CN109320611A - 一种人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法，包括将含有人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药上样至强阳离子层析柱进行纯化，其中所述纯化在上样后包括平衡、淋洗、再平衡和洗脱等步骤。本发明洗脱操作步骤简单，对层析仪器分辨率和精确度的要求较低，节省了纯化时间，在保证纯度、提高回收率的同时，也节约了生产成本。

Description

一种人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法
技术领域
本发明涉及制药领域，具体涉及一种人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法。
背景技术
抗体(antibody)是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白，它是能与相应抗原特异的结合、产生各种免疫效应(生理效应)的球蛋白。单克隆抗体(monoclonal antibody，简称单抗)是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。单克隆抗体药物，即单一的抗原刺激作用于单一B淋巴细胞可以分泌出单一的抗体。单克隆抗体药物是生物医药领域中最耀眼的明珠。该类药物具有靶向性强、特异性高和毒副作用低等特点，代表了药品治疗领域的最新发展方向，并且在抗肿瘤和自身免疫系统缺陷治疗领域得到了有力的推广。单抗药物的大规模生产对技术和工艺的要求极高。体外细胞培养技术和蛋白纯化技术是单抗药物生产工艺的难点和技术壁垒。
目前抗CD20单克隆抗体是治疗B淋巴瘤的最有效的靶向性生物治疗药物，在治疗NHL中有极其重要的地位。其常见的纯化方法有阳离子层析、阴离子层析、蛋白A层析等。生物类似药对纯化工艺在酸、碱和主峰之间比例上要求较高。需要通过层析技术将酸、碱峰比例控制在原研药的批次间变化范围内，从而满足法规中对相似度的要求。按照各国法规对生物类似药开发的要求，生物类似药的电荷异构体要与原研药保持一致，也就是生物类似药的酸，碱和主峰的比例要控制在原研药的批次变化范围内。为了达到此要求，一方面可以通过上游细胞培养技术对产品的电荷异构体进行调节，但另一方面纯化技术也在生物类似药的电荷异构体调控上起关键作用。目前主要的手段是使用阳离子交换层析技术来对电荷异构体进行调节。
然而因为电荷异构体本身的性能差别不大，通过纯化手段来调节电荷异构体有相当难度。在现有的技术上，通过阳离子层析来调节电荷异构体通常需要对层析的产品进行分段收集，然后进行电荷异构体的检查，然后来进行混合得到所需要的产品。该模式具有工艺复杂，耗时长，回收率低等特点。如果在现有的层析方法上直接收集产品，则损失的产品更多，回收率更低。
单克隆抗体生物类似药例如抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体类似药的要求较高，根据原研药的电荷异构体数据，将标准设定为酸峰比例应小于20％、主峰大于65％且碱峰应小于10％，较为符合单克隆抗体类似药的应用要求。鉴于在阳离子层析步骤中纯化方法工艺复杂，耗费时间多，回收率比较低。因此，非常有必要开发一种操作简单，节约时间，回收率较高的阳离子层析方法。
发明内容
本发明所要解决的问题是克服人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药现有纯化工艺复杂、耗时较长和回收率较低等技术缺陷。针对上述技术缺陷，本发明提供了人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法，既简化了工艺流程，节省了时间和缓冲液的用量，又提高了目标产物回收率。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：一种人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法，包括将含有人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药上样至强阳离子层析柱进行纯化，其中所述纯化在上样后还包括以下步骤：
(1)平衡步骤，在所述层析柱中加入2-5个柱体积的平衡缓冲液，所述平衡缓冲液含55～65mM的钠盐溶液；
(2)淋洗步骤，在所述层析柱中加入2-6个柱体积的淋洗缓冲液，所述淋洗缓冲液含110～120mM的钠盐溶液；
(3)再平衡步骤，在所述层析柱中加入0.5-2个柱体积的平衡缓冲液；和
(4)洗脱步骤，在所述层析柱中加入5-8个柱体积的洗脱缓冲液，所述洗脱缓冲液含135～150mM的钠盐溶液；
其中，所述平衡缓冲液、淋洗缓冲液和洗脱缓冲液的pH值为5.4-5.6。
在所述上样前，一般按照本领域常规操作。优选地，在所述上样前还可有(0)预平衡步骤，即加入3-5个柱体积的预平衡缓冲液。
更优选地，所述(1)平衡步骤中，在所述层析柱中加入3-4个柱体积的平衡缓冲液；所述(2)淋洗步骤中，在所述层析柱中加入3-5个柱体积的淋洗缓冲液；所述(3)再平衡步骤中，在所述层析柱中加入0.9～1.5个柱体积的平衡缓冲液；和所述(4)洗脱步骤中，在所述层析柱中加入6-7个柱体积的洗脱缓冲液。
进一步更优选地，所述(0)中加入4个柱体积的预平衡缓冲液。
在本发明中，术语“抗CD20单克隆抗体”指特异性结合于细胞表面，尤其是B细胞表面CD20抗原的单克隆抗体。CD20是一种分子量为33～37kD的磷酸化蛋白质分子，是B淋巴细胞非糖基化四重跨膜磷蛋白，位于B淋巴细胞表面，即B淋巴细胞表面分化抗原，而在其他组织以及多能B淋巴干细胞均不表达。术语“人鼠嵌合抗体”，即抗体的可变区来自大/小鼠MAb，而恒定区则来自人的抗体；这样的抗体既保持了原来MAb的特异性和亲和力，又大大减少了在人体内的免疫原性。
一般地，本发明所述的人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药为抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体。优选地，所述抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体为利妥昔单抗。更优选为利妥昔单抗病毒灭活液。最优选为利妥昔单抗病毒灭活过滤液，其质量参数如下表1所示。
表1人鼠嵌合单克隆抗体阳离子交换层析上样液的质量参数
本发明的纯化过程使用阳离子交换层析技术，所述阳离子交换层析的介质选自但不限于Eshmuno CPX(Millipore)、POROS HS(AB)、POROS XS(AB)、Toyopearl Gigacap S-650M(TOSOH)、Toyopearl SP-650M(TOSOH)、Nuvia HR-S(Bio-Rad)和SP Sepharose(GE)。
优选地，所述强阳离子型层析柱的填料为POROS 50HS。
纯化过程使用的缓冲液包含但不限于2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(MES)、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸缓冲液或磷酸盐缓冲液。本发明采用的缓冲液为一组含有不同含量NaCl的MES缓冲体系。优选地，所述平衡缓冲液、淋洗缓冲液和洗脱缓冲液中，所述MES的浓度为50mM，所述平衡缓冲液中NaCl溶液的浓度为60mM，pH为5.5，所述洗脱缓冲液中NaCl的浓度为143mM，pH为5.5。所述预平衡缓冲液中，所述MES浓度为250mM，NaCl的浓度为60mM，pH为5.5。
更优选地，所述淋洗缓冲液的NaCl的浓度为115mM，pH为5.5。
或更优选地，所述步骤(2)中，淋洗采用包含A相、B相两种缓冲液的渐进式梯度淋洗法，所述A相为60mM NaCl的平衡缓冲液，所述B相为115mM NaCl的淋洗缓冲液；所述A相的体积百分比由淋洗起始100％梯降至淋洗结束0％，所述B相的体积百分比由淋洗起始0％梯升至淋洗结束100％。
本发明的一个实施方案的纯化过程中，在上样前，预平衡使用≥3个柱体积平衡液(250mM MES,60mM NaCl,pH5.5buffer)；上样后，平衡使用≥2个柱体积上述平衡液；淋洗使用A相平衡缓冲液(50mM MES,60mM NaCl,pH5.5buffer)和B相淋洗缓冲液(50mM MES,115mMNaCl,pH5.5buffer)，A相的体积百分比由淋洗起始100％梯降至淋洗结束0％，B相的体积百分比由淋洗起始0％梯升至淋洗结束100％，共淋洗5个柱体积；再平衡使用0.9个柱体积的上述平衡缓冲液；最后使用洗脱缓冲液(50mM MES,143mM NaCl,pH5.5buffer)，共洗脱≤8个柱体积。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1.在结合/洗脱模式中，当用洗涤缓冲液或者洗脱缓冲液选择性收集时，带有较少正电荷的酸性异构体在主峰前被洗脱下来；带有较多正电荷的碱性异构体在酸性异构体和主峰之后被洗脱下来，在保证纯度的基础上提高了回收率：利用现有技术的回收率约为40-45％，本发明的回收率可提高到约50-55％，甚至接近60％。
2.本发明的缓冲体系具有较好的缓冲能力，具有良好地水溶性，随温度改变具有最小的pKa值的变化，以及最小的盐效应。在阴离子交换层析步骤只需少量的水就可以调节电导率。
3.本发明洗脱操作步骤简单，对层析仪器分辨率和精确度的要求较低，确保每批生产的稳健性；本发明节省了纯化时间，在保证纯度、提高回收率的同时，也节约了生产成本。
附图说明
图1为现有技术实验室规模下，当载量为25g/L时的阳离子交换层析紫外吸收图谱；
图2为现有技术实验室规模下，当载量为29g/L时的阳离子交换层析紫外吸收图谱；
图3为现有技术实验室规模下，当载量为33g/L时的阳离子交换层析紫外吸收图谱；
图4为本发明在实验室规模下，当载量为25g/L时的阳离子交换层析紫外吸收图谱；
图5为本发明在实验室规模下，当载量为29g/L时的阳离子交换层析紫外吸收图谱；
图6为本发明在实验室规模下，当载量为33g/L时的阳离子交换层析紫外吸收图谱；
图7为现有技术中试规模下，当载量为25g/L时的阳离子交换层析紫外吸收图谱；
图8为现有技术中试规模下，当载量为33g/L时的阳离子交换层析紫外吸收图谱；
图9为本发明在中试规模下，当载量为25g/L时的阳离子交换层析紫外吸收图谱；
图10为本发明在中试规模下，当载量为33g/L时的阳离子交换层析紫外吸收图谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
原料制备：人鼠嵌合单克隆抗体的制备
实施例中采用的人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药例如利妥昔单抗病毒灭活过滤液来自于喜康(武汉)生物医药公司，利妥昔单抗分子的结构披露于5,736,137,Andersonetal。
A.细胞培养生产：上游的细胞培养生产为本领域常规技术，将能表达所述单克隆抗体的CHO细胞复苏后，接种在含有50mL新鲜选择性培养基(化学限定培养基)的250mL摇瓶中，细胞密度为0.25-0.6×106cell/mL，将250mL摇瓶放入培养箱中开始原代培养，当细胞密度大于2.30×106cells/mL且活率大于90％时进行传代，传代初始细胞密度范围是0.4-0.6×106cells/mL，种子体积逐步扩大至50升反应器中，然后接种200L反应器开始生产培养。在200升反应器中培养13天后，收获细胞培养液。经过深层和除菌过滤后得到澄清细胞培养液，进入下游纯化阶段。
B.抗体的初步纯化：首先使用蛋白A亲和层析，接着经过低pH值病毒灭活后，通过阳离子与阴离子交换层析，再经过除病毒过滤后，即进行超滤透析以及最终过滤以获得本发明原液。以上所述步骤均为本领域常规手段，现简述如下：
蛋白A亲和层析使用蛋白A亲和性树酯为填料，此填料可以结合目标蛋白，而大部分宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA和其他一些杂质将流穿进入废液中。在病毒灭活步骤中，将未中和的亲和层析收集液pH值调至3.2-3.6，并且保持30-60分钟。随后，将pH值中和至5.3-5.7。收集液再立即依次经过5μm和0.2μm孔径滤器过滤。分析过滤后所收集的产物的pH、浓度、电导率、微生物负载、内毒素与利用弱阳离子色谱分析电荷异质体。
在阳离子交换层析步骤中，宿主细胞蛋白质、宿主细胞DNA、多聚体、蛋白片段、脱落的蛋白A配基将被阳离子交换填料去除，该层析步骤也可以有效的减少电荷变异体的数量。分析洗脱产物的pH、浓度、电导率、微生物负载、内毒素、宿主细胞蛋白及DNA、上游细胞培养添加的其他杂质的残留、并分析电荷异质体与单体纯度。在阴离子交换层析步骤，残留的蛋白A、宿主细胞蛋白质、宿主细胞DNA、将被阴离子交换填料去除。该层析步骤也可以除去潜在的病毒。分析收集产物的浓度、微生物负载与内毒素。阴离子交换层析收集液以常规的流动模式通过病毒滤器进行除病毒过滤。分析过滤后产物的浓度、微生物负载与内毒素。经过除病毒过滤后，将除病毒过滤产品通过10-30kD级切向流膜包来进行浓缩和透析。除病毒过滤后收集液首先通过超滤从而浓缩到大约15g/L，再进行约5-10个体积的缓冲液置换并进一步浓缩至50g/L。最后，将原液通过0.22μm滤器除菌，过滤到保存袋中。调配好的原料药将存储在-20℃条件下。
同样地，利用本领域常规技术获得的利妥昔单抗或其他抗CD20单克隆抗体的病毒灭活过滤液也可以用于本发明以下步骤的纯化中。
由表1可知，所述人鼠嵌合单克隆抗体通过亲和层析和深层过滤后，已经达到了较高的蛋白浓度和一定的纯度。
对比例1实验室规模下载量为25g/L的现有技术
上样量按载量计算为，纯化时加入浓度为3-8g/L的样品。POROS 50HS填料由Thermofisher提供(货号1-3359-08)。每个柱体积约25-30mL。具体操作步骤参见表2。
表2操作步骤
表3产品纯化前后的对比
层析图谱见图1，质量数据详见表3。由表3可知，洗脱样品的酸性异构体、碱性异构体都在质量范围内，即酸峰小于20％、主峰大于65％和碱峰小于10％，且数值较低，但回收率偏低，只有40％。纯化后，产品在酸碱电荷异构体组成上明显不同。经过阳离子层析后，酸峰和碱峰比例显著减少，主峰比例显著提高。
对比例2实验室规模下载量为29g/L的现有技术
本对比例除载量与对比例1不同外，层析方法、填料和操作步骤，以及使用的各种缓冲液柱体积与对比例1均相同。
表4产品纯化前后的对比
层析图谱见图2，质量数据详见表4。由表4可知，洗脱样品的酸性异构体、碱性异构体都在质量范围内，即酸峰小于20％、主峰大于65％和碱峰小于10％，且数值较低，但回收率偏低，只有43％。纯化后，产品在酸碱电荷异构体组成上明显不同。经过阳离子层析后，酸峰和碱峰比例显著减少，主峰比例显著提高。
对比例3中试规模下载量为25g/L的现有技术
本对比例除载量、规模与对比例1不同外，层析方法、填料和操作步骤，以及使用的各种缓冲液柱体积与对比例1均相同。中试规模柱体积约2.4升。
表5产品纯化前后的对比
层析图谱见图7，质量数据详见表5。由表5可知，洗脱样品的酸性异构体、碱性异构体都在质量范围内但回收率偏低，只有40％。纯化后，产品在酸碱电荷异构体组成上明显不同。经过阳离子层析后，酸峰和碱峰比例显著减少，主峰比例显著提高。
对比例4中试规模下载量为33g/L的现有技术
本对比例除载量与对比例1不同外，层析方法、填料和操作步骤，以及使用的各种缓冲液柱体积、中试规模的柱体积与对比例3均相同。
表6产品纯化前后的对比
层析图谱见图8，质量数据详见表6。由表6可知，洗脱样品的酸性异构体、碱性异构体都在质量范围内但回收率偏低，只有38％。纯化后，产品在酸碱电荷异构体组成上明显不同。经过阳离子层析后，酸峰和碱峰比例显著减少，主峰比例显著提高。
实施例1实验室规模下载量为25g/L的本发明技术
本发明技术采用的纯化方法其具体操作步骤参见表7，层析方法与填料同对比例1。
表7操作步骤
以上的步骤洗涤2中，A和B为渐进式梯度洗涤，通过调节两个泵的转速，使B溶液从最开始的0％经过5个柱体积，逐渐提高到100％；而A溶液从最开始的100％经过5个柱体积，逐渐降低到0％。
表8产品纯化前后的对比
层析图谱见图4，质量数据参见表8。由表8可知，洗脱样品酸性异构体，碱性异构体都在质量范围内，回收率为58％。与对比例1相比，在保证产品质量满足质量标准的基础上，回收率显著提高(P<0.05)。
实施例2实验室规模下载量为29g/L的本发明技术
本对比例除载量与实施例1不同、不含预平衡步骤外，层析方法、填料和操作步骤与实施例1均相同。
表9产品纯化前后的对比
层析图谱见图5，质量数据详见表9。由表9可知，洗脱样品的酸性异构体、碱性异构体都在质量范围内且回收率较对比例2的43％高。纯化后，产品在酸碱电荷异构体组成上明显不同。经过阳离子层析后，酸峰和碱峰比例显著减少，主峰比例显著提高。
实施例3实验室规模下载量为33g/L的本发明技术
本对比例除载量与实施例1不同外，层析方法、填料和操作步骤与实施例2均相同。
表10产品纯化前后的对比
层析图谱见图6，质量数据详见表10。由表10可知，洗脱样品的酸性异构体、碱性异构体都在质量范围内且回收率较对比例1的40％和对比例2的43％高。纯化后，产品在酸碱电荷异构体组成上明显不同。经过阳离子层析后，酸峰和碱峰比例显著减少，主峰比例显著提高。图3为现有技术实验室规模下，相同载量时的阳离子交换层析紫外吸收图谱，与图6对比可知，本发明技术下的淋洗峰明显高于现有技术的淋洗峰。
实施例4中试规模下载量为25g/L的本发明技术
本对比例除载量、规模与实施例1不同外，层析方法、填料和操作步骤与实施例1均相同。中试规模柱体积约2.4升。
表11产品纯化前后的对比
层析图谱见图9，质量数据详见表11。由表11可知，洗脱样品的酸性异构体、碱性异构体都在质量范围内且回收率较对比例3的40％和对比例4的38％高。纯化后，产品在酸碱电荷异构体组成上明显不同。经过阳离子层析后，酸峰和碱峰比例显著减少，主峰比例显著提高。
实施例5中试规模下载量为33g/L的本发明技术
本对比例除载量与实施例4不同、不含预平衡步骤外，层析方法、填料和操作步骤与实施例4均相同。
表12产品纯化前后的对比
层析图谱见图10，质量数据详见表12。由表12可知，洗脱样品的酸性异构体、碱性异构体都在质量范围内且回收率较对比例3的40％和对比例4的38％高。纯化后，产品在酸碱电荷异构体组成上明显不同。经过阳离子层析后，酸峰和碱峰比例显著减少，主峰比例显著提高。
总结：通过图谱对比可以发现，在实验室规模下，采用现有技术在较低载量的时无淋洗峰出现，在较高载量的时出现较大淋洗峰。而本发明在较低和较高载量的情况下，都存在较小的淋洗峰(如黑色箭头所示，出现相对稳定的淋洗峰有利于控制产物中的酸碱峰比例)。如上表所示，在不同的载量情况下，虽然现有技术和本发明得到的产物都符合质量标准，但本发明的回收率稳定在50％以上，显著高于现有技术约10-20个百分点。在中试规模下，采用现有技术在较低载量的时无淋洗峰出现，在较高载量的时出现较大淋洗峰。而本发明在较低和较高载量的情况下，都存在淋洗峰。如上表所示，在不同的载量情况下，虽然现有技术和本发明得到的产物都符合质量标准，但本发明的回收率稳定在48％以上，显著高于现有技术约10-15个百分点。

Claims (10)

1.一种人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法，包括将含有人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药上样至强阳离子层析柱进行纯化，其特征在于，所述纯化在上样后还包括以下步骤：
(1)平衡步骤，在所述层析柱中加入2-5个柱体积的平衡缓冲液，所述平衡缓冲液含55～65mM的钠盐溶液；
(2)淋洗步骤，在所述层析柱中加入2-6个柱体积的淋洗缓冲液，所述淋洗缓冲液含110～120mM的钠盐溶液；
(3)再平衡步骤，在所述层析柱中加入0.5-2个柱体积的平衡缓冲液；和
(4)洗脱步骤，在所述层析柱中加入5-8个柱体积的洗脱缓冲液，所述洗脱缓冲液含135～150mM的钠盐溶液；
其中，所述平衡缓冲液、淋洗缓冲液和洗脱缓冲液的pH值为5.4-5.6。
2.根据权利要求1所述的人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法，其特征在于，在所述上样前还有(0)预平衡步骤，在所述层析柱中加入3-5个柱体积的预平衡缓冲液，所述预平衡缓冲液含55～65mM的钠盐溶液，pH值为5.4-5.6。
3.根据权利要求2所述的人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法，其特征在于，所述(1)平衡步骤中，在所述层析柱中加入3-4个柱体积的平衡缓冲液；所述(2)淋洗步骤中，在所述层析柱中加入3-5个柱体积的淋洗缓冲液；所述(3)再平衡步骤中，在所述层析柱中加入0.9～1.5个柱体积的平衡缓冲液；和所述(4)洗脱步骤中，在所述层析柱中加入6-7个柱体积的洗脱缓冲液。
4.根据权利要求3所述的人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法，其特征在于，所述(0)预平衡步骤中，在所述层析柱中加入4个柱体积的预平衡缓冲液。
5.根据权利要求1所述的人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法，其特征在于，所述人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药为抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体；优选为利妥昔单抗；更优选为利妥昔单抗病毒灭活液；最优选为利妥昔单抗病毒灭活过滤液。
6.根据权利要求1所述的人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法，其特征在于，所述强阳离子型层析柱的填料为POROS 50HS。
7.根据权利要求1-6任一项所述的人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法，其特征在于，所述平衡缓冲液、淋洗缓冲液和洗脱缓冲液的缓冲体系中还包括MES；所述钠盐溶液为NaCl溶液。
8.根据权利要求7所述的人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法，其特征在于，所述平衡缓冲液、淋洗缓冲液和洗脱缓冲液中，所述MES的浓度为50mM，所述平衡缓冲液中NaCl的浓度为60mM，pH为5.5，所述洗脱缓冲液中NaCl的浓度为143mM，pH为5.5；和/或，所述预平衡缓冲液中，所述MES的浓度为250mM，所述NaCl的浓度为60mM，pH为5.5。
9.根据权利要求8所述的人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法，其特征在于，所述淋洗缓冲液的NaCl的浓度为115mM，pH为5.5。
10.根据权利要求8所述的人鼠嵌合单克隆抗体生物类似药的纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，淋洗采用包含A相、B相两种缓冲液的渐进式梯度淋洗法，所述A相为60mMNaCl的平衡缓冲液，所述B相为115mM NaCl的淋洗缓冲液；在所述淋洗过程中，所述A相的体积百分比由淋洗起始100％梯降至淋洗结束0％，所述B相的体积百分比由淋洗起始0％梯升至淋洗结束100％。
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