CN106380519A - 一种单克隆抗体的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效去除重组人源化抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗中酸性异构体的方法,该方法利用阳离子交换层析填料对含有酸性异构体的抗体样品进行纯化,酸性异构体含量降至25%以下,抗体回收率达到60%以上,本发明的方法采用缓冲液种类少,且为等梯度洗脱,操作方便,适合工业化放大生产。
Description
技术领域
本发明属于蛋白纯化领域,具体涉及一种使用阳离子交换层析去除抗HER2单克隆抗体酸性异构体的方法。
背景技术
通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备单克隆抗体药物已经成为生物制药领域的一个重要方面由于单克隆抗体药物专一性强、疗效显著,因此成为近年来研究的热点药物之一。曲妥珠单抗为一种针对HER2/neu的重组人源化IgG单克隆抗体,能特异性识别Her2调控的细胞表面蛋白HER2,使其通过内吞噬作用离开胞膜进入核体内,抑制其介导的信号转导,从而起到治疗肿瘤的作用。美国FDA于1999年批准其上市,2002年在我国上市。大量临床资料证实曲妥珠单抗用于HER2阳性乳腺癌的有效率为21%,而且它与化疗联合应用明显提高了生存时间。
单克隆抗体是复杂的四聚体糖蛋白,具有异质性,包括电荷、疏水、形态等相关的异构体。在生产以及储存过程中都可能出现异构体。其中由于抗体分子所带电荷差异造成的异质性称为电荷异构体,一般分为酸性异构体和碱性异构体,产生原因主要与翻译后修饰有关。由于这些异构体可能会影响抗体的稳定性、药效、免疫原性或药代动力学,因此需要识别和分离抗体的电荷异构体。
在抗体纯化过程中,通常使用多种层析技术进行多步纯化,才能将目的蛋白与杂质或异构体分开。这些技术的原理是基于分子大小、性状、电荷量、疏水性、溶解度等的差异。其中基于电荷差异原理的离子交换层析被认为是最常用也是最有前景的方法。
在离子交换层析中,目标分子和电荷异构体杂质一起进入平衡后的离子交换剂,目标分子和电荷异构体杂质因带电量的不同,与离子交换剂有不同的结合能力,因此可以通过逐渐增加盐离子浓度,将目标分子和电荷异构体杂质分别洗脱下来,从而达到将目标分子和电荷异构体杂质分离开来的目的。也可以通过调整溶剂的pH来改变电荷异构体分子的带电量达到分离的效果。有研究表明,依赖pH变化的分离方式比依赖离子强度变化的分离方式效果更好,但整个工艺较为复杂,pH控制不稳定,很难在生产放大中应用。
抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗商品名为赫赛汀,美国药典USP中对赫赛汀酸性异构体的含量要求为不大于35%。在抗体发酵期间会发生不同过程的修饰,导致同一批次发酵抗体的电荷异质性,这些修饰包括脱酰胺化、糖基化、不完全的二硫键形成、N端焦谷酰胺环化、C端赖氨酸修饰等。抗HER2单克隆抗体的脱酰胺化是一种典型的酸性异构体的形成方式。脱酰胺化一般发生在天冬酰胺和谷氨酰胺残基位点,这些氨基酸的侧链被修饰成异-谷氨酸和异-天冬氨酸或者谷氨酸和天冬氨酸。脱酰胺化对抗体引入一个额外的负电荷,形成酸性异构体,在阳离子交换层析中与阳离子交换剂结合力稍弱,可以较早被洗脱。中国专利99805836.X报道了在洗脱目的抗体之前使用具有不同电导率的缓冲液通过阳离子交换层析来纯化HER2抗体,达到降低酸性峰含量比例的目的。中国专利201080032734.8报道了通过分不同阶段线性洗脱的方式或者逐步增加清洗缓冲液电导或pH的方式或者两者结合的方式来去除酸性异构体。
发明内容
本发明提供了一种高效去除重组人源化抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗中酸性异构体的方法,该方法利用阳离子交换层析填料对含有酸性异构体的抗体样品进行纯化,酸性异构体含量降至25%以下,抗体回收率达到60%以上,本发明的方法采用缓冲液种类少,且为等梯度洗脱,操作方便,适合工业化放大生产。
本发明提供的一种去除重组人源化抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗中酸性异构体的方法,其特征在于,包含如下步骤:
步骤1):用平衡缓冲液将阳离子交换层析填料平衡,所述阳离子交换填料选自POROS HS、POROS XS、SP-SEPHAROSE FAST FLOW、Capto S ImpAct、Nuvia HRS、Nuvia S。
步骤2):将包含抗体及其酸性异构体的样品加载到阳离子交换层析填料上,保留时间为3~6min。
步骤3):用步骤1)所述平衡缓冲液清洗所述阳离子交换填料,清洗3~5个柱体积。
步骤4):用清洗缓冲液清洗所述阳离子交换填料,清洗3~8个柱体积。
步骤5):用步骤1)所述平衡缓冲液清洗所述阳离子交换层析填料,清洗4~5个柱体积。
步骤6):用洗脱缓冲液从所述阳离子交换填料上洗脱抗体,自UV280为500mAU开始收集,收集UV280上升及再次降至500mAU时的抗体。
本发明的方法还包括在阳离子交换层析之前,将包含重组人源化抗HER2单克隆抗体及其酸性异构体的样品进行亲和层析纯化,将亲和层析纯化得到的产品调节pH和电导率后作为阳离子交换层析纯化的样品。
进一步优化,步骤1)所述阳离子交换填料每毫升的抗体载量在30mg以上,优选POROSXS填料;所述平衡缓冲液种类可选自NaAc-HAc(醋酸钠-醋酸缓冲液)、MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)、Sodium Citrate(柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)等,优选NaAc-HAc缓冲液;平衡缓冲液pH与抗体样品的pH一致,电导率为3.0~5.0mS/cm。为了缩短填料的平衡时间,使填料的pH迅速达到预定值,本发明的方法还可在采用平衡缓冲液平衡之前采用高浓度、高电导的该种平衡缓冲液平衡阳离子交换填料。
步骤2)每毫升阳离子交换层析填料加载的抗体样品量为30~120mg,优选50~100mg。通常来说,每毫升阳离子交换层析填料加载的抗体样品量越高,填料的分辨率会越低,纯化效果越差,但对于本发明的方法来说,在较高的抗体负载量时,纯化效果更好。
步骤2)所述样品pH为5.0~5.5,电导率不大于5.0mS/cm。
步骤3)采用与步骤1)相同的平衡缓冲液对层析柱进行清洗,以除去与填料结合微弱的杂质。
步骤4)所述清洗缓冲液浓度为10~50mM,pH为7.5~8.3,电导率为1.0~7.0mS/cm。清洗缓冲液盐种类选自Tris(氨基丁三醇)、HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)、NaPi(磷酸盐)等,优选Tris缓冲液,缓冲液为Tris时,用盐酸或醋酸调pH为8.0,浓度为20mM,根据需要用NaCl调节电导率至上述范围。在此步骤可以将大量的酸性异构体除去。
步骤5)采用步骤1)的平衡缓冲液,平衡缓冲液与洗脱缓冲液缓冲体系相同,pH相同,但不含NaCl,即电导率不同,作用为将填料平衡至洗脱缓冲液pH,便于下一步抗体的洗脱。
步骤6)所述洗脱缓冲液的pH为5.0~5.5,电导率为16.0~22.0mS/cm。洗脱缓冲液的缓冲体系须与步骤1)的平衡缓冲液保持一致,当平衡缓冲液优选NaAc-HAc缓冲液时,洗脱缓冲液也为NaAc-HAc缓冲体系,优选用NaCl调节电导率,洗脱缓冲液中NaCl优选浓度为130~200mM。
本发明将经过初步亲和层析纯化以后的由CHO(中国仓鼠卵巢)细胞发酵的人源化抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗进行阳离子交换层析纯化。本发明采用经Protein A亲和层析纯化后抗体样品的主峰(HER2抗体)含量为53.4%,酸性峰(酸性异构体)含量为38.8%,碱性峰(碱性异构体)含量为7.7%的抗体,以POROS XS为填料做了一系列试验,考察清洗缓冲液的条件对酸性峰、碱性峰、主峰含量及抗体回收率的影响。
备注:CEX-HPLC为阳离子交换-高效液相色谱。
从以上结果可以看出当清洗缓冲液的pH低于7.5时(见试验1),对于酸性峰的去除没有效果;增加清洗缓冲液的体积可以提高酸性峰的去除效率,但回收率会降低(见试验3和4)。提高缓冲液的电导在一定范围内可以去除酸性峰,当电导超过一个阈值时(见试验5)虽然酸性峰去除效率高,但会降低回收率。
本发明提供了一种高效去除重组人源化抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗中酸性异构体的方法采用阳离子交换层析的纯化方法,步骤简单,仅涉及三种缓冲液,清洗步骤以及洗脱步骤皆为等梯度洗脱方式,无需变换梯度,操作便捷,利于自动化操作及放大生产,酸性异构体去除率高,同时能保持较高的抗体回收率,且本发明在填料负载较多重组人源化抗HER2单克隆抗体及其酸性异构体的混合物的情况下,能够实现上述技术效果,提高填料的利用率,降低生产成本,因此更适合工业化生产。
下面结合具体实施方式的实施例和说明书附图对本发明做进一步说明。
说明书附图
附图1实施例1纯化抗HER2抗体层析图
附图2实施例1亲和层析后与阳离子交换层析纯化后CEX-HPLC图谱比较
具体实施方式
实施例1:抗HER2抗体的纯化
本实施例描述本发明方法用于重组人源化抗HER2单克隆抗体的阳离子交换层析工艺。本实施例所述重组人源化抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗由CHO细胞生产。CHO细胞发酵产生的重组人源化抗HER2单克隆抗体中主峰含量为53.4%,酸性峰含量为38.8%,碱性峰含量为7.7%。蛋白生产和分泌到培养基以后用深层过滤的方式去除细胞及其碎片,然后通过装填有MabSelect填料的亲和层析柱进行捕获。
亲和层析以后将收获的蛋白A洗脱液样品用1M Tris-HCl(pH9.0)将pH调为5.5,加载到POROS XS填料上进行进一步纯化。工艺具体方式如下:用预平衡缓冲液(500mM NaAc,pH5.5)后用平衡缓冲液(50mM NaAc,pH5.5)将POROS XS柱洗涤好,将pH为5.5±0.1,电导率低于5.0mS/cm的亲和层析样品加载于柱子上,保留时间为6min。加样量为每毫升POROS XS填料负载50mg重组人源化抗HER2单克隆抗体。按照以下条件进行三步清洗:(1)3个体积的平衡缓冲液(50mM NaAc,pH5.5)。(2)5个体积的清洗缓冲液(20mM Tris-HCl,17mM NaCl,pH8.0)。(3)4个体积的平衡缓冲液(50mM NaAc,pH5.5)。然后用洗脱缓冲液(50mM NaAc,130mM NaCl,pH5.5),当峰升至UV280为500mAU开始收集,峰降至UV280为500mAU时停止收集,合并收集的洗脱液。然后用2个体积再生缓冲液(50mM NaAc,1.0M NaCl,pH5.5)再生柱子。附图1中为本发明方法工艺纯化层析图。
计算回收率:用BioPhotometer plus测定收集各组分的蛋白浓度,计算回收率。
回收率(%)=洗脱组分收集体积(mL)×UV280/(上样总量(mg)×1.484)×100
抗HER2抗体的消光系数为1.484。
测定抗HER2组分中异构体含量:通过CEX-HPLC的方法测定组分中抗体异构体的含量。在30℃条件下以1mL/min速度洗脱层析柱,柱子为戴安(Dionex)BioLC ProPac WCX-10(4×250mm),样品为100μg抗体(浓度为1mg/mL)。用平衡好的层析柱,按以下梯度进行测定(表1)。
表1:流动相梯度
流动相B为10mM磷酸盐缓冲液,pH7.40±0.01,流动相C为10mM磷酸盐-500mM NaCl溶液,pH7.40±0.01。采用峰面积归一化法对结果进行定量分析。积分区间内,保留时间早于主峰的峰为酸性峰,保留时间晚于主峰的峰为碱性峰。计算主峰峰面积占总峰面积的百分比。
表2显示了经过本发明工艺方法纯化后获得样品的异构体含量、抗体纯度以及回收率。
表2:阳离子交换层析纯化结果
备注:SEC-HPLC为分子排阻-高效液相色谱。
在亲和层析得到的洗脱物中酸性异构体的含量大约在36%,通过在阳离子交换层析洗脱步骤前添加三步清洗步骤后,主峰1发生明显富集,而酸性异构体中峰2含量明显降低(见附图2)。与亲和层析洗脱物相比能将抗HER2抗体混合物中的酸性异构体含量比例降低14%左右,使得到的洗脱物中HER2抗体活性形式大于65%,抗体回收率达到77.3%。
实施例2抗HER2抗体的纯化
本实施例描述本发明方法用于重组人源化抗HER2单克隆抗体的阳离子交换层析工艺。本实施例所述重组人源化抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗由CHO细胞生产。CHO细胞发酵产生的重组人源化抗HER2单克隆抗体中主峰含量为53.6%,酸性峰含量为37.8%,碱性峰含量为8.6%。蛋白生产和分泌到培养基以后用深层过滤的方式去除细胞及其碎片,然后通过装填有MabSelect填料的亲和层析柱进行捕获。
亲和层析以后将收获的蛋白A洗脱液样品用1M Tris-HCl,pH9.0将pH调为5.5,加载到Capto S ImpAct填料上进行进一步纯化。工艺具体方式如下:用预平衡缓冲液(500mMNaAc,pH5.5)后用平衡缓冲液(50mM NaAc,pH5.5)将Capto S ImpAct柱洗涤好,将pH为5.5±0.1,电导率低于5.0mS/cm的亲和层析样品加载于柱子上,保留时间为4min。加样量为每毫升Capto S ImpAct填料负载100mg重组人源化抗HER2单克隆抗体。按照以下条件进行三步清洗:(1)3个体积的平衡缓冲液(50mM NaAc,pH5.5)。(2)3个体积的清洗缓冲液(50mMTris-HCl,pH8.3)。(3)4个体积的平衡缓冲液(50mM NaAc,pH5.5)。然后用洗脱缓冲液(50mMNaAc,130mM NaCl,pH5.5),当峰升至UV280为500mAU开始收集,峰降至UV280为500mAU时停止收集,将峰合并。然后用2个体积再生缓冲液(50mM NaAc,1.0M NaCl,pH5.5)再生柱子。
计算回收率:用BioPhotometer plus测定收集各组分的蛋白浓度,计算回收率。
回收率(%)=洗脱组分收集体积(mL)×UV280/(上样总量(mg)×1.484)×100
抗HER2抗体的消光系数为1.484。
测定抗HER2组分中异构体含量:通过实施例1种描述的CEX-HPLC方法测定组分中抗体异构体的含量。下表3显示了经过上述工艺纯化后获得样品的异构体含量、抗体纯度以及回收率。
表3:阳离子交换层析的纯化结果
从表3中可以看出,在Capto S ImpAct填料上清洗缓冲液为50mM Tris-HCl,pH8.3时,清洗3个柱体积,可以将酸性峰降低14%,主峰含量达到65%以上,抗体回收率也达到65%。
实施例3抗HER2抗体的纯化
本实施例描述本发明方法用于重组人源化抗HER2单克隆抗体的阳离子交换层析工艺。本实施例所述重组人源化抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗由CHO细胞生产。CHO细胞发酵产生的重组人源化抗HER2单克隆抗体中主峰含量为53.6%,酸性峰含量为37.8%,碱性峰含量为8.6%。蛋白生产和分泌到培养基以后用深层过滤的方式去除细胞及其碎片,然后通过装填有MabSelect填料的亲和层析柱进行捕获。
亲和层析以后将收获的蛋白A洗脱液样品用1M Tris-HCl,pH9.0将pH调为5.5,加载到Capto S ImpAct填料上进行进一步纯化。工艺具体方式如下:用预平衡缓冲液(500mMNaAc,pH5.5)后用平衡缓冲液(50mM NaAc,pH5.5)将Capto S ImpAct柱洗涤好,将pH为5.5±0.1,电导率低于5.0mS/cm的亲和层析样品加载于柱子上,保留时间为4min。加样量为每毫升Capto S ImpAct填料负载100mg重组人源化抗HER2单克隆抗体。按照以下条件进行三步清洗:(1)3个体积的平衡缓冲液(50mM NaAc,pH5.5)。(2)8个体积的清洗缓冲液(25mMHEPES,10mM NaCl,pH7.8)。(3)5个体积的平衡缓冲液(50mM NaAc,pH5.5)。然后用洗脱缓冲液(50mM NaAc,130mM NaCl,pH5.5),当峰升至UV280为500mAU开始收集,峰降至UV280为500mAU时停止收集,将峰合并。然后用2个体积再生缓冲液(50mM NaAc,1.0M NaCl,pH5.5)再生柱子。
计算回收率:用BioPhotometer plus测定收集各组分的蛋白浓度,计算回收率。
回收率(%)=洗脱组分收集体积(mL)×UV280/(上样总量(mg)×1.484)×100
抗HER2抗体的消光系数为1.484。
测定抗HER2组分中异构体含量:通过实施例1种描述的CEX-HPLC方法测定组分中抗体异构体的含量。下表4显示了经过上述工艺纯化后获得样品的异构体含量、抗体纯度以及回收率。
表4:阳离子交换层析的纯化结果
从表4中可以看出,在Capto S ImpAct填料上清洗缓冲液为25mM HEPES,10mMNaCl,pH7.8时,清洗8个柱体积,可以将酸性峰含量降低11%,主峰含量达到65%以上,同时回收率达到70%。
实施例4抗HER2抗体的纯化
本实施例描述本发明方法用于重组人源化抗HER2单克隆抗体的阳离子交换层析工艺。本实施例所述重组人源化抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗由CHO细胞生产。CHO细胞发酵产生的重组人源化抗HER2单克隆抗体中主峰含量为53.6%,酸性峰含量为37.8%,碱性峰含量为8.6%。蛋白生产和分泌到培养基以后用深层过滤的方式去除细胞及其碎片,然后通过装填有MabSelect填料的亲和层析柱进行捕获。
亲和层析以后将收获的蛋白A洗脱液样品用1M Tris-HCl,pH9.0将pH调为5.5,加载到Capto S ImpAct填料上进行进一步纯化。工艺具体方式如下:用预平衡缓冲液(500mMNaAc,pH5.5)后用平衡缓冲液(50mM NaAc,pH5.5)将Capto S ImpAct柱洗涤好,将pH为5.5±0.1,电导率低于5.0mS/cm的亲和层析样品加载于柱子上,保留时间为4min。加样量为每毫升Capto S ImpAct填料负载100mg重组人源化抗HER2单克隆抗体。按照以下条件进行三步清洗:(1)3个体积的平衡缓冲液(50mM NaAc,pH5.5)。(2)5个体积的清洗缓冲液(20mMNaPi,50mM NaCl,pH7.2)。(3)4个体积的平衡缓冲液(50mM NaAc,pH5.5)。然后用洗脱缓冲液(50mM NaAc,130mM NaCl,pH5.5),当峰升至UV280为500mAU开始收集,峰降至UV280为500mAU时停止收集,将峰合并。然后用2个体积再生缓冲液(50mM NaAc,1.0M NaCl,pH5.5)再生柱子。
计算回收率:用BioPhotometer plus测定收集各组分的蛋白浓度,计算回收率。
回收率(%)=洗脱组分收集体积(mL)×UV280/(上样总量(mg)×1.484)×100
抗HER2抗体的消光系数为1.484。
测定抗HER2组分中异构体含量:通过实施例1种描述的CEX-HPLC方法测定组分中抗体异构体的含量。下表5显示了经过上述工艺纯化后获得样品的异构体含量、抗体纯度以及回收率。
表5:阳离子交换层析的纯化结果
从表5中可以看出,在Capto S ImpAct填料上清洗缓冲液为20mM NaPi,50mMNaCl,pH7.2时,清洗5个柱体积,可以将酸性峰含量降低12%,主峰含量达到65%以上,同时回收率达到60%以上。
实施例5本发明方法与现有技术方法纯化效果的对比
在中国专利99805836.X(方法一)和201080032734.8(方法二)中提及利用改变缓冲液电导率/或pH的方法去除HER2抗体的酸性异构体,本实施例利用公司自产的曲妥珠单抗,进行本发明方法与上述专利公开方法的纯化效果比较。在进行阳离子交换层析之前样品经过Protein A亲和层析纯化。下表6提供了本发明方法与上述两个专利方法阳离子交换层析条件的比较。
表6:本发明工艺方法与现有技术方法阳离子交换层析工艺条件
备注:CV=柱体积;RT=保留时间。
上表各方法的条件可知,从工艺操作上来说,本发明工艺方法操作更为便捷。方法一在清洗酸性异构体步骤的终点为紫外检测峰顶因而需要人工进行监控,不利于自动化生产放大。方法二需要利用多步线性电导梯度进行清洗,操作复杂,对仪器精密要求高。
下表7显示了经过Protein A亲和层析和阳离子交换层析以后获得洗脱样品中HER2抗体的纯度、回收率。
表7:经过纯化后HER2抗体纯度和回收率
从表7中可以看出,与上述两个专利公开的方法相比,本发明工艺方法能得到更高主峰含量的抗体,酸性峰含量比例降低的更多;与方法二相比,本发明工艺方法能得到同等质量的主峰含量抗体,酸性峰的去除效率等同,但实施例1本发明工艺方法的回收率显著更高(约为3倍)。
实施例6不同含量酸性异构体抗HER2抗体混合物的纯化
本实施例利用本实施例1方法在层析柱为3L、纯化量为160~200g/批阳离子交换层析上的纯化三批不同纯度的公司自产的曲妥珠单抗样品,纯化结果见表8。结果表明,本发明方法有卓越的去除酸性峰效力和工艺稳健性。虽然不同批次发酵液中经过ProteinA亲和层析洗脱物中主峰含量有差异,本发明方法都可以将酸性峰含量降低至25%以下,主峰含量达到65%以上,并保持较高的回收率。在亲和层析洗脱物的酸性峰含量相对高时,回收率相应也较低,这是由于酸性峰等杂质的去除造成的。
表8:三批阳离子交换层析纯化效果
Claims (11)
1.一种去除重组人源化抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗中酸性异构体的方法,其特征在于包含如下步骤:
步骤1):用平衡缓冲液将阳离子交换层析填料平衡,所述阳离子交换填料选自POROSHS、POROS XS、SP-SEPHAROSE FAST FLOW、Capto S ImpAct、Nuvia HRS、Nuvia S。
步骤2):将包含抗体及其酸性异构体的样品加载到阳离子交换层析填料上,保留时间为3~6min。
步骤3):用步骤1)所述平衡缓冲液清洗所述阳离子交换填料,清洗3~5个柱体积。
步骤4):用清洗缓冲液清洗所述阳离子交换填料,清洗3~8个柱体积。
步骤5):用步骤1)所述平衡缓冲液清洗所述阳离子交换层析填料,清洗4~5个柱体积。
步骤6):用洗脱缓冲液从所述阳离子交换填料上洗脱抗体,自UV280为500mAU开始收集,收集UV280上升及再次降至500mAU时的抗体。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)所述阳离子交换填料选自POROSXS。
3.据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)平衡缓冲液pH与抗体样品的pH一致,电导率为3.0~5.0mS/cm。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)所述平衡缓冲液为NaAc-HAc缓冲液。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)每毫升阳离子交换层析填料加载的抗体样品量为30~120mg。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤2)每毫升阳离子交换层析填料加载的抗体样品量为50~100mg。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)所述样品pH为5.0~5.5。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤4)所述清洗缓冲液浓度为10~50mM,pH为7.5~8.3,电导率为1.0~7.0mS/cm。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤4)所述清洗缓冲液种类选自Tris、HEPES、MOPS、NaPi。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤4)所述清洗缓冲液为Tris缓冲液,调pH为8.0,浓度为20mM。
11.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤6)所述洗脱缓冲液与平衡缓冲液缓冲体系一致,pH为5.0~5.5,电导率为16.0~22.0mS/cm。
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