CN109336970A

CN109336970A - 阳离子交换层析法纯化抗体的方法

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Publication number: CN109336970A
Application number: CN201811333478.0A
Authority: CN
Inventors: 方峰; 梁泊宁; 汤炜; 周佳豪
Original assignee: Hangzhou Yian Jishi Biopharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Yian Jishi Biopharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2018-11-09
Filing date: 2018-11-09
Publication date: 2019-02-15

Abstract

本发明涉及抗体纯化技术领域，尤其是涉及一种阳离子交换层析法纯化抗体的方法。所述方法包括如下步骤：对抗体溶液进行阳离子交换层析处理，调节抗体溶液的pH为5.0‑7.0、电导率为3‑20mS/cm进行上样，平衡缓冲液的pH为5.0‑7.0、电导率为3‑20mS/cm，采用流穿模式或过载模式进行纯化。本发明利用阳离子交换层析法纯化抗体，调节抗体溶液和平衡缓冲液的pH和电导率，使目标抗体单体不能或极少量与阳离子层析柱或膜结合，随流穿液流出，而杂质成分能够与层析柱或膜结合，以达到抗体纯化的目的；同时抗体的得率可达到90％以上。

Description

阳离子交换层析法纯化抗体的方法

技术领域

本发明涉及抗体纯化技术领域，尤其是涉及一种阳离子交换层析法纯化抗体的方法。

背景技术

目前，已经有上百种单克隆抗体药物上市以及处于研发阶段，人们对生物制药的兴趣也越发浓厚。低毒副作用、高特异性治疗功效、较长的半衰期和平台化的生产工艺技术等特点，使单抗在治疗生物制品领域处于领导地位，是最成功的一类生物制品。迄今，大部分的单抗都是由哺乳动物细胞表达的，具有很高的同源性以及相似的分子特性。这些相似特性被很多公司及研究机构开发成平台化技术以达到只做少量的技术改变与优化便可对大量处于临床早期阶段不同类抗体进行高效纯化，随着项目进展到临床后期及商业化阶段，需要针对细胞培养的改变，抗体滴定的增加，生产设备的更新等做进一步工艺优化与开发，并且提高产量，降低商业成本。

抗体药物制造工艺从研发时期的细胞株构建、培养基优化、上游细胞培养、下游纯化到最后制剂这五个方面的任何一个环节都对抗体药物有很重要的影响，其中又以下游纯化工艺最为复杂繁琐。

如今下游纯化工艺形成的平台技术主要为通过蛋白A亲和层析对培养液中抗体进行捕获，随后一至两步精制步骤，如离子交换层析、疏水层析、混合模式层析。宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA、多聚体、病毒等杂质在精纯过程中会被降到法规允许的水平。

传统的纯化步骤均通过蛋白A亲和层析、阳离子交换层析、疏水层析以及混合模式层析的结合洗脱模式进行。存在填料载量低即单次循环处理料液量低，操作时间长，填料利用率低等缺点。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种阳离子交换层析法纯化抗体的方法，以解决现有技术中存在的填料载量低，操作时间长，填料利用率低的技术问题，该纯化方法通过阳离子交换层析法提高了对HCP、多聚体的去除能力，节省工艺操作时间，降低成本。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

阳离子交换层析法纯化抗体的方法，包括如下步骤：

对抗体溶液进行阳离子交换层析处理，调节抗体溶液的pH为5.0-7.0、电导率为3-20mS/cm进行上样，平衡缓冲液的pH为5.0-7.0、电导率为3-20mS/cm，采用流穿模式或过载模式进行纯化。

本发明利用阳离子交换层析法纯化抗体，调节抗体溶液和平衡缓冲液的pH和电导率，使目标抗体单体不能或极少量与阳离子层析柱或膜结合，随流穿液流出，而杂质成分能够与层析柱或膜结合，以达到抗体纯化的目的；同时抗体的得率可达到90％以上。

并且，流穿模式和过载模式的操作流速快，减少步骤时间；过载模式和流穿模式具有更高的可用结合载量，并且有较少的洗涤和洗脱步骤，单循环样品处理量显著增加，填料及膜耗材减少，提高利用率，降低成本。结合洗脱模式，填料载量低，单次循环处理料液量低，操作时间长，填料利用率低；本发明相较于结合洗脱模式，处理量增加，填料利用率高。

本发明中，抗体溶液的pH为5.0-7.0，在此范围内任意选择，例如5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0等等。

本发明中，抗体溶液的电导率为3-20mS/cm，在此范围内任意选择，例如3mS/cm、4mS/cm、5mS/cm、6mS/cm、7mS/cm、8mS/cm、9mS/cm、10mS/cm、11mS/cm、12mS/cm、13mS/cm、14mS/cm、15mS/cm、16mS/cm、17mS/cm、18mS/cm、19mS/cm、20mS/cm等等。

本发明的方法主要适用于抗体的纯化，尤其是单抗的纯化，尤其是中国仓鼠卵巢细胞表达的抗体。优选的，抗体的浓度为1-15g/L，优选为2.7-10.4g/L。

优选的，抗体的等电点≥7.5。

优选的，调节抗体溶液的pH为5.0-7.0、电导率为12-20mS/cm，采用流穿模式进行纯化。更优选的，pH为5.5，电导率为15-19mS/cm，优选为16-19，更优选18±1mS/cm。

通过预实验，在抗体溶液在上述范围内直接上样，抗体单体不结合层析柱或膜，直接流穿；而上样抗体溶液在上述范围内，多聚体等杂质能够结合层析柱或膜，从而实现抗体的纯化。采用流穿模式，可增快流速、提高填料或膜载量，缩短步骤时间，节省成本。

优选的，采用流穿模式时，上样完成后，采用平衡缓冲液冲洗阳离子交换层析介质，收集流穿液。更优选的，平衡缓冲液的pH为5.0-7.0、电导率为12-20mS/cm。流穿模式的抗体溶液的上样载量＞300g/L，能够保证得率在90％以上。

本发明通过预实验的方式，确定流穿模式的上样抗体溶液的电导率。这一电导率为抗体单体不能与层析柱或膜结合，而多聚体等杂质可以与层析柱或膜结合的临界值。

预实验的方法包括：调节抗体溶液的pH为5.0-7.0进行上样，上样载量＜300g/L，不过载为宜；用平衡缓冲液-氯盐溶液梯度洗脱，收集洗脱液，分别检测纯度及杂质含量，以对应抗体纯度开始降低，多聚体含量开始升高时的洗脱液的电导率作为上样抗体溶液的电导率。

优选的，调节抗体溶液的pH为5.0-7.0、电导率为3-8mS/cm，采用过载模式进行纯化。更优选的，pH为5.5，电导率为5mS/cm。过载模式的抗体溶液的上样载量＞500g/L。

在载量未饱和(＜100g/L填料或膜体积)条件下，抗体单体与多聚体等杂质均与柱或膜结合。持续上样至层析柱或膜对抗体单体的结合能力饱和后，上样抗体单体穿透，收集流穿液。

持续上样，载量大于500g/L条件下，抗体单体在与层析柱或膜结合过载，单体抗体不能继续与层析柱或膜结合，而由于多聚体相较于单体与阳离子交换层析柱或膜有更强的结合能力，继续与层析柱或膜结合；持续上样过程中，多聚体取代单体的结合位置，单体会被替换下来；多聚体持续结合在柱或膜上，而后续上样单体以及原先结合在柱或膜上的单体持续随流穿液流出；以此降低抗体料液中的多聚体比例，达到抗体纯化的目的。

优选的，采用过载模式时，上样载量＞500g/L，完成上样；采用平衡缓冲液冲洗阳离子交换层析介质，收集流穿液。更优选的，平衡缓冲液的pH为5.0-7.0、电导率为3-8mS/cm。由于过载模式，单体抗体不能继续与层析柱或膜结合，采用平衡缓冲液推出样品溶液，收集流穿液，单体抗体被推出，待流穿液的紫外吸光度降至一定值后，停止样品收集。由于多聚体相较于单体与阳离子交换层析柱或膜有更强的结合能力，冲洗过程中，继续与层析柱或膜结合，替换下单体，从而达到抗体纯化的效果。

优选的，上样前，采用平衡缓冲液对阳离子交换层析介质平衡处理。更优选的，采用阳离子交换层析柱或阳离子交换层析膜对抗体溶液进行阳离子交换层析处理。采用＞3CV的平衡缓冲液对阳离子交换层析柱进行平衡处理，采用＞20MV的平衡缓冲液对阳离子层析膜进行平衡处理。

优选的，平衡缓冲液的pH为5.0-7.0，优选为5.5。平衡缓冲液包括但不局限于醋酸钠-醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液，优选为醋酸钠-醋酸缓冲液。

优选的，阳离子交换层析介质包括Fractogel COO-(Millipore)、Eshmuno CPX(Millipore)、POROS 50HS(Thermo Scientific)、POROS XS(Thermo Scientific)、CaptoSP ImpRes(GE Life science)、Capto S(GE Life science)、Capto S ImpAct(GE Lifescience)、SP HP(GE Life science)及Mustang S(PALL)、Sartobind S(Sartorius)中的任一种。

收集流穿液后，采用高浓度含盐溶液对层析柱或膜进行再生处理，收集再生液。如可采用50mM NaAc-HAc、1M NaCl对层析柱或膜进行再生处理。

优选的，抗体溶液的获取方法包括：通过蛋白A亲和层析对细胞培养液中抗体捕获，进行病毒灭活，调节pH至5.0-7.0后，进行深层过滤，得到抗体溶液。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明利用阳离子交换层析法纯化抗体，调节抗体溶液和平衡缓冲液的pH和电导率，使目标抗体单体不能或极少量与阳离子层析柱或膜结合，随流穿液流出，而杂质成分能够与层析柱或膜结合，以达到抗体纯化的目的；同时抗体的得率可达到90％以上；

(2)本发明采用流穿模式和过载模式的操作流速快，减少步骤时间；过载模式和流穿模式具有更高的可用结合载量，并且有较少的洗涤和洗脱步骤，单循环样品处理量显著增加，填料及膜耗材减少，提高利用率，降低成本；

(3)通过优化工艺参数，进一步改善了纯化方法对特定抗体的纯度和得率以及HCP和多聚体的去除能力，抗体得率在90％以上，多聚体含量降低50％以上，HCP含量降低75％以上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的分布收集洗脱样品的层析图谱；

图2为本发明实施例1提供的纯化过程的层析图谱；

图3为本发明实施例2提供的纯化过程的层析图谱。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

使用阳离子层析膜Mustang S XT Acrodis Units(PALL)，膜体积0.86mL，操作流速8.6mL/min。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab1)经蛋白A亲和层析捕获，低pH灭活后调节样品抗体溶液的pH为5.5，电导率值为5mS/cm，中间深层过滤后得到抗体溶液。得到的抗体溶液中，Mab1浓度10.4g/L，纯度97.0％，多聚体含量2.5％，HCP含量212.7ppm。

层析膜经平衡缓冲液(50mM NaAc-HAc，pH 5.5)平衡后，取7.2mL稀释后样品Mab1浓度1.8g/L，纯度97.0％，多聚体含量2.5％的抗体溶液上样，载量15g/L MV。用洗脱缓冲液(50mM NaAc-HAc，0.5M NaCl，pH 5.5)梯度洗脱(0-100％，30MV)，出峰分布收集0.8mL/管，检测纯度及多聚体含量。层析图谱如图1所示。

分布收集洗脱样品检测结果如表1所示。

表1分布收集洗脱样品检测结果

从表1中可知，在15-19mS/cm的电导率范围内，能够保证抗体单体不能与层析膜结合，而多聚体等杂质可以与层析膜结合，从而使上样后抗体单体直接流穿，多聚体等杂质结合层析膜，从而实现抗体的纯化。

本实施例采用pH 5.5，电导率值为18.0mS/cm作为上样的抗体溶液和平衡缓冲液的条件。

用平衡缓冲液(50mM NaAc-HAc，150mM NaCl，pH 5.5，电导率值为17.7mS/cm)平衡层析膜30MV，调节样品抗体溶液为pH 5.5，电导率值为18.0mS/cm，浓度2.7g/L，纯度97.0％，多聚体含量2.5％，HCP含量212.7ppm。上样1.6mL后，样品开始穿透，收集流穿液，持续上样，至上样414mL，即抗体载量为1031g/L MV时，完成上样。过程中，分布收集流穿液32mL/管。上样结束后，用平衡缓冲液(50mM NaAc-HAc，150mM NaCl，pH 5.5)顶推层析膜内的样品溶液，至流穿液紫外吸光度降至100mAu时，停止收集流穿液。用再生缓冲液(50mMNaAc-HAc，1M NaCl，pH 5.5)再生层析膜，消毒液(0.5M NaOH)消毒层析膜，保存液(0.1MNaOH)保存层析膜。层析图谱如图2所示。

纯化过程得到分布收集样品的测试结果如表2所示。

表2分布收集样品检测结果

混合所有样品，检测HCP含量为43.2ppm(比上样抗体溶液中含量降低79.7％)，多聚体含量为1.1％，纯度为98.7％，得率为99％。

实施例2

使用阳离子层析膜Mustang S XT Acrodis Units(PALL)，膜体积0.86mL，操作流速8.6mL/min。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab1)经蛋白A亲和层析捕获，低pH灭活后调节样品抗体溶液的pH为5.5，电导率值为5mS/cm，中间深层过滤后得到抗体溶液。得到的抗体溶液中，Mab1浓度4.1g/L，纯度97.0％，多聚体含量2.5％，HCP含量212.7ppm。

用平衡缓冲液(50mM NaAc-HAc，pH 5.5，电导率值为3.2mS/cm)平衡层析膜30MV，上样5.2mL后，样品开始穿透，收集流穿液。持续上样，至上样279mL，即抗体载量为1328g/LMV时，完成上样。过程中，分布收集流穿液21mL/管。上样结束后，用平衡缓冲液(50mM NaAc-HAc，pH 5.5)顶推层析膜内的样品溶液，至流穿液紫外吸光度降至100mAu时，停止收集流穿液。用再生缓冲液(50mM NaAc-HAc，1M NaCl，pH 5.5)再生层析膜，消毒液(0.5M NaOH)消毒层析膜，保存液(0.1M NaOH)保存层析膜。层析图谱如图3所示。

纯化过程得到分布收集样品的测试结果如表3所示。

表3分布收集样品检测结果

混合所有样品，检测HCP含量为45.7ppm(比上样抗体溶液中含量降低78.5％)，多聚体含量为1.0％，纯度为99.0％，得率为96.0％。

实施例3

预装柱Fractogel COO-(Millipore)，直径0.8cm，柱高10cm，柱体积5mL，操作线性流速300cm/h。样品来源为CHO细胞表达的单抗(Mab1)经蛋白A亲和层析捕获，低pH灭活后调节样品抗体溶液的pH为5.5，电导率值为5mS/cm，中间深层过滤后得到抗体溶液。得到的抗体溶液中，Mab1浓度10.4g/L，纯度97.0％，多聚体含量2.5％，HCP含量212.7ppm。

用平衡缓冲液(50mM NaAc-HAc，pH 5.5)平衡层析柱3CV，后上样32mL后，样品开始穿透，收集流穿液。持续上样，至上样495mL，即抗体载量为1029g/L填料时，完成上样。用平衡缓冲液(50mM NaAc-HAc，pH 5.5)顶推层析柱内的样品溶液，至流穿液紫外吸光度降至100mAu时，停止收集流穿液。用再生缓冲液(50mM NaAc-HAc，1M NaCl，pH 5.5)再生层析柱，消毒液(0.5M NaOH)消毒层析柱，保存液(0.1M NaOH)保存层析柱。

共收集流穿样品溶液465mL，Mab1浓度为10.2g/L，得率为92％，纯度为95.9％，多聚体含量1.1％，HCP含量39.8ppm(比上样抗体溶液中含量降低81.3％)。

实施例4

经前期研究，本实施例采用pH 5.5，电导率值为16.0mS/cm作为上样的抗体溶液和平衡缓冲液的条件。

用平衡缓冲液(50mM NaAc-HAc，130mM NaCl，pH 5.5，电导率值为16.2mS/cm)平衡层析膜3CV，调节样品抗体溶液为pH 5.5，电导率值为16.0mS/cm，浓度5.2g/L，纯度97.0％，多聚体含量2.5％，HCP含量212.7ppm。上样22mL后，样品开始穿透，收集流穿液，持续上样，至上样480mL，即抗体载量为499g/L时，完成上样。过程中，分布收集流穿液96mL/管。上样结束后，用平衡缓冲液(50mM NaAc-HAc，130mM NaCl，pH 5.5)顶推层析膜内的样品溶液，至流穿液紫外吸光度降至100mAu时，停止收集流穿液。用再生缓冲液(50mM NaAc-HAc，1M NaCl，pH 5.5)再生层析膜，消毒液(0.5M NaOH)消毒层析膜，保存液(0.1M NaH)保存层析膜。

纯化过程得到分布收集样品的测试结果如表4所示。

表4分布收集样品检测结果

混合所有样品，检测HCP含量为37.2ppm(比上样抗体溶液中含量降低82.5％)，多聚体含量为1.1％，纯度为98.8％，得率为96％。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.阳离子交换层析法纯化抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

对抗体溶液进行阳离子交换层析处理，调节所述抗体溶液的pH为5.0-7.0、电导率为3-20mS/cm进行上样，平衡缓冲液的pH为5.0-7.0、电导率为3-20mS/cm，采用流穿模式或过载模式进行纯化。

2.根据权利要求1所述的阳离子交换层析法纯化抗体的方法，其特征在于，调节所述抗体溶液的pH为5.0-7.0、电导率为12-20mS/cm，采用流穿模式进行纯化；

优选的，调节所述抗体溶液的pH为5.5-6.5，电导率为15-19mS/cm，采用流穿模式进行纯化；

更优选的，调节所述抗体溶液的pH为5.5，电导率为18±1mS/cm，采用流穿模式进行纯化。

3.根据权利要求1或2所述的阳离子交换层析法纯化抗体的方法，其特征在于，采用所述流穿模式时，上样完成后，采用平衡缓冲液冲洗阳离子交换层析介质，收集流穿液；

优选的，所述平衡缓冲液的pH为5.0-7.0、电导率为12-20mS/cm；

优选的，所述流穿模式的抗体溶液的上样载量＞300g/L。

4.根据权利要求1所述的阳离子交换层析法纯化抗体的方法，其特征在于，通过预实验的方式，确定流穿模式的上样抗体溶液的电导率，预实验的方法包括：调节抗体溶液的pH为5.0-7.0进行上样，上样载量＜300g/L；用平衡缓冲液-氯盐溶液梯度洗脱，收集洗脱液，分别检测纯度及杂质含量，以对应抗体纯度开始降低，多聚体含量开始升高时的洗脱液的电导率作为上样抗体溶液的电导率。

5.根据权利要求1所述的阳离子交换层析法纯化抗体的方法，其特征在于，调节所述抗体溶液的pH为5.0-7.0、电导率为3-8mS/cm，采用过载模式进行纯化；

优选的，调节所述抗体溶液的pH为5.5、电导率为5mS/cm，采用过载模式进行纯化。

6.根据权利要求1所述的阳离子交换层析法纯化抗体的方法，其特征在于，采用所述过载模式时，上样载量＞500g/L，完成上样；采用平衡缓冲液冲洗阳离子交换层析介质，收集流穿液；

优选的，所述平衡缓冲液的pH为5.0-7.0、电导率为3-8mS/cm。

7.根据权利要求1所述的阳离子交换层析法纯化抗体的方法，其特征在于，上样前，采用平衡缓冲液对阳离子交换层析介质平衡处理；

优选的，采用所述流穿模式时，平衡缓冲液的pH为5.0-7.0、电导率为12-20mS/cm；

优选的，采用过载模式时，平衡缓冲液的pH为5.0-7.0、电导率为3-8mS/cm。

8.根据权利要求1所述的阳离子交换层析法纯化抗体的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液包括醋酸钠-醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液中的任一种；

优选的，所述平衡缓冲液为醋酸钠-醋酸缓冲液。

9.根据权利要求1所述的阳离子交换层析法纯化抗体的方法，其特征在于，所述阳离子交换层析介质包括Fractogel COO-、Eshmuno CPX、POROS 50HS、POROS XS、Capto SPImpRes、Capto S、Capto S ImpAct、SP HP、Mustang S、Sartobind S中的任一种。

10.根据权利要求1所述的阳离子交换层析法纯化抗体的方法，其特征在于，所述抗体溶液的获取方法包括：通过蛋白A亲和层析对细胞培养液中抗体捕获，进行病毒灭活，调节pH至5.0-7.0后，进行深层过滤，得到所述抗体溶液。