KR102351259B1 - 58형 인유두종 바이러스 엘1 단백질의 돌연변이체 - Google Patents

58형 인유두종 바이러스 엘1 단백질의 돌연변이체 Download PDF

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Abstract

돌연변이된 HPV58 L1 단백질 또는 그의 변체, 그의 암호화 서열 및 제조 방법, 및 상기를 포함하는 바이러스유사 입자를 개시하며, 상기 단백질 또는 그의 변체 및 상기 바이러스유사 입자는 적어도 2개 유형의 HPV에 대한 중화 항체를 유도할 수 있으므로, 이들을 상기 적어도 2개 유형의 HPV에 의한 감염 및 상기 감염에 의해 유발된 질병, 예를 들어 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마의 예방에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 적어도 2개 유형의 HPV에 의한 감염 및 상기 감염에 의해 유발된 질병, 예를 들어 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마를 예방하기 위한 약학 조성물 또는 백신을 제조하기 위한 상기-언급된 단백질 및 바이러스유사 입자의 용도에 관한 것이다.

Description

58형 인유두종 바이러스 엘1 단백질의 돌연변이체
본 발명은 분자 바이러스학 및 면역학의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 돌연변이된 HPV58 L1 단백질(또는 그의 변체), 상기를 암호화하는 서열, 그의 제조 방법, 및 상기를 포함하는 바이러스유사 입자에 관한 것이며, 여기에서 상기 단백질(또는 그의 변체) 및 상기 바이러스유사 입자는 적어도 2개 유형의 HPV(예를 들어 HPV58 및 HPV33, 또는 HPV58, HPV33 및 HPV52)에 대한 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고 따라서 이들을 상기 적어도 2개 유형의 HPV에 의한 감염, 및 상기 감염에 의해 유발된 질병, 예를 들어 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마의 예방에 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 적어도 2개 유형의 HPV에 의한 감염, 및 상기 감염에 의해 유발된 질병, 예를 들어 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마를 예방하기 위한 약학 조성물 또는 백신의 제조에서 상기 단백질 및 상기 바이러스유사 입자의 용도에 관한 것이다.
인유두종 바이러스(HPV)는 주로 피부 및 점막에 사마귀를 유발시킨다. HPV 유형은 종양형성과의 관련성에 따라 고위험 유형 및 저위험 유형으로 분류된다. 이 중에서, 고위험 HPV 유형에 의한 감염은 여성에서 자궁경부암을 포함한 음부암의 선두 원인인 것으로 입증되었으며; 저위험 HPV 유형은 주로 첨형 콘딜로마를 유발시킨다. HPV 감염의 예방 및 억제에 가장 유효한 방법은 HPV 백신, 특히 자궁경부암을 일으키는 고위험 HPV 유형에 대한 백신을 투여하는 것이다.
HPV의 주요 캡시드 단백질 L1은 중공 바이러스유사 입자(VLP)로 자가-조립하는 특성을 갖는다. HPV VLP는 주요 캡시드 단백질 L1의 72개 오량체로 구성된 대칭적인 20면체 구조를 갖는다(Doorbar, J. and P.H. Gallimore. 1987. J Virol, 61(9): 2793-9). HPV VLP는 구조에 대해서 천연 HPV와 고도로 유사하고, 천연 바이러스의 중화 에피토프의 대부분을 유지하며, 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있다(Kirnbauer, R., F. Booy, et al. 1992 Proc Natl Acad Sci U S A 89(24): 12180-4).
그러나, 기존의 연구들은 HPV VLP가 주로 동일한 HPV 유형에 대한 중화 항체의 생성을 유도하고, 동일한 HPV 유형에 대한 보호 면역성을 생성시키며, 소수의 고도로 상동성인 HPV 유형들간에 단지 낮은 교차-보호 효과를 가짐을 보인다(Sara L. Bissett, Giada Mattiuzzo, et al. 2014 Vaccine. 32:6548-6555). 따라서, 기존의 HPV 백신들은 매우 제한된 보호 범위를 갖는다. 일반적으로, 하나의 HPV 유형의 VLP는 단지 동일한 HPV 유형에 의한 감염의 예방에만 사용될 수 있다. 이 경우에, HPV 백신의 보호 범위를 확장시킬 필요가 있는 경우, 유일한 방법은 백신 중에 보다 많은 HPV 유형의 VLP를 부가하는 것이다. 현재, 상업적으로 입수할 수 있는 HPV 백신, 예를 들어 가르다실(Gardasil)(등록상표)(머크(Merck))(HPV16, 18, 6 및 11에 대한 4가 백신이다), 세르바릭스(Cervarix)(등록상표)(GSK)(HPV16 및 18에 대한 2가 백신이다), 및 가르다실(등록상표)9(머크)(9-가 백신이다)이 다수의 HPV 유형의 VLP들을 병용하여 제조된다. 그러나, 상기와 같은 해법은 HPV 백신의 생산비용을 크게 증가시킬 것이며, 면역화 용량의 증가로 인해 안전성 문제를 일으킬 수도 있다.
따라서, 당해 분야에서는 다수의 HPV 유형에 의한 감염, 및 상기 감염에 의해 유발된 질병, 예를 들어 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마를 예방하기 위해, 다수의 HPV 유형에 대한 보호 중화 항체의 생성을 유도할 수 있는 HPV 바이러스유사 입자의 보다 경제적이고 유효한 개발이 시급하다.
발명의 내용
본 발명은 적어도 부분적으로 발명자의 놀라운 발견, 즉 58형 인유두종 바이러스(HPV)의 L1 단백질의 특정 조각을 제2 HPV 유형(예를 들어 HPV33)의 L1 단백질의 상응하는 조각으로 치환 후, 상기와 같이 수득된 돌연변이된 HPV58 L1 단백질이 유기체에서 HPV58 및 제2 HPV 유형(예를 들어 HPV33)에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있으며, 그의 보호 효과가 HPV58 VLP와 제2 HPV 유형의 VLP의 혼합물의 효과에 필적하고, HPV58에 대한 그의 보호 효과가 상기 HPV58 VLP 단독의 경우에 필적하며, 제2 HPV 유형(예를 들어 HPV33)에 대한 그의 보호 효과가 상기 제2 HPV 유형 단독의 경우에 필적한다는 발견을 기본으로 한다.
또한, 상기 치환을 기본으로 하여, HPV58 L1 단백질의 다른 특정 조각은 제 3 HPV 유형 (HPV52 등)의 L1 단백질의 대응 조각으로 더 치환될 수 있고, 이에 수득된 이중 치환을 갖는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질은 HPV58, 상기 제2 HPV 유형 (HPV33 등) 및 제3 HPV 유형 (HPV52 등)에 대해 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있으며, 그의 보호 효과는 HPV58 VLP, 제2 HPV 유형의 VLP 및 제3 HPV 유형의 VLP의 혼합물의 경우와 필적하며, HPV58에 대한 그의 보호 효과는 HPV58 VLP 단독의 경우에 필적하며, 제2 HPV 유형 (HPV33 등) 에 대한 그의 보호 효과는 제2 HPV 유형의 VLP 단독의 경우에 필적하며, 제3 HPV 유형 (HPV52 등) 에 대한 그의 보호 효과는 제3 HPV 유형의 VLP 단독의 경우에 필적한다.
따라서, 하나의 태양에서, 본 발명은 돌연변이된 HPV58 L1 단백질 또는 그의 변체로서, 상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질은 야생형 HPV58 L1 단백질과 비교하여 하기의 돌연변이:
(1) 5 내지 70개 아미노산, 예를 들어 5 내지 60개, 15 내지 60개, 20 내지 50개, 30 내지 45개, 또는 35 내지 40개 아미노산의 N-말단 절두; 및
(2) (a) 상기 야생형 HPV58 L1 단백질의 80-87번 위치의 아미노산 잔기의, 제2 유형의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환; 또는
(b) 상기 야생형 HPV58 L1 단백질의 376 내지 383번 위치의 아미노산 잔기의, 제2 유형의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖고;
상기 변체가 상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질과 단지 하나 이상의(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개) 아미노산의 치환(바람직하게는 보존적 치환), 부가 또는 결실에 의해서만 상이하고, 상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질의 기능, 즉 적어도 2개 유형의 HPV(예를 들어 HPV58 및 HPV33, 또는 HPV58, HPV33 및 HPV52)에 대한 중화 항체의 생성을 유도하는 능력을 유지하는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질 또는 그의 변체를 제공한다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질은 (2)(a)에서 정의한 바와 같은 돌연변이를 갖고, 하기 돌연변이:
(3) 상기 야생형 HPV58 L1 단백질의376-383번 위치의 아미노산 잔기의, 제3 유형의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환; 또는
(4) 상기 야생형 HPV58 L1 단백질의144-168번 위치의 아미노산 잔기의, 제3 유형의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환을 선택적으로 더 갖는다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질은 상기 야생형 HPV58 L1 단백질과 비교하여, N-말단에 절두된 5, 15, 27, 35, 40, 60 또는 70개의 아미노산을 갖는다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질은 상기 야생형 HPV58 L1 단백질과 비교하여, N-말단에 절두된 35개의 아미노산을 갖는다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 제2 유형의 야생형 HPV는 HPV33이다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 (2)(a)에 기재된 바와 같은 상응하는 위치의 아미노산 잔기는 야생형 HPV33 L1 단백질의 54-61번 위치의 아미노산 잔기이다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 (2)(b)에 기재된 바와 같은 상응하는 위치의 아미노산 잔기는 야생형 HPV33 L1 단백질의 350-357번 위치의 아미노산 잔기이다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 제3 유형의 야생형 HPV는 HPV52이다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 (3)에 기재된 바와 같은 상응하는 위치의 아미노산 잔기는 야생형 HPV52 L1 단백질의 380-388번 위치의 아미노산 잔기이다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 (4)에 기재된 바와 같은 상응하는 위치의 아미노산 잔기는 야생형 HPV52 L1 단백질의 146-170번 위치의 아미노산 잔기이다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 야생형 HPV58 L1 단백질은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 야생형 HPV33 L1 단백질은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 야생형 HPV52 L1 단백질은 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 야생형 HPV33 L1 단백질의 54 내지 61번 위치의 아미노산 잔기는 서열번호 59에 제시된 바와 같은 서열을 갖는다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 야생형 HPV33 L1 단백질의 350 내지 357번 위치의 아미노산 잔기는 서열번호 60에 제시된 바와 같은 서열을 갖는다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 야생형 HPV52 L1 단백질의 146 내지 170번 위치의 아미노산 잔기는 서열번호 61에 제시된 바와 같은 서열을 갖는다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 야생형 HPV52 L1 단백질의 380 내지 388번 위치의 아미노산 잔기는 서열번호 62에 제시된 바와 같은 서열을 갖는다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질은 서열번호 4, 10, 11 및 14로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 상술한 바와 같은 돌연변이된 HPV58 L1 단백질 또는 그의 변체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 상기 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 단리된 핵산은 서열번호 18, 24, 25 및 28로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
관심 폴리뉴클레오타이드의 삽입에 유용한 벡터, 예를 들어 비제한적으로 클로닝 벡터 및 발현 벡터는 당해 분야에 주지되어 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지 등이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 상기 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는 비제한적으로 원핵생물 세포, 예를 들어 이 콜라이 세포, 및 진핵생물 세포, 예를 들어 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포(예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 마우스 세포, 인간 세포 등)를 포함한다. 본 발명에 따른 숙주 세포는 또한 세포주, 예를 들어 293T 세포일 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이된 HPV58 L1 단백질 또는 그의 변체를 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 HPV 바이러스유사 입자에 관한 것이다.
일부 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자는 야생형 HPV58 L1 단백질과 비교하여 5개 내지 70개 아미노산, 예를 들어 5-60, 15-60, 20-50, 30-45, 35-40개 아미노산, 예컨대, 5, 15, 27, 35, 40, 60 또는 70개의 아미노산의 N-말단 절두, 및 야생형 HPV58 L1 단백질의 80-87번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV33 L1 단백질의 54-61번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질을 포함한다.
일부 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자는 야생형 HPV58 L1 단백질과 비교하여 5개 내지 70개 아미노산, 예를 들어 5-60, 15-60, 20-50, 30-45, 35-40개 아미노산, 예컨대, 5, 15, 27, 35, 40, 60 또는 70개의 아미노산의 N-말단 절두, 및 야생형 HPV58 L1 단백질의 376-383번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV33 L1 단백질의 350-357번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질을 포함한다.
일부 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자는 야생형 HPV58 L1 단백질과 비교하여 5개 내지 70개 아미노산, 예를 들어 5-60, 15-60, 20-50, 30-45, 35-40개 아미노산, 예컨대, 5, 15, 27, 35, 40, 60 또는 70개의 아미노산의 N-말단 절두, 및 야생형 HPV58 L1 단백질의 80-87번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV33 L1 단백질의 54-61번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환, 및 야생형 HPV58 L1 단백질의 144-168번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV52 L1 단백질의 146-170번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질을 포함한다.
일부 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자는 야생형 HPV58 L1 단백질과 비교하여 5개 내지 70개 아미노산, 예를 들어 5-60, 15-60, 20-50, 30-45, 35-40개 아미노산, 예컨대, 5, 15, 27, 35, 40, 60 또는 70개의 아미노산의 N-말단 절두, 및 야생형 HPV58 L1 단백질의 80-87번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV33 L1 단백질의 54-61번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환, 및 야생형 HPV58 L1 단백질의 375-383번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV52 L1 단백질의 380-388번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질을 포함한다.
특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자는 서열번호 4, 10, 11 또는 14에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질 또는 그의 변체, 상기 단리된 핵산, 상기 벡터, 상기 숙주 세포 또는 상기 HPV 바이러스유사 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 조성물은 본 발명에 따른 돌연변이된 HPV58 L1 단백질 또는 그의 변체를 포함한다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 조성물은 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자를 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자 및 임의로 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물 또는 백신에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 백신을 HPV 감염, 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질병, 예를 들어 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마의 예방에 사용할 수 있다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 HPV 바이러스유사 입자는 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질병의 예방에 유효한 양으로 존재한다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 HPV 감염은 하나 이상의 HPV 유형에 의한 감염(예를 들어 HPV58 감염, HPV33 감염 및/또는 HPV52 감염)이다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 HPV 감염에 의해 유발된 감염은 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
본 발명에 따른 약학 조성물 또는 백신을 당해 분야에 주지된 방법에 의해, 예를 들어 비제한적으로 경구로 또는 주사에 의해 투여할 수 있다. 본 발명에서, 특히 바람직한 투여 경로는 주사이다.
일부 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 백신을 단위 투여형으로 투여한다. 예를 들어, 본 발명에 비제한적으로, 각각의 단위 투여량은 5 ㎍ 내지 80 ㎍, 바람직하게는 20 ㎍ 내지 40 ㎍의 HPV 바이러스유사 입자를 함유한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 상술한 바와 같은 돌연변이된 HPV58 L1 단백질 또는 그의 변체의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질 또는 그의 변체를 숙주 세포에서 발현시키고, 이어서 상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질 또는 그의 변체를 상기 숙주 세포의 배양물로부터 회수함을 포함한다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 이 콜라이(E. coli)이다.
일부 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질 또는 그의 변체를 이 콜라이에서 발현시키는 단계와, 이어서 상기 이 콜라이의 용해물 상등액을 정제시킴으로써 상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질 또는 그의 변체를 수득하는 단계를 포함한다. 일부 바람직한 실시태양에서, 상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질 또는 그의 변체를 크로마토그래피(예를 들어 양이온-교환 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피)에 의해 상기 이 콜라이의 용해물 상등액으로부터 회수한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자를 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제와 병용함을 포함하는 백신의 제조 방법에 관한 것이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질병의 예방 방법에 관한 것으로, 피실험자에게 예방학적 유효량의 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자 또는 약학 조성물 또는 백신을 투여함을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 HPV 감염은 하나 이상의 HPV 유형에 의한 감염(예를 들어 HPV58 감염, HPV33 감염 및/또는 HPV52 감염)이다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 HPV 감염에 의해 유발된 질병은 비제한적으로 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 피실험자는 포유동물, 예를 들어 인간이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 또한 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질병의 예방을 위한 약학 조성물 또는 백신의 제조에서 본 발명에 따른 돌연변이된 HPV58 L1 단백질 또는 그의 변체 또는 HPV 바이러스유사 입자의 용도에 관한 것이다. 바람직한 실시태양에서, 상기 HPV 감염은 하나 이상의 HPV 유형에 의한 감염(예를 들어 HPV58 감염, HPV33 감염 및/또는 HPV52 감염)이다. 또 다른 바람직한 실시태양에서, 상기 HPV 감염에 의해 유발된 질병은 비제한적으로 자궁경부암 및 첨형 콘딜로마를 포함한다.
본 발명의 용어의 정의
본 발명에서, 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 과학기술 용어들은 당업자에 의해 일반적으로 정의되는 의미를 갖는다. 더욱이, 본 명세서에 사용된 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학 및 면역학의 실험 작업들은 상응하는 분야에 널리 사용되는 통상적인 작업들이다. 한편으로, 본 발명을 보다 잘 이해하기 위해서, 관련 용어의 정의 및 설명을 하기와 같이 제공한다.
본 발명에 따라, "제2 유형의 야생형 HPV"란 용어는 HPV58 이외의 야생형 HPV 유형을 지칭한다. 본 발명에서, 제2 유형의 야생형 HPV는 바람직하게는 야생형 HPV33이다. 본 발명에 따라, "제3 유형의 야생형 HPV"란 용어는 HPV58과 제2 유형의 야생형 HPV 이외의 야생형 HPV 유형을 지칭한다. 본 발명에서, 제3 유형의 야생형 HPV는 바람직하게는 야생형 HPV52이다
본 발명에 따라, "상응하는 위치"란 표현은 서열들을 최적으로 정렬시킬 때, 즉 서열들을 최고의 일치성 백분율이 획득되도록 정렬시킬 때 비교되는 상기 서열들의 균등한 위치를 지칭한다.
본 발명에 따라, "야생형 HPV58 L1 단백질"이란 용어는 58형 인유두종 바이러스(HPV58)의 천연 주요 캡시드 단백질 L1을 지칭한다. 야생형 HPV58 L1 단백질의 서열은 당해 분야에 주지되어 있으며, 공개된 데이터베이스(예를 들어, NCBI 데이터베이스에서 수납 번호 P26535.1, ACJ13480, ACX32376.1 및 ACK37663.1 등)에서 찾을 수 있다.
본 발명에서, 야생형 HPV58 L1 단백질의 아미노산 서열을 언급하는 경우, 이는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열을 참조하여 기재한다. 예를 들어, "야생형 HPV58 L1 단백질의 80-87번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 1에 제시된 바와 같은 폴리펩타이드의 80-87번 위치의 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러나, 당업자는 야생형 HPV58이 다양한 단리물을 포함할 수 있으며 다양한 단리물들간에 L1 단백질의 아미노산 서열의 차이가 있을 수도 있음을 이해한다. 또한, 당업자는 서열의 차이가 있을 수도 있지만, L1 단백질의 아미노산 서열은 상이한 HPV58 단리물들간에 매우 높은 일치성(일반적으로 95% 초과, 예를 들어 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과)을 가지며, 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 가짐을 이해한다. 따라서, 본 발명에서, "야생형 HPV58 L1 단백질"이란 용어는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 단백질뿐만 아니라 다양한 HPV58 단리물의 L1 단백질(예를 들어, 기탁 번호 P26535.1, ACJ13480, ACX32376.1 또는 ACK37663.1 등에 나타낸 HPV58 L1 단백질)을 포함한다. 더욱이, 야생형 HPV58 L1 단백질의 서열 단편을 기재하는 경우, 상기는 서열번호 1의 서열 단편뿐만 아니라, 다양한 HPV58 단리물의 L1 단백질의 상응하는 서열 단편을 포함한다. 예를 들어, "야생형 HPV58 L1 단백질의 80-87번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 1의 80-87번 위치의 아미노산 잔기 및 다양한 HPV58 단리물의 L1 단백질의 상응하는 단편을 포함한다.
본 발명에 따라, "야생형 HPV33 L1 단백질"이란 용어는 인유두종 바이러스 33형 (HPV33)의 천연 주요 캡시드 단백질 L1을 지칭한다. 야생형 HPV33 L1 단백질의 서열은 당해 분야에 주지되어 있으며, 공개된 데이터베이스(예를 들어, NCBI 데이터베이스에서 수납 번호 P06416.1, ACV84008.1, ACV84011.1, ACV84012.1 및 ACL12333.1 등)에서 찾을 수 있다.
본 발명에서, 야생형 HPV33 L1 단백질의 아미노산 서열을 언급하는 경우, 이는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 서열을 참조하여 기재한다. 예를 들어, "야생형 HPV33 L1 단백질의 54-61번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 2에 제시된 바와 같은 폴리펩타이드의 54-61번 위치의 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러나, 당업자는 야생형 HPV33이 다양한 단리물을 포함할 수 있으며 다양한 단리물들간에 L1 단백질의 아미노산 서열의 차이가 있을 수도 있음을 이해한다. 또한, 당업자는 서열의 차이가 있을 수도 있지만, L1 단백질의 아미노산 서열은 상이한 HPV33 단리물들간에 매우 높은 일치성(일반적으로 95% 초과, 예를 들어 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과)을 가지며, 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 가짐을 이해한다. 따라서, 본 발명에서, "야생형 HPV33 L1 단백질"이란 용어는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 단백질뿐만 아니라 다양한 HPV33 단리물의 L1 단백질(예를 들어 NCBI 데이터베이스에서 수납 번호 P06416.1, ACV84008.1, ACV84011.1, ACV84012.1 및 ACL12333.1에 나타낸 바와 같은 HPV33 L1 단백질)을 포함한다. 더욱이, 야생형 HPV33 L1 단백질의 서열 단편을 기재하는 경우, 상기는 서열번호 2의 서열 단편뿐만 아니라, 다양한 HPV33 단리물의 L1 단백질의 상응하는 서열 단편을 포함한다. 예를 들어, "야생형 HPV33 L1 단백질의 54-61번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 2의 54-61번 위치의 아미노산 잔기 및 다양한 HPV33 단리물의 L1 단백질의 상응하는 단편을 포함한다.
본 발명에 따라, "야생형 HPV52 L1 단백질"이란 용어는 인유두종 바이러스 52형 (HPV52)의 천연 주요 캡시드 단백질 L1을 지칭한다. 야생형 HPV52 L1 단백질의 서열은 당해 분야에 주지되어 있으며, 공개된 데이터베이스 (예를 들어 NCBI 데이터베이스에서 수납 번호 ACX32362.1, Q05138.2 또는 ABU55790.1)에서 확인할 수 있다.
본 발명에서, 야생형 HPV52 L1 단백질의 아미노산 서열을 언급하는 경우, 이는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 서열을 참조하여 기재한다. 예를 들어, "야생형 HPV52 L1 단백질의 146-170번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 3에 제시된 바와 같은 폴리펩타이드의 146-170번 위치의 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러나, 당업자는 야생형 HPV52이 다양한 단리물을 포함할 수 있으며 다양한 단리물들간에 L1 단백질의 아미노산 서열의 차이가 있을 수도 있음을 이해한다. 또한, 당업자는 서열의 차이가 있을 수도 있지만, L1 단백질의 아미노산 서열은 상이한 HPV52 단리물들간에 매우 높은 일치성(일반적으로 95% 초과, 예를 들어 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과)을 가지며, 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 가짐을 이해한다. 따라서, 본 발명에서, "야생형 HPV52 L1 단백질"이란 용어는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 단백질뿐만 아니라 다양한 HPV52 단리물의 L1 단백질(예를 들어 NCBI 데이터베이스에서 수납 번호 ACX32362.1, Q05138.2 또는 ABU55790.1로 나타낸 HPV52 L1 단백질)을 포함한다. 더욱이, 야생형 HPV52 L1 단백질의 서열 단편을 기재하는 경우, 상기는 서열번호 3의 서열 단편뿐만 아니라, 다양한 HPV52 단리물의 L1 단백질의 상응하는 서열 단편을 포함한다. 예를 들어, "야생형 HPV52 L1 단백질의 146-170번 위치의 아미노산 잔기"란 표현은 서열번호 3의 146-170번 위치의 아미노산 잔기 및 다양한 HPV52 단리물의 L1 단백질의 상응하는 단편을 포함한다.
본 발명에 따라, "상응하는 서열 단편" 또는 "상응하는 단편"이란 표현은 서열들을 최적으로 정렬시킬 때, 즉 서열들을 최고의 일치성 백분율이 획득되도록 정렬시킬 때 비교되는 상기 서열들의 균등한 위치에 위치하는 단편을 지칭한다.
본 발명에 따라, "X 아미노산의 N-말단 절두" 또는 "N-말단에 절두된 X 아미노산을 가짐"이란 표현은 단백질의 N-말단의 1 내지 X번 위치의 아미노산 잔기의, 개시 코돈(단백질 번역을 개시하기 위한)에 의해 암호화된 메티오닌 잔기에 의한 치환을 지칭한다. 예를 들어 N-말단에 절두된 35개 아미노산을 갖는 HPV58 L1 단백질은 야생형 HPV58 L1 단백질의 N-말단의 1 내지 35번 위치의 아미노산 잔기의, 개시 코돈에 의해 암호화된 메티오닌 잔기에 의한 치환으로부터 생성되는 단백질을 지칭한다.
본 발명에 따라, "변체"란 용어는 단백질의 아미노산 서열이 하나 이상의(예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개) 아미노산의 치환(바람직하게는 보존적 치환), 부가 또는 결실을 갖거나, 또는 본 발명에 따른 돌연변이된 HPV58 L1 단백질(예를 들어 서열번호 4, 10, 11 및 14에 제시된 바와 같은 단백질)과 비교하여 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 일치성을 가지며, 본 발명에 따른 돌연변이된 HPV58 L1 단백질의 기능을 유지하는 상기 단백질을 지칭한다. 본 발명에서, "돌연변이된 HPV58 L1 단백질의 기능"이란 용어는 적어도 2개 유형의 HPV(예를 들어 HPV58 및 HPV33, 또는 HPV58, HPV33 및 HPV52)에 대한 중화 항체의 생성을 유도하는 능력을 지칭한다. "일치성"이란 용어는 뉴클레오타이드 서열들 또는 아미노산 서열들간의 유사성의 척도를 지칭한다. 일반적으로, 서열들은 최대의 합치가 획득되도록 정렬되었다. "일치성"은 당해 분야에서 주지된 의미를 가지며 공개된 알고리즘(예를 들어 BLAST)에 의해 계산될 수 있다.
본 발명에 따라, "일치성"이란 용어는 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 핵산간의 합치 정도를 지칭한다. 비교를 위한 2개의 서열이 특정한 위치에서 염기 또는 아미노산의 동일한 단량체 서브유닛을 갖는 경우(예를 들어 2개의 DNA 분자가 각각 특정한 위치에서 아데닌을 갖거나, 또는 2개의 폴리펩타이드가 각각 특정한 위치에서 리신을 갖는 경우), 상기 2개의 분자는 상기 부위에서 일치한다. 2개 서열간의 일치성 퍼센트는 비교를 위한 부위의 총수에 걸쳐 상기 2개 서열에 의해 공유된 일치하는 부위수 x 100의 함수이다. 예를 들어 2개 서열의 10개 부위 중 6개가 합치하는 경우, 이들 2개 서열은 60%의 일치성을 갖는다. 예를 들어, DNA 서열: CTGACT 및 CAGGTT는 50%의 일치성을 공유한다(6개 부위 중 3개가 합치된다). 일반적으로 2개 서열의 비교를 최대 일치성을 생성시키는 방식으로 수행한다. 상기와 같은 정렬을 예를 들어 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 얼라인(Align) 프로그램(DNAstar 인코포레이티드)(니들맨(Needleman) 등의 방법(J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970)에 기반한다)을 사용하여 수행할 수 있다. 2개 아미노산 서열간의 일치성 퍼센트를 또한, PAM120 중량 잔기 표를 사용하고 12의 끊김 길이 벌점 및 4의 끊김 벌점을 갖는 이 마이어스(E. Meyers) 및 더블유 밀러(W. Miller)(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))의 알고리즘(상기 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합되었다)을 사용하여 측정할 수 있다. 또한, 2개 아미노산 서열간의 일치성 백분율을, 블로슘(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스를 사용하고 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 끊김 가중치, 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치를 사용하는, 니들맨 및 분취(Wunsch)의 알고리즘(J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970)(GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램(http://www.gcg.com에서 입수할 수 있다)에 통합되었다)에 의해 측정할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "보존적 치환"이란 용어는 아미노산 서열을 포함하는 단백질/폴리펩타이드의 필수적인 성질에 불리한 영향을 미치거나 또는 상기 성질을 변화시키지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 예를 들어, 보존적 치환을 당해 분야에 공지된 표준 기법, 예를 들어 부위-지향된 돌연변이유발 및 PCR-매개된 돌연변이유발에 의해 도입시킬 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기, 예를 들어 상응하는 아미노산 잔기와 물리적으로 또는 기능적으로 유사한(예를 들어 유사한 크기, 모양, 전하, 공유 결합 또는 수소 결합을 형성시키는 능력을 포함한 화학적 성질 등을 갖는) 잔기로 치환되는 치환을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 과가 당해 분야에 정의되었다. 이들 과는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 리신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 아스파트산 및 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지된 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 쓰레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 일반적으로 보존적인 치환은 상응하는 아미노산 잔기의, 동일한 측쇄 과로부터의 또 다른 아미노산 잔기에 의한 치환을 지칭한다. 아미노산 보존적 치환의 식별 방법은 당해 분야에 주지되어 있다(예를 들어 문헌[Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993)]; [Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999)]; 및 [Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)]을 참조하시오).
본 발명에 따라, "이 콜라이 발현 시스템"이란 용어는 이 콜라이(균주) 및 벡터로 이루어지는 발현 시스템을 지칭하며, 여기에서 상기 이 콜라이(균주)는 비제한적으로 ER2566, BL21 (DE3), B834 (DE3), 및 BLR (DE3)을 포함한 상업적으로 입수할 수 있는 균주로부터 유래된다.
본 발명에 따라, "벡터"란 용어는 폴리뉴클레오타이드가 삽입될 수 있는 핵산 담체 도구를 지칭한다. 상기 벡터가 상기 중에 삽입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 단백질의 발현을 허용하는 경우, 상기 벡터를 발현 벡터라 칭한다. 상기 벡터는 숙주 세포내로의 형질전환, 형질도입 또는 형질감염에 의해 상기 숙주 세포에서 발현된 운반된 유전물질 요소를 가질 수 있다. 벡터, 예를 들어 비제한적으로 플라스미드, 파지, 코스미드 등은 당업자에 의해 주지되어 있다.
본 발명에 따라, "약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제"란 용어는 피실험자 및 활성 성분에 약물학적으로 및/또는 생리학적으로 상용성인 담체 및/또는 부형제를 지칭하며, 이들은 당해 분야에 주지되어 있고(예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995]을 참조하시오), 비제한적으로 pH 조절제, 계면활성제, 항원보강제, 및 이온 강도 증대제를 포함한다. 예를 들어, pH 조절제는 비제한적으로 포스페이트 완충제를 포함하고; 계면활성제는 비제한적으로 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제, 또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈-80을 포함하고; 항원보강제는 비제한적으로 알루미늄 항원보강제(예를 들어 수산화 알루미늄), 및 프로인트 항원보강제(예를 들어 프로인트 완전 항원보강제)를 포함하고; 이온 강도 증대제는 비제한적으로 NaCl을 포함한다.
본 발명에 따라, "유효량"이란 용어는 의도하는 목적을 유효하게 성취할 수 있는 양을 지칭한다. 예를 들어, 질병(예를 들어 HPV 감염) 예방 유효량은 질병(예를 들어 HPV 감염)의 발생을 예방하거나, 억제하거나 또는 지연시키기에 유효한 양을 지칭한다. 상기와 같은 유효량의 측정은 당업자의 능력내에 있다.
본 발명에 따라, "크로마토그래피"란 용어는 비제한적으로 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어 양이온 교환 크로마토그래피), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 흡수성 크로마토그래피(예를 들어 하이드록시아파타이트 크로마토그래피), 젤 여과 크로마토그래피(젤 배제 크로마토그래피), 및 친화성 크로마토그래피를 포함한다.
본 발명에 따라, "용해물 상등액"이란 용어는 하기의 단계에 의해 생성된 용액을 지칭한다: 숙주 세포(예를 들어 이 콜라이)를 용해 완충제에서 붕괴시키고, 이어서 불용성 물질을 상기 붕괴된 숙주 세포를 함유하는 용해된 용액으로부터 제거한다. 다양한 용해 완충제, 예를 들어 비제한적으로 트리스 완충제, 포스페이트 완충제, HEPES 완충제, MOPS 완충제 등이 당해 분야에 주지되어 있다. 또한, 숙주 세포의 붕괴를 당업자에 의해 주지된 방법, 예를 들어 비제한적으로 균질화기 붕괴, 초음파 처리, 분쇄, 고압 추출, 리소자임 처리 등에 의해 수행할 수 있다. 불용성 물질의 제거 방법, 예를 들어 비제한적으로 여과 및 원심분리가 또한 당업자에 의해 주지되어 있다.
연구들은 HPV58 및 다른 HPV 유형(들)(예를 들어 HPV33 및 HPV52)간에 어느 정도의 교차-보호가 존재하지만, 상기와 같은 교차-보호는 매우 낮음, 일반적으로 동일한 HPV 유형의 보호 수준의 1 퍼센트 미만, 심지어 1/1000임을 보인다. 따라서, HPV58 백신을 접종받은 피실험자는 여전히 다른 HPV 유형(들)(예를 들어 HPV33 및 HPV52)에 의해 감염될 위험이 높다.
본 발명은 돌연변이된 HPV58 L1 단백질 및 이에 의해 형성된 HPV 바이러스유사 입자를 제공한다. 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자는 HPV58 및 다른 HPV 유형(들)(예를 들어 HPV33 및 HPV52)에 대해 현저한 교차-보호를 제공할 수 있다. 특히, 동일한 면역화 용량에서, 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자는 유기체에서 적어도 2개 유형의 HPV(예를 들어 HPV58 및 HPV33, 또는 HPV58, HPV33 및 HPV52)에 대해 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있으며, 그의 효과는 다수 HPV 유형의 VLP의 혼합물(예를 들어 HPV58 VLP 및 HPV33 VLP의 혼합물, 또는 HPV58 VLP, HPV33 VLP 및 HPV52 VLP의 혼합물)의 경우에 필적한다. 따라서, 본 발명에 따른 HPV 바이러스유사 입자를 사용하여 동시에 적어도 2개 유형의 HPV(예를 들어 HPV58 및 HPV33, 또는 HPV58, HPV33 및 HPV52)에 의한 감염뿐만 아니라 상기 감염과 관련된 질병을 예방할 수 있으며, 상기 입자는 현저하게 이로운 기술적 효과를 갖는다. 이는 특히 HPV 백신의 보호 범위의 연장 및 HPV 백신의 생산 비용의 감소에 대해 상당한 장점을 갖는다.
본 발명의 실시태양을 도면 및 실시예를 참조하여 상세히 추가로 기재한다. 그러나, 당업자는 하기 도면 및 실시예가 본 발명의 범위를 한정한다기 보다는 단지 본 발명의 예시를 위한 것임을 이해할 것이다. 하기 도면 및 바람직한 실시태양의 상세한 설명에 따라, 본 발명의 다양한 목적 및 장점들이 당업자에게 자명하다.
도 1은 실시예 1의 정제된 돌연변이된 단백질의 SDS-PAGE 결과를 도시한다. 레인 M: 단백질 분자량 마커; 레인 1: HPV58N35 (N-말단에 절두된 35개 아미노산을 갖는 HPV58 L1 단백질); 레인 2: H58N35-33T1; 레인 3: H58N35-33T2; 레인 4: H58N35-33T3; 레인 5: H58N35-33T4; 레인 6: H58N35-33T5; 레인 7: H58N35-33T1; 레인 8: H58N35-33T1-52S1; 레인 9: H58N35-33T1-52S2; 레인 10: H58N35-33T1-52S3; 레인 11: H58N35-33T1-52S4. 상기 결과는 크로마토그래피 정제 후, H58N35-33T1, H58N35-33T2, H58N35-33T3, H58N35-33T4, H58N35-33T5, H58N35-33T1-52S1, H58N35-33T1-52S2, H58N35-33T1-52S3, 및 H58N35-33T1-52S4 단백질의 순도가 95%를 초과하는 것을 보여주었다.
도 2는 광역 항체 4B3를 이용하여 판단한 실시예 1에서 제조한 H58N35-33T1, H58N35-33T2, H58N35-33T3, H58N35-33T4, H58N35-33T5, H58N35-33T1-52S1, H58N35-33T1-52S2, H58N35-33T1-52S3, 및 H58N35-33T1-52S4의 웨스턴 블럿 결과를 나타낸다. 레인 M: 단백질 분자량 마커; 레인 1: HPV58N35; 레인 2: H58N35-33T1; 레인 3: H58N35-33T2; 레인 4: H58N35-33T3; 레인 5: H58N35-33T4; 레인 6: H58N35-33T5; 레인 7: H58N35-33T1; 레인 8: H58N35-33T1-52S1; 레인 9: H58N35-33T1-52S2; 레인 10: H58N35-33T1-52S3; 레인 11: H58N35-33T1-52S4. 결과는 돌연변이된 단백질 H58N35-33T1, H58N35-33T2, H58N35-33T3, H58N35-33T4, H58N35-33T5, H58N35-33T1-52S1, H58N35-33T1-52S2, H58N35-33T1-52S3, 및 H58N35-33T1-52S4는 광역 항체 4B3에 의해 특별히 인지될 수 있음을 보여주었다.
도 3A 내지 도 3L은 HPV58N35, H58N35-33T1, H58N35-33T2, H58N35-33T3, H58N35-33T4, H58N35-33T5, HPV33N9 (N-말단에 절두된 9개의 아미노산을 갖는 HPV33 L1 단백질), H58N35-33T1-52S1, H58N35-33T1-52S2, H58N35-33T1-52S3, H58N35-33T1-52S4, 및 HPV52N40 (N-말단에 절두된 40개의 아미노산을 갖는 HPV52 L1 단백질) 단백질을 포함하는 샘플의 분자체 크로마토그래피 분석의 결과를 도시한다. 결과는 H58N35-33T1, H58N35-33T3, H58N35-33T4, H58N35-33T5, H58N35-33T1-52S1, H58N35-33T1-52S2, H58N35-33T1-52S3, 또는 H58N35-33T1-52S4 단백질을 포함하는 샘플의 첫 번째 단백질 피크가 약 12분째에 나타났으며, 이는 HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 HPV52N40 VLP의 경우에 필적함을 보였다. 이는 이들 단백질이 모두 VLP로 조립될 수 있음을 보였다. 그러나, H58N35-33T2 단백질을 포함하는 샘플의 첫 번째 단백질 피크가 약 16분에 관찰되었고, 이는 HPV58 L1 단백질의 오량체의 체류 시간에 필적하며, 상기 단백질이 VLP로 조립될 수 없음을 의미한다.
도 4A 내지 도 4F는 HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP, HPV52N40 VLP, H58N35-33T1 VLP, H58N35-33T1-52S1 VLP, 및 H58N35-33T1-52S4 VLP의 침강 속도 분석의 결과를 도시한다. 도 4A, HPV58N35 VLP; 도 4B, HPV33N9 VLP; 도 4C, HPV52N40 VLP; 도 4D, H58N35-33T1 VLP; 도 4E, H58N35-33T1-52S1 VLP; 도 4F, H58N35-33T1-52S4 VLP. 상기 결과는 H58N35-33T1 VLP, H58N35-33T1-52S1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4 VLP의 침강 계수가 각각 109S, 113S 및 109S임을 보였고, HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 PV52N40 VLP의 침강 계수가 각각 118S, 133S 및 131S임을 보였다. 이는 H58N35-33T1, H58N35-33T1-52S1 및 H58N35-33T1-52S4가 크기 및 형태에 있어서 야생형 VLP와 유사한 바이러스유사 입자로 조립될 수 있음을 암시하였다.
도 5A 내지 도 5L은 다양한 VLP 샘플의 투과형 전자 현미경검사(TEM) 사진(100,000 x 배율로 촬영됨, 바 = 0.1 ㎛)을 도시한다. 도 5A, HPV58N35에 의해 조립된 VLP; 도 5B, H58N35-33T1에 의해 조립된 VLP; 도 5C, VLP로 더 조립되지 못한 H58N35-33T2에 의해 형성된 오량체; 도 5D, H58N35-33T3에 의해 조립된 VLP; 도 5E, H58N35-33T4에 의해 조립된 VLP; 도 5F, H58N35-33T5에 의해 조립된 VLP; 도 5G, HPV33N9에 의해 조립된 VLP; 도 5H, H58N35-33T1-52S1에 의해 조립된 VLP; 도 5I, H58N35-33T1-52S2에 의해 조립된 VLP; 도 5J, H58N35-33T1-52S3에 의해 조립된 VLP; 도 5K, H58N35-33T1-52S4에 의해 조립된 VLP; 도 5L, HPV52N40에 의해 조립된 VLP. 상기 결과는 H58N35-33T1, H58N35-33T3, H58N35-33T4, H58N35-33T5, H58N35-33T1-52S1, H58N35-33T1-52S2, H58N35-33T1-52S3 및 H58N35-33T1-52S4가 HPV58N35, HPV33N9 및 HPV52N40와 유사하고, 약 30 ㎚의 반경을 갖는 VLP로 조립될 수 있으나,오직 H58N35-33T2는 약 5 ㎚의 반경을 갖는 오량체를 형성하여 VLP로 조립될 수 없음을 보였다.
도 6A 내지 도 6F는 각각 H58N35-33T1 VLP, H58N35-33T1-52S1 VLP, H58N35-33T1-52S2 VLP, H58N35-33T1-52S3 VLP, 및 H58N35-33T1-52S4 VLP에 의해 형성된 VLP의 열안정성 평가의 결과를 도시한다. 도 6A, HPV58N35 VLP; 도 6B, H58N35-33T1 VLP; 도 6C, H58N35-33T1-52S1 VLP; 도 6D, H58N35-33T1-52S1 VLP; 도 6E, H58N35-33T1-52S1 VLP; 도 6F, H58N35-33T1-52S4 VLP. 상기 결과는 이들 단백질에 의해 형성된 VLP가 모두 매우 높은 열안정성을 가짐을 보였다.
도 7A는 마우스에서 실험 그룹 H58N35-33T1 VLP, H58N35-33T3 VLP, H58N35-33T4 VLP 및 H58N35-33T5 VLP, 및 대조용 그룹 HPV58N35 VLP 및 HPV33N9 VLP의 면역보호의 평가 결과를 도시한다. 상기 결과는 H58N35-33T1 VLP 및 H58N35-33T5 VLP 중 어느 하나가 마우스에서 HPV33 및 HPV58에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고; HPV58에 대한 그들의 보호 효과가 HPV58N35 VLP 단독의 경우에 필적하며, HPV33N9 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 높고; HPV33에 대한 그들의 보호 효과가 HPV33N9 VLP 단독의 경우에 필적하며, HPV58N35 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 높음을 보였다. 이는 H58N35-33T1 VLP 및 H58N35-33T5 VLP가 HPV58 감염 및 HPV33 감염의 예방에 유효한 백신으로서 사용될 수 있고, HPV58 VLP 및 HPV33 VLP를 포함하는 혼합 백신 대신에 사용될 수 있음을 보였다.
도 7B는 마우스에서 실험 그룹 H58N35-33T1-52S1, H58N35-33T1-52S2, H58N35-33T1-52S3 및 H58N35-33T1-52S4, 및 대조용 그룹 HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP, HPV52N40 VLP, 및 혼합된 HPV58/HPV33/HPV52 VLP의 면역보호의 평가 결과를 도시한다. 상기 결과는 H58N35-33T1-52S1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4 VLP 중 어느 하나가 마우스에서 HPV58, HPV33 및 HPV52에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고; HPV58에 대한 그들의 보호 효과가 HPV58N35 VLP 단독 및 혼합된 HPV58/HPV33/HPV52 VLP의 경우에 필적하며, HPV33N9 VLP 단독 및 HPV52N40 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 높고; HPV33에 대한 그들의 보호 효과가 HPV33N9 VLP 단독 및 혼합된 HPV58/HPV33/HPV52 VLP의 경우에 필적하며, HPV58N35 VLP 단독 및 HPV52N40 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 높음을 보였고, HPV52에 대한 그들의 보호 효과가 HPV52N40 VLP 단독 및 혼합된 HPV58/HPV33/HPV52 VLP의 경우에 필적하며, HPV33N9 VLP 단독 및 HPV58N35 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 높음을 보여주었다. 이는 H58N35-33T1-52S1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4 VLP가 HPV58 감염, HPV33 감염 및 HPV52 감염의 예방에 유효한 백신으로서 사용될 수 있고, HPV58 VLP, HPV33 VLP 및 HPV52 VLP를 포함하는 혼합 백신 대신에 사용될 수 있음을 보였다.
도 8A 내지 도 8D는 H58N35-33T1 VLP에 의한 마우스의 백신화 후 마우스 혈청 중 중화 항체 역가의 평가 결과를 도시한다. 도 8A: 알루미늄 항원보강제 그룹 1(10 ㎍의 면역화 용량에서, 알루미늄 항원보강제 사용); 도 8B: 알루미늄 항원보강제 그룹 2(1 ㎍의 면역화 용량에서, 알루미늄 항원보강제 사용); 도 8C: 알루미늄 항원보강제 그룹 3(0.1 ㎍의 면역화 용량에서, 알루미늄 항원보강제 사용); 도 8D: 프로인트 항원보강제 그룹 (1 ㎍의 면역화 용량에서, 프로인트 항원보강제 사용). 결과는 H58N35-33T1 VLP는 마우스에서 HPV58에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 그의 보호 효과는 동일한 용량에서 HPV58N35 VLP 단독의 경우에 필적하며, 동일한 용량에서 HPV33N9 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 우수하고; 마우스에서 HPV33에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 그의 보호 효과는 동일한 용량에서 HPV33N9 VLP 단독의 경우에 필적하며, 동일한 용량에서 HPV58N35 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 우수함을 보였다. 이는 H58N35-33T1 VLP가 HPV58 및 HPV33에 대해 양호한 교차-면역원성 및 교차-보호성을 가짐을 보였다.
도 8E 내지 도 8G는 H58N35-33T1-52S1 VLP 또는 H58N35-33T1-52S4 VLP에 의한 마우스의 백신화 후 마우스 혈청 중 중화 항체 역가의 평가 결과를 도시한다. 도 8E: 알루미늄 항원보강제 그룹 1(10 ㎍의 면역화 용량에서, 알루미늄 항원보강제 사용); 도 8F: 알루미늄 항원보강제 그룹 2(1 ㎍의 면역화 용량에서, 알루미늄 항원보강제 사용); 도 8G: 알루미늄 항원보강제 그룹 3(0.1 ㎍의 면역화 용량에서, 알루미늄 항원보강제 사용). 결과는 H58N35-33T1-52S1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4 VLP는 마우스에서 HPV58에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 그의 보호 효과는 동일한 용량에서 HPV58N35 VLP 단독 및 HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 HPV52N40 VLP의 혼합물의 경우에 필적하며, 동일한 용량에서 HPV33N9 VLP 단독 또는 HPV52N40 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 우수하고; 마우스에서 HPV33에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 그의 보호 효과는 동일한 용량에서 HPV33N9 VLP 단독 및 HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 HPV52N40 VLP의 혼합물의 경우에 필적하며, 동일한 용량에서 HPV58N35 VLP 단독 또는 HPV52N40 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 우수함을 보였고, 마우스에서 HPV52에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 그의 보호 효과는 동일한 용량에서 HPV52N40 VLP 단독의 경우와 HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 HPV52N40 VLP의 혼합물의 경우보다 다소 약하지만, 동일한 용량에서 HPV58N35 VLP 단독의 경우 또는 HPV33N9 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 우수하였다. 이는 H58N35-33T1-52S1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4 VLP가 HPV58, HPV33 및 HPV52에 대해 양호한 교차-면역원성 및 교차-보호성을 가짐을 보였다.
도 9는 H58N35-33T1-52S4 VLP에 의한 키노몰구스 원숭이의 백신화 후 키노몰구스 원숭이 혈청 중 중화 항체의 평가 결과를 도시한다. 상기 결과는 H58N35-33T1-52S4가 키노몰구스 원숭이에서 HPV58, HPV33 및 HPV52에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있으며, 그의 보호 효과가 동일한 용량에서 HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 HPV52N40 VLP의 혼합물의 경우에 필적함을 보였다. 이는 H58N35-33T1-52S4 VLP가 HPV58, HPV33 및 HPV52에 대한 양호한 교차-면역원성을 가지며, 영장류에서 HPV58, HPV33 및 HPV52에 대한 양호한 교차-보호를 유도할 수 있음을 보였다.
도 10A 내지 도 10D는 H58N35-33T1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4 VLP의 저온-전자 현미경 (저온EM) 사진과 재구성된 3차원 구조를 각각 도시한다. 도 10A, H58N35-33T1 VLP의 저온-전자 현미경 (저온 EM) 사진; 도 10B, H58N35-33T1 VLP의 재구성된 3차원 구조; 도 10C: H58N35-33T1-52S4 VLP의 저온-전자 현미경검사(저온EM) 사진; 도 10D, H58N35-33T1-52S4 VLP의 재구성된 3차원 구조. 상기 재구성된 3차원 구조는 H58N35-33T1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4가 모두 72개의 캡소머(형태학적 서브유닛, 오량체)로 이루어지는 T=7 20면체 구조(h=1, k=2)를 가짐을 보였다. 준-등가(quasi-equivalence) 원리와 일치하는 통상적인 20면체 바이러스 캡시드와 달리, H58N35-33T1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4 VLP 구조 중 모든 구성 서브유닛들은 육량체 없이 오량체였다. 더욱이, 상기 두 VLP들은 약 60 ㎚의 외부 직경을 가졌다. 이들은 앞서 보고된 천연 HPV 바이러스 입자 및 진핵생물 발현 시스템(예를 들어 폭스바이러스 발현 시스템)에 의해 제조된 HPV VLP의 3차원 구조와 유사하였다(Baker TS, Newcomb WW, Olson NH. et al. Biophys J. (1991), 60(6): 1445-1456. Hagensee ME, Olson NH, Baker TS, et al. J Virol. (1994), 68(7):4503-4505. Buck CB, Cheng N, Thompson CD. et al. J Virol. (2008), 82(11): 5190-7).
서열 정보
본 발명에 관련된 서열들 중 일부를 하기 표 1에 제공한다.
서열의 설명
서열 번호 설명
1 야생형 HPV58 L1 단백질
2 야생형 HPV33 L1 단백질
3 야생형 HPV52 L1 단백질
4 HPV33 L1 단백질 의 조각 1을 포함하는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질, H58N35-33T1
5 H58N35-33T2-1
6 H58N35-33T2-2
7 HPV33 L1 단백질의 조각 2를 포함하는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질, H58N35-33T2
8 HPV33 L1 단백질의 조각 3을 포함하는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질, H58N35-33T3
9 HPV33 L1 단백질의 조각 4를 포함하는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질, H58N35-33T4
10 HPV33 L1 단백질의 조각 5를 포함하는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질, H58N35-33T5
11 HPV33 L1 단백질 의 조각 1과 HPV52 L1 단백질의 조각 1을 포함하는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질, H58N35-33T1-52S1
12 HPV33 L1 단백질 의 조각 1과 HPV52 L1 단백질의 조각 2를 포함하는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질, H58N35-33T1-52S2
13 HPV33 L1 단백질의 조각 1과 HPV52 L1 단백질의 조각 3을 포함하는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질, H58N35-33T1-52S3
14 HPV33 L1 단백질의 단편 1과 HPV52 L1 단백질의 단편 4를 포함하는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질, H58N35-33T1-52S4
15 서열번호 1을 암호화하는 DNA 서열
16 서열번호 2를 암호화하는 DNA 서열
17 서열번호 3을 암호화하는 DNA 서열
18 서열번호 4를 암호화하는 DNA 서열
19 서열번호 5를 암호화하는 DNA 서열
20 서열번호 6을 암호화하는 DNA 서열
21 서열번호 7을 암호화하는 DNA 서열
22 서열번호 8을 암호화하는 DNA 서열
23 서열번호 9를 암호화하는 DNA 서열
24 서열번호 10을 암호화하는 DNA 서열
25 서열번호 11을 암호화하는 DNA 서열
26 서열번호 12를 암호화하는 DNA 서열
27 서열번호 13을 암호화하는 DNA 서열
28 서열번호 14를 암호화하는 DNA 서열
59 야생형 HPV33 L1 단백질의 54 내지 61 위치의 아미노산 잔기의 서열
60 야생형 HPV33 L1 단백질의 350 내지 357 위치의 아미노산 잔기의 서열
61 야생형 HPV52 L1 단백질 야생형 HPV52 L1 단백질의 146 내지 170 위치의 아미노산 잔기의 서열
62 야생형 HPV52 L1 단백질 야생형 HPV52 L1 단백질의 380 내지 388 위치의 아미노산 잔기의 서열
서열 1 (서열번호 1):
MVLILCCTLAILFCVADVNVFHIFLQMSVWRPSEATVYLPPVPVSKVVSTDEYVSRTSIYYYAGSSRLLAVGNPYFSIKSPNNNKKVLVPKVSGLQYRVFRVRLPDPNKFGFPDTSFYNPDTQRLVWACVGLEIGRGQPLGVGVSGHPYLNKFDDTETSNRYPAQPGSDNRECLSMDYKQTQLCLIGCKPPTGEHWGKGVACNNNAAATDCPPLELFNSIIEDGDMVDTGFGCMDFGTLQANKSDVPIDICNSTCKYPDYLKMASEPYGDSLFFFLRREQMFVRHFFNRAGKLGEAVPDDLYIKGSGNTAVIQSSAFFPTPSGSIVTSESQLFNKPYWLQRAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCTEVTKEGTYKNDNFKEYVRHVEEYDLQFVFQLCKITLTAEIMTYIHTMDSNILEDWQFGLTPPPSASLQDTYRFVTSQAITCQKTAPPKEKEDPLNKYTFWEVNLKEKFSADLDQFPLGRKFLLQSGLKAKPRLKRSAPTTRAPSTKRKKVKK
서열 2 (서열번호 2):
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서열 3 (서열번호 3):
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서열 4 (서열번호 4):
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서열 5 (서열번호 5):
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서열 6 (서열번호 6):
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서열 7 (서열번호 7):
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서열 8 (서열번호 8):
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서열 9 (서열번호 9):
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서열 10 (서열번호 10):
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서열 11 (서열번호 11):
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서열 12 (서열번호 12):
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서열 13 (서열번호 13):
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서열 14 (서열번호 14):
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서열 15 (서열번호 15):
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서열 16 (서열번호 16):
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서열 17 (서열번호 17):
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서열 18 (서열번호 18):
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서열 19 (서열번호 19):
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서열 20 (서열번호 20):
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAGCCCCAACAACAACAAGAAGGTGCTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTCGGAATAAGCGGCCACCCCTTACTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCGGAAACAAGTACCCCGCCCAGCCCGGCAGCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCGTGGCCTGCAACAACAACGCCGCCGCCACCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCAACACCGCCGTGATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAAGGAGGGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTGA
서열 21 (서열번호 21):
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAGCCCCAACAACAACAAGAAGGTGCTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTCGGAATAAGCGGCCACCCCTTACTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCGGAAACAAGTACCCCGGACAGCCCGGCGCTGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCGTGGCCTGCAACAACAACGCCGCCGCCACCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCAACACCGCCGTGATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAAGGAGGGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTAA
서열 22 (서열번호 22):
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGTAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAGCCCCAACAACAACAAGAAGGTGCTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCGTGAGCGGCCACCCCTACCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCAGCAACAGGTACCCCGCCCAGCCCGGCAGCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGAGTAGCATGTACAAACGCTGCACCTGCCAACGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCAACACCGCCGTGATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAAGGAGGGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTAA
서열 23 (서열번호 23):
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAGCCCCAACAACAACAAGAAGGTGCTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCGTGAGCGGCCACCCCTACCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCAGCAACAGGTACCCCGCCCAGCCCGGCAGCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCGTGGCCTGCAACAACAACGCCGCCGCCACCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCACAACAGCAAGTATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAAGGAGGGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGTTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTAA
서열 24 (서열번호 24):
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAGCCCCAACAACAACAAGAAGGTGCTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCGTGAGCGGCCACCCCTACCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCAGCAACAGGTACCCCGCCCAGCCCGGCAGCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCGTGGCCTGCAACAACAACGCCGCCGCCACCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCAACACCGCCGTGATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAGCGACAGCACGTACAAGAACGAGAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTAA
서열 25 (서열번호 25):
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAATCCCACTAACGCTAAAAAATTACTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCATCAGCGGCCACCCCCTGCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCAGCAACAAGTACGCCGGCAAGCCCGGCATCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCGTGGCCTGCAACAACAACGCCGCCGCCACCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCAACACCGCCGTGATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAAGGAGGGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTAA
서열 26 (서열번호 26):
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAATCCCACTAACGCTAAAAAATTACTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCGTGAGCGGCCACCCCTACCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCAGCAACAGGTACCCCGCCCAGCCCGGCAGCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCACCCCCTGCAACAACAACAGCGGCAACCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCAACACCGCCGTGATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAAGGAGGGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTAA
서열 27 (서열번호 27):
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAATCCCACTAACGCTAAAAAATTACTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCGTGAGCGGCCACCCCTACCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCAGCAACAGGTACCCCGCCCAGCCCGGCAGCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCGTGGCCTGCAACAACAACGCCGCCGCCACCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCACCCTGGGCGACCCCGTGCCCGGCGACCTGTACATCCAGGGCAGCAACAGCGGCAACACCGCCACCGTGCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGACCAAGGAGGGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTAA
서열 28 (서열번호 28):
ATGACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGAGCAGGACCAGCATCTACTACTACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCAACCCCTACTTCAGCATCAAGAATCCCACTAACGCTAAAAAATTACTGGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAGGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACAACCCCGACACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCGTGAGCGGCCACCCCTACCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGACCAGCAACAGGTACCCCGCCCAGCCCGGCAGCGACAACAGGGAGTGCCTGAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCGTGGCCTGCAACAACAACGCCGCCGCCACCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCTGCATGGACTTCGGCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCATCGACATCTGCAACAGCACCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCTACGGCGACAGCCTGTTCTTCTTCCTGAGGAGGGAGCAGATGTTCGTGAGGCACTTCTTCAACAGGGCCGGCAAGCTGGGCGAGGCCGTGCCCGACGACCTGTACATCAAGGGCAGCGGCAACACCGCCGTGATCCAGAGCAGCGCCTTCTTCCCCACCCCCAGCGGCAGCATCGTGACCAGCGAGAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCAGAGGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGGGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGAAGAAGGAGAGCACCTACAAGAACGAGAACTTCAAGGAGTACGTGAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCGTGTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGAGATCATGACCTACATCCACACCATGGACAGCAACATCCTGGAGGACTGGCAGTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGCCAGCCTGCAGGACACCTACAGGTTCGTGACCAGCCAGGCCATCACCTGCCAGAAGACCGCCCCCCCCAAGGAGAAGGAGGACCCCCTGAACAAGTACACCTTCTGGGAGGTGAACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGAGCGGCCTGAAGGCCAAGCCCAGGCTGAAGAGGAGCGCCCCCACCACCAGGGCCCCCAGCACCAAGAGGAAGAAGGTGAAGAAGTAA
서열 59 (서열번호 59):
NPTNAKKL
서열 60 (서열번호 60):
SDSTYKNE
서열 61 (서열번호 61):
ISGHPLLNKFDDTETSNKYAGKPGI
서열 62 (서열번호 62):
KKESTYKNE
본 발명을 하기와 같은 실시예를 참조하여 추가로 기재하며, 여기에서 이들 실시예는 본 발명을 제한한다기 보다는 단지 본 발명을 예시하기 위해 사용된다.
달리 나타내지 않는 한, 본 발명에 사용된 분자 생물학적 실험 방법 및 면역학적 분석들은 실질적으로 문헌[Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], 및 문헌[F. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995]에 기재된 바와 같은 방법에 따라 수행되며; 제한 효소는 제조사에 의해 권장되는 조건하에서 사용된다. 당업자들은 이들 실시예가 본 발명을 예시하기 위해 사용되지만, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 이해한다.
실시예 1. 돌연변이된 HPV58 L1 단백질의 발현 및 정제
발현 벡터의 구성
HPV33 L1 단백질로부터의 조각을 포함하는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질을 암호화하는 발현 벡터를 다중-부위 돌연변이유발을 위해 PCR에 의해 구성하였으며, 여기에서 사용된 초기 주형은 플라스미드 pTO-T7-HPV58L1N35C(N-말단에 절두된 35개 아미노산을 갖는 HPV58 L1 단백질을 암호화한다; 표 2에서 58L1N35로서 약기됨)였다. 각각의 PCR에 대한 주형 및 프라이머를 표 2에 나타내었으며, PCR에 대한 증폭 조건은 하기와 같았다: 94℃에서 10분간 변성; 25 주기(94℃에서 50초간 변성, 일정 기간 동안 주어진 온도에서 어닐링, 및 72℃에서 7.5분간 연장); 및 72℃에서 10분간 최종 연장. 상기 사용된 PCR 프라이머의 서열을 표 3에 나열하였다.
증폭 산물(50 ㎕)에 2 ㎕의 제한 엔도뉴클레아제 DpnI를 가하고 생성 혼합물을 37 ℃에서 60분간 배양하였다. 10 ㎕의 절단 산물을 사용하여, 염화 칼슘 방법에 의해 제조된 40 ㎕ 수용성 이 콜라이 ER2566(뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터 구입)을 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 이 콜라이를 카나마이신(25 ㎎/㎖의 최종 농도로, 본 명세서에서 이후에도 동일함)을 함유하는 고형 LB 배지(상기 LB 배지의 성분들: 10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 분말, 10 g/L NaCl, 본 명세서에서 이후에도 동일함)상에 평판도말하고, 단일 콜로니가 명백히 관찰될 수 있을 때까지 37 ℃에서 10 내지 12시간 동안 정적으로 배양시켰다. 단일 콜로니를 채집하고 4 ㎖ 액체 LB 배지(카나마이신 함유)를 함유하는 튜브에 접종하고 37℃에서 10시간 동안 220 rpm으로 진탕시키면서 배양하고, 이어서 1 ㎖ 세균 용액을 취하여 -70℃에서 보관하였다. 플라스미드를 이 콜라이로부터 추출하고, T7 프라이머를 사용하여 상기 플라스미드에 삽입된 관심 단편의 뉴클레오타이드 서열을 서열분석하였다. 상기 서열분석 결과는 상기 구성된 플라스미드(발현 벡터)에 삽입된 관심 단편의 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 18, 19, 20, 21, 22, 23 및 24가고, 이들의 암호화된 아미노산 서열은 각각 서열번호 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10(상응하는 단백질을 H58N35-33T1, H58N35-33T2-1, H58N35-33T2-2, H58N35-33T2, H58N35-33T3, H58N35-33T4 및 H58N35-33T5로 표시하였다)임을 보였다.
상기 돌연변이된 단백질 H58N35-33T1은, 야생형 HPV58 L1 단백질의 80 내지 87번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV33 L1 단백질의 54 내지 61번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환에 의해 HPV58N35와 상이하다. 상기 돌연변이된 단백질 H58N35-33T2는 야생형 HPV58 L1 단백질의 144 내지 168번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV33 L1 단백질의 118 내지 142번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환에 의해 HPV58N35와 상이하다. 상기 돌연변이된 단백질 H58N35-33T3는 야생형 HPV58 L1 단백질의 203 내지 209번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV33 L1 단백질의 177 내지 183번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환에 의해 HPV58N35와 상이하다. 상기 돌연변이된 단백질 H58N35-33T4는 야생형 HPV58 L1 단백질의 308 내지 311번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV33 L1 단백질의 282 내지 285번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환에 의해 HPV58N35와 상이하다. 상기 돌연변이된 단백질 H58N35-33T5는 야생형 HPV58 L1 단백질의 376 내지 383번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV33 L1 단백질의 350 내지 357번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환에 의해 HPV58N35와 상이하다.
깁슨(Gibson) 조립(Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 2009; 6:343-5. doi: 10.1038/nmeth.1318)를 사용하여 이중 치환을 갖는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질을 암호화하는 발현 벡터를 구성하였으며, 여기에서 상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질은 HPV33 L1으로부터의 조각과 HPV52 L1으로부터의 조각을 포함하였다. 간단히, 돌연변이를 포함하는 짧은 단편 및 돌연변이를 포함하지 않는 긴 단편을 PCR에 의해 수득하고, 이어서 깁슨 조립 시스템을 사용하여 상기 2개의 단편을 결찰시켜 고리를 형성시켰다. 사용된 초기 주형은 플라스미드 pTO-T7-H58N35-33T1 (돌연변이된 단백질 H58N35-33T1을 암호화하며, 표 2에 "H58N35-33T1"로 약기됨) 및 플라스미드 pTO-T7-HPV52N40C (N-말단에 절두된 40개 아미노산을 갖는 HPV52 L1 단백질을 암호화하며, 표 2에 "52L1N40"로 약기됨)를 포함하였다. 각각의 PCR에 대한 주형 및 프라이머를 표 2에 나타내었으며, 상기 짧은 단편을 증폭시키기 위한 PCR에 대한 증폭 조건은 하기와 같았다: 94℃에서 10분간 변성; 25 주기(94℃에서 50초간 변성, 일정 기간 동안 주어진 온도에서 어닐링, 및 72℃에서 1분간 연장); 및 72℃에서 10분간 최종 연장. 상기 긴 단편을 증폭시키기 위한 PCR에 대한 증폭 조건은 하기와 같았다: 94℃에서 10분간 변성; 25 주기(94 ℃에서 50초간 변성, 일정 기간 동안 주어진 온도에서 어닐링, 및 72℃에서 7.5분간 연장); 및 최종적으로 72℃에서 10분간 연장. 상기 사용된 PCR 프라이머의 서열을 표 3에 나열하였다. 상기 증폭 산물에 전기영동을 가하고, 이어서 관심 단편을 DNA 추출 키트를 사용하여 회수하고, 그의 농도를 측정하였다. 증폭에 의해 획득된 짧은 단편 및 긴 단편을 2:1의 몰비(총 부피 3 ㎕)로 혼합하고, 이어서 3 ㎕의 2X 깁슨 조립 마스터 믹스(NEB로부터 구입, T5 엑소뉴클레아제, 퓨전(Phusion) DNA 폴리머라제, Taq DNA 리가제를 함유한다)를 가하고, 50℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
상기 조립된 생성물(6 ㎕)을 사용하여, 염화 칼슘 방법에 의해 제조된 수용성 이 콜라이 ER2566(뉴잉글랜드 바이오랩스로부터 구입) 40 ㎕를 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 이 콜라이를 카나마이신을 함유하는 고체 LB 배지상에 평판도말하고, 단일 콜로니가 명백히 관찰될 수 있을 때까지 37℃에서 10 내지 12시간 동안 정적으로 배양시켰다. 단일 콜로니를 채집하고 4 ㎖ 액체 LB 배지(카나마이신 함유)를 함유하는 튜브에 접종하고 37℃에서 10시간 동안 220 rpm으로 진탕시키면서 배양하고, 이어서 1 ㎖ 세균 용액을 취하여 -70℃에서 보관하였다. 플라스미드를 이 콜라이로부터 추출하고, T7 프라이머를 사용하여 상기 플라스미드에 삽입된 관심 단편의 뉴클레오타이드 서열을 서열분석하였다. 상기 서열분석 결과는 상기 구성된 플라스미드(발현 벡터)에 삽입된 관심 단편의 뉴클레오타이드 서열들이 각각 서열번호 25, 26, 27 및 28이고, 이들의 암호화된 아미노산 서열이 각각 서열번호 11, 12, 13 및 14 (상응하는 단백질을 각각 H58N35-33T1-52S1, H58N35-33T1-52S2, H58N35-33T1-52S3 및 H58N35-33T1-52S4로서 각각 표시하였다)임을 보였다.
상기 돌연변이된 단백질 H58N35-33T1-52S1은, 야생형 HPV58 L1 단백질의 80 내지 87번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV33 L1 단백질의 54 내지 61번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환과, 야생형 HPV58 L1 단백질의 144 내지 168번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV52 L1 단백질의 146 내지 170번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환에 의해 HPV58N35와 상이하다. 상기 돌연변이된 단백질 H58N35-33T1-52S2는 야생형 HPV58 L1 단백질의 80 내지 87번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV33 L1 단백질의 54 내지 61번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환과, 야생형 HPV58 L1 단백질의 200 내지 209번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV52 L1 단백질의 202 내지 212번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환에 의해 HPV58N35와 상이하다. 상기 돌연변이된 단백질 H58N35-33T1-52S3은, 야생형 HPV58 L1 단백질의 80 내지 87번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV33 L1 단백질의 54 내지 61번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환과, 야생형 HPV58 L1 단백질의 292 내지 312번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV52 L1 단백질의 295 내지 317번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환에 의해 HPV58N35와 상이하다. 상기 돌연변이된 단백질 H58N35-33T1-52S4는 야생형 HPV58 L1 단백질의 80 내지 87번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV33 L1 단백질의 54 내지 61번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환과, 야생형 HPV58 L1 단백질의 375 내지 383번 위치의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV52 L1 단백질의 380 내지 388번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환에 의해 HPV58N35와 상이하다.
발현 벡터를 구성하기 위한 PCR 주형 및 프라이머
주형 상류 프라이머 하류 프라이머 생성물
58L1N35 H58N35-33T1-F H58N35-33T1-R H58N35-33T1
58L1N35 H58N35-33T2-1F H58N35-33T2-1R H58N35-33T2-1
H58N35-33T2-1 H58N35-33T2-2F H58N35-33T2-2R H58N35-33T2-2
H58N3-33T2-2 H58N35-33T2-3F H58N35-33T2-3R H58N35-33T2
58L1N35 H58N35-33T3-F H58N35-33T3-R H58N35-33T3
58L1N35 H58N35-33T4-F H58N35-33T4-R H58N35-33T4
58L1N35 H58N35-33T5-F H58N35-33T5-R H58N35-33T5
H58N35-33T1 G-V-H58N35-33T1-52S1-F G-V-H58N35-33T1-52S1-R H58N35-33T1-52S1 긴 단편
H58N35-33T1 G-V-H58N35-33T1-52S2-F G-V-H58N35-33T1-52S2-R H58N35-33T1-52S2 긴 단편
H58N35-33T1 G-V-H58N35-33T1-52S3-F G-V-H58N35-33T1-52S3-R H58N35-33T1-52S3 긴 단편
H58N35-33T1 G-V-H58N35-33T1-52S4-F G-V-H58N35-33T1-52S4-R H58N35-33T1-52S4 긴 단편
52L1N40 G-H58N35-33T1-52S1-F G-H58N35-33T1-52S1-R H58N35-33T1-52S1 짧은 단편
52L1N40 G-H58N35-33T1-52S2-F G-H58N35-33T1-52S2-R H58N35-33T1-52S2 짧은 단편
52L1N40 G-H58N35-33T1-52S3-F G-H58N35-33T1-52S3-R H58N35-33T1-52S3 짧은 단편
52L1N40 G-H58N35-33T1-52S4-F G-H58N35-33T1-52S4-R H58N35-33T1-52S4 짧은 단편
사용된 프라이머들의 서열(서열번호 29-58)
서열번호 프라이머 명칭 프라이머 서열 (5'-3')
29 H58N35-33T1-F CTTCAGCATCAAGAATCCCACTAACGCTAAAAAATTACTGGTGCCCAAGG
30 H58N35-33T1-R CCTTGGGCACCAGTAATTTTTTAGCGTTAGTGGGATTCTTGATGCTGAAG
31 H58N35-33T2-1F CCTGGGCGTCGGAATAAGCGGCCACCCCTTACTGAACAAGTTCG
32 H58N35-33T2-1R CGAACTTGTTCAGTAAGGGGTGGCCGCTTATTCCGACGCCCAGG
33 H58N35-33T2-2F CGACACCGAGACCGGAAACAAGTACCCCGCCCAGC
34 H58N35-33T2-2R GCTGGGCGGGGTACTTGTTTCCGGTCTCGGTGTCG
35 H58N35-33T2-3F AACAAGTACCCCGGACAGCCCGGCGCTGACAACAGGGAGT
36 H58N35-33T2-3R ACTCCCTGTTGTCAGCGCCGGGCTGTCCGGGGTACTTGTT
37 H58N35-33T3-F GGGGCAAGGGAGTAGCATGTACAAACGCTGCACCTGCCAACGACTGC
38 H58N35-33T3-R GCAGTCGTTGGCAGGTGCAGCGTTTGTACATGCTACTCCCTTGCCCC
39 H58N35-33T4-F CAAGGGCAGCGGCACAACAGCAAGTATCCAGAGCAGCG
40 H58N35-33T4-R CGCTGCTCTGGATACTTGCTGTTGTGCCGCTGCCCTTG
41 H58N35-33T5-F CCGAGGTGACCAGCGACAGCACGTACAAGAACGAGAACTTCAAGGAG
42 H58N35-33T5-R CTCCTTGAAGTTCTCGTTCTTGTACGTGCTGTCGCTGGTCACCTCGG
43 G-V-H58N35-33T1-52S1-F CTGATCGGCTGCAAGCCCCCCAC
44 G-V-H58N35-33T1-52S1-R CACGCAGGCCCACACCAGCC
45 G-V-H58N35-33T1-52S2-F GAGCTGTTCAACAGCATCATCGAGG
46 G-V-H58N35-33T1-52S2-R GGTGGGGGGCTTGCAGCCGATC
47 G-V-H58N35-33T1-52S3-F ATCGTGACCAGCGAGAGCCAGC
48 G-V-H58N35-33T1-52S3-R CTTCAGGTAGTCGGGGTACTTGC
49 G-V-H58N35-33T1-52S4-F GTGAGGCACGTGGAGGAGTACG
50 G-V-H58N35-33T1-52S4-R GGTGCACAGGGTCATGTTGGTG
51 G-H58N35-33T1-52S1-F GAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCCTGGAGATCGGCAGG
52 G-H58N35-33T1-52S1-R TGGGGGGCTTGCAGCCGATCAGGCACAGCTGGGTCTGCTTG
53 G-H58N35-33T1-52S2-F TGATCGGCTGCAAGCCCCCCACCGGCGAGCACTGGGGCAAGGG
54 G-H58N35-33T1-52S2-R TCGATGATGCTGTTGAACAGCTCCAGGGGGGGGCAGTCGCCG
55 G-H58N35-33T1-52S3-F GCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGCCAGCGAGCCCT
56 G-H58N35-33T1-52S3-R GCTGGCTCTCGCTGGTCACGATGCTGCCGCTGGGGGTG
57 G-H58N35-33T1-52S4-F CACCAACATGACCCTGTGCACCGAGGTGAAGAAGGAGAG
58 G-H58N35-33T1-52S4-R CGTACTCCTCCACGTGCCTCACGTACTCCTTGAAGTTCTCG
돌연변이된 단백질의 대규모 발현
각각 재조합 플라스미드 pTO-T7-H58N35-33T1, pTO-T7-H58N35-33T2, pTO-T7-H58N35-33T3, pTO-T7-H58N35-33T4, pTO-T7-H58N35-33T5, pTO-T7-H58N35-33T1-52S1, pTO-T7-H58N35-33T1-52S2, pTO-T7-H58N35-33T1-52S3, 및 pTO-T7-H58N35-33T1-52S4를 포함하는 이 콜라이 용액을 각각 -70℃ 냉장고로부터 꺼내어, 카나마이신을 함유하는 100 ㎖ LB 액체 배지에 시딩하고, 각각 200 rpm 및 37℃에서 약 8시간 동안 배양하였다. 이어서, 상기 배양물을 카나마이신을 함유하는 500 ㎖ LB 배지로 옮기고(1 ㎖ 세균 용액을 옮기고), 추가로 배양하였다. 상기 세균 농도가 약 0.6의 OD600에 도달했을 때, 배양 온도를 25℃로 낮추고 500 ㎕의 IPTG를 각 배양 보틀에 가하였다. 상기 배양을 8시간 동안 추가로 수행하였다. 배양을 끝낸 후에, 세균을 원심분리에 의해 수집하였다. 각각 H58N35-33T1, H58N35-33T2, H58N35-33T3, H58N35-33T4, H58N35-33T5, H58N35-33T1-52S1, H58N35-33T1-52S2, H58N35-33T1-52S3, 및 H58N35-33T1-52S4 단백질을 발현하는 세균을 수득하였다.
돌연변이된 단백질을 발현하는 세균의 붕괴
상기 수득된 세균을 1 g 세균 대 10 ㎖ 용해 완충제(20 mM 트리스 완충제, pH 7.2, 300 mM NaCl)의 비로 재-현탁시켰다. 상기 세균을 30분 동안 초음파 기구를 사용하여 붕괴시켰다. 상기 붕괴된 세균을 함유하는 용해 용액을 13500 rpm(30000 g)에서 15분 동안 원심분리시키고, 상등액(즉 붕괴된 세균의 상등액)을 수득하였다.
돌연변이된 단백질의 크로마토그래피 정제
장비: GE 헬쓰케어(즉 오리지널 애머샨 파마시아 캄파니(Amershan Pharmacia Co.))에 의해 제조된 AKTA 익스플로러(Explorer) 100 예비 액체 크로마토그래피 시스템
크로마토그래피 매질: SP 세파로스 4 패스트 플로우(Sepharose 4 Fast Flow)(GE 헬쓰케어 캄파니), CHT-II(바이오 래드(Bio-RAD)로부터 구입) 및 부틸 세파로스 4 패스트 플로우(GE 헬쓰케어 캄파니)
완충제: 20 mM 포스페이트 완충제, pH 8.0, 20 mM DTT; 및 20 mM 포스페이트 완충제, pH 8.0, 20 mM DTT, 2 M NaCl.
샘플: 상기에서 수득된 바와 같은, 각각 H58N35-33T1, H58N35-33T2, H58N35-33T3, H58N35-33T4, H58N35-33T5, H58N35-33T1-52S1, H58N35-33T1-52S2, H58N35-33T1-52S3, 및 H58N35-33T1-52S4를 함유하는 붕괴된 세균의 상등액.
용출 프로토콜:
(1) SP 세파로스 4 패스트 플로우에 의한 붕괴된 세균의 상등액의 양이온 교환 정제: 상기 샘플을 상기 컬럼상에 로딩하고, 이어서 불필요한 단백질을 400 mM NaCl을 함유하는 완충제로 용출시킨 다음 관심 단백질을 800 mM NaCl을 함유하는 완충제로 용출시키고, 상기 800 mM NaCl을 함유하는 완충제로 용출된 분획을 수집하였다;
(2) CHTII(하이드록시아파타이트 크로마토그래피)에 의한 상기 단계 (1)에서 수득된 용출 분획의 크로마토그래피 정제: 상기 단계 (1)에서 수득된 용출 분획을, NaCl 농도가 0.5 M로 감소되도록 희석시키고; 상기 샘플을 상기 컬럼상에 로딩하고, 이어서 불필요한 단백질을 500 mM NaCl을 함유하는 완충제로 용출시킨 다음 관심 단백질을 1000 mM NaCl을 함유하는 완충제로 용출시키고, 상기 1000 mM NaCl을 함유하는 완충제로 용출된 분획을 수집하였다;
(3) HIC(소수성 상호작용 크로마토그래피)에 의한 상기 단계 (2)에서 수득된 용출 분획의 크로마토그래피 정제: 상기 샘플을 상기 컬럼상에 로딩하고, 이어서 불필요한 단백질을 1000 mM NaCl을 함유하는 완충제로 용출시킨 다음 관심 단백질을 200 mM NaCl을 함유하는 완충제로 용출시키고, 상기 200 mM NaCl을 함유하는 완충제로 용출된 분획을 수집하였다.
상기 단계 (3)에서 수득된 150 ㎕ 용출 분획을 30 ㎕의 6X 로딩 완충제에 가하였다. 상기 생성된 용액을 균일하게 혼합하고 80 ℃ 수욕에서 10분 동안 배양하였다. 이어서 10 ㎕의 상기 생성된 샘플에 120 V에서 120분 동안 10% SDS-PAGE를 가하고; 쿠마씨 브릴리언트 블루에 의해 전기영동 밴드를 염색하였다. 상기 전기영동 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 결과는 상기 정제 단계 후에, H58N35-33T1, H58N35-33T2, H58N35-33T3, H58N35-33T4, H58N35-33T5, H58N35-33T1-52S1, H58N35-33T1-52S2, H58N35-33T1-52S3, 및 H58N35-33T1-52S4 단백질이 95% 초과의 순도를 가짐을 보였다.
유사한 방법에 의해, HPV58N35 단백질을 제조하고 이 콜라이 및 플라스미드 pTO-T7-HPV58N35C를 사용하여 정제시키고, HPV52N40 단백질을 제조하고 이 콜라이 및 플라스미드 pTO-T7-HPV52N40C를 사용하여 정제시켰고, HPV33N9 단백질을 제조하고 이 콜라이 및 플라스미드 (HPV33N9 단백질을 암호화하는) pTO-T7-HPV33L1N9C를 사용하여 정제시켰다.
돌연변이 단백질의 웨스턴 블럿 분석
상술한 방법으로 정제된 H58N35-33T1, H58N35-33T2, H58N35-33T3, H58N35-33T4, H58N35-33T5, H58N35-33T1-52S1, H58N35-33T1-52S2, H58N35-33T1-52S3, 및 H58N35-33T1-52S4 을 전기영동 처리하였다. 전기영동 후, HPV L1 단백질에 대한 광역 항체4B3를 이용하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였고 결과는 도 2에 나타내었다. 결과는 H58N35-33T1, H58N35-33T2, H58N35-33T3, H58N35-33T4, H58N35-33T5, H58N35-33T1-52S1, H58N35-33T1-52S2, H58N35-33T1-52S3, 및 H58N35-33T1-52S4은 광역 항체 4B3에 의해 특별히 인지될 수 있음을 보여주었다.
실시예 2: HPV 바이러스유사 입자의 조립 및 입자의 형태 확인
HPV 바이러스유사 입자의 조립
소정의 부피(약 2 ㎖)의 H58N35-33T1, H58N35-33T2, H58N35-33T3, H58N35-33T4, H58N35-33T5, H58N35-33T1-52S1, H58N35-33T1-52S2, H58N35-33T1-52S3, 또는 H58N35-33T1-52S4 단백질을 (1) 2L 저장 완충제(20 mM 나트륨 포스페이트 완충제 pH 6.5, 0.5 M NaCl); (2) 2L 재생 완충제(50 mM 나트륨 포스페이트 완충제 pH 6.0, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 0.5 M NaCl); 및 (3) 20 mM 나트륨 포스페이트 완충제 pH 7.0, 0.5 M NaCl에 연속적으로 투석시켰다. 상기 투석을 상기 각각의 3개의 완충제에서 12시간 동안 수행하였다.
유사한 방법에 의해, HPV58N35, HPV33N9 및 HPV52N40 단백질을 각각 HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 HPV52N40 VLP로 각각 조립하였다.
분자체 크로마토그래피 분석
상기 투석된 샘플에 1120 콤팩트 LC 고성능 액체 크로마토그래피 시스템(에이질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies))에 의해 분자체 크로마토그래피 분석을 수행하였으며, 여기에서 상기 사용된 분석 컬럼은 TSK Gel PW5000xl 7.8x300 ㎜이었다. 상기 분석 결과를 도 3A-3L에 도시하였다. 상기 결과는 각각 단백질 H58N35-33T1, H58N35-33T3, H58N35-33T4, H58N35-33T5, H58N35-33T1-52S1, H58N35-33T1-52S2, H58N35-33T1-52S3, 및 H58N35-33T1-52S4를 포함하는 샘플의 첫 번째 단백질 피크가 약 12분째에 존재하고, 이는 HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 HPV52N40의 경우에 필적함을 보였다. 이는 이들 모든 단백질들이 VLP로 조립될 수 있음을 보였다. 그러나, H58N35-33T2 단백질을 포함하는 샘플의 첫 번째 단백질 피크가 약 16분째에 관찰되었고, 이는 HPV58 L1 단백질의 오량체의 체류 시간에 필적하며, 단백질이 VLP로 조립될 수 없음을 의미한다.
침강 속도 분석
침강 속도 분석용 기구는 벡크만(Beckman) XL-A 분석학적 초원심분리기로, 광학 검사 시스템 및 An-50Ti 및 An-60Ti 로터가 구비되어 있다. HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 H58N35-33T1 VLP의 침강 계수를 침강 속도 방법에 의해 분석하였다. 상기 결과를 도 4A-4F에 도시하였다. 상기 결과는 H58N35-33T1 VLP, H58N35-33T1-52S1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4 VLP의 침강 계수가 각각 109S, 113S 및 109S임을 보였으며, HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 HPV52N40 VLP의 침강 계수가 각각 118S, 133S 및 131S임을 보였다. 이는 H58N35-33T1, H58N35-33T1-52S1 및 H58N35-33T1-52S4가 크기 및 형태에 관하여 야생형 VLP와 유사한 바이러스유사 입자로 조립될 수 있음을 보였다.
바이러스유사 입자의 형태학적 시험
VLP를 포함하는 100 ㎕ 샘플을 투과형 전자 현미경(TEM)에 의해 관찰하였다. 사용된 장비는 JEOL Ltd에 의해 공급된 100kV 투과형 전자 현미경이었다(100,000x 배율). 간단히, 13.5 ㎕ 샘플을 2% 포스포텅스텐산(pH 7.0)으로 음으로 염색하고, 탄소-코팅된 구리 격자상에 고정시키고, 이어서 TEM에 의해 관찰하였다. 상기 결과를 도 5A-5L에 도시하였다. 상기 결과는 H58N35-33T1, H58N35-33T3, H58N35-33T4, H58N35-33T5, H58N35-33T1-52S1, H58N35-33T1-52S2, H58N35-33T1-52S3, 및 H58N35-33T1-52S4가 바이러스유사 입자로 조립될 수 있음을 보였다. 또한, 상기 결과는 또한 이들 돌연변이된 단백질에 의해 조립된 입자가 약 30 ㎚의 반경을 가지며, 크기가 균일함을 보였다. 이는 이들 돌연변이된 단백질이 HPV33, HPV58 및 HPV52의 L1 단백질과 유사하며 균일한 크기를 갖는 VLP로 조립될 수 있음을 암시하였다. 다만, H58N35-33T2 만이 오량체를 형성할 수 있었지만, 바이러스 유사 입자로 조립될 수 없었다.
실시예 3: 바이러스유사 입자의 열안정성의 평가
H58N35-33T1, H58N35-33T1-52S1, H58N35-33T1-52S2, H58N35-33T1-52S3, 및 H58N35-33T1-52S4에 의해 형성된 VLP를 GE 캄파니(즉마이크로칼 캄파니(MicroCal Co.))로부터 구입한 차동 주사 열량계 VP 캐필러리(Capillary) DSC를 사용하여 그들의 열안정성에 대해 평가하였으며, 여기에서 상기 단백질용 보관 완충제가 대조용으로서 사용되었고, 상기 단백질들을 10℃ 내지 90℃의 온도 범위내에서 1.5℃/분의 가열속도로 주사하였다. 검출 결과를 도 6A-6F에 도시하였다. 상기 결과는 상기 단백질들에 의해 형성된 이들 VLP가 모두 매우 높은 열안정성을 가짐을 보였다.
실시예 4: 동물에서 바이러스유사 입자의 면역 보호의 평가 1
H58N35-33T1, H58N35-33T3, H58N35-33T4, H58N35-33T5, H58N35-33T1-52S1, H58N35-33T1-52S2, H58N35-33T1-52S3, 및 H58N35-33T1-52S4에 의해 형성된 VLP의 면역 보호를 마우스에서 평가하였다. 백신화를 위한 동물은 5-6주령 BALB/c 마우스(통상적인 등급)였다(샹하이 SLAC 레보라토리 애니멀 캄파니 리미티드(Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. LTD.)로부터 구입).
상기에서 제조된 바와 같은 H58N35-33T1 VLP, H58N35-33T3 VLP, H58N35-33T4 VLP, H58N35-33T5 VLP, HPV58N35 VLP 및 HPV33N9 VLP를 각각 프로인트 항원보강제 (Freund's adjuvant)상에 흡수시켰다. 마우스들을 면역원에 따라 6개의 그룹으로 분류하고, 각 그룹에 3마리의 마우스를 포함시켰다. 백신화 과정은 하기와 같았다: 0주째에 1차 백신화, 및 각각 2주 및 4주째에 추가 백신화. 마우스를 피하 주사를 통해 백신화하였다. 사용된 면역원 및 그의 용량을 표 4에 나타내었다. 상기 1차 백신화 후 8주째에, 정맥혈을 안구로부터 채혈하고, 혈청을 분리시켰다. 상기 혈청 중 중화 항체의 역가를 측정하였다. 상기 검출 결과를 도 7A에 나타내었다. 상기 결과는 H58N35-33T1 VLP 및 H58N35-33T5 VLP 중 어느 하나가 마우스에서 HPV33 및 HPV58에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고; HPV58에 대한 이들의 보호 효과가 HPV58N35 VLP 단독의 경우에 필적하며 HPV33N9 VLP 단독보다 현저하게 더 높고; HPV33에 대한 이들의 보호 효과가 HPV33N9 VLP 단독의 경우에 필적하며 HPV58N35 VLP 단독보다 현저하게 더 높음을 보였다. 이는 H58N35-33T1 VLP 및 H58N35-33T5 VLP가 HPV58 감염 및 HPV33 감염의 예방에 유효한 백신으로서 사용될 수 있고 HPV58 VLP 및 HPV33 VLP를 포함하는 혼합 백신 대신에 사용될 수 있음을 보였다.
백신화 스케줄
백신화용 항원 항원보강제 면역화 용량 수 백신화 과정(주)
HPV33N9 VLP 프로인트 항원보강제 100μg 3 0, 2, 4
HPV58N35 VLP 프로인트 항원보강제 100μg 3 0, 2, 4
H58N35-33T1VLP 프로인트 항원보강제 100μg 3 0, 2, 4
H58N35-33T3 VLP 프로인트 항원보강제 100μg 3 0, 2, 4
H58N35-33T4 VLP 프로인트 항원보강제 100μg 3 0, 2, 4
H58N35-33T5 VLP 프로인트 항원보강제 100μg 3 0, 2, 4
또한, 상기에서 제조된 바와 같은 H58N35-33T1-52S1 VLP, H58N35-33T1-52S2 VLP, H58N35-33T1-52S3 VLP, H58N35-33T1-52S4 VLP, HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP, HPV52N40 VLP 및 혼합된 HPV58/HPV33/HPV52 VLP (즉 HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 HPV52N40 VLP의 혼합물)를 각각 알루미늄 항원보강제상에 흡수시켰다. 마우스들을 면역원에 따라 8개의 그룹으로 분류하고, 각 그룹에 4마리의 마우스를 포함시켰다. 백신화 과정은 하기와 같았다: 0주째에 1차 백신화, 및 각각 2주 및 4주째에 추가 백신화. 마우스를 복강 주사를 통해 백신화하였다. 면역원 및 그의 용량을 표 5에 나타내었다. 상기 1차 백신화 후 8주째에, 정맥혈을 안구로부터 채혈하고, 혈청을 분리시켰다. 상기 혈청 중 중화 항체의 역가를 측정하였다. 상기 검출 결과를 도 7B에 나타내었다. 상기 결과는 H58N35-33T1-52S1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4 VLP 중 어느 하나가 마우스에서 HPV58, HPV33 및 HPV52에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고; HPV58에 대한 이들의 보호 효과가 HPV58N35 VLP 단독 또는 혼합된 HPV58/HPV33/HPV52 VLP의 경우에 필적하며 HPV33N9 VLP 단독 및 HPV52N40 VLP 단독보다 현저하게 더 높고; HPV33에 대한 이들의 보호 효과가 HPV33N9 VLP 단독 또는 혼합된 HPV58/HPV33/HPV52 VLP의 경우에 필적하며 HPV58N35 VLP 단독 및 HPV52N40 VLP 단독보다 현저하게 더 높음을 보였고, HPV52에 대한 이들의 보호 효과가 HPV52N40 VLP 단독 및 혼합된 HPV58/HPV33/HPV52 VLP의 경우에 필적하며, HPV33N9 VLP 단독 및 HPV58N35 VLP 단독보다 현저하게 더 높음을 보였다. 이는 H58N35-33T1-52S1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4 VLP가 HPV58 감염, HPV33 감염 및 HPV52 감염의 예방에 유효한 백신으로서 사용될 수 있고 HPV58 VLP, HPV33 VLP 및 HPV52 VLP를 포함하는 혼합 백신 대신에 사용될 수 있음을 보였다.
백신화용 항원 항원보강제 면역화 용량 수 백신화 과정(주)
HPV33N9 VLP 알루미늄 항원보강제 5 μg 4 0, 2, 4
HPV52N40 VLP 알루미늄 항원보강제 5 μg 4 0, 2, 4
HPV58N35 VLP 알루미늄 항원보강제 5 μg 4 0, 2, 4
H58N35-33T1-52S1 VLP 알루미늄 항원보강제 5 μg 4 0, 2, 4
H58N35-33T1-52S2 VLP 알루미늄 항원보강제 5 μg 4 0, 2, 4
H58N35-33T1-52S3 VLP 알루미늄 항원보강제 5 μg 4 0, 2, 4
H58N35-33T1-52S4 VLP 알루미늄 항원보강제 5 μg 4 0, 2, 4
HPV58/HPV33/HPV52 VLP 알루미늄 항원보강제 VLP마다5 μg씩 4 0, 2, 4
실시예 5: 동물에서 바이러스유사 입자의 면역 보호의 평가 2
H58N35 -33T1 VLP의 ED 50
6주령 BalB/c 암컷 마우스 (8 마리)는 알루미늄 항원보강제를 단일 복강 주사로 접종하였으며, 실험군에는 H58N35-33T1 VLP를 이용하였고, 대조군에는 HPV58N35 VLP 단독 또는 HPV33N9 VLP 단독을 이용하였으며, 면역 용량은 0.300 μg, 0.100 μg, 0.033 μg, 0.011 μg 또는 0.004 μg이었고, 면역 부피는 1 mL이었다. 접종 후 5주 후 안구에서 정맥혈을 수거하였다. 혈액 중 HPV에 대한 항체를 검출하고 리드 뮤헨치 (Reed-Muench) 방법 (Reed LJ MH. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg. 1938; 27:493-7)에 의해, 각 샘플에 대하여 혈청변환을 유도 (즉, 마우스에서 항체 생성 유도)하는 ED50을 계산하였다. 결과는 표 6-8에 나타내었다.
[표 6]
마우스에서 HPV33, HPV58에 대한 항체 생성을 유도하는 HPV33N9 VLP의 ED50
Figure 112018065242057-pct00001
[표 7]
마우스에서 HPV33, HPV58에 대한 항체 생성을 유도하는 H58N35-33T1 VLP의 ED50
Figure 112018065242057-pct00002
[표 8]
마우스에서 HPV33, HPV58에 대한 항체 생성을 유도하는 HPV58N35 VLP의 ED50
Figure 112018065242057-pct00003
결과는 마우스에 접종한 후 5주 후에, 마우스에서 HPV58에 대한 항체 생성을 유도하는 H58N35-33T1 VLP의 ED50은 HPV58N35 VLP 단독의 경우와 유사하였고, HPV33N9 VLP 단독의 경우와 필적하였으며, 마우스에서 HPV33에 대한 항체 생성을 유도하는 ED50은 HPV33N9 VLP의 경우와 필적하였고, HPV58N35 VLP 단독보다 상당히 우수하였음을 보여주었다. 이는 H58N35-33T1 VLP가 HPV58 및 HPV33에 대하여 우수한 교차 면역원성과 교차 보호성을 지님을 보여주었다.
H58N35 -33T1- 52S1 VLP 및 H58N35 -58T1- 52S4 VLP의 ED 50
6주령 BalB/c 암컷 마우스 (8 마리)는 알루미늄 항원보강제를 단일 복강 주사로 접종하였으며, 실험군에는 H58N35-33T1-52S1 VLP 또는 H58N35-58T1-52S4 VLP를 이용하였고(면역 용량은 0.900 μg, 0.300 μg, 0.100 μg, 0.033 μg, 0.011 μg 또는 0.004 μg), 대조군에는 HPV33N9 VLP 단독, HPV58N35 VLP 단독 또는 HPV52N40 VLP 단독 (VLP각각에 대하여, 면역 용량은 0.300 μg, 0.100 μg, 0.033 μg, 0.011 μg 또는 0.004 μg), 또는 HPV33N9 VLP, HPV58N35 VLP 및 HPV52N40 VLP의 혼합물 (각 VLP에 대하여 면역 용량은 0.300 μg, 0.100 μg, 0.033 μg, 0.011 μg 또는 0.004 μg)을 사용하였으며, 면역 부피는 1 mL이었다. 접종 후 5주 후에 안구에서 정맥혈을 수거하였다. 혈액 중 HPV에 대한 항체를 검출하고 리드 뮤헨치 (Reed-Muench) 방법 (Reed LJ MH. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg. 1938; 27:493-7)에 의해, 각 샘플에 대하여 혈청변환을 유도 (즉, 마우스에서 항체 생성 유도)하는 ED50을 계산하였다. 결과는 표 9-14에 나타내었다.
[표 9]
마우스에서 HPV33, HPV58, HPV52에 대한 항체 생성을 유도하는 HPV33N9 VLP의 ED50
Figure 112018065242057-pct00004
[표 10]
마우스에서 HPV33, HPV58, HPV52에 대한 항체 생성을 유도하는 HPV58N35 VLP의 ED50
Figure 112018065242057-pct00005
[표 11]
마우스에서 HPV33, HPV58, HPV52에 대한 항체 생성을 유도하는 HPV52N40 VLP의 ED50
Figure 112018065242057-pct00006
[표 12]
마우스에서 HPV33, HPV58, HPV52에 대한 항체 생성을 유도하는 HPV33N9 VLP, HPV58N35 VLP 및 HPV52N40 VLP의 혼합물의 ED50
Figure 112018065242057-pct00007
[표 13]
마우스에서 HPV33, HPV58, HPV52에 대한 항체 생성을 유도하는 H58N35-33T1-52S1 VLP의 ED50
Figure 112018065242057-pct00008
[표 14]
마우스에서 HPV33, HPV58, HPV52에 대한 항체 생성을 유도하는 H58N35-33T1-52S4 VLP의 ED50
Figure 112018065242057-pct00009
결과는 마우스에 접종한 후 5주 후에, 마우스에서 HPV58에 대한 항체 생성을 유도하는 H58N35-33T1-52S1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4 VLP의ED50 은HPV58N35 VLP 단독 및HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 HPV52N40 VLP의 혼합물과 유사하였고, HPV33N9 VLP 단독 및 HPV52N40 VLP보다 상당히 우수하였으며, 마우스에서 HPV33에 대한 항체 생성을 유도하는 ED50은 HPV33N9 VLP와 HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 HPV52N40 VLP의 혼합물의 경우와 유사하였고, HPV58N35 VLP 단독 및HPV52N40 VLP 단독보다 상당히 우수하였음을 보여주었으며, 마우스에서 HPV52에 대한 항체 생성을 유도하는 H58N35-33T1-52S1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4 VLP의 ED50은 HPV52N40 VLP 단독, 및 HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 HPV52N40 VLP의 혼합물과 필적하였고, HPV33N9 VLP 단독 및 HPV58N35 VLP 단독보다 상당히 우수하였음을 보여주었다. 이는 H33N9-58T5-52S2 VLP가 HPV58, HPV33 및 HPV52에 대하여 우수한 교차 면역원성과 교차 보호성을 지님을 보여주었다.
H58N35 -33T1 VLP로 백신화된 마우스의 혈청 중 중화 항체 역가의 평가
본 실험에서, 백신화 스케줄을 표 15에 나타내었다. 모든 마우스(6주령 BalB/c 암컷 마우스)를 4개의 그룹: 프로인트 항원보강제 그룹 1(10 ㎍의 면역화 용량에서, 프로인트 항원보강제 사용); 알루미늄 항원보강제 그룹 1(10 ㎍의 면역화 용량에서, 알루미늄 항원보강제 사용), 알루미늄 항원보강제 그룹 2(1 ㎍의 면역화 용량에서, 알루미늄 항원보강제 사용); 및 알루미늄 항원보강제 그룹 3(0.1 ㎍의 면역화 용량에서, 알루미늄 항원보강제 사용)으로 분류하였다. 각 그룹을 3개의 하위그룹으로 추가로 분류하였다. 대조용 하위그룹 1 및 2를 HPV33N9 VLP 단독 및 HPV58N35 VLP 단독 각각으로 백신화하였으며, 실험 하위그룹을 H58N35-33T1 VLP으로 백신화하였다.
프로인트 항원보강제 그룹에서, 6마리의 마우스/하위그룹을 피하내 주사에 의해 1 ㎍의 면역화 용량, 및 200 ㎖의 주사 부피로 백신화하였다. 알루미늄 항원보강제 그룹 1 내지 3에서, 6마리의 마우스/하위그룹을 복강내 주사에 의해 각각 10 ㎍, 1 ㎍, 및 0.1 ㎍의 면역화 용량, 및 1 mL의 주사 부피로 백신화하였다. 상기 마우스 모두에게 0주째에 1차 백신화를 가하고, 이어서 각각 2주 및 4주째에 추가 백신화를 가하였다. 8주째에, 혈액 샘플을 안와 출혈을 통해 채혈하고, 혈청 중 HPV58 및 HPV33에 대한 항체의 역가를 분석하였다. 상기 분석 결과를 도 8A 내지 8D에 나타내었다. 상기 결과는 H58N35-33T1 VLP는 마우스에서 HPV58에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 그의 보호 효과는 동일한 용량에서 HPV58N35 VLP 단독의 경우에 필적하며, 동일한 용량에서 HPV33N9 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 우수하고; 마우스에서 HPV33에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 그의 보호 효과는 동일한 용량에서 HPV33N9 VLP 단독의 경우에 필적하며, 동일한 용량에서 HPV58N35 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 우수함을 보였다. 이는 H58N35-33T1 VLP가 HPV58 및 HPV33에 대해 양호한 교차-면역원성 및 교차-보호성을 가짐을 보였다.
백신화 스케줄
그룹 백신화용 항원 항원 보강제 면역화 용량 수 백신화 과정(주)
프로인트 항원보강제 그룹 HPV58N35 VLP 프로인트 항원보강제 1 μg 6 0, 2, 4
HPV33N9 VLP 프로인트 항원보강제 1 μg 6 0, 2, 4
H58N35-33T1 VLP 프로인트 항원보강제 1 μg 6 0, 2, 4
알루미늄 항원보강제 그룹 1 HPV58N35 VLP 알루미늄 항원보강제 10 μg 6 0, 2, 4
HPV33N9 VLP 알루미늄 항원보강제 10 μg 6 0, 2, 4
H58N35-33T1 VLP 알루미늄 항원보강제 10 μg 6 0, 2, 4
알루미늄 항원보강제 그룹 2 HPV58N35 VLP 알루미늄 항원보강제 1 μg 6 0, 2, 4
HPV33N9 VLP 알루미늄 항원보강제 1 μg 6 0, 2, 4
H58N35-33T1 VLP 알루미늄 항원보강제 1 μg 6 0, 2, 4
알루미늄 항원보강제 그룹 3 HPV58N35 VLP 알루미늄 항원보강제 0.1 μg 6 0, 2, 4
HPV33N9 VLP 알루미늄 항원보강제 0.1 μg 6 0, 2, 4
H58N35-33T1 VLP 알루미늄 항원보강제 0.1 μg 6 0, 2, 4
H58N35 -33T1- 52S1 VLP 또는 H58N35 -33T1- 52S4 VLP로 백신화된 마우스의 혈청 중 중화 항체 역가의 평가
본 실험에서, 백신화 스케줄을 표 16에 나타내었다. 모든 마우스(6주령 BalB/c 암컷 마우스)를 3개의 그룹: 알루미늄 항원보강제 그룹 1(10 ㎍의 면역화 용량에서, 알루미늄 항원보강제 사용), 알루미늄 항원보강제 그룹 2(1 ㎍의 면역화 용량에서, 알루미늄 항원보강제 사용); 및 알루미늄 항원보강제 그룹 3(0.1 ㎍의 면역화 용량에서, 알루미늄 항원보강제 사용)으로 분류하였다. 각 그룹을 6개의 하위그룹으로 추가로 분류하였다. 대조용 하위그룹 1, 2 및 3을 HPV58N35 VLP 단독, HPV33N9 VLP 단독 및 HPV52N40 VLP 단독 각각으로 백신화하였으며, 대조 하위그룹 4는 HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 HPV52N40 VLP의 혼합물로 백신화하였으며, 실험 하위그룹 1 및 2를 H58N35-33T1-52S1 VLP 단독 및 H58N35-33T1-52S4 VLP 단독으로 각각 백신화하였다.
알루미늄 항원보강제 그룹 1 내지 3에서, 6마리의 마우스/하위그룹을 복강내 주사에 의해 각각 10 ㎍, 1 ㎍, 및 0.1 ㎍의 면역화 용량, 및 1 mL의 주사 부피로 백신화하였다. 상기 마우스 모두에게 0주째에 1차 백신화를 가하고, 이어서 각각 2주 및 4주째에 추가 백신화를 가하였다. 8주째에, 혈액 샘플을 안와 출혈을 통해 채혈하고, 혈청 중 HPV58, HPV33 및 HPV52에 대한 항체의 역가를 분석하였다. 상기 분석 결과를 도 8E 내지 8G에 나타내었다. 상기 결과는 H58N35-33T1-52S1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4 VLP는 마우스에서 HPV58에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 그의 보호 효과는 동일한 용량에서 HPV58N35 VLP 단독의 경우와 HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 HPV52N40 VLP의 혼합물의 경우에 필적하며, 동일한 용량에서 HPV33N9 VLP 단독의 경우 또는 HPV52N40 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 우수하고, 마우스에서 HPV33에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 이의 보호 효과는 동일한 용량에서 HPV33N9 VLP 단독의 경우와 HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 HPV52N40 VLP의 혼합물의 경우에 필적하며, 동일한 용량에서 HPV58N35 VLP 단독의 경우 또는 HPV52N40 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 우수함을 보였고, 마우스에서 HPV52에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 그의 보호 효과는 동일한 용량에서 HPV52N40 VLP 단독의 경우와 HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 HPV52N40 VLP의 혼합물의 경우보다 다소 약하지만, 동일한 용량에서 HPV58N35 VLP 단독의 경우 또는 HPV33N9 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 우수하였다. 이는 H58N35-33T1-52S1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4 VLP가 HPV58, HPV33 및 HPV52에 대해 양호한 교차-면역원성 및 교차-보호성을 가짐을 보였다.
백신화 스케줄
그룹 백신화용 항원 항원 보강제 면역화 용량 수 백신화 과정(주)
알루미늄 항원보강제 그룹 1 HPV33N9 VLP 알루미늄 항원보강제 10 μg 6 0, 2, 4
HPV58N35 VLP 알루미늄 항원보강제 10 μg 6 0, 2, 4
HPV52N40 VLP 알루미늄 항원보강제 10 μg 6 0, 2, 4
HPV58/HPV33/HPV52 VLP 알루미늄 항원보강제 10 μg (VLP 각각) 6 0, 2, 4
H58N35-33T1-52S1 VLP 알루미늄 항원보강제 10 μg 6 0, 2, 4
H58N35-33T1-52S4 VLP 알루미늄 항원보강제 10 μg 6 0, 2, 4
알루미늄 항원보강제 그룹 2 HPV33N9 VLP 알루미늄 항원보강제 1 μg 6 0, 2, 4
HPV58N35 VLP 알루미늄 항원보강제 1 μg 6 0, 2, 4
HPV52N40 VLP 알루미늄 항원보강제 1 μg 6 0, 2, 4
HPV58/HPV33/HPV52 VLP 알루미늄 항원보강제 1 μg (VLP 각각) 6 0, 2, 4
H58N35-33T1-52S1 VLP 알루미늄 항원보강제 1 μg 6 0, 2, 4
H58N35-33T1-52S4 VLP 알루미늄 항원보강제 1 μg 6 0, 2, 4
알루미늄 항원보강제 그룹 3 HPV33N9 VLP 알루미늄 항원보강제 0.1 μg 6 0, 2, 4
HPV58N35 VLP 알루미늄 항원보강제 0.1 μg 6 0, 2, 4
HPV52N40 VLP 알루미늄 항원보강제 0.1 μg 6 0, 2, 4
HPV58/HPV33/HPV52 VLP 알루미늄 항원보강제 0.1 μg (VLP 각각) 6 0, 2, 4
H58N35-33T1-52S1 VLP 알루미늄 항원보강제 0.1 μg 6 0, 2, 4
H58N35-33T1-52S4 VLP 알루미늄 항원보강제 0.1 μg 6 0, 2, 4
키노몰구스 원숭이에서 H58N35-33T1-52S4 VLP의 면역 보호의 평가
본 실험은 프라이메이트 바이오메디컬 리서치의 유난 키 실험실 (Yunnan Key Laboratory of Primate Biomedical Research)에서 수행되었다. 백신화 스케줄은 표 17에 나타내었다. 14마리의 키노몰구스 원숭이를 2개의 그룹(대조군은 HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 HPV52N40 VLP의 혼합물로 백신화하고, 이 때 각 VLP의 용량은 5 ㎍이며, 주사 부피는 1 mL이며, 실험군은 H58N35-33T1-52S4 VLP 단독으로 백신화하고, 용량은 5 ㎍이며, 주사 부피는 1 mL였다)으로 무작위 분할하였다. 사용된 항원보강제는 알루미늄 항원보강제이며, 상기 원숭이들을 근육내 주사에 의해 백신화하였다. 상기 키노몰구스 원숭이 모두에게 0주째에 1차 백신화를 가하고, 이어서 8주째에 추가 백신화를 가하였다. 10주째에, 키노몰구스 원숭이로부터 혈액을 채혈하고, 혈청 중 HPV58, HPV33 및 HPV52에 대한 항체의 역가를 분석하였다. 상기 분석 결과를 도 9에 나타내었다. 상기 결과는 H58N35-33T1-52S4 VLP 단독이 키노몰구스 원숭이에서 HPV58, HPV33 및 HPV52에 대한 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 이의 보호 효과는 동일 용량에서 HPV58N35 VLP, HPV33N9 VLP 및 HPV52N40 VLP의 혼합물의 경우에 필적함을 보였다. 이들 결과는 H58N35-33T1-52S4 VLP가 HPV58, HPV33 및 HPV52 대하여 양호한 교차 면역원성을 가지며, 영장류에서 HPV58, HPV33 및 HPV52에 대한 양호한 교차-보호를 유도할 수 있음을 보였다.
백신화 스케줄
백신화용 항원 항원 보강제 면역화 용량 수 백신화 과정(주)
H58N35-33T1-52S4 VLP 알루미늄 항원보강제 5 ug 7 0, 8
HPV58/HPV33/HPV52 VLP 알루미늄 항원보강제 5 ug (VLP 각각) 7 0, 8
실시예 7: H58N35-33T1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4 VLP의 3차원 구조의 재구성
H58N35-33T1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4 VLP의 3차원 구조를 저온-전자 현미경검사(저온EM)를 이용한 3차원 구조 재구성 실험에 의해 재구성하였다 [Wolf M, Garcea RL, Grigorieff N. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. (2010), 107(14): 6298-303)]. 간단히, H58N35-33T1 VLP의 저온-전자 현미경 (저온 EM) 사진 (도 10A)에서, 균일한 크기 및 50 nm 초과의 입경을 갖는 581개의 입자를 컴퓨터 오버랩핑 및 구조 재구성을 위해 선택하여 H58N35-33T1 VLP의 3차원 구조를 수득하였다. 상기 획득된 3차원 구조를 도 10B(분해능: 22Å)에 도시하였다. 또한, H58N35-33T1-52S4 VLP의 저온-전자 현미경검사(저온EM) 사진(도 10C) 중에서, 균일한 크기 및 50 ㎚ 초과의 직경을 갖는 220개 입자를 각각 컴퓨터 오버랩핑 및 구조 재구성을 위해 선택하여 H58N35-33T1-52S4 VLP의 3차원 구조를 획득하였다. 상기 획득된 3차원 구조를 도 10D(분해능: 18Å)에 도시하였다. 상기 결과는 H58N35-33T1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4가 모두 72개의 캡소머(형태학적 서브유닛, 오량체)로 이루어지는 T=7 20면체 구조(h=1, k=2)를 가짐을 보였다. 준-등가(quasi-equivalence) 원리와 일치하는 통상적인 20면체 바이러스 캡시드와 달리, H58N35-33T1 VLP 및 H58N35-33T1-52S4 VLP 구조 중 모든 구성 서브유닛들은 육량체 없이 오량체였다. 더욱이, 상기 두 VLP들은 약 60 ㎚의 외부 직경을 가졌다. 이들은 앞서 보고된 천연 HPV 바이러스 입자 및 진핵생물 발현 시스템(예를 들어 폭스바이러스 발현 시스템)에 의해 제조된 HPV VLP의 3차원 구조와 유사하였다(Baker TS, Newcomb WW, Olson NH. et al. Biophys J. (1991), 60(6): 1445-1456. Hagensee ME, Olson NH, Baker TS, et al. J Virol. (1994), 68(7):4503-4505. Buck CB, Cheng N, Thompson CD. et al. J Virol. (2008), 82(11): 5190-7).
본 발명의 구체적인 실시태양들을 상세히 기재하였지만, 당업자들은 명세서에 개시된 교시에 따라, 이들에 대한 다양한 변형 및 변화를 수행할 수 있고 상기와 같은 변형 및 변화는 본 발명의 범위내에 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구의 범위 및 그의 임의의 균등물에 의해 제공된다.
SEQUENCE LISTING <110> XIAMEN UNIVERSITY; XIAMEN INNOVAX BIOTECH CO. , LTD. <120> MUTANT OF L1 PROTEIN OF HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE 58 <130> IEC150085 <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 524 <212> PRT <213> HPV 58 <400> 1 Met Val Leu Ile Leu Cys Cys Thr Leu Ala Ile Leu Phe Cys Val Ala 1 5 10 15 Asp Val Asn Val Phe His Ile Phe Leu Gln Met Ser Val Trp Arg Pro 20 25 30 Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val Pro Val Ser Lys Val Val 35 40 45 Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ser Arg Thr Ser Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly 50 55 60 Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly Asn Pro Tyr Phe Ser Ile Lys Ser 65 70 75 80 Pro Asn Asn Asn Lys Lys Val Leu Val Pro Lys Val Ser Gly Leu Gln 85 90 95 Tyr Arg Val Phe Arg Val Arg Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Phe 100 105 110 Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala 115 120 125 Cys Val Gly Leu Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val 130 135 140 Ser Gly His Pro Tyr Leu Asn Lys Phe Asp Asp Thr Glu Thr Ser Asn 145 150 155 160 Arg Tyr Pro Ala Gln Pro Gly Ser Asp Asn Arg Glu Cys Leu Ser Met 165 170 175 Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly Cys Lys Pro Pro Thr 180 185 190 Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Asn Asn Ala Ala Ala 195 200 205 Thr Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Phe Asn Ser Ile Ile Glu Asp Gly 210 215 220 Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Cys Met Asp Phe Gly Thr Leu Gln 225 230 235 240 Ala Asn Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile Cys Asn Ser Thr Cys Lys 245 250 255 Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Ala Ser Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu 260 265 270 Phe Phe Phe Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe Val Arg His Phe Phe Asn 275 280 285 Arg Ala Gly Lys Leu Gly Glu Ala Val Pro Asp Asp Leu Tyr Ile Lys 290 295 300 Gly Ser Gly Asn Thr Ala Val Ile Gln Ser Ser Ala Phe Phe Pro Thr 305 310 315 320 Pro Ser Gly Ser Ile Val Thr Ser Glu Ser Gln Leu Phe Asn Lys Pro 325 330 335 Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly 340 345 350 Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met 355 360 365 Thr Leu Cys Thr Glu Val Thr Lys Glu Gly Thr Tyr Lys Asn Asp Asn 370 375 380 Phe Lys Glu Tyr Val Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Val 385 390 395 400 Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Ala Glu Ile Met Thr Tyr Ile 405 410 415 His Thr Met Asp Ser Asn Ile Leu Glu Asp Trp Gln Phe Gly Leu Thr 420 425 430 Pro Pro Pro Ser Ala Ser Leu Gln Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser 435 440 445 Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Thr Ala Pro Pro Lys Glu Lys Glu Asp 450 455 460 Pro Leu Asn Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe 465 470 475 480 Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln 485 490 495 Ser Gly Leu Lys Ala Lys Pro Arg Leu Lys Arg Ser Ala Pro Thr Thr 500 505 510 Arg Ala Pro Ser Thr Lys Arg Lys Lys Val Lys Lys 515 520 <210> 2 <211> 499 <212> PRT <213> HPV 33 <400> 2 Met Ser Val Trp Arg Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val 1 5 10 15 Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ser Arg Thr Ser 20 25 30 Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro 35 40 45 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Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Lys Pro Lys Leu Lys 465 470 475 480 Arg Ala Ala Pro Thr Ser Thr Arg Thr Ser Ser Ala Lys Arg Lys Lys 485 490 495 Val Lys Lys <210> 3 <211> 529 <212> PRT <213> HPV 52 <400> 3 Met Val Gln Ile Leu Phe Tyr Ile Leu Val Ile Phe Tyr Tyr Val Ala 1 5 10 15 Gly Val Asn Val Phe His Ile Phe Leu Gln Met Ser Val Trp Arg Pro 20 25 30 Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val Pro Val Ser Lys Val Val 35 40 45 Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ser Arg Thr Ser Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly 50 55 60 Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly His Pro Tyr Phe Ser Ile Lys Asn 65 70 75 80 Thr Ser Ser Gly Asn Gly Lys Lys Val Leu Val Pro Lys Val Ser Gly 85 90 95 Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile Lys Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe 100 105 110 Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Glu Thr Gln Arg Leu Val 115 120 125 Trp Ala Cys Thr Gly Leu Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Phe Asp Asp Thr Glu Thr 145 150 155 160 Ser Asn Lys Tyr Ala Gly Lys Pro Gly Ile Asp 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agcggccacc ccttactgaa caagttcgac 360 gacaccgaga ccggaaacaa gtaccccgga cagcccggcg ctgacaacag ggagtgcctg 420 agcatggact acaagcagac ccagctgtgc ctgatcggct gcaagccccc caccggcgag 480 cactggggca agggcgtggc ctgcaacaac aacgccgccg ccaccgactg cccccccctg 540 gagctgttca acagcatcat cgaggacggc gacatggtgg acaccggctt cggctgcatg 600 gacttcggca ccctgcaggc caacaagagc gacgtgccca tcgacatctg caacagcacc 660 tgcaagtacc ccgactacct gaagatggcc agcgagccct acggcgacag cctgttcttc 720 ttcctgagga gggagcagat gttcgtgagg cacttcttca acagggccgg caagctgggc 780 gaggccgtgc ccgacgacct gtacatcaag ggcagcggca acaccgccgt gatccagagc 840 agcgccttct tccccacccc cagcggcagc atcgtgacca gcgagagcca gctgttcaac 900 aagccctact ggctgcagag ggcccagggc cacaacaacg gcatctgctg gggcaaccag 960 ctgttcgtga ccgtggtgga caccaccagg agcaccaaca tgaccctgtg caccgaggtg 1020 accaaggagg gcacctacaa gaacgacaac ttcaaggagt acgtgaggca cgtggaggag 1080 tacgacctgc agttcgtgtt ccagctgtgc aagatcaccc tgaccgccga gatcatgacc 1140 tacatccaca ccatggacag caacatcctg gaggactggc 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cgccgacctg gaccagttcc ccctgggcag gaagttcctg 1380 ctgcagagcg gcctgaaggc caagcccagg ctgaagagga gcgcccccac caccagggcc 1440 cccagcacca agaggaagaa ggtgaagaag taa 1473 <210> 29 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 cttcagcatc aagaatccca ctaacgctaa aaaattactg gtgcccaagg 50 <210> 30 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 ccttgggcac cagtaatttt ttagcgttag tgggattctt gatgctgaag 50 <210> 31 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 cctgggcgtc ggaataagcg gccacccctt actgaacaag ttcg 44 <210> 32 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 cgaacttgtt cagtaagggg tggccgctta ttccgacgcc cagg 44 <210> 33 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 cgacaccgag accggaaaca agtaccccgc ccagc 35 <210> 34 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 gctgggcggg gtacttgttt ccggtctcgg tgtcg 35 <210> 35 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 aacaagtacc ccggacagcc cggcgctgac aacagggagt 40 <210> 36 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 actccctgtt gtcagcgccg ggctgtccgg ggtacttgtt 40 <210> 37 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 37 ggggcaaggg agtagcatgt acaaacgctg cacctgccaa cgactgc 47 <210> 38 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 gcagtcgttg gcaggtgcag cgtttgtaca tgctactccc ttgcccc 47 <210> 39 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 caagggcagc ggcacaacag caagtatcca gagcagcg 38 <210> 40 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 cgctgctctg gatacttgct gttgtgccgc tgcccttg 38 <210> 41 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 41 ccgaggtgac cagcgacagc acgtacaaga acgagaactt caaggag 47 <210> 42 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 42 ctccttgaag ttctcgttct tgtacgtgct gtcgctggtc acctcgg 47 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 43 ctgatcggct gcaagccccc cac 23 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 44 cacgcaggcc cacaccagcc 20 <210> 45 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 45 gagctgttca acagcatcat cgagg 25 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 46 ggtggggggc ttgcagccga tc 22 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 47 atcgtgacca gcgagagcca gc 22 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 48 cttcaggtag tcggggtact tgc 23 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 gtgaggcacg tggaggagta cg 22 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 ggtgcacagg gtcatgttgg tg 22 <210> 51 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 51 gaggctggtg tgggcctgcg tgggcctgga gatcggcagg 40 <210> 52 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 52 tggggggctt gcagccgatc aggcacagct gggtctgctt g 41 <210> 53 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 53 tgatcggctg caagcccccc accggcgagc actggggcaa ggg 43 <210> 54 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 54 tcgatgatgc tgttgaacag ctccaggggg gggcagtcgc cg 42 <210> 55 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 55 gcaagtaccc cgactacctg aagatggcca gcgagccct 39 <210> 56 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 56 gctggctctc gctggtcacg atgctgccgc tgggggtg 38 <210> 57 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 57 caccaacatg accctgtgca ccgaggtgaa gaaggagag 39 <210> 58 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 58 cgtactcctc cacgtgcctc acgtactcct tgaagttctc g 41 <210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> HPV 33 <400> 59 Asn Pro Thr Asn Ala Lys Lys Leu 1 5 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> HPV 33 <400> 60 Ser Asp Ser Thr Tyr Lys Asn Glu 1 5 <210> 61 <211> 25 <212> PRT <213> HPV 52 <400> 61 Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Phe Asp Asp Thr Glu Thr Ser 1 5 10 15 Asn Lys Tyr Ala Gly Lys Pro Gly Ile 20 25 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> HPV 52 <400> 62 Lys Lys Glu Ser Thr Tyr Lys Asn Glu 1 5

Claims (22)

  1. 돌연변이된 HPV58 L1 단백질로, 상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질이 야생형 HPV58 L1 단백질과 비교하여 하기의 돌연변이를 갖는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질:
    (1) 5 내지 70개 아미노산의 N-말단 절두; 및
    (2)(a) 서열번호 1의 80 내지 87번 위치에 상응하는 상기 야생형 HPV58 L1 단백질의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV 33의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기로의 치환; 또는
    (b) 서열번호 1의 376 내지 383번 위치에 상응하는 상기 야생형 HPV58 L1 단백질의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV 33의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기로의 치환,
    상기 상응하는 위치는 비교되는 서열들의 최적의 정렬에 의해 결정되는 위치이다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질이 하기의 돌연변이를 갖는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질:
    (1) 5 내지 70개 아미노산의 N-말단 절두;
    (2)(a) 서열번호 1의 80 내지 87번 위치에 상응하는 상기 야생형 HPV58 L1 단백질의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV 33의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기로의 치환; 및
    (3)(a) 서열번호 1의 375 내지 383번 위치에 상응하는 상기 야생형 HPV58 L1 단백질의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV52의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기로의 치환;또는
    (b) 서열번호 1의 144 내지 168번 위치에 상응하는 상기 야생형 HPV58 L1 단백질의 아미노산 잔기의, 야생형 HPV52의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기로의 치환,
    상기 상응하는 위치는 비교되는 서열들의 최적의 정렬에 의해 결정되는 위치이다.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질이 상기 야생형 HPV58 L1 단백질과 비교하여, N-말단에 절두된 5, 15, 27, 35, 40, 60 또는 70개의 아미노산을 갖는, 돌연변이된 HPV58 L1 단백질.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 (2)(a)에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 야생형 HPV33 L1 단백질의 54-61번 위치의 아미노산 잔기이고; 및/또는, 상기 (2)(b)에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 야생형 HPV33 L1 단백질의 350-357번 위치의 아미노산 잔기인,
    돌연변이된 HPV58 L1 단백질.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 (3)(a)에 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 야생형 HPV52 L1 단백질의 380-388번 위치의 아미노산 잔기이고; 및/또는, 상기 3(b)에 기재된 바와 같은 상응하는 위치의 아미노산 잔기가 야생형 HPV52 L1 단백질의 146-170번 위치의 아미노산 잔기인,
    돌연변이된 HPV58 L1 단백질.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질은 하기 사항 중 어느 하나 이상으로 특징지어지는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질:
    (i) 상기 야생형 HPV58 L1 단백질이 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 갖고;
    (ii) 상기 야생형 HPV33 L1 단백질이 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
  7. 제 2 항에 있어서,
    상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질은 하기 사항 중 어느 하나 이상으로 특징지어지는 돌연변이된 HPV58 L1 단백질:
    (i) 상기 야생형 HPV58 L1 단백질이 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 갖고;
    (ii) 상기 야생형 HPV33 L1 단백질이 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖고;
    (iii) 상기 야생형 HPV52 L1 단백질이 서열번호 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질이 서열번호 4, 10, 11 및 14로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는, 돌연변이된 HPV58 L1 단백질.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이된 HPV58 L1 단백질을 암호화하는 단리된 핵산.
  10. 제 9 항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  11. 제 9 항에 따른 단리된 핵산 및/또는 상기 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  12. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이된 HPV58 L1 단백질을 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 HPV 바이러스유사 입자.
  13. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이된 HPV58 L1 단백질, 또는
    제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이된 HPV58 L1 단백질을 암호화 하는 단리된 핵산, 또는
    상기 단리된 핵산을 포함하는 벡터, 또는
    상기 단리된 핵산 및/또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포, 또는
    제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이된 HPV58 L1 단백질을 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 HPV 바이러스유사 입자
    를 포함하는 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질병의 예방에 사용되기 위한 조성물.
  14. 제 12 항에 따른 HPV 바이러스유사 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질병의 예방에 사용되기 위한 약학 조성물.
  15. 제 12 항에 따른 HPV 바이러스유사 입자 및 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질병의 예방에 사용되기 위한 백신.
  16. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이된 HPV58 L1 단백질 의 제조 방법으로, 상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질를 숙주 세포에서 발현시키고, 이어서 상기 돌연변이된 HPV58 L1 단백질을 상기 숙주 세포의 배양물로부터 회수함을 포함하는, 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 숙주 세포가 이 콜라이(E. coli)인, 방법.
  18. 제 12 항에 따른 HPV 바이러스유사 입자를 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제와 병용함을 포함하는 백신의 제조 방법.
  19. HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질병의 예방을 위해 사용되는, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 돌연변이된 HPV58 L1 단백질.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 HPV 감염 또는 상기 질병이 하기 중 어느 하나 이상인 돌연변이된 HPV58 L1 단백질:
    HPV58 감염, HPV33 감염 및 HPV52 감염; 및
    자궁경부암 및 첨형 콘딜로마로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 HPV 감염에 의해 유발된 질병.
  21. 제 12 항에 있어서,
    상기 HPV 바이러스유사 입자는 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질병의 예방에 사용되기 위한, HPV 바이러스유사 입자.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 HPV 감염 또는 상기 질병이 하기 중 어느 하나 이상인 HPV 바이러스유사 입자:
    HPV58 감염, HPV33 감염 및 HPV52 감염; 및
    자궁경부암 및 첨형 콘딜로마로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 HPV 감염에 의해 유발된 질병.
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