CN107964044A - 从乳样中纯化抗cd20单克隆抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从乳样中纯化抗CD20单克隆抗体的方法，以含有抗CD20单克隆抗体的转基因哺乳动物乳样为原料，通过预处理得到脱脂乳，再将所获得的脱脂乳进行亲和色谱或复合型阳离子交换色谱分离，去除大部分杂蛋白，得到高纯度的抗CD20单克隆抗体，并将其进行病毒灭活，缓冲液置换，进一步通过复合型阴离子交换色谱纯化抗CD20单克隆抗体并将其浓缩脱盐。本发明利用色谱技术两步纯化将原乳样中抗CD20单克隆抗体分离并将杂质完全去除，达到注射药用级别，该工艺简便、快速、低成本、适合大规模生产抗CD20单克隆抗体。

Description

从乳样中纯化抗CD20单克隆抗体的方法
技术领域
本发明涉及重组蛋白纯化技术，具体地说，涉及一种从乳样中纯化抗CD20单克隆抗体的方法。
背景技术
非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin's lymphoma，NHL)是最常见的血液系统恶性肿瘤，绝大多数NHL发生与B细胞相关，每年预计有近300000人死于NHL，NHL是威胁人类生命的10大恶性肿瘤之一。目前，一些单克隆抗体已经成功应用于患有肿瘤的病人的治疗。美罗华(Rituximab)C2B8是美国基因生物科技有限公司研发的以人CD20分子为靶点的人鼠嵌合型IgG1免疫球蛋白，它是由人IgG1的恒定区与鼠源Kappa轻链区组成，其结构中含有1328个氨基酸残基，分子量约为144kDa，主要功能为补体依赖性细胞毒性反应、抗体依赖性细胞毒性反应和诱导细胞凋亡。1997年，通过FDA批准，美罗华上市后已经成功地治疗370000名NHL患者。
目前，分离纯化抗CD20单克隆抗体最主要的方法是液相色谱法。亲和、离子交换和疏水互作等液相色谱法的组合在单抗的实验室规模与工业生产规模中应用较多，其中包括在层析纯化过程中去除杂质的步骤，使其达到注射级药品标准。US4801687公开了将抗体溶液与盐溶液混合后使用蛋白A进行亲和层析以提高蛋白收率；中国专利号CN102179237A公开了一种由单分散多孔微球固相载体与蛋白A连接组成，从而得到亲和色谱填料，此方法用于单抗药物的生产过程以及抗体球蛋白的分离纯化；US5726293公开了一种使用咪唑作为洗脱缓冲液可以在高pH值条件下洗脱单抗，使得单抗免失生物活性；WO2005016968公开了在低温或缓冲液中加入金属离子络合剂和非离子型表面活性剂可降低亲和层析中脱落的蛋白A的含量；WO1998024485公开了在单抗溶液中加入辛酸钠孵育抗体可达到病毒灭活的作用；WO2011049798公开了一种利用复合型色谱作为第一步捕获单抗的方法；WO2014207763公开了通过亲和、疏水互作与离子交换色谱相结合的方法分离纯化单抗，即可得到蛋白纯度大于99％的单抗纯品。然而，上述方法步骤繁琐、工艺成本高，不适于工业放大。
发明内容
本发明的目的是提供一种从含有抗CD20单克隆抗体的乳样中，快速、高效分离纯化具有生物活性的且符合注射药用级别的抗CD20单克隆抗体。
为了实现本发明目的，本发明提供的一种从乳样中纯化抗CD20单克隆抗体的方法，以含有抗CD20单克隆抗体的转基因哺乳动物乳样为原料，通过预处理得到脱脂乳，再将所获得的脱脂乳进行亲和色谱或复合型阳离子交换色谱(阳离子交换色谱)分离，去除大部分杂蛋白，得到高纯度的抗CD20单克隆抗体，并将其进行病毒灭活，缓冲液置换，进一步通过复合型阴离子交换色谱精细纯化抗CD20单克隆抗体并将其浓缩脱盐。
前述的方法，所述预处理为通过蝶式离心机进行脱脂，再利用0.14μm-1.4μm滤膜进行过滤除菌，得到脱脂乳。
前述的方法，所述亲和色谱的具体步骤包括：将脱脂乳上样到电导率为2-40ms/cm，pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液平衡的亲和层析柱，流速为266-399cm/h，上样完毕继续用电导率为2-40ms/cm，pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液冲洗至基线，然后用电导率为10-20ms/cm，pH4.5-5.0的柠檬酸盐缓冲液洗脱乳样内源杂蛋白，最后用电导率为35-50ms/cm，pH3.0-4.0的洗脱缓冲液洗脱抗CD20单克隆抗体。
其中，亲和层析柱使用的填料包括Mabselect Sure LX、Mabselect Sure、IgSelect、Toyopearl AF-rProtein A HC-650F、Protein A CIP Resin、Protein A CeramicHyperD F、Prosep ultra plus等，优选Mabselect Sure LX。
洗脱缓冲液包括精氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸盐缓冲液等碱性氨基酸或碱性化合物缓冲液，优选电导率为35-50ms/cm，pH3.0-4.0的精氨酸缓冲液。
前述的方法，所述复合型阳离子交换色谱的具体步骤包括：将脱脂乳上样到电导率为2-6ms/cm，pH4.0-7.5的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液或醋酸盐缓冲液平衡的复合型阳离子交换层析柱或带有磺酸基及羧基基团的阳离子交换树脂，流速为250-400cm/h，上样完毕继续用电导率为2-6ms/cm，pH4.0-7.5的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液或醋酸盐缓冲液冲洗至基线，然后用电导率为10-20ms/cm的氯化钠，pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，接着用电导率为20-40ms/cm的氯化钠，pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液洗脱抗CD20单克隆抗体，最后用电导率为170ms/cm以下的NaCl或KCl缓冲液洗脱杂质。
其中，复合型阳离子交换层析柱使用的填料包括Capto MMC、MEP HyperCel、Toyopearl MX-Trp-650M、Nuvia cPrime等，优选Capto MMC。
前述的方法，将经过亲和色谱或复合型阳离子交换色谱纯化获得的抗CD20单克隆抗体溶液置于室温或4℃、pH3.0-4.5条件下孵育35-60分钟进行病毒灭活。
前述的方法，将经过病毒灭活的抗CD20单克隆抗体溶液用截留分子量100kD以下的滤膜，流速为30-50ml/min，转膜压0.6-1.2bar进行缓冲液置换。
其中，所述滤膜包括聚醚砜膜和再生纤维素膜等，优选再生纤维素膜。
前述的方法，所述复合型阴离子交换色谱的具体步骤包括：将经过缓冲液置换的抗CD20单克隆抗体溶液上样到电导率为6.0-15.0ms/cm的氯化钠，pH6.0-7.5的磷酸盐缓冲液平衡的复合型阴离子交换层析柱，流速为266-399cm/h，上样完毕继续用电导率为6.0-15.0ms/cm的氯化钠，pH6.0-7.5的磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液冲洗至基线，最后用电导率为170ms/cm以下的NaCl或KCl，pH6.0-7.5的磷酸盐缓冲液或pH 2.5-4.5的0.05-0.2mol/L醋酸盐缓冲液洗脱杂质。
其中，复合型阴离子交换层析柱使用的填料包括Capto adhere、HEA/PPAHyperCel等，优选Capto adhere。
前述的方法，将经过复合型阴离子交换色谱纯化获得的抗CD20单克隆抗体溶液用截留分子量100kD以下的滤膜，流速30-50ml/min，转膜压0.6-1.2bar进行蛋白质浓缩脱盐。
前述的方法，还包括对纯化获得的抗CD20单克隆抗体进行活性检测的步骤。例如，将纯化获得的抗CD20单克隆抗体与Raji和Daudi细胞进行亲和力活性检测。
本发明还提供采用前述方法获得的纯化抗CD20单克隆抗体在制备治疗淋巴瘤的药物中的应用。
本发明利用色谱技术两步纯化将原乳样中抗CD20单克隆抗体分离并将杂质完全去除，达到注射药用级别，得到的抗CD20单克隆抗体的纯度≥99.9％，工艺收率≥80％，蛋白A含量≤0.0004％，聚体含量≤0.25％，宿主蛋白残留量≤0.0005％，内毒素含量≤0.5EU/mg，均符合质控标准，且纯化得到的抗CD20单克隆抗体与Raji和Daudi细胞亲和力活性与市售美罗华相似。本发明的纯化工艺简便、快速、低成本、适合大规模生产抗CD20单克隆抗体。
附图说明
图1为本发明实施例2中Mabselect Sure LX介质亲和色谱图(A)及高效液相凝胶色谱图(B)。A图中FT为杂蛋白穿透组分；P1为在pH5.0条件下洗脱的牛内源蛋白；P2为在pH3.0条件下洗脱的抗CD20单克隆抗体；B图中P1为聚体物质；P2为抗CD20单克隆抗体。
图2为本发明实施例3中Capto MMC介质复合型阳离子交换色谱图(A)及高效液相凝胶色谱图(B)。A图中FT为杂蛋白穿透组分；P1为洗脱的杂蛋白；P2为洗脱的抗CD20单克隆抗体；P3为洗脱的杂蛋白；B图中P1为抗CD20单克隆抗体；P2为杂蛋白。
图3为本发明实施例6中Capto adhere介质复合型阴离子交换色谱图(A)及高效液相凝胶色谱图(B)。A图中FT为穿透的抗CD20单克隆抗体纯品；P为在84ms/cm的氯化钠条件下洗脱的杂蛋白；B图为抗CD20单克隆抗体。
图4为本发明实施例8中抗CD20单克隆抗体与Daudi(A)和Raji(B)细胞亲和力的分析结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中所用的主要试剂如下：
人、牛IgG标准品、L-精氨酸购自Sigma公司；95％乙醇购自国药集团化学试剂有限公司；二水合磷酸二氢钠、氯化钠、硫酸钠、二水合柠檬酸三钠、一水合柠檬酸、氢氧化钠、乙酸、乙酸钠购自西陇化工股份有限公司；HUMAN IgG ELISA KIT、BOVINE IgG ELISA KIT购自BETHYL公司；Protein A ELISA KIT购自RepliGen公司；Daudi、Raji细胞源于ATCC细胞库。牛乳样品购自北京济普霖生物技术有限公司。
以下实施例中所用的主要试验仪器如下：
高效液相色谱1260Infinity、TSK gel Super SW 3000色谱柱购自安捷伦科技有限公司；AKTA Pure快速蛋白液相层析系统、Mabselect Sure LX填料、Capto MMC填料、Capto adhere填料、XK 16/40层析柱、AKTA Cross flow超滤系统购自GE公司；30kDUltracel PLC膜购自Millipore；陶瓷膜冷除菌及超滤凭介装置(型号TOP/CMM-1/3/3T)、1.4μm陶瓷膜购自陶普森公司；FACScalibur购自BD Biosciences公司。
实施例1含抗CD20单克隆抗体乳样的预处理
收集含有抗CD20单克隆抗体(含量为1.5-3克/升)的哺乳动物奶样，以牛奶为优选。将上述奶样通过蝶式离心机进行脱脂，再利用0.2μm～1.4μm陶瓷膜技术去除牛乳中细菌及残留乳脂，操作温度设为30℃-40℃，进口压为0.3Mpa-0.5Mpa，然后打开透过阀门，将操作压设置为0.1Mpa-0.3Mpa，流速为6m/s，通量为100L·m2/h-500L·m2/h，即得到纯净的脱脂乳。
实施例2亲和色谱捕获抗CD20单克隆抗体
将实施例1得到的脱脂乳上样到用3ms/cm，pH6.5磷酸盐缓冲液平衡的MabselectSure LX亲和层析柱，流速为399cm/h，上样结束后，继续使用3ms/cm，pH6.5磷酸盐缓冲液冲洗层析柱至基线，然后用14ms/cm，pH5.0柠檬酸盐缓冲液洗脱牛内源杂蛋白，最后用45ms/cm，pH3.0精氨酸缓冲液直接洗脱抗CD20单克隆抗体。通过SEC-HPLC进行聚体与蛋白纯度的检测，聚体含量≤3％，蛋白(抗CD20单克隆抗体)纯度≥95％。图1为Mabselect Sure LX介质亲和色谱图(A)及高效液相凝胶色谱图(B)。
实施例3复合型阳离子交换色谱捕获抗CD20单克隆抗体
将实施例1得到的脱脂乳上样到用3ms/cm，pH5.0醋酸盐缓冲液平衡的Capto MMC复合型层析柱，流速为399cm/h，上样结束后，继续使用3ms/cm，pH4.5醋酸盐缓冲液冲洗层析柱至基线，然后用15ms/cm的氯化钠，pH7.5的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，用25ms/cm的氯化钠，pH7.5的磷酸盐缓冲液洗脱抗CD20单克隆抗体，最后用84ms/cm的氯化钠，pH7.5的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白。通过SEC-HPLC进行蛋白纯度的检测，蛋白(抗CD20单克隆抗体)纯度≥90％。图2为Capto MMC介质复合型阳离子交换色谱图(A)及高效液相凝胶色谱图(B)。
实施例4病毒灭活
将实施例2或实施例3得到的抗CD20单克隆抗体纯化液于室温，pH4.0的条件下孵育40分钟灭活病毒。
实施例5抗CD20单克隆抗体纯化液缓冲液置换
将实施例4得到的抗CD20单克隆抗体纯化液装入AKTA Cross flow的储液罐中，使用30kD的再生纤维素膜装置，流速30ml/min，转膜压0.8bar进行缓冲液置换。
实施例6复合型阴离子交换色谱精细纯化抗CD20单克隆抗体
将实施例5得到的抗CD20单克隆抗体纯化液上样到6.5ms/cm，pH6.5磷酸盐缓冲液平衡的Capto adhere复合型层析柱，流速为399cm/h，收集穿透液(含抗CD20单克隆抗体)，上样完毕后，最后使用pH3.0的0.1mol/L的醋酸盐缓冲液直接洗脱杂质。通过SEC-HPLC进行聚体与蛋白纯度的检测，聚体含量≤0.25％，蛋白(抗CD20单克隆抗体)纯度≥99.9％。图3为Capto adhere介质复合型阴离子交换色谱图(A)及高效液相凝胶色谱图(B)。表1为通过ELISA方法和SEC-HPLC高效液相色谱法对层析纯化抗CD20单克隆抗体后各项指标的检测结果。
表1层析纯化检测结果
实施例7抗CD20单克隆抗体纯化液浓缩脱盐
将实施例6得到的抗CD20单克隆抗体纯化液装入AKTA Crossflow的储液罐中，使用30kD的再生纤维素膜装置，流速30ml/min，转膜压1bar进行蛋白质浓缩脱盐。
实施例8抗CD20单克隆抗体与Daudi和Raji细胞亲和活性检测
实验对象为Daudi细胞和Raji细胞。Daudi和Raji都是体外培养的淋巴瘤细胞，细胞表面含有CD20抗原分子，被广泛用于抗CD20抗体的细胞结合活性检测。
将实施例7得到的抗CD20单克隆抗体浓缩液与Daudi和Raji细胞进行结合(37℃孵育1h)，然后2000rpm室温离心3min，去上清后用PBS(pH7.4)重悬细胞，洗去未结合的抗体后，加入抗人IgG的荧光二抗(4℃孵育1h)，继续2000rpm室温离心3min，去上清后用PBS(pH7.4)重悬细胞，重复三次洗去未结合抗体后上机进行FACScalibur流式细胞仪检测。同时使用美罗华作为阳性对照，使用赫赛汀作为阴性对照进行检测。
抗CD20单克隆抗体浓度为0μg/ml，0.0781μg/ml，0.1563μg/ml，0.3125μg/ml，0.6250μg/ml，1.2500μg/ml，2.5000μg/ml，5.0000μg/ml，10.0000μg/ml。
结合数据分析，FACScalibur原始数据保存后，采用WinMidi2.9软件获得各试验组的二抗信号FITC的平均荧光强度(Median Fluorescence Intensity，MFI)。以抗体浓度为横坐标，MFI为纵坐标，采用GraphPad Prism 6.0的One site-Specific binding withHill slope模块计算Kd值，结果表明通过纯化得到的CD20单克隆抗体与Raji和Daudi细胞亲和力活性与市售美罗华相似。图4为抗CD20单克隆抗体与Daudi(A)和Raji(B)细胞亲和力的分析结果。该结果表明，按本发明方法纯化获得的抗CD20单克隆抗体可用于制备抗B淋巴瘤药物。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种从乳样中纯化抗CD20单克隆抗体的方法，其特征在于，以含有抗CD20单克隆抗体的转基因哺乳动物乳样为原料，通过预处理得到脱脂乳，再将所获得的脱脂乳进行亲和色谱或复合型阳离子交换色谱分离，去除大部分杂蛋白，得到高纯度的抗CD20单克隆抗体，并将其进行病毒灭活，缓冲液置换，进一步通过复合型阴离子交换色谱纯化抗CD20单克隆抗体并将其浓缩脱盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理为通过蝶式离心机进行脱脂，再利用0.14μm-1.4μm滤膜进行过滤除菌，得到脱脂乳。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和色谱的具体步骤包括：将脱脂乳上样到电导率为2-40ms/cm，pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液平衡的亲和层析柱，流速为266-399cm/h，上样完毕继续用电导率为2-40ms/cm，pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液冲洗至基线，然后用电导率为10-20ms/cm，pH4.5-5.0的柠檬酸盐缓冲液洗脱乳样内源杂蛋白，最后用电导率为35-50ms/cm，pH3.0-4.0的洗脱缓冲液洗脱抗CD20单克隆抗体；
其中，亲和层析柱使用的填料包括Mabselect Sure LX、MabselectSure、Ig Select、Toyopearl AF-rProtein A HC-650F、Protein A CIP Resin、Protein A Ceramic HyperDF、Prosep ultra plus，优选Mabselect Sure LX；
洗脱缓冲液包括精氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸盐缓冲液，优选电导率为35-50ms/cm，pH3.0-4.0的精氨酸缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合型阳离子交换色谱的具体步骤包括：将脱脂乳上样到电导率为2-6ms/cm，pH4.0-7.5的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液或醋酸盐缓冲液平衡的复合型阳离子交换层析柱或带有磺酸基及羧基基团的阳离子交换树脂，流速为250-400cm/h，上样完毕继续用电导率为2-6ms/cm，pH4.0-7.5的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液或醋酸盐缓冲液冲洗至基线，然后用电导率为10-20ms/cm的氯化钠，pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，接着用电导率为20-40ms/cm的氯化钠，pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液洗脱抗CD20单克隆抗体，最后用电导率为170ms/cm以下的NaCl或KCl缓冲液洗脱杂质；
其中，复合型阳离子交换层析柱使用的填料包括Capto MMC、MEP HyperCel、ToyopearlMX-Trp-650M、Nuvia cPrime，优选CaptoMMC。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将经过亲和色谱或复合型阳离子交换色谱纯化获得的抗CD20单克隆抗体溶液置于室温或4℃、pH3.0-4.5条件下孵育35-60分钟进行病毒灭活。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将经过病毒灭活的抗CD20单克隆抗体溶液用截留分子量100kD以下的滤膜，流速为30-50ml/min，转膜压0.6-1.2bar进行缓冲液置换；
其中，所述滤膜包括聚醚砜膜和再生纤维素膜，优选再生纤维素膜。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合型阴离子交换色谱的具体步骤包括：将经过缓冲液置换的抗CD20单克隆抗体溶液上样到电导率为6.0-15.0ms/cm的氯化钠，pH6.0-7.5的磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液平衡的复合型阴离子交换层析柱，流速为266-399cm/h，上样完毕继续用电导率为6.0-15.0ms/cm的氯化钠，pH6.0-7.5的磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液冲洗至基线，最后用电导率为170ms/cm以下的NaCl或KCl，pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液或pH2.5-4.5的0.05-0.2mol/L醋酸盐缓冲液洗脱杂质；
其中，复合型阴离子交换层析柱使用的填料包括Capto adhere、HEA/PPA HyperCel，优选Capto adhere。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将经过复合型阴离子交换色谱纯化获得的抗CD20单克隆抗体溶液用截留分子量100kD以下的滤膜，流速30-50ml/min，转膜压0.6-1.2bar进行蛋白质浓缩脱盐。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对纯化获得的抗CD20单克隆抗体进行活性检测的步骤。
10.采用权利要求1所述方法获得的纯化抗CD20单克隆抗体在制备治疗淋巴瘤的药物中的应用。
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