CN117736324A - 一种抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药领域，具体提供了一种抗Siglec‑15单克隆抗体的纯化方法，该方法包括亲和层析：对含有抗Siglec‑15单克隆抗体的细胞液进行初步纯化，并进行病毒灭活；深层过滤膜包过滤：调节pH值和电导率，通过深层过滤膜包过滤；阳离子交换层析：对抗体蛋白溶液进行精纯。本发明提供的抗Siglec‑15单克隆抗体能够与Siglec‑15特异性结合，阻断Siglec‑15与细胞表面受体的结合，抑制胞内信号通路的传导，并达到抑制肿瘤生长的作用；本发明提供的纯化方法，有效提高抗体的纯化效率和回收率，简化了工艺流程，以最少的步骤有效去除杂质，具有稳定性好、控制指标明确、适合规模化生产等特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法。
背景技术
目前，我国恶性肿瘤发病、死亡数持续上升，每年恶性肿瘤所致的医疗花费超过2200亿。在过去的10余年里，恶性肿瘤生存率呈现逐渐上升趋势，目前我国恶性肿瘤的5年相对生存率约为40.5％，与10年前相比，我国恶性肿瘤生存率总体提高约10个百分点，但是与发达国家还有很大差距，为此，癌症药物的研发迫在眉睫。随着生物技术药物发展的日新月异，生物技术药物已经成为了全球炙手可热的新药研发领域。
唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素-15(Sialic acid-binding Ig-like lectin15，Siglec-15)，是SIGLEC基因家族的一员，也是一种DAP12相关免疫受体，属于免疫球蛋白超家族和唾液酸结合Ig样凝集素家族。Siglec-15由免疫球蛋白(Ig)样结构域、跨膜结构域和短胞质尾组成。Siglec-15分为外源性和内源性两种。通常，外源性Siglec-15高表达于肿瘤细胞表面，内源性Siglec-15主要表达在巨噬细胞及树突状细胞表面，而在人和小鼠组织以及各种细胞类型中最低限度表达。研究发现，Siglec-15具有抑制T细胞活性的功能，巨噬细胞表达的Siglec-15可直接抑制人和小鼠T细胞的增殖和活性，并抑制IFNγ和TNFα的分泌；小鼠体内对Siglec-15的基因敲除和抗体封闭，均可以增强微环境中的肿瘤免疫，抑制某些小鼠模型中的肿瘤生长。因此，Siglec15是一个全新的广泛存在于多种肿瘤中的免疫抑制分子，具有潜在的临床相关性,截止目前，以Siglec-15为靶点的药物全球尚无上市的产品，为此，为了满足市场需求，尽快为肿瘤患者提供新型靶点的抗癌药物，急需快速开发抗Siglec-15单克隆抗体的制备工艺，推动产品尽快上市。
经典的抗体药物制备工艺主要包括抗体的捕获和精细纯化两个阶段，一般采用三步层析法。细胞培养上清经亲和层析捕获后，收集样品成分仍较复杂，含聚体、降解产物、宿主DNA和宿主细胞蛋白等多种杂质，一般还需经阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水层析进一步去除，才能获得质量符合要求的产品。每一步层析结束后需要过滤或调整样品来适应下一步的纯化条件，例如在低pH病毒灭活结束后，采用微孔过滤或者深层过滤的方法澄清样品，接着运用阴离子交换层析流穿模式进一步的去除杂质或者病毒。过多的中间操作步骤不仅造成时间的浪费，还会影响收率、增加成本，而且可能面临引入新杂质的风险。因此，急需开发一种能够专门适用于本发明提供的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法。
发明内容
为了解决现有技术公开的纯化工艺中存在的工艺复杂，影响纯化回收率，增加成本，且可能面临引入新杂质的风险等问题，本发明专门提供了一种适用于抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，所述方法包括以下步骤：
S1、亲和层析：利用亲和层析柱对含有抗Siglec-15单克隆抗体的细胞液进行初步纯化和浓缩，收集蛋白溶液，并将所述蛋白溶液在酸溶液中进行病毒灭活；
S2、深层过滤膜包过滤：将所述蛋白溶液的pH值调节至5-7，电导率调节至3-5mS/cm，并通过所述深层过滤膜包进行过滤；
S3、阳离子交换层析：利用阳离子交换层析柱对过滤后的所述抗体蛋白溶液进行精纯，得到精纯的所述抗Siglec-15单克隆抗体的蛋白溶液。
本发明根据抗Siglec-15单克隆抗体的特性筛选出适合该抗体的纯化工艺，其中，步骤S1中亲和层析用于捕获目的抗体蛋白，步骤S2中选择深层过滤膜包过滤能够实现抗体工艺中低pH病毒灭活样品的澄清，同时可以达到对可溶性和不溶性杂质进行更精准的分离，步骤S3中阳离子交换层析用于精细纯化抗体蛋白，通过上述方法能够提升抗体的生产效率，不仅大大的节约了纯化时间，而且避免了纯化过程中引入杂质，提高了蛋白的纯度，具有较高的实用性。
进一步的，所述抗Siglec-15单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区，轻链可变区包括3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区，所述重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，所述重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，所述重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示，所述轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示，所述轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示，所述轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。
本发明通过对免疫文库的筛选，得到了可以与Siglec-15特异性结合且具有较高生物学活性的抗Siglec-15单克隆抗体。
进一步的，所述抗Siglec-15单克隆抗体为鼠源抗体分子，所述鼠源抗体分子的所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:7所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNo:8所示；
所述鼠源抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:15所示，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:16所示。
进一步的，所述抗Siglec-15单克隆抗体为人源化抗体分子，所述人源化抗体分子选自以下任意一种：
HA-Ⅰ：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:24所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:25所示；
HA-Ⅱ：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:24所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:26所示。
进一步的，所述人源化抗体分子还包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区，所述人源化抗体轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:23所示；所述人源化抗体重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:20所示。
进一步的，步骤S1中，所述亲和层析具体包括以下步骤：
S101、使用浓度为30-60mM的缓冲液B1对所述亲和层析柱进行平衡，所述亲和层析柱的填料选自MabSelect Sure LX、MabSelect PrismA、Eshmuno A或NMab Pro；所述缓冲液B1选自Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液或磷酸盐缓冲液，所述缓冲液B1的pH为7-8，所述缓冲液B1的电导率为10-30mS/cm；
S102、将含有抗Siglec-15单克隆抗体的细胞液以50-300cm/h的流速上样至所述亲和层析柱上，上样载量为20-55mg蛋白/ml填料，所述亲和层析柱的柱床高度为18-22cm；
S103、上样结束后，使用所述缓冲液B1进行再平衡，待紫外信号平稳后，使用浓度为30-60mM的缓冲液B2进行至少一次的中间淋洗洗脱，直至紫外吸收值的曲线降至平稳后，停止冲洗，所述缓冲液B2选自HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，所述缓冲液B2的pH为5-6；
S104、使用浓度为20-200mM缓冲液B3对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外吸收值上升至100mAU时，开始收集所述蛋白溶液，当所述紫外吸收值降至100mAU时结束收集，备用，所述缓冲液B3选自甘氨酸-盐酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，所述缓冲液B3的pH为3-4；
S105、使用酸溶液将收集的所述蛋白溶液的pH值调节至3.5-3.7，并在此pH条件下室温孵育0.5-2h，最后用1M的Tris缓冲液将所述蛋白溶液的pH回调至5-7，所述酸溶液选自柠檬酸、乙酸或盐酸。
优选的，所述亲和层析柱的填料为NMab Pro，所述缓冲液B1为Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.0-7.6，所述Tris-HCl缓冲液的电导率为18mS/cm；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，且所述Tris-HCl缓冲液中含有120-160mM的添加剂，所述添加剂为NaCl；
所述缓冲液B2为醋酸盐缓冲液，所述醋酸盐缓冲液的pH为5.0-5.5，所述醋酸盐缓冲液浓度为50mM；
所述缓冲液B3为醋酸盐缓冲液，所述醋酸盐缓冲液的pH为3.6，所述醋酸盐缓冲液的浓度为50mM。
进一步的，所述深层过滤膜包选自Natrix Q膜、Mustang Q膜或Polisher ST膜；
优选的，所述深层过滤膜包为Polisher ST膜。Polisher ST膜采用全合成的具有阴离子交换层析功能的纤维填料，并与0.2um聚醚砜(PES)滤膜相结合，在保证高回收率的同时，可实现抗体工艺中低pH病毒灭活样品的澄清，且能够对可溶性和不溶性杂质进行更精准的分离，减少了工艺步骤，提升了生产效率。
进一步的，步骤S3中，所述阳离子交换层析，具体包括以下步骤：
S301、平衡：使用浓度为10-50mM的缓冲液B4对所述阳离子交换层析柱进行平衡，所述阳离子交换层析柱的填料选自Capto SP、Capto MMC、Eshmuno S或NanoGel 50SP，所述缓冲液B4选自柠檬酸缓冲液、醋酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，所述缓冲液B4的pH值为5.5-6.5，其电导率为2-5mS/cm；
S302、上样：将步骤S2中过滤后的所述蛋白溶液以100-200cm/h的流速上样至所述阳离子交换层析柱，上样载量为20-55mg蛋白/ml填料，所述阳离子交换层析柱的柱床高度为18-22cm；
S303、再平衡：上样结束后，再次使用所述缓冲液B4进行再平衡，待所述紫外吸收值平稳后，停止冲洗；
S304、洗脱：使用缓冲液B5对所述阳离子交换层析柱进行洗脱，当所述紫外吸收值上升至100mAU时开始收集，当所述紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，即得到纯化后的抗Siglec-15单克隆抗体的蛋白溶液；所述缓冲液B5为醋酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液；所述缓冲液B5的pH值为5-7。
优选的，所述阳离子交换层析柱的填料为NanoGel 50SP；
所述缓冲液B5为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为20mM，其pH值为6，其电导率为18mS/cm，所述磷酸盐缓冲液中含有120-160mM的添加剂，所述添加剂为150mM的NaCl。
本发明的有益效果如下：首先，本发明提供的抗Siglec-15单克隆抗体能够与Siglec-15特异性结合，阻断Siglec-15与细胞表面受体的结合，抑制胞内信号通路的传导，并达到抑制肿瘤生长的作用，用于治疗癌症或免疫性疾病，癌症包括但不限于脑胶质瘤、黑色素瘤、结直肠癌、肾癌、肺癌、淋巴癌或白血病等，免疫性疾病包括但不限于银屑病、克罗恩病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、溃疡性结肠炎和自身免疫性肝炎等；其次，本发明根据抗Siglec-15单克隆抗体的特性，通过大量实验筛选了两步层析和一步膜过滤法所需的条件和层析填料，有效提高抗Siglec-15单克隆抗体的纯化效率和回收率，简化了工艺流程，缩短了纯化时间，以最少的步骤有效去除杂质，具有稳定性好、过程控制指标明确、适合规模化生产等特点。
附图说明
图1为本发明实施例2中pScFv-Disb-HS载体的质粒图谱；
图2为本发明实施例3中梯度稀释ELISA抗Siglec-15噬菌体单克隆抗体的亲和力的比较图；
图3为本发明实施例5中载体pTSE的图谱；
图4为本发明实施例5中鼠源抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图5为本发明实施例6中鼠源抗体分子与Siglec-15的结合能力比较图；
图6为本发明实施例7中鼠源抗体抑制Siglec-15与Jurkat细胞表面受体的结合能力比较图；
图7为本发明实施例8中鼠源抗体分子抑制Siglec-15与CHOSLV-LRRC4C细胞表面受体的结合能力比较图；
图8为本发明实施例9中鼠源抗体分子促进人TNF-α细胞因子释放曲线图；
图9为本发明实施例9中鼠源抗体分子促进人IFN-γ细胞因子释放曲线图；
图10为本发明实施例9中鼠源抗体分子促进T细胞激活及增殖曲线图；
图11为本发明实施例10中鼠源抗体分子生物学活性检测图；
图12为本发明实施例15中人源化抗体分子的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图13为本发明实施例18中人源化抗体分子与Siglec-15的结合能力比较图；
图14为本发明实施例19中人源化抗体与不同种属的Siglec-15交叉结合实验图；
图15为本发明实施例20中人源化抗体分子抑制Siglec-15与Jurkat细胞表面受体的结合能力图；
图16为本发明实施例21中人源化抗体分子的生物学活性检测图；
图17为本发明实施例22中抗Siglec-15单克隆抗体HA-I对小鼠体内MC38-Siglec-15结直肠癌模型中肿瘤体积生长曲线图；
图18为本发明实施例23中抗Siglec-15单克隆抗体HA-I热稳定性评价图。
具体实施方式
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明实施例1提供了一种抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，该方法包括以下步骤：
细胞澄清：对含有抗Siglec-15单克隆抗体的细胞培养液进行处理得到细胞液，采用离心或深层过滤的方式对细胞液进行澄清，目的是去除100％的细胞及细胞碎片等。
S1、亲和层析：利用亲和层析柱对澄清后的含有抗Siglec-15单克隆抗体的细胞液进行初步纯化和浓缩，收集蛋白溶液，并将蛋白溶液在酸溶液中进行病毒灭活；
S101、使用浓度为30mM的缓冲液B1对亲和层析柱进行平衡，亲和层析柱的填料为MabSelect Sure LX(购买自：General Electric Company；货号：17547402)；缓冲液B1为HEPES缓冲液，缓冲液B1的pH为7，缓冲液B1的电导率为10mS/cm；亲和层析柱的填料还可以替换为MabSelect PrismA(购买自：General Electric Company；货号：17549802)、EshmunoA(购买自：Merck；货号：1.20089.0500)或NMab Pro(购买自：苏州纳微科技股份有限公司；货号：17013-070100-2500)；
S102、将含有抗Siglec-15单克隆抗体的细胞液以50cm/h的流速上样至亲和层析柱上，上样载量为20mg蛋白/ml填料，亲和层析柱的柱床高度为18cm；
S103、上样结束后，使用缓冲液B1进行再平衡，待紫外信号平稳后，使用浓度为30mM的缓冲液B2进行至少一次的中间淋洗洗脱，直至紫外吸收值的曲线降至平稳后，停止冲洗，缓冲液B2为HEPES缓冲液，缓冲液B2的pH为5；
S104、使用浓度为20mM缓冲液B3对亲和层析柱进行洗脱，当紫外吸收值上升至100mAU时，开始收集所述蛋白溶液，当紫外吸收值降至100mAU时结束收集，备用，缓冲液B3为甘氨酸-盐酸盐缓冲液，缓冲液B3的pH为3；
S105、使用酸溶液将收集的蛋白溶液的pH值调节至3.5，并在此pH条件下室温孵育0.5h，最后用1M的Tris缓冲液将蛋白溶液的pH回调至5，酸溶液为柠檬酸。
S2、深层过滤膜包过滤：将蛋白溶液的pH值调节至5，电导率调节至3mS/cm并通过深层过滤膜包进行过滤，过滤的目的是用于去除沉淀物、DNA和宿主细胞等可溶性和不溶性杂质；深层过滤膜包为Natrix Q膜(购买自Merck，货号：RXQ-01)，同时深层过滤膜包也可替换为Mustang Q膜(购买自Pall Corporation，货号：MSTGXT25Q16)或Polisher ST膜(购买自Minnesota Mining and Manufacturing，货号：BC1)；
S3、阳离子交换层析：利用阳离子交换层析柱对过滤后的抗体蛋白溶液进行精纯，得到精纯的抗Siglec-15单克隆抗体的蛋白溶液。
S301、平衡：使用浓度为10mM的缓冲液B4对阳离子交换层析柱进行平衡，阳离子交换层析柱的填料选自Capto SP(购买自：General Electric Company；货号：17544101)，缓冲液B4为柠檬酸缓冲液，缓冲液B4的pH值为6.5，其电导率为2mS/cm；阳离子层析柱的填料还可以替换为Capto MMC(购买自：General Electric Company；货号17531703：)、EshmunoS(购买自：Merck；货号：1.20078.0500)或NanoGel 50SP(购买自：苏州纳微科技股份有限公司；货号：04062-050200-2500)；
S302、上样：将步骤S2中过滤后的蛋白溶液以100cm/h的流速上样至阳离子交换层析柱，上样载量为20mg蛋白/ml填料，阳离子交换层析柱的柱床高度为18cm；
S303、再平衡：上样结束后，再次使用缓冲液B4进行再平衡，待紫外吸收值平稳后，停止冲洗；
S304、洗脱：使用缓冲液B5对阳离子交换层析柱进行洗脱，当紫外吸收值上升至100mAU时开始收集，当紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，即得到纯化后的抗Siglec-15单克隆抗体的蛋白溶液；缓冲液B5为醋酸钠缓冲液；缓冲液B5的pH值为5。
抗Siglec-15单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区，轻链可变区包括3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区，重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示，轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示，轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示，轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQID No:6所示。
实施例2鼠源抗体分子筛选
本发明通过用Siglec-15抗原(Siglec-15蛋白胞外段，后续实验所使用的Siglec-15抗原、蛋白均为Siglec-15胞外段)免疫小鼠，优化免疫方法，创建噬菌体展示库并建立抗原位点筛选方法，具体噬菌体展示库的构建与筛选鉴定如下：
步骤一：Siglec-15抗原免疫小鼠
1、实验动物：
种属品系：BALB/c，雌性，小鼠；
体重：18-20g；
实验动物提供商：北京华阜康生物科技股份有限公司。
2、免疫：对小鼠进行免疫，免疫抗原为人Siglec-15(南京金斯瑞生物科技有限公司合成基因，本公司构建载体并表达纯化)。
步骤二：噬菌体抗体库的构建
取效价较高的小鼠脾细胞，利用Trizol试剂(购买自Ambion，货号：15596026)，提取小鼠脾细胞中的总RNA，RT-PCR获得cDNA，以cDNA为模板，采用简并引物(所用简并引物参考文献：Journal of Immunological Methods233(2000)167-177)进行PCR扩增，从而获得免疫小鼠抗体重链可变区基因库(VH)及轻链可变区基因库(VL)，轻重链分别双酶切，连接至同样分步骤酶切处理过的载体上，构建pScFv-Disb-HS-VH-VL基因库，pScFv-Disb-HS载体是采用一系列基因克隆的方法对载体pComb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名pScFv-Disb-HS载体，获得其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建小鼠免疫噬菌体抗体库。
步骤三：以Siglec-15为抗原包被免疫管，抗原包被量为5μg/500μL/管，4℃包被过夜，再用4％脱脂奶粉/PBST分别封闭免疫管和免疫噬菌体抗体库，室温封闭1h。封闭后的免疫噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，噬菌体投入量约为109～1012个，室温反应1h后，使用PBST-PBS洗去未结合的噬菌体，通过0.1MpH2.2的Glycine-HCl洗脱，最后使用1.5M pH 8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至pH7.0左右。
步骤四：将上述中和后的噬菌体感染10ml生长至对数期的TG1菌液，37℃培养箱中静置30min，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，用于计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备。
步骤五：将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培养基，摇至对数期后加入M13KO7辅助噬菌体超感染，在28℃条件下，220rpm培养过夜制备噬菌体，PEG/NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选，共进行一轮噬菌体库富集筛选。
步骤六：Siglec-15噬菌体单链抗体阳性克隆的筛选：经过一轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板，在37℃的温度下，220rpm的条件下培养至其对数生长期，每孔加入约1010的辅助噬菌体M13KO7，在37℃的温度条件下静止感染30min。4000rpm，离心15min，弃去上清，菌体用2YTAK重悬沉淀，在28℃且220rpm的条件下培养过夜。4000rpm，4℃的条件下离心15min后，吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定，最终筛选得到四个亲和力较高的抗Siglec-15的鼠源抗体分子，分别命名为MA-I，MA-II，MA-III和MA-IV，将上述得到的单克隆抗体进行基因测序确定为正确的抗体序列，经过测序，上述筛选到的4个单克隆抗体序列如下：
具体的，SEQ ID No:7(MA-I的重链可变区的氨基酸序列)
EVKLEQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYNMFWVKQSHGKTLEWIGYIYPDNGGTGYNQNFKSKATLTVDNSSSSAYMELRSLTSEDSAVYYCARSEYDYFDYWGQGTTLTVSS；
SEQ ID No:8(MA-I的轻链可变区的氨基酸序列)
DIVLTQSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPLTFGAGTKLELK；
SEQ ID No:9(MA-II的重链可变区的氨基酸序列)
EVKLEQSGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQSPEKRLEWVAEIISGGSHTYYPDTVTGRFTISRDDAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCARDGNYGYAMDYWGQGTSVTVSS；
SEQ ID No:10(MA-II的轻链可变区的氨基酸序列)
DIVITQTPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASGVPARFSGGGSGTSYSLTISSVEAEDDATYYCQQWSGYPWTFGGGTKLEIK；
SEQ ID No:11(MA-III的重链可变区的氨基酸序列)
QVKLEESGPELVKPGASVKMSCKASGYIFTSYVMHWVRQKPGQGLEWIGYIDPYNDRTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSGDYGSSFDYWGQGTTLTVSS；
SEQ ID No:12(MA-III的轻链可变区的氨基酸序列)
DIVMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISGYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYASYPYTFGGGTKLEIK；
SEQ ID No:13(MA-IV的重链可变区的氨基酸序列)
EVKLQESGAELVKPGASVKLSCIASGFNIKDTFIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPASGYTKYDPKFQGKATITTDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTRSGSYVSFVYWGQGTLVTVSA；
SEQ ID No:14(MA-IV的轻链可变区的氨基酸序列)
DIVMTQTPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK。
实施例3梯度稀释ELISA比较抗Siglec-15噬菌体单克隆抗体的亲和力
将实施例2中获得的4个鼠源抗体分子(MA-I，MA-II，MA-III和MA-IV)进行单克隆噬菌体的展示和纯化，然后进行噬菌体梯度稀释ELISA实验鉴定亲和力，对照抗体为奈斯科尔公司的抗SIGLEC-15的单克隆抗体(又名5G12，专利申请号为201780067999.3，专利名称为针对SIGLEC-15的抗体及其使用方法)，具体方法如下：
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被Siglec-15抗原，100ng/孔/100μL，在4℃温度条件下包被过夜，使用PBST洗涤三次，将实施例2中筛选得到的4个噬菌体单克隆抗体分别用PBST五倍梯度稀释，每孔加入100μl稀释后的样品，在室温下静置1小时。用PBST洗涤ELISA板，将PBST稀释后的HRP-anti-M13(购买自Bio-viewshine，货号：GE27-9421-01)单克隆抗体加入ELISA板中，在室温放置1h。TMB显色试剂盒显色，室温显色10分钟，用2M H2SO4终止后，酶标仪在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
通过上述数据及如图2所示，实施例2筛选出的4个不同的鼠源抗体分子均能够与Siglec-15结合，本发明提供的单克隆抗体与Siglec-15均具有较高的亲和力。
实施例4
本发明实施例4在实施例2的基础上进一步限定了鼠源抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区为鼠的IgG1型、IgG2a型、IgG2b型或IgG3型的恒定区的一种，轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:15所示的鼠源Ck型的恒定区，IgG1型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:16所示，IgG2a型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:17所示，IgG2b型的恒定区的氨基酸序列如SEQID No:18所示，IgG3型的恒定区的氨基酸序列如SEQID No:19所示；具体序列如下：
SEQ ID No:15(鼠Ck型的轻链恒定区氨基酸序列)：
ADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC；
SEQ ID No:16(鼠的IgG1型的重链恒定区氨基酸序列)：
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG；
SEQ ID No:17(鼠的IgG2a型的重链恒定区氨基酸序列)：
AKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPEPVTLTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVTSSTWPSQSITCNVAHPASSTKVDKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK；
SEQ ID No:18(鼠的IgG2b型的重链恒定区氨基酸序列)：
AKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK；
SEQ ID No:19(鼠的IgG3型的重链恒定区氨基酸序列)：
ATTTAPSVYPLVPGCSDTSGSSVTLGCLVKGYFPEPVTVKWNYGALSSGVRTVSSVLQSGFYSLSSLVTVPSSTWPSQTVICNVAHPASKTELIKRIEPRIPKPSTPPGSSCPPGNILGGPSVFIFPPKPKDALMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVHVSWFVDNKEVHTAWTQPREAQYNSTFRVVSALPIQHQDWMRGKEFKCKVNNKALPAPIERTISKPKGRAQTPQVYTIPPPREQMSKKKVSLTCLVTNFFSEAISVEWERNGELEQDYKNTPPILDSDGTYFLYSKLTVDTDSWLQGEIFTCSVVHEALHNHHTQKNLSRSPELELNETCAEAQDGELDGLWTTITIFISLFLLSVCYSASVTLFKVKWIFSSVVQVKQTAIPDYRNMIGQGA。
实施例5抗Siglec-15单克隆抗体鼠源抗体分子制备
本发明实施例5在实施例4的基础上优选的限定了鼠源抗体分子包括鼠的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:16所示)和鼠Ck型的轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:15所示)。抗体制备方法具体如下：
1、在将实施例2筛选出来的4个单克隆抗体的重链VH和轻链VL的编码基因分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，优选的重链恒定区为鼠的IgG1型恒定区(氨基酸序列如SEQ ID No:16所示)，轻链恒定区为鼠源Ck链(氨基酸序列如SEQID No:15所示)，pTSE载体结构如图3所示(pTSE载体制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段)。
2、瞬时转染HEK293E细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号为GNHu43)，进行抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得4个单克隆抗体，同时使用BCA试剂盒(购买自：北京汇天东方科技有限公司，货号：BCA0020)进行蛋白浓度测定，之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小，结果如图4所示，从左侧到右侧依次为非还原MA-I，MA-II，MA-III和MA-IV，蛋白质分子量Marker1，蛋白分子量Marker2，以及还原MA-I，MA-II，MA-III和MA-IV鼠源抗Siglec-15单克隆抗体，每条带的分子量大小与理论一致。
实施例6鼠源抗体与Siglec-15的结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被Siglec-15抗原，100ng/孔/100μL，在4℃的温度条件下包被过夜。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h，加入不同稀释浓度的MA-I，MA-II，MA-III和MA-IV鼠源抗体分子，4种抗体分子的起始最高浓度均是5μg/ml，分别经过5倍梯度稀释，每个抗体共稀释8个梯度，在37℃温度条件下孵育1h。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST 1:2000稀释的Goat Anti-MouseIgG-HRP(购买自solarbio，货号：SE131)，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μL/孔，室温显色8min，然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
通过上述数据及如图5所示，筛选出的4个不同的鼠源抗体分子均能与Siglec-15进行结合。
实施例7鼠源抗体抑制Siglec-15与Jurkat细胞表面受体的结合
首先，分别将四种鼠源抗体(MA-I、MA-II、MA-III、MA-IV)及对照抗体5G12，配制成浓度为600μg/mL的蛋白溶液，加入96孔板中，每孔25μL。其次，配制Siglec-15配体蛋白，配制浓度200μg/mL，每孔25μL，加入96孔板中。再次，对Jurkat细胞株进行计数，取一定数目细胞，离心后用PBS缓冲液重悬，调整细胞密度至2E+6cells/mL，每孔50μL加入96孔板中。所有样品及蛋白的稀释，均使用PBS缓冲液进行。最后，将加样完成的96孔板，置于4℃放置，孵育1h。取出后每孔加100μLPBS缓冲液，3000rpm离心清洗细胞一次，收集细胞沉淀。在细胞沉淀中加入提前配制的AF488-anti human IgG-Fc抗体(购买自SouthernBiotech，货号为2048-30)稀释液，4℃孵育1h。取出后3000rpm清洗一次，200μLPBS重悬后，流式上机检测，收集FL1-A通道内的荧光信号。
结果如图6所示，本发明实施例2筛选得到的四个鼠源抗体分子均可以抑制Siglec-15与Jurkat细胞表面受体的结合，且在同一作用浓度下，与对照抗体5G12相当。
实施例8鼠源抗体抑制Siglec-15与CHOSLV-LRRC4C细胞表面受体的结合
梯度稀释四种鼠源抗体分子(MA-I、MA-II、MA-III、MA-IV)及对照抗体5G12，配制浓度为200μg/mL，3x梯度稀释，共计8个梯度，每孔25μL加入96孔板相应位置。稀释Siglec-15-Fc配体蛋白，配制浓度40μg/mL，每孔25μL加入96孔板相应位置。对CHOSLV-LRRC4C细胞株进行计数，取一定数量细胞，离心后用PBS缓冲液重悬，调整细胞密度至2E+6cells/mL，每孔50μL加入96孔板中。所有样品及蛋白的稀释，均使用PBS缓冲液进行。将加样完成的96孔板，置于4℃放置，孵育1h。取出后每孔加100μLPBS缓冲液，3000rpm离心清洗细胞一次，收集细胞沉淀。在细胞沉淀中加入提前配制的AF488-anti human IgG-Fc抗体(购买自SouthernBiotech，货号为2048-30)，4℃孵育1h后3000rpm清洗一次，200μLPBS重悬后，流式上机检测，收集FL1-A通道内的荧光信号。绘制剂量效应曲线，计算候选分子抑制Siglec-15配体蛋白与细胞表面LRRC4C受体的结合。
结论：通过上述数据及图7可以看出，四个鼠源候选分子(MA-I、MA-II、MA-III、MA-IV)均能够阻断Siglec-15与其受体的结合。
实施例9鼠源抗体促进T细胞激活及增殖
复苏人PBMC细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，离心后收集细胞沉淀，用RPMI1640完全培养基重悬并计数，并调整细胞密度至2E+6cells/mL，每孔50μL加入96孔板中。Siglec-15配体蛋白，配制浓度为20μg/mL，每孔50μL加入96孔板相应位置。Anti-CD3抗体的作用终浓度为0.5μg/孔，配制浓度为10μg/mL，每孔50μL加入96孔板中相应位置。四种鼠源分子(MA-I、MA-II、MA-III、MA-IV)及对照抗体5G12，配制起始浓度为100μg/mL，3x梯度稀释，共计8个梯度。每孔50μL加入96孔板中相应位置。蛋白及抗体的稀释，均使用RPMI1640完全培养基进行，混匀96孔板，37℃避光孵育3天。取细胞培养上清，稀释10倍后，用于细胞因子检测。抗Siglec-15鼠源抗体分子对天然T细胞的激活，从以下三个角度进行评价考量：人TNF-α细胞因子释放、人IFN-γ细胞因子释放以及T细胞增殖，具体操作如下：
人IFN-γ检测试剂盒(购买自依科赛生物科技有限公司，货号为H008-96)：将稀释上清及标准品加入样本孔中，每孔100μL，盖上封板膜，室温孵育1.5h。孵育结束后洗板3次。加入人IFN-γ检测试剂盒内的Biotinylated antibody稀释液，每孔100μL，盖上封板膜室温孵育1h。孵育结束后洗板3次。加入Streptavidin-HRP工作液，每孔100μL，盖上封板膜，室温孵育30min。孵育结束后洗板3次。加入TMB显色液，每孔100μL，避光室温孵育约15分钟，每孔加入100μL Stop solution终止反应。酶标仪读取OD值后，绘制剂量效应曲线。
人TNF-α检测试剂盒(购买自依科赛生物科技有限公司，货号为EM008-96)：将稀释上清及标准品加入样本孔中，每孔100μL，盖上封板膜，室温孵育1.5h。孵育结束后洗板3次。加入Biotinylated antibody稀释液，每孔100μL，盖上封板膜室温孵育1h。孵育结束后洗板3次。加入人IFN-γ检测试剂盒内的Streptavidin-HRP工作液，每孔100μL，盖上封板膜，室温孵育30min。孵育结束后洗板3次。加入TMB显色液，每孔100μL，避光室温孵育约15分钟，每孔加入100μL Stop solution终止反应。酶标仪读取OD值后，绘制剂量效应曲线。
收集细胞沉淀，用CD3e Monoclonal Antibody(购买自赛默飞世尔科技有限公司，货号为MA1-10177)对细胞进行染色，室温避光孵育15min后，洗板一次，100μLPBS缓冲液重悬，流式上机进行绝对计数，绘制剂量效应曲线。
人TNF-α细胞因子释放
人IFN-γ细胞因子释放
T细胞增殖(绝对计数)
通过上述数据及图8-10可知，四个鼠源抗体分子(MA-I、MA-II、MA-III、MA-IV)均可以通过结合Siglec-15，阻断Siglec-15配体蛋白与天然T细胞表面受体的结合，阻断胞内抑制信号通路，激活T细胞，促使T细胞增殖并激活(释放TNF-α及IFN-γ)。
实施例10鼠源抗体分子生物学活性检测(报告基因法)
对Jurkat-NFAT-Luc工程细胞株计数，利用样品稀释液(其成分包括90％RPMI1640、10％FBS、0.5μg/ml Puromycin)调整细胞密度至2E+6cells/mL，轻轻混匀后将细胞液加入96孔板，50μL/孔。四种鼠源分子(MA-I、MA-II、MA-III、MA-IV)分别利用样品稀释液稀释至初始浓度为800μg/mL，5倍梯度稀释，共8个梯度，50μL/孔，加入96孔板相应位置，每个样品浓度设置两个复孔。配制Siglec-15抗原，每孔50μL加入96孔板中，使其作用终浓度至16μg/mL。配制Human CD3 antibody(购买自义翘神州生物技术有限公司，货号为10977-H001)，每孔50μL加入96孔板中，使其作用浓度至1μg/mL。轻轻混匀细胞培养板，置于37℃CO2培养箱孵育6h。离心弃上清，加入裂解液，每孔取10μL加入384孔板中，加入等量的荧光素酶反应底物(购买自普洛麦格生物技术有限公司，货号为E2610)，室温反应5min，在酶标仪下读荧光数值，并计算对应的IC50值，具体数据如下：
通过上述数据及图11所示，筛选出的4个不同的鼠源抗体及对照抗体均能结合Siglec-15，并抑制Siglec-15与Jurkat细胞表面受体的结合，阻断胞内的抑制信号通路，重新激活T细胞。工程细胞株Jurkat-NFAT-Luc的构建，可以模拟T细胞。Siglec-15通过与T细胞表面受体的结合，抑制并下调细胞内激活信号通路(NFAT-Luc)。这4个鼠源抗体分子能够有效阻断Siglec-15与细胞表面受体的结合作用，重新激活T细胞内信号通路。
实施例11
本发明实施例11进一步的限定了抗Siglec-15单克隆抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体分子，嵌合抗体分子包括实施例2中鼠源抗体分子的重链可变区、鼠源抗体分子的轻链可变区和人源化抗体恒定区。人源化抗体恒定区包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区，人源化抗体重链恒定区为人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的恒定区的一种，IgG1型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:20所示，IgG2型的恒定区的氨基酸序列如SEQID No:21所示，IgG4型的恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:22所示，人源化抗体轻链恒定区为氨基酸序列如SEQ ID No:23所示的人Ck型的恒定区；
SEQ ID No:20(人的IgG1型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
SEQ ID No:21(人的IgG2型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；
SEQ ID No:22(人的IgG4型的重链恒定区氨基酸序列)：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK；
SEQ ID No:23(人的Ck链的轻链恒定区氨基酸序列)：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
实施例12嵌合抗体分子抗体的制备
本发明实施例12在实施例7的基础上进一步限定了人源化抗体恒定区包括人的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:20所示)和人Ck型的轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:23所示)。
具体的制备方法：
将实施例2中免疫噬菌体抗体库筛选得到的抗体分子MA-I的重链可变区VH(SEQID No:7)和轻链可变区VL基因(SEQ ID No:8)保持鼠源序列不变，分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)上，重链恒定区为人的IgG1型(氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示)，轻链恒定区为人的Ck型(氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示)。瞬时转染HEK293E细胞(购买自：中国医学科学院基础医学研究所，货号为：GNHu43)，进行抗体表达，得到嵌合抗体CA-I。
实施例13鼠源抗体分子进行人源化
首先，选择实施例2中鼠源抗体分子MA-1的序列和人抗体种系数据库(v-base)比较，寻找同源性较高的人抗体轻、重链种系作为候选序列，然后将鼠源抗体分子MA-I的CDR的序列移植到人源候选序列上进行同源建模。然后通过三维结构模拟计算可能对于维持CDR环状结构起重要作用的关键框架氨基酸残基，从而设计人源化抗体的回复突变。将设计好的包含回复突变的人源化抗体的轻、重链可变区序列分别由南京金斯瑞生物科技有限公司优化合成，然后再连接到瞬时表达载体上，对人源化得到的轻重链组合分析，得到如下人源化抗体分子：HA-I，HA-II，上述筛选到的2个单克隆抗体序列如下：
具体的，SEQ ID No:24(HA-I和HA-II的重链可变区的氨基酸序列)：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMFWVRQAPGQRLEWIGYIYPDNGGTGYNQNFKSKATLTVDNSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSEYDYFDYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID No:25(HA-I的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPLTFGQGTKVELK；
SEQ ID No:26(HA-II的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPLTFGQGTKVELK。
实施例14
本发明实施例14在实施例13的基础上进一步的限定了人源化抗体分子还包括人源化抗体恒定区；人源化抗体恒定区包括选自人的IgG1型、IgG2型或IgG4型的重链恒定区和人Ck型的轻链恒定区，IgG1型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:20所示，IgG2型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:21所示，IgG4型的重链恒定区氨基酸序列如SEQ IDNo:22所示，人Ck型的轻链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No:23所示。
上述人源化抗体恒定区具体序列与实施例11相同。
实施例15人源化抗体分子的制备
本发明实施例15在实施例10的基础上进一步的限定了人源化抗体恒定区包括人的IgG1型的重链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:20所示)和人Ck型的轻链恒定区(其氨基酸序列如SEQ ID No:23所示)。
将实施例13人源化得到的2个人源化抗体分子的重链VH和轻链VL的编码基因分别克隆至装有重链恒定区和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)，重链恒定区为人的IgG1型(氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示)，轻链恒定区为Ck链(氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示)。
将人源化抗体分子HA-I、HA-II，分别瞬时转染HEK293细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所，货号为GNHu43)，进行抗体表达，使用AKTA仪器通过protein A亲和柱纯化获得单克隆抗体，同时使用BCA试剂盒(购买自：北京汇天东方科技有限公司，货号：BCA0020)进行蛋白浓度测定，之后通过SDS-PAGE鉴定蛋白大小，结果如图12所示，从左侧到右侧依次为非还原蛋白质分子量HA-I、HA-II、实施例12中制备的嵌合抗体CA-I、非还原蛋白质分子量Marker1和还原蛋白质分子量Marker2、HA-I、HA-II、嵌合抗体CA-I，每条带的分子量大小与理论一致。
实施例18人源化抗体分子与Siglec-15结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被Siglec-15抗原，200ng/孔/100μL，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h，加入不同稀释浓度的人源化抗体HA-I、HA-II和实施例12中制备的嵌合抗体CA-I，3个抗体的起始最高浓度均是50μg/mL，分别经过3倍稀释后每个抗体均做10个梯度，在37℃温度条件下孵育1h。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST 1:5000稀释的Goat AntiHuman IgG-HRP(购买自北京中杉金桥生物技术有限公司，货号：ZB-2304)，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μL/孔，室温显色5min，然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
通过上述数据及实验结果如图13所示，2个不同的人源化抗体分子均能与Siglec-15进行结合，且2个人源化抗体分子的EC50值均与嵌合抗体CA-I接近，说明人源化后的抗体分子保留了鼠源亲本抗体MA-I与Siglec-15的高结合能力。
实施例19人源化抗体与不同种属的Siglec-15交叉结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液分别包被人Siglec-15、鼠Siglec-15-His(购买自近岸蛋白质科技有限公司，货号：CW71)、食蟹猴Siglec-15-His(购买自近岸蛋白质科技有限公司，货号：CW70)100ng/孔/100μL，在4℃的温度条件下过夜包被。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入1％BSA-PBST在37℃温度条件下封闭1h，加入不同稀释浓度的人源化抗体HA-I、HA-II，2个人源化抗体的起始最高浓度均是25μg/mL，分别经过5倍稀释后每个抗体均做8个梯度，在37℃温度条件下孵育1h。用300μL/孔PBST洗涤五次，再加入用1％BSA-PBST 1:5000稀释的Goat Anti Human IgG-HRP，在37℃温度条件下孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μL/孔，室温显色5min，然后用2M H2SO4终止显色。酶标仪在450nm/630nm下读数，并计算对应的EC50值，具体数据如下：
通过上述数据及如图14所示，筛选出的2个不同的人源化抗体分子均能与人Siglec-15、食蟹猴Siglec-15、鼠Siglec-15进行结合。
实施例20人源化抗体分子抑制Siglec-15与Jurkat细胞表面受体的结合
梯度稀释两种人源化抗体分子(HA-I、HA-II)及对照抗体5G12，配制浓度为200μg/mL，5梯度稀释，共计8个梯度，每孔25μL加入96孔板相应位置。利用FITC荧光标记蛋白试剂盒(购买自赛默飞世尔科技有限公司，货号为F6434)对Siglec-15蛋白进行荧光标记，制备Siglec-15-FITC蛋白。利用PBS缓冲液调整Siglec-15-FITC蛋白浓度，配制浓度为40μg/mL，每孔25μL加入96孔板相应位置。对Jurkat细胞株进行计数，取一定数量细胞，离心后用PBS缓冲液重悬，调整细胞密度至2E+6cells/mL，每孔50μL加入96孔板中。所有样品及蛋白的稀释，均使用PBS缓冲液进行。将加样完成的96孔板，置于4℃放置，孵育1h。取出后每孔加100μLPBS缓冲液，3000rpm离心清洗细胞一次，收集细胞沉淀，200μLPBS重悬后，流式上机检测，收集FL1-A通道内的荧光信号。绘制剂量效应曲线，计算候选分子抑制Siglec-15配体蛋白与Jurkat细胞表面受体的结合。
通过上述数据及图15可知，两个人源化候选分子(HA-I、HA-II)均能够阻断Siglec-15与Jurkat细胞表面的受体的结合。
实施例21人源化抗体分子的生物学活性检测(报告基因)
对Jurkat-NFAT-Luc工程细胞株计数，利用样品稀释液(其成分包括90％RPMI1640、10％FBS、0.5μg/ml Puromycin)调整细胞密度至2E+6cells/mL，轻轻混匀后将细胞液加入96孔板，50μL/孔。两种人源化抗体分子(HA-I、HA-II)分别利用样品稀释液稀释至初始浓度为800μg/ml，5倍梯度稀释，共8个梯度，50μL/孔，加入96孔板相应位置，每个样品浓度设置两个复孔。配制Siglec-15抗原，每孔50μL加入96孔板中，使其作用终浓度至16μg/mL。配制anti-CD3抗体(购买自义翘神州生物技术有限公司，货号为10977-H001)，每孔50μL加入96孔板中，使其作用浓度至1μg/mL。轻轻混匀细胞培养板，置于37℃CO2培养箱孵育6h。离心弃上清，加入裂解液，每孔取10μL加入384孔板中，加入等量的荧光素酶反应底物(购买自普洛麦格生物技术有限公司，货号为E2610)，室温反应5min，在酶标仪下读荧光数值，并计算对应的IC50值，具体数据如下：
通过上述数据及图16所示，筛选出的2个人源化抗体分子均能结合Siglec-15，并抑制Siglec-15与Jurkat细胞表面受体的结合，阻断胞内的抑制信号通路，重新激活T细胞。
实施例22抗Siglec-15单克隆抗体HA-I对小鼠体内MC38-Siglec-15结直肠癌的抑制实验
1、实验动物：
种属品系：C57BL/6JGpt，小鼠；
周龄：6-8周；
实验动物提供商:江苏集萃药康生物科技有限公司。
2、细胞培养：
MC38肿瘤细胞(YK-CL-256-02)(购自：普如汀生物技术(北京)有限公司(Biovector NTCC Inc.)，货号：NTCC-MC38)为原始细胞，构建MC38-Siglec-15肿瘤细胞株。用含有灭活的10％胎牛血清(ExCell Bio,货号：FND500)，100U/mL的青霉素、100μg/mL的链霉素，250μg/mL的Hygromycin B(购自：赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Gibco)，货号：10687010)以及2mM谷氨酰胺的DMEM培养基(购自：赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Gibco)，货号：10566-016)在37℃、5％CO2的培养箱中培养肿瘤细胞，每隔3至4天待细胞长满后分瓶传代，将处于对数生长期的肿瘤细胞用于体内肿瘤的接种。
骨髓源性巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophage，BMDM)分离自C57BL/6小鼠。用含有灭活的10％胎牛血清(ExCell Bio,货号：FND500)，100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素以及20ng/mL mouse M-CSF(购自：北京义翘神州科技股份有限公司，货号：51112-MNAH)和20ng/mL mouse IL-10(购自：北京义翘神州科技股份有限公司，货号：50245-MNAE)的RPMI 1640培养基(购自：赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Gibco)，货号：A10491-01)在37℃、5％CO2的培养箱中培养4天后，可用于体内肿瘤模型的使用。
3、肿瘤细胞的接种与分组：
PBS重悬的MC38-Siglec-15肿瘤细胞，细胞密度为1.0×106/mL，与一定量的BMDMs细胞悬液混合均匀，接种于实验动物的右侧胁肋部皮下，100μL/只，在肿瘤生长至43mm3左右时分组给药，共2组，每组5只，分别为溶媒对照组(Vehicle，i.p，tiw×3w)、HA-1(10mg/kg，i.p.，tiw×3w)。
4、检测指标：每周使用游标卡尺对肿瘤体积进行2次的测量，测量肿瘤的长径和短径，其体积计算公式为：体积＝0.5×长径×短径2；记录肿瘤体积的变化与给药时间的关系，实验结果如图17所示。
通过图17数据显示，抗Siglec-15单克隆抗体HA-1能够抑制肿瘤的生长，且呈现剂量依赖性反应。
实施例23抗Siglec-15单克隆抗体HA-I热稳定性评估
使用多功能蛋白热稳定性分析系统(购买自Unchained Labs)对抗Siglec-15单克隆抗体HA-I的热稳定性进行评估。通过监测蛋白内源性荧光随温度变化(从25℃开始，以0.3℃/min的升温速度升温至95℃)检测蛋白构象的变化，从而确定蛋白熔解温度Tm，评估蛋白构象稳定性。样品发生聚集时，会导致散射光波发生干涉，散射光信号增加，通过静态光散射测定蛋白的胶体稳定性(以Tagg进行表征)，结果参考如下表和附图18所示。
抗Siglec-15单克隆抗体HA-I的温度为72.9℃，平均Tagg为72.0℃，显示出较好的构象稳定性和胶体稳定性。
实施例24
本发明实施例24在上述实施例1的基础上进一步限定了一种抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，通过实施例3-23中选择与Siglec-15结合能力最高、活性最好的抗Siglec-15单克隆抗体HA-I作为蛋白分子，然后进行蛋白溶液的纯化，纯化方法与实施例1相同，但是实施例24具体的限定了以下步骤：
S1、亲和层析：
S101、使用浓度为50mM的缓冲液B1对亲和层析柱进行平衡，亲和层析柱的填料为NMab Pro；本发明选择NMab Pro作为填料捕获细胞上清中的抗体，去除大部分的杂质。NMabPro可显著提高载量，是一款耐碱性的Protein A亲和填料，可实现更高效的清洁和灭菌，避免交叉污染，增强捕获步骤的生物污染控制能力。缓冲液B1为Tris-HCl缓冲液，缓冲液B1的pH为7.6，缓冲液B1的电导率为18mS/cm，Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，且Tris-HCl缓冲液中含有120-160mM的添加剂，添加剂为NaCl；
S102、将含有抗Siglec-15单克隆抗体的细胞液以200cm/h的流速上样至亲和层析柱上，上样载量为55mg蛋白/ml填料，亲和层析柱的柱床高度为20cm；
S103、上样结束后，使用缓冲液B1进行再平衡，待紫外信号平稳后，使用浓度为50mM的缓冲液B2进行至少一次的中间淋洗洗脱，直至紫外吸收值的曲线降至平稳后，停止冲洗，缓冲液B2为醋酸盐缓冲液，缓冲液B2的pH为5.5；
S104、使用浓度为50mM缓冲液B3对亲和层析柱进行洗脱，当紫外吸收值上升至100mAU时，开始收集所述蛋白溶液，当紫外吸收值降至100mAU时结束收集，备用，缓冲液B3为醋酸盐缓冲液，缓冲液B3的pH为3.6；
S105、使用酸溶液将收集的蛋白溶液的pH值调节至3.6，并在此pH条件下室温孵育1.25h，最后用1M的Tris缓冲液将蛋白溶液的pH回调至6，酸溶液为盐酸。
S2、深层过滤膜包过滤：将蛋白溶液的pH值调节至6，电导率调节至5mS/cm，并通过深层过滤膜包进行过滤，深层过滤膜包为Polisher ST膜；
S3、阳离子交换层析：
S301、平衡：使用浓度为20mM的缓冲液B4对阳离子交换层析柱进行平衡，阳离子交换层析柱的填料为NanoGel 50SP，NanoGel 50SP层析采用结合洗脱模式，即加样时目的蛋白吸附在阳离子交换层析柱上，而杂质流穿，通过不同的盐浓度洗脱达到分离目的蛋白。缓冲液B4为磷酸盐缓冲液，其pH值为6.0，其电导率为2.5mS/cm；
S302、上样：将步骤S2中过滤后的蛋白溶液以150cm/h的流速上样至阳离子交换层析柱，上样载量为55mg蛋白/ml填料，阳离子交换层析柱的柱床高度为20cm；
S303、再平衡：上样结束后，再次使用缓冲液B4进行再平衡，待紫外吸收值平稳后，停止冲洗；
S304、洗脱：使用缓冲液B5对阳离子交换层析柱进行洗脱，当紫外吸收值上升至100mAU时开始收集，当紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，即得到纯化后的抗Siglec-15单克隆抗体的蛋白溶液；缓冲液B5为20mM的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的浓度为20mM，其pH值为6，其电导率为18.0mS/cm，磷酸盐缓冲液中含有120-160mM的添加剂，添加剂为150mM的NaCl。
实施例25
本发明实施例25在上述实施例1的基础上进一步限定了一种抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，通过实施例3-23中选择与Siglec-15结合能力最高、活性最好的抗Siglec-15单克隆抗体HA-I作为蛋白分子，然后进行细胞培养液的纯化，纯化方法与实施例1相同，但是实施例25具体的限定了以下步骤：
S1、亲和层析：
S101、使用浓度为60mM的缓冲液B1对亲和层析柱进行平衡，亲和层析柱的填料为Eshmuno A；缓冲液B1为磷酸盐缓冲液，缓冲液B1的pH为7.0，缓冲液B1的电导率为30mS/cm；
S102、将含有抗Siglec-15单克隆抗体的细胞液以300cm/h的流速上样至亲和层析柱上，上样载量为40mg蛋白/ml填料，亲和层析柱的柱床高度为22cm；
S103、上样结束后，使用缓冲液B1进行再平衡，待紫外信号平稳后，使用浓度为60mM的缓冲液B2进行至少一次的中间淋洗洗脱，直至紫外吸收值的曲线降至平稳后，停止冲洗，缓冲液B2为磷酸盐缓冲液，缓冲液B2的pH为6；
S104、使用浓度为200mM缓冲液B3对亲和层析柱进行洗脱，当紫外吸收值上升至100mAU时，开始收集所述蛋白溶液，当紫外吸收值降至100mAU时结束收集，备用，缓冲液B3为醋酸盐缓冲液，缓冲液B3的pH为4；
S105、使用酸溶液将收集的蛋白溶液的pH值调节至3.7，并在此pH条件下室温孵育2h，最后用1M的Tris缓冲液将蛋白溶液的pH回调至7，酸溶液为盐酸。
S2、深层过滤膜包过滤：将蛋白溶液的pH值调节至7，电导率调节至4.7mS/cm，并通过深层过滤膜包进行过滤，深层过滤膜包为Mustang Q膜；
S3、阳离子交换层析：
S301、平衡：使用浓度为50mM的缓冲液B4对阳离子交换层析柱进行平衡，阳离子交换层析柱的填料为Eshmuno S，缓冲液B4为醋酸盐缓冲液，缓冲液B4的pH值为5.5，其电导率为5mS/cm；
S302、上样：将步骤S2中过滤后的蛋白溶液以200cm/h的流速上样至阳离子交换层析柱，上样载量为70mg蛋白/ml填料，阳离子交换层析柱的柱床高度为22cm；
S303、再平衡：上样结束后，再次使用缓冲液B4进行再平衡，待紫外吸收值平稳后，停止冲洗；
S304、洗脱：使用缓冲液B5对阳离子交换层析柱进行洗脱，当紫外吸收值上升至100mAU时开始收集，当紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，即得到纯化后的抗Siglec-15单克隆抗体的蛋白溶液；缓冲液B5为磷酸盐缓冲液，缓冲液B5的pH为7。
实施例26
本发明实施例26在实施例24的基础上，进一步限定了抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法中，S105中酸溶液优选为乙酸。
实施例27-30
本发明实施例27-30在实施例26的基础上，进一步限定了抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法中步骤S2中病毒灭活后，蛋白溶液的pH值和电导范围，其他方法和参数与实施例24全部相同，具体如下。
| 实施例 | pH值 | 样品电导(mS/cm) |
| 实施例27 | 5.5 | 5 |
| 实施例28 | 6.5 | 5 |
| 实施例29 | 7.5 | 5 |
| 实施例30 | 7.0 | 4 |
实施例31-33
本发明实施例31-33在实施例30的基础上，进一步限定了抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法中步骤S304的缓冲液B5，其他方法和参数与实施例30全部相同，具体如下。
对照例1
本发明对照例1在实施例24的基础上使用了单克隆抗体经典的三步纯化工艺，第一步亲和层析柱的填料为NMab Pro，第二步阴离子交换层析柱替换了实施例24中步骤S2，其填料为NanoGel 50Q，第三步阳离子交换层析柱的填料为NanoGel 50SP，其他两步均与实施例24相同。
对照例2
本发明对照例2在实施例24的基础上提供了一种抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，使用两步层析，相比实施例24，去掉了步骤S2，其他方法和参数与实施例24全部相同。
实验一、抗Siglec-15单克隆抗体的理化检测
针对本发明上述实施例1、24和26-33及对照例1提供的纯化方法所获得的抗Siglec-15单克隆抗体，运用凝胶色谱技术手段检测纯度，分析纯化过程中样品的聚集体、单体及降解产物含量；此外，运用离子色谱技术手段，分析电荷异构体酸碱峰含量，同时，通过以下公式计算总回收率：总回收率＝亲和层析蛋白收率(％)*阴离子交换层析蛋白收率(％)或膜层析过滤(％)*阳离子交换层析蛋白收率(％)，具体数据如下：
从上表可看出，本发明提供的纯化方法纯化得到的抗Siglec-15单克隆抗体，蛋白纯度可达99％以上，同时蛋白总收率可达到75％以上；其中，
通过实施例1、24和26-33对比可知，实施例32提供的方法中通过使用最佳的缓冲液B1、缓冲液B2、缓冲液B3、缓冲液B4、缓冲液B5的成分和含量及pH值得到的蛋白溶液中，蛋白纯度及收率最高，蛋白总回收率达到85％以上；
通过实施例26与实施例24相比，实施例26的亲和层析中酸溶液优选为乙酸后，灭活后蛋白样品的纯度明显高于实施例24，为此，亲和层析中，病毒灭活调酸溶液优选为乙酸。
通过实施例27-30相比可得出，实施例30提供的步骤S2中，优选的调节蛋白溶液的pH值为7，电导率为4mS/cm，能够适应本发明提供的Polisher ST膜，蛋白总回收率明显提高。
通过实施例31-33相比可得出，实施例32中提供的缓冲液B5为磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的浓度为20mM，其pH值为6，其电导率为18.0mS/cm，磷酸盐缓冲液中含有120-160mM的添加剂，添加剂为150mM的NaCl能够有效提高纯度，分离效果较好。
此外，通过本发明实施例24与对照例1相比，实施例24中深层过滤膜包过滤替代了对照例1中的阴离子交换层析，其回收率和纯化时间明显优于对照例1，说明本发明两步层析且配合Polisher ST膜过滤工艺能达到三步层析的纯化效果，而且总收率高，纯化周期短；亲和层析柱的填料优选为NMab pro，能达到进口填料的纯化效果，而且载量更高，降低成本；深层过滤膜包为3M的Polisher ST，既能澄清病毒灭活后的样品，又能替代阴离子交换层析的作用；阳离子交换层析柱的填料为NanoGel-50SP，能够有效提高蛋白纯度。
实验二、抗Siglec-15单克隆抗体的相关杂质检测
针对本发明上述实施例1、24和27-33及对照例2提供的纯化方法纯化的抗Siglec-15单克隆抗体，采用专用的试剂盒检测工艺相关杂质的含量。
通过上述实验数据表明，通过实施例27-30对比可知，实施例30提供的步骤S2中，优选的调节蛋白溶液的pH值为7，电导率为4mS/cm，能够适应本发明提供的Polisher ST膜，去除残留HCP、DNA和Pro-A等杂质的效果较优。
通过实施例1、24和27-33对比可知，实施例32提供的方法中通过使用最佳的缓冲液B1、缓冲液B2、缓冲液B3、缓冲液B4、缓冲液B5的成分和含量及pH值得到的蛋白溶液中，对残留HCP和残留DNA有显著地去除效果，同时聚集体和降解产物，显著提高蛋白纯度。
实施例24与对照例2对比可知，对照例2提供的纯化方法所得样品中杂质残留数据不符合要求，对照例2选用亲和层析和阳离子交换层析两步工艺纯化后的残留HCP和DNA无法有效控制，显著高于实施例24，并且不符合要求；实施例24添加深层过滤膜包过滤能够提高纯化效果，再次验证了本发明中深层过滤膜包采用Polisher ST，具有澄清过滤和阴离子交换层析的双重功能，不但能够有效地去除HCP、DNA等工艺相关杂质，而且能够吸附聚集体、产片片段等产品相关杂质，提高产品的纯度，可以替代传统的阴离子交换层析步骤，两步层析和深层过滤膜包过滤配合工艺的纯化效果高于三步层析工艺，同时缩短纯化时间，降低成本，相应提高了产量。
实验三、抗Siglec-15单克隆抗体的结合活性及生物学活性检测
针对本发明上述实施例1、24和26-33提供的纯化方法纯化的抗Siglec-15单克隆抗体，本发明采用ELISA手段，分析纯化后的抗Siglec-15单克隆抗体与Siglec-15的特异性结合能力，以评价纯化后抗体的活性，检测结果如下：
| 实施例 | 结合活性(％) | 生物学活性(％) |
| 实施例1 | 95 | 94 |
| 实施例24 | 100 | 102 |
| 实施例26 | 112 | 96 |
| 实施例27 | 88 | 93 |
| 实施例28 | 90 | 103 |
| 实施例29 | 78 | 82 |
| 实施例30 | 105 | 97 |
| 实施例31 | 79 | 84 |
| 实施例32 | 86 | 80 |
| 实施例33 | 83 | 88 |
从上表可看出，通过本发明上述实施例提供的方法纯化得到的抗Siglec-15单克隆抗体，结合活性及生物学活性均较好，在90％±20％范围内，说明通过大量实验条件筛选下，本发明提供的方法限定的条件纯化得到的抗Siglec-15单克隆抗体具有较好的生物学活性。
综上三个实验的数据可知，本发明采用两步层析和一步膜包过滤工艺，不但能够有效地去除HCP、DNA等工艺相关杂质及聚集体，使样品最终的纯度在99％以上，而且能够缩短纯化的周期，降低生产成本。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、亲和层析：利用亲和层析柱对含有抗Siglec-15单克隆抗体的细胞液进行初步纯化和浓缩，收集蛋白溶液，并将所述蛋白溶液在酸溶液中进行病毒灭活；
S2、深层过滤膜包过滤：将所述蛋白溶液的pH值调节至5-7，电导率调节至3-5mS/cm，并通过所述深层过滤膜包进行过滤；
S3、阳离子交换层析：利用阳离子交换层析柱对过滤后的所述抗体蛋白溶液进行精纯，得到精纯的所述抗Siglec-15单克隆抗体的蛋白溶液。
2.如权利要求1所述的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述抗Siglec-15单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括3个分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示的重链互补决定区，轻链可变区包括3个分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示的轻链互补决定区，所述重链互补决定区HCDR1的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，所述重链互补决定区HCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，所述重链互补决定区HCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示，所述轻链互补决定区LCDR1的氨基酸序列如SEQID No:4所示，所述轻链互补决定区LCDR2的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示，所述轻链互补决定区LCDR3的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。
3.如权利要求2所述的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述抗Siglec-15单克隆抗体为鼠源抗体分子，所述鼠源抗体分子的所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:7所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示；
所述鼠源抗体分子还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:15所示，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:16所示。
4.如权利要求2所述的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述抗Siglec-15单克隆抗体为人源化抗体分子，所述人源化抗体分子选自以下任意一种：
HA-Ⅰ：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:24所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:25所示；
HA-Ⅱ：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:24所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No:26所示。
5.如权利要求4所述的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述人源化抗体分子还包括人源化抗体重链恒定区和人源化抗体轻链恒定区，所述人源化抗体轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID No:23所示；所述人源化抗体重链恒定区的氨基酸序列如SEQID No:20所示。
6.如权利要求1所述的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，步骤S1中，所述亲和层析具体包括以下步骤：
S101、使用浓度为30-60mM的缓冲液B1对所述亲和层析柱进行平衡，所述亲和层析柱的填料选自MabSelect Sure LX、MabSelect PrismA、Eshmuno A或NMab Pro；所述缓冲液B1选自Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液或磷酸盐缓冲液，所述缓冲液B1的pH为7-8，所述缓冲液B1的电导率为10-30mS/cm；
S102、将含有抗Siglec-15单克隆抗体的细胞液以50-300cm/h的流速上样至所述亲和层析柱上，上样载量为20-55mg蛋白/ml填料，所述亲和层析柱的柱床高度为18-22cm；
S103、上样结束后，使用所述缓冲液B1进行再平衡，待紫外信号平稳后，使用浓度为30-60mM的缓冲液B2进行至少一次的中间淋洗洗脱，直至紫外吸收值的曲线降至平稳后，停止冲洗，所述缓冲液B2选自HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，所述缓冲液B2的pH为5-6；
S104、使用浓度为20-200mM缓冲液B3对所述亲和层析柱进行洗脱，当所述紫外吸收值上升至100mAU时，开始收集所述蛋白溶液，当所述紫外吸收值降至100mAU时结束收集，备用，所述缓冲液B3选自甘氨酸-盐酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，所述缓冲液B3的pH为3-4；
S105、使用酸溶液将收集的所述蛋白溶液的pH值调节至3.5-3.7，并在此pH条件下室温孵育0.5-2h，最后用1M的Tris缓冲液将所述蛋白溶液的pH回调至5-7，所述酸溶液选自柠檬酸、乙酸或盐酸。
7.如权利要求6所述的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述亲和层析柱的填料为NMab Pro，所述缓冲液B1为Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.0-7.6，所述Tris-HCl缓冲液的电导率为18mS/cm；所述Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，且所述Tris-HCl缓冲液中含有120-160mM的添加剂，所述添加剂为NaCl；
所述缓冲液B2为醋酸盐缓冲液，所述醋酸盐缓冲液的pH为5.0-5.5，所述醋酸盐缓冲液浓度为50mM；
所述缓冲液B3为醋酸盐缓冲液，所述醋酸盐缓冲液的pH为3.6，所述醋酸盐缓冲液的浓度为50mM。
8.如权利要求1所述的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述深层过滤膜包选自Natrix Q膜、Mustang Q膜或Polisher ST膜；
优选的，所述深层过滤膜包为Polisher ST膜。
9.如权利要求1所述的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，步骤S3中，所述阳离子交换层析，具体包括以下步骤：
S301、平衡：使用浓度为10-50mM的缓冲液B4对所述阳离子交换层析柱进行平衡，所述阳离子交换层析柱的填料选自Capto SP、Capto MMC、Eshmuno S或NanoGel 50SP，所述缓冲液B4选自柠檬酸缓冲液、醋酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液，所述缓冲液B4的pH值为5.5-6.5，其电导率为2-5mS/cm；
S302、上样：将步骤S2中过滤后的所述蛋白溶液以100-200cm/h的流速上样至所述阳离子交换层析柱，上样载量为20-55mg蛋白/ml填料，所述阳离子交换层析柱的柱床高度为18-22cm；
S303、再平衡：上样结束后，再次使用所述缓冲液B4进行再平衡，待所述紫外吸收值平稳后，停止冲洗；
S304、洗脱：使用缓冲液B5对所述阳离子交换层析柱进行洗脱，当所述紫外吸收值上升至100mAU时开始收集，当所述紫外吸收值下降至100mAU时结束收集，即得到纯化后的抗Siglec-15单克隆抗体的蛋白溶液；所述缓冲液B5为醋酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液；所述缓冲液B5的pH值为5-7。
10.如权利要求9所述的抗Siglec-15单克隆抗体的纯化方法，其特征在于，所述阳离子交换层析柱的填料为NanoGel 50SP；
所述缓冲液B5为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的浓度为20mM，其pH值为6，其电导率为18mS/cm，所述磷酸盐缓冲液中含有120-160mM的添加剂，所述添加剂为150mM的NaCl。
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