CN104710527B

CN104710527B - 一种生物制品的内毒素去除方法

Info

Publication number: CN104710527B
Application number: CN201510091560.7A
Authority: CN
Inventors: 罗天学; 罗培文; 荣艳珍
Original assignee: SUZHOU GENEMEN BIOTECH CO Ltd
Current assignee: Xinlitai (Suzhou) Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2015-02-28
Filing date: 2015-02-28
Publication date: 2018-08-24
Anticipated expiration: 2035-02-28
Also published as: CN104710527A

Abstract

本发明公开了一种生物制品的内毒素去除方法，包括如下步骤：(1)取待处理生物制品，阴离子交换层析；(2)羟基磷灰石层析，即可。本发明还提供了前述方法制备得到的生物制品。本发明方法可以有效去除内毒素，蛋白回收率高，不需要采用特定抗体吸附目标蛋白，处理方法简单，成本低廉，采用本发明方法处理后的生物制品的内毒素含量小于0.05EU/mg蛋白，安全性好，具有较好的应用前景。

Description

一种生物制品的内毒素去除方法

技术领域

本发明涉及一种生物制品的内毒素去除方法。

背景技术

内毒素是脂多糖(LPS)，来自革兰阴性菌的外膜，其结构包含3个区域，即类脂A区、核心多糖区和特异性多糖区，是热原的一种。极微量的内毒素进入动物或人体内都会引发强烈的炎症反应，导致轻微如发热，重则死亡的严重后果。

而生物制品中，内毒素的污染广泛存在，比如，单克隆抗体作为生物大分子药物，生产和纯化工艺复杂，有诸多环节可能将内毒素带入，因此需要去除内毒素，保证生物制品的安全性。各国药监部门对生物产品中的内毒素含量也均有严格规定。欧洲药典规定注射剂内毒素限度不得高于5EU/(kg·h)，EU为内毒素单位，每EU内毒素约相当于100pg。随着生物制品的大量使用，对生物制品中内毒素残留限的要求越高，但是因为内毒素分子结构复杂且不均一，导致内毒素可以多种方式与溶液中的蛋白质相互作用，形成复合物，大大增加了去除的难度。并且，在去除内毒素同时，还要尽可能减小活性成分的损失。

目前，常用的去除内毒素的方法有活性炭吸附、萃取、超滤、离子交换色谱等，但是去除效果均不佳。如，李彦英等。单克隆抗体纯化过程中内毒素去除方法分析，生物技术通讯，2013年1月24(1)中，采用离子交换色谱的方式处理单克隆抗体溶液，内毒素含量降低至5EU/ml后，便很难进一步降低；采用对内毒素有亲和作用的氨基酸作为层析介质时，最低也仅能降低至0.2～0.3EU/mg；公开号为103923211的专利申请中，制备人血浆来源人血清白蛋白单克隆抗体(pHSA)时，先采用rHSA填料亲和层析特异性吸附pHSA后，再采用离子交换的方式去除内毒素，得到的pHSA制品中内毒素含量仍然高达0.1EU/mg。

因此，采用吸附方法去除内毒素，不仅去除效果不佳，成本也很高，亟需改进。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的内毒素去除方法以及该方法制备得到的生物制品。

本发明生物制品的内毒素去除方法，包括如下步骤：

(1)取待处理生物制品，阴离子交换层析；

(2)羟基磷灰石层析，即可。

步骤(1)中，所述阴离子交换层析的步骤如下：

a、用平衡液平衡阴离子交换层析柱；

b、取待处理样品，调节pH以及电导率与平衡液一致；

c、上样，收集280nm紫外吸收峰处的流出液；

d、用平衡液冲洗，收集280nm紫外吸收峰处的流出液；

e、合并步骤c和步骤d的流出液，即可。

步骤a中，所述阴离子交换层析柱的填料为Q Sepharose High Performance填料、Q Sepharose Fast Flow填料、DEAE Sepharose Fast Flow填料或者Nuvia Q填料。

步骤a和步骤d中，所述平衡液是含有NaCl的磷酸缓冲液，其pH为6.1～7.9，电导率为8.3～24.1S/cm mS/cm，NaCl浓度为50～150mmol/L，磷酸盐浓度5～50mmol/L。

步骤(2)中，所述羟基磷灰石层析的步骤如下：

①用平衡液平衡羟基磷灰石层析柱；

②取待处理样品，调节pH以及电导率与平衡液一致；

③上样，用平衡液冲洗至流出液280nm紫外吸收回到基线；

④用洗脱液洗脱，收集280nm紫外吸收峰处的流出液，即可。

步骤①中，所述羟基磷灰石层析柱使用的填料是CHT Ceramic HydroxyapatiteType I填料或者CHT Ceramic hydroxyapatite type II填料。

步骤①和③中，所述平衡液是含有NaCl的磷酸缓冲液，其pH为6.5～8.0，电导率为8.4～17.8mS/cm，NaCl浓度为50～120mmol/L，磷酸盐浓度为10～40mmol/L。

步骤④中，所述洗脱液是含有NaCl的磷酸缓冲液，其pH 6.5～7.9，NaCl浓度为200～500mmol/L，磷酸盐浓度为5～40mmol/L。

本发明还提供了前述任意一项方法制备得到的生物制品。优选地，所述生物制品的内毒素含量低于0.05EU/mg。优选地，所述生物制品是单克隆抗体。

本发明方法可以有效去除内毒素，蛋白回收率高，不需要采用特定抗体吸附目标蛋白，处理方法简单，成本低廉，采用本发明方法处理后的生物制品的内毒素含量小于0.05EU/mg蛋白，安全性好，临床应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1本发明内毒素去除方法

1、试验材料

抗体蛋白样品的获得：

步骤1、一种可表达抗CD20单克隆抗体的CHO细胞的制备：

制备表达抗CD20单克隆抗体的CHO细胞：采用PCR技术和DNA重组技术将pSV2-dhfr载体(ATCC产品)中的dhfr(二氢叶酸还原酶)表达单元克隆到pCDNA3.1(+)载体(Invitrogen公司产品)中，构建可表达DHFR的哺乳动物细胞表达载体pBF01。

根据文献报道(US Patent,US6399061)，采用化学合成技术合成重组抗CD20单克隆抗体的轻链和重链基因片段；采用DNA重组技术将合成的基因片段分别克隆到pBF01载体中，分别构建可表达抗CD20单克隆抗体的轻链和重链多肽的重组表达载体pBF01-CD20L和pBF01-CD20H。

采用脂质体转染法，将构建的重组表达载体pBF01-CD20L和pBF01-CD20H共转染Invitrogen公司的CHO-DG44细胞，然后经G418抗性筛选阳性克隆，然后再通过ELISA法筛选高表达抗体的克隆，然后再用MTX(甲氨蝶呤)逐步加压、筛选、克隆，最终获得一株高表达抗CD20单克隆抗体的CHO细胞株CHO-CD20。

步骤2、细胞培养

采用批次流加培养，得到细胞培养液。

步骤3、细胞培养上清的分离

采用深层过滤的方法获得细胞培养上清：采用Millipore公司的D0HC和B1HC深层滤器按顺序过滤步骤2中的细胞培养液，收集滤过液。

步骤4、Protein A亲和层析

层析填料：采用GE公司的MabselectSuRe层析填料(一种耐碱的Protein A填料)。

层析流速：50～300cm/h。

填料清洗：用清洗液0.1mol/L NaOH+1.0mol/L NaCl清洗层析柱。

平衡：用平衡液20mmol/L PB(磷酸缓冲液)+50mmol/L NaCl、pH7.2平衡层析柱。

20mmol/L PB：是指缓冲液中，磷酸根的浓度为20mmol/L。

上样：步骤3收集的细胞培养上清调节pH7.2后上样；上完样后用平衡液冲洗层析柱直至流出液280nm紫外吸收回到基线。

中间冲洗：采用缓冲液20mmol/L PB、1mol/L NaCl、pH7.2冲洗层析柱，直至流出液280nm紫外吸收回到基线。然后用平衡液冲洗层析柱1.5CV(柱床体积)以上。

洗脱和收集：采用洗脱液20mmol/L柠檬酸+50mmol/L NaCl、pH3.5进行抗体蛋白洗脱，收集280nm紫外吸收峰；抗体蛋白收集后用TRIS调节pH至7.2。

2、本发明内毒素去除方法

(1)阴离子交换层析

层析填料：采用GE公司的Q Sepharose Fast Flow填料

填料清洗：用清洗液0.5mol/L NaOH+1.0mol/L NaCl清洗层析柱。

填料再生：用20mmol/L PB+0.5mol/L NaCl、pH7.2冲洗层析柱，至流出液pH为中性(pH6～9)

平衡：用平衡液20mmol/L PB+50mmol/L NaCl、pH7.2平衡层析柱。

上样：将经过预处理获得的抗CD20的抗体蛋白样品用酸或碱调节pH至7.2、用无热原注射用水或NaCl调节样品电导与平衡液一致后上样(平衡液的电导是8.9mS/cm)；上完样后用平衡液冲洗层析柱直至流出液280nm紫外吸收回到基线。

样品收集：上样和冲洗过程中收集流出液的280nm紫外吸收峰。

(2)羟基磷灰石层析

层析填料：采用Biorad公司的CHT Ceramic Hydroxyapatite Type I，40um。

填料清洗：用清洗液0.5mol/L NaOH清洗层析柱。

填料再生：用400mmol/L PB、pH7.2冲洗层析柱，至流出液pH为中性(pH6～9)

平衡：用平衡液10mmol/L PB+50mmol/L NaCl、pH7.4平衡层析柱。

上样：将经过阴离子交换层析获得的抗CD20的抗体蛋白样品用酸或碱调节pH至7.5、用无热原注射用水或NaCl调节样品电导(平衡液的电导是8.4mS/cm)与平衡液一致后上样；上完样后用平衡液冲洗层析柱直至流出液280nm紫外吸收回到基线。

洗脱和收集：采用洗脱液10mmol/L PB+300mmol/L NaCl、pH7.0进行抗体蛋白洗脱，收集流出液280nm紫外吸收峰。

3、检测分析

内毒素含量检测方法：鲎试剂法，按照《中华人民共和国药典》2010年版三部附录ⅫE“细菌内毒素检查法(凝胶限度试验)”进行。

4、实验结果

采用本发明方法处理前，样品中内毒素含量大于10-20EU/mg蛋白；采用本发明方法处理后，样品中内毒素含量小于0.05EU/mg蛋白。

实验结果说明，本发明方法可以有效去除样品中的内毒素，去除效果佳。

实施例2本发明内毒素去除方法

1、试验材料

同实施例1。

2、本发明内毒素去除方法

除了如下表1～表2中改变的参数外，其余条件同实施例1。

表1阴离子树脂类型和羟基磷灰石类型的改变

编号	阴离子树脂类型	羟基磷灰石类型
			1	Q Sepharose High Performance	CHT Ceramic hydroxyapatite type I,40um
2	DEAE Sepharose Fast Flow	CHT Ceramic hydroxyapatite type II,40um
			3	Nuvia Q	CHT Ceramic hydroxyapatite type I,80um

表2缓冲体系的改变

3、检测分析

同实施例1。

4、实验结果

表3检测结果

由表3可以看出，采用本发明方法处理前，样品中内毒素含量在0.1～50不等；但采用本发明方法处理后，样品中内毒素含量均小于0.05EU/mg蛋白，蛋白收率为76～80％，回收率高。

由实施例1和实施例2可以看出，本发明方法采用表1中的各种类型的阴离子树脂和羟基磷灰石均可有效去除内毒素；本发明方法中，阴离子交换层析的平衡液pH为6.1～7.9，NaCl浓度为50～150mmol/L，磷酸盐浓度5～50mmol/L，电导率8.3～24.1mS/cm时，均可有效去除内毒素；本发明方法中，羟基磷灰石层析的平衡液pH为6.5～8.0，NaCl浓度为50～120mmol/L，磷酸盐浓度为10～40mmol/L,电导率8.4～17.8mS/cm时，洗脱液的pH 6.5～7.9，NaCl浓度为200～500mmol/L，磷酸盐浓度为5～40mmol/L时，均可有效去除内毒素。

对比例1

1、试验材料

同实施例1。

2、内毒素去除方法

除了如下改变的参数外，其余条件同实施例1。

编号1：阴离子交换层析中，平衡液为“10mmol/L柠檬酸、pH5.0”；

编号2：阴离子交换层析中，平衡液为“10mmol/L柠檬酸、50mmol/L NaCl、pH为5.5”。

3、检测分析

同实施例1。

4、实验结果

编号1：处理后，样品中内毒素含量大于0.1EU/mg；

编号2：处理后，样品中含量为0.1-0.5EU/mg。

实验结果说明，只有采用在本发明特定的条件下，才可以有效去除内毒素，改变其中一个步骤，如，改变平衡液的组成则无法达效果。

综上，本发明方法可以有效去除内毒素，蛋白回收率高，不需要采用特定抗体吸附目标蛋白，处理方法简单，成本低廉，采用本发明方法处理后的生物制品的内毒素含量小于0.05EU/mg蛋白，安全性好，临床应用前景良好。

Claims

1.一种生物制品的内毒素去除方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）取待处理生物制品，阴离子交换层析；

（2）羟基磷灰石层析，即可，

其中，步骤（1）中，所述阴离子交换层析的步骤如下：

a、用平衡液平衡阴离子交换层析柱；

b、取待处理样品，调节pH以及电导率与平衡液一致；

c、上样，收集280nm紫外吸收峰处的流出液；

d、用平衡液冲洗，收集280nm紫外吸收峰处的流出液；

e、合并步骤c和步骤d的流出液，即可；

其中，步骤a和步骤d中，所述平衡液是含有NaCl的磷酸缓冲液，其pH为6.1~7.9，电导率为8.3～24.1mS/cm，NaCl浓度为50～150mmol/L，磷酸盐浓度5～50mmol/L；

步骤（2）中，所述羟基磷灰石层析的步骤如下：

①用平衡液平衡羟基磷灰石层析柱；

②取待处理样品，调节pH以及电导率与平衡液一致；

③上样，用平衡液冲洗至流出液280nm紫外吸收回到基线；

④用洗脱液洗脱，收集280nm紫外吸收峰处的流出液，即可。

步骤①和③中，所述平衡液是含有NaCl的磷酸缓冲液，其pH为 6.5～8.0，电导率为8.4~17.8mS/cm，NaCl浓度为50～120mmol/L，磷酸盐浓度为10～40mmol/L；

步骤④中，所述洗脱液是含有NaCl的磷酸缓冲液，其pH 6.5～7.9，NaCl浓度为200～500mmol/L，磷酸盐浓度为5～40mmol/L；

所述生物制品是单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）a中，所述阴离子交换层析柱的填料为Q Sepharose High Performance填料、Q Sepharose Fast Flow填料、DEAE SepharoseFast Flow填料或者 Nuvia Q填料。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）①中，所述羟基磷灰石层析柱使用的填料是CHT Ceramic Hydroxyapatite Type I填料或者CHT Ceramic Hydroxyapatitetype II填料。