JP7265563B2 - ヒトパピローマウイルス１８型のｌ１タンパク質の変異体 - Google Patents

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Description

本出願は、２０１８年６月４日に出願された中国特許出願第２０１８１０５６６２０８．８号に基づき、その優先権の利益を主張し、その開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（技術分野）
本発明は、分子ウイルス学及び免疫学の分野に関する。特に本発明は、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質（又はその変種）、これをコードする配列、これを調製する方法、及びこれを含むウイルス様粒子に関し、ここで、前記タンパク質（又はその変種）及びウイルス様粒子は、少なくとも２種のＨＰＶ型（例えばＨＰＶ１８とＨＰＶ４５、又はＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５９）に対する中和抗体の生成を誘導することができ、従って前記少なくとも２種のＨＰＶ型による感染、及び前記感染によって引き起こされる疾患、例えば子宮頸癌及び尖圭コンジローマを防ぐために使用することができる。本発明はさらに、前記少なくとも２種のＨＰＶ型による感染、及び前記感染によって引き起こされる疾患、例えば子宮頸癌及び尖圭コンジローマを、予防するための医薬組成物又はワクチンの製造における前記タンパク質及びウイルス様粒子の使用に関する。
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、主に皮膚や粘膜にいぼを発生させる。ＨＰＶの型は、腫瘍形成との関連に応じて高リスク型と低リスク型に分けられる。その中で、高リスクのＨＰＶ型による感染は、女性の子宮頸癌を含む生殖器癌の主な原因であることが示されており、低リスクのＨＰＶ型は、主に尖圭コンジローマを引き起こす。ＨＰＶ感染を予防及び制御するための最も効果的な方法は、ＨＰＶワクチン、特に子宮頸癌を引き起こす高リスクのＨＰＶ型に対するワクチンを接種することである。
ＨＰＶの主要なキャプシドタンパク質Ｌ１は、自己集合して中空のウイルス様粒子（ＶＬＰ）になるという特徴がある。ＨＰＶ ＶＬＰは、主要なキャプシドタンパク質Ｌ１の７２個の五量体で構成された対称二十面体構造を有する（Doorbar, J. and P.H. Gallimore. 1987. J Virol, 61(9): 2793-9）。ＨＰＶ ＶＬＰは、構造が天然のＨＰＶと非常に類似しており、天然ウイルスの中和性エピトープのほとんどを保持し、高力価中和抗体の生成を誘導することができる（Kirnbauer, R., F. Booy, et al. 1992 Proc Natl Acad Sci U S A 89(24): 12180-4）。
しかし既存の研究では、ＨＰＶ ＶＬＰは主に、同じＨＰＶ型に対する中和抗体の生成を誘導し、同じＨＰＶ型に対する防御免疫を生成し、いくつかの相同性の高いＨＰＶ型の中では交差防御効果が低いことが示されている（Sara L. Bissett, Giada Mattiuzzo, et al. 2014 Vaccine. 32:6548-6555）。従って、既存のＨＰＶワクチンの防御範囲は非常に限られている。一般に、１種のＨＰＶ型のＶＬＰは、同じＨＰＶ型による感染を防ぐために使用できるだけである。この場合、ＨＰＶワクチンの防御範囲を広げる必要があるなら、唯一の方法は、ワクチン中により多くのＨＰＶ型のＶＬＰを追加することである。現在、市販のＨＰＶワクチン、例えばMerckのGardasil（登録商標）（これは、ＨＰＶ１６、１８、６、及び１１に対する４価ワクチンである）、GSKのCervarix（登録商標）（これは、ＨＰＶ１６及び１８に対する２価ワクチンである）、MerckのGardasil（登録商標）9（これは、ＨＰＶ６、１１、１６、１８、３１、３３、４５、５２、及び５８に対する９価ワクチンである）は、複数のＨＰＶ型のＶＬＰを組み合わせて調製される。しかし、そのような解決策はＨＰＶワクチンの製造コストを大幅に上昇させ、免疫用量の増加により安全性の問題を引き起こす可能性がある。
従って、当該分野では、複数のＨＰＶ型による感染、及び感染によって引き起こされる疾患、例えば子宮頸癌及び尖圭コンジローマを、より経済的かつ効果的に予防するために、複数のＨＰＶ型に対する防御性中和抗体の生成を誘導することができるＨＰＶウイルス様粒子を、開発することが急務である。
発明の内容
本発明は、少なくとも部分的に、本発明者らの驚くべき発見に基づいている：ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１８型のＬ１タンパク質の特定のセグメントを、第２のＨＰＶ型（例えばＨＰＶ４５）のＬ１タンパク質の対応するセグメントで置換した後に、このようにして得られた変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、生物においてＨＰＶ１８及び２番目のＨＰＶ型（例えばＨＰＶ４５）に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、その防御効果はＨＰＶ１８ ＶＬＰと２番目のＨＰＶ型のＶＬＰの混合物の防御効果と同等であり、ＨＰＶ１８に対するその防御効果はＨＰＶ１８ ＶＬＰ単独の防御効果と同等であり、２番目のＨＰＶ型（例えばＨＰＶ４５）に対するその防御効果は２番目のＨＰＶ型のＶＬＰ単独の防御効果と同等である。
さらに、上記置換に基づいて、ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の別の特定のセグメントを、第３のＨＰＶ型（例えばＨＰＶ５９）のＬ１タンパク質の対応するセグメントでさらに置換することができ、こうして得られた２重置換を有する変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、ＨＰＶ１８、２番目のＨＰＶ型（例えばＨＰＶ４５）、及び３番目のＨＰＶ型（例えばＨＰＶ５９）に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、その防御効果は、ＨＰＶ１８ ＶＬＰと、２番目のＨＰＶ型のＶＬＰと、３番目のＨＰＶ型のＶＬＰとの混合物の防御効果と同等であり、ＨＰＶ１８に対するその防御効果は、ＨＰＶ１８ ＶＬＰ単独の防御効果と同等であり、２番目のＨＰＶ型（例えばＨＰＶ４５）に対するその防御効果は、２番目のＨＰＶ型のＶＬＰ単独の防御効果と同等であり、３番目のＨＰＶ型（例えばＨＰＶ５９）に対する防御効果は、３番目のＨＰＶ型のＶＬＰ単独の防御効果と同等である。
従って、１つの態様において本発明は、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質若しくはその変種を提供し、ここで野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質と比較して、前記変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は以下の変異：
（１）４０～８０個のアミノ酸、例えば４０～５０、４５～７０、５０～７０、５５～６５、６０～７０、６５～７５、６０～８０、又は７０～８０個のアミノ酸のＮ末端切断；そして
（２）（ａ）野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の２３５～２４３位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、又は
（ｂ）野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の３２７～３４６位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、又は
（ｃ）野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１１４～１２３位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、又は
（ｄ）野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１７６～２０２位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、を有し、
そして、前記変種は、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９）のアミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、付加、又は欠失によってのみ、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質と異なり、そして、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の機能、すなわち少なくとも２種のＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ１８とＨＰＶ４５、又はＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５９）に対する中和抗体の生成を誘導する能力、を保持する。
いくつかの好適な実施態様において、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、（２）（ａ）又は（２）（ｂ）で定義されるような変異を有し、そして任意選択的に、さらに以下の変異を有する：
（３）野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１１２～１２３位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換。
いくつかの好適な実施態様において、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、（２）（ｃ）又は（２）（ｄ）で定義されるような変異を有し、そして任意選択的に、さらに以下の変異を有する：
（４）野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の４１０～４２１位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換。
いくつかの好適な実施態様において、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、（２）（ｃ）及び（２）（ａ）で定義されるような変異を有し、そして任意選択的に、さらに（４）で定義されるような変異を有する。
いくつかの好適な実施態様において、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、以下の変異を有する：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の２３５～２４３位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１１２～１２３位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換。
いくつかの好適な実施態様において、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、以下の変異を有する：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の３２７～３４６位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１１２～１２３位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換。
いくつかの好適な実施態様において、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、以下の変異を有する：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１１４～１２３位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の４１０～４２１位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換。
いくつかの好適な実施態様において、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、以下の変異を有する：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１７６～２０２位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の４１０～４２１位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換。
いくつかの好適な実施態様において、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、以下の変異を有する：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１１４～１２３位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の２３５～２４３位のアミノ酸残基の、第２の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の４１０～４２１位のアミノ酸残基の、第３の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換。
いくつかの好適な実施態様において、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質と比較して、Ｎ末端の４５、５０、５２、５５、５８、６０、６２、６５、６８、７０、７２、７５、又は７８個のアミノ酸が切断されている。
いくつかの好適な実施態様において、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質と比較して、Ｎ末端の６５個のアミノ酸が切断されている。
いくつかの好適な実施態様において、第２の型の野生型ＨＰＶはＨＰＶ４５である。いくつかの好適な実施態様において、（２）（ａ）に記載されるような対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２０１～２０９位のアミノ酸残基である。いくつかの好適な実施態様において、（２）（ｂ）に記載されるような対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２９３～３１４位のアミノ酸残基である。いくつかの好適な実施態様において、（２）（ｃ）に記載されるような対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の７９～８９位のアミノ酸残基である。いくつかの好適な実施態様において、（２）（ｄ）に記載されるような対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の１４２～１６８位のアミノ酸残基である。
いくつかの好適な実施態様において、第３の型の野生型ＨＰＶはＨＰＶ５９である。いくつかの好適な実施態様において、（３）に記載されるような対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の５１～６２位のアミノ酸残基である。いくつかの好適な実施態様において、（４）に記載されるような対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の３４９～３６０位のアミノ酸残基である。
いくつかの好適な実施態様において、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、配列番号１又は１１３に記載されるようなアミノ酸配列を有する。
いくつかの好適な実施態様において、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質は、配列番号２又は１１５に記載されるようなアミノ酸配列を有する。
いくつかの好適な実施態様において、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質は、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有する。
いくつかの好適な実施態様において、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の７９～８９位のアミノ酸残基は、配列番号３９に示されるような配列を有する。
いくつかの好適な実施態様において、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の１４２～１６８位のアミノ酸残基は、配列番号４０に示されるような配列を有する。
いくつかの好適な実施態様において、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２０１～２０９位のアミノ酸残基は、配列番号４１に示されるような配列を有する。
いくつかの好適な実施態様において、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２９３～３１４位のアミノ酸残基は、配列番号４２に示されるような配列を有する。
いくつかの好適な実施態様において、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の５１～６２のアミノ酸残基は、配列番号４３に示されるような配列を有する。
いくつかの好適な実施態様において、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の３４９～３６０位のアミノ酸残基は、配列番号４４に示されるような配列を有する。
いくつかの好適な実施態様において、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、配列番号４、５、６、７、９、１３、１７、１８、及び１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの好適な実施態様において、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、配列番号６、７、９、１３、１７、１８、及び１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
別の態様において、本発明はさらに、上述した変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質若しくはその変種をコードする単離された核酸を提供する。別の態様において、本発明は、単離された核酸を含むベクターを提供する。いくつかの好適な実施態様において、本発明の単離された核酸は、配列番号２３、２４、２５、２６、２８、３２、３６、３７、及び３８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。いくつかのより好適な実施態様において、本発明の単離された核酸は、配列番号２５、２６、２８、３２、３６、３７、及び３８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。
目的のポリヌクレオチドの挿入に有用なベクターは、当該分野で公知であり、特に限定されるものではないが、クローニングベクター及び発現ベクターが含まれる。 １つの実施態様において、ベクターは、例えばプラスミド、コスミド、ファージなどである。
別の態様において、本発明はさらに、単離された核酸又はベクターを含む宿主細胞に関する。 宿主細胞には、特に限定されるものではないが、原核細胞、例えば大腸菌（E. coli）細胞、ならびに真核細胞、例えば酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び動物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばマウス細胞、ヒト細胞）が含まれる。 本発明の宿主細胞はまた、２９３Ｔ細胞などの細胞株であり得る。
別の態様において、本発明は、本発明の変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質その変種を含むか又はそれからなるＨＰＶウイルス様粒子に関する。
いくつかの好適な実施態様において、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質を含み、これは、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質と比較した場合、４０～８０個のアミノ酸、例えば４０～５０、４５～７０、５０～７０、５５～６５、６０～７０、６５～７５、６０～８０、又は７０～８０個のアミノ酸、例えば４５、５０、５２、５５、５８、６０、６２、６５、６８、７０、７２、７５、又は７８個のアミノ酸のＮ末端切断と、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の２３５～２４３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２０１～２０９位のアミノ酸残基による置換とを有する。
いくつかの好適な実施態様において、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質を含み、これは、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質と比較した場合、４０～８０個のアミノ酸、例えば４０～５０、４５～７０、５０～７０、５５～６５、６０～７０、６５～７５、６０～８０、又は７０～８０個のアミノ酸、例えば４５、５０、５２、５５、５８、６０、６２、６５、６８、７０、７２、７５、又は７８個のアミノ酸のＮ末端切断と、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の３２７～３４６位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２９３～３１４位のアミノ酸残基による置換とを有する。
いくつかの好適な実施態様において、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質を含み、これは、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質と比較した場合、４０～８０個のアミノ酸、例えば４０～５０、４５～７０、５０～７０、５５～６５、６０～７０、６５～７５、６０～８０、又は７０～８０個のアミノ酸、例えば４５、５０、５２、５５、５８、６０、６２、６５、６８、７０、７２、７５、又は７８個のアミノ酸のＮ末端切断と、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１１４～１２３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の７９～８９位のアミノ酸残基による置換とを有する。
いくつかの好適な実施態様において、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質を含み、これは、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質と比較した場合、４０～８０個のアミノ酸、例えば４０～５０、４５～７０、５０～７０、５５～６５、６０～７０、６５～７５、６０～８０、又は７０～８０個のアミノ酸、例えば４５、５０、５２、５５、５８、６０、６２、６５、６８、７０、７２、７５、又は７８個のアミノ酸のＮ末端切断と、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１７６～２０２位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の１４２～１６８位のアミノ酸残基による置換とを有する。
いくつかの好適な実施態様において、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質を含み、これは、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質と比較した場合、４０～８０個のアミノ酸、例えば４０～５０、４５～７０、５０～７０、５５～６５、６０～７０、６５～７５、６０～８０、又は７０～８０個のアミノ酸、例えば４５、５０、５２、５５、５８、６０、６２、６５、６８、７０、７２、７５、又は７８個のアミノ酸のＮ末端切断と、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の２３５～２４３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２０１～２０９位のアミノ酸残基による置換と、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１１２～１２３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の５１～６２位のアミノ酸残基による置換とを有する。
いくつかの好適な実施態様において、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質を含み、これは、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質と比較した場合、４０～８０個のアミノ酸、例えば４０～５０、４５～７０、５０～７０、５５～６５、６０～７０、６５～７５、６０～８０、又は７０～８０個のアミノ酸、例えば４５、５０、５２、５５、５８、６０、６２、６５、６８、７０、７２、７５、又は７８個のアミノ酸のＮ末端切断と、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の３２７～３４６位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２９３～３１４位のアミノ酸残基による置換と、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１１２～１２３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の５１～６２位のアミノ酸残基による置換とを有する。
いくつかの好適な実施態様において、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質を含み、これは、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質と比較した場合、４０～８０個のアミノ酸、例えば４０～５０、４５～７０、５０～７０、５５～６５、６０～７０、６５～７５、６０～８０、又は７０～８０個のアミノ酸、例えば４５、５０、５２、５５、５８、６０、６２、６５、６８、７０、７２、７５、又は７８個のアミノ酸のＮ末端切断と、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１１４～１２３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の７９～８９位のアミノ酸残基による置換と、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の４１０～４２１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の３４９～３６０位のアミノ酸残基による置換とを有する。
いくつかの好適な実施態様において、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質を含み、これは、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質と比較した場合、４０～８０個のアミノ酸、例えば４０～５０、４５～７０、５０～７０、５５～６５、６０～７０、６５～７５、６０～８０、又は７０～８０個のアミノ酸、例えば４５、５０、５２、５５、５８、６０、６２、６５、６８、７０、７２、７５、又は７８個のアミノ酸のＮ末端切断と、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１７６～２０２位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の１４２～１６８位のアミノ酸残基による置換と、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の４１０～４２１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の３４９～３６０位のアミノ酸残基による置換とを有する。
いくつかの好適な実施態様において、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質を含み、これは、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質と比較した場合、４０～８０個のアミノ酸、例えば４０～５０、４５～７０、５０～７０、５５～６５、６０～７０、６５～７５、６０～８０、又は７０～８０個のアミノ酸、例えば４５、５０、５２、５５、５８、６０、６２、６５、６８、７０、７２、７５、又は７８個のアミノ酸のＮ末端切断と、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１１４～１２３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の７９～８９位のアミノ酸残基による置換と、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の２３５～２４３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２０１～２０９位のアミノ酸残基による置換と、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の４１０～４２１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の３４９～３６０位のアミノ酸残基による置換とを有する。
特に好適な実施態様において、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は、配列番号４、５、６、７、９、１３、１７、１８、又は１９に記載の配列を有する変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質を含む。
別の態様において、本発明はさらに、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質若しくはその変種、単離された核酸、ベクター、宿主細胞、又はＨＰＶウイルス様粒子を含む組成物に関する。いくつかの好適な実施態様において、前記組成物は、本発明の変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質若しくはその変種を含む。いくつかの好適な実施態様において、前記組成物は、本発明のＨＰＶウイルス様粒子含む。
別の態様において、本発明はさらに、本発明のＨＰＶウイルス様粒子、及び任意選択的に医薬的に許容し得る担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物又はワクチンに関する。本発明の前記医薬組成物又はワクチンは、ＨＰＶ感染、又はＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患、例えば子宮頸癌及び尖圭コンジローマを予防するために使用することができる。
いくつかの好適な実施態様において、ＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するのに有効な量で存在する。いくつかの好適な実施態様において、ＨＰＶ感染は、１種以上のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ１８感染、ＨＰＶ４５感染、及び／又はＨＰＶ５９感染）である。いくつかの好適な実施態様において、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌及び尖圭コンジローマからなる群から選択される。
本発明の医薬組成物又はワクチンは、当該分野で公知の方法によって、例えば、特に限定されるものではないが、経口的に又は注射によって投与することができる。本発明において、特に好ましい投与経路は注射である。
いくつかの好適な実施態様において、本発明の医薬組成物又はワクチンは、単位用量の形態で投与される。例えば、特に限定されるものではないが、各単位用量は、５μｇ～８０μｇ、好ましくは２０μｇ～４０μｇのＨＰＶウイルス様粒子を含む。
別の態様において本発明は、上述した変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質若しくはその変種を調製する方法に関し、この方法は、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質若しくはその変種を宿主細胞中で発現させ、次に変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質若しくはその変種を宿主細胞の培養物から回収することを含む。
いくつかの好適な実施態様において、宿主細胞は、大腸菌である。
いくつかの好適な実施態様において、この方法は、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質若しくはその変種を大腸菌中で発現させる工程と、次に大腸菌の溶解物上清を精製することによって変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質若しくはその変種を得る工程とを含む。いくつかの好適な実施態様において、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質若しくはその変種は、大腸菌の溶解物上清から、クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー）によって回収される。
別の態様において、本発明は、本発明のＨＰＶウイルス様粒子を医薬的に許容し得る担体及び／又は賦形剤と組み合わせることを含む、ワクチンの調製方法に関する。
別の態様において、本発明は、被験体に予防的に有効な量の本発明のＨＰＶウイルス様粒子又は医薬組成物又はワクチンを投与することを含む、ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するための方法に関する。好適な実施態様において、ＨＰＶ感染は、１種以上のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ１８感染、ＨＰＶ４５感染、及び／又はＨＰＶ５９感染）である。別の好適な実施態様において、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患には、特に限定されるものではないが、子宮頸癌及び尖圭コンジローマが含まれる。別の好適な実施態様において、被験体は、ヒトなどの哺乳動物である。
別の態様において、本発明はさらに、ＨＰＶ感染又はＨＰＶによって引き起こされる疾患を予防するための医薬組成物又はワクチンの製造における、本発明の変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質若しくはその変種、又はＨＰＶウイルス様粒子の使用に関する。好適な実施態様において、ＨＰＶ感染は、１種以上のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ１８感染、ＨＰＶ４５感染、及び／又はＨＰＶ５９感染）である。別の好適な実施態様において、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患には、特に限定されるものではないが、子宮頸癌及び尖圭コンジローマが含まれる。
別の態様において、本発明はさらに、ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患の予防のための、本発明の変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質若しくはその変種、又はＨＰＶウイルス様粒子に関する。好適な実施態様において、ＨＰＶ感染は、１種以上のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ１８感染、ＨＰＶ４５感染、及び／又はＨＰＶ５９感染）である。別の好適な実施態様において、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患には、特に限定されるものではないが、子宮頸癌及び尖圭コンジローマが含まれる。
本発明における用語の定義
本発明において、他に明記されない限り、本明細書で使用される科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、及び免疫学の実験室操作は、対応する分野で広く使用されている日常的な操作である。一方、本発明をよりよく理解するために、関連する用語の定義及び説明を以下に提供する。
本発明において「第２の型の野生型ＨＰＶ」という用語は、ＨＰＶ１８以外の野生型ＨＰＶ型を指す。本発明において第２の型の野生型ＨＰＶは、好ましくは野生型ＨＰＶ４５である。本発明において「第３の型の野生型ＨＰＶ」という用語は、ＨＰＶ１８及び第２の型の野生型ＨＰＶ型以外の野生型ＨＰＶを指す。本発明において第３の型の野生型ＨＰＶは、好ましくは野生型ＨＰＶ５９である。
本発明において「対応する位置」という表現は、配列が最適に整列されたとき、すなわち配列が最も高い割合の同一性を得るように整列されたときに、比較される配列の同等の位置を指す。
本発明において「野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質」という用語は、ヒトパピローマウイルス１８型（ＨＰＶ１８）に天然に存在する主要なキャプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の配列は当該分野で公知であり、公開データベース（例えば、ＮＣＢＩデータベースの受け入れ番号ＡＲＳ４３４２８．１、ＡＲＳ４３４０７．１、ＡＲＳ４３４０１．１、ＡＡＰ２０６０１．１、及びＡＢＰ９９７２７．１）で見つけることができる。
本発明において、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列が言及される場合、それは、配列番号１に記載される配列を参照することにより説明される。例えば「野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の２３５～２４３位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号１に記載のポリペプチドの２３５～２４３位のアミノ酸残基を指す。しかしながら当業者は、野生型ＨＰＶ１８が様々な分離株を含み得ること、及びさまざまな分離株間でＬ１タンパク質のアミノ酸配列に違いがあり得ることを理解している。さらに当業者は、配列に違いがあるかもしれないが、Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、異なるＨＰＶ１８分離株間で非常に高い同一性（一般に９５％より高い、例えば９６％より高い、９７％より高い、９８％より高い、又は９９％より高い）を有し、実質的に同じ生物学的機能を有することを理解している。従って本発明において、「野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質」という用語は、配列番号１に記載のタンパク質だけでなく、様々なＨＰＶ１８分離株のＬ１タンパク質（例えば、ＡＲＳ４３４２８．１、ＡＲＳ４３４０７．１、ＡＲＳ４３４０１．１、ＡＡＰ２０６０１．１、及びＡＢＰ９９７２７．１に記載のＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質）も含む。さらに、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、それは、配列番号１の配列断片だけでなく、様々なＨＰＶ１８分離株のＬ１タンパク質の対応する配列の断片も含む。例えば「野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の２３５～２４３位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号１の２３５～２４３位のアミノ酸残基、及び様々なＨＰＶ１８分離株のＬ１タンパク質の対応する断片を含む。
本発明において「野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質」という用語は、ヒトパピローマウイルス４５型（ＨＰＶ４５）に天然に存在する主要なキャプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の配列は当該分野で公知であり、公開データベース（例えば、ＮＣＢＩデータベースの受け入れ番号Ｐ３６７４１．１、ＡＬＶ８５６８９．１、ＡＢＰ９９８１５．１、ＡＧＵ９０６００．１、及びＡＬＶ８５６４９．１）で見つけることができる。
本発明において、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列が言及される場合、それは、配列番号２に記載される配列を参照することにより説明される。例えば「野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２０１～２０９位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号２に記載のポリペプチドの２０１～２０９位のアミノ酸残基を指す。しかしながら当業者は、野生型ＨＰＶ４５が様々な分離株を含み得ること、及びさまざまな分離株間でＬ１タンパク質のアミノ酸配列に違いがあり得ることを理解している。さらに当業者は、配列に違いがあるかもしれないが、Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、異なるＨＰＶ４５分離株間で非常に高い同一性（一般に９５％より高い、例えば９６％より高い、９７％より高い、９８％より高い、又は９９％より高い）を有し、実質的に同じ生物学的機能を有することを理解している。従って本発明において、「野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質」という用語は、配列番号２に記載のタンパク質だけでなく、様々なＨＰＶ４５分離株のＬ１タンパク質（例えば、Ｐ３６７４１．１、ＡＬＶ８５６８９．１、ＡＢＰ９９８１５．１、ＡＧＵ９０６００．１、及びＡＬＶ８５６４９．１に記載のＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質）も含む。さらに、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、それは、配列番号２の配列断片だけでなく、様々なＨＰＶ４５分離株のＬ１タンパク質の対応する配列の断片も含む。例えば「野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２０１～２０９位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号２の２０１～２０９位のアミノ酸残基、及び様々なＨＰＶ４５分離株のＬ１タンパク質の対応する断片を含む。
本発明において「野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質」という用語は、ヒトパピローマウイルス５９型（ＨＰＶ５９）に天然に存在する主要なキャプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の配列は当該分野で公知であり、公開データベース（例えば、ＮＣＢＩデータベースの受け入れ番号ＣＡＡ５４８５６．１、ＡＧＵ９０６５６．１、ＡＥＰ２３０８８．１、ＡＥＰ２３０８７．１、及びＡＧＵ９０６７２．１）で見つけることができる。
本発明において、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列が言及される場合、それは、配列番号３に記載される配列を参照することにより説明される。例えば「野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の５１～６２位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号３に記載のポリペプチドの５１～６２位のアミノ酸残基を指す。しかしながら当業者は、野生型ＨＰＶ５９が様々な分離株を含み得ること、及びさまざまな分離株間でＬ１タンパク質のアミノ酸配列に違いがあり得ることを理解している。さらに当業者は、配列に違いがあるかもしれないが、Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、異なるＨＰＶ５９分離株間で非常に高い同一性（一般に９５％より高い、例えば９６％より高い、９７％より高い、９８％より高い、又は９９％より高い）を有し、実質的に同じ生物学的機能を有することを理解している。従って本発明において、「野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質」という用語は、配列番号３に記載のタンパク質だけでなく、様々なＨＰＶ５９分離株のＬ１タンパク質（例えば、ＣＡＡ５４８５６．１、ＡＧＵ９０６５６．１、ＡＥＰ２３０８８．１、ＡＥＰ２３０８７．１、及びＡＧＵ９０６７２．１に記載のＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質）も含む。さらに、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、それは、配列番号３の配列断片だけでなく、様々なＨＰＶ５９分離株のＬ１タンパク質の対応する配列の断片も含む。例えば「野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の５１～６２位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号３の５１～６２位のアミノ酸残基、及び様々なＨＰＶ５９分離株のＬ１タンパク質の対応する断片を含む。
本発明において「対応する配列断片」又は「対応する断片」という表現は、配列が最適に整列されたとき、すなわち最も高い割合の同一性を得るように配列が整列されたときに、比較される配列の同等の位置に存在する断片を指す。
本発明において「Ｘ個のアミノ酸のＮ末端切断」又は「Ｘ個のアミノ酸がＮ末端で切断されている」という表現は、タンパク質のＮ末端の１位からＸ位までのアミノ酸残基を、開始コドン（タンパク質翻訳を開始するため）によりコードされるメチオニン残基で置換することを指す。例えば、６５個のアミノ酸がＮ末端で切断されたＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質のＮ末端の１～６５位のアミノ酸残基を、開始コドンによりコードされるメチオニン残基で置換することにより得られるタンパク質を指す。
本発明において「変種」という用語は、そのアミノ酸配列が、本発明の変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質（例えば、配列番号６、７、９、１３、１７、１８、又は１９に記載のタンパク質）と比較して、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９）のアミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、付加、又は欠失を有し、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、本発明の変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の機能を保持しているタンパク質を指す。本発明において「変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の機能」という用語は、少なくとも２種のＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ１８とＨＰＶ４５、又はＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５９）に対する中和抗体の生成を誘導する能力を指す。「同一性」という用語は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の類似性の尺度を指す。一般に、配列は最大の一致を得るように整列された。「同一性」は当該分野でよく知られた意味を有し、公開されたアルゴリズム（例えばＢＬＡＳＴ）によって算出することができる。
本発明において「同一性」という用語は、２つのポリペプチド間又は２つの核酸間の一致の程度を指す。比較のための２つの配列が、特定の部位に塩基又はアミノ酸の同じモノマーサブユニットを有する（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれが特定の部位にアデニンを有するか、２つのポリペプチドのそれぞれが特定の部位にリジンを有する）場合、２つの分子はその部位で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、［（２つの配列によって共有される同一部位の数）／（比較部位の総数）］×１００の関数である。例えば、２つの配列の１０部位のうち６つの部位が一致する場合、これら２つの配列は６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴは５０％の同一性を共有する（６つの部位のうち３つが一致している）。一般に、２つの配列の比較は、最大の同一性を生み出すように行われる。そのような整列は、例えばNeedleman, et al. (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970)の方法に基づくＡｌｉｇｎプログラム（DNAstar, Inc.）などのコンピュータプログラムを使用して実施することができる。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ａｌｉｇｎプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重量残基表を使用し、ギャップ長ペナルティを１２及びギャップペナルティ４を用いて決定することもできる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれている Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) のアルゴリズムにより、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを使用して、ギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６、又は４で及び長さ重み１、２、３、４、５、又は６を用いて決定することができる。
本明細書で使用される「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な特性に悪影響を与えたり変化させたりしないであろうアミノ酸置換を指す。例えば保存的置換は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当該分野で公知の標準的な技術によって導入され得る。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば対応するアミノ酸残基に物理的又は機能的に同様の残基（例えば、同様のサイズ、形状、電荷、共有結合又は水素結合などを形成する能力含む化学的特性）で置換される置換が含まれる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、及びβ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。従って、一般に保存的置換とは、対応するアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換することを指す。アミノ酸の保存的置換を同定するための方法は、当該分野で公知である（例えば、Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); and Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)参照、これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
本発明において「大腸菌発現系」とは、大腸菌（株）とベクターからなる発現系を指し、ここで、大腸菌（株）は、特に限定されるものではないが、ＥＲ２５６６、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、及びＢＬＲ（ＤＥ３）を含む市販の株から得られる。
本発明において「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドをその中に挿入することができる核酸担体ツールを指す。ベクターが、その中に挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、そのベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、宿主細胞への形質転換、形質導入、又はトランスフェクションによって宿主細胞で発現される運搬される遺伝物質要素を有することができる。ベクターは当業者に公知であり、特に限定されるものではないが、プラスミド、ファージ、コスミドなどが含まれる。
本発明において「医薬的に許容し得る担体及び／又は賦形剤」という用語は、被験体及び活性成分に対して薬理学的及び／又は生理学的に適合性のある担体及び／又は賦形剤を指し、これは当該分野で公知（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995を参照）であり、特に限定されるものではないが、ｐＨ調節剤、界面活性剤、アジュバント、及びイオン強度増強剤が含まれる。例えばｐＨ調整剤には、特に限定されるものではないが、リン酸緩衝液が含まれる。界面活性剤には、特に限定されるものではないが、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、又は非イオン性界面活性剤、例えばツイーン－８０が含まれる。アジュバントには、特に限定されるものではないが、アルミニウムアジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、及びフロイントアジュバント（例えばフロイント完全アジュバント）が含まれる。そしてイオン強度増強剤には、特に限定されるものではないが、ＮａＣｌが含まれる。
本発明において「有効量」という用語は、意図された目的を効果的に達成することができる量を指す。例えば疾患（例えばＨＰＶ感染）の予防に有効な量とは、疾患（ＨＰＶ感染など）の発生を予防、抑制、又は遅延させるのに有効な量を指す。そのような有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
本発明において「クロマトグラフィー」という用語は、特に限定されるものではないが、イオン交換クロマトグラフィー（例えばカチオン交換クロマトグラフィー）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、吸収性クロマトグラフィー（例えばハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル排除クロマトグラフィー）、及び親和性クロマトグラフィーを含む。
本発明において「溶解物上清」という用語は、以下の工程によって生成される溶液を指す：宿主細胞（例えば大腸菌）が溶解緩衝液中で破壊され、次に、破壊された宿主細胞を含む溶解液から不溶性物質が除去される。様々な溶解緩衝液が当該分野で公知であり、特に限定されるものではないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ヘペス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液などが含まれる。さらに、宿主細胞の破壊は、当業者に公知の方法によって達成することができ、その方法には、特に限定されるものではないが、ホモジナイザー破壊、超音波処理、粉砕、高圧押出し、リゾザイム処理などが含まれる。不溶性物質を除去するための方法もまた当該分野の当業者にとって公知であり、特に限定されるものではないが、ろ過及び遠心分離が含まれる。
発明の有益な効果
研究によると、ＨＰＶ１８と他のＨＰＶ型（ＨＰＶ４５及びＨＰＶ５９など）の間には一定の交差防御性があるが、そのような交差防御性は非常に小さく、一般に１％未満であり、同じＨＰＶ型のＶＬＰの防御レベルの１０００分の１ですらある。従って、ＨＰＶ１８ワクチンを接種された被験体は、他のＨＰＶ型（例えばＨＰＶ４５及びＨＰＶ５９）に感染するリスクが依然として高い。
本発明は、変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質、及びそれによって形成されるＨＰＶウイルス様粒子を提供する。本発明のＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ１８及び他のＨＰＶ型（ＨＰＶ４５及びＨＰＶ５９など）に対して顕著な交差防御性を提供することができる。特に、同じ免疫用量で、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は、生物中の少なくとも２種のＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ１８とＨＰＶ４５、又はＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５９）に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、その効果は、複数のＨＰＶ型のＶＬＰの混合物（例えば、ＨＰＶ１８ ＶＬＰとＨＰＶ４５ＶＬＰの混合物、又はＨＰＶ１８ ＶＬＰ、ＨＰＶ４５ ＶＬＰ、及びＨＰＶ５９ＶＬＰの混合物）の効果に匹敵する。従って、本発明のＨＰＶウイルス様粒子を使用して、少なくとも２種のＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ１８とＨＰＶ４５、又はＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５９）による同時の感染、並びに感染に関連する疾患を予防することができ、非常に有益な技術的効果がある。これは、ＨＰＶワクチンの防御範囲を拡大し、ＨＰＶワクチンの製造コストを削減するという点で、特に重要な利点がある。
本発明の実施態様は、図面及び実施例を参照することによってさらに詳細に説明される。しかしながら、当業者は、以下の図面及び実施例が本発明を説明することのみを目的としており、本発明の範囲を規定するのではないことを理解するであろう。以下の図面及び好適な実施態様の詳細な説明によれば、本発明の様々な目的及び利点は当業者にとって明らかである。
実施例１の精製された変異タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を示す。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：ＨＰＶ１８Ｎ６５（６５個のアミノ酸がＮ末端で切断されたＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質）；レーン２：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１；レーン３：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２；レーン４：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３；レーン５：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４；レーン６：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５；レーン７：ＨＰＶ１８Ｎ６５；レーン８：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１；レーン９：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２；レーン１０：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４；レーン１１：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５；レーン１２：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１；レーン１３：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２；レーン１４：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３；レーン１５：ＨＰＶ１８Ｎ６５；レーン１６：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５；レーン１７：ＨＰＶ１８Ｎ６５；レーン１８：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５；レーン１９：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５；レーン２０：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５。結果は、クロマトグラフィー精製後、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５タンパク質が８５％を超える純度に達したことを示した。 実施例１の精製されたＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５の、広域スペクトル抗体４Ｂ３を使用して測定されたウエスタンブロットの結果を示す。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：ＨＰＶ１８Ｎ６５；レーン２：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１；レーン３：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２；レーン４：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３；レーン５：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４；レーン６：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５；レーン７：ＨＰＶ１８Ｎ６５；レーン８：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１；レーン９：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２；レーン１０：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４；レーン１１：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５；レーン１２：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１；レーン１３：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２；レーン１４：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３；レーン１５：ＨＰＶ１８Ｎ６５；レーン１６：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５；レーン１７：ＨＰＶ１８Ｎ６５；レーン１８：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５；レーン１９：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５；レーン２０：Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５。結果は、変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５が、広域スペクトル抗体４Ｂ３により特異的に認識されている可能性があることを示した。 タンパク質ＨＰＶ１８Ｎ６５（図３Ａ）、ＨＰＶ４５Ｎ２７（図３Ｂ）、ＨＰＶ５９ Ｌ１（図３Ｃ）、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１（図３Ｄ）、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２（図３Ｅ）、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３（図３Ｆ）、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４（図３Ｇ）、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５（図３Ｈ）を含む試料の、分子ふるいクロマトグラフィーによって分析された結果を示す。この結果は、タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、又はＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５を含む試料の最初のタンパク質ピークが、ＨＰＶ１８Ｎ６５ Ｌ１タンパク質によって組み立てられたＶＬＰ（ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ）、ＨＰＶ４５Ｎ２７タンパク質によって組み立てられたＶＬＰ（ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ）、及びＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質によって組み立てられたＶＬＰ（ＨＰＶ５９ ＶＬＰ）のタンパク質ピークに匹敵する約１３分で現れたことを示した。これは、これらすべてのタンパク質がＶＬＰに組み立てることができることを示している。 タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１（図３Ｉ）、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２（図３Ｊ）、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４（図３Ｋ）、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５（図３Ｌ）、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１（図３Ｍ）、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２（図３Ｎ）、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３（図３Ｏ）、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５（図３Ｐ）を含む試料の、分子ふるいクロマトグラフィーによって分析された結果を示す。この結果は、タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、又はＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５を含む試料の最初のタンパク質ピークが、ＨＰＶ１８Ｎ６５ Ｌ１タンパク質によって組み立てられたＶＬＰ（ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ）、ＨＰＶ４５Ｎ２７タンパク質によって組み立てられたＶＬＰ（ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ）、及びＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質によって組み立てられたＶＬＰ（ＨＰＶ５９ ＶＬＰ）のタンパク質ピークに匹敵する約１３分で現れたことを示した。これは、これらすべてのタンパク質がＶＬＰに組み立てることができることを示している。 タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５（図３Ｑ）、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５（図３Ｒ）、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５（図３Ｓ）を含む試料の、分子ふるいクロマトグラフィーによって分析された結果を示す。この結果は、タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、又はＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５を含む試料の最初のタンパク質ピークが、ＨＰＶ１８Ｎ６５ Ｌ１タンパク質によって組み立てられたＶＬＰ（ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ）、ＨＰＶ４５Ｎ２７タンパク質によって組み立てられたＶＬＰ（ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ）、及びＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質によって組み立てられたＶＬＰ（ＨＰＶ５９ ＶＬＰ）のタンパク質ピークに匹敵する約１３分で現れたことを示した。これは、これらすべてのタンパク質がＶＬＰに組み立てることができることを示している。 様々なＶＬＰ試料の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真（１０万倍の倍率で撮影、バー＝０．１μｍ）を示す。図４Ａ、ＨＰＶ１８Ｎ６５によって組み立てられたＶＬＰ；図４Ｂ、ＨＰＶ４５Ｎ２７によって組み立てられたＶＬＰ；図４Ｃ、ＨＰＶ５９ Ｌ１によって組み立てられたＶＬＰ；図４Ｄ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１によって組み立てられたＶＬＰ；図４Ｅ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２によって組み立てられたＶＬＰ；図４Ｆ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３によって組み立てられたＶＬＰ；図４Ｇ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４によって組み立てられたＶＬＰ；図４Ｈ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５によって組み立てられたＶＬＰ；図４Ｉ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１によって組み立てられたＶＬＰ；図４Ｊ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２によって組み立てられたＶＬＰ；図４Ｋ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４によって組み立てられたＶＬＰ；図４Ｌ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５によって組み立てられたＶＬＰ。結果は、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５が、ＨＰＶ１８Ｎ６５、ＨＰＶ４５Ｎ２７、及びＨＰＶ５９ Ｌ１と同様であり、半径約３０ｎｍのＶＬＰに組み立てることができることを示した。 様々なＶＬＰ試料の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真（１０万倍の倍率で撮影、バー＝０．１μｍ）を示す。図４Ｍ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１によって組み立てられたＶＬＰ；図４Ｎ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２によって組み立てられたＶＬＰ；図４Ｏ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３によって組み立てられたＶＬＰ；図４Ｐ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５によって組み立てられたＶＬＰ；図４Ｑ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５によって組み立てられたＶＬＰ；図４Ｒ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５によって組み立てられたＶＬＰ；図４Ｓ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５によって組み立てられたＶＬＰ。結果は、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５が、ＨＰＶ１８Ｎ６５、ＨＰＶ４５Ｎ２７、及びＨＰＶ５９ Ｌ１と同様であり、半径約３０ｎｍのＶＬＰに組み立てることができることを示した。 ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ、ＨＰＶ５９ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す；図５Ａ、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ；図５Ｂ、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ；図５Ｃ、ＨＰＶ５９ ＶＬＰ；図５Ｄ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３ ＶＬＰ；図５Ｅ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰ；図５Ｆ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ；図５Ｇ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ；図５Ｈ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰ。結果は、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰの沈降係数が、それぞれ１４３．７Ｓ、１７３．３Ｓ、及び１６７．１Ｓであり、これは、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ、及びＨＰＶ５９ＶＬＰの沈降係数（ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ、１４２．２Ｓ；ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ、１４６．５Ｓ、及びＨＰＶ５９ ＶＬＰ、１３９．３Ｓ）と同様であることを示した。これは、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５が、サイズと形態の点で野生型ＶＬＰと同様のウイルス様粒子に組み立て得ることを示した。 ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ、ＨＰＶ５９ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰの熱安定性の検出結果を示す。図６Ａ、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ；図６Ｂ、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ；図６Ｃ、ＨＰＶ５９ ＶＬＰ；図６Ｄ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３ ＶＬＰ；図６Ｅ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰ；図６Ｆ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ；図６Ｇ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ；図６Ｈ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰ。結果は、これらのタンパク質によって形成されたすべてのＶＬＰが非常に高い熱安定性を有することを示した。 実験群のマウスのＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ５ ＶＬＰ、並びに対照群のマウスのＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ、及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５ ＶＬＰの免疫防御の評価結果を示す。結果は、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰがそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ１８に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができる活性を保持し、ＨＰＶ１８に対するそれらの防御効果が、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５ ＶＬＰの防御効果と同等であることを示し、マウスにおいてＨＰＶ４５に対する中和抗体の生成を誘導することができる活性が、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の活性よりも高いことを示した。特に、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３ ＶＬＰ及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰはそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ４５及びＨＰＶ１８に対する高力価中和抗体の生成を誘導できる可能性があり；ＨＰＶ１８に対するそれらの防御効果は、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５ ＶＬＰの防御効果と同等であり、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高く；ＨＰＶ４５に対するそれらの防御効果は、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５ ＶＬＰの防御効果と同等であり、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高かった。これは、変異後、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰがＨＰＶ１８に対するそれらの免疫原性を保持し、ＨＰＶ４５に対するそれらの免疫原性も、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰと比較して改善されていることを示した。特に、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３ ＶＬＰ及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰは、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５に対して良好な交差免疫原性及び交差防御性を有し、ＨＰＶ１８感染及び／又はＨＰＶ４５感染を予防するための効果的なワクチンとして使用でき、ＨＰＶ１８ ＶＬＰとＨＰＶ４５ ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できる可能性がある。 実験群のマウスのＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５ ＶＬＰ、並びに対照群のマウスのＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ、ＨＰＶ５９ ＶＬＰ、及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰの免疫防御の評価結果を示す。結果は、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰがそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、及びＨＰＶ５９に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ；ＨＰＶ１８に対するそれらの防御効果は、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰの防御効果と同等であり、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果及びＨＰＶ５９ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高く；ＨＰＶ４５に対するそれらの防御効果は、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰの防御効果と同等であり、そしてＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果及びＨＰＶ５９ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高く；ＨＰＶ５９に対するそれらの防御効果は、ＨＰＶ５９ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰの防御効果と同等であり、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果及びＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高いことを示した。これは、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰが、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、及びＨＰＶ５９に対して良好な交差免疫原性及び交差防御性を有し、ＨＰＶ１８感染、ＨＰＶ４５感染、及び／又はＨＰＶ５９感染を予防するための効果的なワクチンとして使用でき、ＨＰＶ１８ ＶＬＰ、ＨＰＶ４５ ＶＬＰ、及びＨＰＶ５９ ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できることを示した。 マウスにＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰをワクチン接種した後のマウス血清中の中和抗体力価の結果を示す。図８Ａ：１０μｇ用量の群（１０μｇの免疫用量で、アルミニウムアジュバントを使用）；図８Ｂ：１μｇ用量の群（１μｇの免疫用量で、アルミニウムアジュバントを使用）。結果は、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰが、マウスにおいてＨＰＶ１８に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、その防御効果が、同じ用量の、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５ ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量の、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に優れており；これは、マウスにおいてＨＰＶ４５に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、その防御効果が、同じ用量の、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５ ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量のＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に優れていることを示した。これは、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰが、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５に対して良好な交差免疫原性及び交差防御性を有することを示した。 マウスにＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５ ＶＬＰ、又はＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰをワクチン接種した後のマウス血清中の中和抗体力価の結果を示す；図８Ｃ：１０μｇ用量の群（１０μｇの免疫用量で、アルミニウムアジュバントを使用）；図８Ｄ：１μｇ用量の群（１μｇの免疫用量で、アルミニウムアジュバントを使用）。結果は、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰが、マウスにおいてＨＰＶ１８に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、それらの防御効果が、同じ用量の、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量の、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果又はＨＰＶ５９ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に優れており；Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰが、マウスにおいてＨＰＶ４５に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、それらの防御効果が、同じ用量の、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量の、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果又はＨＰＶ５９ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に優れており；そして、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰが、マウスにおいてＨＰＶ５９に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、それらの防御効果が、同じ用量の、ＨＰＶ５９ ＶＬＰ単独の防御効果又は混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量の、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果又はＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に優れていることを示した。これは、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰが、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、及びＨＰＶ５９に対して良好な交差免疫原性及び交差防御性を有することを示した。
配列情報
本発明に含まれる配列のいくつかは、以下の表１に提供されている。
Figure 0007265563000001
Figure 0007265563000002
配列１（配列番号１）：
MCLYTRVLILHYHLLPLYGPLYHPQPLPLHSILVYMVHIIICGHYIILFLRNVNVFPIFLQMALWRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSATTASKPAKRVRVRARK
配列２（配列番号２）：
MAHNIIYGHGIIIFLKNVNVFPIFLQMALWRPSDSTVYLPPPSVARVVSTDDYVSRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVVPNGAGNKQAVPKVSAYQYRVFRVALPDPNKFGLPDSTIYNPETQRLVWACVGMEIGRGQPLGIGLSGHPFYNKLDDTESAHAATAVITQDVRDNVSVDYKQTQLCILGCVPAIGEHWAKGTLCKPAQLQPGDCPPLELKNTIIEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGVMGDTVPTDLYIKGTSANMRETPGSCVYSPSPSGSIITSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFVTVVDTTRSTNLTLCASTQNPVPSTYDPTKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTAEVMSYIHSMNSSILENWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAVTCQKDTTPPEKQDPYDKLKFWTVDLKEKFSSDLDQYPLGRKFLVQAGLRRRPTIGPRKRPAASTSTASTASRPAKRVRIRSKK
配列３（配列番号３）：
MALWRSSDNKVYLPPPSVAKVVSTDEYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGHPYFKVPKGGNGRQDVPKVSAYQYRVFRVKLPDPNKFGLPDNTVYDPNSQRLVWACVGVEIGRGQPLGVGLSGHPLYNKLDDTENSHVASAVDTKDTRDNVSVDYKQTQLCIIGCVPAIGEHWTKGTACKPTTVVQGDCPPLELINTPIEDGDMVDTGYGAMDFKLLQDNKSEVPLDICQSICKYPDYLQMSADAYGDSMFFCLRREQVFARHFWNRSGTMGDQLPESLYIKGTDIRANPGSYLYSPSPSGSVVTSDSQLFNKPYWLHKAQGLNNGICWHNQLFLTVVDTTRSTNLSVCASTTSSIPNVYTPTSFKEYARHVEEFDLQFIFQLCKITLTTEVMSYIHNMNTTILEDWNFGVTPPPTASLVDTYRFVQSAAVTCQKDTAPPVKQDPYDKLKFWPVDLKERFSADLDQFPLGRKFLLQLGARPKPTIGPRKRAAPAPTSTPSPKRVKRRKSSRK
配列４（配列番号４）：
MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVVPNGAGNKQAVPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSATTASKPAKRVRVRARK
配列５（配列番号５）：
MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGIGLSGHPFYNKLDDTESAHAATAVITQDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSATTASKPAKRVRVRARK
配列６（配列番号６）：
MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTLCKPAQLQPGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSATTASKPAKRVRVRARK
配列７（配列番号７）：
MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGVMGDTVPTDLYIKGTSANMRETPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSATTASKPAKRVRVRARK
配列８（配列番号８）：
MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQNPVPSTYDPTKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSATTASKPAKRVRVRARK
配列９（配列番号９）：
MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFKVPKGGNGRQDVPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTLCKPAQLQPGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSATTASKPAKRVRVRARK
配列１０（配列番号１０）：
MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPLYNKLDDTENSHVASAVDTKDTRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTLCKPAQLQPGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSATTASKPAKRVRVRARK
配列１１（配列番号１１）：
MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTLCKPAQLQPGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRSGTMGDQLPESLYIKGTDIRANPGSYLYSPSPSGSIVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSATTASKPAKRVRVRARK
配列１２（配列番号１２）：
MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTLCKPAQLQPGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTTSSIPNVYTPTSFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSATTASKPAKRVRVRARK
配列１３（配列番号１３）：
MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFKVPKGGNGRQDVPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGVMGDTVPTDLYIKGTSANMRETPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSATTASKPAKRVRVRARK
配列１４（配列番号１４）：
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配列１５（配列番号１５）：
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配列１６（配列番号１６）：
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配列１７（配列番号１７）：
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配列１８（配列番号１８）：
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配列１９（配列番号１９）：
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配列２０（配列番号２０）：
ATGTGCCTGTATACACGGGTCCTGATATTACATTACCATCTACTACCTCTGTATGGCCCATTGTATCACCCACAGCCCCTGCCTCTACACAGTATATTGGTATACATGGTACACATTATTATTTGTGGCCATTATATTATTTTATTCCTAAGAAACGTAAACGTGTTCCCTATTTTTTTGCAGATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATATTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGGCATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTGTCTGTAGATTATAAGC
AGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTGCCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAATCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACTTAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATATGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATTATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTGGAATAGAGCAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTGCCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTGCCAGGAAGTAA
配列２１（配列番号２１）：
ATGGCACACAATATTATTTATGGCCATGGTACTATTATTTTCCTAAAAAACGTAAACGTATTCCCTATTTTTTTGCAGATGGCCCTGTGGAGGCCCAGCGACAGCACCGTGTACCTGCCCCCCCCCAGCGTGGCCAGGGTGGTGAGCACCGACGACTACGTGAGCAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGACCGTGGGCAACCCCTACTTCAGGGTGGTGCCCAACGGCGCCGGCAACAAGCAGGCCGTGCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGGCCCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACAGCACCATCTACAACCCCGAGACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCATGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCATCGGCCTGAGCGGCCACCCCTTCTACAACAAGCTGGACGACACCGAGAGCGCCCACGCCGCCACCGCCGTGATCACCCAGGACGTGAGGGACAACGTGAGCGTGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCCTGGGCTGCGTGCCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCCTGTGCAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGAAGAACACCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTACGGCGCCATGGACTTCAGCACCCTGCAGGACACCAAGTGCGAGGTGCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTGCAGATGAGCGCCGACCCCTACGGCGACAGCATGTTCTTCTGCCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTTCTGGAACAGGGCCGGCGTGATGGGCGACACCGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGGCACCAGCGCCAACATGAGGGAGACCCCCGGCAGCTGCGTGTACAGCCCCAGCCCCAGCGGCAGCATCATCACCAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCCTGTGCGCCAGCACCCAGAACCCCGTGCCCAGCACCTACGACCCCACCAAGTTCAAGCAGTACAGCAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCACCATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGAGCTACATCCACAGCATGAACAGCAGCATCCTGGAGAACTGGAACTTCGGCGTGCCCCCCCCCCCCACCACCAGCCTGGTGGACACCTACAGGTTCGTGCAGAGCGTGGCCGTGACCTGCCAGAAGGACACCACCCCCCCCGAGAAGCAGGACCCCTACGACAAGCTGAAGTTCTGGACCGTGGACCTGAAGGAGAAGTTCAGCAGCGACCTGGACCAGTACCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGGTGCAGGCCGGCCTGAGGAGGAGGCCCACCATCGGCCCCAGGAAGAGGCCCGCCGCCAGCACCAGCACCGCCAGCACCGCCAGCAGGCCCGCCAAGAGGGTGAGGATCAGGAGCAAGAAGTGA
配列２２（配列番号２２）：
ATGGCCCTGTGGAGGAGCAGCGACAACAAGGTGTACCTGCCCCCCCCCAGCGTGGCCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGACCAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTGCCCAAGGGCGGCAACGGCAGGCAGGACGTGCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAAGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACAACACCGTGTACGACCCCAACAGCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCGTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTACAACAAGCTGGACGACACCGAGAACAGCCACGTGGCCAGCGCCGTGGACACCAAGGACACCAGGGACAACGTGAGCGTGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCATCGGCTGCGTGCCCGCCATCGGCGAGCACTGGACCAAGGGCACCGCCTGCAAGCCCACCACCGTGGTGCAGGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGATCAACACCCCCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTACGGCGCCATGGACTTCAAGCTGCTGCAGGACAACAAGAGCGAGGTGCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTGCAGATGAGCGCCGACGCCTACGGCGACAGCATGTTCTTCTGCCTGAGGAGGGAGCAGGTGTTCGCCAGGCACTTCTGGAACAGGAGCGGCACCATGGGCGACCAGCTGCCCGAGAGCCTGTACATCAAGGGCACCGACATCAGGGCCAACCCCGGCAGCTACCTGTACAGCCCCAGCCCCAGCGGCAGCGTGGTGACCAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCCCAGGGCCTGAACAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCCTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGAGCGTGTGCGCCAGCACCACCAGCAGCATCCCCAACGTGTACACCCCCACCAGCTTCAAGGAGTACGCCAGGCACGTGGAGGAGTTCGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCACCGAGGTGATGAGCTACATCCACAACATGAACACCACCATCCTGGAGGACTGGAACTTCGGCGTGACCCCCCCCCCCACCGCCAGCCTGGTGGACACCTACAGGTTCGTGCAGAGCGCCGCCGTGACCTGCCAGAAGGACACCGCCCCCCCCGTGAAGCAGGACCCCTACGACAAGCTGAAGTTCTGGCCCGTGGACCTGAAGGAGAGGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGCTGGGCGCCAGGCCCAAGCCCACCATCGGCCCCAGGAAGAGGGCCGCCCCCGCCCCCACCAGCACCCCCAGCCCCAAGAGGGTGAAGAGGAGGAAGAGCAGCAGGAAGTGA
配列２３（配列番号２３）：
ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGACCGTGGGCAACCCCTACTTCAGGGTGGTGCCCAACGGCGCCGGCAACAAGCAGGCCGTGCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGGCATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTGTCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTGCCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAATCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACTTAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATATGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATTATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTGGAATAGAGCAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTGCCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTGCCAGGAAGTAA
配列２４（配列番号２４）：
ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATATTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCATCGGCCTGAGCGGCCACCCCTTCTACAACAAGCTGGACGACACCGAGAGCGCCCACGCCGCCACCGCCGTGATCACCCAGGACGTGAGGGACAACGTGAGCGTGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCCTGGGCTGCGCCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAATCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACTTAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATATGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATTATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTGGAATAGAGCAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTGCCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTGCCAGGAAGTAA
配列２５（配列番号２５）：
ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATATTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGGCATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTGTCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTGCCCCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCCTGTGCAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGAAGAACACCGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATATGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATTATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTGGAATAGAGCAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTGCCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTGCCAGGAAGTAA
配列２６（配列番号２６）：
ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATATTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGGCATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTGTCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTGCCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAATCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACTTAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATACGGCGCCATGGACTTCAGCACCCTGCAGGACACCAAGTGCGAGGTGCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTGCAGATGAGCGCCGACCCCTACGGCGACAGCATGTTCTTCTGCCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTTCTGGAACAGGGCCGGCGTGATGGGCGACACCGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGGCACCAGCGCCAACATGAGGGAGACCCCCGGCAGCTGCGTGTACAGCCCCAGCCCCAGCGGCAGCATCGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTGCCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTGCCAGGAAGTAA
配列２７（配列番号２７）：
ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATATTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGGCATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTGTCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTGCCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAATCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACTTAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATATGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATTATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTGGAATAGAGCAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGCGCCAGCACCCAGAACCCCGTGCCCAGCACCTACGACCCCACCAAGTTCAAGCAGTACAGCAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCACCATCACCCTGACCGCCGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTGCCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTGCCAGGAAGTAA
配列２８（配列番号２８）：
ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCATATTTCAAGGTGCCCAAGGGCGGCAACGGCAGGCAGGACGTGCCCAAGGTGAGCGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGGCATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTGTCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTGCCCCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCCTGTGCAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGAAGAACACCGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATATGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATTATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTGGAATAGAGCAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTGCCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTGCCAGGAAGTAA
配列２９（配列番号２９）：
ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATATTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGCGTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTACAACAAGCTGGACGACACCGAGAACAGCCACGTGGCCAGCGCCGTGGACACCAAGGACACCAGGGACAACGTGAGCGTGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCTTGGGCTGTGCCCCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCCTGTGCAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGAAGAACACCGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATATGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATTATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTGGAATAGAGCAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTGCCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTGCCAGGAAGTAA
配列３０（配列番号３０）：
ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATATTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGGCATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTGTCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTGCCCCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCCTGTGCAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGAAGAACACCGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATATGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATTATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTCGCCAGGCACTTCTGGAACAGGAGCGGCACCATGGGCGACCAGCTGCCCGAGAGCCTGTACATCAAGGGCACCGACATCAGGGCCAACCCCGGCAGCTACCTGTACAGCCCCAGCCCCAGCGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTGCCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTGCCAGGAAGTAA
配列３１（配列番号３１）：
ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATATTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGGCATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTGTCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTGCCCCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCCTGTGCAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGAAGAACACCGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATATGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATTATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTGGAATAGAGCAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGCGCCAGCACCACCAGCAGCATCCCCAACGTGTACACCCCCACCAGCTTCAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTGCCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTGCCAGGAAGTAA
配列３２（配列番号３２）：
ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCCTACTTCAAGGTGCCCAAGGGCGGCAACGGCAGGCAGGACGTGCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGGCATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTGTCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTGCCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAATCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACTTAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATACGGCGCCATGGACTTCAGCACCCTGCAGGACACCAAGTGCGAGGTGCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTGCAGATGAGCGCCGACCCCTACGGCGACAGCATGTTCTTCTGCCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTTCTGGAACAGGGCCGGCGTGATGGGCGACACCGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGGCACCAGCGCCAACATGAGGGAGACCCCCGGCAGCTGCGTGTACAGCCCCAGCCCCAGCGGCAGCATCGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTGCCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTGCCAGGAAGTAA
配列３３（配列番号３３）：
ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATATTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGCGTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCACCCCCTGTACAACAAGCTGGACGACACCGAGAACAGCCACGTGGCCAGCGCCGTGGACACCAAGGACACCAGGGACAACGTGAGCGTGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCTTGGGCTGTGCCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAATCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACTTAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATACGGCGCCATGGACTTCAGCACCCTGCAGGACACCAAGTGCGAGGTGCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTGCAGATGAGCGCCGAcCCCTACGGCGACAGCATGTTCTTCTGCCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTTCTGGAACAGGGCCGGCGTGATGGGCGACACCGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGGCACCAGCGCCAACATGAGGGAGACCCCCGGCAGCTGCGTGTACAGCCCCAGCCCCAGCGGCAGCATCGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTGCCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTGCCAGGAAGTAA
配列３４（配列番号３４）：
ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATATTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGGCATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTGTCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTGCCCCCGCCATCGGCGAGCACTGGACCAAGGGCACCGCCTGCAAGCCCACCACCGTGGTGCAGGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATACGGCGCCATGGACTTCAGCACCCTGCAGGACACCAAGTGCGAGGTGCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTGCAGATGAGCGCCGACCCCTACGGCGACAGCATGTTCTTCTGCCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTTCTGGAACAGGGCCGGCGTGATGGGCGACACCGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGGCACCAGCGCCAACATGAGGGAGACCCCCGGCAGCTGCGTGTACAGCCCCAGCCCCAGCGGCAGCATCGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTGCCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTGCCAGGAAGTAA
配列３５（配列番号３５）：
ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATATTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGGCATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTGTCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTGCCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAATCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACTTAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATACGGCGCCATGGACTTCAGCACCCTGCAGGACACCAAGTGCGAGGTGCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTGCAGATGAGCGCCGAcCCCTACGGCGACAGCATGTTCTTCTGCCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTTCTGGAACAGGGCCGGCGTGATGGGCGACACCGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGGCACCAGCGCCAACATGAGGGAGACCCCCGGCAGCTGCGTGTACAGCCCCAGCCCCAGCGGCAGCATCGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGCGCCAGCACCACCAGCAGCATCCCCAACGTGTACACCCCCACCAGCTTCAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTGCCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTGCCAGGAAGTAA
配列３６（配列番号３６）：
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配列３７（配列番号３７）：
ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATATTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCATCGGCCTGAGCGGCCACCCCTTCTACAACAAGCTGGACGACACCGAGAGCGCCCACGCCGCCACCGCCGTGATCACCCAGGACGTGAGGGACAACGTGAGCGTGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCCTGGGCTGCGCCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAATCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACTTAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATATGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATTATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTGGAATAGAGCAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGCGCCAGCACCACCAGCAGCATCCCCAACGTGTACACCCCCACCAGCTTCAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTGCCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTGCCAGGAAGTAA
配列３８（配列番号３８）：
ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGACCGTGGGCAACCCCTACTTCAGGGTGGTGCCCAACGGCGCCGGCAACAAGCAGGCCGTGCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGGCATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTGTCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTGCCCCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCCTGTGCAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGAAGAACACCGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATATGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATTATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTGGAATAGAGCAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGCGCCAGCACCACCAGCAGCATCCCCAACGTGTACACCCCCACCAGCTTCAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTGCCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTGCCAGGAAGTAA
配列３９（配列番号３９）：
VPNGAGNKQAV

配列４０（配列番号４０）：
IGLSGHPFYNKLDDTESAHAATAVITQ

配列４１（配列番号４１）：
LCKPAQLQP

配列４２（配列番号４２）：
VMGDTVPTDLYIKGTSANMRET

配列４３（配列番号４３）：
KVPKGGNGRQDV

配列４４（配列番号４４）：
TSSIPNVYTPTS

配列１０９（配列番号１０９）：
NPVPSTYDP

配列１１０（配列番号１１０）：
LYNKLDDTENSHVASAVDTKDT

配列１１１（配列番号１１１）：
SGTMGDQLPESLYIKGTDIRANPGSYL

配列１１２（配列番号１１２）：
TKGTACKPTTVV
配列１１３（配列番号１１３）：
MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSATTASKPAKRVRVRARK
配列１１４（配列番号１１４）：
ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATATTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGGCATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTGTCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTGCCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAATCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACTTAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATATGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATTATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTGGAATAGAGCAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCcTTATATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTGCCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTGCCAGGAAGTAA
配列１１５（配列番号１１５）：
MALWRPSDSTVYLPPPSVARVVSTDDYVSRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVVPNGAGNKQAVPKVSAYQYRVFRVALPDPNKFGLPDSTIYNPETQRLVWACVGMEIGRGQPLGIGLSGHPFYNKLDDTESAHAATAVITQDVRDNVSVDYKQTQLCILGCVPAIGEHWAKGTLCKPAQLQPGDCPPLELKNTIIEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGVMGDTVPTDLYIKGTSANMRETPGSCVYSPSPSGSIITSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFVTVVDTTRSTNLTLCASTQNPVPSTYDPTKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTAEVMSYIHSMNSSILENWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAVTCQKDTTPPEKQDPYDKLKFWTVDLKEKFSSDLDQYPLGRKFLVQAGLRRRPTIGPRKRPAASTSTASTASRPAKRVRIRSKK
配列１１６（配列番号１１６）：
ATGGCCCTGTGGAGGCCCAGCGACAGCACCGTGTACCTGCCCCCCCCCAGCGTGGCCAGGGTGGTGAGCACCGACGACTACGTGAGCAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGACCGTGGGCAACCCCTACTTCAGGGTGGTGCCCAACGGCGCCGGCAACAAGCAGGCCGTGCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGGCCCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACAGCACCATCTACAACCCCGAGACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCATGGAGATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCATCGGCCTGAGCGGCCACCCCTTCTACAACAAGCTGGACGACACCGAGAGCGCCCACGCCGCCACCGCCGTGATCACCCAGGACGTGAGGGACAACGTGAGCGTGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCCTGGGCTGCGTGCCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCCTGTGCAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGAAGAACACCATCATCGAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTACGGCGCCATGGACTTCAGCACCCTGCAGGACACCAAGTGCGAGGTGCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTGCAGATGAGCGCCGACCCCTACGGCGACAGCATGTTCTTCTGCCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCACTTCTGGAACAGGGCCGGCGTGATGGGCGACACCGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGGCACCAGCGCCAACATGAGGGAGACCCCCGGCAGCTGCGTGTACAGCCCCAGCCCCAGCGGCAGCATCATCACCAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCCCAGGGCCACAACAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCCTGTGCGCCAGCACCCAGAACCCCGTGCCCAGCACCTACGACCCCACCAAGTTCAAGCAGTACAGCAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCACCATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGAGCTACATCCACAGCATGAACAGCAGCATCCTGGAGAACTGGAACTTCGGCGTGCCCCCCCCCCCCACCACCAGCCTGGTGGACACCTACAGGTTCGTGCAGAGCGTGGCCGTGACCTGCCAGAAGGACACCACCCCCCCCGAGAAGCAGGACCCCTACGACAAGCTGAAGTTCTGGACCGTGGACCTGAAGGAGAAGTTCAGCAGCGACCTGGACCAGTACCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGGTGCAGGCCGGCCTGAGGAGGAGGCCCACCATCGGCCCCAGGAAGAGGCCCGCCGCCAGCACCAGCACCGCCAGCACCGCCAGCAGGCCCGCCAAGAGGGTGAGGATCAGGAGCAAGAAGTGA
本発明は、以下の実施例を参照することによりさらに説明され、実施例は本発明を例示する目的でのみ使用され、本発明を限定するものではない。
他に明記されない限り、本発明で使用される分子生物学的実験方法及び免疫学的アッセイは、実質的に、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、及びF. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995に記載されている方法に従って実施され；制限酵素は製造業者が推奨する条件下で使用される。当業者は、実施例が本発明を例示するために使用されるものであり、本発明の保護範囲を限定することを意図するものではないことを理解している。
実施例１：変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の発現と精製
発現ベクターの構築
ギブソンアセンブリー（Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 2009; 6:343-5. doi: 10.1038/nmeth.1318）を使用して、ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質からの特定のセグメント及び／又はＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質からの特定のセグメントを含む変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質をコードする発現ベクターを構築した。簡単に説明すると、まず、変異を含む短い断片と変異を含まない長い断片をＰＣＲにより得て、次にギブソンアセンブリーシステムを使用して２つの断片を連結してリングを形成した。
使用した最初の鋳型は、プラスミドｐＴＯ－Ｔ７－ＨＰＶ１８Ｎ６５Ｌ１（６５個のアミノ酸がＮ末端で切断されたＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質をコードし、タンパク質はＨＰＶ１８Ｎ６５と呼ばれ、表２で１８Ｌ１Ｎ６５と略記される）、プラスミドｐＴＯ－Ｔ７－ＨＰＶ４５Ｌ１Ｎ２７Ｃ（２７個のアミノ酸がＮ末端で切断されたＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質をコードし、タンパク質はＨＰＶ４５Ｎ２７と呼ばれ、表２で４５Ｌ１Ｎ２７と略記される）、プラスミドｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１（変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１をコードし、表２でＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１と略記される）、プラスミドｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２（変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２をコードし、表２でＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ２と略記される）、プラスミドｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３（変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３をコードし、表２でＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ３と略記される）、プラスミドｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４（変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４をコードし、表２でＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ４と略記される）、プラスミドｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５（変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５をコードし、表２でＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５と略記される）、及びプラスミドｐＴＯ－Ｔ７－ＨＰＶ５９Ｌ１（ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質をコードし、表２でＨＰＶ５９ Ｌ１と略記される）を含んだ。各ＰＣＲの鋳型とプライマーを表２に示し、短い断片を増幅するためのＰＣＲの増幅条件は次のとおりである：９４℃で１０分間の変性；２５サイクル（９４℃で５０秒間の変性、特定の温度で一定時間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長）；そして７２℃で１０分間の最終伸長。長い断片を増幅するためのＰＣＲの増幅条件は次のとおりである：９４℃で１０分間の変性；２５サイクル（９４℃で５０秒間の変性、特定の温度で一定時間のアニーリング、７２℃で７．５分間の伸長）；そして７２℃で１０分間の最終伸長。アニーリングの温度と時間を表２に示した。使用したＰＣＲプライマーの配列を表３に示した。
増幅産物を電気泳動にかけ、次に目的の断片をＤＮＡ抽出キット（BEYOTIME、カタログ番号Ｄ００３３）を用いて回収し、その濃度を測定した。増幅によって得られた短い断片と長い断片を２：１のモル比（総量３μＬ）で混合し、３μＬの２×ギブソンアセンブリーマスターミックス（NEBから購入、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼを含む）を添加し、５０℃で１時間反応させた。
組み立てた生成物（６μＬ）を使用して、塩化カルシウム法で調製した４０μＬのコンピテント大腸菌ＥＲ２５６６（New England Biolabsから購入）を形質転換した。形質転換された大腸菌を、カナマイシン（最終濃度２５μｇ／ｍＬ、以下同じ）を含む固体ＬＢ培地（ＬＢ培地の成分：１０ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ酵母粉末、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、以下同じ）に広げ、単一コロニーがはっきり観察されるまで、３７℃で１０～１２時間静置培養に付した。単一コロニーを採取し、４ｍＬの液体ＬＢ培地（カナマイシンを含む）を含むチューブに接種し、２２０ｒｐｍで１０時間、３７℃で振盪培養した後、１ｍｌの細菌溶液を採取し、－７０℃で保存した。大腸菌からプラスミドを抽出し、Ｔ７プライマーを使用して、プラスミドに挿入された目的の断片のヌクレオチド配列を決定した。配列決定の結果は、構築されたプラスミド（発現ベクター）に挿入された目的の断片のヌクレオチド配列が、それぞれ配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び３８であり、それらのコードされたアミノ酸配列は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、及び１９であった（対応するタンパク質を、それぞれＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５と呼んだ）。
変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１は、以下の点でＨＰＶ１８Ｎ６５とは異なる：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１１４～１２３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の７９～８９位のアミノ酸残基による置換。変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２は、以下の点でＨＰＶ１８Ｎ６５とは異なる：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１７６～２０２位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の１４２～１６８位のアミノ酸残基による置換。変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３は、以下の点でＨＰＶ１８Ｎ６５とは異なる：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の２３５～２４３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２０１～２０９位のアミノ酸残基による置換。変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４は、以下の点でＨＰＶ１８Ｎ６５とは異なる：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の３２７～３４６位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２９３～３１４位のアミノ酸残基による置換。変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５は、以下の点でＨＰＶ１８Ｎ６５とは異なる：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の４１１～４１９位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の３７９～３８７位のアミノ酸残基による置換。
変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１は、以下の点でＨＰＶ１８Ｎ６５とは異なる：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の２３５～２４３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２０１～２０９位のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１１２～１２３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の５１～６２位のアミノ酸残基による置換。変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２は、以下の点でＨＰＶ１８Ｎ６５とは異なる：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の２３５～２４３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２０１～２０９位のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１８３～２０４位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の１２２～１４３位のアミノ酸残基による置換。変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４は、以下の点でＨＰＶ１８Ｎ６５とは異なる：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の２３５～２４３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２０１～２０９位のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の３２５～３５１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の２６４～２９０位のアミノ酸残基による置換。変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５は、以下の点でＨＰＶ１８Ｎ６５とは異なる：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の２３５～２４３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２０１～２０９位のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の４１０～４２１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の３４９～３６０位のアミノ酸残基による置換。
変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１は、以下の点でＨＰＶ１８Ｎ６５とは異なる：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の３２７～３４６位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２９３～３１４位のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１１２～１２３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の５１～６２位のアミノ酸残基による置換。変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２は、以下の点でＨＰＶ１８Ｎ６５とは異なる：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の３２７～３４６位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２９３～３１４位のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１８３～２０４位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の１２２～１４３位のアミノ酸残基による置換。変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３は、以下の点でＨＰＶ１８Ｎ６５とは異なる：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の３２７～３４６位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２９３～３１４位のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の２３１～２４２位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の１７０～１８１位のアミノ酸残基による置換。変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５は、以下の点でＨＰＶ１８Ｎ６５とは異なる：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の３２７～３４６位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２９３～３１４位のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の４１０～４２１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の３４９～３６０位のアミノ酸残基による置換。
変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５は、以下の点でＨＰＶ１８Ｎ６５とは異なる：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１１４～１２３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の７９～８９位のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の４１０～４２１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の３４９～３６０位のアミノ酸残基による置換。変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５は、以下の点でＨＰＶ１８Ｎ６５とは次の点で異なる：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１７６～２０２位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の１４２～１６８位のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の４１０～４２１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の３４９～３６０位のアミノ酸残基による置換。変異タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５は、以下の点でＨＰＶ１８Ｎ６５とは異なる：野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の１１４～１２３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の７９～８９位のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の２３５～２４３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２０１～２０９位のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の４１０～４２１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の３４９～３６０位のアミノ酸残基による置換。
Figure 0007265563000003
Figure 0007265563000004
Figure 0007265563000005
Figure 0007265563000006
変異タンパク質の大規模な発現
組換えプラスミドｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、ｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、ｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、ｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、ｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、ｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、ｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、ｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、ｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、ｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、ｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、ｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、ｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、ｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、ｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、及びｐＴＯ－Ｔ７－Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５を含む大腸菌溶液をそれぞれ、－７０℃の冷蔵庫から取り出し、カナマイシンを含む１００ｍＬのＬＢ液体培地に接種し、２００ｒｐｍ及び３７℃で約８時間インキュベートした。次に、培養物をカナマイシンを含む５００ｍＬのＬＢ培地に移し（１ｍｌの細菌溶液を移した）、さらにインキュベートした。細菌濃度のＯＤ600が約０．６に達したとき、培養温度を２５℃に下げ、５００μＬのＩＰＴＧを各培養ボトルに加えた。さらにインキュベーションを８時間行った。インキュベーション終了後、遠心分離により細菌を回収した。Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５タンパク質を発現する細菌が、それぞれ得られた。
変異タンパク質を発現する細菌の破壊
上記で得られた細菌を、１ｇの細菌と１０ｍＬの溶解緩衝液（２０ｍＭ トリス緩衝液、ｐＨ７．２、３００ｍＭ ＮａＣｌ）の比率で再懸濁した。超音波装置を３０分間使用して、細菌を破壊した。破壊された細菌を含む溶解溶液を１３５００ｒｐｍ（３００００ｇ）で１５分間遠心分離し、上清（すなわち、破壊された細菌の上清）を得た。
変異タンパク質のクロマトグラフィー精製
機器：GE Healthcare（すなわち、元のAmershan Pharmacia Co.）製のAKTA Explorer 100分取液体クロマトグラフィーシステム
クロマトグラフィー媒体：ＳＰセファロース４ファストフロー（GE Healthcare Co.）、ＣＨＴ－ＩＩ（Bio-RADから購入）、及びブチルセファロース４ファストフロー（GE Healthcare Co.）
緩衝液：緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＤＴＴ）；及び緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、２０ｍＭ ＤＴＴ、２Ｍ ＮａＣｌ）。以下の溶出プロトコールで使用した異なる濃度のＮａＣｌを含む緩衝液は、緩衝液Ａと緩衝液Ｂを特定の比率で混合して調製された。
試料：上記のように得られた、それぞれＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５を含む破壊された細菌の上清。
溶出プロトコール：
（１）破壊された細菌の上清の、ＳＰセファロース４ファストフローによる陽イオン交換精製：試料をカラムに載せ、４００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液（８０％緩衝液Ａ＋２０％緩衝液Ｂ）を用いて不要なタンパク質を溶出し、次に８００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液（６０％緩衝液Ａ＋４０％緩衝液Ｂ）を用いて目的のタンパク質を溶出し、８００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液で溶出した画分を回収した。
（２）工程（１）で得られた溶出画分の、ＣＨＴＩＩ（ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー）によるクロマトグラフィー精製：工程（１）で得られた溶出画分を希釈して、ＮａＣｌ濃度を０．５Ｍに下げた。試料をカラムに載せ、次に不要なタンパク質を、５００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液（７５％緩衝液Ａ＋２５％緩衝液Ｂ）で溶出し、次に１０００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液（５０％緩衝液Ａ＋５０％緩衝液Ｂ）を用いて目的のタンパク質を溶出し、１０００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液で溶出した画分を回収した。
（３）工程（２）で得られた溶出画分の、ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）によるクロマトグラフィー精製：試料をカラムに載せ、次に不要なタンパク質を１０００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液を用いて溶出し、次に２００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液（９０％緩衝液Ａ＋１０％緩衝液Ｂ）を用いて目的のタンパク質を回収し、２００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液を用いて溶出した画分を回収した。
工程（３）で得られた１５０μＬの溶出画分を、３０μＬの６×ローディング緩衝液（この１Ｌは、３００ｍｌの１Ｍ ＴＢ ６．８、６００ｍｌの１００％グリセロール、１２０ｇのＳＤＳ、６ｇのブロモフェノールブルー、及び５０ｍｌのβ－メルカプトエタノールを含有した）に添加した。得られた溶液を十分に混合し、８０℃の水浴中で１０分間インキュベートした。次に、得られた試料１０μＬを１２０Ｖで１２０分間１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけた。電気泳動バンドをクマシーブリリアントブルーで染色した。電気泳動の結果を図１に示した。結果は、上記の精製工程後、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５タンパク質は、８５％超の純度を有することを示した。
同様の方法により、大腸菌及びプラスミドｐＴＯ－Ｔ７－ＨＰＶ１８Ｎ６５Ｌ１を使用して、ＨＰＶ１８Ｎ６５タンパク質（配列番号１１３）を調製及び精製した。大腸菌及びプラスミドｐＴＯ－Ｔ７－ＨＰＶ４５Ｌ１Ｎ２７Ｃを使用して、ＨＰＶ４５Ｎ２７タンパク質（配列番号１１５）を調製及び精製した。大腸菌及びプラスミドｐＴＯ－Ｔ７－ＨＰＶ５９Ｌ１を使用して、ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質（配列番号３）を調製及び精製した。
変異タンパク質のウエスタンブロットアッセイ
上記方法により精製されたＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５タンパク質を、電気泳動にかけた。電気泳動後、ＨＰＶ Ｌ１タンパク質に対する広域スペクトル抗体４Ｂ３を用いてウエスタンブロットアッセイを行い、その結果を図２に示した。結果は、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５が、広域スペクトル抗体４Ｂ３によって明確に認識できることを示した。
実施例２：ＨＰＶウイルス様粒子の組立てと粒子の形態学的検出
ＨＰＶウイルス様粒子の組み立て
所定の容量（約２ｍｌ）のタンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、又はＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５を、（１）２Ｌ保存緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ）；（２）２Ｌ再生緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、２ｍＭ ＣａＣｌ2、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５Ｍ ＮａＣｌ）；及び（３）２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．５Ｍ ＮａＣｌで、連続して透析した。透析は、３つの緩衝液のそれぞれで１２時間実施された。
同様の方法で、ＨＰＶ１８Ｎ６５、ＨＰＶ４５Ｎ２７、及びＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質を、それぞれＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ、及びＨＰＶ５９ ＶＬＰに組み立てた。
モレキュラーシーブクロマトグラフィー分析
透析した試料を、１１２０ Ｃｏｍｐａｃｔ ＬＣ高速液体クロマトグラフィーシステム（Agilent Technologies）によるモレキュラーシーブクロマトグラフィー分析にかけた。使用した分析カラムは、ＴＳＫゲルＰＷ５０００×１ ７．８×３００ｍｍであった。分析結果を図３Ａ～３Ｓに示した。結果は、タンパク質Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、又はＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５を含む試料の最初のタンパク質ピークが約１３分で現れ、これは、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ、及びＨＰＶ５９ ＶＬＰと同様であり、これは、これらすべてのタンパク質がＶＬＰに組み立てることができることを示した。
ウイルス様粒子の形態学的試験
ＶＬＰを含む１００μＬの試料を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。使用した装置は、JEOL Ltd. により提供された１００ｋＶ透過型電子顕微鏡（倍率１０万倍）であった。簡単に説明すると、１３．５μＬの試料を２％リンタングステン酸（ｐＨ７．０）で陰性染色し、炭素コーティングされた銅格子に固定して、ＴＥＭで観察した。結果を図４Ａ～４Ｓに示した。結果は、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５が、ウイルス様粒子に組み立てることができることを示した。さらに結果はまた、これらの変異タンパク質によって組み立てられた粒子が約３０ｎｍの半径を有し、サイズが均一であることを示した。野生型ＨＰＶ１８Ｎ６５、ＨＰＶ４５Ｎ２７、及びＨＰＶ５９ Ｌ１によって組み立てられた粒子も、半径が約３０ｎｍで、サイズが均一であった。これは、これらの変異タンパク質が、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、及びＨＰＶ５９のＬ１タンパク質に類似しており、均一なサイズのＶＬＰに組み立てることができることを示した。
沈降速度分析
沈降速度分析用の装置は、光学検査システムとＡｎ－５０Ｔｉ及びＡｎ－６０Ｔｉローターを備えたＢｅｃｋｍａｎＸＬ－Ａ分析用超遠心分離機であった。ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ、ＨＰＶ５９ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰの沈降係数を、沈降速度法により分析した。結果を図５Ａ～５Ｈに示した。結果は、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰの沈降係数がそれぞれ１４３．７Ｓ、１７３．３Ｓ、及び１６７．１Ｓであり、これは、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ、及びＨＰＶ５９ ＶＬＰの沈降係数（ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ、１４２．２Ｓ；ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ、１４６．５Ｓ、及びＨＰＶ５９ ＶＬＰ、１３９．３Ｓ）と同様であることを示した。これは、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰが、サイズと形態の点で野生型 ＶＬＰと同様のウイルス様粒子に組み立てることができることを示した。
実施例３：ウイルス様粒子の熱安定性の評価
タンパク質ＨＰＶ１８Ｎ６５、ＨＰＶ４５Ｎ２７、ＨＰＶ５９、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５によって形成されたＶＬＰを、GE Company（すなわち元のMicroCal Co.）から購入した示差走査熱量計ＶＰキャピラリーＤＳＣを使用して、これらの熱安定性を評価し、ここで、タンパク質の保存緩衝液を対照として使用し、タンパク質を１０℃～９０℃の温度範囲内で１．５℃／分の加熱速度で走査した。検出結果を図６Ａ～６Ｈに示した。結果は、これらのタンパク質によって形成されたこれらすべてのＶＬＰが非常に高い熱安定性を有することを示した。
実施例４：ウイルス様粒子をワクチン接種されたマウスの血清中の中和抗体力価の評価１
Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５によって形成されたＶＬＰの免疫防御を、マウスで評価した。ワクチン接種用の動物は、５～６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（通常グレード）（Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. LTD.から購入）であった。
上で調製したＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ５ ＶＬＰ、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ、及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５ ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰとＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰの混合物）を、それぞれアルミニウムアジュバントに吸収させた。マウスは免疫原に応じて８つの群に分けられ、各群には５匹のマウスを含まれた。ワクチン接種手順は以下のとおりであった：０週目に最初のワクチン接種、そしてそれぞれ２週目と４週目の追加免疫ワクチン接種。マウスに、腹腔内注射によりワクチン接種した。免疫原とその用量を表４に示した。最初のワクチン接種後８週目に、眼球から静脈血を回収し、血清を分離した。血清中の中和抗体の力価を測定した。検出結果を図７Ａに示した。結果は、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰがそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ１８に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができる活性を保持し、ＨＰＶ１８に対するそれらの防御効果が、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５ ＶＬＰの防御効果と同様であり、マウスにおいてＨＰＶ４５に対する中和抗体の生成を誘導することができる活性が、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の活性よりも高いことを示した。特に、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３ ＶＬＰ及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰはそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ４５及びＨＰＶ１８に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ；ＨＰＶ１８に対するそれらの防御効果は、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５ ＶＬＰの防御効果と同等であり、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高く；ＨＰＶ４５に対するそれらの防御効果は、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５ ＶＬＰの防御効果と同等であり、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高かった。これは、変異後、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰが、ＨＰＶ１８に対するそれらの免疫原性を保持し、ＨＰＶ４５に対するそれらの免疫原性もＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰと比較して改善されていることを示した。特に、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３ ＶＬＰ及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰは、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５に対して良好な交差免疫原性及び交差防御性を有し、ＨＰＶ１８感染及び／又はＨＰＶ４５感染を予防するための効果的なワクチンとして使用でき、ＨＰＶ１８ ＶＬＰとＨＰＶ４５ ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できる可能性がある。
Figure 0007265563000007
さらに、上で調製したＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ２ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ４ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ２ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ３ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ５ ＶＬＰ、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ、ＨＰＶ５９ ＶＬＰ、及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ、及びＨＰＶ５９ ＶＬＰの混合物）を、それぞれアルミニウムアジュバントに吸収させた。マウスは免疫原に応じて１２の群に分けられ、各群には５匹のマウスが含まれた。ワクチン接種手順は次のとおりであった：０週目の最初のワクチン接種、そしてそれぞれ２週目と４週目の追加免疫ワクチン接種。マウスに、腹腔内注射によりワクチン接種した。免疫原とその用量を表５に示した。最初のワクチン接種後８週目に、眼球から静脈血を回収し、血清を分離した。血清中の中和抗体の力価を測定した。検出結果を図７Ｂに示した。結果は、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰがそれぞれ、マウスにおいてＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、及びＨＰＶ５９に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ；ＨＰＶ１８に対するそれらの防御効果が、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰの防御効果と同等であり、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果及びＨＰＶ５９ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高く；ＨＰＶ４５に対するそれらの防御効果は、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰの防御効果と同等であり、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果及びＨＰＶ５９ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高く；ＨＰＶ５９に対するそれらの防御効果は、ＨＰＶ５９ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰの防御効果と同等であり、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果及びＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に高いことを、示した。これは、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰが、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、及びＨＰＶ５９に対して良好な交差免疫原性及び交差防御性を有し、ＨＰＶ１８感染、ＨＰＶ４５感染、及び／又はＨＰＶ５９感染を予防するための効果的なワクチンとして使用でき、ＨＰＶ１８ ＶＬＰ、ＨＰＶ４５ ＶＬＰ、及びＨＰＶ５９ ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できる可能性があることを示した。
Figure 0007265563000008
実施例５：セロコンバージョンを誘導するためのウイルス様粒子のＥＤ50の評価
この実験では、使用したウイルス様粒子は、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰであった。
６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌マウス（８匹のマウス）に、アルミニウムアジュバントとともに１回腹腔内注射してワクチン接種し、ここで、実験群では、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、又はＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰ（免疫用量は０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇ、又は０．００４μｇ）を使用し、対照群では、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独、ＨＰＶ５９ ＶＬＰ単独（免疫用量は０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇ、又は０．００４μｇ）、又は混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ、及びＨＰＶ５９ ＶＬＰの混合物であり、各ＶＬＰについて免疫用量は０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇ、又は０．００４μｇ）を使用し；免疫容量は１ｍＬであった。さらに、ワクチンを希釈するために使用した希釈剤をブランク対照として使用した。各群で８匹のマウスにワクチン接種し、ワクチン接種後５週目に、眼球から静脈血を回収した。血清中のＨＰＶに対する抗体が検出され、Reed-Muench法（Reed LJ MH. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg. 1938; 27:493-7）により、セロコンバージョン（すなわち、マウスにおける抗体の生成）を誘発するＥＤ50を、各試料について計算した。結果を表６～１２に示した。
Figure 0007265563000009
Figure 0007265563000010
Figure 0007265563000011
Figure 0007265563000012
Figure 0007265563000013
Figure 0007265563000014
Figure 0007265563000015
結果は、マウスのワクチン接種の５週間後、マウスにおいてＨＰＶ１８に対する抗体の生成を誘導するためのＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰのＥＤ50が、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独のＥＤ50及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰのＥＤ50と同等であり、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独のＥＤ50及びＨＰＶ５９ ＶＬＰ単独のＥＤ50よりも有意に優れており；マウスにおいてＨＰＶ４５に対する抗体の生成を誘導するためのＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰのＥＤ50が、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独のＥＤ50及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰのＥＤ50と同等であり、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独のＥＤ50及びＨＰＶ５９ ＶＬＰ単独のＥＤ50よりも有意に優れており；マウスにおいてＨＰＶ５９に対する抗体の生成を誘導するためのＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰのＥＤ50が、ＨＰＶ５９ ＶＬＰ単独のＥＤ50及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰのＥＤ50と同等であり、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独のＥＤ50及びＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独のＥＤ50よりも有意に優れていることを示した。これは、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰが、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、及びＨＰＶ５９に対して良好な交差免疫原性及び交差防御性を有することを示した。
実施例６：ウイルス様粒子をワクチン接種されたマウスの血清中の中和抗体力価の評価２
この実験では、使用したウイルス様粒子はＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰであった。
この実験では、ワクチン接種スケジュールを表１３に示した。すべてのマウス（６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌マウス）を２つの群に分けた：１０μｇ用量の群（１０μｇの免疫用量で、アルミニウムアジュバントを使用）、及び１μｇ用量の群（１μｇの免疫用量で、アルミニウムアジュバントを使用）。各群をさらに５つの亜群に分けた。対照亜群１及び２には、それぞれＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独及びＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独をワクチン接種し、対照亜群３には、混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５ ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰとＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰの混合物を、それぞれのＶＬＰの所定の免疫用量で）をワクチン接種し、実験亜群には、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰをワクチン接種した。
１亜群につき６匹のマウスに、それぞれ１０μｇ及び１μｇの免疫用量で、及び１ｍＬの注射量で、腹腔内注射によってワクチン接種した。すべてのマウスは、０週目に最初のワクチン接種を受け、次に２週目と４週目にそれぞれ追加免疫ワクチン接種を受けた。８週目に、眼窩出血を介して血液試料を回収し、血清中のＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５に対する抗体の力価を分析した。分析結果を図８Ａ～８Ｂに示した。結果は、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰが、マウスにおいてＨＰＶ１８に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、その防御効果は、同じ用量の、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５ ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量のＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に優れており；これは、マウスにおいてＨＰＶ４５に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、その防御効果は、同じ用量の、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５ ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量のＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独よりも有意に優れていることを、示した。これは、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４ ＶＬＰが、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５に対して良好な交差免疫原性及び交差防御性を有することを示した。
Figure 0007265563000016
実施例７：ウイルス様粒子をワクチン接種されたマウスの血清中の中和抗体力価の評価３
この実験では、使用したウイルス様粒子は、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰであった。
この実験では、ワクチン接種スケジュールを表１４に示した。すべてのマウス（６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌マウス）を２つの群に分けた：１０μｇ用量の群（１０μｇの免疫用量で、アルミニウムアジュバントを使用）、及び１μｇ用量の群（１μｇの免疫用量で、アルミニウムアジュバントを使用）。各群をさらに９つの亜群に分けた。対照亜群１、２、及び３には、それぞれＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独、及びＨＰＶ５９ ＶＬＰ単独をワクチン接種し、対照亜群４には、混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ、及びＨＰＶ５９ ＶＬＰの混合物、各ＶＬＰに所定の免疫用量で）をワクチン接種し、及び実験亜群１、２、３、４、及び５には、それぞれＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰをワクチン接種した。
１亜群につき６匹のマウスに、それぞれ１０μｇ及び１μｇの免疫用量で、及び１ｍＬの注射量で、腹腔内注射によってワクチン接種した。すべてのマウスは、０週目に最初のワクチン接種を受け、次に２週目と４週目にそれぞれ追加免疫ワクチン接種を受けた。８週目に、眼窩出血を介して血液試料を回収し、血清中のＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、及びＨＰＶ５９に対する抗体の力価を分析した。分析結果を図８Ｃ～８Ｄに示した。結果は、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰが、マウスにおいてＨＰＶ１８に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、それらの防御効果は、同じ用量の、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量の、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果又はＨＰＶ５９ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に優れており；Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰは、マウスにおいてＨＰＶ４５に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、それらの防御効果は、同じ用量の、ＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果及び混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量の、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果又はＨＰＶ５９ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に優れており；Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰは、マウスにおいてＨＰＶ５９に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、それらの防御効果は、同じ用量の、ＨＰＶ５９ ＶＬＰ単独の防御効果又は混合ＨＰＶ１８／ＨＰＶ４５／ＨＰＶ５９ ＶＬＰの防御効果と同等であり、同じ用量の、ＨＰＶ１８Ｎ６５ ＶＬＰ単独の防御効果又はＨＰＶ４５Ｎ２７ ＶＬＰ単独の防御効果よりも有意に優れていた。これは、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ３－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ４－５９Ｓ１ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ１－５９Ｓ５ ＶＬＰ、Ｈ１８Ｎ６５－４５Ｔ２－５９Ｓ５ ＶＬＰ、及びＨ１８Ｎ６５－４５Ｔ１Ｔ３－５９Ｓ５ ＶＬＰが、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、及びＨＰＶ５９に対して良好な交差免疫原性及び交差防御性を有することを、示した。
Figure 0007265563000017
本発明の特定の実施態様を詳細に説明してきたが、当業者は、本明細書に開示された教示によれば、様々な修正及び変更を行うことができ、そのような修正及び変更が本発明の範囲内であることを理解しているであろう。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその任意の同等物によって与えられる。

Claims (23)

  1. 変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質であって、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質と比較して、
    （Ｉ）前記変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は以下の変異：
    （１）４０～８０個のアミノ酸のＮ末端切断；及び
    （２）（ａ）配列番号１の２３５～２４３位に対応する野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の位置におけるアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、又は
    （ｂ）配列番号１の３２７～３４６位に対応する野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の位置におけるアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、又は
    （ｃ）配列番号１の１１４～１２３位に対応する野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の位置におけるアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、又は
    （ｄ）配列番号１の１７６～２０２位に対応する野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の位置におけるアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、を有する；あるいは、
    （ＩＩ）変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、（１）および（２）（ａ）で定義されるような変異を有し、そしてさらに以下の変異；
    （３）配列番号１の１１２～１２３位に対応する野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の位置におけるアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、を有する；あるいは、
    （ＩＩＩ）変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、（１）および（２）（ｂ）で定義されるような変異を有し、そしてさらに以下の変異；
    （３）配列番号１の１１２～１２３位に対応する野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の位置におけるアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、を有する；あるいは、
    （ＩＶ）変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、（１）および（２）（ｃ）で定義されるような変異を有し、そしてさらに以下の変異：
    （４）配列番号１の４１０～４２１位に対応する野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の位置におけるアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、を有する；あるいは、
    （Ｖ）変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、（１）および（２）（ｄ）で定義されるような変異を有し、そしてさらに以下の変異：
    （４）配列番号１の４１０～４２１位に対応する野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質の位置におけるアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換、を有する；あるいは、
    （ＶＩ）変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、（１）、（２）（ｃ）および（２）（ａ）で定義されるような変異を有し、そしてさらに（４）で定義されるような変異を有する；
    ここで、前記対応する位置は、比較される配列が最適に整列されることにより決定される、上記変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質。
  2. 前記変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質と比較して、４５、５０、５２、５５、５８、６０、６２、６５、６８、７０、７２、７５、又は７８個のアミノ酸がＮ末端で切断されている、請求項１に記載の変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質。
  3. （２）（ａ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２０１～２０９位のアミノ酸残基であり；
    （２）（ｂ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の２９３～３１４位のアミノ酸残基であり；
    （２）（ｃ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の７９～８９位のアミノ酸残基であり；
    （２）（ｄ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質の１４２～１６８位のアミノ酸残基である、請求項１又は２に記載の変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質。
  4. （３）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の５１～６２位のアミノ酸残基であり；
    （４）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質の３４９～３６０位のアミノ酸残基である、請求項１～３のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質。
  5. 前記変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は以下の特徴：
    （ｉ）野生型ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、配列番号１又は１１３に記載のアミノ酸配列を有する；
    （ｉｉ）野生型ＨＰＶ４５ Ｌ１タンパク質は、配列番号２又は１１５に記載のアミノ酸配列を有する；
    （ｉｉｉ）野生型ＨＰＶ５９ Ｌ１タンパク質は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する；
    の１又は複数を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質。
  6. 前記変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質は、配列番号６、７、９、１３、１７、１８、及び１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質。
  7. 請求項１～６のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質をコードする単離された核酸。
  8. 配列番号２５、２６、２８、３２、３６、３７、及び３８からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項７に記載の単離された核酸。
  9. 請求項７又は８に記載の単離された核酸を含むベクター。
  10. 請求項７又は８に記載の単離された核酸及び／又は請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
  11. 請求項１～６のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質を含むか又はそれからなるＨＰＶウイルス様粒子。
  12. 請求項１～６のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質、又は請求項７又は８に記載の単離された核酸、又は請求項９に記載のベクター、又は請求項１０に記載の宿主細胞、又は請求項１１に記載のＨＰＶウイルス様粒子、を含む組成物。
  13. 請求項１１に記載のＨＰＶウイルス様粒子、及び医薬的に許容し得る担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物又はワクチン。
  14. 前記ＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するのに有効な量で存在する、請求項１３に記載の医薬組成物又はワクチン。
  15. 前記ＨＰＶ感染は、１種以上のＨＰＶ型による感染であり、かつ／あるいは、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌及び尖圭コンジローマからなる群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物又はワクチン。
  16. 前記ＨＰＶ感染は、ＨＰＶ１８感染、ＨＰＶ４５感染、ＨＰＶ５９感染、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される、請求項１５に記載の医薬組成物又はワクチン。
  17. 変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質を宿主細胞で発現させ、次に変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパクを宿主細胞の培養物から回収することを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質を調製する方法。
  18. 前記宿主細胞は大腸菌である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記方法は、大腸菌中で変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質を発現させ、次に大腸菌の溶解物上清を精製することによって変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質を得る工程を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 請求項１１に記載のＨＰＶウイルス様粒子を、医薬的に許容し得る担体及び／又は賦形剤と組み合わせることを含む、ワクチンの調製方法。
  21. ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患の予防のための、請求項１～６のいずれか１項に記載の変異ＨＰＶ１８ Ｌ１タンパク質、又は請求項１１に記載のＨＰＶウイルス様粒子を含む組成物又はワクチン。
  22. 前記ＨＰＶ感染は、１種以上のＨＰＶ型による感染であり、かつ／あるいは、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌及び尖圭コンジローマからなる群から選択される、請求項２１に記載の医薬組成物又はワクチン。
  23. 前記ＨＰＶ感染は、ＨＰＶ１８感染、ＨＰＶ４５感染、ＨＰＶ５９感染、及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される、請求項２２に記載の医薬組成物又はワクチン。
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