BR112020024699A2 - Mutante da proteína l1 do papilomavírus humano tipo 18 - Google Patents

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Abstract

a presente invenção refere-se a uma proteína l1 do hpv18 com mutação (ou uma variante da mesma), uma sequência de codificação desta e um método para a preparação para isso, assim como uma partícula semelhante ao vírus compreendendo a mesma; a proteína (ou uma variante da mesma) e a partícula semelhante ao vírus são capazes de induzir um anticorpo neutralizante contra pelo menos dois tipos de hpv (tais como hpv 18 e hpv 45 ou hpv 18, hpv 45 e hpv 59) e, portanto, podem ser utilizadas para prevenir a infecção de pelos dois tipos de hpv, assim como a doença provocada pela infecção, tal como câncer cervical e condyloma acuminata. a presente invenção também se refere a um uso da proteína e da partícula semelhante ao vírus descritas na preparação de uma composição farmacêutica ou uma vacina, em que a composição farmacêutica ou a vacina pode ser utilizada para prevenir a infecção de pelos dois tipos de hpv, assim como a doença provocada pela infecção, tal como câncer cervical e condyloma acuminata.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MU- TANTE DA PROTEÍNA L1 DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO TIPO 18".
[0001] O presente pedido se baseia e reivindica o benefício de pri- oridade do pedido chinês No. 201810566208.8, depositado em 4 de junho de 2018, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Campo Técnico
[0002] A invenção refere-se ao campo da virologia molecular e imunologia. Em particular, a invenção se refere a uma proteína L1 do HPV18 com mutação (ou uma variante da mesma), uma sequência que codifica a mesma, um método para a sua preparação e uma partí- cula semelhante a vírus compreendendo-a, em que a proteína (ou uma variante desta) e a partícula semelhante a vírus podem induzir a gera- ção de anticorpos neutralizantes contra pelo menos dois tipos de HPV (por exemplo, HPV18 e HPV45 ou HPV18, HPV45 e HPV59) e, portan- to, podem ser utilizadas para prevenir a infecção por ditos pelo menos dois tipos de HPV, e uma doença provocada por essa infecção, tal como câncer cervical e condyloma acuminatum. A invenção se refere ainda ao uso da proteína e da partícula semelhante a vírus na fabrica- ção de uma composição farmacêutica ou uma vacina para prevenir a infecção por ditos pelo menos dois tipos de HPV e uma doença provo- cada pela referida infecção, tal como câncer cervical e condyloma acuminatum. Técnica Antecedente
[0003] O papilomavírus humano (HPV) causa principalmente ver- rugas na pele e nas mucosas. Os tipos de HPV são divididos em tipos de alto risco e tipos de baixo risco, dependendo de sua associação com a tumorigênese. Entre eles, a infecção por tipos de HPV de alto risco demonstrou ser a principal causa de câncer genital incluindo câncer cervical em mulheres; e os tipos de HPV de baixo risco provo- cam principalmente condyloma acuminatum. A maneira mais eficaz de prevenir e controlar a infecção por HPV é vacinar com vacinas contra o HPV, particularmente vacinas contra os tipos de HPV de alto risco que provocam câncer cervical.
[0004] A proteína do capsídeo principal L1 do HPV possui a carac- terística de auto-organizar em partículas semelhantes a vírus (VLP) ocas. A VLP do HPV possui uma estrutura icosaédrica simétrica com- posta de 72 pentâmeros da proteína da cápside principal L1 (Doorbar, J. and P.H. Gallimore. 1987. J Virol, 61(9): 2793-9). A VLP do HPV é altamente semelhante ao HPV natural em termos de estrutura, retém a maioria dos epítopos neutralizantes do vírus natural e pode induzir a geração de anticorpos neutralizantes de alto título (Kirnbauer, R., F. Booy, et al. 1992 Proc Natl Acad Sci U S A 89(24): 12180-4).
[0005] No entanto, os estudos existentes mostram que as VLPs do HPV induzem principalmente a geração de anticorpos neutralizantes contra o mesmo tipo de HPV, produzem imunidade protetora contra o mesmo tipo de HPV e só possuem baixo efeito de proteção cruzada entre alguns tipos de HPV altamente homólogos (Sara L. Bissett, Gi- ada Mattiuzzo, et al. 2014 Vaccine. 32:6548-6555). Portanto, as va- cinas contra o HPV existentes possuem uma faixa de proteção muito limitada. Em geral, a VLP de um tipo de HPV só pode ser utilizada pa- ra prevenir a infecção pelo mesmo tipo de HPV. Nesse caso, se for necessário ampliar a faixa de proteção das vacinas contra o HPV, a única maneira é adicionar VLPs de mais tipos de HPV nas vacinas. Atualmente, as vacinas de HPV comercialmente disponíveis, incluindo Gardasil® da Merck (que é uma vacina quadrivalente contra HPV16, 18, 6 e 11), Cervarix® da GSK (que é uma vacina bivalente contra HPV16 e 18) e Gardasil®9 da Merck (que é uma vacina 9-valente con- tra HPV6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52 e 58), são preparadas através da combinação de VLPs de vários tipos de HPV. No entanto, uma tal so- lução aumentaria muito o custo de produção das vacinas contra o HPV e poderia provocar problemas de segurança devido ao aumento da dose de imunização.
[0006] Portanto, é urgente na técnica desenvolver partículas se- melhantes ao vírus HPV capazes de induzir a geração de anticorpos neutralizantes protetores contra vários tipos de HPV, de modo a pre- venir a infecção por vários tipos de HPV e uma doença provocada pela infecção, tal como cervical câncer e condyloma acuminatum, de forma mais econômica e eficaz. Conteúdo da Invenção
[0007] A invenção é pelo menos parcialmente baseada na desco- berta surpreendente dos inventores: após a substituição de um seg- mento específico da proteína L1 do Papilomavírus Humano (HPV) Tipo 18 com o segmento correspondente da proteína L1 de um segundo tipo de HPV (tal como HPV45), a proteína L1 do HPV18 com mutação assim obtida pode induzir a geração de anticorpos neutralizantes de alto título contra o HPV18 e o segundo tipo de HPV (tal como HPV45) em organismos, e seu efeito de proteção é comparável com aquele de uma mistura de VLP do HPV18 e VLP do segundo Tipo de HPV, seu efeito de proteção contra o HPV18 é comparável com aquele da VLP do HPV18 isoladamente, e seu efeito de proteção contra o segundo tipo de HPV (tal como HPV45) é comparável com aquele da VLP do segundo tipo de HPV isoladamente.
[0008] Além disso, com base na substituição acima, outro segmen- to específico da proteína L1 do HPV18 pode ser ainda substituído com o segmento correspondente da proteína L1 de um terceiro tipo de HPV (tal como HPV59), e a proteína L1 do HPV18 com mutação tendo substituições duplas assim obtida pode induzir a geração de anticor- pos neutralizantes de alto título contra o HPV18, o segundo tipo de
HPV (tal como HPV45) e o terceiro tipo de HPV (tal como HPV59); e seu efeito de proteção é comparável com aquele de uma mistura de VLP do HPV18, VLP do segundo tipo de HPV e VLP do terceiro tipo de HPV, seu efeito de proteção contra o HPV18 é comparável com aquele da VLP do HPV18 isoladamente, seu efeito de proteção contra o se- gundo tipo de HPV (tal como HPV45) é comparável com aquele da VLP do segundo tipo de HPV isoladamente, e seu efeito de proteção contra o terceiro tipo de HPV (tal como HPV59) é comparável com aquele da VLP do terceiro tipo de HPV isoladamente.
[0009] Portanto, em um aspecto, a invenção fornece uma proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma, em que, em comparação com uma proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem, a pro- teína L1 do HPV18 com mutação possui as seguintes mutações: (1) truncamento N-terminal de 40 a 80 aminoácidos, por exemplo 40 a 50, 45 a 70, 50 a 70, 55 a 65, 60 a 70, 65 a 75, 60 a 80 ou 70 a 80 aminoácidos; e (2) (a) substituição de resíduos de aminoácido nas posições 235 a 243 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de ami- noácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um se- gundo tipo de HPV do tipo selvagem; ou (b) substituição de resíduos de aminoácido nas posições 327 a 346 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de ami- noácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um se- gundo tipo de HPV do tipo selvagem; ou (c) substituição de resíduos de aminoácido nas posições 114 a 123 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de ami- noácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um se- gundo tipo de HPV do tipo selvagem; ou (d) substituição de resíduos de aminoácidos nas posições 176 a 202 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de ami-
noácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um se- gundo tipo de HPV do tipo selvagem, e, a variante difere da proteína L1 do HPV18 com mutação apenas pe- la substituição (de preferência substituição conservadora), adição ou supressão de um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9) ami- noácidos, e retém a função da proteína L1 do HPV18 com mutação, isto é, a capacidade de induzir a geração de anticorpos neutralizantes contra pelo menos dois tipos de HPV (por exemplo, HPV18 e HPV45, ou HPV18, HPV45 e HPV59).
[0010] Em algumas modalidades preferidas, a proteína L1 do HPV18 com mutação possui a mutação conforme definida em (2) (a) ou (2) (b) e, opcionalmente, ainda possui a seguinte mutação: (3) substituição de resíduos de aminoácidos nas posições 112 a 123 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de aminoá- cido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um terceiro tipo de HPV do tipo selvagem.
[0011] Em algumas modalidades, a proteína L1 do HPV18 com mutação possui a mutação conforme definida em (2) (c) ou (2) (d) e, opcionalmente, ainda possui a seguinte mutação: (4) substituição de resíduos de aminoácido nas posições 410 a 421 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de aminoácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um terceiro tipo de HPV do tipo selvagem.
[0012] Em algumas modalidades, a proteína L1 do HPV18 com mutação possui as mutações definidas em (2) (c) e (2) (a) e, opcio- nalmente, ainda possui a mutação como definida em (4).
[0013] Em algumas modalidades preferidas, a proteína L1 do HPV18 com mutação possui as seguintes mutações: substituição de resíduos de aminoácido nas posições 235 a 243 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de aminoácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um segundo tipo de HPV do tipo selvagem, e substituição de resíduos de aminoácidos nas posi- ções 112 a 123 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resí- duos de aminoácidos nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um terceiro tipo de HPV do tipo selvagem.
[0014] Em algumas modalidades preferidas, a proteína L1 do HPV18 com mutação possui as seguintes mutações: substituição de resíduos de aminoácido nas posições 327 a 346 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de aminoácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um segundo tipo de HPV do tipo selvagem, e substituição de resíduos de aminoácido nas posições 112 a 123 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de aminoácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um terceiro tipo de HPV do tipo selvagem.
[0015] Em algumas modalidades preferidas, a proteína L1 do HPV18 com mutação possui as seguintes mutações: substituição de resíduos de aminoácido nas posições 114 a 123 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de aminoácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um segundo tipo de HPV do tipo selvagem, e substituição de resíduos de aminoácido nas posições 410 a 421 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de aminoácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um terceiro tipo de HPV do tipo selvagem.
[0016] Em algumas modalidades preferidas, a proteína L1 do HPV18 com mutação possui as seguintes mutações: substituição de resíduos de aminoácido nas posições 176 a 202 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de aminoácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um segundo tipo de HPV do tipo selvagem, e substituição de resíduos de aminoácido nas posições 410 a 421 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de aminoácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um terceiro tipo de HPV do tipo selvagem.
[0017] Em algumas modalidades preferidas, a proteína L1 do HPV18 com mutação possui as seguintes mutações: substituição de resíduos de aminoácido nas posições 114 a 123 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de aminoácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um segundo tipo de HPV do tipo selvagem, e substituição de resíduos de aminoácido nas posições 235 a 243 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de aminoácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um segundo tipo de HPV do tipo selvagem, e substituição de resíduos de aminoácido nas posições 410 a 421 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de aminoácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um terceiro tipo de HPV do tipo selvagem.
[0018] Em algumas modalidades preferidas, a proteína L1 do HPV18 com mutação possui 45, 50, 52, 55, 58, 60, 62, 65, 68, 70, 72, 75 ou 78 aminoácidos truncados no N-terminal, em comparação com a proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem.
[0019] Em algumas modalidades preferidas, a proteína L1 do HPV18 com mutação possui 65 aminoácidos truncados no N-terminal, em comparação com a proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem.
[0020] Em algumas modalidades preferidas, o segundo tipo de HPV do tipo selvagem é HPV45. Em algumas modalidades preferidas, os resíduos de aminoácido nas posições correspondentes conforme descrito em (2) (a) são resíduos de aminoácido nas posições 201 a 209 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem. Em algumas modalidades preferidas, os resíduos de aminoácido nas posições cor- respondentes conforme descrito em (2) (b) são resíduos de aminoáci- do nas posições 293 a 314 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo sel- vagem. Em algumas modalidades preferidas, os resíduos de aminoá-
cido nas posições correspondentes conforme descrito em (2) (c) são resíduos de aminoácido nas posições 79 a 89 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem. Em algumas modalidades preferidas, os re- síduos de aminoácido nas posições correspondentes conforme des- crito em (2) (d) são resíduos de aminoácido nas posições 142 a 168 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem.
[0021] Em algumas modalidades preferidas, o terceiro tipo de HPV do tipo selvagem é HPV59. Em algumas modalidades preferidas, os resíduos de aminoácido nas posições correspondentes conforme des- crito em (3) são resíduos de aminoácido nas posições 51 a 62 de uma proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem. Em algumas modalidades preferidas, os resíduos de aminoácido nas posições correspondentes conforme descrito em (4) são resíduos de aminoácido nas posições 349 a 360 de uma proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem.
[0022] Em algumas modalidades preferidas, a proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem possui uma sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 1 ou 113.
[0023] Em algumas modalidades preferidas, a proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem possui uma sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 2 ou 115.
[0024] Em algumas modalidades preferidas, a proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem possui uma sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 3.
[0025] Em algumas modalidades preferidas, os resíduos de ami- noácido nas posições 79 a 89 da proteína L1 do HPV45 do tipo selva- gem possuem uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 39.
[0026] Em algumas modalidades preferidas, os resíduos de ami- noácido nas posições 142 a 168 da proteína L1 do HPV45 do tipo sel- vagem possuem uma sequência como apresentada na SEQ ID NO:
40.
[0027] Em algumas modalidades preferidas, os resíduos de ami- noácido nas posições 201 a 209 da proteína L1 do HPV45 do tipo sel- vagem possuem uma sequência como apresentada na SEQ ID NO:
41.
[0028] Em algumas modalidades preferidas, os resíduos de ami- noácido nas posições 293 a 314 da proteína L1 do HPV45 do tipo sel- vagem possuem uma sequência como apresentada na SEQ ID NO:
42.
[0029] Em algumas modalidades preferidas, os resíduos de ami- noácido nas posições 51 a 62 da proteína L1 do HPV59 do tipo selva- gem possuem uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 43.
[0030] Em algumas modalidades preferidas, os resíduos de ami- noácido nas posições 349 a 360 da proteína L1 do HPV59 do tipo sel- vagem possuem uma sequência como apresentada na SEQ ID NO:
44.
[0031] Em algumas modalidades preferidas, a proteína L1 do HPV18 com mutação possui uma sequência de aminoácido seleciona- da do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 9, 13, 17, 18 e
19.
[0032] Em algumas modalidades preferidas, a proteína L1 do HPV18 com mutação possui uma sequência de aminoácido seleciona- da do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 6, 7, 9, 13, 17, 18 e 19.
[0033] Em outro aspecto, a invenção fornece um ácido nucleico isolado, que codifica a proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma conforme descrito acima. Em outro aspecto, a invenção fornece um vetor que compreende o ácido nucleico isola- do. Em algumas modalidades preferidas, o ácido nucleico isolado de acordo com a invenção possui uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 28, 32, 36, 37 e 38. Em algumas modalidades mais preferidas, o ácido nucleico isolado de acordo com a invenção possui uma s e- quência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 25, 26, 28, 32, 36, 37 e 38.
[0034] Os vetores úteis para a inserção de um polinucleotídeo de interesse são bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado aos vetores de clonagem e vetores de expressão. Em uma modalida- de, os vetores são, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, fagos, etc.
[0035] Em outro aspecto, a invenção se refere ainda a uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico isolado ou o vetor. A cé- lula hospedeira inclui, mas não é limitada a estas, células procarióticas tais como células de E. coli, e células eucarióticas, tais como células de levedura, células de inseto, células vegetais e células animais (tais como células de mamífero, por exemplo, células de camundongo, cé- lulas humanas, etc.). A célula hospedeira de acordo com a invenção também pode ser uma linhagem celular, tal como a célula 293T.
[0036] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma partícula semelhante a vírus HPV, que compreende ou consiste na proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma de acordo com a invenção.
[0037] Em algumas modalidades preferidas, a partícula semelhan- te a vírus HPV de acordo com a invenção compreende a proteína L1 do HPV18 com mutação, que possui truncamento N-terminal de 40 a 80 aminoácidos, por exemplo, 40 a 50, 45 a 70, 50 a 70, 55 a 65, 60 a 70, 65 a 75, 60 a 80 ou 70 a 80 aminoácidos, por exemplo, 45, 50, 52, 55, 58, 60, 62, 65, 68, 70, 72, 75 ou 78 aminoácidos, em comparação com uma proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem, e substituição dos resíduos de aminoácido nas posições 235 a 243 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido nas posições 201 a 209 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem.
[0038] Em algumas modalidades preferidas, a partícula semelhan-
te a vírus HPV de acordo com a invenção compreende a proteína L1 do HPV18 com mutação, que possui truncamento N-terminal de 40 a 80 aminoácidos, por exemplo, 40 a 50, 45 a 70, 50 a 70, 55 a 65, 60 a 70, 65 a 75, 60 a 80 ou 70 a 80 aminoácidos, por exemplo, 45, 50, 52, 55, 58, 60, 62, 65, 68, 70, 72, 75 ou 78 aminoácidos, em comparação com uma proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem, e substituição dos resíduos de aminoácido nas posições 327 a 346 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido nas posições 293 a 314 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem.
[0039] Em algumas modalidades preferidas, a partícula semelhan- te a vírus HPV de acordo com a invenção compreende a proteína L1 do HPV18 com mutação, que possui truncamento N-terminal de 40 a 80 aminoácidos, por exemplo, 40 a 50, 45 a 70, 50 a 70, 55 a 65, 60 a 70, 65 a 75, 60 a 80 ou 70 a 80 aminoácidos, por exemplo, 45, 50, 52, 55, 58, 60, 62, 65, 68, 70, 72, 75 ou 78 aminoácidos, em comparação com uma proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem, e substituição dos resíduos de aminoácido nas posições 114 a 123 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido nas posições 79 a 89 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem.
[0040] Em algumas modalidades preferidas, a partícula semelhan- te a vírus HPV de acordo com a invenção compreende a proteína L1 do HPV18 com mutação, que possui truncamento N-terminal de 40 a 80 aminoácidos, por exemplo, 40 a 50, 45 a 70, 50 a 70, 55 a 65, 60 a 70, 65 a 75, 60 a 80 ou 70 a 80 aminoácidos, por exemplo, 45, 50, 52, 55, 58, 60, 62, 65, 68, 70, 72, 75 ou 78 aminoácidos, em comparação com uma proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem, e substituição dos resíduos de aminoácido nas posições 176 a 202 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido nas posições 142 a 168 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem.
[0041] Em algumas modalidades preferidas, a partícula semelhan-
te a vírus HPV de acordo com a invenção compreende a proteína L1 do HPV18 com mutação, que possui truncamento N-terminal de 40 a 80 aminoácidos, por exemplo, 40 a 50, 45 a 70, 50 a 70, 55 a 65, 60 a 70, 65 a 75, 60 a 80 ou 70 a 80 aminoácidos, por exemplo, 45, 50, 52, 55, 58, 60, 62, 65, 68, 70, 72, 75 ou 78 aminoácidos, em comparação com uma proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem, e substituição dos resíduos de aminoácido nas posições 235 a 243 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido nas posições 201 a 209 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, e substi- tuição dos resíduos de aminoácido nas posições 112 a 123 da proteí- na L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido nas posições 51 a 62 de uma proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem.
[0042] Em algumas modalidades preferidas, a partícula semelhan- te a vírus HPV de acordo com a invenção compreende a proteína L1 do HPV18 com mutação, que possui truncamento N-terminal de 40 a 80 aminoácidos, por exemplo, 40 a 50, 45 a 70, 50 a 70, 55 a 65, 60 a 70, 65 a 75, 60 a 80 ou 70 a 80 aminoácidos, por exemplo, 45, 50, 52, 55, 58, 60, 62, 65, 68, 70, 72, 75 ou 78 aminoácidos, em comparação com uma proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem, e substituição dos resíduos de aminoácido nas posições 327 a 346 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido nas posições 293 a 314 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, e substi- tuição dos resíduos de aminoácido nas posições 112 a 123 da proteí- na L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido nas posições 51 a 62 de uma proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem.
[0043] Em algumas modalidades preferidas, a partícula semelhan- te a vírus HPV de acordo com a invenção compreende a proteína L1 do HPV18 com mutação, que possui truncamento N-terminal de 40 a 80 aminoácidos, por exemplo, 40 a 50, 45 a 70, 50 a 70, 55 a 65, 60 a 70, 65 a 75, 60 a 80 ou 70 a 80 aminoácidos, por exemplo, 45, 50, 52,
55, 58, 60, 62, 65, 68, 70, 72, 75 ou 78 aminoácidos, em comparação com uma proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem, e substituição dos resíduos de aminoácido nas posições 114 a 123 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido nas posições 79 a 89 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, e substitui- ção dos resíduos de aminoácido nas posições 410 a 421 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido nas posições 349 a 360 de uma proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem.
[0044] Em algumas modalidades preferidas, a partícula semelhan- te a vírus HPV de acordo com a invenção compreende a proteína L1 do HPV18 com mutação, que possui truncamento N-terminal de 40 a 80 aminoácidos, por exemplo, 40 a 50, 45 a 70, 50 a 70, 55 a 65, 60 a 70, 65 a 75, 60 a 80 ou 70 a 80 aminoácidos, por exemplo, 45, 50, 52, 55, 58, 60, 62, 65, 68, 70, 72, 75 ou 78 aminoácidos, em comparação com uma proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem, e substituição dos resíduos de aminoácido nas posições 176 a 202 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido nas posições 142 a 168 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, e substi- tuição dos resíduos de aminoácido nas posições 410 a 421 da proteí- na L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido nas posições 349 a 360 de uma proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem.
[0045] Em algumas modalidades preferidas, a partícula semelhan- te a vírus HPV de acordo com a invenção compreende a proteína L1 do HPV18 com mutação, que possui truncamento N-terminal de 40 a 80 aminoácidos, por exemplo, 40 a 50, 45 a 70, 50 a 70, 55 a 65, 60 a 70, 65 a 75, 60 a 80 ou 70 a 80 aminoácidos, por exemplo, 45, 50, 52, 55, 58, 60, 62, 65, 68, 70, 72, 75 ou 78 aminoácidos, em comparação com uma proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem, e substituição dos resíduos de aminoácido nas posições 114 a 123 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido nas posições
79 a 89 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, e substitui- ção dos resíduos de aminoácido nas posições 235 a 243 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido nas posições 201 a 209 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, e substituição dos resíduos de aminoácido nas posições 410 a 421 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoáci- do nas posições 349 a 360 de uma proteína L1 do HPV59 do tipo sel- vagem.
[0046] Em uma modalidade particularmente preferida, a partícula semelhante a vírus HPV de acordo com a invenção compreende a pro- teína L1 do HPV18 com mutação, que possui uma sequência como apresentada na SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 9, 13, 17, 18 ou 19.
[0047] Em outro aspecto, a invenção ainda se refere a uma composição que compreende a proteína L1 do HPV18 com muta- ção ou uma variante da mesma, o ácido nucleico isolado, o vetor, a célula hospedeira ou a partícula semelhante a vírus HPV. Em al- gumas modalidades preferidas, a composição compreende a prote- ína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma de acordo com a invenção. Em algumas modalidades preferidas, a composição compreende a partícula semelhante a vírus HPV de acordo com a invenção.
[0048] Em outro aspecto, a invenção ainda se refere a uma composição farmacêutica ou vacina, que compreende a partícula semelhante a vírus HPV de acordo com a invenção, e opcional- mente um veículo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica ou vacina de acordo com a invenção po- de ser utilizada para prevenir a infecção por HPV, ou uma doença provocada pela infecção por HPV, tal como câncer cervical e con- dyloma acuminatum.
[0049] Em algumas modalidades preferidas, a partícula semelhan-
te a vírus HPV está presente em uma quantidade eficaz para prevenir a infecção por HPV ou uma doença provocada pela infecção por HPV. Em algumas modalidades preferidas, a infecção por HPV é a infecção por um ou mais tipos de HPV (por exemplo, infecção por HPV18, in- fecção por HPV45 e/ou infecção por HPV59). Em algumas modalida- des preferidas, a doença provocada pela infecção por HPV é selecio- nada do grupo que consiste em câncer cervical e condyloma acumina- tum.
[0050] A composição farmacêutica ou vacina de acordo com a in- venção pode ser administrada por métodos bem conhecidos na técni- ca, por exemplo, mas não limitado a por via oral ou por injeção. Na in- venção, uma via de administração particularmente preferida é a inje- ção.
[0051] Em algumas modalidades preferidas, a composição farma- cêutica ou vacina de acordo com a invenção é administrada na forma de uma dosagem unitária. Por exemplo, mas não para limitar a inven- ção, cada dosagem unitária contém de 5 µg a 80 µg, de preferência de 20 µg a 40 µg de partícula semelhante ao vírus HPV.
[0052] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para a preparação da proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante desta como descrito acima, compreendendo a expressão da proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma em uma célula hospedeira e, em seguida, a recuperação da proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma de uma cultura da célula hospedeira.
[0053] Em algumas modalidades preferidas, a célula hospedeira é E. coli.
[0054] Em algumas modalidades preferidas, o método compreen- de as etapas de: expressar a proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante desta em E. coli e, em seguida, obter a proteína L1 do
HPV18 com mutação ou uma variante da mesma através da purifica- ção de um sobrenadante de lisado da E. coli. Em algumas modalida- des preferidas, a proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma é recuperada do sobrenadante de lisado da E. coli por cro- matografia (por exemplo, cromatografia de troca catiônica, cromatogra- fia de hidroxiapatita e/ou cromatografia de interação hidrofóbica).
[0055] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para a preparação de uma vacina, compreendendo a combinação da partícu- la semelhante ao vírus HPV de acordo com a invenção com um veícu- lo e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
[0056] Em outro aspecto, a invenção se refere a um método para prevenir a infecção por HPV ou uma doença provocada pela infecção por HPV, compreendendo a administração a um indivíduo de uma quantidade profilaticamente eficaz da partícula semelhante a vírus HPV ou a composição farmacêutica ou vacina de acordo com a inven- ção. Em uma modalidade preferida, a infecção por HPV é a infecção por um ou mais tipos de HPV (por exemplo, infecção por HPV18, in- fecção por HPV45 e/ou infecção por HPV59). Em outra modalidade preferida, a doença provocada pela infecção por HPV inclui, mas não é limitada ao câncer cervical e condyloma acuminatum. Em outra moda- lidade preferida, o indivíduo é um mamífero, tal como um ser humano.
[0057] Em outro aspecto, a invenção se refere ainda ao uso da proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma ou da partícula semelhante a vírus HPV de acordo com a invenção na fabri- cação de uma composição farmacêutica ou vacina para prevenir a in- fecção por HPV ou uma doença provocada pela infecção por HPV. Em uma modalidade preferida, a infecção por HPV é a infecção por um ou mais tipos de HPV (por exemplo, infecção por HPV18, infecção por HPV45 e/ou infecção por HPV59). Em outra modalidade preferida, a doença provocada pela infecção por HPV inclui, mas não é limitada a câncer cervical e condyloma acuminatum.
[0058] Em outro aspecto, a invenção se refere ainda à proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante desta ou à partícula seme- lhante a vírus HPV de acordo com a invenção para a prevenção de infecção por HPV ou uma doença provocada pela infecção por HPV. Em uma modalidade preferida, a infecção por HPV é a infecção por um ou mais tipos de HPV (por exemplo, infecção por HPV18, infecção por HPV45 e/ou infecção por HPV59). Em outra modalidade preferida, a doença provocada pela infecção por HPV inclui, mas não está limita- da a câncer cervical e condyloma acuminatum. Definições dos termos na presente invenção
[0059] Na invenção, a não ser que de outra maneira especificada, os termos científicos e técnicos utilizados nesta invenção possuem os significados geralmente compreendidos por uma pessoa versada na técnica. Além do mais, as operações de laboratório de cultura celular, genética molecular, química de ácido nucleico e imunologia aqui utili- zadas são as operações de rotina amplamente utilizadas nos campos correspondentes. Entretanto, a fim de melhor compreender a inven- ção, as definições e explicações dos termos relevantes são fornecidas como se segue.
[0060] De acordo com a invenção, o termo "um segundo tipo de HPV do tipo selvagem" refere-se a um tipo de HPV do tipo selvagem diferente do HPV18. Na invenção, um segundo tipo de HPV do tipo selvagem é de preferência HPV45 do tipo selvagem. De acordo com a invenção, o termo "um terceiro tipo de HPV do tipo selvagem" refere- se a um tipo de HPV do tipo selvagem diferente do HPV18 e do se- gundo tipo de HPV do tipo selvagem. Na invenção, um terceiro tipo de HPV do tipo selvagem é de preferência HPV59 do tipo selvagem.
[0061] De acordo com a invenção, a expressão "posições corres- pondentes" refere-se às posições equivalentes das sequências sendo comparadas quando as sequências estão alinhadas de forma ideal, isto é, as sequências são alinhadas para obter uma porcentagem mais elevada de identidade.
[0062] De acordo com a invenção, o termo "proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem" refere-se à proteína L1 do capsídeo principal de ocorrência natural no papilomavírus humano tipo 18 (HPV18). A se- quência da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem é bem conhecida na técnica e pode ser encontrada no banco de dados público (tal como o número de acesso ARS43428.1, ARS43407.1, ARS43401.1, AAP20601.1 e ABP99727.1 no banco de dados NCBI).
[0063] Na invenção, quando uma sequência de aminoácido da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem é mencionada, ela é descrita por referência à sequência conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1. Por exemplo, a expressão “resíduos de aminoácidos nas posições 235 a 243 de uma proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem” refere-se aos resíduos de aminoácido nas posições 235 a 243 do polipeptídeo con- forme estabelecido na SEQ ID NO: 1. No entanto, uma pessoa versa- da na técnica entende que o HPV18 do tipo selvagem pode incluir vá- rios isolados, e pode haver diferença na sequência de aminoácido da proteína L1 entre vários isolados. Além disso, uma pessoa versada na técnica entende que, embora possa haver diferença na sequência, as sequências de aminoácido da proteína L1 possuem uma identidade muito maior (geralmente maior do que 95%, por exemplo, maior do que 96%, maior do que 97%, maior do que 98% ou maior do que 99%) entre diferentes isolados de HPV18, e possuem substancialmente a mesma função biológica. Portanto, na invenção, o termo "proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem" inclui não apenas a proteína conforme apresentada na SEQ ID NO: 1, mas também a proteína L1 de vários isolados de HPV18 (tal como a proteína L1 do HPV18 conforme apre- sentada em ARS43428.1, ARS43407.1, ARS43401.1, AAP20601.1 e
ABP99727.1). Além do mais, quando um fragmento de sequência de uma proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem é descrito, ele inclui não apenas o fragmento de sequência da SEQ ID NO: 1, mas também o fragmento de sequência correspondente de uma proteína L1 de vários isolados de HPV18. Por exemplo, a expressão "resíduos de aminoáci- dos nas posições 235 a 243 de uma proteína L1 do HPV18 do tipo sel- vagem" inclui os resíduos de aminoácido nas posições 235 a 243 da SEQ ID NO: 1 e o fragmento correspondente de uma proteína L1 de vários isolados de HPV18.
[0064] De acordo com a invenção, o termo "proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem" refere-se à proteína L1 do capsídeo principal de ocorrência natural no papilomavírus humano tipo 45 (HPV45). A se- quência da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem é bem conhecida na técnica e pode ser encontrada no banco de dados público (tal como o número de Acesso P36741.1, ALV85689.1, ABP99815.1, AGU90600.1 e ALV85649.1 no banco de dados NCBI).
[0065] Na invenção, quando uma sequência de aminoácido da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem é mencionada, ela é descrita por referência à sequência conforme apresentado na SEQ ID NO: 2. Por exemplo, a expressão “resíduos de aminoácido nas posições 201 a 209 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem” refere-se aos resíduos de aminoácido nas posições 201 a 209 do polipeptídeo con- forme apresentado na SEQ ID NO: 2. No entanto, uma pessoa versa- da na técnica entende que o HPV45 do tipo selvagem pode incluir vá- rios isolados, e pode haver diferença na sequência de aminoácido da proteína L1 entre vários isolados. Além disso, uma pessoa versada na técnica entende que, embora possa haver diferença na sequência, as sequências de aminoácido da proteína L1 possuem uma identidade muito alta (geralmente maior do que 95%, por exemplo, maior do que 96%, maior do que 97%, maior do que 98% ou maior do que 99%) en-
tre diferentes isolados de HPV45 e possuem substancialmente a mesma função biológica. Portanto, na invenção, o termo "proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem" inclui não apenas a proteína conforme apresentado na SEQ ID NO: 2, mas também a proteína L1 de vários isolados de HPV45 (tal como a proteína L1 do HPV45 conforme apre- sentado em P36741.1, ALV85689.1, ABP99815.1, AGU90600.1 e ALV85649.1). Além disso, quando um fragmento de sequência de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem é descrito, ele inclui não ape- nas o fragmento de sequência da SEQ ID NO: 2, mas também o frag- mento de sequência correspondente de uma proteína L1 de vários iso- lados de HPV45. Por exemplo, a expressão "resíduos de aminoácido nas posições 201 a 209 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selva- gem" inclui os resíduos de aminoácido nas posições 201 a 209 da SEQ ID NO: 2 e o fragmento correspondente de uma proteína L1 de vários isolados de HPV45.
[0066] De acordo com a invenção, o termo "proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem" refere-se à proteína L1 do capsídeo principal de ocorrência natural no papilomavírus humano tipo 59 (HPV59). A se- quência da proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem é bem conhecida na técnica e pode ser encontrada no banco de dados público (tal como o número de acesso CAA54856.1, AGU90656.1, AEP23088.1, AEP23087.1 e AGU90672.1 no banco de dados NCBI).
[0067] Na invenção, quando uma sequência de aminoácido da proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem é mencionada, ela é descrita por referência à sequência conforme apresentado na SEQ ID NO: 3. Por exemplo, a expressão “resíduos de aminoácido nas posições 51 a 62 de uma proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem” refere-se aos re- síduos de aminoácido nas posições 51 a 62 do polipeptídeo conforme apresentado na SEQ ID NO: 3. No entanto, uma pessoa versada na técnica entende que o HPV59 do tipo selvagem pode incluir vários iso-
lados, e pode haver diferença na sequência de aminoácido da proteína L1 entre vários isolados. Além disso, uma pessoa versada na técnica entende que, embora possa haver diferença na sequência, as sequên- cias de aminoácido da proteína L1 possuem uma identidade muito alta (geralmente maior do que 95%, por exemplo, maior do que 96%, maior do que 97%, maior do que 98% ou maior do que 99%) entre diferentes isolados de HPV59 e possuem substancialmente a mesma função bio- lógica. Portanto, na invenção, o termo "proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem" inclui não apenas a proteína conforme apresentado na SEQ ID NO: 3, mas também a proteína L1 de vários isolados de HPV59 (tal como a proteína L1 do HPV59 conforme estabelecido em CAA54856.1, AGU90656.1, AEP23088.1, AEP23087.1 e AGU90672.1). Além disso, quando um fragmento de sequência de uma proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem é descrito, ele inclui não apenas o fragmento de sequência de SEQ ID NO: 3, mas também o fragmento de sequência correspondente da proteína L1 de vários iso- lados de HPV59. Por exemplo, a expressão "resíduos de aminoácido nas posições 51 a 62 de uma proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem" inclui os resíduos de aminoácidos nas posições 51 a 62 da SEQ ID NO: 3 e o fragmento correspondente da proteína L1 de vários isolados de HPV59.
[0068] De acordo com a invenção, a expressão "fragmentos de sequência correspondentes" ou "fragmentos correspondentes" refere- se aos fragmentos que estão localizados em posições equivalentes das sequências sendo comparadas quando as sequências são alinha- das de forma ideal, isto é, as sequências estão alinhadas para obter uma porcentagem mais elevada de identidade.
[0069] De acordo com a invenção, a expressão "truncamento N- terminal de X aminoácidos" ou "tendo X aminoácidos truncados no N- terminal" refere-se à substituição dos resíduos de aminoácido das po-
sições 1 a X no N-terminal de uma proteína com resíduo de metionina codificado por um códon iniciador (para iniciar a translação da proteí- na). Por exemplo, uma proteína L1 do HPV18 com 65 aminoácidos truncados no N-terminal refere-se a uma proteína resultante da substi- tuição dos resíduos de aminoácido das posições 1 a 65 no N-terminal da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduo de metionina codificado por um códon iniciador.
[0070] De acordo com a invenção, o termo "variante" refere-se a uma proteína, cuja sequência de aminoácidos possui substituição (de preferência substituição conservativa), adição ou supressão de um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9) aminoácidos, ou possui uma identidade de pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, em comparação com a proteína L1 do HPV18 com mutação de acordo com a invenção (por exemplo, a proteína conforme apresentado na SEQ ID NO: 6, 7, 9, 13, 17, 18 ou 19), e que retém uma função da pro- teína L1 do HPV18 com mutação de acordo com a invenção. Na in- venção, o termo "função da proteína L1 do HPV18 com mutação" refe- re-se a uma capacidade de induzir a geração de anticorpos neutrali- zantes contra pelo menos dois tipos de HPV (por exemplo, HPV18 e HPV45, ou HPV18, HPV45 e HPV59). O termo "identidade" refere-se a uma medida de similaridade entre as sequências de nucleotídeo ou sequências de aminoácido. Geralmente, as sequências eram alinha- das para obter uma correspondência máxima. "Identidade" possui sig- nificados bem conhecidos na técnica e pode ser calculada por algorit- mo publicado (tal como BLAST).
[0071] De acordo com a invenção, o termo "identidade" se refere ao grau de correspondência entre dois polipeptídeos ou entre dois áci- dos nucleicos. Quando duas sequências para comparação possuem a mesma subunidade de monômero de base ou aminoácido em um de- terminado local (por exemplo, cada uma das duas moléculas de DNA possui uma adenina em um certo local, ou cada um dos dois polipeptí- deos possui uma lisina em um certo local), as duas moléculas são idênticas no local. A identidade percentual entre duas sequências é uma função do número de locais idênticos compartilhados pelas duas sequências sobre o número total de locais para comparação × 100. Por exemplo, se 6 de 10 locais de duas sequências são correspondi- dos, essas duas sequências possuem um identidade de 60%. Por exemplo, as sequências de DNA: CTGACT e CAGGTT compartilham uma identidade de 50% (3 de 6 locais são correspondentes). Geral- mente, a comparação de duas sequências é conduzida de forma a produzir identidade máxima. Tal alinhamento pode ser conduzido, por exemplo, através do uso de um programa de computador tal como o programa Align (DNAstar, Inc.), que se baseia no método de Needle- man, et al. (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970). A identidade percentual entre duas sequências de aminoácido também pode ser determinada utilizando o algoritmo de E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que foi incorporado no programa ALIGN (ver- são 2.0), utilizando uma tabela de resíduos de peso PAM120, e com uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade para lacunas de 4. Além disso, a porcentagem de identidade entre du- as sequências de aminoácido pode ser determinada pelo algoritmo de Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), utilizando uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e com um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
[0072] Como aqui utilizado, o termo "substituição conservativa" refere-se a substituições de aminoácido que não afetariam ou alterari- am de forma desvantajosa as propriedades essenciais de uma proteí- na/polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido. Por exemplo, uma substituição conservativa pode ser introduzida por téc- nicas padrão conhecidas na especialidade, tais como mutagênese di- recionada ao sítio e mutagênese mediada por PCR. As substituições de aminoácido conservativas incluem substituições em que um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral semelhante, por exemplo, um resíduo física ou fun- cionalmente semelhante (tal como, tendo tamanho, forma, carga, pro- priedade química semelhantes, incluindo a capacidade de formar uma ligação covalente ou ligação de hidrogênio, etc.) ao resíduo de amino- ácido correspondente. As famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Estas famí- lias incluem aminoácidos tendo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina e histidina), aminoácidos tendo cadeias laterais acídi- cas (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico), aminoácidos tendo cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), aminoácidos tendo cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), aminoáci- dos tendo cadeias laterais β-ramificadas (tais como treonina, valina, isoleucina) e aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Portanto, geral- mente uma substituição conservativa refere-se a uma substituição de um resíduo de aminoácido correspondente por outro resíduo de ami- noácido da mesma família de cadeia lateral. Métodos para identificar substituições conservativas de aminoácido são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); e Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997), que são aqui incorporados por referência).
[0073] De acordo com a invenção, o termo “sistema de expressão de E. coli" refere-se a um sistema de expressão que consiste em E. coli (cepa) e um vetor, em que E. coli (cepa) é derivada das cepas co- mercialmente disponíveis, incluindo, mas limitadas a estas: ER2566, BL21 (DE3) , B834 (DE3) e BLR (DE3).
[0074] De acordo com a invenção, o termo "vetor" se refere a uma ferramenta de transporte de ácido nucleico que pode ter um polinucle- otídeo nela inserido. Quando o vetor leva em conta a expressão da proteína codificada pelo polinucleotídeo nele inserida, o vetor é deno- minado vetor de expressão. O vetor pode ter os elementos transporta- dos de material genético expressos em uma célula hospedeira através da transformação, transdução ou transfecção na célula hospedeira. Os vetores são bem conhecidos de uma pessoa versada na técnica, inclu- indo, mas não limitado a plasmídeos, fagos, cosmídeos, etc.
[0075] De acordo com a invenção, o termo "um veículo e/ou exci- piente farmaceuticamente aceitável" refere-se a um veículo e/ou exci- piente que é farmacológica e/ou fisiologicamente compatível com um indivíduo e ingredientes ativos, que é bem conhecido na técnica (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), incluindo, mas não limitado a estes: reguladores de pH, tensoa- tivos, adjuvantes e intensificadores de força iônica. Por exemplo, regu- ladores de pH incluem, mas não são limitados a estes, tampões de fosfato; tensoativos incluem, mas não são limitados a estes: tensoati- vos catiônicos, tensoativos aniônicos ou tensoativos não iônicos, por exemplo, Tween-80; adjuvantes incluem, mas não são limitados a es- tes, adjuvante de alumínio (por exemplo, hidróxido de alumínio) e ad- juvante de Freund (por exemplo, adjuvante completo de Freund); e os intensificadores de força iônica incluem, mas não são limitados a NaCl.
[0076] De acordo com a invenção, o termo "uma quantidade efi- caz" refere-se a uma quantidade que pode efetivamente atingir o pro-
pósito pretendido. Por exemplo, uma quantidade eficaz para prevenir uma doença (tal como infecção por HPV) refere-se a uma quantidade eficaz para prevenir, suprimir ou retardar a ocorrência de uma doença (tal como infecção por HPV). A determinação de uma tal quantidade eficaz está dentro da capacidade de uma pessoa versada na técnica.
[0077] De acordo com a invenção, o termo "cromatografia" inclui, mas não é limitado a: cromatografia de troca iônica (como cromatogra- fia de troca catiônica), cromatografia de interação hidrofóbica, croma- tografia absorvente (tal como cromatografia de hidroxiapatita), croma- tografia de filtração em gel (cromatografia de exclusão em gel ) e cro- matografia de afinidade.
[0078] De acordo com a invenção, o termo "sobrenadante de lisa- do" refere-se a uma solução produzida pelas seguintes etapas: células hospedeiras (tais como E. coli) são rompidas em um tampão de lise e as substâncias insolúveis são então removidas da solução submetida a lise contendo as células hospedeiras interrompidas. Vários tampões de lise são bem conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados a estes, tampões Tris, tampões de fosfato, tampões HEPES, tampões MOPS, etc. Além disso, a interrupção de uma célula hospedeira pode ser executada por métodos bem conhecidos por um pessoa versada na técnica, incluindo, mas não limitado a interrupção do homogeneiza- dor, tratamento ultrassônico, trituração, extrusão de alta pressão, tra- tamento com lisozima, etc. Métodos para remover substâncias insolú- veis também são bem conhecidos de uma pessoa versada na técnica, incluindo, mas não limitado a filtração e centrifugação. Efeitos Benéficos da Invenção
[0079] Estudos mostram que, embora haja certa proteção cruzada entre o HPV18 e outros tipos de HPV (tais como HPV45 e HPV59), essa proteção cruzada é muito baixa, geralmente menor do que um por cento, até um milésimo do nível de proteção de VLP do mesmo tipo de HPV. Portanto, um indivíduo vacinado com a vacina HPV18 ainda possui um alto risco de ser infectado por outros tipos de HPV (tais como HPV45 e HPV59).
[0080] A invenção fornece uma proteína L1 do HPV18 com muta- ção e uma partícula semelhante a vírus HPV formada pela mesma. A partícula semelhante a vírus HPV de acordo com a invenção pode for- necer proteção cruzada significativa contra o HPV18 e outros tipos de HPV (tais como HPV45 e HPV59). Especialmente, na mesma dose de imunização, a partícula semelhante ao vírus HPV de acordo com a in- venção pode induzir a geração de anticorpos neutralizantes de alto título contra pelo menos dois tipos de HPV (por exemplo, HPV18 e HPV45 ou HPV18, HPV45 e HPV59) em organismos, e seu efeito é comparável àquele de uma mistura de VLPs de vários tipos de HPV (por exemplo, uma mistura de VLP do HPV18 e VLP do HPV45, ou uma mistura de VLP do HPV18, VLP do HPV45 e VLP do HPV59). Portanto, a partícula semelhante ao vírus HPV de acordo com a inven- ção pode ser utilizada para prevenir a infecção por pelo menos dois tipos de HPV (por exemplo, HPV18 e HPV45 ou HPV18, HPV45 e HPV59) ao mesmo tempo, assim como as doenças associadas à in- fecção, e possui efeitos técnicos significativamente benéficos. Isso tem vantagens particularmente significativas em termos de extensão da faixa de proteção das vacinas contra o HPV e redução do custo de produção das vacinas contra o HPV.
[0081] As modalidades da invenção são ainda descritas com deta- lhes através da referência aos desenhos e exemplos. No entanto, uma pessoa versada na técnica iria entender que os seguintes desenhos e exemplos se destinam apenas a ilustrar a invenção, em vez de definir o escopo da invenção. De acordo com a descrição detalhada dos se- guintes desenhos e modalidades preferidas, vários objetivos e vanta- gens da invenção são evidentes para uma pessoa versada na técnica.
Descrição dos Desenhos
[0082] A FIG. 1 mostra o resultado SDS-PAGE das proteínas com mutação purificadas no Exemplo 1. Pista M: marcador de peso mole- cular da proteína; Pista 1: HPV18N65 (proteína L1 do HPV18 tendo 65 aminoácidos truncados no N-terminal); Pista 2: H18N65-45T1; Pista 3: H18N65-45T2; Pista 4: H18N65-45T3; Pista 5: H18N65-45T4; Pista 6: H18N65-45T5; Pista 7: HPV18N65; Pista 8: H18N65-45T3- 59S1; Pista 9: H18N65-45T3-59S2; Pista 10: H18N65-45T3-59S4; Pista 11: H18N65-45T3-59S5; Pista 12: H18N65-45T4-59S1; Pista 13: H18N65-45T4-59S2; Pista 14: H18N65-45T4-59S3; Pista 15: HPV18N65; Pista 16: H18N65-45T4-59S5; Pista 17: HPV18N65; Pista 18: H18N65-45T1-59S5; Pista 19: H18N65-45T2-59S5; Pista 20: H18N65-45T1T3-59S5. O resultado mostrou que após purificação cromatográfica, as proteínas H18N65-45T1, H18N65-45T2, H18N65- 45T3, H18N65-45T4, H18N65-45T5, H18N65-45T3-59S1, H18N65- 45T3-59S2, H18N65-45T3-59S4, H18N65-45T3-59S5, H18N65- 45T4-59S1, H18N65-45T4-59S2, H18N65-45T4-59S3, H18N65- 45T4-59S5, H18N65-45T1-59S5, H18N65-45T2-59S5 e H18N65- 45T1T3-59S5 alcançaram uma pureza acima de 85%.
[0083] A FIG. 2 mostra o resultado de Western Blot de H18N65- 45T1, H18N65-45T2, H18N65-45T3, H18N65-45T4, H18N65-45T5, H18N65-45T3-59S1, H18N65-45T3-59S2, H18N65-45T3-59S4, H18N65-45T3-59S5, H18N65-45T4-59S1, H18N65-45T4-59S2, H18N65-45T4-59S3, H18N65-45T4-59S5, H18N65-45T1-59S5, H18N65-45T2-59S5 e H18N65-45T1T3-59S5 preparadas no Exemplo 1, conforme determinado mediante o uso de um anticorpo de amplo espectro 4B3. Pista M: marcador de peso molecular de proteína; Pista 1: HPV18N65; Pista 2: H18N65-45T1; Pista 3: H18N65-45T2; Pista 4: H18N65-45T3; Pista 5: H18N65-45T4; Pista 6: H18N65-45T5; Pista 7: HPV18N65; Pista 8: H18N65-45T3-59S1; Pista 9: H18N65-45T3-59S2;
Pista 10: H18N65-45T3-59S4; Pista 11: H18N65-45T3-59S5; Pista 12: H18N65-45T4-59S1; Pista 13: H18N65-45T4-59S2; Pista 14: H18N65- 45T4-59S3; Pista 15: HPV18N65; Pista 16: H18N65-45T4-59S5; Pista 17: HPV18N65; Pista 18: H18N65-45T1-59S5; Pista 19: H18N65- 45T2-59S5; Pista 20: H18N65-45T1T3-59S5. O resultado mostrou que as proteínas com mutação H18N65-45T1, H18N65-45T2, H18N65- 45T3, H18N65-45T4, H18N65-45T5, H18N65-45T3-59S1, H18N65- 45T3-59S2, H18N65-45T3-59S4, H18N65-45T3-59S5, H18N65-45T4- 59S1, H18N65-45T4-59S2, H18N65-45T4-59S3, H18N65-45T4-59S5, H18N65-45T1-59S5, H18N65-45T2-59S5 e H18N65-45T1T3-59S5 podem ser especificamente reconhecido pelo anticorpo de amplo es- pectro 4B3.
[0084] As FIGs. 3A a 3S mostram os resultados das amostras que compreendem as proteínas HPV18N65 (FIG.3A), HPV45N27 (FIG. 3B), HPV59 L1 (FIG. 3C), H18N65-45T1 (FIG. 3D), H18N65-45T2 (FIG. 3E), H18N65-45T3 (FIG. 3F), H18N65-45T4 (FIG. 3G), H18N65- 45T5 (FIG. 3H), H18N65-45T3-59S1 (FIG. 3I), H18N65-45T3-59S2 (FIG. 3J), H18N65-45T3-59S4 (FIG. 3K), H18N65-45T3-59S5 (FIG. 3L), H18N65-45T4-59S1 (FIG. 3M), H18N65-45T4-59S2 (FIG. 3N), H18N65-45T4-59S3 (FIG. 3O), H18N65-45T4-59S5 (FIG. 3P), H18N65-45T1-59S5 (FIG. 3Q), H18N65-45T2-59S5 (FIG. 3R) e H18N65-45T1T3-59S5 (FIG. 3S), conforme analisadas pela cromato- grafia de peneira molecular. Os resultados mostraram que o primeiro pico de proteína das amostras compreendendo a proteína H18N65- 45T1, H18N65-45T2, H18N65-45T3, H18N65-45T4, H18N65-45T5, H18N65-45T3-59S1, H18N65-45T3-59S2, H18N65-45T3-59S4, H18N65-45T3-59S5, H18N65-45T4-59S1, H18N65-45T4-59S2, H18N65-45T4-59S3, H18N65-45T4-59S5, H18N65-45T1-59S5, H18N65-45T2-59S5 ou H18N65-45T1T3-59S5 apareceu em cerca de 13 min, o que foi comparável com aquele da VLP organizada pela pro-
teína L1 do HPV18N65 (VLP do HPV18N65), VLP organizada pela proteína do HPV45N27 (VLP do HPV45N27) e VLP organizada pela proteína L1 do HPV59 (VLP do HPV59). Isso mostrou que todas essas proteínas foram capazes de se organizar em VLPs.
[0085] As FIGs. 4A a 4S mostram as fotografias de microscopia eletrônica de transmissão (TEM) (tiradas com ampliação de 100.000 ×, Bar = 0,1 µm) de várias amostras de VLP. FIG. 4A, VLP organizada pelo HPV18N65; FIG. 4B, VLP organizada pelo HPV45N27; FIG. 4C, VLP organizada pelo HPV59 L1; FIG. 4D, VLP organizada pelo H18N65-45T1; FIG. 4E, VLP organizada pelo H18N65-45T2; FIG. 4F, VLP organizada pelo H18N65-45T3; FIG. 4G, VLP organizada pelo H18N65-45T4; FIG. 4H, VLP organizada pelo H18N65-45T5; FIG. 4I, VLP organizada pelo H18N65-45T3-59S1; FIG. 4J, VLP organizada pelo H18N65-45T3-59S2; FIG. 4K, VLP organizada pelo H18N65-45T3-59S4; FIG. 4L, VLP organizada pelo H18N65-45T3- 59S5; FIG. 4M, VLP organizada pelo H18N65-45T4-59S1; FIG. 4N, VLP organizada pelo H18N65-45T4-59S2; FIG. 4O, VLP organiza- da pelo H18N65-45T4-59S3; FIG. 4P, VLP organizada pelo H18N65-45T4-59S5; FIG. 4Q, VLP organizada pelo H18N65-45T1- 59S5; FIG. 4R, VLP organizada pelo H18N65-45T2-59S5; FIG. 4S, VLP organizada pelo H18N65-45T1T3-59S5. Os resultados mostra- ram que H18N65-45T1, H18N65-45T2, H18N65-45T3, H18N65- 45T4, H18N65-45T5, H18N65-45T3-59S1, H18N65-45T3-59S2, H18N65-45T3-59S4, H18N65-45T3-59S5, H18N65-45T4-59S1, H18N65-45T4-59S2, H18N65-45T4-59S3, H18N65-45T4-59S5, H18N65-45T1-59S5, H18N65-45T2-59S5 e H18N65-45T1T3-59S5 eram semelhantes à L1 do HPV18N65, HPV45N27 e HPV59, e foram capazes de se organizar em VLPs com um raio de cerca de 30 nm.
[0086] As FIGs. 5A a 5H mostram os resultados da análise de ve- locidade de sedimentação da VLP do HPV18N65, VLP do HPV45N27,
VLP do HPV59, VLP da H18N65-45T3, VLP da H18N65-45T4, VLP da H18N65-45T3-59S1, VLP da H18N65-45T4-59S1 e VLP da H18N65- 45T1T3-59S5. A FIG. 5A, VLP do HPV18N65; a FIG. 5B, VLP do HPV45N27; a FIG. 5C, VLP do HPV59; a FIG. 5D, VLP da H18N65- 45T3; a FIG. 5E, VLP da H18N65-45T4; a FIG. 5F, VLP da H18N65- 45T3-59S1; a FIG. 5G, VLP da H18N65-45T4-59S1; FIG. 5H, VLP da H18N65-45T1T3-59S5 VLP. Os resultados mostraram que os coefici- entes de sedimentação da VLP da H18N65-45T3, VLP da H18N65- 45T4 e VLP da H18N65-45T1T3-59S5 foram 143,7S, 173,3S e 167,1S, respectivamente, que eram semelhantes aos das VLP do HPV18N65, VLP do HPV45N27 e VLP do HPV59 (VLP do HPV18N65, 142,2S; VLP do HPV45N27, 146,5S e VLP do HPV59 VLP, 139,3S). Isso mostrou que as H18N65-45T3, H18N65-45T4 e H18N65-45T1T3- 59S5 foram capazes de se organizar em partículas semelhantes a ví- rus que eram semelhantes à VLP do tipo selvagem em termos de ta- manho e morfologia.
[0087] As FIGs. 6A a 6H mostram os resultados de detecção da termoestabilidade das VLP do HPV18N65, VLP do HPV45N27, VLP do HPV59, VLP da H18N65-45T3, VLP da H18N65-45T4, VLP da H18N65-45T3-59S1, VLP da H18N65-45T4-59S1 e VLP da H18N65- 45T1T3-59S5. A FIG. 6A, VLP do HPV18N65; a FIG. 6B, VLP do HPV45N27; a FIG. 6C, VLP do HPV59; a FIG. 6D, VLP da H18N65- 45T3 VLP; a FIG. 6E, VLP da H18N65-45T4; a FIG. 6F, VLP da H18N65-45T3-59S1; a FIG. 6G, VLP da H18N65-45T4-59S1; a FIG. 6H, VLP da H18N65-45T1T3-59S5. Os resultados mostraram que to- das as VLPs formadas por essas proteínas apresentaram termoestabi- lidade muito elevada.
[0088] A FIG. 7A mostra o resultado da avaliação da proteção imunológica de VLP da H18N65-45T1, VLP da H18N65-45T2, VLP da H18N65-45T3, VLP da H18N65-45T4 e VLP da H18N65-45T5 em camundongos dos grupos experimentais, e de VLP do HPV18N65, VLP do HPV45N27, e a VLP HPV18/HPV45 misturados em camun- dongos dos grupos de controle.
O resultado mostrou que a VLP da H18N65-45T1, a VLP da H18N65-45T2, a VLP da 18N65-45T3 e a VLP da H18N65-45T4, cada uma reteve a atividade que poderia indu- zir a geração de anticorpos neutralizantes de alto título contra o HPV18 em camundongos, e seus efeitos protetores contra o HPV18 eram comparáveis com àqueles da VLP de HPV18N65 isoladamente e àqueles do VLP do HPV18/HPV45 misturados, e suas atividades que poderiam induzir a geração de anticorpos neutralizantes contra HPV45 em camundongos foram maiores do que aquelas de VLP do HPV18N65 isoladamente.
Em particular, a VLP do H18N65-45T3 e a VLP da H18N65-45T4 cada uma poderia induzir a geração de anticor- pos neutralizantes de alto título contra o HPV45 e o HPV18 em ca- mundongos; e os seus efeitos protetores contra o HPV18 foram com- paráveis com aqueles da VLP do HPV18N65 isoladamente e da VLP do HPV18/HPV45 misturados, e foram significativamente maiores do que aqueles da VLP do HPV45N27 isoladamente; e seus efeitos prote- tores contra o HPV45 foram comparáveis com aqueles da VLP do HPV45N27 isoladamente e com aqueles da VLP do HPV18/HPV45 misturados, e foram significativamente maiores do que aqueles da VLP do HPV18N65 isoladamente.
Isso mostrou que após a mutação, a VLP da H18N65-45T1, a VLP da H18N65-45T2, a VLP da H18N65-45T3 e a VLP da H18N65-45T4 mantiveram sua imunogenicidade contra o HPV18, e sua imunogenicidade contra o HPV45 também melhorou em comparação com a VLP do HPV18N65 VLP.
Especialmente, a VLP da H18N65-45T3 e a VLP da H18N65-45T4 tinham boa imunogenicidade cruzada e proteção cruzada contra o HPV18 e o HPV45, e poderiam ser utilizadas como vacinas eficazes para a prevenção da infecção por HPV18 e/ou infecção por HPV45, e poderiam ser utilizadas no lugar de uma vacina misturada compreendendo a VLP do HPV18 e a VLP do HPV45.
[0089] A FIG. 7B mostra o resultado da avaliação da proteção imunológica de VLP da H18N65-45T3-59S1, VLP da H18N65-45T3- 59S2, VLP da H18N65-45T3-59S4, VLP da H18N65-45T3-59S5, VLP da H18N65-45T4-59S1, VLP da H18N65-45T4-59S2, VLP da H18N65- 45T4-59S3 e VLP da H18N65-45T4-59S5 em camundongos dos gru- pos Experimentais e de VLP do HPV18N65, VLP do HPV45N27, VLP do HPV59 e VLP do HPV18/HPV45/HPV59 misturados em camun- dongos dos grupos de controle. O resultado mostrou que a VLP da H18N65-45T3-59S1 e a VLP da H18N65-45T4-59S1 cada uma pode- ria induzir a geração de anticorpos neutralizantes de alto título contra HPV18, HPV45 e HPV59 em camundongos; e seus efeitos protetores contra HPV18 foram comparáveis com aqueles da VLP do HPV18N65 isoladamente e com aqueles da VLP do HPV18/HPV45/HPV59 mistu- rados, e foram significativamente maiores do que aqueles da VLP do HPV45N27 isoladamente e aqueles da VLP do HPV59 isoladamente; e seus efeitos protetores contra HPV45 foram comparáveis com aqueles da VLP do HPV45N27 isoladamente e aqueles da VLP do HPV18/HPV45/HPV59 misturados, e foram significativamente maiores do que aqueles de VLP do HPV18N65 isoladamente e aqueles de VLP do HPV59 isoladamente; e seus efeitos protetores contra o HPV59 fo- ram comparáveis com aqueles da VLP do HPV59 isoladamente e aqueles da VLP do HPV18/HPV45/HPV59 misturados, e foram signifi- cativamente maiores do que aqueles da VLP do HPV45N27 isolada- mente e da VLP do HPV18N65 isoladamente. Isso mostrou que a VLP da H18N65-45T3-59S1 e a VLP da H18N65-45T4-59S1 tinham boa imunogenicidade cruzada e proteção cruzada contra HPV18, HPV45 e HPV59, e poderiam ser utilizadas como vacinas eficazes para a pre- venção da infecção por HPV18, infecção por HPV45 e/ou infecção por
HPV59, e podem ser utilizadas no lugar de uma vacina misturada compreendendo VLP do HPV18, VLP do HPV45 e VLP do HPV59.
[0090] As FIGs. 8A-8B mostram o resultado do título de anticorpos neutralizantes no soro de camundongo após a vacinação do camun- dongos com VLP da H18N65-45T4. FIG. 8A: Grupo da dose de 10 μg (em uma dose de imunização de 10 μg, utilizando adjuvante de alumí- nio); FIG. 8B: Grupo de dose de 1 μg (em uma dose de imunização de 1 μg, utilizando adjuvante de alumínio). O resultado mostrou que a VLP da H18N65-45T4 poderia induzir a geração de anticorpos neutra- lizantes de alto título contra o HPV18 em camundongos, e seu efeito protetor era comparável com aquele da VLP do HPV18N65 isolada- mente e da VLP do HPV18/HPV45 misturados na mesma dose, e foi significativamente superior àquele da VLP do HPV45N27 isoladamente na mesma dose; e poderia induzir a geração de anticorpos neutralizan- tes de alto título contra o HPV45 em camundongos, e seu efeito prote- tor era comparável com aquele da VLP do HPV45N27 isoladamente e da VLP do HPV18/HPV45 misturados na mesma dose, e era significa- tivamente superior àquele da VLP do HPV18N65 isoladamente na mesma dose. Isso mostrou que a VLP da H18N65-45T4 tinha boa imunogenicidade cruzada e proteção cruzada contra HPV18 e HPV45.
[0091] As FIGs. 8C-8D mostram o resultado do título de anticorpo neutralizante no soro de camundongo após a vacinação de camun- dongos com VLP da H18N65-45T3-59S1, VLP da H18N65-45T4- 59S1, VLP da H18N65-45T1-59S5, VLP da H18N65-45T2-59S5 ou VLP da H18N65-45T1T3-59S5. FIG. 8C: Grupo da dose de 10 μg (em uma dose de imunização de 10 μg, utilizando adjuvante de alumí- nio); FIG. 8D: Grupo de dose de 1 μg (em uma dose de imunização de 1 μg, utilizando adjuvante de alumínio). O resultado mostrou que a VLP da H18N65-45T3-59S1, a VLP da H18N65-45T4-59S1, a VLP da H18N65-45T1-59S5, a VLP da H18N65-45T2-59S5 e a VLP da
H18N65-45T1T3-59S5 VLP poderiam induzir a geração de anticorpos neutralizantes de alto título contra o HPV18 em camundongos, e seus efeitos protetores foram comparáveis com aqueles da VLP do HPV18N65 isoladamente e da VLP do HPV18/HPV45/HPV59 mistura- dos na mesma dose, e foram significativamente superiores àqueles da VLP do HPV45N27 isoladamente ou da VLP do HPV59 isoladamente na mesma dose; e as VLP da H18N65-45T3-59S1, VLP da H18N65- 45T4-59S1, VLP da H18N65-45T1-59S5, VLP da H18N65-45T2- 59S5 e VLP da H18N65-45T1T3-59S5 poderiam induzir a geração de anticorpos neutralizantes de alto título contra o HPV45 em camun- dongos, e seus efeitos protetores foram comparáveis com aqueles da VLP do HPV45N27 isoladamente e aqueles da VLP do HPV18/HPV45/HPV59 misturados na mesma dose, e foram significati- vamente superiores àqueles da VLP do HPV18N65 isoladamente ou da VLP do HPV59 isoladamente na mesma dose; e as VLP da H18N65-45T3-59S1, VLP da H18N65-45T4-59S1, VLP da H18N65- 45T1-59S5, VLP da H18N65-45T2-59S5 e VLP da H18N65- 45T1T3-59S5 poderiam induzir a geração de anticorpos neutralizantes de alto título contra o HPV59 em camundongos, e seus efeitos proteto- res foram comparáveis com aqueles da VLP do HPV59 isoladamente ou da VLP do HPV18/HPV45/HPV59 misturados na mesma dose e foram significativamente superiores àqueles da VLP do HPV18N65 isoladamente ou da VLP HPV45N27 isoladamente na mesma dose. Isso mostrou que as VLP da H18N65-45T3-59S1, VLP da H18N65- 45T4-59S1, VLP da H18N65-45T1-59S5, VLP da H18N65-45T2- 59S5 e VLP da H18N65-45T1T3-59S5 tinham boa imunogenicidade cruzada e boa proteção cruzada contra o HP18, o HPV45 e o HPV59. Informação de Sequências
[0092] Algumas das sequências envolvidas na invenção são for- necidas na seguinte Tabela 1.
Tabela 1: Descrição das sequências
SEQ ID Descrição NO: 1 proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem 2 proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem 3 proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem a proteína L1 do HPV18 com mutação que compreende 4 Segmento 1 da proteína L1 do HPV45, H18N65-45T1 a proteína L1 do HPV18 com mutação que compreende 5 Segmento 2 da proteína L1 do HPV45, H18N65-45T2 a proteína L1 do HPV18 com mutação que compreende 6 Segmento 3 da proteína L1 do HPV45, H18N65-45T3 a proteína L1 do HPV18 com mutação que compreende 7 Segmento 4 da proteína L1 do HPV45, H18N65-45T4 a proteína L1 do HPV18 com mutação que compreende 8 Segmento 5 da proteína L1 do HPV45, H18N65-45T5 a proteína L1 do HPV18 com mutação que compreende 9 Segmento 3 da proteína L1 do HPV45 e Segmento 1 da proteína L1 do HPV59, H18N65-45T3-59S1 a proteína L1 do HPV18 com mutação que compreende 10 Segmento 3 da proteína L1 do HPV45 e Segmento 2 da proteína L1 do HPV59, H18N65-45T3-59S2 a proteína L1 do HPV18 com mutação que compreende 11 Segmento 3 da proteína L1 do HPV45 e Segmento 4 da proteína L1 do HPV59, H18N65-45T3-59S4 a proteína L1 do HPV18 com mutação que compreende 12 Segmento 3 da proteína L1 do HPV45 e Segmento 5 da proteína L1 do HPV59, H18N65-45T3-59S5 13 a proteína L1 do HPV18 com mutação que compreende
Segmento 4 da proteína L1 do HPV45 e Segmento 1 da proteína L1 do HPV59, H18N65-45T4-59S1 a proteína L1 do HPV18 com mutação que compreende 14 Segmento 4 da proteína L1 do HPV45 e Segmento 2 da proteína L1 do HPV59, H18N65-45T4-59S2 a proteína L1 do HPV18 com mutação que compreende 15 Segmento 4 da proteína L1 do HPV45 e Segmento 3 da proteína L1 do HPV59, H18N65-45T4-59S3 a proteína L1 do HPV18 com mutação que compreende 16 Segmento 4 da proteína L1 do HPV45 e Segmento 5 da proteína L1 do HPV59, H18N65-45T4-59S5 a proteína L1 do HPV18 com mutação que compreende 17 Segmento 1 da proteína L1 do HPV45 e Segmento 5 da proteína L1 do HPV59, H18N65-45T1-59S5 a proteína L1 do HPV18 com mutação que compreende 18 Segmento 2 da proteína L1 do HPV45 e Segmento 5 da proteína L1 do HPV59, H18N65-45T2-59S5 a proteína L1 do HPV18 com mutação que compreende Segmento 1 e Segmento 3 da proteína L1 do HPV45 e 19 Segmento 5 da proteína L1 do HPV59, H18N65-45T1T3- 59S5 20 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 1 21 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 2 22 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 3 23 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 4 24 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 5 25 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 6 26 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 7 27 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 8 28 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 9
29 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 10 30 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 11 31 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 12 32 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 13 33 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 14 34 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 15 35 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 16 36 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 17 37 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 18 38 a sequência de DNA que codifica SEQ ID NO: 19 a sequência dos resíduos de aminoácido nas posições 79 39 a 89 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, Segmen- to 1 da proteína L1 do HPV45 a sequência dos resíduos de aminoácido nas posições 142 40 a 168 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, Seg- mento 2 da proteína L1 do HPV45 a sequência dos resíduos de aminoácido nas posições 201 41 a 209 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, Seg- mento 3 da proteína L1 do HPV45 a sequência dos resíduos de aminoácido nas posições 293 42 a 314 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, Seg- mento 4 da proteína L1 do HPV45 a sequência dos resíduos de aminoácido nas posições 51 43 a 62 da proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem, Segmen- to 1 da proteína L1 do HPV59 a sequência dos resíduos de aminoácido nas posições 349 44 a 360 da proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem, Seg- mento 5 da proteína L1 do HPV59 a sequência dos resíduos de aminoácido nas posições 379 109 a 387 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, Seg-
mento 5 da proteína L1 do HPV45 a sequência dos resíduos de aminoácido nas posições 122 110 a 143 da proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem, Seg- mento 2 da proteína L1 do HPV59 a sequência dos resíduos de aminoácido nas posições 264 111 a 290 da proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem, Seg- mento 4 da proteína L1 do HPV59 a sequência dos resíduos de aminoácido nas posições 170 112 a 181 da proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem, Seg- mento 3 da proteína L1 do HPV59 a proteína L1 do HPV18 tendo 65 aminoácidos truncados 113 no N-terminal, HPV18N65 114 a sequência de DNA que codifica a SEQ ID NO: 113 o proteína L1 do HPV45 tendo 27 aminoácidos truncados 115 no N-terminal, HPV45N27 116 a sequência de DNA que codifica a SEQ ID NO: 115 Sequência 1 (SEQ ID NO: 1): MCLYTRVLILHYHLLPLYGPLYHPQPLPLHSILVYMVHIIICGHYIILFL- RNVNVFPIFLQMALWRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSI- FYHAGSSRLLTVGNPYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLP- DPNKFGLPDTSIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPL- GVGLSGHPFYNKLDDTESSHAATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCIL- GCAPAIGEHWAKGTACKSRPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMV- DTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSM- FFCLRREQLFARHFWNRAGTMGDTVPQSLYIKGTGMRAS- PGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGVCWHN- QLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPVPGQYDATKFKQYSRHVE- EYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILEDWNFGVPPPPTTSLV- DTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYDKLKFWNVDLKEKFSLDLD-
QYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSATTASKPAKRVRVRARK
Sequência 2(SEQ ID NO: 2): MAHNIIYGHGIIIFLKNVNVFPIFLQMALWRPSDSTVYLPPPSVAR- VVSTDDYVSRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVVPNGAGNKQAV- PKVSAYQYRVFRVALPDPNKFGLPDSTIYNPETQRLVWACVGMEI- GRGQPLGIGLSGHPFYNKLDDTESAHAATAVITQDVRDNVSV- DYKQTQLCILGCVPAIGEHWAKGTLCKPAQLQPGDCPPLELKNTIIE- DGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSAD- PYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGVMGDTVPTDLYIKGTSANM- RETPGSCVYSPSPSGSIITSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHN- QLFVTVVDTTRSTNLTLCASTQNPVPSTYDPTKFKQYSRHVE- EYDLQFIFQLCTITLTAEVMSYIHSMNSSILENWNFGVPPPPTTSLV- DTYRFVQSVAVTCQKDTTPPEKQDPYDKLKFWTVDLKEKFSSDLD- QYPLGRKFLVQAGLRRRPTIGPRKRPAASTSTASTASR-
PAKRVRIRSKK Sequência 3(SEQ ID NO: 3): MALWRSSDNKVYLPPPSVAKVVSTDEYVTRTSIFYHAGSSR- LLTVGHPYFKVPKGGNGRQDVPKVSAYQYRVFRVKLPDPNKFGLP- DNTVYDPNSQRLVWACVGVEIGRGQPLGVGLSGHPLYN- KLDDTENSHVASAVDTKDTRDNVSVDYKQTQLCIIGCVPAIGEHWT- KGTACKPTTVVQGDCPPLELINTPIEDGDMVDTGYGAMDF- KLLQDNKSEVPLDICQSICKYPDYLQMSADAYGDSMFFCLRRE- QVFARHFWNRSGTMGDQLPESLYIKGTDIRANPGSYLYS- PSPSGSVVTSDSQLFNKPYWLHKAQGLNNGICWHNQLFLTVVDT- TRSTNLSVCASTTSSIPNVYTPTSFKEYARHVE- EFDLQFIFQLCKITLTTEVMSYIHNMNTTILEDWNFGVTPPPTASLV- DTYRFVQSAAVTCQKDTAPPVKQDPYDKLKFWPVDLKERFSADLD-
QFPLGRKFLLQLGARPKPTIGPRKRAAPAPTSTPSPKRVKRRKSSRK Sequência 4(SEQ ID NO: 4): MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGN- PYFRVVPNGAGNKQAVPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDT-
SIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHA- ATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKS- RPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPL- DICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTM- GDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNK- PYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPV- PGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSI- LEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYD- KLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAP-
SATTASKPAKRVRVRARK Sequência 5(SEQ ID NO: 5): MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGN- PYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYN- PETQRLVWACAGVEIGRGQPLGIGLSGHPFYNKLDDTESAHAATA- VITQDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKS- RPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPL- DICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTM- GDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNK- PYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPV- PGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSI- LEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYD- KLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAP-
SATTASKPAKRVRVRARK Sequência 6(SEQ ID NO: 6): MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGN- PYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYN- PETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAAT- SNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTLCK- PAQLQPGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEV- PLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAG-
TMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNK- PYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPV- PGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSI- LEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYD- KLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAP-
SATTASKPAKRVRVRARK Sequência 7(SEQ ID NO: 7): MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGN- PYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYN- PETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAAT- SNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKS- RPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPL- DICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGVM- GDTVPTDLYIKGTSANMRETPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNK- PYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPV- PGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSI- LEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYD- KLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAP-
SATTASKPAKRVRVRARK Sequência 8(SEQ ID NO: 8): MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGN- PYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYN- PETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAAT- SNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKS- RPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPL- DICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTM- GDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNK- PYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQNPV- PSTYDPTKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSI- LEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYD-
KLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAP-
SATTASKPAKRVRVRARK Sequência 9 (SEQ ID NO: 9): MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGN- PYFKVPKGGNGRQDVPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYN- PETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAAT- SNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTLCK- PAQLQPGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEV- PLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAG- TMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNK- PYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPV- PGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSI- LEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYD- KLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAP-
SATTASKPAKRVRVRARK Sequência 10 (SEQ ID NO: 10): MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGN- PYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYN- PETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPLYNKLDDTENSHVA- SAVDTKDTRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTLCK- PAQLQPGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEV- PLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAG- TMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNK- PYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPV- PGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSI- LEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYD- KLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAP-
SATTASKPAKRVRVRARK Sequência 11 (SEQ ID NO: 11): MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGN-
PYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYN- PETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAAT- SNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTLCK- PAQLQPGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEV- PLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRSG- TMGDQLPESLYIKGTDIRANPGSYLYSPSPSGSIVTSDSQLFNK- PYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPV- PGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSI- LEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYD- KLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAP-
SATTASKPAKRVRVRARK Sequência 12 (SEQ ID NO: 12): MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGN- PYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYN- PETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAAT- SNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTLCK- PAQLQPGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEV- PLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAG- TMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNK- PYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTTSSIPN- VYTPTSFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILE- DWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYDKLK- FWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSAT-
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TASKPAKRVRVRARK Sequência 19 (SEQ ID NO: 19): MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGN- PYFRVVPNGAGNKQAVPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDT- SIYNPETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHA- ATSNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTLCK- PAQLQPGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEV- PLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAG- TMGDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNK- PYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTTSSIPN- VYTPTSFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSILE- DWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYDKLK- FWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAPSAT-
TASKPAKRVRVRARK Sequência 20 (SEQ ID NO: 20): ATGTGCCTGTATACACGGGTCCTGATATTACATTACCATCTAC- TACCTCTGTATGGCCCATTGTATCACCCACAGCCCCTGCCTCTA- CACAGTATATTGGTATACATGGTACACATTATTATTTGTGGCCAT- TATATTATTTTATTCCTAAGAAACGTAAACGTGTTCCCTA-
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CCAGGAAGTAA Sequência 24 (SEQ ID NO: 24): ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTG- TGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAG- CATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAA- TCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATA- TTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGT- TACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAA- TCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAGA- TCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCATCGGCCTGAGCGGCCAC- CCCTTCTACAACAAGCTGGACGACACCGAGAGCGCCCACGCCG- CCACCGCCGTGATCACCCAGGACGTGAGGGACAACGTGAGCG- TGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCCTGGGCTGCG- CCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAA- TCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACT- TAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATA- TGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGG- TACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATTATT- TACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCT- TACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTGGAATAGAGCA- GGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGG- CACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATT- CTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTG- TTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAA- TGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATAC- CACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAG- TCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTA- TAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAG- TTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATA- GTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTT-
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CCAGGAAGTAA Sequência 25 (SEQ ID NO: 25): ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTG- TGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAG- CATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAA- TCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATA- TTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGT- TACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAA- TCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAA- TTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGG- CATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATG- CCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTG- TCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTG- CCCCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCCTGTG- CAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGA- GCTGAAGAACACCGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTG- GATATGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATG- TGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGAT- TATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATG- TTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTG- GAATAGAGCAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTA- TATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTG- TGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGAC-
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CCAGGAAGTAA Sequência 26 (SEQ ID NO: 26): ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTG- TGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAG- CATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAA- TCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATA- TTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGT- TACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAA- TCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAA- TTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGG- CATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATG- CCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTG- TCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTG- CCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAA- TCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACT- TAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATA-
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CGTGTACGTGCCAGGAAGTAA Sequência 27 (SEQ ID NO: 27): ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTG- TGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAG- CATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAA- TCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATA- TTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGT- TACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAA- TCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAA-
TTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGG- CATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATG- CCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTG- TCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTG- CCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAA- TCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACT- TAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATA- TGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGG- TACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATTATT- TACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCT- TACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTGGAATAGAGCA- GGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGG- CACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATT- CTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTG- TTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAA- TGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATAC- CACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGCGCCAGCACCCAGAAC- CCCGTGCCCAGCACCTACGACCCCACCAAGTTCAAGCAGTACA- GCAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCATCTTCCAG- CTGTGCACCATCACCCTGACCGCCGATGTTATGTCCTATATTCA- TAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTT- CCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTA- CAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGG- CTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTG- GATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATA- TCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCG- CAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTG- CCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTG-
CCAGGAAGTAA Sequência 28 (SEQ ID NO: 28):
ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTG- TGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAG- CATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAA- TCCATATTTCAAGGTGCCCAAGGGCGGCAACGGCAGGCAGGA- CGTGCCCAAGGTGAGCGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTG- CAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATT- TATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAG- TGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGG- CATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATG- CCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTG- TCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTG- CCCCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCCTGTG- CAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGA- GCTGAAGAACACCGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTG- GATATGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATG- TGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGAT- TATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATG- TTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTG- GAATAGAGCAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTA- TATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTG- TGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGAC- TCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGT- CATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTG- TGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTA- CACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAG- CAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTT- CAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATT- CATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTT- CCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTA- CAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGG- CTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTG- GATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATA- TCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCG- CAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTG- CCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTG-
CCAGGAAGTAA Sequência 29 (SEQ ID NO: 29): ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTG- TGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAG- CATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAA- TCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATA- TTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGT- TACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAA- TCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGCGTGGAGA- TCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCAC- CCCCTGTACAACAAGCTGGACGACACCGAGAACAGCCACGTGG- CCAGCGCCGTGGACACCAAGGACACCAGGGACAACGTGAGCG- TGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCTTGGGCTGTG- CCCCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCCTGTG- CAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGA- GCTGAAGAACACCGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTG- GATATGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATG- TGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGAT- TATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATG- TTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTG- GAATAGAGCAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTA- TATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTG- TGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGAC- TCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGT- CATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTG-
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CCAGGAAGTAA Sequência 30 (SEQ ID NO: 30): ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTG- TGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAG- CATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAA- TCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATA- TTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGT- TACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAA- TCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAA- TTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGG- CATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATG- CCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTG- TCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTG- CCCCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCCTGTG- CAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGA- GCTGAAGAACACCGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTG- GATATGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATG- TGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGAT-
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CCAGGAAGTAA Sequência 31 (SEQ ID NO: 31): ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTG- TGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAG- CATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAA- TCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATA- TTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGT- TACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAA- TCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAA- TTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGG- CATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATG-
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CCAGGAAGTAA Sequência 32 (SEQ ID NO: 32): ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTG- TGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAG-
CATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAA- TCCCTACTTCAAGGTGCCCAAGGGCGGCAACGGCAGGCAGGA- CGTGCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTATTTAGGGTG- CAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATT- TATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAG- TGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGG- CATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATG- CCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTG- TCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTG- CCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAA- TCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACT- TAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATA- CGGCGCCATGGACTTCAGCACCCTGCAGGACACCAAGTG- CGAGGTGCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTAC- CCCGACTACCTGCAGATGAGCGCCGACCCCTACGGCGACAG- CATGTTCTTCTGCCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCAC- TTCTGGAACAGGGCCGGCGTGATGGGCGACACCGTGCCCAC- CGACCTGTACATCAAGGGCACCAGCGCCAACATGAGGGAGAC- CCCCGGCAGCTGCGTGTACAGCCCCAGCCCCAGCGGCAG- CATCGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGT- TACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAAT- CAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATT- TAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATA- TGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATA- TGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCA- GATGTTATGTCCTATATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAG- GATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGG- TGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGT- CAAAAGGATGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGA- TAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTA- GACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGG- CTGGATTGCGTCGCAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTT- CTGCTCCATCTGCCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTG-
CGTGTACGTGCCAGGAAGTAA Sequência 33 (SEQ ID NO: 33): ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTG- TGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAG- CATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAA- TCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATA- TTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGT- TACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAA- TCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGCGTGGAGA- TCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCCTGAGCGGCCAC- CCCCTGTACAACAAGCTGGACGACACCGAGAACAGCCACGTGG- CCAGCGCCGTGGACACCAAGGACACCAGGGACAACGTGAGCG- TGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCTTGGGCTGTG- CCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAA- TCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACT- TAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATA- CGGCGCCATGGACTTCAGCACCCTGCAGGACACCAAGTG- CGAGGTGCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTAC- CCCGACTACCTGCAGATGAGCGCCGAcCCCTACGGCGACAG- CATGTTCTTCTGCCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCAC- TTCTGGAACAGGGCCGGCGTGATGGGCGACACCGTGCCCAC- CGACCTGTACATCAAGGGCACCAGCGCCAACATGAGGGAGAC- CCCCGGCAGCTGCGTGTACAGCCCCAGCCCCAGCGGCAG- CATCGTTACCTCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGT- TACATAAGGCACAGGGTCATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAAT- CAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATT- TAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATA-
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CGTGTACGTGCCAGGAAGTAA Sequência 34 (SEQ ID NO: 34): ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTG- TGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAG- CATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAA- TCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATA- TTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGT- TACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAA- TCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAA- TTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGG- CATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATG- CCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTG- TCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTG- CCCCCGCCATCGGCGAGCACTGGACCAAGGGCACCGCCTG- CAAGCCCACCACCGTGGTGCAGGGCGACTGCCCCCCCCTGGA- GCTGAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTG- GATACGGCGCCATGGACTTCAGCACCCTGCAGGACACCAAGTG- CGAGGTGCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTAC- CCCGACTACCTGCAGATGAGCGCCGACCCCTACGGCGACAG- CATGTTCTTCTGCCTGAGGAGGGAGCAGCTGTTCGCCAGGCAC-
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CGTGTACGTGCCAGGAAGTAA Sequência 35 (SEQ ID NO: 35): ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTG- TGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAG- CATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAA- TCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATA- TTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGT- TACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAA- TCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAA- TTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGG- CATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATG- CCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTG- TCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTG-
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CGTGTACGTGCCAGGAAGTAA Sequência 36 (SEQ ID NO: 36): ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTG- TGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTAGGACCAG- CATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGACCGTGGG- CAACCCCTACTTCAGGGTGGTGCCCAACGGCGCCGGCAACAAG-
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CCAGGAAGTAA Sequência 37 (SEQ ID NO: 37): ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTG- TGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAG- CATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAA- TCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATA- TTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGT- TACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAA- TCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAGA- TCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCATCGGCCTGAGCGGCCAC- CCCTTCTACAACAAGCTGGACGACACCGAGAGCGCCCACGCCG- CCACCGCCGTGATCACCCAGGACGTGAGGGACAACGTGAGCG- TGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCATCCTGGGCTGCG- CCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAA- TCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACT- TAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATA- TGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGG- TACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATTATT- TACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCT- TACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTGGAATAGAGCA- GGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGG- CACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATT- CTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTG- TTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAA- TGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATAC- CACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGCGCCAGCACCACCAGCA- GCATCCCCAACGTGTACACCCCCACCAGCTTCAAGCAGTATAG- CAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAGTTGTG- TACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTA-
TGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTT- CCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTA- CAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGG- CTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTG- GATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATA- TCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCG- CAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTG- CCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTG-
CCAGGAAGTAA Sequência 38 (SEQ ID NO: 38): ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTG- TGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTAGGACCAG- CATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGACCGTGGG- CAACCCCTACTTCAGGGTGGTGCCCAACGGCGCCGGCAACAAG- CAGGCCGTGCCCAAGGTGAGCGCCTACCAGTACAGGGTGTTCA- GGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATAC- TAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTG- CTGGAGTGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCT- TAGTGGGCATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTT- CCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAA- TGTGTCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTG- TGCCCCCGCCATCGGCGAGCACTGGGCCAAGGGCACCCTGTG- CAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGA- GCTGAAGAACACCGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTG- GATATGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATG- TGAGGTACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGAT- TATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATG- TTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTG- GAATAGAGCAGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTA- TATATTAAAGGCACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTG-
TGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGAC- TCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGT- CATAACAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTG- TGGTAGATACCACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGCGCCAG- CACCACCAGCAGCATCCCCAACGTGTACACCCCCACCAGCTT- CAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTA- TTTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTA- TATTCATAGTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGG- TGTTCCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCG- TTTTGTACAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCAC- CGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATG- TGGATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATA- TCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCG- CAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTG- CCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTG-
CCAGGAAGTAA Sequência 39 (SEQ ID NO: 39):
VPNGAGNKQAV Sequência 40 (SEQ ID NO: 40):
IGLSGHPFYNKLDDTESAHAATAVITQ Sequência 41 (SEQ ID NO: 41):
LCKPAQLQP Sequência 42 (SEQ ID NO: 42):
VMGDTVPTDLYIKGTSANMRET Sequência 43 (SEQ ID NO: 43):
KVPKGGNGRQDV Sequência 44 (SEQ ID NO: 44):
TSSIPNVYTPTS Sequência 109 (SEQ ID NO: 109):
NPVPSTYDP
Sequência 110 (SEQ ID NO: 110):
LYNKLDDTENSHVASAVDTKDT Sequência 111 (SEQ ID NO: 111):
SGTMGDQLPESLYIKGTDIRANPGSYL Sequência 112 (SEQ ID NO: 112):
TKGTACKPTTVV Sequência 113 (SEQ ID NO: 113): MRPSDNTVYLPPPSVARVVNTDDYVTRTSIFYHAGSSRLLTVGN- PYFRVPAGGGNKQDIPKVSAYQYRVFRVQLPDPNKFGLPDTSIYN- PETQRLVWACAGVEIGRGQPLGVGLSGHPFYNKLDDTESSHAAT- SNVSEDVRDNVSVDYKQTQLCILGCAPAIGEHWAKGTACKS- RPLSQGDCPPLELKNTVLEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPL- DICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGTM- GDTVPQSLYIKGTGMRASPGSCVYSPSPSGSIVTSDSQLFNK- PYWLHKAQGHNNGVCWHNQLFVTVVDTTRSTNLTICASTQSPV- PGQYDATKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMSYIHSMNSSI- LEDWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAIACQKDAAPAENKDPYD- KLKFWNVDLKEKFSLDLDQYPLGRKFLVQAGLRRKPTIGPRKRSAP-
SATTASKPAKRVRVRARK Sequência 114 (SEQ ID NO: 114): ATGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTG- TGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTACGTGACTCGCACAAG- CATATTTTATCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAA- TCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATA- TTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGT- TACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAA- TCCTGAAACACAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAAA- TTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGG- CATCCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATG- CCGCCACGTCTAATGTTTCTGAGGACGTTAGGGACAATGTG-
TCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTGTG- CCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCTAAAGGCACTGCTTGTAAA- TCGCGTCCTTTATCACAGGGCGATTGCCCCCCTTTAGAACT- TAAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTGATATGGTAGATACTGGATA- TGGTGCCATGGACTTTAGTACATTGCAAGATACTAAATGTGAGG- TACCATTGGATATTTGTCAGTCTATTTGTAAATATCCTGATTATT- TACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCCATGTTTTTTTGCT- TACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTGGAATAGAGCA- GGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCcTTATATATTAAAGG- CACAGGTATGCGTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATT- CTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACCTCTGACTCCCAGTTG- TTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAACAA- TGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATAC- CACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAG- TCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTA- TAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTATTTTTCAG- TTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATA- GTATGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTT- CCCCCCCCGCCAACTACTAGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTA- CAATCTGTTGCTATTGCCTGTCAAAAGGATGCTGCACCGG- CTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTG- GATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATA- TCCCCTTGGACGTAAATTTTTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCG- CAAGCCCACCATAGGCCCTCGCAAACGTTCTGCTCCATCTG- CCACTACGGCTTCTAAACCTGCCAAGCGTGTGCGTGTACGTG-
CCAGGAAGTAA Sequência 115 (SEQ ID NO: 115): MALWRPSDSTVYLPPPSVARVVSTDDYVSRTSIFYHAGSSR- LLTVGNPYFRVVPNGAGNKQAVPKVSAYQYRVFRVALPDPNKFGL- PDSTIYNPETQRLVWACVGMEIGRGQPLGIGLSGHPFYNKLDDTE-
SAHAATAVITQDVRDNVSVDYKQTQLCILGCVPAIGEHWAKGTLCK- PAQLQPGDCPPLELKNTIIEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPL- DICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGVM- GDTVPTDLYIKGTSANMRETPGSCVYSPSPSGSIITSDSQLFNK- PYWLHKAQGHNNGICWHNQLFVTVVDTTRSTNLTLCASTQNPV- PSTYDPTKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTAEVMSYIHSMNSSI- LENWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAVTCQKDTTPPEKQDPYD- KLKFWTVDLKEKFSSDLDQYPLGRKFLVQAGLRRRPTIGPRKR-
PAASTSTASTASRPAKRVRIRSKK Sequência 116 (SEQ ID NO: 116): ATGGCCCTGTGGAGGCCCAGCGACAGCACCGTGTACCTG- CCCCCCCCCAGCGTGGCCAGGGTGGTGAGCACCGACGACTACG- TGAGCAGGACCAGCATCTTCTACCACGCCGGCAGCAGCAGG- CTGCTGACCGTGGGCAACCCCTACTTCAGGGTGGTG- CCCAACGGCGCCGGCAACAAGCAGGCCGTGCCCAAGGTGAG- CGCCTACCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGGCCCTGCCCGAC- CCCAACAAGTTCGGCCTGCCCGACAGCACCATCTACAAC- CCCGAGACCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCATGGA- GATCGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCATCGGCCTGAGCGG- CCACCCCTTCTACAACAAGCTGGACGACACCGAGAGCG- CCCACGCCGCCACCGCCGTGATCACCCAGGACGTGAGGGA- CAACGTGAGCGTGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTG- CATCCTGGGCTGCGTGCCCGCCATCGGCGAGCACTGGG- CCAAGGGCACCCTGTGCAAGCCCGCCCAGCTGCAGCCCGG- CGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGAAGAACACCATCATCGAGGA- CGGCGACATGGTGGACACCGGCTACGGCGCCATGGACTTCAG- CACCCTGCAGGACACCAAGTGCGAGGTGCCCCTGGACATCTG- CCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTGCAGATGAGCG- CCGACCCCTACGGCGACAGCATGTTCTTCTGCCTGAGGAGGGA- GCAGCTGTTCGCCAGGCACTTCTGGAACAGGGCCGGCG-
TGATGGGCGACACCGTGCCCACCGACCTGTACATCAAGGGCAC- CAGCGCCAACATGAGGGAGACCCCCGGCAGCTGCGTGTACAG- CCCCAGCCCCAGCGGCAGCATCATCACCAGCGACAGCCAGCTG- TTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCCCAGGGCCACAA- CAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTG- GACACCACCAGGAGCACCAACCTGACCCTGTGCGCCAGCAC- CCAGAACCCCGTGCCCAGCACCTACGACCCCACCAAGTTCAAG- CAGTACAGCAGGCACGTGGAGGAGTACGACCTGCAGTTCATCTT- CCAGCTGTGCACCATCACCCTGACCGCCGAGGTGATGAGCTA- CATCCACAGCATGAACAGCAGCATCCTGGAGAACTGGAACTT- CGGCGTGCCCCCCCCCCCCACCACCAGCCTGGTGGACACCTA- CAGGTTCGTGCAGAGCGTGGCCGTGACCTGCCAGAAGGACAC- CACCCCCCCCGAGAAGCAGGACCCCTACGACAAGCTGAAGTT- CTGGACCGTGGACCTGAAGGAGAAGTTCAGCAGCGACCTGGAC- CAGTACCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGGTGCAGGCCGG- CCTGAGGAGGAGGCCCACCATCGGCCCCAGGAAGAGGCCCG- CCGCCAGCACCAGCACCGCCAGCACCGCCAGCAGGCCCG-
CCAAGAGGGTGAGGATCAGGAGCAAGAAGTGA Modos Específicos para a Realização da Invenção
[0093] A presente invenção é ainda descrita com referência aos exemplos como se seguem, em que os exemplos são utilizados ape- nas para o propósito de ilustrar a presente invenção, em vez de limitar a presente invenção.
[0094] A menos que indicado de outra forma, os métodos experi- mentais de biologia molecular e os ensaios imunológicos utilizados na presente invenção são realizados substancialmente de acordo com os métodos descritos em J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A La- boratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, e F. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995; e as enzimas de restrição são utilizadas nas condições recomendadas pelos fabrican- tes. Aqueles versados na técnica entendem que os exemplos são utili- zados para ilustrar a presente invenção, mas não pretendem limitar o escopo de proteção da presente invenção. Exemplo 1. Expressão e purificação das proteínas L1 do HPV18 com mutação Construção dos vetores de expressão
[0095] A organização de Gibson (Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 2009; 6:343-
5. doi: 10.1038/nmeth.1318) foi utilizada para construir o vetor de ex- pressão que codifica a proteína L1 do HPV18 com mutação compre- endendo um segmento específico da proteína L1 do HPV45 e/ou um segmento específico da proteína L1 do HPV59. Em resumo, um frag- mento curto compreendendo mutações e um fragmento longo não compreendendo nenhuma mutação foram obtidos em primeiro lugar pela PCR, e o sistema de organização de Gibson foi então utilizado para ligar os dois fragmentos para formar um anel.
[0096] O modelo inicial utilizado compreendia o plasmídeo pTO- T7-HPV18N65L1 (que codifica a proteína L1 do HPV18 tendo 65 ami- noácidos truncados no N-terminal, e a proteína foi designada como HPV18N65; abreviada como 18L1N65 na Tabela 2), o plasmídeo pTO- T7- HPV45L1N27C (que codifica a proteína L1 do HPV45 tendo 27 aminoácidos truncados no N-terminal, e a proteína foi designada como HPV45N27; abreviada como 45L1N27 na Tabela 2), o plasmídeo pTO- T7-H18N65-45T1 (que codifica a proteína com mutação H18N65- 45T1; abreviada como H18N65-45T1 na Tabela 2), o plasmídeo pTO- T7-H18N65-45T2 (que codifica a proteína com mutação H18N65- 45T2; abreviada como H18N65-45T2 na Tabela 2), o plasmídeo pTO- T7-H18N65-45T3 (que codifica a proteína com mutação H18N65-
45T3; abreviada como H18N65-45T3 na Tabela 2), o plasmídeo pTO- T7-H18N65-45T4 (que codifica a proteína com mutação H18N65- 45T4; abreviada como H18N65-45T4 na Tabela 2), o plasmídeo pTO- T7-H18N65-45T3-59S5 (que codifica a proteína com mutação H18N65-45T3-59S5; abreviada como H18N65-45T3-59S5 na Tabela 2) e o plasmídeo pTO-T7-HPV59L1 (que codifica a proteína L1 do HPV59; abreviada como 59L1 na Tabela 2). Os modelos e iniciadores para cada PCR foram mostrados na Tabela 2, e as condições de am- plificação para a PCR para amplificar o fragmento curto foram as se- guintes: desnaturação a 94°C durante 10 min; 25 ciclos (desnaturação a 94°C durante 50 seg, anelamento em uma dada temperatura durante um certo período de tempo e extensão a 72°C durante 1 min); e exten- são final a 72°C durante 10 min. As condições de amplificação para a PCR para amplificar o fragmento longo foram as seguintes: desnatura- ção a 94°C durante 10 min; 25 ciclos (desnaturação a 94°C durante 50 seg, anelamento em uma dada temperatura durante um certo período de tempo e extensão a 72°C durante 7,5 min); e extensão final a 72°C durante 10 min. A temperatura e o tempo de anelamento foram lista- dos na Tabela 2. As sequências dos iniciadores de PCR utilizados fo- ram listadas na Tabela 3.
[0097] O produto da amplificação foi submetido à eletroforese, o fragmento de interesse foi então recuperado através do uso de DNA Extraction Kit (BEYOTIME, Cat.No.D0033), e sua concentração foi de- terminada. O fragmento curto e o fragmento longo obtidos por amplifi- cação foram misturados em uma relação molar de 2:1 (um volume to- tal de 3 μL) e 3 μL de 2 × Gibson Assembly Master Mix (adquirido da NEB, contendo exonuclease T5, polimerase de DNA Phusion, Taq DNA ligase) foram então adicionados e reagiram a 50 °C durante 1 h.
[0098] O produto reunido (6 μL) foi utilizado para transformar 40 μL de E. coli competente ER2566 (adquirido na New England Biolabs)
preparado pelo método de cloreto de cálcio. As E. coli transformadas foram espalhadas em meio LB sólido (componentes do meio LB: 10 g/L de peptona, 5 g/L de pó de levedura, 10 g/L de NaCl, o mesmo a seguir) contendo canamicina (em uma concentração final de 25 μg/mL, o mesmo daqui em diante), e foram submetidas ao cultivo estático a 37 °C durante 10 a 12 h até que colônias únicas pudessem ser obser- vadas claramente. A colônia única foi colhida e inoculada em um tubo contendo 4 ml de meio LB líquido (contendo canamicina) e cultivada com agitação em 220 rpm durante 10 h a 37 °C e, em seguida, 1 ml de solução bacteriana foi retirado e armazenado a -70 °C. Os plasmídeos foram extraídos de E. coli, e o iniciador T7 foi utilizado para sequenciar as sequências de nucleotídeo dos fragmentos de interesse inseridos nos plasmídeos. O resultado do sequenciamento mostrou que as se- quências de nucleotídeo dos fragmentos de interesse inseridos nos plasmídeos construídos (vetores de expressão) foram SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 e 38, respectiva- mente, e suas sequências de aminoácido codificadas foram SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19, respectiva- mente (as proteínas correspondentes foram designadas como H18N65-45T1, H18N65-45T2, H18N65-45T3, H18N65-45T4, H18N65-45T5, H18N65-45T3-59S1, H18N65-45T3-59S2, H18N65- 45T3-59S4, H18N65-45T3-59S5, H18N65-45T4-59S1, H18N65- 45T4-59S2, H18N65-45T4-59S3, H18N65-45T4-59S5, H18N65- 45T1-59S5, H18N65-45T2-59S5 e H18N65-45T1T3-59S5, respecti- vamente.
[0099] A proteína com mutação H18N65-45T1 difere de HPV18N65 por: a substituição dos resíduos de aminoácido das posi- ções 114 a 123 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 79 a 89 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem. A proteína com mutação H18N65-45T2 dife-
re de HPV18N65 por: a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 176 a 202 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 142 a 168 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem. A proteína com mutação H18N65-45T3 dife- re de HPV18N65 por: a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 235 a 243 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácidos das posições 201 a 209 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem. A proteína com mutação H18N65-45T4 dife- re de HPV18N65 por: a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 327 a 346 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 293 a 314 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem. A proteína com mutação H18N65-45T5 dife- re de HPV18N65 por: a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 411 a 419 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 379 a 387 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem.
[00100] A proteína com mutação H18N65-45T3-59S1 difere de HPV18N65 por: a substituição dos resíduos de aminoácido das posi- ções 235 a 243 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 201 a 209 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, e a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 112 a 123 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 51 a 62 da proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem. A proteína com mutação H18N65-45T3- 59S2 difere de HPV18N65 por: a substituição dos resíduos de amino- ácido das posições 235 a 243 da proteína L1 do HPV18 do tipo selva- gem com os resíduos de aminoácido das posições 201 a 209 da prote- ína L1 do HPV45 do tipo selvagem, e a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 183 a 204 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 122 a 143 da proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem. A proteína com mutação H18N65-45T3-59S4 difere de HPV18N65 por: a substituição dos resí- duos de aminoácido das posições 235 a 243 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 201 a 209 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, e a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 325 a 351 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 264 a 290 da proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem. A proteína com mutação H18N65-45T3-59S5 difere de HPV18N65 por: a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 235 a 243 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 201 a 209 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, e a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 410 a 421 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 349 a 360 da proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem.
[00101] A proteína com mutação H18N65-45T4-59S1 difere de HPV18N65 por: a substituição dos resíduos de aminoácido das posi- ções 327 a 346 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 293 a 314 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, e a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 112 a 123 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 51 a 62 da proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem. A proteína com mutação H18N65-45T4- 59S2 difere de HPV18N65 por: a substituição dos resíduos de amino- ácido das posições 327 a 346 da proteína L1 do HPV18 do tipo selva- gem com os resíduos de aminoácido das posições 293 a 314 da prote- ína L1 do HPV45 do tipo selvagem, e a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 183 a 204 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 122 a 143 da proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem. A proteína com mutação
H18N65-45T4-59S3 difere de HPV18N65 por: a substituição dos resí- duos de aminoácido das posições 327 a 346 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 293 a 314 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, e a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 231 a 242 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 170 a 181 da proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem. A proteína com mutação H18N65-45T4-59S5 difere de HPV18N65 por: a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 327 a 346 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 293 a 314 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, e a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 410 a 421 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 349 a 360 da proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem.
[00102] A proteína com mutação H18N65-45T1-59S5 difere de HPV18N65 por: a substituição dos resíduos de aminoácido das po- sições 114 a 123 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 79 a 89 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, e a substituição dos resíduos de aminoá- cido das posições 410 a 421 da proteína L1 do HPV18 do tipo se l- vagem com os resíduos de aminoácido das posições 349 a 360 da proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem. A proteína com mutação H18N65-45T2-59S5 difere de HPV18N65 por: a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 176 a 202 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posi- ções 142 a 168 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, e a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 410 a 421 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 349 a 360 da proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem. A proteína com mutação H18N65-45T1T3-59S5 di-
fere de HPV18N65 por: a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 114 a 123 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 79 a 89 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, e a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 235 a 243 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 201 a 209 da proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem, e a substituição dos resíduos de aminoácido das posições 410 a 421 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com os resíduos de aminoácido das posições 349 a 360 da proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem.
Tabela 2. Modelos e iniciadores da PCR para a construção de vetores de expressão Temperatura/ Iniciador a montan- Modelo Iniciador a jusante Produto Tempo de anela- te mento G-V-H18N65-45T1- G-V-H18N65-45T1- H18N65-45T1 fragmento 56 °C/50 s 18L1N65 F R longo H18N65-45T1 fragmento 56 °C/30 s 45L1N27 G-H18N65-45T1-F G-H18N65-45T1-R curto G-V-H18N65-45T2- G-V-H18N65-45T2- H18N65-45T2 fragmento 56 °C/50 s 18L1N65 F R longo H18N65-45T2 fragmento 56 °C/30 s 45L1N27 G-H18N65-45T2-F G-H18N65-45T2-R curto G-V-H18N65-45T3- G-V-H18N65-45T3- H18N65-45T3 fragmento 56 °C/50 s 18L1N65 F R longo H18N65-45T3 fragmento 56 °C/30 s 45L1N27 G-H18N65-45T3-F G-H18N65-45T3-R curto G-V-H18N65-45T4- G-V-H18N65-45T4- H18N65-45T4 fragmento 56 °C/50 s 18L1N65 F R longo H18N65-45T4 fragmento 56 °C/30 s 45L1N27 G-H18N65-45T4-F G-H18N65-45T4-R curto G-V-H18N65-45T5- G-V-H18N65-45T5- H18N65-45T5 fragmento 56 °C/50 s 18L1N65 F R longo H18N65-45T5 fragmento 56 °C/30 s 45L1N27 G-H18N65-45T5-F G-H18N65-45T5-R curto H18N65- G-V-H18N65-45T3- G-V-H18N65-45T3- H18N65-45T3-59S1 56 °C/50 s 45T3 59S1-F 59S1-R fragmento longo 59L1 G-H18N65-45T3- G-H18N65-45T3- H18N65-45T3-59S1 56 °C/30 s
59S1-F 59S1-R fragmento curto H18N65- G-V-H18N65-45T3- G-V-H18N65-45T3- H18N65-45T3-59S2 56 °C/50 s 45T3 59S2-F 59S2-R fragmento longo G-H18N65-45T3- G-H18N65-45T3- H18N65-45T3-59S2 56 °C/30 s 59L1 59S2-F 59S2-R fragmento curto H18N65- G-V-H18N65-45T3- G-V-H18N65-45T3- H18N65-45T3-59S4 56 °C/50 s 45T3 59S4-F 59S4-R fragmento longo G-H18N65-45T3- G-H18N65-45T3- H18N65-45T3-59S4 56 °C/30 s 59L1 59S4-F 59S4-R fragmento curto H18N65- G-V-H18N65-45T3- G-V-H18N65-45T3- H18N65-45T3-59S5 56 °C/50 s 45T3 59S5-F 59S5-R fragmento longo G-H18N65-45T3- G-H18N65-45T3- H18N65-45T3-59S5 56 °C/30 s 59L1 59S5-F 59S5-R fragmento curto H18N65- G-V-H18N65-45T4- G-V-H18N65-45T4- H18N65-45T4-59S1 56 °C/50 s 45T4 59S1-F 59S1-R fragmento longo G-H18N65-45T4- G-H18N65-45T4- H18N65-45T4-59S1 56 °C/30 s 59L1 59S1-F 59S1-R fragmento curto H18N65- G-V-H18N65-45T4- G-V-H18N65-45T4- H18N65-45T4-59S2 56 °C/50 s 45T4 59S2-F 59S2-R fragmento longo G-H18N65-45T4- G-H18N65-45T4- H18N65-45T4-59S2 56 °C/30 s 59L1 59S2-F 59S2-R fragmento curto H18N65- G-V-H18N65-45T4- G-V-H18N65-45T4- H18N65-45T4-59S3 56 °C/50 s 45T4 59S3-F 59S3-R fragmento longo G-H18N65-45T4- G-H18N65-45T4- H18N65-45T4-59S3 56 °C/30 s 59L1 59S3-F 59S3-R fragmento curto H18N65- G-V-H18N65-45T4- G-V-H18N65-45T4- H18N65-45T4-59S5 56 °C/50 s 45T4 59S5-F 59S5-R fragmento longo G-H18N65-45T4- G-H18N65-45T4- H18N65-45T4-59S5 56 °C/30 s 59L1 59S5-F 59S5-R fragmento curto H18N65- G-V-H18N65-45T1- G-V-H18N65-45T1- H18N65-45T1-59S5 56 °C/50 s 45T1 59S5-F 59S5-R fragmento longo G-H18N65-45T1- G-H18N65-45T1- H18N65-45T1-59S5 56 °C/30 s 59L1 59S5-F 59S5-R fragmento curto H18N65- G-V-H18N65-45T2- G-V-H18N65-45T2- H18N65-45T2-59S5 56 °C/50 s 45T2 59S5-F 59S5-R fragmento longo G-H18N65-45T2- G-H18N65-45T2- H18N65-45T2-59S5 56 °C/30 s 59L1 59S5-F 59S5-R fragmento curto H18N65- G-V-H18N65- G-V-H18N65- H18N65-45T1T3-59S5 56 °C/50 s 45T3-59S5 45T1T3-59S5-F 45T1T3-59S5-R fragmento longo G-H18N65- G-H18N65- H18N65-45T1T3-59S5 56 °C/30 s 45L1N27 45T1T3-59S5-F 45T1T3-59S5-R fragmento curto
Tabela 3. Sequências dos iniciadores utilizados (SEQ ID NOs: 45 a 108)
SEQ ID Nome do iniciador Sequência do iniciador (5’-3’) NO: 45 G-V-H18N65-45T1-F CAGTTACCTGACCCAAATAAATT 46 G-V-H18N65-45T1-R AGTCACGTAATCATCGGTAT TAAATACCGATGATTACGTGACTAGGACCAGCATCTT- 47 G-H18N65-45T1-F
CTACCAC AATTTATTTGGGTCAGGTAACTGCACCCTGAACAC- 48 G-H18N65-45T1-F
CCTGTACTGG 49 G-V-H18N65-45T2-F GCCCCTGCTATTGGGGAACACTGGGCT 50 G-V-H18N65-45T2-R CACTCCAGCACAGGCCCACACTAAAC GTGTGGGCCTGTGCTGGAGTGGAGATCGGCAGGGG- 51 G-H18N65-45T2-F
CCAG CAGTGTTCCCCAATAGCAGGGGCGCAGCCCAGGA- 52 G-H18N65-45T2-R
TGCACAGCT 53 G-V-H18N65-45T3-F GTTTTGGAAGATGGTGATATGGT 54 G-V-H18N65-45T3-R GGCACAGCCCAAAATACATAACT AGTTATGTATTTTGGGCTGTGCCCCCGCCATCGG- 55 G-H18N65-45T3-F
CGAGCACTGGG ACCATATCACCATCTTCCAAAACGGTGTTCTTCAG- 56 G-H18N65-45T3-R
CTCCAGGGG 57 G-V-H18N65-45T4-F GTTACCTCTGACTCCCAGTTGTT 58 G-V-H18N65-45T4-R TCCAGTATCTACCATATCACCATCTT GATGGTGATATGGTAGATACTGGATACGGCGCCATG- 59 G-H18N65-45T4-F
GACTTCAGCAC AACAACTGGGAGTCAGAGGTAACGATGCTGCCG- 60 G-H18N65-45T4-R
CTGGGGCTGGGGCT 61 G-V-H18N65-45T5-F GATGTTATGTCCTATATTCAT 62 G-V-H18N65-45T5-R TATTGTTAAATTGGTACTGCGAG CTCGCAGTACCAATTTAACAATATGCGCCAGCAC- 63 G-H18N65-45T5-F
CCAGAACCCCG CTATGAATATAGGACATAACATCGGCGGTCAGGG- 64 G-H18N65-45T5-R
TGATGGTGCAC 65 G-V-H18N65-45T3-59S1-F GCATACCAATATAGAGTATTTAG 66 G-V-H18N65-45T3-59S1-R ATATGGATTACCAACAGTTAATAAT TATTAACTGTTGGTAATCCATATTTCAAGGTG- 67 G-H18N65-45T3-59S1-F
CCCAAGGGCGGC CCTAAATACTCTATATTGGTATGCGCTCACCTTGGG- 68 G-H18N65-45T3-59S1-R
CACGTCCTGC 69 G-V-H18N65-45T3-59S2-F TTGGGCTGTGCCCCCGCCATCGG 70 G-V-H18N65-45T3-59S2-R AGCACAGGCCCACACTAAACGTTGT
CAACGTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGCGTGGAGA- 71 G-H18N65-45T3-59S2-F
TCGGCAGGGGC GCCGATGGCGGGGGCACAGCCCAAGATGCACAG- 72 G-H18N65-45T3-59S2-R
CTGGGTCTGCTTGT 73 G-V-H18N65-45T3-59S4-F GGCTCTATTGTTACCTCTGACTC 74 G-V-H18N65-45T3-59S4-R AAGCTGCTCACGCCGTAAGCAAAAA TGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTCGCCAGGCACTT- 75 G-H18N65-45T3-59S4-F
CTGGAACAG GGAGTCAGAGGTAACAATAGAGCCGCTGGGG- 76 G-H18N65-45T3-59S4-R
CTGGGGCTGTACAGGT 77 G-V-H18N65-45T3-59S5-F CAGTATAGCAGACATGTTGAGG 78 G-V-H18N65-45T3-59S5-R TATTGTTAAATTGGTACTGCGAG ACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGCGCCAGCAC- 79 G-H18N65-45T3-59S5-F
CACCAGCAGCAT TTCCTCAACATGTCTGCTATACTGCTTGAAGCTGG- 80 G-H18N65-45T3-59S5-R
TGGGGGTGT 81 G-V-H18N65-45T4-59S1-F GCATACCAATATAGAGTATTTAG 82 G-V-H18N65-45T4-59S1-R ATTACCAACAGTTAATAATCTAGAGC GATTATTAACTGTTGGTAATCCCTACTTCAAGGTG- 83 G-H18N65-45T4-59S1-F
CCCAAGGGCGG ATTTGGGTCAGGTAACTGCACCCTGAACACCCTG- 84 G-H18N65-45T4-59S1-R
TACTGGTAGGCGC 85 G-V-H18N65-45T4-59S2-F TTATGTATTTTGGGCTGTGCCCCTG 86 G-V-H18N65-45T4-59S2-R AGCACAGGCCCACACTAAACGTT GTTTAGTGTGGGCCTGTGCTGGCGTGGAGATCGG- 87 G-H18N65-45T4-59S2-F
CAGGGGCCAGCCC GCAGGGGCACAGCCCAAAATACATAACTGGGTCTG- 88 G-H18N65-45T4-59S2-R
CTTGTAGTCCAC 89 G-V-H18N65-45T4-59S3-F AAAAACACAGTTTTGGAAGATGGTG 90 G-V-H18N65-45T4-59S3-R GGCACAGCCCAAAATACATAACT TTATGTATTTTGGGCTGTGCCCCCGCCATCGGCGAG- 91 G-H18N65-45T4-59S3-F
CACTGGAC ACCATCTTCCAAAACTGTGTTTTTCAGCTCCA- 92 G-H18N65-45T4-59S3-R
GGGGGGGGCAGTCGC 93 G-V-H18N65-45T4-59S5-F CAGTATAGCAGACATGTTGAGG 94 G-V-H18N65-45T4-59S5-R TATTGTTAAATTGGTACTGCGGTGGT CAGTACCAATTTAACAATATGCGCCAGCACCACCAG- 95 G-H18N65-45T4-59S5-F
CAGCATCCCC ATATTCCTCAACATGTCTGCTATACTGCTTGAAG- 96 G-H18N65-45T4-59S5-R
CTGGTGGGGGTGT 97 G-V-H18N65-45T1-59S5-F CAGTATAGCAGACATGTTGAGG
98 G-V-H18N65-45T1-59S5-R TATTGTTAAATTGGTACTGCGAG ACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGCGCCAGCAC- 99 G-H18N65-45T1-59S5-F
CACCAGCAGCAT TTCCTCAACATGTCTGCTATACTGCTTGAAGCTGG- 100 G-H18N65-45T1-59S5-R
TGGGGGTGT 101 G-V-H18N65-45T2-59S5-F CAGTATAGCAGACATGTTGAGG 102 G-V-H18N65-45T2-59S5-R TATTGTTAAATTGGTACTGCGAG ACTCGCAGTACCAATTTAACAATATGCGCCAGCAC- 103 G-H18N65-45T2-59S5-F
CACCAGCAGCAT TTCCTCAACATGTCTGCTATACTGCTTGAAGCTGG- 104 G-H18N65-45T2-59S5-R
TGGGGGTGT G-V-H18N65-45T1T3- 105 CAGTTACCTGACCCAAATAAATT 59S5-F G-V-H18N65-45T1T3- 106 AGTCACGTAATCATCGGTAT 59S5-R TAAATACCGATGATTACGTGACTAGGACCAGCATCTT- 107 G-H18N65-45T1T3-59S5-F
CTACCAC AATTTATTTGGGTCAGGTAACTGCACCCTGAACAC- 108 G-H18N65-45T1T3-59S5-R
CCTGTACTGG Expressão das proteínas com mutação em uma grande escala
[00103] As soluções de E. coli compreendendo os plasmídeos re- combinantes pTO-T7-H18N65-45T1, pTO-T7-H18N65-45T2, pTO-T7- H18N65-45T3, pTO-T7-H18N65-45T4, pTO-T7-H18N65-45T5, pTO- T7-H18N65-45T3-59S1, pTO-T7-H18N65-45T3-59S2, pTO-T7- H18N65-45T3-59S4, pTO-T7-H18N65-45T3-59S5, pTO-T7-H18N65- 45T4-59S1, pTO-T7-H18N65-45T4-59S2, pTO-T7-H18N65-45T4- 59S3, pTO-T7-H18N65-45T4-59S5, pTO-T7-H18N65-45T1-59S5, pTO-T7-H18N65-45T2-59S5 e pTO-T7-H18N65-45T1T3-59S5, res- pectivamente, foram retirados do refrigerador -70 °C, foram inoculados em 100 ml de meio líquido LB contendo canamicina e incubados em 200 rpm e 37°C durante cerca de 8 h. Em seguida, a cultura foi trans- ferida para 500 ml de meio LB contendo canamicina (1 ml de solução bacteriana foi transferido) e foi posteriormente incubada. Quando a concentração bacteriana atingiu uma OD600 de cerca de 0,6, a tempe- ratura de cultivo foi reduzida para 25°C e 500 μl de IPTG foram adicio- nados a cada frasco de cultura. A incubação foi ainda executada du-
rante 8 h. Após o término da incubação, as bactérias foram coletadas por centrifugação. As bactérias que expressam as proteínas H18N65- 45T1, H18N65-45T2, H18N65-45T3, H18N65-45T4, H18N65-45T5, H18N65-45T3-59S1, H18N65-45T3-59S2, H18N65-45T3-59S4, H18N65-45T3-59S5, H18N65-45T4-59S1, H18N65-45T4-59S2, H18N65-45T4-59S3, H18N65-45T4-59S5, H18N65-45T1-59S5, H18N65-45T2-59S5 e H18N65-45T1T3-59S5 foram obtidas, respecti- vamente. Disrupção de bactérias que expressam as proteínas com mutação
[00104] As bactérias obtidas acima foram colocadas novamente em suspensão em uma relação de 1 g de bactérias para 10 ml de tampão de lise (tampão Tris 20 mM, pH 7,2, NaCl 300 mM). As bactérias foram rompidas utilizando um aparelho ultrassônico durante 30 min. A solu- ção de lise contendo as bactérias rompidas foi centrifugada em 13500 rpm (30000 g) durante 15 min, e o sobrenadante (isto é, o sobrenadan- te das bactérias rompidas) foi obtido. Purificação cromatográfica da proteína com mutação
[00105] Equipamento: sistema de cromatografia em fase líquida preparativa AKTA Explorer 100 produzido pela GE Healthcare (isto é, a Amershan Pharmacia Co. original).
[00106] Meio cromatográfico: SP Sepharose 4 Fast Flow (GE Heal- thcare Co.), CHT-II (adquirido da Bio-RAD) e Butyl Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare Co.).
[00107] Tampão: Tampão A (tampão de fosfato 20 mM, pH 8,0, DTT 20 mM); e Tampão B (tampão de fosfato 20 mM, pH 8,0, DTT 20 mM, NaCl 2M). Os tampões contendo diferentes concentrações de NaCl usados no seguinte protocolo de eluição foram preparados atra- vés da mistura do Tampão A e do Tampão B em uma certa relação.
[00108] Amostra: os sobrenadantes de bactérias rompidas conten- do H18N65-45T1, H18N65-45T2, H18N65-45T3, H18N65-45T4,
H18N65-45T5, H18N65-45T3-59S1, H18N65-45T3-59S2, H18N65- 45T3-59S4, H18N65-45T3-59S5, H18N65-45T4-59S1, H18N65- 45T4-59S2, H18N65-45T4-59S3, H18N65-45T4-59S5, H18N65- 45T1-59S5, H18N65-45T2-59S5 e H18N65-45T1T3-59S5, respecti- vamente como obtidas acima. Protocolo de eluição: (1) Purificação de troca catiônica do sobrenadante de bactérias rompi- das por SP Sepharose 4 Fast Flow: a amostra foi carregada na coluna, as proteínas indesejadas foram então eluídas com um tampão conten- do NaCl 400 mM (80% Tampão A + 20% Tampão B), seguido pela eluição da proteína de interesse com um tampão contendo NaCl 800 mM (60% Tampão A + 40% Tampão B), e a fração eluída com o tam- pão contendo NaCl 800 mM foi coletada; (2) Purificação cromatográfica da fração de eluição obtida na etapa (1) por CHTII (cromatografia de hidroxiapatita): a fração de eluição obtida na etapa (1) foi diluída de modo que a concentração de NaCl diminuiu para 0,5 M; a amostra foi carregada na coluna, as proteínas indeseja- das foram então eluídas com um tampão contendo NaCl 500 mM (75% Tampão A + 25% Tampão B), seguido pela eluição da proteína de inte- resse com um tampão contendo NaCl 1000 mM (50% Tampão A + 50% Tampão B), e a fração eluída com o tampão contendo NaCl 1000 mM foi coletada; (3) Purificação cromatográfica da fração de eluição obtida na etapa (2) por HIC (cromatografia de interação hidrofóbica): a amostra foi carre- gada na coluna, as proteínas indesejadas foram então eluídas com um tampão contendo NaCl 1000 mM, seguido pela eluição da proteína de interesse com um tampão contendo NaCl 200 mM (90% Tampão A + 10% Tampão B), e a fração eluída com o tampão contendo NaCl 200 mM foi coletada.
[00109] 150 μl da fração de eluição obtida na etapa (3) foram adici-
onados a 30 μl de tampão de carga 6 × (1 L dos quais continha 300 ml de TB 6.8 1M, 600 ml de glicerol 100%, 120 g de SDS, 6 g de azul de bromofenol e 50 ml de β-mercaptoetanol). A solução resultante foi bem misturada e incubada em banho de água a 80 °C durante 10 min. 10 µl da amostra resultante foram então submetidos à SDS-PAGE 10% em 120 V durante 120 min; e as faixas eletroforéticas foram coradas com azul brilhante de Coomassie. O resultado eletroforético foi mostrado na FIG. 1. O resultado mostrou que após as referidas etapas de purifica- ção, as proteínas H18N65-45T1, H18N65-45T2, H18N65-45T3, H18N65-45T4, H18N65-45T5, H18N65-45T3-59S1, H18N65-45T3- 59S2, H18N65-45T3-59S4, H18N65-45T3-59S5, H18N65-45T4- 59S1, H18N65-45T4-59S2, H18N65-45T4-59S3, H18N65-45T4- 59S5, H18N65-45T1-59S5, H18N65-45T2-59S5 e H18N65-45T1T3- 59S5 tiveram uma pureza acima de 85%.
[00110] Por métodos semelhantes, a proteína HPV18N65 (SEQ ID NO: 113) foi preparada e purificada utilizando E. coli e o plasmídeo pTO-T7-HPV18N65L1; a proteína do HPV45N27 (SEQ ID NO: 115) foi preparada e purificada utilizando E. coli e o plasmídeo pTO-T7- HPV45L1N27C; e a proteína L1 do HPV59 (SEQ ID NO: 3) foi prepa- rada e purificada utilizando E. coli e o plasmídeo pTO-T7-HPV59L1. Ensaio de Western blot das proteínas com mutação
[00111] As proteínas H18N65-45T1, H18N65-45T2, H18N65- 45T3, H18N65-45T4, H18N65-45T5, H18N65-45T3-59S1, H18N65- 45T3-59S2, H18N65-45T3-59S4, H18N65-45T3-59S5, H18N65- 45T4-59S1, H18N65-45T4-59S2, H18N65-45T4-59S3, H18N65- 45T4-59S5, H18N65-45T1-59S5, H18N65-45T2-59S5 e H18N65- 45T1T3-59S5 proteínas purificadas pelo método acima foram subme- tidas à eletroforese. Após a eletroforese, o ensaio de Western Blot foi realizado através do uso de um anticorpo de amplo espectro 4B3 con- tra a proteína L1 do HPV, e o resultado foi mostrado na FIG. 2. O re-
sultado mostrou que H18N65-45T1, H18N65-45T2, H18N65-45T3, H18N65-45T4, H18N65-45T5, H18N65-45T3-59S1, H18N65-45T3- 59S2, H18N65-45T3-59S4, H18N65-45T3-59S5, H18N65-45T4- 59S1, H18N65-45T4-59S2, H18N65-45T4-59S3, H18N65-45T4- 59S5, H18N65-45T1-59S5, H18N65-45T2-59S5 e H18N65-45T1T3- 59S5 podem ser especificamente reconhecidas pelo anticorpo de am- plo espectro 4B3. Exemplo 2: Organização de partículas semelhantes ao vírus HPV e detecção morfológica de partículas Organização de partículas semelhantes a vírus HPV
[00112] Um determinado volume (ao redor de 2 ml) da proteína H18N65-45T1, H18N65-45T2, H18N65-45T3, H18N65-45T4, H18N65- 45T5, H18N65-45T3-59S1, H18N65-45T3-59S2, H18N65-45T3-59S4, H18N65-45T3-59S5, H18N65-45T4-59S1, H18N65-45T4-59S2, H18N65-45T4-59S3, H18N65-45T4-59S5, H18N65-45T1-59S5, H18N65-45T2-59S5 ou H18N65-45T1T3-59S5, foi submetido a diálise em (1) tampão de armazenamento 2 L (tampão de fosfato de sódio 20 mM pH 6,5, NaCl 0,5 M); (2) tampão de renaturação 2 L (tampão de fosfato de sódio 50 mM pH 6,0, CaCl2 2 mM, MgCl2 2 mM, NaCl 0,5 M); e (3) tampão de fosfato de sódio 20 mM pH 7,0, NaCl 0,5 M, su- cessivamente. A diálise foi executada em cada um dos três tampões durante 12 h.
[00113] Por métodos semelhantes, as proteínas L1 do HPV18N65, HPV45N27 e HPV59 foram organizadas nas VLP do HPV18N65, VLP do HPV45N27 e VLP do HPV59, respectivamente. Análise cromatográfica de peneira molecular
[00114] A amostra submetida à diálise foi submetida à análise cro- matográfica de peneira molecular pelo 1120 Compact LC High Perfor- mance Liquid Chromatographic System (Agilent Technologies), em que a coluna analítica utilizada foi TSK Gel PW5000×l 7,8×300 mm.
Os resultados da análise foram mostrados nas FIGs. 3A a 3S. Os re- sultados mostraram que o primeiro pico de proteína das amostras compreendendo a proteína H18N65-45T1, H18N65-45T2, H18N65- 45T3, H18N65-45T4, H18N65-45T5, H18N65-45T3-59S1, H18N65- 45T3-59S2, H18N65-45T3-59S4, H18N65-45T3-59S5, H18N65- 45T4-59S1, H18N65-45T4-59S2, H18N65-45T4-59S3, H18N65- 45T4-59S5, H18N65-45T1-59S5, H18N65-45T2-59S5 ou H18N65- 45T1T3-59S5 apareceu ao redor de 13 min, que era comparável com aquele das VLP do HPV18N65, VLP do HPV45N27 e VLP do HPV59. Isso mostrou que todas essas proteínas foram capazes de se organi- zar em VLPs. Teste morfológico das partículas semelhantes a vírus
[00115] Uma amostra de 100 μl compreendendo VLP foi observada por microscópio eletrônico de transmissão (TEM). O mecanismo utili- zado foi um 100kV Transmission Electron Microscope fornecido pela JEOL Ltd. (aumento de 100.000×). Em resumo, 13,5 μl de amostra fo- ram negativamente corados com ácido fosfotúngstico a 2% (pH 7,0), fixados em uma grade de cobre revestido de carbono e, depois, obser- vados por TEM. Os resultados foram mostrados nas FIGs. 4A a 4S. Os resultados mostraram que as H18N65-45T1, H18N65-45T2, H18N65-45T3, H18N65-45T4, H18N65-45T5, H18N65-45T3-59S1, H18N65-45T3-59S2, H18N65-45T3-59S4, H18N65-45T3-59S5, H18N65-45T4-59S1, H18N65-45T4-59S2, H18N65-45T4-59S3, H18N65-45T4-59S5, H18N65-45T1-59S5, H18N65-45T2-59S5 e H18N65-45T1T3-59S5 foram capazes de se organizar em partículas semelhantes a vírus. Além disso, os resultados também mostraram que as partículas organizadas por essas proteínas com mutação ti- nham um raio de cerca de 30 nm e eram de tamanho uniforme. As par- tículas organizadas pela L1 do HPV18N65, HPV45N27 e HPV59 do tipo selvagem também tinham um raio de cerca de 30 nm e eram uni-
formes em tamanho. Isso indicou que essas proteínas com mutação eram semelhantes à proteína L1 do HPV18, HPV45 e HPV59, e eram capazes de se organizar em VLPs com um tamanho uniforme. Análise da velocidade de sedimentação
[00116] O mecanismo para análise da velocidade de sedimentação foi Beckman XL-A Analytical Ultracentrifuge, equipada com sistema de inspeção óptica e rotor An-50Ti e An-60Ti. Os coeficientes de se- dimentação de VLP do HPV18N65, VLP do HPV45N27, VLP do HPV59, VLP da H18N65-45T3, VLP da H18N65-45T4, VLP da H18N65-45T3-59S1, VLP da H18N65-45T4-59S1 e VLP da H18N65-45T1T3-59S5 foram analisados pelo método de velocidade de sedimentação. Os resultados foram mostrados nas FIGs. 5A a 5H. Os resultados mostraram que o coeficiente de sedimentação da VLP da H18N65-45T3, da VLP da H18N65-45T4 e da VLP da H18N65- 45T1T3-59S5 foi 143,7S, 173,3S e 167,1S, respectivamente, que foi semelhante àquele da VLP do HPV18N65, da VLP do HPV45N27 e da VLP do HPV59 (VLP do HPV18N65, 142,2S; VLP do HPV45N27, 146,5S e VLP do HPV59, 139,3S). Isso mostrou que a VLP da H18N65-45T3, a VLP da H18N65-45T4 e a VLP da H18N65-45T1T3- 59S5 foram capazes de se organizaar em partículas semelhantes a vírus que eram semelhantes às VLPs do tipo selvagem em termos de tamanho e morfologia. Exemplo 3: Avaliação da termoestabilidade de partículas seme- lhantes a vírus
[00117] As VLPs formadas pela proteína do HPV18N65, HPV45N27, HPV59, H18N65-45T3, H18N65-45T4, H18N65-45T3- 59S1, H18N65-45T4-59S1 e H18N65-45T1T3-59S5 foram avaliadas quanto à sua termostabilidade mediante o uso de um calorímetro de varredura diferencial VP Capillary DSC adquirido da GE Company (isto é, a MicroCal Co. original), em que o tampão de armazenamento para a proteína foi utilizado como controle e as proteínas foram lidas otica- mente em uma taxa de aquecimento de 1,5°C/min dentro de uma faixa de temperatura de 10°C a 90°C. Os resultados da detecção foram mostrados nas FIGs. 6A a 6H. Os resultados mostraram que todas es- sas VLPs formadas pelas proteínas tiveram termoestabilidade muito elevada. Exemplo 4: Avaliação 1 do título de anticorpo neutralizante no so- ro de camundongos vacinados com partículas semelhantes a ví- rus
[00118] A proteção imune das VLPs formadas por H18N65-45T1, H18N65-45T2, H18N65-45T3, H18N65-45T4, H18N65-45T5, H18N65- 45T3-59S1, H18N65-45T3-59S2, H18N65-45T3-59S4, H18N65-45T3- 59S5, H18N65-45T4-59S1, H18N65-45T4-59S2, H18N65-45T4-59S3, H18N65-45T4-59S5, H18N65-45T1-59S5, H18N65-45T2-59S5 e H18N65-45T1T3-59S5 foi avaliada em camundongos. Os animais para vacinação foram camundongos BALB/c (categoria normal), de 5 a 6 semanas de idade (adquirido da Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. LTD.).
[00119] As VLP da H18N65-45T1, VLP da H18N65-45T2, VLP da H18N65-45T3, VLP da H18N65-45T4, VLP da H18N65-45T5, VLP do HPV18N65, VLP do HPV45N27 e uma VLP do HPV18/HPV45 misturados (isto é, uma mistura de VLP do HPV18N65 e VLP do HPV45N27) conforme preparadas acima foram absorvidas em adju- vante de alumínio, respectivamente. Os camundongos foram divididos em 8 grupos dependendo do imunógeno, e cada grupo incluiu 5 ca- mundongos. O procedimento de vacinação foi o seguinte: a primeira vacinação na semana 0 e a vacinação de reforço nas semanas 2 e 4, respectivamente. Os camundongos foram vacinados por meio de inje- ção intraperitoneal. Os imunógenos e suas doses foram mostrados na Tabela 4. Na semana 8 após a primeira vacinação, o sangue venoso foi coletado do globo ocular e o soro foi separado.
Os títulos de anti- corpos neutralizantes no soro foram determinados.
O resultado de de- tecção foi mostrado na FIG. 7A.
O resultado mostrou que as VLP da H18N65-45T1, VLP da H18N65-45T2, VLP da H18N65-45T3 e VLP da H18N65-45T4 cada um reteve a atividade que pode induzir a gera- ção de anticorpos neutralizantes de alto título contra o HPV18 em ca- mundongos, e seus efeitos protetores contra o HPV18 eram compará- veis com aqueles da VLP do HPV18N65 isoladamente e da VLP do HPV18/HPV45 misturados, e suas atividades que podem induzir a ge- ração de anticorpos neutralizantes contra o HPV45 em camundongos foram maiores do que aquelas da VLP do HPV18N65 isoladamente.
Em particular, a VLP da H18N65-45T3 e a VLP da H18N65-45T4 cada uma pode induzir a geração de anticorpos neutralizantes de alto título contra o HPV45 e o HPV18 em camundongos; e os seus efeitos prote- tores contra o HPV18 foram comparáveis com aqueles da VLP do HPV18N65 isoladamente e aqueles da VLP do HPV18/HPV45 mistu- rados, e foram significativamente maiores do que aqueles da VLP do HPV45N27 isoladamente; e seus efeitos protetores contra o HPV45 foram comparáveis com aqueles da VLP do HPV45N27 isoladamente e aqueles da VLP do HPV18/HPV45 misturados, e foram significativa- mente maiores do que aqueles da VLP do HPV18N65 isoladamente.
Isso mostrou que após a mutação, a VLP da H18N65-45T1, a VPL da H18N65-45T2, a VLP da H18N65-45T3 e a VLP da H18N65-45T4 mantiveram sua imunogenicidade contra o HPV18, e a sua imunogeni- cidade contra o HPV45 também melhorou em comparação com a VLP do HPV18N65. Especialmente, a VLP da H18N65-45T3 e a VLP da H18N65-45T4 tinham boas imunogenicidade cruzada e proteção cru- zada contra o HPV18 e o HPV45, e podem ser utilizadas como vacinas eficazes para prevenir a infecção por HPV18 e/ou a infecção por HPV45, e podem ser utilizadas no lugar de uma vacina misturada compreendendo a VLP do HPV18 e a VLP do HPV45. Tabela 4. Cronograma de vacinação Antígeno para vacina- Dose de imuni- Procedimento de vacina- Adjuvante Número ção zação ção (semana) adjuvante de VLP da H18N65-45T1 5 μg 5 0, 2, 4 alumínio adjuvante de VLP da H18N65-45T2 5 μg 5 0, 2, 4 alumínio adjuvante de VLP da H18N65-45T3 5 μg 5 0, 2, 4 alumínio adjuvante de VLP da H18N65-45T4 5 μg 5 0, 2, 4 alumínio adjuvante de VLP da H18N65-45T5 5 μg 5 0, 2, 4 alumínio adjuvante de VLP do HPV18N65 5 μg 5 0, 2, 4 alumínio adjuvante de VLP do HPV45N27 5 μg 5 0, 2, 4 alumínio VLP do adjuvante de 5 μg para cada 5 0, 2, 4 HPV18/HPV45 alumínio VLP
[00120] Além disso, as VLP da H18N65-45T3-59S1, VLP da H18N65-45T3-59S2, VLP da H18N65-45T3-59S4, VLP da H18N65- 45T3-59S5, VLP da H18N65-45T4-59S1, VLP da H18N65-45T4- 59S2, VLP da H18N65-45T4-59S3, VLP da H18N65-45T4-59S5, VLP do HPV18N65, VLP do HPV45N27, VLP do HPV59 e VLP dos HPV18/HPV45/HPV59 misturados (isto é, uma mistura de VLP do HPV18N65, VLP do HPV45N27 e VLP do HPV59 VLP) conforme preparadas acima foram absorvidas em adjuvante de alumínio, respectivamente. Os camundongos foram divididos em 12 grupos de- pendendo do imunógeno e cada grupo incluiu 5 camundongos. O pro- cedimento de vacinação foi o seguinte: a primeira vacinação na sema- na 0 e a vacinação de reforço nas semanas 2 e 4, respectivamente. Os camundongos foram vacinados por meio de injeção intraperitoneal. Os imunógenos e suas doses foram mostrados na Tabela 5. Na se-
mana 8 após a primeira vacinação, o sangue venoso foi coletado do globo ocular e o soro foi separado.
Os títulos de anticorpos neutrali- zantes no soro foram determinados.
O resultado da detecção foi mos- trado na FIG. 7B.
O resultado mostrou que a VLP da H18N65-45T3- 59S1 e a VLP da H18N65-45T4-59S1 cada uma pode induzir a gera- ção de anticorpos neutralizantes de alto título contra HPV18, HPV45 e HPV59 em camundongos; e seus efeitos protetores contra o HPV18 foram comparáveis com aqueles da VLP do HPV18N65 isoladamente e com aqueles da VLP dos HPV18/HPV45/HPV59 misturados, e foram significativamente maiores do que aqueles da VLP do HPV45N27 iso- ladamente e aqueles da VLP do HPV59 isoladamente; e seus efeitos protetores contra o HPV45 foram comparáveis com aqueles da VLP do HPV45N27 isoladamente e com aqueles da VLP dos HPV18/HPV45/HPV59 misturados, e foram significativamente maiores do que aqueles da VLP do HPV18N65 isoladamente e aqueles da VLP do HPV59 isoladamente; e seus efeitos protetores contra o HPV59 fo- ram comparáveis com aqueles da VLP do HPV59 isoladamente e aqueles da VLP dos HPV18/HPV45/HPV59 misturados, e foram signi- ficativamente maiores do que aqueles da VLP do HPV45N27 isolada- mente e da VLP do HPV18N65 isoladamente.
Isso mostrou que a VLP da H18N65-45T3-59S1 e a VLP da H18N65-45T4-59S1 tinham boas imunogenicidade cruzada e proteção cruzada contra HPV18, HPV45 e HPV59, e puderam ser utilizadas como vacinas eficazes para a pre- venção da infecção por HPV18, infecção por HPV45 e/ou infecção por HPV59, e puderam ser utilizadas no lugar de uma vacina misturada compreendendo a VLP do HPV18, a VLP do HPV45 e a VLP do HPV59. Tabela 5. Cronograma de vacinação Dose de imu- Procedimento de vaci- Antígeno para vacinação Adjuvante Número nização nação (semana) VLP da H18N65-45T3- adjuvante 5 μg 5 0, 2, 4
59S1 de alumínio VLP da H18N65-45T3- adjuvante 5 μg 5 0, 2, 4 59S2 de alumínio VLP da H18N65-45T3- adjuvante 5 μg 5 0, 2, 4 59S4 de alumínio VLP da H18N65-45T3- adjuvante 5 μg 5 0, 2, 4 59S5 de alumínio VLP da H18N65-45T4- adjuvante 5 μg 5 0, 2, 4 59S1 de alumínio VLP da H18N65-45T4- adjuvante 5 μg 5 0, 2, 4 59S2 de alumínio VLP da H18N65-45T4- adjuvante 5 μg 5 0, 2, 4 59S3 de alumínio VLP da H18N65-45T4- adjuvante 5 μg 5 0, 2, 4 59S5 de alumínio adjuvante VLP do HPV18N65 5 μg 5 0, 2, 4 de alumínio adjuvante VLP do HPV45N27 5 μg 5 0, 2, 4 de alumínio adjuvante VLP do HPV59 5 μg 5 0, 2, 4 de alumínio VLP dos adjuvante 5 μg para ca- 5 0, 2, 4 HPV18/HPV45/HPV59 de alumínio da VLP Exemplo 5: Avaliação da ED50 de partículas semelhantes a vírus para induzir soroconversão
[00121] Neste experimento, as partículas semelhantes a vírus utili- zadas foram VLP da H18N65-45T3-59S1, VLP da H18N65-45T4- 59S1 e VLP da H18N65-45T1T3-59S5.
[00122] Camundongos BalB/c fêmeas de 6 semanas de idade (8 camundongos) foram vacinados com adjuvante de alumínio através da injeção intraperitoneal única, em que a VLP da H18N65-45T3-59S1, a VLP da H18N65-45T4-59S1 ou a VLP da H18N65-45T1T3-59S5 (em uma dose de imunização de 0,300 μg, 0,100 μg, 0,033 μg, 0,011 μg ou 0,004 μg) foi utilizada nos grupos experimentais e a VLP do HPV45N27 isoladamente, a VLP do HPV18N65 isoladamente, a
VLP do HPV59 isoladamente (em um dose de imunização de 0,300 μg, 0,100 μg, 0,033 μg, 0,011 μg ou 0,004 μg) ou a VLP dos HPV18/HPV45/HPV59 misturados (isto é, uma mistura de VLP do HPV18N65, VLP do HPV45N27 e VLP do HPV59, em uma dose de imunização de 0,300 μg, 0,100 μg, 0,033 μg, 0,011 μg ou 0,004 μg para cada VLP) foi utilizada nos grupos de controle; o volume de imu- nização foi de 1 ml.
Além disso, o diluente utilizado para diluir a vacina foi utilizado como um controle em branco. 8 camundongos foram vaci- nados em cada grupo, e na semana 5 após a vacinação, o sangue ve- noso foi coletado do globo ocular.
Anticorpos contra o HPV no soro foram detectados, e pelo método de Reed-Muench (Reed LJ MH.
A simple method of estimating fifty percent endpoints.
Am J Hyg. 1938; 27:493-7), a ED50 para induzir a soroconversão (isto é, induzir a geração de anticorpos em camundongos) foi calculada para cada amostra.
Os resultados foram apresentados nas Tabelas 6 a 12. Tabela 6. ED50 da VLP do HPV18N65 para induzir a geração de anti- corpos contra HPV45, HPV18 e HPV59 (soroconversão) em camun- dongos Número de Taxa de Dose de Número total camundon- conver- ED50 Tipo imuniza- de camun- gos com são posi- (μg) ção (μg) dongos conversão tiva positiva 0,300 8 6 83,33% 0,100 8 3 36,36% HPV1 0,13 0,033 8 1 6,67% 8 8 0,011 8 0 0,00% 0,004 8 0 0,00% HPV4 0,300 8 0 100,00% >0,3 5 0,100 8 0 100,00%
0,033 8 0 90,00% 0,011 8 0 22,22% 0,004 8 0 0,00% 0,300 8 0 0,00% 0,100 8 0 0,00% HPV5 0,033 8 0 0,00% >0,3 9 0,011 8 0 0,00% 0,004 8 0 0,00% Tabela 7. ED 50 da VLP do HPV45N27 para induzir a geração de anticorpos contra HPV45, HPV18 e HPV59 (soroconversão) em camundongos Número de Taxa de Dose de Número total camundon- conver- ED50 Tipo imuniza- de camun- gos com são posi- (μg) ção (μg) dongos conversão tiva positiva 0,300 8 0 0,00% 0,100 8 0 0,00% HPV1 0,033 8 0 0,00% >0,3 8 0,011 8 0 0,00% 0,004 8 0 0,00% 0,300 8 7 95,83% 0,100 8 8 94,12% HPV4 0,02 0,033 8 7 80,00% 5 1 0,011 8 1 10,00% 0,004 8 0 0,00% 0,300 8 0 0,00% HPV5 0,100 8 0 0,00% >0,3 9 0,033 8 0 0,00%
0,011 8 0 0,00% 0,004 8 0 0,00% Tabela 8. ED 50 da VLP do HPV59 para induzir a geração de anti- corpos contra HPV45, HPV18 e HPV59 (soroconversão) em ca- mundongos Número de Taxa de Dose de Número total camundon- conver- ED50 Tipo imuniza- de camun- gos com são posi- (μg) ção (μg) dongos conversão tiva positiva 0,300 8 0 0,00% 0,100 8 0 0,00% HPV1 0,033 8 0 0,00% >0,3 8 0,011 8 0 0,00% 0,004 8 0 0,00% 0,300 8 0 0,00% 0,100 8 0 0,00% HPV4 0,033 8 0 0,00% >0,3 5 0,011 8 0 0,00% 0,004 8 0 0,00% 0,300 8 8 100,00% 0,100 8 8 100,00% HPV5 0,02 0,033 8 4 55,56% 9 9 0,011 8 1 8,33% 0,004 8 0 0,00% Tabela 9. ED 50 da VLP dos HPV18/HPV45/HPV59 misturados para induzir a geração de anticorpos contra HPV45, HPV18 e HPV59 (soroconversão) em camundongos Tipo Dose de Número total Número de Taxa de ED50 imuniza- de camun- camundon- conver- (μg) ção (μg) dongos gos com são posi- conversão tiva positiva 0,300 μg para cada 8 VLP 6 86,67% 0,100 μg para cada 8 VLP 4 53,85% 0,033 μg HPV1 0,08 para cada 8 8 8 VLP 3 21,43% 0,011 μg para cada 8 VLP 0 0,00% 0,004 μg para cada 8 VLP 0 0,00% 0,300 μg para cada 8 VLP 6 88,24% 0,100 μg para cada 8 HPV4 0,03 VLP 6 69,23% 5 3 0,033 μg para cada 8 VLP 3 25,00% 0,011 μg 8 para cada 0 0,00%
VLP 0,004 μg para cada 8 VLP 0 0,00% 0,300 μg para cada 8 VLP 6 91,30% 0,100 μg para cada 8 VLP 8 88,24% 0,033 μg HPV5 0,02 para cada 8 9 5 VLP 6 63,64% 0,011 μg para cada 8 VLP 1 8,33% 0,004 μg para cada 8 VLP 0 0,00% Tabela 10. ED 50 da VLP da H18N65-45T3-59S1 para induzir a ge- ração de anticorpos contra HPV45, HPV18 e HPV59 (soroconver- são) em camundongos Dose de imuni- Número total de Número de camundongos Taxa de con- ED50 Tipo zação (μg) camundongos com conversão positiva versão positiva (μg) 0,300 8 7 94,12% 0,100 8 7 81,82% HPV18 0,033 8 2 20,00% 0,057 0,011 8 0 0,00% 0,004 8 0 0,00% 0,300 8 2 53,85% 0,100 8 4 33,33% HPV45 0,033 8 1 5,56% 0,244 0,011 8 0 0,00% 0,004 8 0 0,00%
0,300 8 7 90,91% 0,100 8 0 25,00% HPV59 0,033 8 2 16,67% 0,152 0,011 8 1 4,35% 0,004 8 0 0,00%
Tabela 11. ED 50 da VLP da H18N65-45T4-59S1 para induzir a ge- ração de anticorpos contra HPV45, HPV18 e HPV59 (soroconver- são) em camundongos Dose de imuni- Número total de Número de camundongos Taxa de con- ED50 Tipo zação (μg) camundongos com conversão positiva versão positiva (μg) 0,300 8 6 75,00% 0,100 8 0 0,00% HPV18 0,033 8 0 0,00% 0,208 0,011 8 0 0,00% 0,004 8 0 0,00% 0,300 8 4 55,56% 0,100 8 0 7,69% HPV45 0,033 8 1 5,00% 0,264 0,011 8 0 0,00% 0,004 8 0 0,00% 0,300 8 6 77,78% 0,100 8 1 10,00% HPV59 0,033 8 0 0,00% 0,191 0,011 8 0 0,00% 0,004 8 0 0,00%
Tabela 12. ED 50 da VLP da H18N65-45T1T3-59S5 para induzir a geração de anticorpos contra HPV45, HPV18 e HPV59 (sorocon- versão) em camundongos Dose de imuni- Número total de Número de camundongos Taxa de conver- ED50 Tipo zação (μg) camundongos com conversão positiva são positiva (μg) 0,300 8 8 100,00% 0,100 8 5 70,00% HPV18 0,033 8 2 18,18% 0,065 0,011 8 0 0,00% 0,004 8 0 0,00% 0,300 8 8 100,00% 0,100 8 3 54,55% HPV45 0,033 8 2 21,43% 0,086 0,011 8 1 5,26% 0,004 8 0 0,00% 0,300 8 8 100,00% HPV59 0,100 8 3 37,50% 0,125 0,033 8 0 0,00%
0,011 8 0 0,00% 0,004 8 0 0,00%
[00123] Os resultados mostraram que 5 semanas após a vacina- ção de camundongos, a ED50 da VLP da H18N65-45T3-59S1, VLP da H18N65-45T4-59S1 e VLP da H18N65-45T1T3-59S5 para indu- zir a geração de anticorpos contra HPV18 em camundongos foi comparável com aquela de VLP do HPV18N65 isoladamente e aquela da VLP dos HPV18/HPV45/HPV59 misturados, e foi signifi- cativamente superior àquela da VLP do HPV45N27 isoladamente e àquela de VLP do HPV59 isoladamente; e a ED50 da VLP da H18N65-45T3-59S1, VLP da H18N65-45T4-59S1 e VLP da H18N65-45T1T3-59S5 para induzir a geração de anticorpos contra HPV45 em camundongos foi comparável com aquela da VLP do HPV45N27 isoladamente e aquela da VLP dos HPV18/HPV45/HPV59 misturados, e foi significativamente superior àquela da VLP do HPV18N65 isoladamente e àquela da VLP do HPV59 isoladamente; e a ED50 da VLP da H18N65-45T3-59S1, VLP da H18N65-45T4-59S1 e VLP da H18N65-45T1T3-59S5 para induzir a geração de anticorpos contra HPV59 em camundongos foi comparável com aquela da VLP do HPV59 isoladamente e aquela da VLP dos HPV18/HPV45/HPV59 misturados, e foi significativa- mente superior àquela da VLP do HPV45N27 isoladamente e àque- la da VLP do HPV18N65 isoladamente. Isto mostrou que a VLP da H18N65-45T3-59S1, a VLP da H18N65-45T4-59S1 e a VLP da H18N65-45T1T3-59S5 tiveram boas imunogenicidade cruzada e proteção cruzada contra HPV18, HPV45 e HPV59. Exemplo 6: Avaliação 2 do título de anticorpo neutralizante no so- ro de camundongos vacinados com partículas semelhantes a ví- rus
[00124] Neste experimento, a partícula semelhante a vírus utilizada foi a VLP da H18N65-45T4.
[00125] Neste experimento, o esquema de vacinação foi mostrado na Tabela 13. Todos os camundongos (camundongos BalB/c fêmeas com 6 semanas de idade) foram divididos em 2 grupos: Grupo de dose de 10 μg (em uma dose de imunização de 10 μg, utilizando adjuvante de alumínio), e Grupo de dose de 1 μg (em uma dose de imunização de 1 μg, utilizando adjuvante de alumínio). Cada grupo foi ainda dividi- do em 5 subgrupos. Os subgrupos de controle 1 e 2 foram vacinados com VLP do HPV45N27 isoladamente e VLP do HPV18N65 isolada- mente, respectivamente, o subgrupo de controle 3 foi vacinado com a VLP dos HPV18/HPV45 misturados (isto é, uma mistura de VLP do HPV18N65 e VLP do HPV45N27, em uma determinada dose de imu- nização para cada VLP), e o subgrupo Experimental foi vacinado com a VLP da H18N65-45T4.
[00126] 6 Camundongos/subgrupo foram vacinados por injeção in- traperitoneal, em uma dose de imunização de 10 μg e 1 μg, respecti- vamente, e um volume de injeção de 1 ml. Todos os camundongos foram submetidos à primeira vacinação na semana 0 e, depois, sub- metidos à vacinação de reforço nas semanas 2 e 4, respectivamente. Na semana 8, a amostra de sangue foi coletada por meio de sangra- mento orbital e os títulos de anticorpos contra HPV18 e HPV45 no soro foram analisados. Os resultados da análise foram mostrados nas FIGs. 8A a 8B. O resultado mostrou que a VLP da H18N65-45T4 poderia in- duzir a geração de anticorpos neutralizantes de alto título contra HPV18 em camundongos, e seu efeito protetor era comparável àquele da VLP do HPV18N65 isoladamente e da VLP dos HPV18/HPV45 mis- turados na mesma dose, e foi significativamente superior àquele da VLP do HPV45N27 isoladamente na mesma dose; e poderia induzir a geração de anticorpos neutralizantes de alto título contra HPV45 em camundongos, e seu efeito protetor foi comparável com aquele da VLP do HPV45N27 isoladamente e da VLP dos HPV18/HPV45 misturados na mesma dose, e foi significativamente superior àquele da VLP do HPV18N65 isoladamente na mesma dose. Isso mostrou que a VLP da H18N65-45T4 tinha boas imunogenicidade cruzada e proteção cruza- da contra HPV18 e HPV45. Tabela 13. Cronograma de vacinação Antígeno para Dose de imu- Procedimento de Grupo Adjuvante Número vacinação nização vacinação (semana) VLP do adjuvante de 10 μg 6 0, 2, 4 HPV18N65 alumínio VLP do adjuvante de Grupo de 10 μg 6 0, 2, 4 HPV45N27 alumínio dose de 10 VLP do adjuvante de 10 μg para μg 6 0, 2, 4 HPV18/HPV45 alumínio cada VLP VLP do H18N65- adjuvante de 10 μg 6 0, 2, 4 45T4 alumínio VLP do adjuvante de 1 μg 6 0, 2, 4 HPV18N65 alumínio VLP do adjuvante de Grupo de 1 μg 6 0, 2, 4 HPV45N27 alumínio dose de 1 VLP do adjuvante de 1 μg para μg 6 0, 2, 4 HPV18/HPV45 alumínio cada VLP VLP do H18N65- adjuvante de 1 μg 6 0, 2, 4 45T4 alumínio Exemplo 7: Avaliação 3 do título de anticorpo neutralizante no so- ro de camundongos vacinados com partículas semelhantes a ví- rus
[00127] Nestes experimentos, as partículas semelhantes a vírus utilizadas foram VLP da H18N65-45T3-59S1, VLP da H18N65-45T4- 59S1, VLP da H18N65-45T1-59S5, VLP da H18N65-45T2-59S5 e VLP da H18N65-45T1T3-59S5.
[00128] Neste experimento, o esquema de vacinação foi mostra- do na Tabela 14. Todos os camundongos (camundongos BalB/c fêmeas com 6 semanas de idade) foram divididos em 2 grupos: Grupo de dose de 10 μg (em uma dose de imunização de 10 μg,
utilizando o adjuvante de alumínio), e Grupo de dose de 1 μg (em uma dose de imunização de 1 μg, utilizando o adjuvante de alumí- nio). Cada grupo foi ainda dividido em 9 subgrupos. Os subgrupos de controle 1, 2 e 3 foram vacinados com VLP do HPV18N65 isola- damente, VLP do HPV45N27 isoladamente e VLP do HPV59 isola- damente, respectivamente, o subgrupo de controle 4 foi vacinado com a VLP dos HPV18/HPV45/HPV59 misturados (isto é, uma mis- tura de VLP do HPV18N65, VLP do HPV45N27 e VLP do HPV59, em uma determinada dose de imunização para cada VLP), e os subgrupos experimentais 1, 2, 3, 4 e 5 foram vacinados com VLP da H18N65-45T3-59S1, VLP da H18N65-45T4-59S1, VLP da H18N65-45T1-59S5, VLP da H18N65-45T2-59S5 e VLP da H18N65-45T1T3-59S5, respectivamente.
[00129] 6 Camundongos/subgrupo foram vacinados através da injeção intraperitoneal, em uma dose de imunização de 10 μg e 1 μg, respectivamente, e um volume de injeção de 1 ml. Todos os camundongos foram submetidos à primeira vacinação na semana 0, e depois submetidos à vacinação de reforço nas semanas 2 e 4, respectivamente. Na semana 8, a amostra de sangue foi coletada por meio de sangramento orbital, e os títulos de anticorpos contra HPV18, HPV45 e HPV59 no soro foram analisados. Os resultados de análise foram mostrados nas FIGs. 8C-8D. O resultado mostrou que a VLP da H18N65-45T3-59S1, a VLP da H18N65-45T4-59S1, a VLP da H18N65-45T1-59S5, a VLP da H18N65-45T2-59S5 e a VLP da H18N65-45T1T3-59S5 podem induzir a geração de anticor- pos neutralizantes de alto título contra HPV18 em camundongos, e seus efeitos protetores foram comparáveis com aqueles da VLP do HPV18N65 isoladamente e aqueles da VLP dos HPV18/HPV45/HPV59 misturados na mesma dose, e foram signifi- cativamente superiores àqueles da VLP do HPV45N27 isoladamen-
te ou àqueles da VLP do HPV59 isoladamente na mesma dose; e a VLP da H18N65-45T3-59S1, a VLP da H18N65-45T4-59S1, a VLP da H18N65-45T1-59S5, a VLP da H18N65-45T2-59S5 e a VLP da H18N65-45T1T3-59S5 podem induzir a geração de anticorpos neu- tralizantes de alto título contra HPV45 em camundongos, e seus efeitos protetores foram comparáveis com aqueles da VLP do HPV45N27 isoladamente e aqueles da VLP dos HPV18/HPV45/HPV59 misturados na mesma dose, e foram signifi- cativamente superiores àqueles da VLP do HPV18N65 isoladamen- te ou àqueles da VLP do HPV59 isoladamente na mesma dose; e a VLP da H18N65-45T3-59S1, a VLP da H18N65-45T4-59S1, a VLP da H18N65-45T1-59S5, a VLP da H18N65-45T2-59S5 e a VLP da H18N65-45T1T3-59S5 podem induzir a geração de anticorpos neu- tralizantes de alto título contra HPV59 em camundongos, e seus efeitos protetores foram comparáveis com aqueles da VLP do HPV59 isoladamente ou aqueles da VLP dos HPV18/HPV45/HPV59 misturados na mesma dose, e foram signifi- cativamente superiores àqueles da VLP do HPV18N65 isoladamen- te ou àqueles da VLP do HPV45N27 isoladamente na mesma dose.
Isto mostrou que a VLP da H18N65-45T3-59S1, a VLP da H18N65- 45T4-59S1, a VLP da H18N65-45T1-59S5, a VLP da H18N65- 45T2-59S5 e a VLP da H18N65-45T1T3-59S5 tiveram boas imuno- genicidade cruzada e proteção cruzada contra HPV18, HPV45 e HPV59. Tabela 14. Cronograma de vacinação Procedimento de Antígeno para vacina- Dose de Grupo Adjuvante Número vacinação (sema- ção imunização na) adjuvante Grupo de VLP do HPV18N65 10μg 6 0, 2, 4 de alumínio dose de adjuvante 10 μg VLP do HPV45N27 10μg 6 0, 2, 4 de alumínio adjuvante VLP do HPV59 10μg 6 0, 2, 4 de alumínio VLP dos adjuvante 10μg para 6 0, 2, 4 HPV18/HPV45/HPV59 de alumínio cada VLP VLP da H18N65-45T3- adjuvante 10μg 6 0, 2, 4 59S1 de alumínio VLP da H18N65-45T4- adjuvante 10μg 6 0, 2, 4 59S1 de alumínio VLP da H18N65-45T1- adjuvante 10μg 6 0, 2, 4 59S5 de alumínio VLP da H18N65-45T2- adjuvante 10μg 6 0, 2, 4 59S5 de alumínio VLP da H18N65- adjuvante 10μg 6 0, 2, 4 45T1T3-59S5 de alumínio adjuvante VLP do HPV18N65 1μg 6 0, 2, 4 de alumínio adjuvante VLP do HPV45N27 1μg 6 0, 2, 4 de alumínio adjuvante VLP do HPV59 1μg 6 0, 2, 4 de alumínio VLP dos adjuvante 1μg para 6 0, 2, 4 HPV18/HPV45/HPV59 de alumínio cada VLP Grupo de VLP da H18N65-45T3- adjuvante dose de 1μg 6 0, 2, 4 59S1 de alumínio 1 μg VLP da H18N65-45T4- adjuvante 1μg 6 0, 2, 4 59S1 de alumínio VLP da H18N65-45T1- adjuvante 1μg 6 0, 2, 4 59S5 de alumínio VLP da H18N65-45T2- adjuvante 1μg 6 0, 2, 4 59S5 de alumínio VLP da H18N65- adjuvante 1μg 6 0, 2, 4 45T1T3-59S5 de alumínio
[00130] Embora as modalidades específicas da presente invenção tenham sido descritas com detalhes, aqueles versados na técnica en- tenderiam que, de acordo com os ensinamentos divulgados no relató- rio descritivo, várias modificações e mudanças podem ser feitas nas mesmas, e que tais modificações e mudanças estão dentro do escopo da presente invenção.
O escopo da presente invenção é dado pelas reivindicações anexas e qualquer um de seus equivalentes.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES
1. Proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma caracterizada pelo fato de que em comparação com uma pro- teína L1 do HPV18 do tipo selvagem, (I) a proteína L1 do HPV18 com mutação possui as seguintes mutações: (1) truncamento N-terminal de 40 a 80 aminoácidos; e (2) (a) substituição de resíduos de aminoácido nas posições 235 a 243 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de aminoácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um segundo tipo de HPV do tipo selvagem; ou (b) substituição de resíduos de aminoácido nas posições 327 a 346 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de ami- noácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um se- gundo tipo de HPV do tipo selvagem; ou (c) substituição de resíduos de aminoácido nas posições 114 a 123 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de ami- noácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um se- gundo tipo de HPV do tipo selvagem; ou (d) substituição de resíduos de aminoácidos nas posições 176 a 202 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de ami- noácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um se- gundo tipo de HPV do tipo selvagem, ou, (II) a proteína L1 do HPV18 com mutação possui as mutações conforme definidas em (1) e (2) (a), e ainda possui a seguinte muta- ção: (3) substituição de resíduos de aminoácidos nas posições 112 a 123 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de ami- noácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um ter-
ceiro tipo de HPV do tipo selvagem; ou, (III) a proteína L1 do HPV18 com mutação possui as mutações conforme definidas em 1 e (2) (b), e ainda possui a seguinte mutação: (3) substituição de resíduos de aminoácidos nas posições 112 a 123 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de ami- noácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um ter- ceiro tipo de HPV do tipo selvagem; ou, (IV) a proteína L1 do HPV18 com mutação possui as mutações conforme definidas em 1 e (2) (c), e ainda possui a seguinte mutação: (4) substituição de resíduos de aminoácido nas posições 410 a 421 da proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem com resíduos de ami- noácido nas posições correspondentes de uma proteína L1 de um ter- ceiro tipo de HPV do tipo selvagem; ou, (V) a proteína L1 do HPV18 com mutação possui as mutações conforme definidas em (1) e (2) (d), e ainda possui a mutação como definida em (4); (VI) a proteína L1 do HPV18 com mutação possui as mutações conforme definidas em (1) e (2) (c) e (2) (a), e opcionalmente, ainda possui a mutação como definida em (4); e, a variante difere da proteína L1 do HPV18 com mutação ape- nas pela substituição, adição ou supressão de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 aminoácidos, e retém a função da proteína L1 do HPV18 com muta- ção, isto é, a capacidade de induzir a geração de anticorpos neutrali- zantes contra pelo menos dois tipos de HPV.
2. Proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína L1 do HPV18 com mutação possui 45, 50, 52, 55, 58,
60, 62, 65, 68, 70, 72, 75 ou 78 aminoácidos truncados no N-terminal, em comparação com a proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem.
3. Proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o segundo tipo de HPV do tipo selvagem é HPV45; de preferência, os resíduos de aminoácido nas posições corres- pondentes conforme descrito em (2) (a) são resíduos de aminoácido nas posições 201 a 209 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selva- gem; de preferência, os resíduos de aminoácido nas posições corres- pondentes conforme descrito em (2) (b) são resíduos de aminoácido nas posições 293 a 314 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selva- gem; de preferência, os resíduos de aminoácido nas posições corres- pondentes conforme descrito em (2) (c) são resíduos de aminoácido nas posições 79 a 89 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem; de preferência, os resíduos de aminoácido nas posições corres- pondentes conforme descrito em (2) (d) são resíduos de aminoácido nas posições 142 a 168 de uma proteína L1 do HPV45 do tipo selva- gem.
4. Proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, carac- terizada pelo fato de que o terceiro tipo de HPV do tipo selvagem é HPV59; de preferência, os resíduos de aminoácido nas posições corres- pondentes conforme descrito em (3) são resíduos de aminoácido nas posições 51 a 62 de uma proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem; de preferência, os resíduos de aminoácidos nas posições corres- pondentes conforme descrito em (4) são resíduos de aminoácido nas posições 349 a 360 de uma proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem.
5. Proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, carac- terizada pelo fato de que a proteína L1 do HPV18 com mutação se de- fine por um ou mais dos seguintes itens: (i) a proteína L1 do HPV18 do tipo selvagem possui uma sequên- cia de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 1; (ii) a proteína L1 do HPV45 do tipo selvagem possui uma se- quência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 2; (iii) a proteína L1 do HPV59 do tipo selvagem possui uma se- quência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 3.
6. Proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, carac- terizada pelo fato de que a proteína L1 do HPV18 com mutação possui uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 6, 7, 9, 13 , 17, 18 e 19.
7. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que codifica a proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, de preferência, o ácido nucleico isolado possui uma sequência de nu- cleotídeo selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 25, 26, 28, 32, 36, 37 e 38.
8. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o áci- do nucleico isolado, como definido na reivindicação 7.
9. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende o ácido nucleico isolado, como definido na reivindicação 7 e/ou o vetor, como definido na reivindicação 8.
10. Partícula semelhante a vírus HPV, caracterizada pelo fato de que compreende ou consiste em proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
11. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de a proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou o ácido nucleico isolado, como definido na reivindicação 7, ou o vetor, como definido na reivindicação 8, ou a célula hospedeira, como definida na reivindicação 9, ou a partícula semelhante a vírus HPV, como definida na reivindicação 10.
12. Composição farmacêutica ou vacina, caracterizada pelo fato de que compreende a partícula semelhante a vírus HPV, como definida na reivindicação 10, e, opcionalmente, um veículo e/ou excipi- ente farmaceuticamente aceitável, de preferência, a partícula semelhante a vírus HPV está presente em uma quantidade eficaz para prevenir a infecção por HPV ou uma doença provocada pela infecção por HPV; de preferência, a infecção por HPV é infecção por um ou mais tipos de HPV; de preferência, a infecção por HPV é selecionada de: infecção por HPV18, infecção por HPV45, infecção por HPV59 e qualquer uma de suas combinações; de preferência, a doença provocada pela infecção por HPV é selecio- nada do grupo que consiste em câncer cervical e condyloma acumina- tum.
13. Método para a preparação da proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compre- ende a expressão da proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma va- riante da mesma em uma célula hospedeira e, em seguida, a recupe- ração da proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma de uma cultura da célula hospedeira; de preferência, a célula hospedeira é E. coli;
de preferência, o método compreende as etapas de: expressar a proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma em E. coli, e depois obter a proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma va- riante da mesma através da purificação de um sobrenadante de lisado do E. coli; de preferência, recuperar a proteína L1 do HPV18 com mu- tação ou uma variante da mesma a partir do sobrenadante de lisado do E. coli por cromatografia; de preferência, a cromatografia é selecionada de: cromatografia de troca catiônica, cromatografia de hidroxiapatita, cromatografia de interação hidrofóbica, e qualquer uma de suas combinações.
14. Método para a preparação de uma vacina, caracteriza- do pelo fato de que compreende combinar a partícula semelhante a vírus HPV, como definida na reivindicação 10 com um veículo e/ou ex- cipiente farmaceuticamente aceitável.
15. Uso da proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma va- riante da mesma, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou da partícula semelhante a vírus HPV, como definida na rei- vindicação 10, caracterizado pelo fato de que o uso é na fabricação de uma composição farmacêutica ou vacina para prevenir a infecção por HPV ou uma doença provocada pela infecção por HPV, de preferência, a infecção por HPV é infecção por um ou mais tipos de HPV; de preferência, a infecção por HPV é selecionada de: infecção por HPV18, infecção por HPV45 e/ou infecção por HPV59, e qualquer uma de suas combinações; de preferência, a doença provocada pela infecção por HPV é se- lecionada do grupo que consiste em câncer cervical e condyloma acuminatum.
16. Proteína L1 do HPV18 com mutação ou uma variante da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou a partícula semelhante a vírus HPV, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que é para uso na prevenção da infecção por HPV ou uma doença provocada pela infecção por HPV, de preferência, a infecção por HPV é infecção por um ou mais tipos de HPV; de preferência, a infecção por HPV é selecionada de: infecção por HPV18, infecção por HPV45 e/ou infecção por HPV59, e qualquer uma de suas combinações; de preferência, a doença provocada pela infecção por HPV é se- lecionada do grupo que consiste em câncer cervical e condyloma acuminatum.
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