CN104531741B - 增强hpv抗原表位肽免疫原性的方法及类病毒颗粒、颗粒制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，把HPV抗原基因组装到HBc的基因上，将整合之后的基因通过外源表达系统表达融合蛋白，融合蛋白将自动组装形成类病毒颗粒VLP,且所述VLP表面展示多于一个拷贝的HPV抗原，得到HBc‑HPV VLP，该方法有效地增强抗原表位肽的免疫原性，极大的提高了抗原类病毒颗粒的回收率；通过该方法可以获得如序列表<400>8所示序列的类病毒颗粒，该类病毒颗粒在制备HPV疫苗方面具有应用价值。

Description

增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法及类病毒颗粒、颗粒制备方法与应用
技术领域
本发明涉及疫苗制备技术领域，尤其是增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法及类病毒颗粒、颗粒制备方法与应用。
背景技术
人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)属于乳头多瘤空泡病毒科乳头瘤病毒属，它是一类分子量较小的无包膜的双链环状嗜上皮性DNA病毒，通过入侵生殖道鳞状上皮细胞以及其他组织器官的上皮细胞，使细胞发生分化失调，引起局部上皮增生、增厚或呈乳头状。
HPV基因组是双链环状DNA，以共价闭合的超螺旋结构、开放的环状结构、线性分子3种形式存在，HPV基因组编码9个开放阅读框，分为3个功能区即早期转录区、晚期转录区和非转录区。早期转录区又称为E区，分别编码E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8等8个早期蛋白，参与病毒DNA的复制、转录、翻译调控和细胞转化等功能。晚期转录区编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。HPV衣壳是由72个L1蛋白五聚体构成的T＝7的二十面体结构，因此一个病毒粒子上含有360个L1蛋白单体，L2蛋白位于L1构成的VLP(类病毒颗粒)上，每个病毒粒子上含有12个或者更多拷贝的L2蛋白。
HPV的L1可以在酵母菌或者昆虫细胞中表达，并自我组装成与真正病毒颗粒大小相同的VLP，也可以与L2蛋白共组装成VLP，VLP从形态学和抗原的荧光分析跟天然的病毒几乎完全相同，并表现出了很好的免疫原性及耐受性，免疫机体后可诱导产生高滴度的中和抗体，利用此方法可以生产HPV L1VLP疫苗。
最为成熟的HPV疫苗是针对L1抗原设计的，代表产品为已获批上市的由Merck公司生产的Gardasil---包括HPV6、11、16、18的四价疫苗，和GSK的Cervarix---HPV16、18二价疫苗，此外Merck开发的9价HPV疫苗已经完成了III期临床研究，结果表明，对HPV-31、33、45、52、58引起的宫颈、阴道和外阴癌前病变的保护性大约有97％，而对HPV-6、11、16、18的免疫应答也不亚于Gardasil，预计9价疫苗也可以很快获批上市。
虽然有多篇文章报道HPV的L2具有免疫原性，可以激发机体产生中和抗体，但是针对HPV L2的预防性疫苗的研究进展不大，部分原因与单独蛋白表达HPV L2的中和表位，不能有效激发机体的免疫原因有关。
1999年，Kawana等首先报道在HPV16L2aa108—120存在HPV6的交叉中和表位，该表位的合成肽免疫的鼠血清能够同时抑制HPV16假病毒和HPV6假病毒的感染。Embers等从体内水平上验证了该交叉中和表位的合成肽能够诱导中和性抗体，并抑制乳头瘤病毒的感染。2007年，Gambhira等发现HPV16L2aa17—36多肽免疫的鼠血清能够中和HPV5、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV45、HPV52、HPV58假病毒。现已证实L2存在多个交叉中和表位，将具有交叉中和活性的肽段序列链接在一起，可提高L2交叉中和表位的呈递效率，是极具潜力的广谱性HPV疫苗研发途径之一，但唯一的遗憾是,纯粹的肽段偶联分子量太小，不能有效激发机体的免疫反应。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于利用所述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法获得可以展示人乳头瘤病毒抗原肽的类病毒颗粒。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述类病毒颗粒的制备方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述类病毒颗粒的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，把HPV抗原基因组装到HBc(乙肝病毒携带的蛋白，也是乙肝病毒的核心抗原)的基因上，体外表达融合蛋白，则整合之后的基因通过外源表达使HBc形成VLP(类病毒颗粒),且所述VLP表面展示多个拷贝的HPV抗原，得到HBc-HPV VLP。
优选的，上述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，所述HPV抗原基因为HPV晚期转录区编码主要衣壳蛋白L1或HPV晚期转录区编码次要衣壳蛋白L2。
优选的，上述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，所述HPV抗原基因为HPV晚期转录区编码次要衣壳蛋白L2。
优选的，上述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，所述VLP表面表达的HPV抗原是L1或L2的一个抗原肽，或L1或L2的多个抗原肽，或L1或L2的多个抗原肽的偶联。
优选的，上述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，所述VLP表面表达的HPV抗原是L2的两个抗原肽的偶联，所述两个抗原肽的序列为ASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQ和GTGGRTGYIPLGTRPPT。
优选的，上述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，所述HPV抗原肽完全暴露在HBc形成的类病毒颗粒的表面，且VLP表面展示的HPV抗原肽多于一个拷贝。
优选的，上述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，可以在HBc基因上插入更多的外源基因，且不影响HBc类病毒颗粒的形成。
上述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法获得可以表达人乳头瘤病毒抗原肽的类病毒颗粒，为HBc-L2融合蛋白，具有序列表中<400>8所示的序列，即实施例中表1中的全基因组序列。
优选的，上述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法获得可以展示人乳头瘤病毒抗原肽的类病毒颗粒，所述HBc-L2融合蛋白在大肠杆菌表达系统中可溶性表达后可自组装VLP。
上述类病毒颗粒的表达载体构建方法，具体步骤为：
(1)克隆载体转化DH5a，挑取单克隆，接种于5ml LB培养基中，37℃200rpm过夜培养；
(2)按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒提取效果；
(3)BamHI和NdeI双酶切克隆载体上的目标基因；
(4)按照胶回收试剂盒说明书回收目标基因；
(5)将回收的目标基因和经BamHI和NdeI双酶切后的表达载体质粒pET9a通过连接酶进行连接，16℃过夜；
(6)连接产物转化BL21(DE3)，挑取单克隆进行PCR鉴定，继而将阳性克隆接种LB培养基后提取质粒进行酶切鉴定；
(7)阳性菌种扩增保存。
所述步骤(1)所述克隆载体由life technology公司构建，外包公司合成目标基因(-包括两端的BamHI和NdeI酶切位点)并连接T载体构成克隆载体。
优选的，上述类病毒颗粒的制备方法，所述HBc-HPV VLP的表达和纯化的具体步骤为：
Ⅰ、表达实验步骤为：
(1)菌种复苏：将10ul冻存菌液接种到50ml LB培养基中，37℃，250rpm摇菌过夜；
(2)菌种扩增：以5ml复苏菌液接种100mlLB培养基的比例扩大培养，2L三角瓶中加入1L的LB培养基，37℃250rpm摇菌至OD600＝0.6---0.7；
(3)诱导表达：加入IPTG诱导目标蛋白表达，其中诱导条件为1mM IPTG，25℃低温诱导；
(4)菌体收获：诱导4h后，诱导结束，8000rpm离心10min，收集菌体沉淀；
(5)超声破碎：菌体用400mL TGE buffer(50mM Tris，0.5mM EDTA，50mM Nacl，5％甘油)重悬，冰浴超声破碎，镜检确保菌体完全破碎；
Ⅱ、纯化的实验步骤为：
(1)蛋白收集：超声破碎后，8000rpm离心10min，收集上清；
(2)蛋白沉淀：蛋白上清在磁力搅拌状态下缓慢加入(NH4)2SO4粉末，终浓度为10％w/v，待所有粉末溶解后将烧杯置于4℃静置2h；
(3)离心收集沉淀，计算沉淀重量，以每1g沉淀用60mL buffer的比例以TGE buffer重悬溶解；
(4)重悬液再次离心，收集上清，过0.22μm滤膜；
(5)膜包洗涤：100KDa的膜包反复洗滤，其目的是除去小分子量蛋白质，同时浓缩重悬液体积，洗滤结束后浓缩体积至10ml左右，过0.22μm滤膜；
(6)CL-4B凝胶分离纯化浓缩液，收集第一峰；
(7)采用分子筛高效液相色谱(SEC-HPLC)以及HPLC-多角度激光光散射(MALS)联用技术鉴定蛋白纯度和VLP颗粒大小。
上述类病毒颗粒在制备HPV疫苗方面的应用。
优选的，上述类病毒颗粒在制备不含有任何佐剂和保护剂的HPV液体针剂疫苗方面的应用，具体步骤如下：
(1)缓冲液置换：将疫苗原液的缓冲液置换为20mg/ml的NaCl，或者4mM的PB或者8mg/ml的NaCl+2mM的PB(2)，测定蛋白浓度，浓度测定方法参考蛋白浓度测定试剂盒说明书；
(3)补加相应的缓冲液至抗原浓度为100ug/ml，或者50ug/ml；
(4)无菌过滤，得到疫苗半成品；
(5)自动分装机分装疫苗半成品，0.5ml/剂；
(6)封口，如果疫苗产品分装在安剖瓶中的话，需要封口，如果分装在西林瓶中的话，需要压盖；
(7)贴签，4℃冷冻保存。
优选的，上述类病毒颗粒在制备HPV疫苗方面的应用，其中疫苗终产品包括氢氧化铝佐剂，具体的步骤如下：
(1)缓冲液置换：将疫苗原液的缓冲液置换为20mg/ml的NaCl，或者4mM的PB或者8mg/ml的NaCl+2mM的PB(2)，测定蛋白浓度，浓度测定方法参考蛋白浓度测定试剂盒说明书；
(3)补加相应的缓冲液至抗原浓度为900ug/ml，或者450ug/ml；
(4)无菌过滤，得到疫苗半成品；
(5)加入1％的氢氧化铝佐剂，补加缓冲液使得佐剂的终浓度＜0.1％，蛋白抗原的终浓度为100ug/ml，50ug/ml；
(5)自动分装机分装疫苗半成品，0.5ml/剂；
(6)封口，如果疫苗产品分装在安剖瓶中的话，需要封口，如果分装在西林瓶中的话，需要压盖；
(7)贴签，4℃冷冻保存。
本发明的有益效果是：
上述增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，克服了现有技术抗原肽免疫原性差的缺点，克服了插入序列对HBc VLP组装的影响，合理设计了L2抗原肽在HBc中的插入位点，使HBc-VLP表面覆盖着不仅一个拷贝数的L2抗原肽，即本系统在假病毒的外表面，可以呈递不仅一个拷贝数的L2抗原肽，使HPV L2中和表位完全被HBc假病毒颗粒展现在病毒粒子表面，从而有效的增强L2中和表位多肽的免疫原性；所得HBc-L2融合蛋白可溶表达后可自动组装为VLP，免除了体外蛋白以变性复性形成VLP的繁琐过程，极大的提高了抗原VLP的回收率；所得HBc-L2融合蛋白在预防HPV感染的疫苗生产方面具有重要应用。
附图说明
图1：HBc-L2-pET9a表达载体酶切图，图中显示酶切得到670bp左右的DNA片段，和融合基因的理论大小相一致；
图2：HBc-L2诱导表达鉴定，图中显示IPTG诱导表达结束后，离心收集菌体，超声破碎后上清和沉淀电泳，结果表明，目标蛋白主要分别在上清中，说明构建的融合基因主要以可溶表达的形成表达目标蛋白；
图3：HPLC鉴定HBc-L2VLP，图中显示实验设计的HPV L2融合多肽只有52个氨基酸，理论上分子量约22KD，但是经SEC-HPLC分析(使用TSK G5000)，获得的纯化产物的分子量(保留时间14min)远远大于BSA的蛋白(分子量66KD,保留时间大约在23min)，提示融合蛋白自组装形成VLP颗粒；
图4：MALS鉴定HBc-L2VLP，图中显示结合SEC-HPLC以及MALS结果可以看出，表达产物中存在分子量均一性好的大分子颗粒；
图5：HBc-L2VLP电镜照片，图中显示电镜图片直观显示融合蛋白成功自组装为VLP，和SEC-HPLC以及MALS的结果相一致；此外，从电镜图片中可以看出，融合蛋白自组装VLP颗粒的效率高，VLP颗粒均一性好；
图6：CL-4B分离100KD膜包超滤液纯化图，图中显示100KDa超滤浓缩液，经CL-4B可以有效的分离得到VLP，图中箭头峰则为CL-4B分离得到的融合蛋白VLP颗粒；
图7：HBc-L2VLP颗粒纯度分析(HPLC)，图中显示VLP纯化抗原SEC-HPLC纯度分析结果，图中箭头所指目标峰的纯度达到85％；
图8：乙肝病毒HBc蛋白VLP组装图，图中显示乙肝病毒(HBV)的HBc蛋白在大肠杆菌表达后，可以自动组装成VLP颗粒；
图9：HBc-L2VLP疫苗设计模拟图，图中显示HBc蛋白的前段，后端以及中间可以插入外源抗原，且不影响VLP的形成，更重要的是插入抗原经HBc蛋白VLP组装后，全部展示于外面。
具体实施方式
实施例1HBc-L2VLP重组融合蛋白的构建
(1)HBc-L2基因序列的合成
外包Life technology合成HBc-L2融合基因(融合基因两端设计有酶切位点)，融合基因链接T载体，融合基因信息见表1：
表1 HBc-L2融合蛋白基因信息
(2)HBc-VLP诱导表达
BamHI,NdeI双酶切T载体上的目标序列，酶切片段连接pET9a表达载体，转化BL21(DE3)，如图1所示，经酶切以及PCR验证转化成功。
(3)IPTG诱导表达
10ul冻存菌液接种50ml LB培养基，过夜复苏菌种，第二天早上以5ml复苏菌液接种100ml LB培养基的比例，转接扩大培养，待OD600＝0.6时，加入1mM的IPTG诱导表达，诱导温度为25℃；诱导4h后，离心收集沉淀，超声破碎，分别取破碎后的上清以及沉淀进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图2所示，构建的表达载体主要以可溶表达的方式表达目标蛋白。
需要说明的是，在本实施例中基因合成，表达载体构建以及诱导表达、超声破碎和SDS-PAGE分析表达结果均为本领域常规的实验方法，任何熟悉该领域的人都掌握此实验技能，而整个诱导表达过程中使用的培养基则为常规的LB培养基。
并且，本实施例提供的电泳图片仅为初次探索表达载体是否可溶表达的电泳图片，并不代表本实施例中真正的表达量，经过培养基优化以及发酵工艺调整后，可以获得表达量为电泳图片所示数倍高的工艺。
实施例2HBc-L2重组抗原融合蛋白VLP鉴定
发酵收集菌体，超声破碎后，离心收集的上清经简单粗纯，以SEC-HPLC以及MALS分析上清中存在大分子颗粒，将此粗纯样品经电镜分析鉴定，确认存在VLP颗粒。
HBc-L2重组蛋白VLP鉴定粗纯工艺：
(1)发酵结束后，离心收集菌体，菌体用400mL TGE buffer(50mM Tris，0.5mM EDTA，50mM NaCl，5％甘油)重悬，冰浴超声破碎；
(2)离心收集上清，磁力搅拌状态下缓慢加入10％w/v(NH4)2SO4粉末，待所有粉末溶解后将烧杯置于4℃静置2h；
(3)离心收集沉淀，计算沉淀重量，后每1g用60mL buffer重悬溶解；
(4)离心收集上清，上清用0.22μm滤膜过滤，之后用100KD的膜包超滤；
(5)VLP颗粒鉴定，浓缩液进行SEC-HPLC与MALS检测，结果如图3和图4所示，经SEC-HPLC以及MALS分析存在大分子颗粒；后经电镜鉴定，明确此大分子颗粒具有VLP结构，结果如图5所示。
实施例3HBc-L2重组抗原融合蛋白VLP纯化
在实施例2的基础上，进一步完善了HBc-L2VLP抗原纯化方法，将100KD膜包超滤浓缩液，过分子筛；经CL-4B或者sepharose-4FF纯化后，目标抗原VLP的纯度至少达80％；此纯化工艺具有流程简单，回收率高，易于放大的特点；具体来讲，本发明所述VLP纯化工艺具体步骤如下：
(1)蛋白收集：超声破碎后，8000rpm离心10min，收集上清；
(2)蛋白沉淀：蛋白上清在磁力搅拌状态下缓慢加入(NH4)2SO4粉末，终浓度为10％w/v，待所有粉末溶解后将烧杯置于4℃静置2h；
(3)离心收集沉淀，计算沉淀重量，以每1g沉淀用60mL buffer的比例以TGE buffer重悬溶解；
(4)重悬液再次离心，收集上清，过0.22um的滤膜；
(5)膜包洗涤：100KDa的膜包反复洗滤，其目的是除去小分子量蛋白质，同时浓缩重悬液体积，洗滤结束后浓缩体积至10ml左右；
(6)CL-4B或者sepharose4FF凝胶分离纯化浓缩液，收集第一峰；
(7)SEC-HPLC以及MALS鉴定蛋白纯度，100KD膜包超滤液过分子筛，分管收集，以SEC-HPLC分析蛋白分子量以及纯度，结果表明大分子颗粒分布于第一个峰中，且纯度在80％以上，结果如图6和图7所示，分析条件见下表2。
表2
实施例4HBc-L2VLP疫苗制剂
设计疫苗装量为0.5ml，每剂含有VLP的蛋白含量为25μg或者50ug，制剂中可以加入佐剂，也可以不含有佐剂；若加入佐剂，则为氢氧化铝佐剂，制剂缓冲液为NaCl或者NaCl和PB，见表3和表4。
表3 HBc-L2VLP疫苗制剂(低剂量)
表4 HBc-L2VLP疫苗制剂(高剂量)
实施例5HBc-L2VLP抗原小鼠免疫
制备HBc-L2VLP抗原纯度至少80％的抗原，进行小鼠免疫。为了易于比较多肽经HBc有效包装VLP后抗原性增强的效果，实验单纯构建了带有GST标签的L2抗原肽，VLP免疫原性研究中以GST-L2作为对照；实验设计的小鼠免疫方案见表5。
表5 VLP抗原免疫原性研究实验方案
采集二免以及三免后的血清，以ELISA检测小鼠血清效价，所采用的ELISA为实验室常用的实验方法。实验选择以HPV-L2抗原多肽为包被抗原，检测小鼠血清中抗L2IgG抗体效价，其中包被浓度为5ug/ml，100ul/well，包被条件为4℃过夜；以2％BSA，200ul/well的方式封闭ELISA板。血清检测时，血清以及二抗的反应时间为1h，每次反应结束后以0.1％PBST洗涤5次，二抗反应结束后加入TMB显色，OD450测定实验结果，见表6。
表6 VLP抗原免疫原性实验结果
HBc-L2VLP抗原性研究结果表明，HBc-L2VLP的免疫效果远远好于单独GST-L2抗原多肽。将HBc-L2VLP免疫小鼠，小鼠血清三免效果强于二免，提示HBc-L2VLP存在免疫加强效果。此外，铝佐剂可以明显提高抗原的免疫反应。动物实验结果表明，L2抗原多肽经HBc-L2重组构建，形成VLP颗粒后可激发机体产生明显的免疫反应，其抗体水平可提供足够强的保护力。
实施例6保护性实验
采用HPV假病毒中和实验法测定三免鼠血清中HPV特异性中和抗体，借以反应疫苗的保护性。
其中中和实验检测用的宿主细胞为293FT，具体的实验步骤如下：
(1)胰酶消化细胞瓶中的293FT细胞，调整细胞浓度到1.5×105，将此细胞加入96孔细胞板，每孔100ul，37℃、5％CO2培养箱培养4h；
(2)待测血清系列梯度稀释，假病毒按照预先确定的稀释倍数稀释；
(3)血清和假病毒颗粒1:1混合，各50ul，总体积为100ul，4℃中和2h；
(4)中和液加入96孔细胞培养板，置于37℃、5％CO2培养箱培养72h；
(5)荧光显微镜观察结果，感染抑制率大于50％的孔为阳性孔，记录实验结果见表7。
表7：HPV疫苗免疫小鼠中和抗体测定结果
结果表明，GST-L2抗原多肽免疫血清中难以检测到中和抗体，估计与GST-L2抗原多肽难以激发有效的免疫反应有关。
尽管实验设计的L2抗原肽来自于HPV16，但是可以看到给抗原表位肽具有交叉中和活性，可同时有效的中和HPV16以及HPV18型假病毒。
本发明的设计原理说明及有益效果分析：
本发明所述HBc-L2VLP通用疫苗的设计原理如图8所示，HBV的HBc蛋白在大肠杆菌表达后，可以自动组装成VLP颗粒。在实施过程中，HBc蛋白的前段，后端以及中间均可以插入外源抗原，且不影响VLP的形成，更重要的是，如图9所示，插入抗原全部暴露于HBc VLP的外面。因此基于HBc表达异源抗原形成VLP的特性，设计表达HBc-L2VLP，可有效提高L2抗原肽的免疫原性，且L2基因的插入并不影响HBc VLP的形成，所插入的抗原表位肽可以是同一个，也可以是不同的，更可以是两个表位的融合基因。
在本发明的实施例1中，所述融合蛋白，包括位于所述疫苗载体与HPV L2中和表位之间的连接体LE，此柔性连接体的加入可以避免抗原蛋白质与HBc在形成VLP时的相互影响，有助于形成正确的构象；此外，外源基因在HBc的插入位点不仅一个，这些位点可以插入同一个多肽，也可以插入不同的多肽；外源基因可以插入HBc的前面，中间以及后面，且不影响HBc VLP的形成；插入HBc的外源基因可以是一个中和表位，也可以是两个中和表位，可以插入一个位点，也可以插入不同的位点；更可以是两个中和表位融合表达在同一个位点。
由本发明的实施例可以看出，HPV L2中和表位肽的设计使得HBc-L2VLP抗原具有广谱的抗病毒能力，扩大了针对L1设计疫苗的血清型限制；制备的HBc-L2VLP颗粒大小均一，批次一致性好；所提供的VLP抗原纯化方法，工艺设计简单，可以获得VLP纯度在80％以上的抗原；所制备的HBc-L2VLP抗原免疫小鼠后，获得滴度远高于L2的抗原反应。
为了更好的理解本发明所述技术方案，对下述几个问题进行阐述：
(1)本发明提供了一种潜在的预防谱更广的HPV疫苗
目前上市的HPV疫苗均是针对L1抗原设计的，具有明显的血清特异性，而HPV16/18双价疫苗只能抑制约70％的HPV感染，为了让疫苗的预防谱更广，需要设计包括更多血清型的HPV多价疫苗，比如Merck开发的四价疫苗以及目前刚完成临床的9价疫苗。研究发现L2存在多个交叉中和表位，单独或者联合交叉中和表位，可以预防更多血清型的HPV病毒。本发明选择具有更广交叉中和表位的抗原肽作为目标基因，获得HBc-L2VLP可以中和多个血清型的HPV病毒，是一种预防谱更广的HPV疫苗。
(2)本发明提供了抗原多肽增强免疫力的实验方法
HPV L2的中和表位抗原多肽分子量很小，单独免疫很难激发机体产生足够强的免疫反应，这也是虽然大量的文献报道HPV L2可以产生中和抗体，且L2上存在交叉中和表位，但是针对HPV L2疫苗进展缓慢的原因。通过HBc-VLP抗原递呈载体，设计的HBc-L2VLP抗原首先增大了抗原的分子量和空间结构，可有效的激发机体的免疫反应，更为重要的基于本发明实施例中的插入位点设置，HBc VLP的表面被HPV L2抗原肽覆盖。
在本发明的实施例中，L2交叉中和表位抗原肽在HBc VLP表面存在大量拷贝数，且HBc VLP的结构保证L2交叉中和表位抗原肽活性位点完全暴露在外，基于本发明实施例设计的HBc-L2VLP免疫小鼠后可以激发机体产生很好的免疫反应。
(3)本发明实施例极大提高了HBc–L2VLP的得率
虽然HPV L1体外表达可以自组装VLP，但是基于L1抗原的自组装为假病毒颗粒的回收率很低。HPV病毒外壳是由72个L1蛋白五聚体形成的二十面体结构，体外表达的L1蛋白组成类似HPV病毒的假病毒颗粒需要经过5个L1单体形成五聚体以及72个五聚体形成二十面体的过程，往往自组装形成的VLP只有部分为二十面体结构。而本实施例基于HBc VLP呈递L2抗原多肽，极大提高VLP得率，有望极大的降低HPV疫苗的成本。
(4)本发明在插入L2中和表位基因序列的同时并不影响HBc VLP的组装效率
以HBc-VLP作为抗原呈递载体的研究多有报道，但是限于插入序列可能会影响HBc VLP的形成，基于该载体设计的疫苗产品并不多，本研究实施例基于前期大量分子生物学、结构生物学的研究，优化HBc插入位点，确保L2碱基的插入并不影响VLP的形成；
在本发明的实施例中融合蛋白经大肠杆菌可溶表达后，可自组装为VLP，其VLP的组装效率并不低于单独HBc VLP的得率；经电镜分析鉴定，VLP大小均一性也非常好。
(5)本发明实施例L2抗原中和表位在HBc的插入位点有多种方式
本发明的实施例中L2在HBc中的插入位点可以是HBc蛋白的前端、中间、也可以是后端，L2抗原表位肽可以插入一个位点，也可以同时插入两个或者三个位点；可以插入一个抗原中和表位，也可以插入两个抗原表位；同样，本实施例中两个融合抗原表位肽的插入位点可以是同一位点，也可以是不同位点，基于本实施例的研发思路，开发的同类产品也取得巨大的成功。此外，基于本实施例提供的增强抗原多肽的实施方法，可以应用到如L2中和表位等类似的抗原多肽免疫原性增强例中。
综上所述，纳米大小的乙肝核心抗原VLP(HBc-VLP)颗粒易于被抗原递呈细胞吞噬。HBc-VLP是一个有效的抗原载体，递呈在HBc-VLP上的抗原可以消除对佐剂的需要，且能产生Th1免疫反应。HBc-VLP是非感染性的，不同于其他的VLP，他们并不参与病毒受体间相互作用，也不是中和抗体靶位，因此载体抑制并不是主要的挑战。应用HBc-VLP作为疫苗投递系统可以有效的克服小分子量多肽序列不能有效激发机体免疫的缺点。将HPV L2的中和表位插入HBc中，体外表达融合蛋白，可以在形成HBc VLP的同时，在假病毒颗粒的表面呈递目标抗原，形成外表覆盖HPV L2中和表位的VLP颗粒，增强免疫反应。
上述参照具体实施方式对该增强HPV抗原表位肽免疫反应的方法及类病毒颗粒、颗粒制备方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，本发明所述方法可以应用到提高同类抗原表位肽免疫原性的研发中，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，其特征在于：把HPV抗原基因组装到HBc的基因上，所述HPV抗原基因为HPV晚期转录区编码主要衣壳蛋白L1或HPV晚期转录区编码次要衣壳蛋白L2，将整合之后的基因通过外源表达获得融合蛋白，融合蛋白自动组装形成类病毒颗粒VLP,且所述VLP表面展示HPV抗原，得到HBc-HPV VLP。
2.根据权利要求1所述的增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，其特征在于：所述HPV抗原基因为HPV晚期转录区编码次要衣壳蛋白L2。
3.根据权利要求1所述的增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，其特征在于：所述VLP表面展示的HPV抗原是L1或L2的一个抗原肽，或L1或L2的多个抗原肽，或L1或L2的多个抗原肽的偶联。
4.根据权利要求3所述的增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，其特征在于：所述VLP表面展示的HPV抗原是L2的两个抗原肽的偶联，所述两个抗原肽的序列为
ASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQ和GTGGRTGYIPLGTRPPT。
5.根据权利要求1所述的增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，其特征在于：所述HPV抗原肽完全暴露在HBc形成的类病毒颗粒的表面，且展示在HBc VLP表面的抗原肽为多个拷贝。
6.根据权利要求1所述的增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法，其特征在于：在HBc基因上插入更多的外源基因，且不影响HBc类病毒颗粒的形成。
7.权利要求1所述的增强HPV抗原表位肽免疫原性的方法获得的可以表达人乳头瘤病毒抗原肽的类病毒颗粒，其特征在于：为HBc-L2融合蛋白，具有序列表中<400>8所示的序列。
8.根据权利要求7所述的可以展示人乳头瘤病毒抗原肽的类病毒颗粒，其特征在于：所述HBc-L2融合蛋白在大肠杆菌表达系统中可溶性表达后可自组装VLP。
9.权利要求7所述的类病毒颗粒在制备HPV疫苗方面的应用。
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