛋白质及DNA含量，在下述表5示出其结果。
在记载于下述表5的试料的情况下，为根据实施例2-2的配置工艺获取的试料的结果。
表5
Figure BDA0003802839180000261
Figure BDA0003802839180000271
如可在上述表5确认，按照步骤确认了HCP含量及DNA含量。结果，通过在实施例2-2中记载的阳离子交换层析大大减少源自宿主细胞的DNA的含量。之后，优先实施病毒失活，通过剂型上一步骤中的超滤/渗滤确保蛋白质质量，同时，降低收率损失，从而容易配置高浓度的药物。并且，可通过上述的一连串的步骤制备使源自宿主细胞的蛋白质及DNA的含量最小化的抗体群。
实施例9：根据大批量的整个工艺的病毒去除能力确认
在根据上述实施例1至实施例7的步骤进行整个工艺中，确认了低pH处理(Low pHtreatment)、阴离子交换层析(Anion exchange chromatography)、病毒减少过滤(virusreduction filtration)工艺中的病毒去除率，在下述表6中示出其结果。
表6
Figure BDA0003802839180000272
Figure BDA0003802839180000281
如可在上述表6中确认，按照步骤确认了鼠白血病病毒、伪狂犬病病毒、呼肠孤病毒3型、小鼠微小病毒的失活及去除能力。在上述结果的情况下，示出在通过本发明的工艺的抗体群中几乎未表达病毒。尤其，当在上述各工艺中考虑病毒失活及去除能力时，即使在本发明的纯化工艺中发生意想不到的病毒表达或污染，也可将其去除。
从以上说明可理解，本发明所属技术领域的普通技术人员可在不变更其技术思想或必要特征的情况下由其他具体实施方式实施本发明。与此相关地，需要理解的是，以上所记述的实施例在所有方面仅为例示，并不是限定性的。本发明的范围应解释为相比于上述详细的说明，所附的发明要求保护范围的含义及范围以及由其等价概念导出的所有变更或变形的形态包含在本发明的范围内。

Claims (20)

1.一种抗体群的制备方法，其特征在于，
步骤(a)，将包含抗体的混合液的试料加载到平衡化的阳离子交换柱，洗涤上述阳离子交换柱后，利用洗脱缓冲液对与柱结合的抗体进行洗脱，从而从包含抗体的混合液的试料去除宿主细胞蛋白及异构抗体；
步骤(b)，将向在上述步骤(a)中洗脱的抗体洗脱液混合盐的试料加载到疏水相互作用柱，利用洗脱缓冲液对与柱结合的抗体进行洗脱，从而从抗体洗脱液去除宿主细胞蛋白及残留DNA(ResidualDNA)；
步骤(c)，使上述步骤(b)的去除宿主细胞蛋白及残留DNA的抗体洗脱液通过阴离子交换柱来收集通过液，从而去除宿主细胞蛋白及残留DNA；
步骤(d)，使上述步骤(c)中的通过液通过病毒过滤器来去除病毒；以及
步骤(e)，对在上述步骤(d)中洗脱的抗体洗脱液进行浓缩及缓冲液交换，制备分别以10ppb及10ppm以下的浓度包含残留DNA及宿主细胞蛋白的抗体群。
2.根据权利要求1所述的抗体群的制备方法，其特征在于，上述步骤(a)的包含抗体的混合液的试料通过包括如下步骤的方法制备：将培养上清液的pH调节为4至6来去除沉淀的沉淀物。
3.根据权利要求1所述的抗体群的制备方法，其特征在于，在上述步骤(a)的包含抗体的混合液的试料中，溶液的导电率为5mS/cm至7mS/cm。
4.根据权利要求1所述的抗体群的制备方法，其特征在于，上述抗体的等电点为7至10。
5.根据权利要求1所述的抗体群的制备方法，其特征在于，上述抗体为阿达木单抗。
6.根据权利要求1所述的抗体群的制备方法，其特征在于，在上述步骤(a)中洗脱的抗体洗脱液包含60％以上的主要活性抗体、20％以下的酸性异构抗体及20％以下的碱性异构抗体。
7.根据权利要求1所述的抗体群的制备方法，其特征在于，将包含抗体的混合液的试料加载到平衡化的阳离子交换柱的步骤包括如下的步骤：向利用包含pH 4.5至5.5的15mM至30mM的醋酸盐及35mM至45mM的氯化钠的平衡缓冲液平衡化的Fractogel COO-柱加载包含抗体的混合液的试料。
8.根据权利要求1所述的抗体群的制备方法，其特征在于，对阳离子交换柱进行洗涤的步骤包括：
步骤1)，利用包含pH 4.5至5.5的15mM至30mM的醋酸盐及35mM至45mM的氯化钠的缓冲液进行第一次洗涤；以及
步骤2)，利用包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及55mM至59mM的氯化钠的缓冲液进行第二次洗涤。
9.根据权利要求8所述的抗体群的制备方法，其特征在于，在进行第二次洗涤的步骤中，缓冲液通过向pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐缓冲液混合包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及具有设定的摩尔浓度的氯化钠的缓冲液来以具有55mM至59mM的氯化钠的摩尔浓度的方式制备。
10.根据权利要求1所述的抗体群的制备方法，其特征在于，利用洗脱缓冲液对与柱结合的抗体进行洗脱的步骤包括：
步骤1)，利用包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及57mM至63mM的氯化钠的缓冲液对抗体进行第一次洗脱；
步骤2)，利用包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及67mM至73mM的氯化钠的缓冲液对抗体进行第二次洗脱；以及
步骤3)，利用包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及77mM至83mM的氯化钠的缓冲液对抗体进行第三次洗脱。
11.根据权利要求10所述的抗体群的制备方法，其特征在于，进行第一次洗脱、第二次洗脱及第三次洗脱的步骤的缓冲液通过向pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐缓冲液添加包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及具有设定摩尔浓度的氯化钠的缓冲液来以具有进行第一次洗脱、第二次洗脱及第三次洗脱的步骤的上述预设的氯化钠的摩尔浓度的方式制备。
12.根据权利要求1所述的抗体群的制备方法，其特征在于，上述步骤(a)包括：
步骤1)，向利用包含pH 4.5至5.5的15mM至30mM的醋酸盐及35mM至45mM的氯化钠的平衡缓冲液平衡化的FractogelCOO-柱加载包含抗体的混合液的试料；
步骤2)，利用包含pH 4.5至5.5的15mM至30mM的醋酸盐及35mM至45mM的氯化钠的缓冲液进行第一次洗涤；
步骤3)，利用包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及55mM至59mM的氯化钠的缓冲液进行第二次洗涤；
步骤4)，利用包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及57mM至63mM的氯化钠的缓冲液对抗体进行第一次洗脱；
步骤5)，利用包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及67mM至73mM的氯化钠的缓冲液对抗体进行第二次洗脱；以及
步骤6)，利用包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及77mM至83mM的氯化钠的缓冲液对抗体进行第三次洗脱。
13.根据权利要求1所述的抗体群的制备方法，其特征在于，上述步骤(b)以浓度梯度方式对抗体进行洗脱。
14.根据权利要求13所述的抗体群的制备方法，其特征在于，上述浓度梯度方式包括如下的步骤：向利用包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐及0.3M至1.0M的柠檬酸盐的平衡缓冲液平衡化的疏水相互作用柱，加载将在步骤(a)中洗脱的抗体洗脱液配置成与平衡缓冲液相同的柠檬酸盐浓度的试料，将包含pH 5.5至6.5的25mM至35mM的醋酸盐的洗脱缓冲液以浓度梯度方式应用来对抗体进行洗脱。
15.根据权利要求1所述的抗体群的制备方法，其特征在于，上述步骤(b)的疏水相互作用柱为苯基琼脂糖凝胶柱。
16.根据权利要求1所述的抗体群的制备方法，其特征在于，上述步骤(c)的阴离子交换柱在注入试料之前利用pH 7.0至8.0的平衡缓冲液进行平衡化。
17.根据权利要求16所述的抗体群的制备方法，其特征在于，上述平衡缓冲液包含pH为7.0至8.0的Tris-HCl。
18.根据权利要求1所述的抗体群的制备方法，其特征在于，上述步骤(c)的阴离子交换柱为Q Fast Flow柱。
19.一种抗体群，通过权利要求1所述的方法制备，其特征在于，上述抗体群包含60％以上的主要活性抗体。
20.一种抗体群，通过权利要求1所述的方法制备，其特征在于，上述残留DNA及宿主细胞蛋白的浓度分别为0.1ppb及5ppm以下。
CN202180015238.XA 2020-02-21 2021-02-05 阿达木单抗的非蛋白a纯化方法 Pending CN115427425A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200021721A KR102154952B1 (ko) 2020-02-21 2020-02-21 아달리무맙의 Non-Protein A 정제방법
KR10-2020-0021721 2020-02-21
PCT/KR2021/001519 WO2021167275A1 (ko) 2020-02-21 2021-02-05 아달리무맙의 non-protein a 정제방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115427425A true CN115427425A (zh) 2022-12-02

Family

ID=72469660

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180015238.XA Pending CN115427425A (zh) 2020-02-21 2021-02-05 阿达木单抗的非蛋白a纯化方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230124565A1 (zh)
EP (1) EP4108673A4 (zh)
JP (1) JP7430012B2 (zh)
KR (1) KR102154952B1 (zh)
CN (1) CN115427425A (zh)
WO (1) WO2021167275A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102154952B1 (ko) * 2020-02-21 2020-09-10 프레스티지바이오로직스 주식회사 아달리무맙의 Non-Protein A 정제방법
WO2024012364A1 (en) * 2022-07-12 2024-01-18 Beigene Switzerland Gmbh Preparation methods for a highly concentrated pd1 antibody solution by ultrafiltration/diafiltration (uf/df)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101437839A (zh) * 2006-03-20 2009-05-20 米德列斯公司 蛋白质纯化
NZ611859A (en) * 2006-04-05 2014-12-24 Abbvie Biotechnology Ltd Antibody purification
AU2008206923A1 (en) * 2007-01-17 2008-07-24 Merck Serono S.A. Process for the purification of Fc-containing proteins
KR101498771B1 (ko) * 2011-12-15 2015-03-09 한화케미칼 주식회사 항체의 정제 방법
BR112015027812B1 (pt) * 2013-05-06 2021-03-30 Sanofi Método para a purificação de uma proteína a partir de uma solução
TWI596107B (zh) * 2013-06-25 2017-08-21 卡地拉保健有限公司 單株抗體之新穎純化方法
EP3472177A2 (en) * 2016-06-17 2019-04-24 F. Hoffmann-La Roche AG Purification of multispecific antibodies
KR102154952B1 (ko) * 2020-02-21 2020-09-10 프레스티지바이오로직스 주식회사 아달리무맙의 Non-Protein A 정제방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR102154952B1 (ko) 2020-09-10
JP7430012B2 (ja) 2024-02-09
US20230124565A1 (en) 2023-04-20
EP4108673A1 (en) 2022-12-28
EP4108673A4 (en) 2024-05-22
WO2021167275A1 (ko) 2021-08-26
JP2023515123A (ja) 2023-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6039550B2 (ja) タンパク質の精製装置および方法
CN105017418B (zh) 单克隆抗体纯化工艺方法
JP6023715B2 (ja) タンパク質の精製方法
EP3004163B1 (en) Method for purifying antibody
CN105669829B (zh) 在蛋白质纯化过程中降低样品中的一种或多种杂质的水平的方法
KR101498771B1 (ko) 항체의 정제 방법
EP2994485A1 (en) Continuous multistep process for purifying antibodies
JP7430012B2 (ja) アダリムマブのｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ａ精製方法
JP7445332B2 (ja) ベバシズマブ精製の最適化された方法
CN109320611B (zh) 一种人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法
CN107964044A (zh) 从乳样中纯化抗cd20单克隆抗体的方法
JP2022513463A (ja) 容積測定ローディング流量を低減し、そして結合及び溶出クロマトグラフィー精製の生産性を増大するためのインライン生成物濃縮
TW201900257A (zh) 使用親和力層析術純化抗體或其抗體片段的方法
WO2007142578A1 (en) Method of separating monomeric protein (s)
CN116715756A (zh) 一种抗体纯化方法
CN112876567A (zh) Fc融合蛋白及其纯化方法
AU2015255316A1 (en) Apparatus and process of purification of proteins

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination