CN104673760A - 一种原核细胞表达类病毒颗粒的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种大肠杆菌表达的类病毒颗粒的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括沉淀步骤、第一层析步骤、第二层析步骤、浓缩步骤和第三层析步骤，其中所述沉淀步骤包括硫酸铵沉淀步骤，所述第一层析步骤包括分子筛层析步骤，所述第二层析步骤包括羟基磷灰石色谱层析，所述浓缩步骤包括超滤浓缩步骤以及所述第三层析步骤包括及肝素亲和层析步骤。
Description
技术领域
本发明涉及一种原核细胞例如大肠杆菌表达的类病毒颗粒的纯化方法。具体的，本发明涉及一种大肠杆菌表达乙肝病毒表面抗原或核心抗原类病毒颗粒的纯化方法。
背景技术
类病毒颗粒或者病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs）是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒核酸，不能自主复制，在形态上与真正病毒粒子相同或相似，俗称伪病毒。
近年来发现多数病毒的衣壳蛋白基因在真核表达系统以及少数病毒的衣壳蛋白基因在原核表达系统中都能够有效地实现自我组装。这为病毒的基础研究及疫苗的开发提供了便利条件。由于VLPs没有感染性，作为免疫原，它可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应。因此，本领域中需要一种优化的大肠杆菌表达的类病毒颗粒的制备和纯化方法，尤其需要一种可用于大规模生产的低成本纯化方法。
乙肝病毒（HBV）属于嗜肝DNA病毒（Hepadnaviridae）科，是导致人类肝炎疾病的主要致病因素，每年约有450万人感染HBV，其中四分之一的人发展成肝病，每年约导致60多万人死亡（A.R.Zanetti,P.vanDamme,D.Shouval,The global impact of vaccinationagainst hepatitis B:a historical overview,Vaccine26(2008)6266–6273.）。HBV主要由外层外膜蛋白表面抗原（HBsAg），以及内层包裹病毒基因组DNA和病毒聚合酶的核心抗原（HBcAg）组成（M.Nassal,H.Schaller,Hepatitis B virusreplication,Trends Microbiol.1(1993)221–228）。在HBV感染的病人体内，最显著的特征之一是产生较高滴度的针对HBcAg的IgM或者IgG抗体（G.Hess,W.Arnold,The clinical relevance of the antibody to hepatitisB coreantigen(anti-HBc):a review,J.Virol.Methods2(1980)107–117.）。HBcAg可以自发组装成类病毒颗粒（VLP），并且在乙肝病人体内诱导T细胞依赖型以及T细胞非依赖型两种强烈的B细胞、T细胞以及细胞毒T细胞反应（D.R.Milich,A.McLachlan,The nucleocapsid of hepatitisB virus is both aT-cell-independent and a T-cell-dependent antigen,Science234(1986)1398–1401），因此可以应用于预防性或者治疗性乙肝疫苗和乙肝病人感染检测试剂盒的开发（P.Pumpens,R.Ulrich,K.Sasnauskas,A.Kazaks,V.Ose,E.Grens,Constructionof novel vaccineson the basis of the virus-like particles.Hepatitis B virusproteins as vaccinecarriers,in:Y.Khudyakov(Ed.),Medicinal ProteinEngineering,CRCPress,2008,pp.205–248.）。
HBcAg可以自发形成类病毒颗粒，也是目前研究较多的VLP载体，其可作为外源蛋白表位的蛋白载体，同时携带多拷贝插入的表位，引起针对外源表位的强烈体液免疫以及细胞免疫效应（P.Pumpens,E.Grens,Determination of the fold of the core proteinof hepatitis B virus byelectron cryomicroscopy,FEBS Lett.442(1)(1999)1–6.），低温冷冻电镜以及X-ray衍射表明HBcAg通过二聚体组装成T=3或者T=4的颗粒，分别包含180或者240个拷贝的单体，直径为28nm。由单体组装成二聚体，然后将由2个α螺旋组成的具有免疫优势的表位刺突展示在VLP的表面（B.S.A.Wynne,R.A.Crowther,Determination of thefoldof the core protein of hepatitis B virus by electroncryomicroscopy,Nature386(6)(1997)88–91.）。
HBcAg全长183个氨基酸，其中150-183位氨基酸富集碱性精氨酸，不参与VLP的组装，具有结合核酸的作用（M.Nassel,The arginine-richdomain of the hepatitis B virus core protein is required forpregenomeencapsidation and productive viralpositive-strand DNAsynthesis but not for virus assembly,J.Virol.66(7)(1992)107–4116.）。有研究表明在大肠杆菌中表达HBcAg，C端150-183位氨基酸可以非特异性结合宿主RNA，从而有助于HBcAg作为佐剂时的免疫原性（P.Riedl,D.Stober,C.Oehninger,K.Melber,J.Reimann,R.Schirmbeck,PrimingTh1immunity to viral core particles is facilitatedy trace amounts of RNAbound to its arginine-rich domain,J.Immunol.168(2002)4951–4959.）。也有研究认为，HBcAg可以刺激TLR2通路的免疫细胞因子的分泌，而这种效应可能由于其内部包裹的核酸导致（P.Vanlandschoot,F.VanHoutte,P.Ulrichts,J.Tavernier,G.Leroux-Roels,Immunostimulatorypotential of hepatitis B nucleocapsidpreparations:lipopolysaccharidecontamination should not beoverlooked,J.Gen.Virol.86(Pt2)(2005)323–331）。
HBcAg在乙肝诊断试剂开发与预防性或治疗性乙肝疫苗的研究中的作用越来越被重视，从上世纪70年代末期开始，全长或者截短的HBcAg已经在大肠杆菌、酵母、昆虫系统中得到过表达（Nature282,575-579(06December1979);doi:10.1038/282575a0，Hepatitis B virus genes and theirexpression in E.coliMARK PASEK；Nature296,677-678(15April1982)Electron microscopy of hepatitis B core antigen synthesized in E.coliB..COHEN&J.E.RICHMOND R.E.Lanford,L.Notvall,Virology176(1990)222.），但由于其制备工艺原因，得到的HBcAg在纯度和残余物质等方面很难达到药典的质量标准要求，因此，有必要开发出一种成本低廉、适合大规模放大生产且能够达到药典规定标准的制备及纯化工艺。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种原核细胞例如大肠杆菌表达的类病毒颗粒的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括沉淀步骤、第一层析步骤、第二层析步骤、浓缩步骤和第三层析步骤，其中所述沉淀步骤包括硫酸铵沉淀步骤，所述第一层析步骤包括分子筛层析步骤，所述第二层析步骤包括羟基磷灰石层析，所述浓缩步骤包括超滤浓缩步骤以及所述第三层析步骤包括肝素亲和层析步骤。
在本发明的一些实施方案中，所述沉淀步骤在所述第一层析步骤、所述第二层析步骤、所述浓缩步骤和所述第三层析步骤之前进行。
在本发明的一些特定实施方案中，所述沉淀步骤、所述第一层析步骤、所述第二层析步骤、所述浓缩步骤和所述第三层析步骤依次进行。
在本发明的一些特定实施方案中，所述硫酸铵沉淀步骤使用终浓度为20%的硫酸铵溶液在室温下进行，优选地所述硫酸铵沉淀步骤如下所述进行：取破碎菌体上清液，加入终浓度为20%的硫酸铵溶液，室温搅拌，放置10-30min，15000g离心10-20min，收集沉淀，以1/5-1/8上清体积的PBS溶液复溶目的蛋白。
在本发明的一些特定实施方案中，所述分子筛层析使用基于琼脂糖例如Sepharose系列或基于甲基丙烯酸酯系列的介质（例如Sepharose6FF）进行，优选地所述分子筛层析如下所述进行：填料为Sepharose系列或甲基丙烯酸酯系列的介质，流动相为20-50mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系，pH值6.0-8.0，其中加入0.01-1%TritonX-100。
在本发明的一些特定实施方案中，所述羟基磷灰石层析使用I型或Ⅱ型羟基磷灰石进行，优选地所述羟基磷灰石层析如下所述进行：填料为I型或Ⅱ型（例如羟基磷灰石CHT-type I型介质），层析流动相为10-20mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系，pH值6.0-8.0，其中加入0.01-1%TritonX-100和0.5-2M NaCl。
在本发明的一些特定实施方案中，所述超滤浓缩使用截留分子量为500-2000kDa（优选800-1500kDa，例如1000kDa）的滤膜例如膜包进行，优选地所述超滤浓缩如下所述进行：膜包为1000kDa膜包，流缓冲体系为10-20mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系，pH值6.0-8.0。
在本发明的一些特定实施方案中，所述肝素亲和层析使用Heparin系列填料进行，优选地所述肝素亲和层析如下所述进行：所述肝素亲和层析填料为Heparin系列，亲和流动相1）为50mmol/L Tris-盐酸缓冲液，pH值6.5-7.0，其中加入0.1-0.5M NaCl，流动相2)为50mmol/L Tris-盐酸缓冲液，pH值6.5-7.0，其中加入1-2M NaCl。
在本发明的一些特定实施方案中，所述类病毒颗粒选自：乳头瘤病毒类病毒颗粒、轮状病毒类病毒颗粒、乙肝病毒类病毒颗粒、丙肝病毒类病毒颗粒、丁肝病毒类病毒颗粒、流感病毒类病毒颗粒和HIV类病毒颗粒，特别地所述类病毒颗粒为乙肝病毒表面抗原类病毒颗粒或者乙肝病毒核心抗原类病毒颗粒，优选地为重组乙肝病毒核心抗原类病毒颗粒，更优选地为全长的重组乙肝病毒核心抗原类病毒颗粒或截短的重组乙肝病毒核心抗原类病毒颗粒，例如对应于乙肝病毒核心抗原氨基酸序列之1-149位的重组乙肝病毒核心抗原类病毒颗粒。在本发明中，术语“乙肝病毒类病毒颗粒”涵盖由乙肝病毒的一种或更多种组分构成的类病毒颗粒，例如乙肝病毒表面抗原类病毒颗粒或者乙肝病毒核心抗原类病毒颗粒。本发明所用的术语“类病毒颗粒”涵盖了包含除病毒成分之外其他成分的类病毒颗粒，例如标签、佐剂、连接头、标志物等。本发明所用的术语“重组乙肝病毒核心抗原类病毒颗粒”涵盖了包含除乙肝病毒核心抗原成分之外其他成分的类病毒颗粒，例如乙肝病毒表面抗原的全部或部分、标签、佐剂、连接头、标志物等。
在一些特定实施方案中，本发明所提供的方法是大规模纯化方法，例如工业化规模的纯化方法。
本发明的目的之一是提供一种可获得高纯度的、低内毒素以及低核酸残留的原核细胞例如大肠杆菌表达的类病毒颗粒（例如全长或者截短的HBcAg类病毒颗粒）的纯化方法。本发明人出人意料地发现，利用本发明所提供的方法获得的全长或者截短的HBcAg类病毒颗粒在HPLC上显示纯度高达98%以上，且基本为类病毒颗粒VLP状态，并且内毒素残留量仅仅为0.05EU/μg蛋白，核苷酸残留量仅仅为0.8ng/μg蛋白，远远低于使用现有技术方法所得到的结果。另一方面，本发明的方法在实现出色的纯化效果的同时，还具有低成本、适于大规模生产的优点，为类病毒颗粒的产业化生产铺平了道路，解决了长久以来本领域所期待解决的技术问题。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明人通过对多种型别的HBcAg基因序列进行分析获得了较为广谱的目的蛋白序列，通过基因工程的方式在原核细胞例如大肠杆菌表达系统中获得HBcAg高产表达菌株。
在本发明的一个具体实施方案中，HBcAg序列为经过分析NCBI调取的多种型别的HBcAg序列而得，全长为183个氨基酸，示例性氨基酸序列提供于SEQ ID NO:1，表达时采用大肠杆菌表达外源蛋白偏爱的密码子代替天然基因的核苷酸序列。经优化后的核苷酸序列为SEQ IDNO:2，其中1-3位氨基酸ATG为起始密码子，550-552为TTA为终止密码子。另外提到的截短的149位氨基酸示例性序列提供于SEQ ID NO:3中，经优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO:4，其中1-3位氨基酸ATG为起始密码子，451-453为TTA为终止密码子。
本发明提供了一种高产菌株的筛选方法，其包括以下步骤：将优化后合成的全长183位氨基酸或者截短的149位氨基酸的HBcAg基因片段连接于pUC57载体上。通过PCR扩增，将扩增后产物连接到表达载体pET26b（+），分别获得重组质粒pET-26-Con183和pET-26-Con149，上述质粒经测序，证实基因序列正确后，将质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中。固体培养基上培养转化后的大肠杆菌，挑取单克隆菌落继续培养，并经IPTG诱导鉴定，选取SDS-PAGE显示表达量高的菌株作为工程菌株。
本发明提供了一种HBcAg粗品的制备方法，包括高密度发酵工程菌株，收集菌体，以及破菌获得菌体上清液。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种全长或者截短的HBcAg的纯化方法，本发明的方法包括硫酸铵沉淀、分子筛层析、羟基磷灰石色谱层析、超滤浓缩、肝素亲和层析。
在另一个优选的实施方案中，本发明的方法由如下步骤组成，按编号顺序进行：
1）硫酸铵沉淀，
2）分子筛层析、羟基磷灰石色谱层析、超滤浓缩、肝素亲和层析，可以以任何顺序进行。
硫酸铵沉淀步骤，取破碎菌体上清液，加入终浓度为5-20%的硫酸铵溶液，室温搅拌，放置10-30min，15000g离心10-20min，收集含目的蛋白的沉淀，以1/5-1/8体积复溶目的蛋白。
分子筛层析步骤，填料为Sepharose系列或甲基丙烯酸酯系列的介质，流动相为20-50mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系，pH值6.0-8.0，其中加入0.01-1%TritonX-100。
羟基磷灰石色谱层析步骤，填料为I型或Ⅱ型，层析流动相为10-20mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系，pH值6.0-8.0，其中加入0.01-1%TritonX-100和0.5-2M NaCl。
超滤浓缩步骤，膜包为100-1000KDa膜包，流缓冲体系为10-20mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系，pH值6.0-8.0。
肝素亲和步骤，介质为Heparin系列，亲和流动相1）为50mmol/LTris-盐酸缓冲液，pH值6.5-7.0，其中加入0.1-0.5M NaCl，流动相2)为50mmol/L Tris-盐酸缓冲液，pH值6.5-7.0，其中加入1-2M NaCl。
本发明至少具有以下有益效果：
1）室温下，选用低浓度硫酸铵，能够达到杂蛋白处于上清液，目的蛋白沉淀下来的效果。本发明利用硫酸铵沉淀对匀浆上清进行初纯，30min即可完成，目的蛋白复溶后回收率可高于90%以上，并且目的蛋白纯度达到60-70%，具有反应时间短，操作条件简单、易放大，目标蛋白收率及纯度高的优点。
2)经过硫酸铵沉淀、分子筛色谱层析、羟基磷灰石色谱层析、切向流纯化以及肝素亲和层析步骤获得高纯度，低内毒素及低核酸残留的目的蛋白，质量标准符合药典要求。
3）经过硫酸铵沉淀、分子筛色谱层析、羟基磷灰石色谱层析、切向流纯化以及肝素亲和层析步骤获得的目的蛋白，经过N端测序证明目的蛋白完全正确，透射电镜显示目的蛋白VLP形态圆形、规则且均一，目的蛋白纯度在99%以上，且基本为类病毒颗粒VLP形态。
4）本发明的制备及纯化方法适于大规模工业生产。
附图说明
图1为乙肝核心抗原表达质粒图。
图2显示了重组HBcAg表达的SDS-PAGE。
图3显示在本发明一个具体实施方案中使用分子筛层析纯化大肠杆菌表达的HBcAg类病毒颗粒的图谱。
图4显示在本发明一个具体实施方案中使用肝素亲和层析纯化HBcAg类病毒颗粒的图谱。
图5显示在本发明一个具体实施方案中对重组HBcAg类病毒颗粒纯化样品进行HPLC纯度分析的结果。
图6显示在本发明一个具体实施方案中对重组HBcAg类病毒颗粒纯化样品进行N端测序的结果。
图7显示在本发明一个具体实施方案中纯化的重组HBcAg类病毒颗粒的电镜图片。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明（而非限定本发明）的实施例来描述本发明。
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考CurrentProtocols in Molecular Biology（Ausubel）。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间（包含端点）的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。
另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法参照分子克隆实验室手册第2版（J.Sambrook等人）以及精编分子生物学实验指南第3版（F.M.Ausube等人）进行。限制性内切酶的使用参见其说明书。实施例中未注明来源的试剂均是本领域常规市售可得的试剂。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，并不限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.HBcAg基因的分析以及合成
乙肝病毒有多种血清型和基因型，在本实施例中，从NCBI调取各种基因型的HBcAg目的基因序列共9125株，其中基因型分类如下表1中所示，利用Mega软件（Mega5.0,Borland Delphi）对调取的各基因型HBcAg进行分析，从而得出各个基因型的一致序列（Consensus sequence），共30种亚型的HBcAg一致基因序列（如表1），取保守性大于50%的氨基酸类别，对其各基因型的全长HBcAg序列进行逐个突变率分析，随后再次进行一致序列分析（Consensus analysis），得出最终的HBcAg183个氨基酸的全长一致序列，将此一致序列作为本发明中HBcAg基因的来源，将该一致序列命名为Con183。
表1从NCBI调取不同型别HBcAg核苷酸序列分析
| 序列 | NCBI调取的总基因数 | HBcAg基因归类 |
| 1 | 1757 | China core |
| 2 | 23 | China adw2 |
| 3 | 123 | China adr |
| 4 | 3 | China ayr |
| 5 | 9 | China ayw |
| 6 | 1333 | genotype B China |
| 7 | 1249 | genotype C China |
| 8 | 280 | genotype A adw2 |
| 9 | 56 | genotype A adw |
| 10 | 71 | genotype A ayw |
| 11 | 279 | genotype B adw2 |
| 12 | 18 | genotype B ayw1 |
| 13 | 226 | genotype C adw2 |
| 14 | 553 | genotype C adr |
| 15 | 3 | genotype C ayr |
| 16 | 30 | Ba |
| 17 | 8 | Bj |
| 18 | 107 | C1 |
| 19 | 534 | C2 |
| 20 | 29 | C3 |
| 21 | 236 | adw2 |
| 22 | 55 | adw |
| 23 | 6 | ayr |
| 24 | 19 | ayw |
| 25 | 144 | adr |
| 26 | 1123 | genotype D |
| 27 | 521 | genotype E |
| 28 | 255 | genotype F |
| 29 | 18 | genotype G |
| 30 | 57 | genotype H |
| Con183 | 9125 | consensus |
分析所获得的Con183蛋白序列(SEQ.ID No:1)，然后依照大肠杆菌密码子偏爱性优化核苷酸序列（SEQ ID NO:2）。核苷酸片段全长561bp（由苏州金维智公司合成）至pUC57-simple载体（来自苏州金维智公司），转化进上并转Top10菌株（来自苏州金维智公司）中进行保存。
实施例2.HBcAg表达载体构建与诱导鉴定
以合成的Con183核苷酸片段为模板，以Con183F(SEQ.ID No:3)为正向引物（5、端引入NdeI酶切位点），Con183R(SEQ.ID No:4)为反向引物（3‘端引入EcoRI酶切位点）。在PCR仪（ABI）中按照表2所示条件进行PCR反应。
SEQ.ID No:3：正向引物（NdeI）：5‘-GGAATTCCATATGGACATTGACCCG-3’
SEQ.ID No:4：反向引物（EcoRI）：5‘-CCGGAATTCCTAACACTGGCTTTC-3’
表2PCR反应条件
PCR扩增后获得560bp左右的片段。将以上得到的扩增产物与商售的pMD18-T载体（TAKARA公司生产）连接，并命名为pMD18-T-Con183,经NdeI/EcoRI酶切鉴定和测序获得两端添加了酶切位点的核苷酸序列(SEQ.ID No:2)，其编码的氨基酸序列示意于(SEQ.ID No:1)。然后将pMD18-T-Con183质粒进行NdeI/EcoRI酶切，将酶切获得的片段连接入同样经NdeI/EcoRI酶切处理的pET26b原核表达载体（购自Novagen）中。并转化大肠杆菌BL21（DE3）（购自Novagen）；提取质粒，经NdeI/EcoRI酶切鉴定得到了插入Con183片段的阳性质粒pET26b-Con183，如图1（附图1乙肝核心抗原表达质粒图）。
取1μl的pET26b-Con183（30ng/ul）转化利用Zymo（购自ZYMORESEARCH生物科技公司，T3001）超级感受态制备的感受态大肠杆菌BL21（DE3）将其涂布与含卡那霉素（终浓度30μg/ml，下同）的固体LB培养基（成分：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，下同）并37℃静置培养10小时左右至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含5ml液体LB培养基（含卡那霉素）的试管，在37℃180转/分钟下振荡培养10小时，从中取1ml菌液添加20%终浓度甘油冻存于-70℃。同时取5μl菌液接种于5ml含卡那霉素的液体LB培养基中，继续振荡培养至OD600达1.0时加入IPTG终浓度为5mM，在37℃下振荡诱导4个小时。诱导后10000g离心1分钟收集菌体，然后按照1ml加入100ul1XPBS为裂解液，充分悬浮后进行沸水浴10分钟处理，利用SDS-PAGE鉴定目的蛋白表达情况。HBcAg小量诱导表达情况见附图2。
实施例3.HBcAg的发酵
将保存于-80℃冰箱的菌体甘油管悬液常温融化摇匀后划线于LB平板上，37℃培养8～12h生长出单菌落并镜检无杂菌，菌体复壮完毕可进行液体培养。挑选复壮平皿上的单菌落接种于装有50mL LB液体培养基的500mL三角瓶中，37℃，200rpm，培养10h，OD600达到3.0左右作为一级种子。
按5%接种量将一级种子接种于装有300mL LB液体培养基的2L三角瓶中，37℃，200rpm，培养14h至OD600达到4.0左右作为二级种子。
二级种子镜检确认无杂菌后，按5%接种量（250ml）无菌接种至装有预先灭好菌的5L发酵初始培养基的发酵罐（Applikon,BioBundle7L），设定发酵初始条件为转速300rpm，通气量4L/min，pH7.05。发酵开始后每隔1h取样测定OD600，即时分析菌浓变化。约生长5h左右，初始培养基中的碳源耗完时，溶氧反弹至70%以上，此时使用测糖仪（SBA-40D生物传感分析仪）判定葡萄糖消耗完毕。
发酵生长结束后流加葡萄糖、酵母粉和蛋白胨，调整流动泵速率使溶氧曲线稳定在30%～50%，此时诱导开始，每隔1h取样测定湿菌重并留样待发酵结束分析表达趋势，当发酵4h以后，连续两次检测OD600无明显上涨甚至出现下降趋势时，发酵结束并放罐，离心收取菌体。
实施例4.HBcAg匀浆破碎
收集菌体后，按照1g菌体对应10ml裂解液（20mM PBS）的比例重悬菌体，然后使用高压匀浆机（STANSTED,SPCH-10）以1000bar压力高压匀浆1次来破碎菌体。对菌体破碎液以10000g离心10分钟，取上清，以供后续纯化处理。
实施例5.HBcAg的硫酸铵沉淀处理
逐步滴加用pH7.5，20mM PBS配制的40%硫酸铵缓冲液使硫酸铵终浓度为20%，室温搅拌30分钟。然后10000g离心10分钟，弃上清，将沉淀用1/5上清体积的PBS溶液（20mM，pH7.5）进行复溶。经SDS-PAGE及Western印迹检测可知该步骤可以使目的蛋白纯度提高至60%的纯度，目的蛋白回收率为95%。
实施例6.HBcAg的分子筛层析
对如上所述获得的纯度为60-70%的HBcAg蛋白溶液进行分析筛层析。用含0.01%TritonX-100的20mM磷酸盐缓冲液冲洗以及平衡仪器系统（GE healthcare公司）AKTA explorer100液相色谱系统和分子筛介质Sepharose6FF纯化，收集层析谱图中间的主要的目的蛋白峰型（见附图3），合并HBcAg组分。
实施例7.HBcAg的羟基磷灰石层析纯化
对实施例6中所述使用经分子筛层析纯化的HBcAg蛋白溶液进行羟基磷灰石层析纯化。向所述HBcAg蛋白溶液补充5M NaCl溶液至盐浓度为1M NaCl。用含0.01%TritonX-100及1M NaCl的20mM磷酸盐缓冲体系平衡仪器系统和羟基磷灰石CHT-type I型介质，用含0.01%TritonX-100及1M NaCl的250mM磷酸盐缓冲体系(pH7.5)进行洗脱，收集穿透组分和20mM磷酸根洗脱样品，合并穿透组分以及20mM磷酸根洗脱样品。
实施例8.HBcAg的超滤浓缩
对实施例7中所获得的经羟基磷灰石层析纯化的HBcAg蛋白溶液进行超滤浓缩。使用Millipore Lab scale的切向流系统，1000kDa的膜包（Pellicon-XL Biomax）进行超滤浓缩。流缓冲体系为20mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系，pH值7.0，先将样品体积压缩至50ml，然后以十倍体积pH值为7.5的PBS溶液稀释再次压缩至50ml，循环往复3次，最后将目的蛋白体积定至50ml。测定TritonX-100残留量低至0.75μg/μg蛋白。
实施例9.HBcAg的肝素亲和层析纯化
对实施例8中所获得的经超滤浓缩的HBcAg蛋白溶液进行肝素亲和层析纯化。所述经超滤浓缩的HBcAg蛋白溶液经换液至含0.1M NaCl的50mM Tris-盐酸缓冲液（pH值为6.8）中，然后进行heparin亲和层析（GEhealthcare公司）。用含1M NaCl的50mM Tris-盐酸缓冲液（pH值为6.8）进行洗脱，收集洗脱组分（见图4），然后将以上目的蛋白再置换到pH值为7.5的20mM PBS缓冲体系中作为储存缓冲液。
实施例10.HBcAg HPLC纯度分析
通过HPLC分析实施例9中所获得的HBcAg蛋白溶液的纯度。用pH值为7.5的20mM PBS作为流动相平衡高效液相色谱层析系统（Anglient）以及预装柱分子筛G5000Pwxl（TOSOH），然后设定样品分析程序如下：样品上样量50ul/次，运行时间35分钟，检测波长280nm。通过峰面积积分分析样品纯度为99%，结果见图5。
实施例11.HBcAg的N端测序分析
样品为实施例9中所述获得的HBcAg蛋白溶液，利用Eksigent液相-LTQ-MS质谱仪。委托北京蛋白质组研究中心进行检验，经检验结果，证明乙肝核心抗原N端序列全部正确。N端1-9位测序结果如图6所示，N端1-9位氨基酸序列（MDIDPYKEF）鉴定质谱图及序列匹配。
实施例12.HBcAg的颗粒性质分析
样品为实施例9中所述获得的HBcAg蛋白溶液，利用日立H-7650型电镜（常规新型透射电镜，加速电压（accelerating voltage）120kV，分辨率（resolution）0.204nm，最高放大倍数magnification60万倍），委托南京农业大学进行检测。经过检测及分析结果可知，HBcAg VLP为规则，圆形的颗粒形态，直径为29.7nm左右。颗粒形态见图7。
实施例13.HBcAg残余DNA及内毒素测定
样品为实施例9中所述获得的HBcAg蛋白溶液，利用鲎试剂法测定HBcAg的内毒素残留量为0.05EU/ug蛋白，经斑点杂交检测核苷酸残留量为0.8ng/ug蛋白。
表3HBcAg蛋白质序列和核苷酸序列
Claims (9)
1.一种原核细胞例如大肠杆菌表达的类病毒颗粒的纯化方法，其特征在于所述纯化方法包括沉淀步骤、第一层析步骤、第二层析步骤、浓缩步骤和第三层析步骤，其中所述沉淀步骤包括硫酸铵沉淀步骤，所述第一层析步骤包括分子筛层析步骤，所述第二层析步骤包括羟基磷灰石层析，所述浓缩步骤包括超滤浓缩步骤以及所述第三层析步骤包括肝素亲和层析步骤。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于所述沉淀步骤在所述第一层析步骤、所述第二层析步骤、所述浓缩步骤和所述第三层析步骤之前进行。
3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于所述沉淀步骤、所述第一层析步骤、所述第二层析步骤、所述浓缩步骤和所述第三层析步骤依次进行。
4.根据前述任一权利要求所述的纯化方法，其特征在于所述硫酸铵沉淀步骤使用终浓度为20%的硫酸铵溶液在室温下进行，优选地所述硫酸铵沉淀步骤如下所述进行：取破碎菌体上清液，加入终浓度为20%的硫酸铵溶液，室温搅拌，放置10-30min，15000g离心10-20min，收集沉淀，以1/5-1/8上清体积的PBS溶液复溶目的蛋白。
5.根据前述任一权利要求所述的纯化方法，其特征在于所述分子筛层析使用基于琼脂糖例如Sepharose系列或基于甲基丙烯酸酯系列的介质进行，优选地所述分子筛层析如下所述进行：填料为Sepharose系列或甲基丙烯酸酯系列的介质，流动相为20-50mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系，pH值6.0-8.0，其中加入0.01-1%TritonX-100。
6.根据前述任一权利要求所述的纯化方法，其特征在于所述羟基磷灰石层析使用I型或Ⅱ型羟基磷灰石进行，优选地所述羟基磷灰石层析如下所述进行：填料为I型或Ⅱ型，层析流动相为10-20mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系，pH值6.0-8.0，其中加入0.01-1%TritonX-100和0.5-2M NaCl。
7.根据前述任一权利要求所述的纯化方法，其特征在于所述超滤浓缩使用截留分子量为500-2000kDa（例如1000kDa）的滤膜例如膜包进行，优选地所述超滤浓缩如下所述进行：膜包为1000kDa膜包，流缓冲体系为10-20mmol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲体系，pH值6.0-8.0。
8.根据前述任一权利要求所述的纯化方法，其特征在于所述肝素亲和层析使用Heparin系列填料进行，优选地所述肝素亲和层析如下所述进行：所述肝素亲和层析填料为Heparin系列，亲和流动相1）为50mmol/LTris-盐酸缓冲液，pH值6.5-7.0，其中加入0.1-0.5M NaCl，流动相2)为50mmol/L Tris-盐酸缓冲液，pH值6.5-7.0，其中加入1-2M NaCl。
9.根据前述任一权利要求所述的纯化方法，其中所述类病毒颗粒选自：乳头瘤病毒类病毒颗粒、轮状病毒类病毒颗粒、乙肝病毒类病毒颗粒、丙肝病毒类病毒颗粒、丁肝病毒类病毒颗粒、流感病毒类病毒颗粒和HIV类病毒颗粒，特别地所述类病毒颗粒为乙肝病毒表面抗原类病毒颗粒或者乙肝病毒核心抗原类病毒颗粒，优选地为重组乙肝病毒核心抗原类病毒颗粒，更优选地为全长的重组乙肝病毒核心抗原类病毒颗粒或截短的重组乙肝病毒核心抗原类病毒颗粒，例如对应于乙肝病毒核心抗原氨基酸序列之1-149位的重组乙肝病毒核心抗原类病毒颗粒。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104710527A (zh) * | 2015-02-28 | 2015-06-17 | 苏州金盟生物技术有限公司 | 一种生物制品的内毒素去除方法 |
| CN108047316A (zh) * | 2018-01-04 | 2018-05-18 | 南京赛威信生物医药有限公司 | 重组乙肝核心抗原的分离纯化方法 |
| WO2018119746A1 (zh) * | 2016-12-28 | 2018-07-05 | 北京民海生物科技有限公司 | 重组ev71病毒样颗粒的纯化及其疫苗制备方法 |
| CN109517043A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-03-26 | 艾美汉信疫苗（大连）有限公司 | 一种原核表达重组轮状病毒抗原p2-vp8的纯化方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995031532A1 (en) * | 1994-05-16 | 1995-11-23 | Merck & Co., Inc. | Papillomavirus vaccines |
| CN1434056A (zh) * | 2002-01-25 | 2003-08-06 | 杭州泰士生物科技有限公司 | 一种重组人乙肝病毒核心抗原的生产方法 |
| CN101153280A (zh) * | 2006-09-29 | 2008-04-02 | 厦门大学 | 从原核生物中纯化人乳头瘤病毒晚期蛋白l1的方法 |
| CN102488899A (zh) * | 2011-12-15 | 2012-06-13 | 天津济命生生物科技有限公司 | 一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法和用途 |
| CN103173470A (zh) * | 2013-03-11 | 2013-06-26 | 斯澳生物科技（苏州）有限公司 | 大肠杆菌来源的pcv2 orf2衣壳蛋白病毒样颗粒的制备 |
-
2013
- 2013-11-29 CN CN201310629523.8A patent/CN104673760B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995031532A1 (en) * | 1994-05-16 | 1995-11-23 | Merck & Co., Inc. | Papillomavirus vaccines |
| CN1434056A (zh) * | 2002-01-25 | 2003-08-06 | 杭州泰士生物科技有限公司 | 一种重组人乙肝病毒核心抗原的生产方法 |
| CN101153280A (zh) * | 2006-09-29 | 2008-04-02 | 厦门大学 | 从原核生物中纯化人乳头瘤病毒晚期蛋白l1的方法 |
| CN102488899A (zh) * | 2011-12-15 | 2012-06-13 | 天津济命生生物科技有限公司 | 一种卵黄免疫球蛋白缓释制剂的制备方法和用途 |
| CN103173470A (zh) * | 2013-03-11 | 2013-06-26 | 斯澳生物科技（苏州）有限公司 | 大肠杆菌来源的pcv2 orf2衣壳蛋白病毒样颗粒的制备 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| HENG CHEN等: "Expression and purification of the recombinant HBcAg core particles derived from methyltrophic Pichia pastoris, and TEM and AFM of the core particles and their natural aggregates", 《J ELECTRON MICROSC》 * |
| 刘广洋等: "乙型肝炎病毒核心抗原蛋白表达纯化及免疫学分析", 《药物生物技术》 * |
| 李记来等: "乙型肝炎病毒核心抗原的原核表达及纯化", 《中国生物制品学杂志》 * |
| 李静海等主编: "《展望21世纪的化学工程》", 31 August 2004 * |
| 郑裕国主编: "《生物工程设备》", 30 June 2007 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104710527A (zh) * | 2015-02-28 | 2015-06-17 | 苏州金盟生物技术有限公司 | 一种生物制品的内毒素去除方法 |
| CN104710527B (zh) * | 2015-02-28 | 2018-08-24 | 苏州金盟生物技术有限公司 | 一种生物制品的内毒素去除方法 |
| WO2018119746A1 (zh) * | 2016-12-28 | 2018-07-05 | 北京民海生物科技有限公司 | 重组ev71病毒样颗粒的纯化及其疫苗制备方法 |
| CN109689862A (zh) * | 2016-12-28 | 2019-04-26 | 北京民海生物科技有限公司 | 重组ev71病毒样颗粒的纯化及其疫苗制备方法 |
| US10987416B2 (en) | 2016-12-28 | 2021-04-27 | Beijing Minhai Biotechnology Co., Ltd. | Purification of recombinant EV71 virus-like particle and method for preparing vaccine thereof |
| CN109689862B (zh) * | 2016-12-28 | 2022-09-30 | 北京民海生物科技有限公司 | 重组ev71病毒样颗粒的纯化及其疫苗制备方法 |
| CN108047316A (zh) * | 2018-01-04 | 2018-05-18 | 南京赛威信生物医药有限公司 | 重组乙肝核心抗原的分离纯化方法 |
| CN109517043A (zh) * | 2018-11-23 | 2019-03-26 | 艾美汉信疫苗（大连）有限公司 | 一种原核表达重组轮状病毒抗原p2-vp8的纯化方法 |
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| Publication number | Publication date |
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