CN114127093B - 嵌合的人乳头瘤病毒45型l1蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了嵌合的人乳头瘤病毒45型L1蛋白和编码其的多核苷酸，还公开了HPV 45型病毒样颗粒和其制备方法。所述嵌合的人乳头瘤病毒45型L1蛋白包含衍生于HPV 45型L1蛋白的N端片段，所述N端片段保持HPV 45型L1蛋白的免疫原性；和衍生于第二型别乳头瘤病毒L1蛋白的C端片段，所述第二型别乳头状瘤病毒L1蛋白具有相较于其他型别的L1蛋白表达量和可溶性较好的特性；其中所述嵌合的HPV 45型L1蛋白具有HPV 45型L1蛋白的免疫原性。

Description

嵌合的人乳头瘤病毒45型L1蛋白
技术领域
本发明涉及人乳头瘤病毒(HPV)L1蛋白和编码该蛋白的多核苷酸，还涉及HPV病毒样颗粒及其制备方法。
背景技术
乳头瘤病毒(papilloma virus，PV)属于乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)，能引起人、牛、狗、兔等的乳头瘤。其成员人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)为无包膜DNA病毒。该病毒的基因组为双链闭环DNA，大小约7.2-8kb，具有8个开放阅读框，按照功能可分为三个区域：(1)早期区(E)，约4.5kb，编码E1、E2、E4-E7共6个与病毒复制、转录及转化有关的非结构蛋白；(2)晚期区(L)，约2.5kb，编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2；(3)长调控区(LCR)，其位于L区末端与E区起始端之间，长约800-900bp，不编码任何蛋白，但具有DNA复制和表达调控元件。
L1和L2蛋白在HPV感染周期的中晚期合成。L1蛋白是主要衣壳蛋白并且具有55-60kDa的分子量。L2蛋白是次要衣壳蛋白。72个L1蛋白五聚体构成二十面体HPV病毒粒子的外壳(直径为45-55nm)，其包裹闭环双链DNA。L2蛋白质位于L1蛋白质内侧(Structure ofSmall Virus-like Particles Assembled from the L1 Protein of HumanPapillomavirus 16 Chen，X.S.，R.L.Garcea，Mol.Cell.5(3)：557-567，2000)。
L1蛋白的ORF是PV基因组中最保守的基因，可以用于鉴别新的PV型。如果克隆了完整的基因组，并且L1ORF的DNA序列与最接近的已知PV型相差超过10％，则被认定为分离出新的PV型。差异在2％和10％同源性被定义为不同的亚型，差异小于2％被定义为同一亚型的不同变种(E.-M.de Villiers et al./Virology 324(2004)17-27)。
在HPV感染的后期，细胞质中新合成的L1蛋白被输送到终端分化的角蛋白细胞核中，与L2蛋白一起，包装复制的HPV基因组DNA形成传染性病毒(Nelson，L.M，etal.2002.Nuclear import strategies of high risk HPV16 L1 major capsidprotein.J.Biol.Chem.277：23958-23964)。这表明L1蛋白的核导入在HPV感染和生产中起着非常重要的作用。病毒进入细胞核的能力由HPV L1蛋白C端的核定位信号(NLS)决定，核定位信号的一个特征是富含碱性氨基酸(Garcia-Bustos，J.，et al.1991.Nuclearprotein localization.Biochimica et Biophysica Acta 1071：83-101)。
15种高风险(HR)HPV型可导致宫颈、肛门、阴茎、阴道、外阴和口咽癌。其中，HPV-16和HPV-18型是迄今最为常见的癌症起因，约占宫颈癌的70％，其余为其他HR-HPV型(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82)引起。HPV-16约占HPV阳性口咽癌(OPCs)的95％。持续低风险基因型HPV-6和HPV-11导致大多数肛门生殖器疣和呼吸道乳头状瘤，但很少与癌症相关(Human Papillomavirus in Cervical Cancer and Oropharyngeal Cancer：OneCause，Two Diseases Tara A.Bermanand John T.Schiller，PhD2 Cancer 2017；123：2219-29)。
使用痘苗病毒、杆状病毒或酵母系统重组表达L1蛋白，L1蛋白可自我装配形成病毒样颗粒(VLP)，大约含有72个L1蛋白，与病毒体外壳相似。VLP没有适应症。VLP可以在接种动物中诱导中和抗体，保护实验动物免受感染性病毒的随后攻击。因此，VLP似乎是乳头瘤病毒疫苗的优秀候选者(Structure of Small Virus-like Particles Assembled fromthe L1 Protein of Human Papillomavirus 16 Chen，X.S.，R.L.Garcea，Mol.Cell.5(3)：557-567，2000)。
葛兰素公司的是双价重组HPV疫苗。其中含有由重组杆状病毒表达载体系统在夜蛾(Trichoplusia ni)昆虫细胞中表达获得的HPV 16型重组L1蛋白和HPV18型重组L1蛋白。L1蛋白自组装成病毒样颗粒，用于预防9-25岁的妇女由16和18型HPV引起的宫颈癌，2级或3级宫颈上皮内瘤样变和原位腺癌，和1级宫颈上皮内瘤样病变(致癌)(https：//www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProducts/UCM186981.pdf)。
是默克公司生产的人乳头状瘤病毒四价(6、11、16和18型)重组疫苗，用于9-26岁的女孩和妇女用于预防宫颈癌生殖器疣(尖锐湿疣)和由HPV 6、11、16、18型引起癌前或增生异常病变；以及9-26岁的男孩和男人用于预防肛门癌、生殖器疣(尖锐湿疣)和由HPV 6、11、16、18型引起的癌前期或发育异常病变(https：//www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/vaccines/gardasil)。
是默克公司生产的人乳头状瘤病毒九价重组疫苗，包含HPV 6、11、16、18、31、33、45、52和58型L1蛋白的病毒样颗粒，该L1蛋白由酿酒酵母发酵生产，自组装为VLP。用于9-45岁的女孩和妇女用于预防HPV16、18、31、33、45、52和58型引起的宫颈癌、外阴癌、阴道癌和肛门癌，HPV6和11引起的生殖器疣(尖锐湿疣)和由HPV 6、11、16、18、31、33、45、52和58型引起癌前或或增生异常病变；以及9-45岁的男孩和男人用于预防16、18、31、33、45、52和58型引起的肛门癌，HPV 6和11引起的生殖器疣(尖锐湿疣)和由HPV 6、11、16、18、31、33、45、52和58型引起的癌前期或发育异常病变(https：//www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/vaccines/gardasil-9)。
的说明书中声称HPV16和18型是约70％的宫颈癌的发病缘由，其余的20％病例归责于31、33、45、52和58型，由是/>可以预防90％的宫颈癌的发生(https：//www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/Vaccines/ApprovedProducts/ucm426445.htm)。
HPV疫苗研制的关键因素是病毒样颗粒可进行大量生产。目前较为普遍的生产病毒样颗粒的系统主要分为真核表达系统和原核表达系统。
常用的真核表达系统有痘病毒表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统。在真核表达系统中表达的HPV L1蛋白的天然构像破坏较少，可自发装配形成病毒样颗粒，但产量较低。原核表达系统主要大肠杆菌表达系统，产量高但大多以包涵体形式存在，不利于纯化，生产工艺复杂。
因此，在本领域仍然存在获得高产量的HPV病毒样颗粒的需求。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种嵌合的人乳头瘤病毒(HPV)45型L1蛋白，自其N末端至C末端方向包含a.衍生于HPV 45型L1蛋白的N端片段，所述N端片段保持HPV 45型L1蛋白的免疫原性；和b.衍生于第二型别乳头瘤病毒L1蛋白的C端片段，所述第二型别乳头状瘤病毒L1蛋白具有相较于其他型别的L1蛋白表达量和可溶性较好的特性；其中所述嵌合的HPV45型L1蛋白具有HPV 45型L1蛋白的免疫原性。
在另一个方面，本发明提供一种HPV 45型病毒样颗粒，其包含嵌合的HPV 45型L1蛋白。
在另一个方面，本发明提供一种预防HPV相关疾病或感染的免疫原性组合物，其包含HPV 45型病毒样颗粒和佐剂。
在另一个方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其编码嵌合的HPV 45型L1蛋白。
在另一个方面，本发明提供一种载体，其包含编码嵌合的HPV 45型L1蛋白的多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供一种杆状病毒，其包含编码嵌合的HPV 45型L1蛋白多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含如上所述的多核苷酸、载体、或杆状病毒。
在另一个方面，本发明提供一种制备HPV 45型病毒样颗粒的方法，其包括培养如上所述的宿主细胞以表达所述嵌合的HPV 45型L1蛋白并组装成病毒样颗粒；以及纯化所述HPV 45型病毒样颗粒。
附图说明
图1 HPV 45 L1：33C的L1蛋白的表达。M：Marker；L：细胞裂解液；E-S：裂解液离心后收集的上清液。
图2透射电镜观察HPV 45 L1：33C病毒样颗粒。
图3 C端截短的HPV16L1(1-474)的表达。M：Marker；L：细胞裂解液；E-S：裂解液离心后收集的上清液。
具体实施方式
在一个方面，本发明提供一种嵌合的人乳头瘤病毒(HPV)45型L1蛋白，自其N末端至C末端方向包含：a.衍生于HPV 45型L1蛋白的N端片段，所述N端片段保持HPV 45型L1蛋白的免疫原性；和b.衍生于第二型别乳头瘤病毒L1蛋白的C端片段，所述第二型别乳头状瘤病毒L1蛋白具有相较于其他型别的L1蛋白表达量和可溶性较好的特性；其中所述嵌合的HPV45型L1蛋白具有HPV 45型L1蛋白的免疫原性。
在一个实施方式中，所述N端片段为将HPV 45型L1蛋白的天然序列的C末端截短于其α5区内的任一氨基酸位点而得到的片段，以及与其具有至少98％的同一性的片段；所述C端片段为将第二型别乳头状瘤病毒L1蛋白的天然序列的N末端截短于其α5区内的任一氨基酸位点而得到的片段，以及该片段进一步突变、缺失和/或添加而产生的功能性变体。
在另一个实施方式中，所述N端片段与将HPV 45型L1蛋白的天然序列的C端截短于其α5区内的任一氨基酸位点而得到的片段具有至少98.5％、99％、99.5％或100％的同一性。
在另一个实施方式中，所述C端片段含有一个或多个核定位序列。
在一个实施方式中，所述第二型别乳头瘤病毒L1蛋白选自HPV 1型、2型、3型、4型、6型、7型、10型、11型、13型、16型、18型、22型、26型、28型、31型、32型、33型、35型、39型、42型、44型、45型、51型、52型、53型、56型、58型、59型、60型、63型、66型、68型、73型或82型L1蛋白；
优选地，所述第二型别乳头瘤病毒L1蛋白选自HPV 16型、28型、33型、59型、或68型L1蛋白；
更优选地，所述第二型别乳头瘤病毒L1蛋白选自HPV 33型或HPV 59型L1蛋白。
在一个实施方式中，所述第二型别乳头瘤病毒L1蛋白为HPV 33型L1蛋白，所述C端片段为SEQ ID No：2；或其长度为m个氨基酸的片段，优选涵盖SEQ ID No：2的第1-m位氨基酸的片段；其中m为8-26的整数。
在一个实施方式中，HPV 33型L1蛋白的C端片段具有一个核定位序列。在另一个实施方式中，HPV 33型L1蛋白的C端片段具有两个核定位序列。在一些实施方式中，嵌合的HPV45型L1蛋白包含一个或多个HPV 33型L1蛋白的C端片段。所述多个HPV 33型L1蛋白的C端片段可以相同也可以不同。在一个实施方式中，SEQ ID No：2的氨基酸编号7-8的氨基酸序列(KR)和氨基酸序列编号20-23的氨基酸序列(KRKK)为HPV 33型L1蛋白的C端片段的核定位序列。
在另一个实施方式中，所述第二型别乳头瘤病毒L1蛋白为HPV 59型L1蛋白，所述C端片段为SEQ ID No：13；或其长度为n个氨基酸的片段，优选涵盖SEQ ID No：13的第1-n位氨基酸的片段；其中n为16-38的整数。
在一个实施方式中，HPV 59型L1蛋白的C端片段具有一个核定位序列。在另一个实施方式中，HPV 59型L1蛋白的C端片段具有两个核定位序列。在一些实施方式中，嵌合的HPV45型L1蛋白包含一个或多个HPV 59型L1蛋白的C端片段。所述多个HPV 59型L1蛋白的C端片段可以相同也可以不同。在一个实施方式中，SEQ ID No：13的氨基酸编号14-16的氨基酸序列(RKR)和氨基酸序列编号28-34的氨基酸序列(KRVKRRK)为HPV 59型L1蛋白的C端片段的核定位序列。
在一个实施方式中，所述嵌合的HPV 45型L1蛋白包含HPV 33型L1蛋白的C端片段和HPV 59型L1蛋白的C端片段两者。
在一个实施方式中，所述N端片段与将SEQ ID No：1所示序列的C末端截短于其α5区内的任一氨基酸位点而得到的片段具有98％、98.5％、99％、99.5％或100％的同一性。
在一个实施方式中，所述N端片段的C末端与所述C端片段的N末端直接连接或通过接头连接。
接头不影响所述N端片段的免疫原性，且不影响蛋白的表达量或可溶性。在一个实施方式中，所述N端片段和所述C端片段通过由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸组成的接头连接。在一个实施方式中，接头是人工序列。在另一个实施方式中，接头是HPV L1蛋白中天然存在的序列。在一个实施方式中，接头可以是HPV 45型L1蛋白的部分序列。在另一个实施方式中，接头可以是HPV 33型L1蛋白的部分序列。在另一个实施方式中，接头可以是HPV59型L1蛋白的部分序列。
在一个实施方式中，当所述N端片段的C末端与所述C端片段的N末端连接时，在连接点的正负4个氨基酸位点的范围内存在以下连续氨基酸序列：RKFL；优选地，在连接点的正负6个氨基酸位点的范围内存在以下连续氨基酸序列：LGRKFL。
在一个实施方式中，嵌合的HPV 45型L1蛋白与SEQ ID No：3具有98％、98.5％、99％、99.5％或100％的同一性。
在另一个方面，本发明提供一种HPV 45型病毒样颗粒，其包含如前所述的嵌合的HPV 45型L1蛋白。在一个实施方式，HPV 45型病毒样颗粒为由72个所述嵌合的HPV 45型L1蛋白的五聚体构成的二十面体。在一个实施方式中，HPV 45型病毒样颗粒具有正确形成的二硫键，因而具有良好的天然构象。在一个实施方式中，HPV 45型病毒样颗粒在体内表达系统中自行装配。
在一个方面，本发明提供一种预防HPV相关疾病或感染的免疫原性组合物，其包含根据如前所述的HPV 45型病毒样颗粒和佐剂。所述预防可被认为是治疗，两者可互换使用。
在一个方面，将上述免疫原性组合物施用至受试者。在一个实施方式中，受试者是人。
在一个方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其编码如前所述所述的嵌合的HPV45型L1蛋白。在一个实施方式中，多核苷酸为针对不同表达系统进行密码子优化后的多核苷酸。在一个实施方式中，多核苷酸为针对昆虫杆状病毒表达系统进行密码子优化后的多核苷酸。
在一个方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，其具有SEQ ID No：4所示的序列。
在一个方面，本发明提供一种载体，其包含如前所述的多核苷酸。在一个实施方式中，载体是杆状病毒载体。在一个实施方式中，载体可以是用于杆状病毒表达系统的转移载体。在另一个实施方式中，载体可以是用于杆状病毒表达系统的表达载体。在另一个实施方式中，载体可以是用于杆状病毒表达系统的重组后的载体。
在一个方面，本发明提供一种杆状病毒，其包含如前所述的多核苷酸。
在一个方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含如前所述的多核苷酸、载体、或杆状病毒。在一个实施方式中，宿主细胞为昆虫细胞，优选地，所述昆虫细胞选自Sf9细胞、Sf21细胞、Hi5细胞和S2细胞。
在一个方面，本发明提供一种制备根据如前所述的HPV 45型病毒样颗粒的方法，其包括：培养如前所述的宿主细胞以表达所述嵌合的HPV 45型L1蛋白并组装成病毒样颗粒；以及纯化所述HPV 45型病毒样颗粒。
在一个实施方式中，宿主细胞为昆虫细胞。在一个实施方式中，宿主细胞为Hi5细胞。在一个实施方式中，嵌合的HPV 45型L1蛋白在宿主细胞中自行装配成HPV 45型病毒样颗粒。在一个实施方式中，嵌合的HPV 45型L1蛋白在宿主细胞中自行装配成HPV 45型病毒样颗粒，其具有由72个所述嵌合的HPV 45型L1蛋白的五聚体构成的二十面体。在一个实施方式中，HPV 45型病毒样颗粒具有正确形成的二硫键，从而具有良好的天然构象。
在一个实施方式中，纯化采用阳离子交换层析。在一个实施方式中，纯化采用强阳离子交换层析。在另一个实施方式中，纯化采用弱阳离子交换层析。在一个实施方式中，纯化采用多次阳离子交换层析的组合。在一个实施方式中，纯化采用HS强阳离子交换层析。在另一个实施方式中，纯化采用MMA离子交换层析。在另一个实施方式中，纯化采用HS-MMA两步层析。
真核表达系统表达的乳头瘤病毒L1蛋白能自发装配成病毒样颗粒，但具有表达量低不易规模化生产的缺点。
各型别HPV的L1蛋白的序列可以从https：//www.uniprot.org方便地获得。每一型别的HPV L1可以来源于不同的毒株，因而其氨基酸序列有多个版本，其中任何一个版本的天然序列都可以用于本发明，本发明的构思和设计过程中，所用某一给定型别的HPV L1蛋白序列有可能不同于实施例中使用的序列，但是这种差异不影响发明人的判断和结论。
本领域技术人员普遍认为L1蛋白的C端不含有主要中和抗原表位，因此试图通过截短HPV L1蛋白的C端提高表达量，例如葛兰素公司的美国专利US6361778B1中，HPV16 L1蛋白C端截短1-34个氨基酸，优选26个氨基酸，声明VLP的产量增加许多倍，最好至少增加10倍，特别是大约10到100倍。受此启发，发明人尝试将HPV 16型L1的C端截短31个氨基酸，命名为HPV16 L1(1-474)。但其蛋白表达量高但蛋白可溶性差，难以提取纯化(见对比例)。
这种截短引起的蛋白可溶性差有可能是C端的核定位序列的缺失造成的，本发明并不受限于此推测。发明人在研究和生产过程中发现HPV 16型L1蛋白、HPV 28型L1蛋白、HPV 33型L1蛋白、HPV 59型L1蛋白和HPV 68型L1蛋白相较于其他型别的L1蛋白表达量和可溶性较好，受此启发，发明人用表达量和可溶性较好型别的L1蛋白C端替换不易提取或表达量低的HPV型别的C端。即发明人构建了这样一种嵌合蛋白：自其N末端至C末端方向包含衍生于第一型别乳头瘤病毒L1蛋白(例如HPV L1蛋白)的N端片段和衍生于第二型别乳头瘤病毒L1蛋白(例如HPV L1蛋白)的C端片段，前者提供第一型别乳头瘤病毒(例如HPV)的免疫原性，后者提供表达量和可溶性较好的特性。两者可以直接连接也可以通过接头连接。
为保持第一型别HPV L1蛋白的免疫原性，以及保证其能够形成VLP，发明人确定了合适的HPV L1蛋白的N端片段的长度。以下报道涉及常见HPV亚型的表位研究：
Sunanda Baidya等人报道，L1蛋白的表位48EEYDLQFIFQLCKITLTA65，45RHGEEYDLQFIFQLCKITLTA65，63LPDPNKF69，79PETQRLVWAC88，36PVPGQYDA43，77YNPETQRLVWAC88，188DTGYGAMD195，36PVPGQYDATK45，45KQDIPKVSAYQYRVFRV61，130RDNVSVDYKQTQLCI144 and 49YSRHVEEY DLQFIF62可以用作设计HPV16和18型疫苗的工具(参见Epitope design of L1 protein for vaccine production against HumanPapilloma Virus types 16 and 18，Bioinformation 13(3)：86-93 March 2017，通过引用全部并入本文)。
Katharina Slupetzky等人报道HPV-16的aa 282-286及351-355附近的区域对于中和表位有贡献，而且后者是免疫优势位点(参见Chimeric papillomavirus-likeparticles expressing a foreign epitope on capsid surface loops，Journal ofGeneral Virology(2001)，82，2799-2804，通过引用全部并入本文)。
Brooke Bishop等人制备了HPV11、16、18和35L1蛋白的以下3种变体：其N端9个氨基酸缺失、α4(对应于HPV16的404-436位氨基酸残基)缺失、其C端31个氨基酸缺失，报道前两者不能组装成VLP，但是未报道后者有此现象
(Crystal Structures of Four Types of Human Papillomavirus L1 CapsidProteins UNDERSTANDING THE SPECIFICITY OF NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODIES，The Journal of Biological Chemistry，282，31803-31811。通过引用全部并入本文)。各型别的HPV L1蛋白的α螺旋、β折叠片各个Loop区都可以通过本领域常用的序列分析软件方便地确定。其中α螺旋区包含α1区、α2区、α3区、α4区和α5区。
发明人对14种型别(6型、11型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型和59型)的HPV L 1蛋白进行序列比对，然后根据如上引用的文献(CrystalStructures of Four Types of Human Papillomavirus L1 Capsid ProteinsUNDERSTANDING THE SPECIFICITY OF NEUTRALIZING MONOCLONAL ANTIBODIES，TheJournal of Biological Chemistry，282，31803-31811)进行二级结构预测，结果如下所示，其中向下的箭头之间的部分对应于该文献中涉及的为制备变体而缺失的区域。
除发明人所用的序列对比的方法之外，可用于预测的蛋白质二级结构预测软件包括但不限于：
1.JPred：http：//www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/index.html
2.ProtPredicct：http：//predictprotein.org
3.PsiPred：http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred
4.SCRATCH-1D：http：//download.igb.uci.edu
5.Nnpredict：http：//www.cmpharm.ucsf.edu/～nomi/nnpredict
6.Predictprotein：http：//www.embl-heidelberg.de/predictprotein/ SOPMAhttp：//www.ibcp.fr/predict.html
7.SSPRED：http：//www.embl-heidelberg.de/sspred/ssprd_info.html。
在本发明的一个实施方式中，发明人以以下方式确定衍生于第一型别的HPV L1蛋白的N端片段的长度：将L1蛋白天然序列在其α5区及其附近区域截短，保留从其N末端至α5区域新产生的C末端的序列。如此截短的序列可以保证其具有本型别的免疫原性，且能够形成VLP。
衍生于第一型别的HPV L1蛋白的N端片段还可以进一步改造，以保证其具有本型别的免疫原性，且能够形成VLP为限。
发明人以以下方式确定了衍生于第二型别的HPV L1蛋白的C端片段的长度。将L1蛋白天然序列在其α5区及其附近区域截短、保留从其α5区域新产生的N末端至C末端序列。如此截短的序列不具有主要中和抗原表位，不干扰形成的嵌合蛋白的免疫原性。
衍生于第二型别的HPV L1蛋白的C端片段还可以进一步突变、缺失和/或添加，优选保留其至少一个核定位序列。Yang等人预测了107种HPV亚型的核定位序列(Yang et alPredicting the nuclear localization signals of 107 types of HPV L1 proteinsby bioinformatic analysis.Geno.Prot.Bioinfo.Vol.4 No.1 2006通过引用全部并入本文)，各型别的HPV L1蛋白的核定位序列可以通过本领域常用的序列分析软件方便地确定。
上述N端片段和C端片段的连接发生在前者的新产生的C末端和后者的新产生的N末端。可以是直接连接也可以是通过接头连接。将连接点视为原点，则在原点的N端侧为负，而其C端侧为正。
如下示出HPV6L1蛋白的453-469位氨基酸序列、以及多个型别HPV L1蛋白的与之相对应的一段序列。可以看出这些序列高度相似。这段序列和α5区有重合。括号内数字表示所列出序列的最后一位氨基酸的位置，其中对于HPV 45型，一些HPV 45型毒株的L1蛋白的N端存在额外的26个氨基酸，而在另一些HPV 45型毒株的L1蛋白的N端不存在所述额外的26个氨基酸，所以以(478)+26表示。
HPV33DLDQFPLGRKFLLQAGL(473)KAKPKLKRAAPTSTRTSSAKRKKVKK其中，480-481的KR 和493-496位的KRKK是核定位序列。
HPV59
DLDQFPLGRKFLLQLGA(475)RPKPTIGPRKRAAPAPTSTPSPKRVKRRKSSRK，其中，484-486 的RKR和498-504的KRVKRRK是核定位序列。
在本发明的一个实施方式中，发明人借助多个HPV型别之间的α5区及其附近区域的序列相似性，便利地完成了不同型别之间的L1蛋白的C端替换。
在本发明的最优选的实施方式中，发明人注意到各个型别的HPV L1蛋白都在相似的位置具有一段四肽RKFL，更有利的情形是一段六肽LGRKFL。发明人巧妙地利用这一高度保守的序列，将嵌合蛋白的连接点设计在这一段寡肽的任一氨基酸位点。自一个方面看来，自嵌合蛋白N末端起至RKFL或LGRKFL止与衍生于第一型别的HPV L1蛋白的N端片段的序列相同，而从另一方面看来自RKFL或LGRKFL起至嵌合蛋白的C末端止，与衍生于第二型别的L1蛋白的C端片段的序列相同。
如此产生的嵌合蛋白保持与天然HPV L1蛋白高度相似性，可以预期在生产乃至此后的医疗或预防过程中，都会有良好的表现。
本领域的技术人员会理解，因为同一型别的HPV有不同的毒株，因此其天然序列不同，利用不同毒株构建而成的嵌合蛋白亦落入本发明。
本领域的技术人员会理解，因为不同型别HPV L1的高度相似性，如果在嵌合蛋白构建过程中，将衍生于第一型别HPV L1蛋白的N端片段向C末端延伸更多的氨基酸残基，或者是将衍生于第二型别的HPV L1蛋白的C端片段向N末端延伸更多的氨基酸残基，亦有可能因相应位点上氨基酸的相同或相似，形成与本发明结构一致的嵌合蛋白。如此形成的嵌合蛋白亦落入本发明。
本领域的技术人员会理解，在以上描述的实施方式的嵌合蛋白的基础上，会通过氨基酸残基的突变、缺失和/或添加形成嵌合蛋白的变体。这些变体有可能具有第一型别的HPV L1蛋白的免疫原性、可以形成VLP，且具有良好的产量和可溶性。如此形成的嵌合蛋白亦落入本发明。
发明的有益效果
目前普遍用于生产病毒样颗粒的表达系统分为真核表达系统和原核表达系统。真核表达系统表达的乳头瘤病毒L蛋白能自发装配成病毒样颗粒，但具有表达量低不易规模化生产的缺点。原核表达系统表达的乳头瘤病毒L蛋白的天然构象往往被破坏，需要后期进行体外处理才能得到病毒样颗粒，而且产量较低，很难进行产业化。
本发明将乳头瘤病毒(例如人乳头瘤病毒)L蛋白的C端进行改造，例如替换为HPV16型L1蛋白、HPV 28型L1蛋白、HPV 33型L1蛋白、HPV 59型L1蛋白或HPV 68型L1蛋白中的C端片段，可以在表达系统(例如宿主细胞，例如昆虫细胞)中提高乳头瘤病毒L蛋白的表达量和可溶性。这可用于疫苗例如HPV疫苗的大规模生产。
发明人自行发现HPV 16型L1蛋白、HPV 28型L1蛋白、HPV 33型L1蛋白、HPV 59型L1蛋白和HPV 68型L1蛋白相较于其他型的L1蛋白表达量和可溶性较好，且发现所述增加的蛋白表达量和可溶性取决于所述HPV L1蛋白的C端序列。在107型HPV L1蛋白中，大部分在C端具有核定位序列，且C端序列具有一定的相似性。
对于目前无法表达、表达量非常低或表达后不可溶的乳头瘤病毒L蛋白，将其C端片段替换为HPV 16型L1蛋白、HPV 28型L1蛋白、HPV 33型L1蛋白、HPV 59型L1蛋白或HPV 68型L1蛋白中的C端片段，使得原本表达量极低或不可溶的乳头瘤L蛋白的可溶性表达和后续纯化成为可能。这可以用于更多价疫苗(例如HPV疫苗)的大规模生产，使得更全面地预防多种乳头瘤病毒，特别是HPV的感染成为可能。
HPV 45型L1蛋白在昆虫细胞中表达量低且可溶性差，不利于后续纯化和疫苗的生产。此外，在酵母细胞中，因为无法正确形成二硫键，HPV 45型L1蛋白装配成的病毒样颗粒缺乏良好的构象。
本发明的嵌合的HPV 45型L1蛋白相比于未改造之前的HPV 45型L1蛋白在昆虫细胞中的表达量和可溶性大大提高。可用于HPV 45型疫苗的大规模生产。此外，嵌合的HPV 45型L1蛋白在昆虫细胞中可以正确形成二硫键而装配为具有良好构象的HPV 45型病毒样颗粒。这可以提高HPV 45型病毒样颗粒的免疫原性，产生更好的免疫应答。
定义
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的技术领域的普通技术人员通常理解的含义。为方便地理解本发明，以下引述下列术语的通常含义。
当用于本文和所附权利要求书中时，单数形式“一个/种”、“另一个/种”和“所述/该”包括复数指代对象，除非上下文明确地另有指示。除非另有明确说明，否则术语“包括/包含/具有”、“例如”等旨在传达包含而非限制。
术语“免疫原性”是指某种物质，例如蛋白质或多肽刺激免疫应答的能力，即刺激产生抗体，尤其是产生体液或者刺激细胞介导的应答的能力。
术语“抗体”指能结合抗原的免疫球蛋白分子。抗体可以是多克隆混合物或单克隆。抗体可以是源于天然来源或源于重组来源的完整的免疫球蛋白或可以是完整的免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体可以存在于多种形式，包括例如Fv、Fab’、F(ab’)2以及以单链存在。
术语“抗原性”是指某种物质，例如蛋白质或多肽产生与其特异性结合的抗体的能力。
术语“表位”包括能够特异性结合至抗体或T细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链，或其组合)组成，并且通常具有特定三维结构特征以及特定的电荷特征。
术语“亚型”或“型别”可在本文中互换使用，表示所述病毒抗原的遗传变体以使得一个亚型区别于一个不同亚型地被免疫系统识别。例如，HPV 16在免疫学上可区别于HPV33。
术语“HPV L1蛋白”如本文所用，术语“HPV”和“人乳头状瘤病毒”是指乳头状瘤病毒科的无包膜双链DNA病毒。它们的基因组是圆形的，并且大小约为8千碱基对。大多数HPV编码八种主要蛋白，六种位于“早期”区域(E1-E2)，并且两种位于“晚期”区域(L1(主要衣壳蛋白)和L2(次要衣壳蛋白))。已经鉴定了超过120种HPV类型，并且它们由数字标出(例如，HPV-16、HPV-18等)。
术语“HPV”或“HPV病毒”指乳头状瘤病毒科的乳头状瘤病毒，为无包膜DNA病毒，该病毒基因组为双链闭环DNA，大小约为8kb，通常可以分为三个区域：①早期区(E)，含有编码E1、E2、E4～E7病毒复制，转录及转化有关的非结构蛋白的6个开放阅读框，以及E3和E8开放阅读框；②晚期区(L)含有编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2的阅读框；③长调控区(LCR)不编码任何蛋白，但具有复制的起源以及多个转录因子结合位点。
术语“HPV L1蛋白”及“HPV L2蛋白”指由HPV基因的晚期区(L)编码，在HPV感染周期中晚期合成的蛋白。L1蛋白质是主要的衣壳蛋白并且具有55-60kDa的分子量。L2蛋白质是次要的衣壳蛋白质。72个L1五聚体构成二十面体HPV病毒粒子的外壳，包裹闭环双链DNA微染色体。L2蛋白质位于L1蛋白质内侧。
术语“病毒样颗粒”是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒核酸。
“HPV假病毒”系利用HPV VLP的非特异包裹核酸的特性，通过细胞内表达的HPV L1和L2组成的VLP包裹游离的DNA或导入外源质粒形成。是理想的HPV体外中和实验模型。
“假病毒中和法”是评价抗体的中和活性的一种方法，将免疫后的动物血清与一定量的假病毒孵育后再侵染细胞，细胞会随着血清中中和抗体的增加而减少，在一定的范围内可存在线性负相关，因此可以通过检测表达细胞数的变化来评价血清中抗体的中和活性。
术语“其片段”或“其变体”指根据本发明的部分核苷酸或氨基酸序列被缺失、插入和/或取代。优选地，本发明提供的多肽的片段或变体能在动物或人体中引发体液和/或细胞免疫应答。
术语“嵌合”意指，源自不同的亲本分子的多肽或核苷酸序列分别经由酰胺键或3’，5’-磷酸二酯键连接在一起。优选的，不被额外的接头序列分隔开，而是直接彼此相邻。
术语“截短”意指通过从多肽的N和/或C-末端除去一个或多个氨基酸或者缺失一个或多个多肽内部的氨基酸。
术语“核定位序列”为可引导蛋白质进入细胞核的氨基酸序列。在一些HPV L1蛋白中，两个紧密的碱性残基簇(即核定位序列)(例如一个是KRKR、KRKK、KRKRK、KRKKRK、KRVKRRK等，另一个是KR、RKR、KRK等)之间具有10-14个氨基酸的间隔区。上述碱性残基簇属于核定位序列。在另一些HPV L1蛋白中，核定位序列为精氨酸和/或赖氨酸形成的紧密的碱性残基簇。核定位序列包括但不限于如上所述碱性残基簇的实例。参见Jun Yang等，Predicting the Nuclear Localization Signals of 107 Types of HPV L1 Proteinsby Bioinformatic Analysis，Genomics，Proteomics&Bioinformatics Volume 4，Issue1，2006，Pages 34-41，其全部内容通过引用并入本文。
术语“功能性变体”为某一多肽或蛋白经截短、突变、缺失和/或添加后仍然保持所需要的活性或特征的版本。
两条多肽或核酸序列之间的“序列同一性”表示所述序列之间相同的残基的数目占残基总数的百分比，且基于比较的分子中较小者的大小来计算。在计算同一性百分数时，将正在比较的序列以产生序列之间最大匹配的方式比对，通过特定算法解决比对中的空位(如果存在的话)。确定两个序列之间同一性的优选计算机程序方法包括，但不限于，GCG程序包，包括GAP、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)。上述程序可以公开地从国际生物技术信息中心(NCBI)和其他来源得到。熟知的SmithWaterman算法也可用于确定同一性。
可以保守性置换非关键的氨基酸而不影响蛋白质的正常功能。保守性置换意指用化学或功能相似的氨基酸置换氨基酸。提供相似氨基酸的保守性置换表是本领域熟知的。举例来说，在一些实施方式中，表1-3中提供的氨基酸组被认为是相互的保守性置换。
表1在某些实施方式中，被认为是相互保守性置换的氨基酸的所选组
酸性残基 D和E
碱性残基 K、R和H
亲水性不带电荷的残基 S、T、N和Q
脂肪族不带电荷的残基 G、A、V、L和I
非极性不带电荷的残基 C、M和P
芳香族残基 F、Y和W
表2在某些实施方式中，被认为是相互的保守性置换的氨基酸的其他所选组
组1 A、S和T
组2 D和E
组3 N和Q
组4 R和K
组5 I、L和M
组6 F、Y和W
表3在某些实施方式中，被认为是相互的保守性置换的氨基酸的其他所选组
术语“氨基酸”意指二十种常见的天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)；谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。
术语“佐剂”指一种增强免疫应答的化合物或混合物。特别的，疫苗可以包含佐剂。用于本发明的佐剂可以包括但不限于以下的一种或多种：含矿物佐剂组合物、油-乳佐剂、皂素佐剂制剂、细菌或微生物衍生物。
术语“载体”意指能够增殖与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及作为整合至已引入载体的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够引导该类载体以可操作方式连接的核酸的表达。
术语“宿主细胞”意指已引入外源核酸的细胞，以及这样的细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”(或“转化细胞”)、“转染体”(或“转染细胞”)或“感染体”(或“感染细胞”)，其各自包括初代转化、转染或感染的细胞和由其衍生的后代。这样的后代在核酸含量上可能不与亲本细胞完全相同，并且可能含有突变。
施用量优选的为“预防性有效量”(本文预防可以被认为是治疗，两者可互换使用)，其足以对个体显示出益处。
实施例
实施例1：HPV45L1 C端替换为HPV33L1 C端的嵌合基因的构建
1.1用作模板的pFB-HPV45L1的构建
委托Thermo Fisher公司[原英潍捷基(上海)贸易有限公司]基因合成HPV45L1基因，且合成的序列两端分别具有KpnI和XbaI酶切位点，其序列见SEQ ID NO：5。通过KpnI和XbaI酶切位点将合成的基因片段与pcDNA3载体(销售商Thermo Fisher)连接，得到含有编码HPV45L1 27-539个氨基酸的核苷酸序列的质粒pcDNA3-HPV45-L1。
将得到的pcDNA3-HPV45-L1质粒进行KpnI和XbaI双酶切得到HPV45L1(27-539)的基因的片段。再将该片段与KpnI和XbaI双酶切的pFastBacTM1载体(销售商Thermo Fisher)进行连接，得到含HPV45L1(27-539)基因片段的杆粒载体，命名为pFB-HPV45L1。
1.2用作模板的pFB-HPV33L1的构建
委托Thermo Fisher公司[原英潍捷基(上海)贸易有限公司]基因合成HPV33L1基因，且合成序列两端分别具有KpnI和XbaI酶切位点，基因片段序列见SEQ ID NO：6。通过KpnI和XbaI酶切位点将合成的基因片段与pcDNA3载体(销售商Thermo Fisher)连接，得到含有编码HPV33L1 1-499位氨基酸的核苷酸序列的质粒pcDNA3-HPV33-L1。
将得到的pcDNA3-HPV33-L1质粒进行KpnI和XbaI双酶切得到HPV33L1(1-499)的基因的片段。再将该片段与KpnI和XbaI双酶切的pFastBacTM1载体(销售商Thermo Fisher)进行连接，得到含HPV33L1(1-499)基因片段的杆粒载体，命名为pFB-HPV33L1。
1.3 pFB-HPV45L1：33C的构建
HPV45L1 C端替换为HPV33L1 C端的嵌合基因：以构建成功的重组质粒pFB-HPV45L1为基因模板，用引物F1和R1扩增长度为1453bp基因片段，引物序列F1如SEQ ID No：7所示，R1如SEQ ID No：8所示。
该基因片段包含编码HPV45L1的1-478氨基酸的基因片段、与HPV33L1的474-499氨基酸的基因片段重叠的10个碱基以及KpnI酶切位点(GGTAC^C)段，扩增的序列如SEQ IDNo：9所示：
PCR扩增参数：94℃预变性5min；98℃变性10s、69℃退火15s、72℃1kb/1min、进行30个循环；72℃延伸5min；16℃结束。
以重组质粒pFB-HPV33L1为基因模板，用引物F2和R2，扩增长度101bp的基因片段，引物序列F2如SEQ ID No：10所示，R2如SEQ ID No：11所示。
该基因片段含HPV33L1C端的26个(474-499)氨基酸的基因片段、与HPV45L1的1-478氨基酸C端基因片段重叠的10bp碱基以及XbaI(T^CTAGA)酶切位点，扩增的序列如SEQID No：12所示。
PCR扩增参数：94℃预变性5min；98℃变性10s、69℃退火15s、72℃1kb/1min、进行30个循环；72℃延伸5min；16℃结束。
PCR拼接序列：
拼接引物分别为F1和R2，以上述引物扩增得到的片段(F1和R1扩增得到的片段，F2和R2扩增得到的片段)为模板。
PCR拼接参数：94℃预变性5min；98℃变性10s、52℃退火15s、72℃1kb/1min、进行5个循环；98℃变性10s、68℃退火15s、72℃1kb/1min、进行25个循环；72℃延伸5min；16℃结束。
最终得到SEQ ID NO：4，编码由HPV45L1的1-478氨基酸和HPV33L1 C端的26个(474-499)氨基酸组成的核苷酸序列，两端带有KpnI和XbaI酶切位点(下称拼接序列)。
用KpnI+XbaI双酶切pFastBacTM1载体和拼接序列片段，将拼接序列克隆到pFastBacTM1载体上，获得重组质粒pFB-HPV45L1：33C。即为HPV45L1 C端替换为HPV33L1 C端的嵌合基因。
实施例2：HPV 45L1：33C重组杆状病毒包装
实施例1构建的pFB-HPV 45L1：33C的重组质粒经鉴定和测序正确后，将其转化至DH10Bac细菌感受态细胞(试剂盒，购于Thermo Fisher)中，37℃培养扩增，并进行平皿划线培养，挑选白色菌斑并扩增，培养过夜后收集菌液，使用碱裂解法提取重组杆粒DNA。
用阳离子转染试剂(购于Sino Biological)将其转染至昆虫细胞SF9中进行重组杆状病毒毒种包装。具体操作如下：
a.取对数生长期的SF9细胞按照0.6×106cell/dish的密度接种dish，将接种有SF9细胞的dish室温放置2h，贴壁。
b.提取的质粒20μL Bacmid DNA加至200μL Grace’s Medium(无血清，无添加物，购于Gibico)混和颠倒5次。
c.25μL 0.2x TF1(转染试剂，购于Sino Biological)滴加至200μL Grace’sMeduim轻轻混匀。
d.将b和c混合。室温孵育15-45min。
e.当DNA与cellfectin(购于Sino Biological)孵育时，弃细胞上清，添加无血清添加物的Grace Medium 0.8mL/dish。
f.将d中孵育好的DNA与转染试剂复合物滴加到dish中。
g.27℃孵育2hr。
h.弃细胞培养液，加2.5mL/dish完全生长培养基(SCD6 SF+10％FBS)(SCD6SF购于Sino Biological，FBS购于Gibico)。
i.27℃培养7天观察是否有病毒感染。
转染后待细胞产生明显的病变后收集病毒上清，一般培养7-11天。用移液器无菌收取病毒上清液，即为HPV45L1：33C P1代毒种。使用HPV45L1：33C P1代毒种按照1∶50(V/V)比例感染SF9细胞，SF9细胞的感染密度为2×106cells/mL，27℃培养扩增3天，1000g±200g室温离心10min，收集的病毒上清液即为P2代病毒，可用于感染生产。
实施例3：HPV 45L1：33C表达生产
用实施例2中获得的含有HPV 45L1：33C重组基因的杆状病毒感染High Five细胞，感染比例1∶200(V/V)，1000g±100g室温离心收集细胞沉淀，使用PBS或MOPS缓冲液(pH6.0-7.0，盐浓度100mM-1M)超声裂解细胞沉淀，低温超声破碎3min，大于10000g的离心力离心10分钟，收集离心后上清液，SDS-PAGE电泳检测。泳道1：Marker(Marker为7种纯化后的蛋白，分子量大小包含14.4至116kDa，生产商为Thermo Scientific)；泳道2：细胞裂解液；泳道3：裂解液离心后收集的上清液。
结果如图1所示，该方法制备的HPV 45L1：33C L1蛋白产量大于100mg/L，蛋白大小约56KD，可以用于大规模生产。
实施例4：HPV 45L1：33C病毒样颗粒的纯化制备
HPV 45L1：33C病毒样颗粒纯化方法为两步层析法，即HS-MMA法，纯化实施例3中收集的上清液，最终可得到高纯度的病毒样颗粒。
第一步层析：
介质：采用Thermo Fisher公司生产的50HS强阳离子交换介质。
介质体积：介质体积150mL，线性流速30mL/min。
层析条件：平衡缓冲液(pH6.2，盐浓度为50mM磷酸盐，0.5M氯化钠)；清洗缓冲液(盐浓度为50mM磷酸盐，0.75M氯化钠，pH6.2；)
层析柱先用5CV平衡缓冲液，然后上样。上样结束后，之后分别用5CV的平衡缓冲液和清洗缓冲液洗脱杂蛋白。
洗脱条件：pH6.2，洗脱盐浓度为1.25M氯化钠采用含有50mM盐酸精氨酸的50mM磷酸盐缓冲液进行洗脱。
第二步层析：
介质：采用上海博格隆公司生产的MMA离子交换介质。
介质体积：介质体积150mL，线性流速30mL/min。
层析条件：平衡缓冲液50mM PB，1.25M NaCl，pH6.2。层析柱先用4CV平衡缓冲液平衡，然后上样。上样结束后，用5CV平衡缓冲液冲洗杂蛋白后，然后用洗脱缓冲液洗脱目标蛋白收集蛋白。
洗脱条件：100mM NaAC，150mM NaCl，0.01％Tween 80，pH4.5。
实施例5：HPV 45L1：33C病毒样颗粒的形态学检测
取10μL样品用于透射电镜观察。将样品固定到碳喷铜网上吸附2min，残余液体用滤纸吸掉，再使用磷钨酸(北京中镜科仪技术有限公司，浓度2％，pH6.5)染色两次，每次30秒，残余染色液用滤纸吸掉，晾干后即可在透射电子显微镜下观察。透射电子显微镜(品牌：日立，型号：H-7650)为80KV，放大倍数为80，000倍。电镜观察结果见图2，由图2可见，C端改造的HPV 45L1：33C可以形成大小均一的病毒样颗粒，平均直径在60nm左右。
实施例6：HPV 45L1：33C病毒样颗粒动物免疫原性评价
6.1假病毒中和细胞的模型建立
由于HPV很难进行体外培养，又具有较强的宿主特异性，很难在除人体以外的生物体进行繁殖，缺乏合适的动物模型。所以需要建立合适有效的体外中和实验模型，用于疫苗免疫保护性的评估。
HPV假病毒是理想的HPV体外中和实验模型：利用HPV VLP具有非特异包裹核酸的特性，细胞内表达的HPV L1和L2组成的VLP包裹游离的DNA或导入外源质粒形成HPV假病毒。
采用假病毒中和法对样品免疫后动物血清样品进行免疫原性分析。HPV45病毒样颗粒样品免疫动物后能产生针对HPV45的中和抗体，能中和HPV45型的假病毒。将免疫后的动物血清与一定量的假病毒孵育后再侵染细胞，可表达GFP荧光的细胞会随着血清中中和抗体的增加而减少，在一定的范围内可存在线性负相关，因此可以通过检测表达GFP的细胞数的变化来评价血清中抗体的中和活性。
假病毒构建方法：将HPV45型的pCMV3-3-HPV45L1+L2(L1序列来源于UniprotP36741，L2序列来源Uniprot P36761)质粒(购于Sino Biological)以及荧光质粒(PSEU-GFP Spark，购于Sino Biological)共转染至293FT贴壁细胞(购于Thermo Fisher)。具体方法参考文献(Pastrana D V，Buck C B，Pang Y S，Thompson C D，Castle P E，FitzGeraldP C，Kjaer S K，Lowy D R，Schiller J T.Reactivity of human sera in a sensitive，high-throughput pseudovirus-based papillomavirus neutralization assay forHPV16 and HPV18.[J]Virology 2004，321：205-216.)。收集假病毒上清液并进行分装，置于-80℃冰箱中保存备用。
6.2 HPV 45L1：33C病毒样颗粒动物免疫保护性评价
小鼠免疫程序：
HPV 45L1：33C病毒样颗粒吸附于磷酸铝佐剂上，经混合后取200μL用于免疫小鼠，每只小鼠免疫剂量0.15μg，免疫10只小鼠，于实验第0天、第7天、第21天分别用稀释后样品对小鼠进行免疫，同时设立空白血清对照组，于实验第28天摘取小鼠眼球取血，分离出血清进行假病毒中和滴度检测。
小鼠EC50检测：
小鼠血清在56℃灭活30分钟后，离心6000g，5分钟后取上清进行检测。检测前4-8小时，将293FT细胞以15000细胞/孔的密度铺板于96孔板中，培养于37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中。免疫后小鼠血清、空白对照血清均用中和培养基系列稀释后按照体积比1∶1分别与6.1中制备的HPV45假病毒混合。2～8℃冰箱中孵育1小时后按照100μL/孔加入到提前4-8小时铺板的293FT细胞上，每个样品2个复孔，同时设立空白血清对照孔、假病毒阳性对照孔和阴性对照孔。加样后的细胞继续在37℃，5％CO2的二氧化碳培养箱中培养62-96小时后，在酶联斑点分析仪中(型号：S6 Universal-V Analyzer，厂家：CTL)进行荧光扫描拍照以及计数。通过计算每个小鼠血清样品的中和抑制率，依据Reed-Muench法计算得到血清中和抑制率为50％时血清最大稀释倍数，即半数有效稀释倍数EC50。
HPV45血清假病毒中和滴度检测结果详见表4。
表4小鼠血清中和滴度检测结果EC50(GMT±SEM)
备注：
1.动物数，N＝10；
2.GMT(Geometric Mean Titer)：几何平均滴度；
3.SEM(Standard Error of Mean)：标准误差。
上述检测结果显示，本发明制备的HPV 45L1：33C病毒样颗粒具有较好的免疫原性，可在动物体内产生高滴度的中和抗体，可以用于制备成预防HPV感染的疫苗。
比较例1：C端截短的HPV16L1(1-474)的表达
发明人尝试将HPV16L1的C端截短31个氨基酸，命名为HPV16L1(1-474)(SEQ IDNO：14)。但在研究中发现，截短的HPV16L1(1-474)蛋白表达量高但蛋白可溶性差，难以提取纯化，具体表达和提取结果见图3。
虽然前述已经用说明和实施例的方式对本发明进行了细节描述，但其目的在于理解方便，本领域普通技术人员显然可以对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，而不会偏离附加的权利要求的精神或范围。
附录1：序列表
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Claims (16)

1.一种嵌合的HPV 45型L1蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No:3所示。
2.一种HPV 45型病毒样颗粒，其包含权利要求1所述的嵌合的HPV 45型L1蛋白。
3.根据权利要求2所述的HPV 45型病毒样颗粒，其为由72个所述嵌合的HPV 45型L1蛋白的五聚体构成的二十面体。
4.一种预防HPV 45型感染的免疫原性组合物，其包含根据权利要求2或3所述的HPV 45型病毒样颗粒和佐剂。
5.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1所述的嵌合的HPV 45型L1蛋白。
6.一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID No:4所示。
7.一种载体，其包含根据权利要求5或6所述的多核苷酸。
8.根据权利要求7所述的载体，其中所述载体为杆状病毒载体。
9.一种杆状病毒，其包含根据权利要求5或6所述的多核苷酸。
10.一种宿主细胞，其包含根据权利要求5或6所述的多核苷酸、根据权利要求7或8所述的载体、或根据权利要求9所述的杆状病毒。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其为昆虫细胞。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中所述昆虫细胞选自Sf9细胞、Sf21细胞、Hi5细胞或S2细胞。
13.一种制备根据权利要求2或3所述的HPV 45型病毒样颗粒的方法，其包括：
培养权利要求10至12中任一项所述的宿主细胞以表达所述嵌合的HPV 45型L1蛋白并组装成病毒样颗粒；以及
纯化所述HPV 45型病毒样颗粒。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述宿主细胞为Hi5细胞。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述纯化采用阳离子交换层析。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述阳离子交换层析为HS-MMA两步层析。
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