CN109251236B - 一种人乳头瘤病毒35型l1蛋白的突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种突变的HPV35 L1蛋白(或其变体)，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白(或其变体)和病毒样颗粒能够诱发抗至少两个型别的HPV(例如，HPV35和HPV16，或者HPV35、HPV16和HPV31)的中和抗体，从而可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。

Description

一种人乳头瘤病毒35型L1蛋白的突变体
技术领域
本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体地，本发明涉及一种突变的HPV35 L1蛋白(或其变体)，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白(或其变体)和病毒样颗粒能够诱发抗至少两个型别的HPV(例如，HPV35和HPV16，或者HPV35、HPV16和HPV31)的中和抗体，从而可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)主要引起皮肤和粘膜的疣状病变。根据其与肿瘤发生的关系，HPV可分为高危型与低危型，其中高危型的HPV感染被证实是诱发包括女性宫颈癌在内的生殖器癌症的主要原因；低危型则主要引起尖锐湿疣。预防与控制HPV感染的最有效方式是施用HPV疫苗，特别是针对能引起宫颈癌的高危型HPV的疫苗。
HPV的主要衣壳蛋白L1具有自组装为空心病毒样颗粒(Virus-Like Particle,VLP)的特性。HPV VLP是由72个主要衣壳蛋白L1的五聚体构成的20面体立体对称结构(Doorbar,J.and P.H.Gallimore.1987.J Virol,61(9):2793-9)。HPV VLP的结构与天然HPV高度相似，保留了天然病毒的绝大多数中和表位，可诱导高滴度的中和抗体(Kirnbauer，R.，F.Booy，et al.1992Proc Natl Acad Sci U S A 89(24):12180-4)。
然而，现有的研究显示，HPV VLP主要诱导针对同型HPV的中和抗体，产生针对同型HPV的保护性免疫，而仅在一些同源性高的型别之间存在低的交叉保护作用(SaraL.Bissett,Giada Mattiuzzo,et al.2014Vaccine.32:6548-6555)。因此，现有的HPV疫苗的保护范围非常有限。通常，一个型别的HPV VLP只能用于预防该型别的HPV感染。在这种情况下，如果要扩大HPV疫苗的保护范围，那就只能在疫苗中增加更多型别的HPV VLP。目前已上市的HPV疫苗，包括Merck公司的
Figure BDA0001729388540000021
(其为针对HPV16，18，6和11的四价疫苗)，GSK公司的
Figure BDA0001729388540000022
(其为针对HPV16，18的二价疫苗)和Merck公司的
Figure BDA0001729388540000023
9(其为九价疫苗)，均是通过混合多个型别的HPV VLP而制成。然而，这种方案将导致HPV疫苗的生产成本大大提高，并且可能因为免疫剂量的增加而导致潜在的安全性问题。
因此，本领域需要开发能够诱导针对多个型别的HPV的保护性中和抗体的HPV病毒样颗粒，以更经济、有效地预防多个型别的HPV感染和由此导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。
发明内容
本发明至少部分基于发明人的下述出人意料的发现：将人乳头瘤病毒(HPV)35型L1蛋白中的一个特定区段置换为第二型别的HPV(例如HPV16)L1蛋白的相应区段后，所获得的突变的HPV35 L1蛋白能够诱导机体产生针对HPV35和第二型别的HPV(例如HPV16)的高滴度中和抗体，其保护效果与混合的HPV35 VLP和第二型别的HPV VLP相当，并且其针对HPV35的保护效果与单独的HPV35VLP相当，且针对第二型别的HPV(例如HPV16)的保护效果与单独的第二型别的HPV VLP相当。
此外，在上述置换的基础上，还可以将HPV35 L1蛋白中的另一个特定区段进一步置换为第三型别的HPV(例如HPV31)L1蛋白的相应区段，由此所获得的含有双置换的突变的HPV35 L1蛋白能够诱导机体产生针对HPV35、第二型别的HPV(例如HPV16)和第三型别的HPV(例如HPV31)的高滴度中和抗体，其保护效果与混合的HPV35 VLP、第二型别的HPV VLP和第三型别的HPV VLP相当；并且，其针对HPV35的保护效果与单独的HPV35 VLP相当，针对第二型别的HPV(例如HPV16)的保护效果与单独的第二型别的HPV VLP相当，且针对第三型别的HPV(例如HPV31)的保护效果与单独的第三型别的HPV VLP相当。
因此，在一个方面，本发明提供了一种突变的HPV35 L1蛋白或其变体，其中，所述突变的HPV35 L1蛋白与野生型HPV35 L1蛋白相比，具有下述突变：
(1)(a)位于野生型HPV35 L1蛋白第50-61位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV的L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；或
(b)位于野生型HPV35 L1蛋白第266-288位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV的L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；
并且，所述变体与所述突变的HPV35 L1蛋白相异仅在于一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)氨基酸的置换(优选保守置换)、添加或缺失，且保留了所述突变的HPV35 L1蛋白的功能，即，能够诱导针对至少两个型别的HPV(例如，HPV35和HPV16，或者HPV35、HPV16和HPV31)的中和抗体。
在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV35 L1蛋白具有(1)(a)中所定义的突变，并且任选地，还具有下述突变：
(2)位于野生型HPV35 L1蛋白第126-139位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；
(3)位于野生型HPV35 L1蛋白第173-184位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；
(4)位于野生型HPV35 L1蛋白第260-288位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；或
(5)位于野生型HPV35 L1蛋白第346-356位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV35 L1蛋白具有(1)(b)中所定义的突变，并且任选地，还具有下述突变：
(6)位于野生型HPV35 L1蛋白第51-61位的氨基酸残基被替换为第三型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述第二型别的野生型HPV为HPV16。在某些优选的实施方案中，(1)(a)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV16 L1蛋白第76-87位的氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，(1)(b)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV16 L1蛋白第292-316位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述第三型别的野生型HPV为HPV31。在某些优选的实施方案中，(2)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV31 L1蛋白第127-140位的氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，(3)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV31L1蛋白第174-185位的氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，(4)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV31 L1蛋白第261-291位的氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，(5)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV31 L1蛋白第349-359位的氨基酸残基。在某些优选的实施方案中，(6)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV31 L1蛋白第51-62位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV35 L1蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV16 L1蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV31 L1蛋白具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV16 L1蛋白第76-87位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:33所示。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV16 L1蛋白第292-316位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:34所示。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV31 L1蛋白第127-140位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:35所示。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV31 L1蛋白第174-185位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:36所示。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV31 L1蛋白第261-291位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:37所示。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV31 L1蛋白第349-359位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:38所示。
在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV31 L1蛋白第51-62位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:39所示。
在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV35 L1蛋白具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、7、9、10、11、12或13。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码如上所述的突变的HPV35L1蛋白或其变体。在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含所述分离的核酸。在某些优选的实施方案中，本发明的分离的核酸具有选自下列的核苷酸序列：SEQ ID NO:20、23、25、26、27、28或29。
可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等等。
在另一个方面，本发明还涉及包含上述分离的核酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。
在另一个方面，本发明涉及一种HPV病毒样颗粒，其中该病毒样颗粒含有本发明的突变的HPV35 L1蛋白或其变体，或者由本发明的突变的HPV35 L1蛋白或其变体组成或形成。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV35 L1蛋白，其与野生型HPV35 L1蛋白相比，第50-61位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第76-87位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV35 L1蛋白，其与野生型HPV35 L1蛋白相比，第266-288位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第292-316位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV35 L1蛋白，其与野生型HPV35 L1蛋白相比，第50-61位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第76-87位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV35 L1蛋白第126-139位的氨基酸残基被替换为野生型HPV31 L1蛋白第127-140位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV35 L1蛋白，其与野生型HPV35 L1蛋白相比，第50-61位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第76-87位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV35 L1蛋白第173-184位的氨基酸残基被替换为野生型HPV31 L1蛋白第174-185位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV35 L1蛋白，其与野生型HPV35 L1蛋白相比，第50-61位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第76-87位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV35 L1蛋白第260-288位的氨基酸残基被替换为野生型HPV31 L1蛋白第261-291位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV35 L1蛋白，其与野生型HPV35 L1蛋白相比，第50-61位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第76-87位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV35 L1蛋白第346-356位的氨基酸残基被替换为野生型HPV31 L1蛋白第349-359位的氨基酸残基。
在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV35 L1蛋白，其与野生型HPV35 L1蛋白相比，第266-288位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第292-316位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV35 L1蛋白第51-61位的氨基酸残基被替换为野生型HPV31 L1蛋白第51-62位的氨基酸残基。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV35 L1蛋白，其具有SEQ ID NO:4、7、9、10、11、12或13所示的序列。
在另一个方面，本发明还涉及包含上述突变的HPV35 L1蛋白或其变体，或上述分离的核酸或载体或宿主细胞或HPV病毒样颗粒的组合物。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的突变的HPV35 L1蛋白或其变体。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的HPV病毒样颗粒。
在另一个方面，本发明还涉及一种药物组合物或疫苗，其包含本发明的HPV病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。本发明的药物组合物或疫苗可以用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。
在某些优选的实施方案中，所述HPV病毒样颗粒以预防HPV感染或由HPV感染导致的疾病的有效量存在。在某些优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV35感染、HPV16感染和/或HPV31感染)。在某些优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病选自宫颈癌和尖锐湿疣。
本发明的药物组合物或疫苗可通过本领域公知的方法进行施用，例如但不限于通过口服或者注射进行施用。在本发明中，特别优选的施用方式是注射。
在某些优选的实施方案中，本发明的药物组合物或疫苗以单位剂量形式进行施用。例如但不意欲限定本发明，每单位剂量中包含的HPV病毒样颗粒的量为5μg－80μg，优选20μg－40μg。
在另一个方面，本发明涉及一种制备如上所述的突变的HPV35L1蛋白或其变体的方法，其包括，在宿主细胞中表达所述突变的HPV35 L1蛋白或其变体，然后从所述宿主细胞的培养物中回收所述突变的HPV35 L1蛋白或其变体。
在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
在某些优选的实施方案中，所述方法包括步骤：在大肠杆菌中表达所述突变的HPV35 L1蛋白或其变体，然后从所述大肠杆菌的裂解上清中纯化得到所述突变的HPV35 L1蛋白或其变体。在某些优选的实施方案中，通过色谱法(例如，阳离子交换色谱，羟基磷灰石色谱和/或疏水相互作用色谱)，从所述大肠杆菌的裂解上清中回收所述突变的HPV35 L1蛋白或其变体。
在另一个方面，本发明涉及一种制备疫苗的方法，其包括将本发明的HPV病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合。
在另一个方面，本发明涉及一种预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病的方法，其包括将预防有效量的根据本发明的HPV病毒样颗粒或药物组合物或疫苗施用给受试者。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV35感染、HPV16感染和/或HPV31感染)。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，宫颈癌和尖锐湿疣。在另一个优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
在另一个方面，还涉及根据本发明的突变的HPV35 L1蛋白或其变体或HPV病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV35感染、HPV16感染和/或HPV31感染)。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，宫颈癌和尖锐湿疣。
本发明中相关术语的说明及解释
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
根据本发明，术语“第二型别的野生型HPV”是指，不同于HPV35的另一型别的野生型HPV。在本发明中，第二型别的野生型HPV优选为野生型HPV16。根据本发明，术语“第三型别的野生型HPV”是指，不同于HPV35，且不同于第二型别的野生型HPV的另一型别的野生型HPV。在本发明中，第三型别的野生型HPV优选为野生型HPV31。
根据本发明，表述“相应位置”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中的等同位置。
根据本发明，术语“野生型HPV35 L1蛋白”是指，天然存在于人乳头瘤病毒35型(HPV35)中的主要衣壳蛋白L1。野生型HPV35L1蛋白的序列是本领域公知的，并且可参见各种公共数据库(例如NCBI数据库登录号P27232.2、ACV84022.1、AEI61365.1、AEI61429.1和ACV84029.1)。
在本发明中，当提及野生型HPV35 L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO：1所示的序列来进行描述。例如，表述“野生型HPV35 L1蛋白的第50-61位氨基酸残基”是指，SEQID NO：1所示的多肽的第50-61位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，野生型HPV35可包括多种分离株，并且各种分离株的L1蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。进一步，本领域技术人员理解，尽管可能存在着序列差异，但是HPV35的不同分离株的L1蛋白在氨基酸序列上具有极高的同一性(通常高于95％，例如高于96％，高于97％，高于98％，或高于99％)，并且具有实质上相同的生物学功能。因此，在本发明中，术语“野生型HPV35 L1蛋白”不仅包括SEQ ID NO:1所示的蛋白，而且应包括各种HPV35分离株的L1蛋白(例如P27232.2、ACV84022.1、AEI61365.1、AEI61429.1和ACV84029.1所示的HPV35 L1蛋白)。并且，当描述野生型HPV35 L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：1的序列片段，还包括各种HPV35分离株的L1蛋白中的相应序列片段。例如，表述“野生型HPV35 L1蛋白的第50-61位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：1的第50-61位氨基酸残基，以及各种HPV35分离株的L1蛋白中的相应片段。
根据本发明，术语“野生型HPV16 L1蛋白”是指，天然存在于人乳头瘤病毒16型(HPV16)中的主要衣壳蛋白L1。野生型HPV16L1蛋白的序列是本领域公知的，并且可参见各种公共数据库(例如NCBI数据库登录号ANA05496.1，ANA05539.1，AGC65525.1，AAV91659.1和AAD33259.1)。
在本发明中，当提及野生型HPV16 L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO：2所示的序列来进行描述。例如，表述“野生型HPV16 L1蛋白的第76-87位氨基酸残基”是指，SEQID NO：2所示的多肽的第76-87位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，野生型HPV16可包括多种分离株，并且各种分离株的L1蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。进一步，本领域技术人员理解，尽管可能存在着序列差异，但是HPV16的不同分离株的L1蛋白在氨基酸序列上具有极高的同一性(通常高于95％，例如高于96％，高于97％，高于98％，或高于99％)，并且具有实质上相同的生物学功能。因此，在本发明中，术语“野生型HPV16 L1蛋白”不仅包括SEQ ID NO:2所示的蛋白，而且应包括各种HPV16分离株的L1蛋白(例如ANA05496.1，ANA05539.1，AGC65525.1，AAV91659.1和AAD33259.1所示的HPV16 L1蛋白)。并且，当描述野生型HPV16L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：2的序列片段，还包括各种HPV16分离株的L1蛋白中的相应序列片段。例如，表述“野生型HPV16 L1蛋白的第76-87位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：2的第76-87位氨基酸残基，以及各种HPV16分离株的L1蛋白中的相应片段。
根据本发明，术语“野生型HPV31 L1蛋白”是指，天然存在于人乳头瘤病毒31型(HPV31)中的主要衣壳蛋白L1。野生型HPV31 L1蛋白的序列是本领域公知的，并且可参见各种公共数据库(例如NCBI数据库登录号P17388.1、AEI60965.1、ANB49655.1和AEI61021.1)。
在本发明中，当提及野生型HPV31 L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO：3所示的序列来进行描述。例如，表述“野生型HPV31 L1蛋白的第127-140位氨基酸残基”是指，SEQID NO：3所示的多肽的第127-140位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，野生型HPV31可包括多种分离株，并且各种分离株的L1蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。进一步，本领域技术人员理解，尽管可能存在着序列差异，但是HPV31的不同分离株的L1蛋白在氨基酸序列上具有极高的同一性(通常高于95％，例如高于96％，高于97％，高于98％，或高于99％)，并且具有实质上相同的生物学功能。因此，在本发明中，术语“野生型HPV31 L1蛋白”不仅包括SEQ ID NO:3所示的蛋白，而且应包括各种HPV31分离株的L1蛋白(例如P17388.1、AEI60965.1、ANB49655.1和AEI61021.1所示的HPV31 L1蛋白)。并且，当描述野生型HPV31L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：3的序列片段，还包括各种HPV31分离株的L1蛋白中的相应序列片段。例如，表述“野生型HPV31 L1蛋白的第127-140位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：3的第127-140位氨基酸残基，以及各种HPV31分离株的L1蛋白中的相应片段。
根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
根据本发明，表述“N端截短了X个氨基酸”是指，用起始密码子(用于起始蛋白质翻译)编码的甲硫氨酸残基置换蛋白质N末端的第1－X位氨基酸残基。例如，N端截短了30个氨基酸的HPV16 L1蛋白是指，用起始密码子编码的甲硫氨酸残基置换野生型HPV16 L1蛋白N末端的第1-30位氨基酸残基所获得的蛋白质。
根据本发明，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与本发明的突变的HPV35L1蛋白(如SEQ ID NO：4、7、9、10、11或13所示的蛋白)的氨基酸序列相比，具有一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)氨基酸的置换(优选保守置换)、添加或缺失，或者具有至少90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性，并且其保留了所述突变的HPV35 L1蛋白的功能。在本发明中，术语“突变的HPV35 L1蛋白的功能”是指：能够诱导机体产生针对至少两个型别的HPV(例如，HPV35和HPV16，或者HPV35、HPV16和HPV31)的中和抗体。术语“同一性”是对核苷酸序列或氨基酸序列的相似性的量度。通常将序列排列起来，以获得最大限度的匹配。“同一性”本身具有本领域公知的意义并且可用公开的算法(例如BLAST)来计算。
根据本发明，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，保守置换通常是指，用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。
根据本发明，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸所编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。
根据本发明，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:MackPublishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
根据本发明，术语“有效量”是指能够有效实现预期目的的量。例如，预防疾病(例如HPV感染)有效量是指，能够有效预防，阻止，或延迟疾病(例如HPV感染)的发生的量。测定这样的有效量在本领域技术人员的能力范围之内。
根据本发明，术语“色谱层析”包括但不限于：离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析、亲和层析法。
根据本发明，术语“裂解上清”是指通过下述步骤所产生的溶液：将宿主细胞(例如大肠杆菌)在裂解液中破碎，然后将含有经破碎的宿主细胞的裂解液中的不溶物去除。各种裂解液是本领域技术人员公知的，包括但不限于Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。此外，可通过本领域技术人员熟知的各种方法来实现宿主细胞的破碎，包括但不限于匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理等等。去除裂解液中的不溶物的方法也是本领域技术人员公知的，包括但不限于过滤和离心。
发明的有益效果
研究表明，虽然HPV35和其他型别的HPV(例如HPV16和HPV31)之间存在一定的交叉保护，但是这种交叉保护的能力很低，通常低于自身型别的VLP的保护水平的百分之一，甚至低于千分之一。因此，对于接种了HPV35疫苗的受试者来说，其感染其他型别的HPV(例如HPV16和HPV31)的风险依然很高。
本发明提供了一种突变的HPV35 L1蛋白以及由其形成的HPV病毒样颗粒。本发明的HPV病毒样颗粒能够在HPV35和其他型别的HPV(例如HPV16和HPV31)之间提供显著的交叉保护能力。特别地，在同等免疫剂量下，本发明的HPV病毒样颗粒能够诱发机体产生针对至少两个型别的HPV(例如，HPV35和HPV16，或者HPV35、HPV16和HPV31)的高滴度中和抗体，并且其效果与多个型别的HPV VLP的混合物(例如，HPV35 VLP和HPV16 VLP的混合物，或者HPV35 VLP、HPV16 VLP和HPV31 VLP的混合物)相当。因此，本发明的HPV病毒样颗粒能够用于同时预防至少两个型别的HPV(例如，HPV35和HPV16，或者HPV35、HPV16和HPV31)的感染以及与此相关的疾病，具有显著的有利技术效果。这在扩大HPV疫苗的保护范围和降低HPV疫苗的生产成本等方面具有特别显著的优势。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了实施例1中经纯化的突变蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M：蛋白分子量标记；泳道1:HPV35 L1；泳道2:H35-16T1；泳道3:H35-16T2；泳道4:H35-16T3；泳道5:H35-16T4；泳道6:H35-16T5；泳道7:H35-16T1-31S2；泳道8:H35-16T1-31S3；泳道9:H35-16T1-31S4；泳道10:HPV35 L1；泳道11:H35-16T1-31S5；泳道12:H35-16T4-31S1；泳道13:H35-16T4-31S2；泳道14:H35-16T4-31S3；泳道15:H35-16T4-31S5。结果显示，经过色谱纯化后，H35-16T1、H35-16T2、H35-16T3、H35-16T4、H35-16T5、H35-16T1-31S2、H35-16T1-31S3、H35-16T1-31S4、H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1、H35-16T4-31S2、H35-16T4-31S3、H35-16T4-31S5蛋白的纯度达到95％以上。
图2显示了用广谱抗体4B3检测实施例1中制备的H35-16T1、H35-16T2、H35-16T3、H35-16T4、H35-16T5、H35-16T1-31S2、H35-16T1-31S3、H35-16T1-31S4、H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1、H35-16T4-31S2、H35-16T4-31S3、H35-16T4-31S5的蛋白质免疫印迹检测的结果。泳道M：蛋白分子量标记；泳道1:HPV35 L1；泳道2:H35-16T1；泳道3:H35-16T2；泳道4:H35-16T3；泳道5:H35-16T4；泳道6:H35-16T5；泳道7:H35-16T1-31S2；泳道8:H35-16T1-31S3；泳道9:H35-16T1-31S4；泳道10:H35-16T1-31S5；泳道11:H35-16T1-31S5；泳道12:H35-16T4-31S1；泳道13:H35-16T4-31S2；泳道14:H35-16T4-31S3；泳道15:H35-16T4-31S5。结果显示，突变蛋白H35-16T1、H35-16T2、H35-16T3、H35-16T4、H35-16T5、H35-16T1-31S2、H35-16T1-31S3、H35-16T1-31S4、H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1、H35-16T4-31S2、H35-16T4-31S3、H35-16T4-31S5能够被广谱抗体4B3特异性识别。
图3A-3P显示了包含蛋白HPV35 L1、HPV16N30、HPV31 L1、H35-16T1、H35-16T2、H35-16T3、H35-16T4、H35-16T5、H35-16T1-31S2、H35-16T1-31S3、H35-16T1-31S4、H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1、H35-16T4-31S2、H35-16T4-31S3、H35-16T4-31S5的样品的分子筛层析分析的结果。结果显示，包含蛋白H35-16T1、H35-16T2、H35-16T3、H35-16T4、H35-16T5、H35-16T1-31S2、H35-16T1-31S3、H35-16T1-31S4、H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1、H35-16T4-31S2、H35-16T4-31S3、H35-16T4-31S5的样品最先出现的蛋白峰均在12min左右，与由HPV35 L1蛋白组装的VLP(HPV35 VLP)、由HPV16N30蛋白组装的VLP(HPV16N30 VLP)以及由HPV31 L1蛋白组装的VLP(HPV31 VLP)相当。这表明，这些蛋白均可组装成VLP。
图4A-4P显示了HPV35 VLP、HPV16N30 VLP、HPV31 VLP、H35-16T1 VLP、H35-16T2VLP、H35-16T3 VLP、H35-16T4 VLP、H35-16T5 VLP、H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP、H35-16T4-31S1 VLP、H35-16T4-31S2 VLP、H35-16T4-31S3 VLP、H35-16T4-31S5 VLP的沉降速率分析的结果。图4A，HPV35 VLP；图4B，HPV16N30 VLP；图4C，HPV31 VLP；图4D，H35-16T1 VLP；图4E，H35-16T2 VLP；图4F，H35-16T3VLP；图4G，H35-16T4 VLP；图4H，H35-16T5 VLP；图4I，H35-16T1-31S2 VLP；图4J，H35-16T1-31S3 VLP；图4K，H35-16T1-31S4 VLP；图4L，H35-16T1-31S5 VLP；图4M，H35-16T4-31S1VLP；图4N，H35-16T4-31S2 VLP；图4O，H35-16T4-31S3 VLP；图4P，H35-16T4-31S5 VLP。结果显示，H35-16T1 VLP、H35-16T2 VLP、H35-16T3 VLP、H35-16T4 VLP、H35-16T5 VLP、H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP、H35-16T4-31S1 VLP、H35-16T4-31S2 VLP、H35-16T4-31S3 VLP、H35-16T4-31S5 VLP的沉降系数与HPV35 VLP、HPV16N30 VLP和HPV31 VLP的沉降系数相近。这表明，H35-16T1、H35-16T2、H35-16T3、H35-16T4、H35-16T5、H35-16T1-31S2、H35-16T1-31S3、H35-16T1-31S4、H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1、H35-16T4-31S2、H35-16T4-31S3、H35-16T4-31S5能够组装成大小、形态与野生型VLP相似的病毒样颗粒。
图5A-5P显示了各种VLP样品的透射电镜观察结果(放大倍数为100,000倍，Bar＝0.1μm)。图5A，由HPV35 L1组装的VLP；图5B，由HPV16N30组装的VLP；图5C，由HPV31 L1组装的VLP；图5D，由H35-16T1组装的VLP；图5E，由H35-16T2组装的VLP；图5F，由H35-16T3组装的VLP；图5G，由H35-16T4组装的VLP；图5H，由H35-16T5组装的VLP；图5I，由H35-16T1-31S2组装的VLP；图5J，由H35-16T1-31S3组装的VLP；图5K，由H35-16T1-31S4组装的VLP；图5L，由H35-16T1-31S5组装的VLP；图5M，由H35-16T4-31S1组装的VLP；图5N，由H35-16T4-31S2组装的VLP；图5O，由H35-16T4-31S3组装的VLP；图5P，由H35-16T4-31S5组装的VLP。结果显示，H35-16T1、H35-16T2、H35-16T3、H35-16T4、H35-16T5、H35-16T1-31S2、H35-16T1-31S3、H35-16T1-31S4、H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1、H35-16T4-31S2、H35-16T4-31S3、H35-16T4-31S5与HPV35 L1、HPV16N30和HPV31 L1类似，都能够组装成半径为30nm左右的VLP。
图6A-6P显示了HPV35 VLP、HPV16N30 VLP、HPV31 VLP、H35-16T1 VLP、H35-16T2VLP、H35-16T3 VLP、H35-16T4 VLP、H35-16T5 VLP、H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP、H35-16T4-31S1 VLP、H35-16T4-31S2 VLP、H35-16T4-31S3 VLP、H35-16T4-31S5 VLP热稳定性的检测结果。图6A，HPV35 VLP；图6B，HPV16N30 VLP；图6C，HPV31 VLP；图6D，H35-16T1 VLP；图6E，H35-16T2 VLP；图6F，H35-16T3VLP；图6G，H35-16T4 VLP；图6H，H35-16T5 VLP；图6I，H35-16T1-31S2 VLP；图6J，H35-16T1-31S3 VLP；图6K，H35-16T1-31S4 VLP；图6L，H35-16T1-31S5 VLP；图6M，H35-16T4-31S1VLP；图6N，H35-16T4-31S2 VLP；图6O，H35-16T4-31S3 VLP；图6P，H35-16T4-31S5 VLP。结果显示，各个蛋白所形成的VLP均具有极高的热稳定性。
图7A显示了实验组H35-16T1 VLP、H35-16T2 VLP、H35-16T3 VLP、H35-16T4 VLP、H35-16T5 VLP和对照组HPV35 VLP、HPV16N30 VLP、混合的HPV16/35 VLP在小鼠体内的免疫保护性的评价结果。结果显示，H35-16T1 VLP和H35-16T4 VLP各自可在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV16和HPV35的中和抗体；并且其针对HPV35的保护效果与单独的HPV35 VLP、混合的HPV16/35 VLP相当，且显著高于单独的HPV16N30 VLP；并且其针对HPV16的保护效果与单独的HPV16N30 VLP、混合的HPV16/35 VLP相当，且显著高于单独的HPV35 VLP。这表明，H35-16T1 VLP和H35-16T4 VLP可用作预防HPV35感染和HPV16感染的有效疫苗，可用于代替含有HPV35 VLP和HPV16 VLP的混合疫苗。
图7B显示了实验组H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4VLP、H35-16T1-31S5 VLP、H35-16T4-31S1 VLP、H35-16T4-31S2 VLP、H35-16T4-31S3 VLP、H35-16T4-31S5 VLP以及对照组HPV35 VLP、HPV16N30 VLP、HPV31 VLP和混合的HPV35/HPV16/HPV31 VLP在小鼠体内的免疫保护性的评价结果。结果显示，H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP和H35-16T4-31S1 VLP各自可在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV35、HPV16和HPV31的中和抗体；并且其针对HPV35的保护效果与单独的HPV35 VLP、混合的HPV35/HPV16/HPV31 VLP相当，且显著高于单独的HPV16N30 VLP和单独的HPV31 VLP；并且其针对HPV16的保护效果与单独的HPV16N30 VLP、混合的HPV35/HPV16/HPV31 VLP相当，且显著高于单独的HPV35 VLP和单独的HPV31 VLP；并且其针对HPV31的保护效果与单独的HPV31 VLP、混合的HPV35/HPV16/HPV31 VLP相当，且显著高于单独的HPV16N30 VLP和单独的HPV35 VLP。这表明，H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP和H35-16T4-31S1 VLP可用作预防HPV35感染、HPV16感染和HPV31感染的有效疫苗，可用于代替含有HPV35 VLP、HPV16 VLP和HPV31 VLP的混合疫苗。
图8A-8B显示了用H35-16T1 VLP和H35-16T4 VLP免疫小鼠后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价结果。图8A：10μg剂量组(免疫剂量为10μg，使用铝佐剂)；图8B：1μg剂量组(免疫剂量为1μg，使用铝佐剂)。结果显示，H35-16T1 VLP和H35-16T4 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV35的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV35 VLP、混合的HPV16/35VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV16N30 VLP；并且其能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV16的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV16N30 VLP、混合的HPV16/35 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV35 VLP。这表明，H35-16T1 VLP和H35-16T4 VLP对HPV35和HPV16具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
图8C显示了用H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP、H35-16T4-31S1 VLP免疫小鼠后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价结果,其中，免疫剂量为10μg，使用铝佐剂。结果显示，H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP和H35-16T4-31S1 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV35的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV35 VLP以及混合的HPV35/HPV16/HPV31 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV16N30 VLP或单独的HPV31 VLP；并且H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP和H35-16T4-31S1 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV16的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV16N30 VLP以及混合的HPV35/HPV16/HPV31 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV35 VLP或单独的HPV31 VLP；并且H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP和H35-16T4-31S1 VLP其能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV31的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV31 VLP以及混合的HPV35/HPV16/HPV31 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV35 VLP或单独的HPV16N30 VLP，而H35-16T1-31S5 VLP不能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV31的中和抗体，其保护效果弱于同剂量的单独的HPV31 VLP以及混合的HPV35/HPV16/HPV31 VLP。这表明，H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP和H35-16T4-31S1 VLP对HPV35、HPV16和HPV31具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性，H35-16T1-31S5 VLP对HPV35和HPV16具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
序列信息
本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列的描述
Figure BDA0001729388540000211
Figure BDA0001729388540000221
序列1(SEQ ID NO:1)：
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序列2(SEQ ID NO:2)：
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序列4(SEQ ID NO:4)：
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序列5(SEQ ID NO:5)：
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序列6(SEQ ID NO:6)：
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序列7(SEQ ID NO:7)：
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序列8(SEQ ID NO:8)：
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序列9(SEQ ID NO:9)：
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序列10(SEQ ID NO:10)：
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序列11(SEQ ID NO:11)：
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序列12(SEQ ID NO:12)：
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序列13(SEQ ID NO:13)：
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序列14(SEQ ID NO:14)：
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序列16(SEQ ID NO:16)：
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序列17(SEQ ID NO:17)：
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序列18(SEQ ID NO:18)：
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序列29(SEQ ID NO:29)：
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序列30(SEQ ID NO:30)：
ATGAGCCTGTGGAGGAGCAACGAGGCCACCGTGTACCTGCCCCCCGTGAGCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGACCAGGACCAACATCTACTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTACTACGCCATCAAGAAGCAGGACAGCAACAAGATCGCCGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAAGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACGACCCCGCCAGCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCACCGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCATCAGCGGCCACCCCCTGCTGAACAAGTTCGACGACACCGAGAACAGCAACAGGTACGCCGGCGGCCCCGGCACCGACAACAGGGAGTGCATCAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAGGCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCACCCCCTGCAACGCCAACCAGGTGAAGGCCGGCGAGTGCCCCCCCCTGGAGCTGCTGAACACCGTGCTGCAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCACCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCTGCAGCAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGTGAGCGAGCCCTACGGCGACATGCTGTTTTTTTATCTACGAAGGGAACAAATGTTTGTTAGACATTTATTTAATAGGGCTGGTGCTGTTGGTGATAATGTACCAGACGATTTATACATTAAAGGCTCTGGGTCTACTGCAAATTTAGCCAGTTCAAATTATTTTCCTACACCTAGTGGTTCTATGGTTACCTCTGATGCCCAAATATTCAATAAACCTTACTGGTTACAACGAGCACAGGGCCACAATAATGGCATTTGTTGGAGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGAGCGTGTGCAGCGCCGTGAGCAGCAGCGACAGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACCTGAGGCACGGCGAGGAGTACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGACGTGATGACCTACATCCACAGCATGAACCCCAGCATCCTGGAGGACTGGAACTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGGCACCCTGGAGGACACCTACAGGTACGTGACCAGCCAGGCCGTGACCTGCCAGAAGCCCAGCGCCCCCAAGCCCAAGGACGACCCCCTGAAGAACTACACCTTCTGGGAGGTGGACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGCCGGCCTGAAGGCCAGGCCCAACTTCAGGCTGGGCAAGAGGGCCGCCCCCGCCAGCACCAGCAAGAAGAGCAGCACCAAGAGGAGGAAGGTGAAGAGCTGA
序列31(SEQ ID NO:31)：
ATGAGCCTGTGGAGGAGCAACGAGGCCACCGTGTACCTGCCCCCCGTGAGCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGACCAGGACCAACATCTACTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTACTACGCCATCAAGAAGCAGGACAGCAACAAGATCGCCGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAAGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACGACCCCGCCAGCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCACCGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCATCAGCGGCCACCCCCTGCTGAACAAGCTGGACGACACCGAGAACAGCAACAAGTACGTGGGCAACAGCGGCACCGACAACAGGGAGTGCATCAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAGGCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCAGCCCCTGCAGCAACAACGCCATCACCCCCGGCGACTGCCCCCCCCTGGAGCTGCTGAACACCGTGCTGCAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGTGCCATGGACTTCACCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCTGCAGCAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGTGAGCGAGCCCTACGGCGACATGCTGTTTTTTTATCTACGAAGGGAACAAATGTTTGTTAGACATTTATTTAATAGGGCTGGTGCTGTTGGTGATAATGTACCAGACGATTTATACATTAAAGGCTCTGGGTCTACTGCAAATTTAGCCAGTTCAAATTATTTTCCTACACCTAGTGGTTCTATGGTTACCTCTGATGCCCAAATATTCAATAAACCTTACTGGTTACAACGAGCACAGGGCCACAATAATGGCATTTGTTGGAGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGAGCGTGTGCAGCGCCGTGAGCAGCAGCGACAGCACCTACAAGAACGACAACTTCAAGGAGTACC TGAGGCACGGCGAGGAGTACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGACGTGATGACCTACATCCACAGCATGAACCCCAGCATCCTGGAGGACTGGAACTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGGCACCCTGGAGGACACCTACAGGTACGTGACCAGCCAGGCCGTGACCTGCCAGAAGCCCAGCGCCCCCAAGCCCAAGGACGACCCCCTGAAGAACTACACCTTCTGGGAGGTGGACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGCCGGCCTGAAGGCCAGGCCCAACTTCAGGCTGGGCAAGAGGGCCGCCCCCGCCAGCACCAGCAAGAAGAGCAGCACCAAGAGGAGGAAGGTGAAGAGCTGA
序列32(SEQ ID NO:32)：
ATGAGCCTGTGGAGGAGCAACGAGGCCACCGTGTACCTGCCCCCCGTGAGCGTGAGCAAGGTGGTGAGCACCGACGAGTACGTGACCAGGACCAACATCTACTACCACGCCGGCAGCAGCAGGCTGCTGGCCGTGGGCCACCCCTACTACGCCATCAAGAAGCAGGACAGCAACAAGATCGCCGTGCCCAAGGTGAGCGGCCTGCAGTACAGGGTGTTCAGGGTGAAGCTGCCCGACCCCAACAAGTTCGGCTTCCCCGACACCAGCTTCTACGACCCCGCCAGCCAGAGGCTGGTGTGGGCCTGCACCGGCGTGGAGGTGGGCAGGGGCCAGCCCCTGGGCGTGGGCATCAGCGGCCACCCCCTGCTGAACAAGCTGGACGACACCGAGAACAGCAACAAGTACGTGGGCAACAGCGGCACCGACAACAGGGAGTGCATCAGCATGGACTACAAGCAGACCCAGCTGTGCCTGATCGGCTGCAGGCCCCCCATCGGCGAGCACTGGGGCAAGGGCACCCCCTGCAACGCCAACCAGGTGAAGGCCGGCGAGTGCCCCCCCCTGGAGCTGCTGAACACCGTGCTGCAGGACGGCGACATGGTGGACACCGGCTTCGGCGCCATGGACTTCACCACCCTGCAGGCCAACAAGAGCGACGTGCCCCTGGACATCTGCAGCAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTGAAGATGGTGAGCGAGCCCTACGGCGACATGCTGTTTTTTTATCTACGAAGGGAACAAATGTTTGTTAGACATTTATTTAATAGGGCTGGTGCTGTTGGTGATAATGTACCAGACGATTTATACATTAAAGGCTCTGGGTCTACTGCAAATTTAGCCAGTTCAAATTATTTTCCTACACCTAGTGGTTCTATGGTTACCTCTGATGCCCAAATATTCAATAAACCTTACTGGTTACAACGAGCACAGGGCCACAATAATGGCATTTGTTGGAGCAACCAGCTGTTCGTGACCGTGGTGGACACCACCAGGAGCACCAACATGAGCGTGTGCAGCGCCATCGCCAACAGCGACACCACCTTCAAGAGCAGCAACTTCAAGGAGTACCTGAGGCACGGCGAGGAGTACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTGTGCAAGATCACCCTGACCGCCGACGTGATGACCTACATCCACAGCATGAACCCCAGCATCCTGGAGGACTGGAACTTCGGCCTGACCCCCCCCCCCAGCGGCACCCTGGAGGACACCTACAGGTACGTGACCAGCCAGGCCGTGACCTGCCAGAAGCCCAGCGCCCCCAAGCCCAAGGACGACCCCCTGAAGAACTACACCTTCTGGGAGGTGGACCTGAAGGAGAAGTTCAGCGCCGACCTGGACCAGTTCCCCCTGGGCAGGAAGTTCCTGCTGCAGGCCGGCCTGAAGGCCAGGCCCAACTTCAGGCTGGGCAAGAGGGCCGCCCCCGCCAGCACCAGCAAGAAGAGCAGCACCAAGAGGAGGAAGGTGAAGAGCTGA
序列33(SEQ ID NO:33)：
FPIKKPNNNKIL
序列34(SEQ ID NO:34)：
AVGDNVPDDLYIKGSGSTANLASSN
序列35(SEQ ID NO:35)：
FDDTENSNRYAGGP
序列36(SEQ ID NO:36)：
SPCSNNAITPGD
序列37(SEQ ID NO:37)：
FFNRSGTVGESVPTDLYIKGSGSTATLANST
序列38(SEQ ID NO:38)：
IANSDTTFKSS
序列39(SEQ ID NO:39)：
SIPKSDNPKKIV
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1.突变的HPV35 L1蛋白的表达与纯化
表达载体的构建
采用多点突变PCR反应来构建编码含有来源于HPV16 L1蛋白的区段1的突变的HPV35 L1蛋白的表达载体，其中，所使用的初始模板为pTO-T7-HPV35 L1质粒(其编码HPV35L1蛋白；在表2中简写为35L1)。用于各个PCR反应的模板和引物见表2，并且，PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟；25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火一定时间，72℃延伸7分30秒)；最后72℃延伸10分钟。所使用的PCR引物的具体序列列于表3。
向扩增产物(50μL)中加入2μL DpnI限制性内切酶，并在37℃温育60min。取10μL酶切产物，用于转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566(购自新英格兰生物实验室公司)。将经转化的大肠杆菌涂布于含卡那霉素(终浓度25mg/mL，下同)的固体LB培养基(LB培养基成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，下同)，并在37℃静置培养10-12小时，直至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含有4mL液体LB培养基(含卡那霉素)的试管中，并在37℃220转/分钟下振荡培养10小时。随后，取1mL菌液于-70℃保存。从大肠杆菌中提取质粒，并利用T7引物对质粒中插入的目的片段的核苷酸序列进行测序。测序结果显示，所构建的质粒(表达载体)中插入的目的片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：20，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：4(所对应的蛋白命名为H35-16T1)。
突变蛋白H35-16T1与HPV35 L1的区别在于：位于野生型HPV35 L1蛋白第50-61位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第76-87位的氨基酸残基。
采用Gibson装配(Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,Hutchison CA,Smith HO.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundredkilobases.Nat Methods.2009；6:343-5.doi:10.1038/nmeth.1318)来构建含有来源于HPV16 L1蛋白的区段2、区段3、区段4和区段5的突变的HPV35 L1蛋白的表达载体。简言之，首先采用PCR反应来获得一个包含突变的短片段和一个不包含突变的长片段，然后再采用Gibson装配体系将这两个片段连接成环。所使用的初始模板包括pTO-T7-HPV35 L1质粒和pTO-T7-HPV16 L1N30C质粒(其编码N端截短了30个氨基酸的HPV16 L1蛋白(该蛋白命名为HPV16N30)；在表2中简写为16L1N30)。用于各个PCR反应的模板和引物见表2，并且，用于扩增短片段的PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟；25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火一定时间，72℃延伸1分钟)；最后72℃延伸10分钟。用于扩增长片段的PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟；25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火一定时间，72℃延伸7分30秒)；最后72℃延伸10分钟。所使用的PCR引物的具体序列列于表3。将扩增产物进行电泳，随后使用DNA回收试剂盒回收目的片段并测定其浓度。按2:1的摩尔比将扩增得到的短片段和长片段混合(总体积3μL)，随后添加3μL 2X Gibson装配预混试剂(2X GibsonAssembly Master Mix，购自NEB，包含T5exonuclease，Phusion DNA polymerase，Taq DNAligase)，并在50℃反应1小时。
用装配后的产物(6μL)转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566(购自新英格兰生物实验室公司)。将经转化的大肠杆菌涂布于含卡那霉素的固体LB培养基，并在37℃静置培养10-12小时，直至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含有4mL液体LB培养基(含卡那霉素)的试管中，并在37℃220转/分钟下振荡培养10小时。随后，取1mL菌液于-70℃保存。从大肠杆菌中提取质粒，并利用T7引物对质粒中插入的目的片段的核苷酸序列进行测序。测序结果显示，所构建的各个质粒(表达载体)中插入的目的片段的核苷酸序列分别为SEQID NO：21、22、23、24，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：5、6、7、8(所对应的蛋白分别命名为H35-16T2，H35-16T3，H35-16T4，和H35-16T5)。
突变蛋白H35-16T2与HPV35 L1的区别在于：位于野生型HPV35 L1蛋白第132-141位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第158-167位的氨基酸残基。突变蛋白H35-16T3与HPV35 L1的区别在于：位于野生型HPV35 L1蛋白第173-184位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第199-210位的氨基酸残基。突变蛋白H35-16T4与HPV35 L1的区别在于：位于野生型HPV35 L1蛋白第266-288位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第292-316位的氨基酸残基。突变蛋白H35-16T5与HPV35 L1的区别在于：位于野生型HPV35L1蛋白第346-356位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第374-384位的氨基酸残基。
采用Gibson装配来构建编码双置换的突变的HPV35 L1蛋白的表达载体，所述突变的HPV35 L1蛋白含有来源于HPV16 L1的区段和来源于HPV31 L1的区段。简言之，首先采用PCR反应来获得一个包含突变的短片段和一个不包含突变的长片段，然后再采用Gibson装配体系将这两个片段连接成环。所使用的初始模板包括pTO-T7-H35-16T1质粒(其编码突变蛋白H35-16T1；在表2中简写为H35-16T1)、pTO-T7-H35-16T4质粒(其编码突变蛋白H35-16T4；在表2中简写为H35-16T4)和pTO-T7-HPV31 L1质粒(其编码HPV31 L1蛋白；在表2中简写为31L1)。用于各个PCR反应的模板和引物见表2，并且，用于扩增短片段的PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟；25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火一定时间，72℃延伸1分钟)；最后72℃延伸10分钟。用于扩增长片段的PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟；25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火一定时间，72℃延伸7分30秒)；最后72℃延伸10分钟。所使用的PCR引物的具体序列列于表3。将扩增产物进行电泳，随后使用DNA回收试剂盒回收目的片段并测定其浓度。按2:1的摩尔比将扩增得到的短片段和长片段混合(总体积3μL)，随后添加3μL 2X Gibson装配预混试剂(2X Gibson Assembly Master Mix，购自NEB，包含T5exonuclease，Phusion DNA polymerase，Taq DNA ligase)，并在50℃反应1小时。
用装配后的产物(6μL)转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566(购自新英格兰生物实验室公司)。将经转化的大肠杆菌涂布于含卡那霉素的固体LB培养基，并在37℃静置培养10-12小时，直至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含有4mL液体LB培养基(含卡那霉素)的试管中，并在37℃220转/分钟下振荡培养10小时。随后，取1mL菌液于-70℃保存。从大肠杆菌中提取质粒，并利用T7引物对质粒中插入的目的片段的核苷酸序列进行测序。测序结果显示，所构建的各个质粒(表达载体)中插入的目的片段的核苷酸序列分别为SEQID NO：25、26、27、28、29、30、31、32，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：9、10、11、12、13、14、15、16(所对应的蛋白分别命名为H35-16T1-31S2，H35-16T1-31S3，H35-16T1-31S4，H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1，H35-16T4-31S2，H35-16T4-31S3，和H35-16T4-31S5)。
突变蛋白H35-16T1-31S2与HPV35 L1的区别在于：位于野生型HPV35 L1蛋白第50-61位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第76-87位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV35 L1蛋白第126-139位的氨基酸残基被替换为野生型HPV31 L1蛋白的第127-140位的氨基酸残基。突变蛋白H35-16T1-31S3与HPV35 L1的区别在于：位于野生型HPV35 L1蛋白第50-61位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第76-87位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV35 L1蛋白第173-184位的氨基酸残基被替换为野生型HPV31 L1蛋白的第174-185位的氨基酸残基。突变蛋白H35-16T1-31S4与HPV35 L1的区别在于：位于野生型HPV35L1蛋白第50-61位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第76-87位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV35 L1蛋白第260-288位的氨基酸残基被替换为野生型HPV31L1蛋白的第261-291位的氨基酸残基。突变蛋白H35-16T1-31S5与HPV35 L1的区别在于：位于野生型HPV35 L1蛋白第50-61位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第76-87位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV35 L1蛋白第346-356位的氨基酸残基被替换为野生型HPV31 L1蛋白的第349-359位的氨基酸残基。
突变蛋白H35-16T4-31S1与HPV35 L1的区别在于：位于野生型HPV35 L1蛋白第266-288位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第292-316位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV35 L1蛋白第51-61位的氨基酸残基被替换为野生型HPV31 L1蛋白的第51-62位的氨基酸残基。突变蛋白H35-16T4-31S2与HPV35 L1的区别在于：位于野生型HPV35 L1蛋白第266-288位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第292-316位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV35L1蛋白第126-139位的氨基酸残基被替换为野生型HPV31 L1蛋白的第127-140位的氨基酸残基。突变蛋白H35-16T4-31S3与HPV35 L1的区别在于：位于野生型HPV35 L1蛋白第266-288位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第292-316位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV35 L1蛋白第173-184位的氨基酸残基被替换为野生型HPV31L1蛋白的第174-185位的氨基酸残基。突变蛋白H35-16T4-31S5与HPV35 L1的区别在于：位于野生型HPV35 L1蛋白第266-288位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白第292-316位的氨基酸残基，并且位于野生型HPV35 L1蛋白第346-356位的氨基酸残基被替换为野生型HPV31 L1蛋白的第349-359位的氨基酸残基。
表2.用于构建表达载体的PCR反应的模板和引物
Figure BDA0001729388540000401
Figure BDA0001729388540000411
表3：所使用的引物的具体序列(SEQ ID NO:29-58)
Figure BDA0001729388540000412
Figure BDA0001729388540000421
突变蛋白的大量表达
从-70℃冰箱中取出携带重组质粒pTO-T7-H35-16T1、pTO-T7-H35-16T2、pTO-T7-H35-16T3、pTO-T7-H35-16T4、pTO-T7-H35-16T5、pTO-T7-H35-16T1-31S2、pTO-T7-H35-16T1-31S3、pTO-T7-H35-16T1-31S4、pTO-T7-H35-16T1-31S5、pTO-T7-H35-16T4-31S1、pTO-T7-H35-16T4-31S2、pTO-T7-H35-16T4-31S3、pTO-T7-H35-16T4-31S5的大肠杆菌菌液，分别接种入100ml含卡那霉素的LB液体培养基中，在200rpm，37℃下培养大约8小时；然后分别转接入500ml含卡那霉素的LB培养基中(接入1ml菌液)，并继续进行培养。当细菌浓度达到OD600为0.6左右时，将培养温度降至25℃，并向各培养瓶中加入500μL IPTG，继续培养8小时。培养结束后，离心收集菌体。获得表达了H35-16T1、H35-16T2、H35-16T3、H35-16T4、H35-16T5、H35-16T1-31S2、H35-16T1-31S3、H35-16T1-31S4、H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1、H35-16T4-31S2、H35-16T4-31S3、H35-16T4-31S5蛋白的菌体。
表达突变蛋白的菌体破碎
按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液，pH7.2，300mM NaCl)的比例重悬上述得到的菌体。用超声波仪破碎菌体30min。以13500rpm(30000g)离心含有经破碎的菌体的裂解液15min，留取上清(即，菌体破碎上清)。
突变蛋白的色谱纯化
仪器系统：GE Healthcare公司(原Amershan Pharmacia公司)生产的AKTAexplorer 100型制备型液相色谱系统。
层析介质：SP Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare公司)、CHT-Ⅱ(购自Bio－RAD)和Butyl Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare公司)。
缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液，pH8.0，20mM DTT；以及，20mM磷酸盐缓冲液，pH8.0，20mM DTT，2M NaCl。
样品：如上获得的含有H35-16T1、H35-16T2、H35-16T3、H35-16T4、H35-16T5、H35-16T1-31S2、H35-16T1-31S3、H35-16T1-31S4、H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1、H35-16T4-31S2、H35-16T4-31S3、H35-16T4-31S5的菌体破碎上清。
洗脱程序为：
(1)用SP Sepharose 4Fast Flow对菌体破碎上清进行阳离子交换纯化：将样品上柱，然后用含有400mM NaCl的缓冲液洗脱杂蛋白，然后用含有800mM NaCl的缓冲液洗脱目的蛋白，并收集由含有800mM NaCl的缓冲液洗脱的级分；
(2)用CHTⅡ(羟基磷灰石色谱)对前一步获得的洗脱级分进行色谱纯化：对前一步骤获得的洗脱级分进行稀释，以使得NaCl的浓度降至0.5M；将样品上柱，然后用含有500mMNaCl的缓冲液洗脱杂蛋白，然后用含有1000mM NaCl的缓冲液洗脱目的蛋白，并收集由含有1000mM NaCl的缓冲液洗脱的级分；
(3)用HIC(疏水相互作用色谱)对前一步骤获得的洗脱级分进行色谱纯化：将样品上柱，然后用含有1000mM NaCl的缓冲液洗脱杂蛋白，然后用含有200mM NaCl的缓冲液洗脱目的蛋白，并收集由含有200mM NaCl的缓冲液洗脱的级分。
取步骤(3)获得的洗脱级分150μL，加入30μL 6X Loading Buffer中，混匀，并于80℃水浴中温育10min。然后取10μl样品于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min；然后以考马斯亮兰染色显示电泳条带。电泳结果示于图1中。结果显示，经过上述纯化步骤后，H35-16T1、H35-16T2、H35-16T3、H35-16T4、H35-16T5、H35-16T1-31S2、H35-16T1-31S3、H35-16T1-31S4、H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1、H35-16T4-31S2、H35-16T4-31S3、H35-16T4-31S5蛋白的纯度大于95％。
通过类似的方法，使用大肠杆菌和pTO-T7-HPV35 L1质粒制备和纯化了HPV35 L1蛋白(SEQ ID NO:1)；使用大肠杆菌和pTO-T7-HPV16 L1N30C质粒制备和纯化了HPV16N30蛋白；使用大肠杆菌和pTO-T7-HPV31 L1质粒制备和纯化了HPV31 L1蛋白(SEQ ID NO:3)。
突变蛋白的免疫印迹实验
按上述方法对经纯化的H35-16T1、H35-16T2、H35-16T3、H35-16T4、H35-16T5、H35-16T1-31S2、H35-16T1-31S3、H35-16T1-31S4、H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1、H35-16T4-31S2、H35-16T4-31S3、H35-16T4-31S5进行电泳。电泳结束后，使用抗HPV L1蛋白的广谱抗体4B3进行Western Blot检测，结果示于图2中。结果显示，H35-16T1、H35-16T2、H35-16T3、H35-16T4、H35-16T5、H35-16T1-31S2、H35-16T1-31S3、H35-16T1-31S4、H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1、H35-16T4-31S2、H35-16T4-31S3、H35-16T4-31S5能够被广谱抗体4B3特异性识别。
实施例2：HPV病毒样颗粒的组装与颗粒形态学检测
HPV病毒样颗粒的组装
取一定体积(约2ml)的蛋白H35-16T1、H35-16T2、H35-16T3、H35-16T4、H35-16T5、H35-16T1-31S2、H35-16T1-31S3、H35-16T1-31S4、H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1、H35-16T4-31S2、H35-16T4-31S3、H35-16T4-31S5，分别依次透析至(1)2L储存缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，0.5M NaCl)；(2)2L复性缓冲液(50mM磷酸钠缓冲液pH 6.0，2mM CaCl2，2mM MgCl2，0.5M NaCl)；和(3)20mM磷酸钠缓冲液pH 7.0，0.5M NaCl中。在三种缓冲液中各自进行透析12h。
通过类似的方法，将HPV35 L1、HPV16N30和HPV31 L1蛋白分别组装为HPV35 VLP、HPV16N30 VLP和HPV31 VLP。
分子筛层析分析
用美国安捷伦公司的1120 Compact LC高效液相色谱系统对经透析的样品进行分子筛层析分析，其中，所使用的分析柱为TSK Gel PW5000xl 7.8x300mm。分析结果如图3A-3P所示。结果显示，包含蛋白H35-16T1、H35-16T2、H35-16T3、H35-16T4、H35-16T5、H35-16T1-31S2、H35-16T1-31S3、H35-16T1-31S4、H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1、H35-16T4-31S2、H35-16T4-31S3、H35-16T4-31S5的样品最先出现的蛋白峰均在12min左右，与HPV35VLP、HPV16N30 VLP以及HPV31 VLP相当。这表明，这些蛋白均可组装成VLP。
沉降速率分析
沉降速率分析所使用的仪器为Beckman XL-A分析型超速离心机，其配有光学检测系统及An-50Ti和An-60Ti转头。采用沉降速率法分析HPV35 VLP、HPV16N30 VLP、HPV31VLP、H35-16T1 VLP、H35-16T2 VLP、H35-16T3 VLP、H35-16T4 VLP、H35-16T5 VLP、H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP、H35-16T4-31S1 VLP、H35-16T4-31S2 VLP、H35-16T4-31S3 VLP、H35-16T4-31S5 VLP的沉降系数。结果如图4A-4P所示。结果显示，H35-16T1 VLP、H35-16T2 VLP、H35-16T3 VLP、H35-16T4 VLP、H35-16T5 VLP、H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP、H35-16T4-31S1 VLP、H35-16T4-31S2 VLP、H35-16T4-31S3 VLP、H35-16T4-31S5VLP的沉降系数与HPV35 VLP、HPV16N30 VLP和HPV31 VLP的沉降系数相近。这表明，H35-16T1、H35-16T2、H35-16T3、H35-16T4、H35-16T5、H35-16T1-31S2、H35-16T1-31S3、H35-16T1-31S4、H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1、H35-16T4-31S2、H35-16T4-31S3、H35-16T4-31S5能够组装成大小、形态与野生型VLP相似的病毒样颗粒。
病毒样颗粒的形态学检测
取100μL含有VLP的样品进行透射电镜观察。所使用的仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜，放大倍数为100,000倍。简言之，取13.5μL样品，用2％磷钨酸pH7.0进行负染，并固定于喷炭的铜网上，然后进行透射电镜观察。观察结果如图5A-5P所示。结果显示，H35-16T1、H35-16T2、H35-16T3、H35-16T4、H35-16T5、H35-16T1-31S2、H35-16T1-31S3、H35-16T1-31S4、H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1、H35-16T4-31S2、H35-16T4-31S3、H35-16T4-31S5均可组装成病毒样颗粒。此外，结果还显示，这些突变蛋白所组装形成的颗粒的半径均在30nm左右，大小均一。这表明，这些突变蛋白与HPV35、HPV16和HPV31的L1蛋白类似，能够形成大小均一的VLP。
实施例3：病毒样颗粒的热稳定性的评价
使用购自美国GE公司(原MicroCal公司)的差温量热仪VP Capillary DSC来评价H35-16T1、H35-16T2、H35-16T3、H35-16T4、H35-16T5、H35-16T1-31S2、H35-16T1-31S3、H35-16T1-31S4、H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1、H35-16T4-31S2、H35-16T4-31S3、H35-16T4-31S5所形成的VLP的热稳定性，其中，使用所述蛋白的储存缓冲液作为对照，并且以1.5℃/min的升温速率在10℃-90℃区间对各蛋白进行扫描。检测结果如图6A-6P所示。结果显示，各个蛋白所形成的VLP均具有极高的热稳定性。
实施例4：病毒样颗粒在动物体内的免疫保护性的评价1
使用小鼠来评价由H35-16T1、H35-16T2、H35-16T3、H35-16T4、H35-16T5、H35-16T1-31S2、H35-16T1-31S3、H35-16T1-31S4、H35-16T1-31S5、H35-16T4-31S1、H35-16T4-31S2、H35-16T4-31S3、H35-16T4-31S5形成的VLP的免疫保护性。用于免疫接种的动物为，5-6周龄BalB/c普通级小鼠(购自上海斯莱康实验动物有限公司)。
将如上制备的H35-16T1 VLP、H35-16T2 VLP、H35-16T3 VLP、H35-16T4 VLP、H35-16T5 VLP、HPV35 VLP、HPV16N30 VLP以及混合的HPV35/HPV16 VLP(即，混合的HPV35 VLP和HPV16N30 VLP)分别吸附于铝佐剂上。按不同的免疫原将小鼠分为8组，每组包含5只小鼠。免疫程序为：在0周时进行初次免疫；在第2和4周时各进行加强免疫一次。免疫方式为腹腔注射，所使用的免疫原与剂量如表4所示。在初次免疫后的第8周，抽取眼球静脉血，并分离血清，随后检测血清中的中和抗体的滴度。检测结果如图7A所示。结果显示，H35-16T1 VLP和H35-16T4 VLP各自可在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV16和HPV35的中和抗体；并且其针对HPV35的保护效果与单独的HPV35 VLP、混合的HPV35/HPV16 VLP相当，且显著高于单独的HPV16N30 VLP；并且其针对HPV16的保护效果与单独的HPV16N30 VLP、混合的HPV35/HPV16VLP相当，且显著高于单独的HPV35 VLP。这表明，H35-16T1 VLP和H35-16T4 VLP可用作预防HPV35感染和HPV16感染的有效疫苗，可用于代替含有HPV35 VLP和HPV16 VLP的混合疫苗。
表4.免疫方案
免疫抗原 佐剂 免疫剂量 数量 免疫程序(周)
H35-16T1 VLP 铝佐剂 5μg 5 0、2、4
H35-16T2 VLP 铝佐剂 5μg 5 0、2、4
H35-16T3 VLP 铝佐剂 5μg 5 0、2、4
H35-16T4 VLP 铝佐剂 5μg 5 0、2、4
H35-16T5 VLP 铝佐剂 5μg 5 0、2、4
HPV35 VLP 铝佐剂 5μg 5 0、2、4
HPV16N30 VLP 铝佐剂 5μg 5 0、2、4
HPV35/HPV16 VLP 铝佐剂 每种VLP各5μg 5 0、2、4
另外，将如上制备的H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4VLP、H35-16T1-31S5 VLP、H35-16T4-31S1 VLP、H35-16T4-31S2 VLP、H35-16T4-31S3 VLP、H35-16T4-31S5 VLP、HPV35 VLP、HPV16N30 VLP、HPV31 VLP以及混合的HPV35/HPV16/HPV31VLP(即，混合的HPV35 VLP、HPV16N30 VLP和HPV31 VLP)分别吸附于铝佐剂上。按不同的免疫原将小鼠分为12组，每组包含5只小鼠。免疫程序为：在0周时进行初次免疫；在第2和4周时各进行加强免疫一次。免疫方式为腹腔注射，所使用的免疫原与剂量如表5所示。在初次免疫后的第8周，抽取眼球静脉血，并分离血清，随后检测血清中的中和抗体的滴度。检测结果如图7B所示。结果显示，H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP和H35-16T4-31S1 VLP各自可在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV35、HPV16和HPV31的中和抗体；并且其针对HPV35的保护效果与单独的HPV35 VLP、混合的HPV35/HPV16/HPV31 VLP相当，且显著高于单独的HPV16N30 VLP和单独的HPV31 VLP；并且其针对HPV16的保护效果与单独的HPV16N30 VLP、混合的HPV35/HPV16/HPV31 VLP相当，且显著高于单独的HPV35 VLP和单独的HPV31 VLP；并且其针对HPV31的保护效果与单独的HPV31 VLP、混合的HPV35/HPV16/HPV31 VLP相当，且显著高于单独的HPV16N30 VLP和单独的HPV35 VLP。这表明，H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP和H35-16T4-31S1 VLP可用作预防HPV35感染、HPV16感染和HPV31感染的有效疫苗，可用于代替含有HPV35 VLP、HPV16 VLP和HPV31 VLP的混合疫苗。
表5.免疫方案
Figure BDA0001729388540000491
Figure BDA0001729388540000501
实施例5：病毒样颗粒在动物体内的免疫保护性的评价2
H35-16T1 VLP和H35-16T4 VLP的ED50
采用铝佐剂、单次腹腔注射方式对6周龄的BalB/c雌鼠(8只)进行免疫，其中，实验组使用H35-16T1 VLP或H35-16T4 VLP(免疫剂量为0.300μg、0.100μg、0.033μg、0.011μg、0.004μg)，对照组使用单独的HPV35 VLP、单独的HPV16N30 VLP(免疫剂量为0.300μg、0.100μg、0.033μg、0.011μg、0.004μg)，或混合的HPV35/HPV16 VLP(每种VLP的免疫剂量各为0.300μg、0.100μg、0.033μg、0.011μg、0.004μg)；免疫体积为1mL。在免疫后第五周，抽取眼球静脉血，对血液中的HPV抗体进行检测，并通过Reed-Muench法(Reed LJ MH.A simplemethod of estimating fifty percent endpoints.Am J Hyg.1938；27:493-7)来计算各个样品诱导血清转换(即，诱导小鼠产生抗体)的ED50。结果如表6-10所示。
表6.HPV35 VLP诱导小鼠产生抗HPV16、抗HPV35抗体的ED50
Figure BDA0001729388540000502
Figure BDA0001729388540000511
表7.HPV16N30 VLP诱导小鼠产生抗HPV16、抗HPV35抗体的ED50
Figure BDA0001729388540000512
表8.混合的HPV35/HPV16 VLP诱导小鼠产生抗HPV16、抗HPV35抗体的ED50
Figure BDA0001729388540000513
表9.H35-16T1 VLP诱导小鼠产生抗HPV16、抗HPV35抗体的ED50
Figure BDA0001729388540000521
表10.H35-16T4 VLP诱导小鼠产生抗HPV16、抗HPV35抗体的ED50
Figure BDA0001729388540000522
结果显示，在免疫小鼠5周后，H35-16T1 VLP和H35-16T4 VLP各自诱导小鼠产生抗HPV35抗体的ED50与单独的HPV35 VLP、混合的HPV35/HPV16 VLP相当，且显著优于单独的HPV16N30 VLP；并且，其诱导小鼠产生抗HPV16体的ED50与单独的HPV16N30 VLP、混合的HPV35/HPV16 VLP相当，且显著优于单独的HPV35 VLP。这表明，H35-16T1 VLP和H35-16T4VLP对HPV35和HPV16具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP和H35-16T4-31S1 VLP的ED50
采用铝佐剂、单次腹腔注射方式对6周龄的BalB/c雌鼠(8只)进行免疫，其中，实验组使用H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP或H35-16T4-31S1 VLP(免疫剂量为0.300μg、0.100μg、0.033μg、0.011μg或0.004μg)；对照组使用单独的HPV16N30 VLP、单独的HPV35 VLP或单独的HPV31 VLP(免疫剂量为0.300μg、0.100μg、0.033μg、0.011μg或0.004μg)，或者混合的HPV35/HPV16/HPV31 VLP(每种VLP的免疫剂量各为0.300μg、0.100μg、0.033μg、0.011μg或0.004μg)；免疫体积为1mL。在免疫后第五周，抽取眼球静脉血，对血液中的HPV抗体进行检测，并通过Reed-Muench法(Reed LJMH.A simple method of estimating fifty percent endpoints.Am J Hyg.1938；27:493-7)来计算各个样品诱导血清转换(即，诱导小鼠产生抗体)的ED50。结果如表11-19所示。
表11.HPV35 VLP诱导小鼠产生抗HPV16、抗HPV35和抗HPV31抗体的ED50
Figure BDA0001729388540000531
Figure BDA0001729388540000541
表12.HPV16N30 VLP诱导小鼠产生抗HPV16、抗HPV35和抗HPV31抗体的ED50
Figure BDA0001729388540000542
表13.HPV31 VLP诱导小鼠产生抗HPV16、抗HPV35和抗HPV31抗体的ED50
Figure BDA0001729388540000543
Figure BDA0001729388540000551
表14.混合的HPV16/HPV35/HPV31 VLP诱导小鼠产生抗HPV16、抗HPV35和抗HPV31抗体的ED50
Figure BDA0001729388540000552
表15.H35-16T1-31S2 VLP诱导小鼠产生抗HPV16、抗HPV35和抗HPV31抗体的ED50
Figure BDA0001729388540000553
Figure BDA0001729388540000561
表16.H35-16T1-31S3 VLP诱导小鼠产生抗HPV16、抗HPV35和抗HPV31抗体的ED50
Figure BDA0001729388540000562
表17.H35-16T1-31S4 VLP诱导小鼠产生抗HPV16、抗HPV35和抗HPV31抗体的ED50
Figure BDA0001729388540000571
表18.H35-16T1-31S5 VLP诱导小鼠产生抗HPV16、抗HPV35和抗HPV31抗体的ED50
Figure BDA0001729388540000572
Figure BDA0001729388540000581
表19.H35-16T4-31S1 VLP诱导小鼠产生抗HPV16、抗HPV35和抗HPV31抗体的ED50
Figure BDA0001729388540000582
结果显示，在免疫小鼠5周后，H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP和H35-16T4-31S1 VLP诱导小鼠产生抗HPV35的ED50与单独的HPV35 VLP以及混合的HPV35 VLP、HPV16N30 VLP和HPV31 VLP相当，且显著优于单独的HPV16N30 VLP以及单独的HPV31 VLP；并且，H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP和H35-16T4-31S1 VLP诱导小鼠产生抗HPV16的ED50与单独的HPV16N30 VLP以及混合的HPV35 VLP、HPV16N30 VLP和HPV31 VLP相当，且显著优于单独的HPV35 VLP以及单独的HPV31 VLP；并且，H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3VLP、H35-16T1-31S4 VLP和H35-16T4-31S1 VLP诱导小鼠产生抗HPV31的ED50与单独的HPV31VLP以及混合的HPV35 VLP、HPV16N30 VLP和HPV31 VLP相当，且显著优于单独的HPV16N30VLP以及单独的HPV35 VLP，而H35-16T1-31S5 VLP诱导小鼠产生抗HPV31的ED50大于单独的HPV31 VLP以及混合的HPV35 VLP、HPV16N30 VLP和HPV31 VLP。这表明，H35-16T1-31S2VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP和H35-16T4-31S1 VLP对HPV35、HPV16以及HPV31具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性，H35-16T1-31S5 VLP对HPV35和HPV16具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
用H35-16T1 VLP和H35-16T4 VLP免疫后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价
在本实验中，免疫方案如表20所示。将所有小鼠(6周龄BalB/c雌性小鼠)分为2个组：10μg剂量组(免疫剂量为10μg，使用铝佐剂)，和1μg剂量组(免疫剂量为1μg，使用铝佐剂)。各个组又细分为5个亚组，对照亚组1和2分别用单独的HPV16N30 VLP、单独的HPV35VLP进行免疫，对照亚组3用混合的HPV35/HPV16 VLP进行免疫，实验亚组1和2分别用H35-16T1 VLP和H35-16T4 VLP进行免疫。
采用腹腔注射方式免疫6只小鼠/亚组，免疫剂量分别为10μg、1μg，注射体积为1ml。所有小鼠均在第0周进行初次免疫，然后在第2和4周各自进行加强免疫一次。在第8周对小鼠进行眼眶采血，并分析血清中的抗HPV35和HPV16抗体的滴度。分析结果如图8A-8B所示。结果显示，H35-16T1 VLP和H35-16T4 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV35的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV35 VLP、混合的HPV35/HPV16 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV16N30 VLP；并且其能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV16的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV16N30 VLP、混合的HPV35/HPV16 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV35 VLP。这表明，H35-16T1 VLP和H35-16T4 VLP对HPV35和HPV16具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性
表20.免疫方案
Figure BDA0001729388540000601
用H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP和H35-16T4-31S1 VLP免疫后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价
在本实验中，免疫方案如表21所示。将所有小鼠(6周龄BalB/c雌性小鼠)分为9个亚组：对照亚组1、2和3分别用单独的HPV35 VLP、单独的HPV16N30 VLP和单独的HPV31 VLP进行免疫，对照亚组4用混合的HPV35/HPV16/HPV31 VLP进行免疫，实验亚组1、2、3、4和5分别用H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP和H35-16T4-31S1 VLP进行免疫；免疫剂量为10μg，使用铝佐剂。
采用腹腔注射方式免疫6只小鼠/亚组，免疫剂量为10μg，注射体积为1ml。所有小鼠均在第0周进行初次免疫，然后在第2和4周各自进行加强免疫一次。在第8周对小鼠进行眼眶采血，并分析血清中的抗HPV35、HPV16和HPV31抗体的滴度。分析结果如图8C所示。结果显示，H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP和H35-16T4-31S1 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV35的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV35 VLP以及混合的HPV35/HPV16/HPV31 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV16N30 VLP或单独的HPV31 VLP；并且H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP、H35-16T1-31S5 VLP和H35-16T4-31S1 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV16的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV16N30 VLP以及混合的HPV35/HPV16/HPV31 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV35 VLP或单独的HPV31 VLP；并且H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP和H35-16T4-31S1 VLP其能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV31的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV31 VLP以及混合的HPV35/HPV16/HPV31 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV35 VLP或单独的HPV16N30 VLP，而H35-16T1-31S5 VLP不能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV31的中和抗体，其保护效果弱于同剂量的单独的HPV31 VLP以及混合的HPV35/HPV16/HPV31 VLP。这表明，H35-16T1-31S2 VLP、H35-16T1-31S3 VLP、H35-16T1-31S4 VLP和H35-16T4-31S1 VLP对HPV35、HPV16和HPV31具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性，H35-16T1-31S5 VLP对HPV35和HPV16具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。
表21.免疫方案
Figure BDA0001729388540000611
Figure BDA0001729388540000621
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
SEQUENCE LISTING
<110> 厦门大学
厦门万泰沧海生物技术有限公司
<120> 一种人乳头瘤病毒35型L1蛋白的突变体
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<160> 89
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 35
<400> 1
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1 5 10 15
Ser Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Thr Arg Thr Asn
20 25 30
Ile Tyr Tyr His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro
35 40 45
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50 55 60
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Thr Glu Asn Ser Asn Lys Tyr Val Gly Asn Ser Gly Thr Asp Asn Arg
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Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly
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Cys Arg Pro Pro Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Thr Pro Cys Asn
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Thr Val Leu Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met
195 200 205
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210 215 220
Cys Ser Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Val Ser Glu
225 230 235 240
Pro Tyr Gly Asp Met Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe
245 250 255
Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Thr Val Gly Glu Thr Val Pro
260 265 270
Ala Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Thr Thr Gly Thr Leu Pro Ser Thr Ser
275 280 285
Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile
290 295 300
Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn Asn Gly
305 310 315 320
Ile Cys Trp Ser Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg
325 330 335
Ser Thr Asn Met Ser Val Cys Ser Ala Val Ser Ser Ser Asp Ser Thr
340 345 350
Tyr Lys Asn Asp Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu Glu Tyr
355 360 365
Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Ala Asp
370 375 380
Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Pro Ser Ile Leu Glu Asp Trp
385 390 395 400
Asn Phe Gly Leu Thr Pro Pro Pro Ser Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr
405 410 415
Arg Tyr Val Thr Ser Gln Ala Val Thr Cys Gln Lys Pro Ser Ala Pro
420 425 430
Lys Pro Lys Asp Asp Pro Leu Lys Asn Tyr Thr Phe Trp Glu Val Asp
435 440 445
Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg
450 455 460
Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Arg Pro Asn Phe Arg Leu
465 470 475 480
Gly Lys Arg Ala Ala Pro Ala Ser Thr Ser Lys Lys Ser Ser Thr Lys
485 490 495
Arg Arg Lys Val Lys Ser
500
<210> 2
<211> 531
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 16
<400> 2
Met Gln Val Thr Phe Ile Tyr Ile Leu Val Ile Thr Cys Tyr Glu Asn
1 5 10 15
Asp Val Asn Val Tyr His Ile Phe Phe Gln Met Ser Leu Trp Leu Pro
20 25 30
Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val Pro Val Ser Lys Val Val
35 40 45
Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn Ile Tyr Tyr His Ala Gly
50 55 60
Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Pro Ile Lys Lys
65 70 75 80
Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu Val Pro Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr
85 90 95
Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro
100 105 110
Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys
115 120 125
Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser
130 135 140
Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp Thr Glu Asn Ala Ser Ala
145 150 155 160
Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn Arg Glu Cys Ile Ser Met Asp
165 170 175
Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly Cys Lys Pro Pro Ile Gly
180 185 190
Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr Asn Val Ala Val Asn Pro
195 200 205
Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn Thr Val Ile Gln Asp Gly
210 215 220
Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asp Phe Thr Thr Leu Gln
225 230 235 240
Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys Thr Ser Ile Cys Lys
245 250 255
Tyr Pro Asp Tyr Ile Lys Met Val Ser Glu Pro Tyr Gly Asp Ser Leu
260 265 270
Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe Val Arg His Leu Phe Asn
275 280 285
Arg Ala Gly Ala Val Gly Asp Asn Val Pro Asp Asp Leu Tyr Ile Lys
290 295 300
Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser Ser Asn Tyr Phe Pro Thr
305 310 315 320
Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala Gln Ile Phe Asn Lys Pro
325 330 335
Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly
340 345 350
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Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu Thr Thr Tyr Lys Asn Thr
370 375 380
Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe
385 390 395 400
Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr Ala Asp Ile Met Thr Tyr
405 410 415
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Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Phe Val Thr
435 440 445
Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr Pro Pro Ala Pro Lys Glu
450 455 460
Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys
465 470 475 480
Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu
485 490 495
Gln Ala Gly Leu Glu Ala Lys Pro Lys Phe Thr Leu Gly Lys Arg Lys
500 505 510
Ala Thr Pro Thr Thr Ser Ser Thr Ser Thr Thr Ala Lys Arg Lys Lys
515 520 525
Arg Lys Leu
530
<210> 3
<211> 504
<212> PRT
<213> Human papillomavirus type 31
<400> 3
Met Ser Leu Trp Arg Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val
1 5 10 15
Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Thr Arg Thr Asn
20 25 30
Ile Tyr Tyr His Ala Gly Ser Ala Arg Leu Leu Thr Val Gly His Pro
35 40 45
Tyr Tyr Ser Ile Pro Lys Ser Asp Asn Pro Lys Lys Ile Val Val Pro
50 55 60
Lys Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Arg Leu Pro Asp
65 70 75 80
Pro Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Glu Thr
85 90 95
Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln
100 105 110
Pro Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Phe Asp
115 120 125
Asp Thr Glu Asn Ser Asn Arg Tyr Ala Gly Gly Pro Gly Thr Asp Asn
130 135 140
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Ser Asn Asn Ala Ile Thr Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys
180 185 190
Asn Ser Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala
195 200 205
Met Asp Phe Thr Ala Leu Gln Asp Thr Lys Ser Asn Val Pro Leu Asp
210 215 220
Ile Cys Asn Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Val Ala
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Glu Pro Tyr Gly Asp Thr Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met
245 250 255
Phe Val Arg His Phe Phe Asn Arg Ser Gly Thr Val Gly Glu Ser Val
260 265 270
Pro Thr Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Ala
275 280 285
Asn Ser Thr Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp
290 295 300
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Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp
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Glu Glu Phe Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu
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Ser Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Thr Arg Thr Asn
20 25 30
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35 40 45
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Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asp Pro Ala Ser Gln
85 90 95
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100 105 110
Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp
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Thr Glu Asn Ser Asn Lys Tyr Val Gly Asn Ser Gly Thr Asp Asn Arg
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195 200 205
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Cys Ser Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Val Ser Glu
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Asn Phe Gly Leu Thr Pro Pro Pro Ser Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr
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450 455 460
Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Arg Pro Asn Phe Arg Leu
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<220>
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<223> H35-16T4
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Tyr Tyr Ala Ile Lys Lys Gln Asp Ser Asn Lys Ile Ala Val Pro Lys
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<220>
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<223> H35-16T4-31S2
<400> 14
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165 170 175
Ala Asn Gln Val Lys Ala Gly Glu Cys Pro Pro Leu Glu Leu Leu Asn
180 185 190
Thr Val Leu Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met
195 200 205
Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Asp Val Pro Leu Asp Ile
210 215 220
Cys Ser Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Val Ser Glu
225 230 235 240
Pro Tyr Gly Asp Met Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe
245 250 255
Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Asp Asn Val Pro
260 265 270
Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser
275 280 285
Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala
290 295 300
Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn
305 310 315 320
Asn Gly Ile Cys Trp Ser Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr
325 330 335
Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Val Cys Ser Ala Val Ser Ser Ser Asp
340 345 350
Ser Thr Tyr Lys Asn Asp Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Arg His Gly Glu
355 360 365
Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr
370 375 380
Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Pro Ser Ile Leu Glu
385 390 395 400
Asp Trp Asn Phe Gly Leu Thr Pro Pro Pro Ser Gly Thr Leu Glu Asp
405 410 415
Thr Tyr Arg Tyr Val Thr Ser Gln Ala Val Thr Cys Gln Lys Pro Ser
420 425 430
Ala Pro Lys Pro Lys Asp Asp Pro Leu Lys Asn Tyr Thr Phe Trp Glu
435 440 445
Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu
450 455 460
Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Gly Leu Lys Ala Arg Pro Asn Phe
465 470 475 480
Arg Leu Gly Lys Arg Ala Ala Pro Ala Ser Thr Ser Lys Lys Ser Ser
485 490 495
Thr Lys Arg Arg Lys Val Lys Ser
500
<210> 15
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H35-16T4-31S3
<400> 15
Met Ser Leu Trp Arg Ser Asn Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pro Val
1 5 10 15
Ser Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Thr Arg Thr Asn
20 25 30
Ile Tyr Tyr His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ile Lys Lys Gln Asp Ser Asn Lys Ile Ala Val Pro Lys
50 55 60
Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Lys Leu Pro Asp Pro
65 70 75 80
Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asp Pro Ala Ser Gln
85 90 95
Arg Leu Val Trp Ala Cys Thr Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro
100 105 110
Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp
115 120 125
Thr Glu Asn Ser Asn Lys Tyr Val Gly Asn Ser Gly Thr Asp Asn Arg
130 135 140
Glu Cys Ile Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly
145 150 155 160
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165 170 175
Asn Asn Ala Ile Thr Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Leu Asn
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Thr Val Leu Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met
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Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Asp Val Pro Leu Asp Ile
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Cys Ser Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Lys Met Val Ser Glu
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Pro Tyr Gly Asp Met Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe
245 250 255
Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Asp Asn Val Pro
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275 280 285
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370 375 380
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<213> 人工序列
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<400> 16
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20 25 30
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50 55 60
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85 90 95
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100 105 110
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<212> DNA
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<223> 编码SEQ ID NO:1的DNA序列
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atgagcctgt ggaggagcaa cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgag cgtgagcaag 60
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aggctgctgg ccgtgggcca cccctactac gccatcaaga agcaggacag caacaagatc 180
gccgtgccca aggtgagcgg cctgcagtac agggtgttca gggtgaagct gcccgacccc 240
aacaagttcg gcttccccga caccagcttc tacgaccccg ccagccagag gctggtgtgg 300
gcctgcaccg gcgtggaggt gggcaggggc cagcccctgg gcgtgggcat cagcggccac 360
cccctgctga acaagctgga cgacaccgag aacagcaaca agtacgtggg caacagcggc 420
accgacaaca gggagtgcat cagcatggac tacaagcaga cccagctgtg cctgatcggc 480
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accggcaccc tgcccagcac cagctacttc cccaccccca gcggcagcat ggtgaccagc 900
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atctgctgga gcaaccagct gttcgtgacc gtggtggaca ccaccaggag caccaacatg 1020
agcgtgtgca gcgccgtgag cagcagcgac agcacctaca agaacgacaa cttcaaggag 1080
tacctgaggc acggcgagga gtacgacctg cagttcatct tccagctgtg caagatcacc 1140
ctgaccgccg acgtgatgac ctacatccac agcatgaacc ccagcatcct ggaggactgg 1200
aacttcggcc tgaccccccc ccccagcggc accctggagg acacctacag gtacgtgacc 1260
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<212> DNA
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caattgtgtt taattggttg caaaccacct ataggggaac actggggcaa aggatcccca 600
tgtaccaatg ttgcagtaaa tccaggtgat tgtccaccat tagagttaat aaacacagtt 660
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attaaaatgg tgtcagaacc atatggcgac agcttatttt tttatctacg aagggaacaa 840
atgtttgtta gacatttatt taatagggct ggtgctgttg gtgataatgt accagacgat 900
ttatacatta aaggctctgg gtctactgca aatttagcca gttcaaatta ttttcctaca 960
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gatactacac gcagtacaaa tatgtcatta tgtgctgcca tatctacttc agaaactaca 1140
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atggtggaca ccggcttcgg cgccatggac ttcaccgccc tgcaggacac caagagcaac 660
gtgcccctgg acatctgcaa cagcatctgc aagtaccccg actacctgaa gatggtggcc 720
gagccctacg gcgacaccct gttcttctac ctgaggaggg agcagatgtt cgtgaggcac 780
ttcttcaaca ggagcggcac cgtgggcgag agcgtgccca ccgacctgta catcaagggc 840
agcggcagca ccgccaccct ggccaacagc acctacttcc ccacccccag cggcagcatg 900
gtgaccagcg acgcccagat cttcaacaag ccctactgga tgcagagggc ccagggccac 960
aacaacggca tctgctgggg caaccagctg ttcgtgaccg tggtggacac caccaggagc 1020
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<210> 20
<211> 1509
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 编码SEQ ID NO:4的DNA序列
<400> 20
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ctcgtgccca aggtgagcgg cctgcagtac agggtgttca gggtgaagct gcccgacccc 240
aacaagttcg gcttccccga caccagcttc tacgaccccg ccagccagag gctggtgtgg 300
gcctgcaccg gcgtggaggt gggcaggggc cagcccctgg gcgtgggcat cagcggccac 360
cccctgctga acaagctgga cgacaccgag aacagcaaca agtacgtggg caacagcggc 420
accgacaaca gggagtgcat cagcatggac tacaagcaga cccagctgtg cctgatcggc 480
tgcaggcccc ccatcggcga gcactggggc aagggcaccc cctgcaacgc caaccaggtg 540
aaggccggcg agtgcccccc cctggagctg ctgaacaccg tgctgcagga cggcgacatg 600
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aactacacct tctgggaggt ggacctgaag gagaagttca gcgccgacct ggaccagttc 1380
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ggcaagaggg ccgcccccgc cagcaccagc aagaagagca gcaccaagag gaggaaggtg 1500
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<210> 21
<211> 1509
<212> DNA
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aggctgctgg ccgtgggcca cccctactac gccatcaaga agcaggacag caacaagatc 180
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aacaagttcg gcttccccga caccagcttc tacgaccccg ccagccagag gctggtgtgg 300
gcctgcaccg gtgttgaggt aggtcgtggt cagccattag gtgtgggcat tagtggccat 360
cctttattaa ataaattgga tgacacagaa aatgctagtg cttatgcagc aaatgcaggt 420
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aaggccggcg agtgcccccc cctggagctg ctgaacaccg tgctgcagga cggcgacatg 600
gtggacaccg gcttcggcgc catggacttc accaccctgc aggccaacaa gagcgacgtg 660
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ccctacggcg acatgctgtt cttctacctg aggagggagc agatgttcgt gaggcacctg 780
ttcaacaggg ccggcaccgt gggcgagacc gtgcccgccg acctgtacat caagggcacc 840
accggcaccc tgcccagcac cagctacttc cccaccccca gcggcagcat ggtgaccagc 900
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atctgctgga gcaaccagct gttcgtgacc gtggtggaca ccaccaggag caccaacatg 1020
agcgtgtgca gcgccgtgag cagcagcgac agcacctaca agaacgacaa cttcaaggag 1080
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ctgaccgccg acgtgatgac ctacatccac agcatgaacc ccagcatcct ggaggactgg 1200
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agccaggccg tgacctgcca gaagcccagc gcccccaagc ccaaggacga ccccctgaag 1320
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cccctgggca ggaagttcct gctgcaggcc ggcctgaagg ccaggcccaa cttcaggctg 1440
ggcaagaggg ccgcccccgc cagcaccagc aagaagagca gcaccaagag gaggaaggtg 1500
aagagctga 1509
<210> 22
<211> 1509
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:6的DNA序列
<400> 22
atgagcctgt ggaggagcaa cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgag cgtgagcaag 60
gtggtgagca ccgacgagta cgtgaccagg accaacatct actaccacgc cggcagcagc 120
aggctgctgg ccgtgggcca cccctactac gccatcaaga agcaggacag caacaagatc 180
gccgtgccca aggtgagcgg cctgcagtac agggtgttca gggtgaagct gcccgacccc 240
aacaagttcg gcttccccga caccagcttc tacgaccccg ccagccagag gctggtgtgg 300
gcctgcaccg gcgtggaggt gggcaggggc cagcccctgg gcgtgggcat cagcggccac 360
cccctgctga acaagctgga cgacaccgag aacagcaaca agtacgtggg caacagcggc 420
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aatccaggtg attgtccacc attagagtta ctgaacaccg tgctgcagga cggcgacatg 600
gtggacaccg gcttcggcgc catggacttc accaccctgc aggccaacaa gagcgacgtg 660
cccctggaca tctgcagcag catctgcaag taccccgact acctgaagat ggtgagcgag 720
ccctacggcg acatgctgtt cttctacctg aggagggagc agatgttcgt gaggcacctg 780
ttcaacaggg ccggcaccgt gggcgagacc gtgcccgccg acctgtacat caagggcacc 840
accggcaccc tgcccagcac cagctacttc cccaccccca gcggcagcat ggtgaccagc 900
gacgcccaga tcttcaacaa gccctactgg ctgcagaggg cccagggcca caacaacggc 960
atctgctgga gcaaccagct gttcgtgacc gtggtggaca ccaccaggag caccaacatg 1020
agcgtgtgca gcgccgtgag cagcagcgac agcacctaca agaacgacaa cttcaaggag 1080
tacctgaggc acggcgagga gtacgacctg cagttcatct tccagctgtg caagatcacc 1140
ctgaccgccg acgtgatgac ctacatccac agcatgaacc ccagcatcct ggaggactgg 1200
aacttcggcc tgaccccccc ccccagcggc accctggagg acacctacag gtacgtgacc 1260
agccaggccg tgacctgcca gaagcccagc gcccccaagc ccaaggacga ccccctgaag 1320
aactacacct tctgggaggt ggacctgaag gagaagttca gcgccgacct ggaccagttc 1380
cccctgggca ggaagttcct gctgcaggcc ggcctgaagg ccaggcccaa cttcaggctg 1440
ggcaagaggg ccgcccccgc cagcaccagc aagaagagca gcaccaagag gaggaaggtg 1500
aagagctga 1509
<210> 23
<211> 1515
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:7的DNA序列
<400> 23
atgagcctgt ggaggagcaa cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgag cgtgagcaag 60
gtggtgagca ccgacgagta cgtgaccagg accaacatct actaccacgc cggcagcagc 120
aggctgctgg ccgtgggcca cccctactac gccatcaaga agcaggacag caacaagatc 180
gccgtgccca aggtgagcgg cctgcagtac agggtgttca gggtgaagct gcccgacccc 240
aacaagttcg gcttccccga caccagcttc tacgaccccg ccagccagag gctggtgtgg 300
gcctgcaccg gcgtggaggt gggcaggggc cagcccctgg gcgtgggcat cagcggccac 360
cccctgctga acaagctgga cgacaccgag aacagcaaca agtacgtggg caacagcggc 420
accgacaaca gggagtgcat cagcatggac tacaagcaga cccagctgtg cctgatcggc 480
tgcaggcccc ccatcggcga gcactggggc aagggcaccc cctgcaacgc caaccaggtg 540
aaggccggcg agtgcccccc cctggagctg ctgaacaccg tgctgcagga cggcgacatg 600
gtggacaccg gcttcggcgc catggacttc accaccctgc aggccaacaa gagcgacgtg 660
cccctggaca tctgcagcag catctgcaag taccccgact acctgaagat ggtgagcgag 720
ccctacggcg acatgctgtt tttttatcta cgaagggaac aaatgtttgt tagacattta 780
tttaataggg ctggtgctgt tggtgataat gtaccagacg atttatacat taaaggctct 840
gggtctactg caaatttagc cagttcaaat tattttccta cacctagtgg ttctatggtt 900
acctctgatg cccaaatatt caataaacct tactggttac aacgagcaca gggccacaat 960
aatggcattt gttggagcaa ccagctgttc gtgaccgtgg tggacaccac caggagcacc 1020
aacatgagcg tgtgcagcgc cgtgagcagc agcgacagca cctacaagaa cgacaacttc 1080
aaggagtacc tgaggcacgg cgaggagtac gacctgcagt tcatcttcca gctgtgcaag 1140
atcaccctga ccgccgacgt gatgacctac atccacagca tgaaccccag catcctggag 1200
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aaggtgaaga gctga 1515
<210> 24
<211> 1509
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:8的DNA序列
<400> 24
atgagcctgt ggaggagcaa cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgag cgtgagcaag 60
gtggtgagca ccgacgagta cgtgaccagg accaacatct actaccacgc cggcagcagc 120
aggctgctgg ccgtgggcca cccctactac gccatcaaga agcaggacag caacaagatc 180
gccgtgccca aggtgagcgg cctgcagtac agggtgttca gggtgaagct gcccgacccc 240
aacaagttcg gcttccccga caccagcttc tacgaccccg ccagccagag gctggtgtgg 300
gcctgcaccg gcgtggaggt gggcaggggc cagcccctgg gcgtgggcat cagcggccac 360
cccctgctga acaagctgga cgacaccgag aacagcaaca agtacgtggg caacagcggc 420
accgacaaca gggagtgcat cagcatggac tacaagcaga cccagctgtg cctgatcggc 480
tgcaggcccc ccatcggcga gcactggggc aagggcaccc cctgcaacgc caaccaggtg 540
aaggccggcg agtgcccccc cctggagctg ctgaacaccg tgctgcagga cggcgacatg 600
gtggacaccg gcttcggcgc catggacttc accaccctgc aggccaacaa gagcgacgtg 660
cccctggaca tctgcagcag catctgcaag taccccgact acctgaagat ggtgagcgag 720
ccctacggcg acatgctgtt cttctacctg aggagggagc agatgttcgt gaggcacctg 780
ttcaacaggg ccggcaccgt gggcgagacc gtgcccgccg acctgtacat caagggcacc 840
accggcaccc tgcccagcac cagctacttc cccaccccca gcggcagcat ggtgaccagc 900
gacgcccaga tcttcaacaa gccctactgg ctgcagaggg cccagggcca caacaacggc 960
atctgctgga gcaaccagct gttcgtgacc gtggtggaca ccaccaggag caccaacatg 1020
agcgtgtgca gcgccatatc tacttcagaa actacatata aaaatactaa ctttaaggag 1080
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aactacacct tctgggaggt ggacctgaag gagaagttca gcgccgacct ggaccagttc 1380
cccctgggca ggaagttcct gctgcaggcc ggcctgaagg ccaggcccaa cttcaggctg 1440
ggcaagaggg ccgcccccgc cagcaccagc aagaagagca gcaccaagag gaggaaggtg 1500
aagagctga 1509
<210> 25
<211> 1509
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:9的DNA序列
<400> 25
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aggctgctgg ccgtgggcca cccctacttc cccatcaaga agccgaacaa caacaagatc 180
ctcgtgccca aggtgagcgg cctgcagtac agggtgttca gggtgaagct gcccgacccc 240
aacaagttcg gcttccccga caccagcttc tacgaccccg ccagccagag gctggtgtgg 300
gcctgcaccg gcgtggaggt gggcaggggc cagcccctgg gcgtgggcat cagcggccac 360
cccctgctga acaagttcga cgacaccgag aacagcaaca ggtacgccgg cggccccggc 420
accgacaaca gggagtgcat cagcatggac tacaagcaga cccagctgtg cctgatcggc 480
tgcaggcccc ccatcggcga gcactggggc aagggcaccc cctgcaacgc caaccaggtg 540
aaggccggcg agtgcccccc cctggagctg ctgaacaccg tgctgcagga cggcgacatg 600
gtggacaccg gcttcggcgc catggacttc accaccctgc aggccaacaa gagcgacgtg 660
cccctggaca tctgcagcag catctgcaag taccccgact acctgaagat ggtgagcgag 720
ccctacggcg acatgctgtt cttctacctg aggagggagc agatgttcgt gaggcacctg 780
ttcaacaggg ccggcaccgt gggcgagacc gtgcccgccg acctgtacat caagggcacc 840
accggcaccc tgcccagcac cagctacttc cccaccccca gcggcagcat ggtgaccagc 900
gacgcccaga tcttcaacaa gccctactgg ctgcagaggg cccagggcca caacaacggc 960
atctgctgga gcaaccagct gttcgtgacc gtggtggaca ccaccaggag caccaacatg 1020
agcgtgtgca gcgccgtgag cagcagcgac agcacctaca agaacgacaa cttcaaggag 1080
tacctgaggc acggcgagga gtacgacctg cagttcatct tccagctgtg caagatcacc 1140
ctgaccgccg acgtgatgac ctacatccac agcatgaacc ccagcatcct ggaggactgg 1200
aacttcggcc tgaccccccc ccccagcggc accctggagg acacctacag gtacgtgacc 1260
agccaggccg tgacctgcca gaagcccagc gcccccaagc ccaaggacga ccccctgaag 1320
aactacacct tctgggaggt ggacctgaag gagaagttca gcgccgacct ggaccagttc 1380
cccctgggca ggaagttcct gctgcaggcc ggcctgaagg ccaggcccaa cttcaggctg 1440
ggcaagaggg ccgcccccgc cagcaccagc aagaagagca gcaccaagag gaggaaggtg 1500
aagagctga 1509
<210> 26
<211> 1509
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:10的DNA序列
<400> 26
atgagcctgt ggaggagcaa cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgag cgtgagcaag 60
gtggtgagca ccgacgagta cgtgaccagg accaacatct actaccacgc cggcagcagc 120
aggctgctgg ccgtgggcca cccctacttc cccatcaaga agccgaacaa caacaagatc 180
ctcgtgccca aggtgagcgg cctgcagtac agggtgttca gggtgaagct gcccgacccc 240
aacaagttcg gcttccccga caccagcttc tacgaccccg ccagccagag gctggtgtgg 300
gcctgcaccg gcgtggaggt gggcaggggc cagcccctgg gcgtgggcat cagcggccac 360
cccctgctga acaagctgga cgacaccgag aacagcaaca agtacgtggg caacagcggc 420
accgacaaca gggagtgcat cagcatggac tacaagcaga cccagctgtg cctgatcggc 480
tgcaggcccc ccatcggcga gcactggggc aagggcagcc cctgcagcaa caacgccatc 540
acccccggcg actgcccccc cctggagctg ctgaacaccg tgctgcagga cggcgacatg 600
gtggacaccg gcttcggcgc catggacttc accaccctgc aggccaacaa gagcgacgtg 660
cccctggaca tctgcagcag catctgcaag taccccgact acctgaagat ggtgagcgag 720
ccctacggcg acatgctgtt cttctacctg aggagggagc agatgttcgt gaggcacctg 780
ttcaacaggg ccggcaccgt gggcgagacc gtgcccgccg acctgtacat caagggcacc 840
accggcaccc tgcccagcac cagctacttc cccaccccca gcggcagcat ggtgaccagc 900
gacgcccaga tcttcaacaa gccctactgg ctgcagaggg cccagggcca caacaacggc 960
atctgctgga gcaaccagct gttcgtgacc gtggtggaca ccaccaggag caccaacatg 1020
agcgtgtgca gcgccgtgag cagcagcgac agcacctaca agaacgacaa cttcaaggag 1080
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agccaggccg tgacctgcca gaagcccagc gcccccaagc ccaaggacga ccccctgaag 1320
aactacacct tctgggaggt ggacctgaag gagaagttca gcgccgacct ggaccagttc 1380
cccctgggca ggaagttcct gctgcaggcc ggcctgaagg ccaggcccaa cttcaggctg 1440
ggcaagaggg ccgcccccgc cagcaccagc aagaagagca gcaccaagag gaggaaggtg 1500
aagagctga 1509
<210> 27
<211> 1515
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:11的DNA序列
<400> 27
atgagcctgt ggaggagcaa cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgag cgtgagcaag 60
gtggtgagca ccgacgagta cgtgaccagg accaacatct actaccacgc cggcagcagc 120
aggctgctgg ccgtgggcca cccctacttc cccatcaaga agccgaacaa caacaagatc 180
ctcgtgccca aggtgagcgg cctgcagtac agggtgttca gggtgaagct gcccgacccc 240
aacaagttcg gcttccccga caccagcttc tacgaccccg ccagccagag gctggtgtgg 300
gcctgcaccg gcgtggaggt gggcaggggc cagcccctgg gcgtgggcat cagcggccac 360
cccctgctga acaagctgga cgacaccgag aacagcaaca agtacgtggg caacagcggc 420
accgacaaca gggagtgcat cagcatggac tacaagcaga cccagctgtg cctgatcggc 480
tgcaggcccc ccatcggcga gcactggggc aagggcaccc cctgcaacgc caaccaggtg 540
aaggccggcg agtgcccccc cctggagctg ctgaacaccg tgctgcagga cggcgacatg 600
gtggacaccg gcttcggcgc catggacttc accaccctgc aggccaacaa gagcgacgtg 660
cccctggaca tctgcagcag catctgcaag taccccgact acctgaagat ggtgagcgag 720
ccctacggcg acatgctgtt cttctacctg aggagggagc agatgttcgt gaggcacttc 780
ttcaacagga gcggcaccgt gggcgagagc gtgcccaccg acctgtacat caagggcagc 840
ggcagcaccg ccaccctggc caacagcacc tacttcccca cccccagcgg cagcatggtg 900
accagcgacg cccagatctt caacaagccc tactggctgc agagggccca gggccacaac 960
aacggcatct gctggagcaa ccagctgttc gtgaccgtgg tggacaccac caggagcacc 1020
aacatgagcg tgtgcagcgc cgtgagcagc agcgacagca cctacaagaa cgacaacttc 1080
aaggagtacc tgaggcacgg cgaggagtac gacctgcagt tcatcttcca gctgtgcaag 1140
atcaccctga ccgccgacgt gatgacctac atccacagca tgaaccccag catcctggag 1200
gactggaact tcggcctgac cccccccccc agcggcaccc tggaggacac ctacaggtac 1260
gtgaccagcc aggccgtgac ctgccagaag cccagcgccc ccaagcccaa ggacgacccc 1320
ctgaagaact acaccttctg ggaggtggac ctgaaggaga agttcagcgc cgacctggac 1380
cagttccccc tgggcaggaa gttcctgctg caggccggcc tgaaggccag gcccaacttc 1440
aggctgggca agagggccgc ccccgccagc accagcaaga agagcagcac caagaggagg 1500
aaggtgaaga gctga 1515
<210> 28
<211> 1509
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:12的DNA序列
<400> 28
atgagcctgt ggaggagcaa cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgag cgtgagcaag 60
gtggtgagca ccgacgagta cgtgaccagg accaacatct actaccacgc cggcagcagc 120
aggctgctgg ccgtgggcca cccctacttc cccatcaaga agccgaacaa caacaagatc 180
ctcgtgccca aggtgagcgg cctgcagtac agggtgttca gggtgaagct gcccgacccc 240
aacaagttcg gcttccccga caccagcttc tacgaccccg ccagccagag gctggtgtgg 300
gcctgcaccg gcgtggaggt gggcaggggc cagcccctgg gcgtgggcat cagcggccac 360
cccctgctga acaagctgga cgacaccgag aacagcaaca agtacgtggg caacagcggc 420
accgacaaca gggagtgcat cagcatggac tacaagcaga cccagctgtg cctgatcggc 480
tgcaggcccc ccatcggcga gcactggggc aagggcaccc cctgcaacgc caaccaggtg 540
aaggccggcg agtgcccccc cctggagctg ctgaacaccg tgctgcagga cggcgacatg 600
gtggacaccg gcttcggcgc catggacttc accaccctgc aggccaacaa gagcgacgtg 660
cccctggaca tctgcagcag catctgcaag taccccgact acctgaagat ggtgagcgag 720
ccctacggcg acatgctgtt cttctacctg aggagggagc agatgttcgt gaggcacctg 780
ttcaacaggg ccggcaccgt gggcgagacc gtgcccgccg acctgtacat caagggcacc 840
accggcaccc tgcccagcac cagctacttc cccaccccca gcggcagcat ggtgaccagc 900
gacgcccaga tcttcaacaa gccctactgg ctgcagaggg cccagggcca caacaacggc 960
atctgctgga gcaaccagct gttcgtgacc gtggtggaca ccaccaggag caccaacatg 1020
agcgtgtgca gcgccatcgc caacagcgac accaccttca agagcagcaa cttcaaggag 1080
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cccctgggca ggaagttcct gctgcaggcc ggcctgaagg ccaggcccaa cttcaggctg 1440
ggcaagaggg ccgcccccgc cagcaccagc aagaagagca gcaccaagag gaggaaggtg 1500
aagagctga 1509
<210> 29
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:13的DNA序列
<400> 29
atgagcctgt ggaggagcaa cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgag cgtgagcaag 60
gtggtgagca ccgacgagta cgtgaccagg accaacatct actaccacgc cggcagcagc 120
aggctgctgg ccgtgggcca cccctactac agcatcccca agagcgacaa ccccaagaag 180
atcgtggtgc ccaaggtgag cggcctgcag tacagggtgt tcagggtgaa gctgcccgac 240
cccaacaagt tcggcttccc cgacaccagc ttctacgacc ccgccagcca gaggctggtg 300
tgggcctgca ccggcgtgga ggtgggcagg ggccagcccc tgggcgtggg catcagcggc 360
caccccctgc tgaacaagct ggacgacacc gagaacagca acaagtacgt gggcaacagc 420
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ggctgcaggc cccccatcgg cgagcactgg ggcaagggca ccccctgcaa cgccaaccag 540
gtgaaggccg gcgagtgccc ccccctggag ctgctgaaca ccgtgctgca ggacggcgac 600
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gtgcccctgg acatctgcag cagcatctgc aagtaccccg actacctgaa gatggtgagc 720
gagccctacg gcgacatgct gtttttttat ctacgaaggg aacaaatgtt tgttagacat 780
ttatttaata gggctggtgc tgttggtgat aatgtaccag acgatttata cattaaaggc 840
tctgggtcta ctgcaaattt agccagttca aattattttc ctacacctag tggttctatg 900
gttacctctg atgcccaaat attcaataaa ccttactggt tacaacgagc acagggccac 960
aataatggca tttgttggag caaccagctg ttcgtgaccg tggtggacac caccaggagc 1020
accaacatga gcgtgtgcag cgccgtgagc agcagcgaca gcacctacaa gaacgacaac 1080
ttcaaggagt acctgaggca cggcgaggag tacgacctgc agttcatctt ccagctgtgc 1140
aagatcaccc tgaccgccga cgtgatgacc tacatccaca gcatgaaccc cagcatcctg 1200
gaggactgga acttcggcct gacccccccc cccagcggca ccctggagga cacctacagg 1260
tacgtgacca gccaggccgt gacctgccag aagcccagcg cccccaagcc caaggacgac 1320
cccctgaaga actacacctt ctgggaggtg gacctgaagg agaagttcag cgccgacctg 1380
gaccagttcc ccctgggcag gaagttcctg ctgcaggccg gcctgaaggc caggcccaac 1440
ttcaggctgg gcaagagggc cgcccccgcc agcaccagca agaagagcag caccaagagg 1500
aggaaggtga agagctga 1518
<210> 30
<211> 1515
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:14的DNA序列
<400> 30
atgagcctgt ggaggagcaa cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgag cgtgagcaag 60
gtggtgagca ccgacgagta cgtgaccagg accaacatct actaccacgc cggcagcagc 120
aggctgctgg ccgtgggcca cccctactac gccatcaaga agcaggacag caacaagatc 180
gccgtgccca aggtgagcgg cctgcagtac agggtgttca gggtgaagct gcccgacccc 240
aacaagttcg gcttccccga caccagcttc tacgaccccg ccagccagag gctggtgtgg 300
gcctgcaccg gcgtggaggt gggcaggggc cagcccctgg gcgtgggcat cagcggccac 360
cccctgctga acaagttcga cgacaccgag aacagcaaca ggtacgccgg cggccccggc 420
accgacaaca gggagtgcat cagcatggac tacaagcaga cccagctgtg cctgatcggc 480
tgcaggcccc ccatcggcga gcactggggc aagggcaccc cctgcaacgc caaccaggtg 540
aaggccggcg agtgcccccc cctggagctg ctgaacaccg tgctgcagga cggcgacatg 600
gtggacaccg gcttcggcgc catggacttc accaccctgc aggccaacaa gagcgacgtg 660
cccctggaca tctgcagcag catctgcaag taccccgact acctgaagat ggtgagcgag 720
ccctacggcg acatgctgtt tttttatcta cgaagggaac aaatgtttgt tagacattta 780
tttaataggg ctggtgctgt tggtgataat gtaccagacg atttatacat taaaggctct 840
gggtctactg caaatttagc cagttcaaat tattttccta cacctagtgg ttctatggtt 900
acctctgatg cccaaatatt caataaacct tactggttac aacgagcaca gggccacaat 960
aatggcattt gttggagcaa ccagctgttc gtgaccgtgg tggacaccac caggagcacc 1020
aacatgagcg tgtgcagcgc cgtgagcagc agcgacagca cctacaagaa cgacaacttc 1080
aaggagtacc tgaggcacgg cgaggagtac gacctgcagt tcatcttcca gctgtgcaag 1140
atcaccctga ccgccgacgt gatgacctac atccacagca tgaaccccag catcctggag 1200
gactggaact tcggcctgac cccccccccc agcggcaccc tggaggacac ctacaggtac 1260
gtgaccagcc aggccgtgac ctgccagaag cccagcgccc ccaagcccaa ggacgacccc 1320
ctgaagaact acaccttctg ggaggtggac ctgaaggaga agttcagcgc cgacctggac 1380
cagttccccc tgggcaggaa gttcctgctg caggccggcc tgaaggccag gcccaacttc 1440
aggctgggca agagggccgc ccccgccagc accagcaaga agagcagcac caagaggagg 1500
aaggtgaaga gctga 1515
<210> 31
<211> 1515
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:15的DNA序列
<400> 31
atgagcctgt ggaggagcaa cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgag cgtgagcaag 60
gtggtgagca ccgacgagta cgtgaccagg accaacatct actaccacgc cggcagcagc 120
aggctgctgg ccgtgggcca cccctactac gccatcaaga agcaggacag caacaagatc 180
gccgtgccca aggtgagcgg cctgcagtac agggtgttca gggtgaagct gcccgacccc 240
aacaagttcg gcttccccga caccagcttc tacgaccccg ccagccagag gctggtgtgg 300
gcctgcaccg gcgtggaggt gggcaggggc cagcccctgg gcgtgggcat cagcggccac 360
cccctgctga acaagctgga cgacaccgag aacagcaaca agtacgtggg caacagcggc 420
accgacaaca gggagtgcat cagcatggac tacaagcaga cccagctgtg cctgatcggc 480
tgcaggcccc ccatcggcga gcactggggc aagggcagcc cctgcagcaa caacgccatc 540
acccccggcg actgcccccc cctggagctg ctgaacaccg tgctgcagga cggcgacatg 600
gtggacaccg gcttcggtgc catggacttc accaccctgc aggccaacaa gagcgacgtg 660
cccctggaca tctgcagcag catctgcaag taccccgact acctgaagat ggtgagcgag 720
ccctacggcg acatgctgtt tttttatcta cgaagggaac aaatgtttgt tagacattta 780
tttaataggg ctggtgctgt tggtgataat gtaccagacg atttatacat taaaggctct 840
gggtctactg caaatttagc cagttcaaat tattttccta cacctagtgg ttctatggtt 900
acctctgatg cccaaatatt caataaacct tactggttac aacgagcaca gggccacaat 960
aatggcattt gttggagcaa ccagctgttc gtgaccgtgg tggacaccac caggagcacc 1020
aacatgagcg tgtgcagcgc cgtgagcagc agcgacagca cctacaagaa cgacaacttc 1080
aaggagtacc tgaggcacgg cgaggagtac gacctgcagt tcatcttcca gctgtgcaag 1140
atcaccctga ccgccgacgt gatgacctac atccacagca tgaaccccag catcctggag 1200
gactggaact tcggcctgac cccccccccc agcggcaccc tggaggacac ctacaggtac 1260
gtgaccagcc aggccgtgac ctgccagaag cccagcgccc ccaagcccaa ggacgacccc 1320
ctgaagaact acaccttctg ggaggtggac ctgaaggaga agttcagcgc cgacctggac 1380
cagttccccc tgggcaggaa gttcctgctg caggccggcc tgaaggccag gcccaacttc 1440
aggctgggca agagggccgc ccccgccagc accagcaaga agagcagcac caagaggagg 1500
aaggtgaaga gctga 1515
<210> 32
<211> 1515
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码SEQ ID NO:16的DNA序列
<400> 32
atgagcctgt ggaggagcaa cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgag cgtgagcaag 60
gtggtgagca ccgacgagta cgtgaccagg accaacatct actaccacgc cggcagcagc 120
aggctgctgg ccgtgggcca cccctactac gccatcaaga agcaggacag caacaagatc 180
gccgtgccca aggtgagcgg cctgcagtac agggtgttca gggtgaagct gcccgacccc 240
aacaagttcg gcttccccga caccagcttc tacgaccccg ccagccagag gctggtgtgg 300
gcctgcaccg gcgtggaggt gggcaggggc cagcccctgg gcgtgggcat cagcggccac 360
cccctgctga acaagctgga cgacaccgag aacagcaaca agtacgtggg caacagcggc 420
accgacaaca gggagtgcat cagcatggac tacaagcaga cccagctgtg cctgatcggc 480
tgcaggcccc ccatcggcga gcactggggc aagggcaccc cctgcaacgc caaccaggtg 540
aaggccggcg agtgcccccc cctggagctg ctgaacaccg tgctgcagga cggcgacatg 600
gtggacaccg gcttcggcgc catggacttc accaccctgc aggccaacaa gagcgacgtg 660
cccctggaca tctgcagcag catctgcaag taccccgact acctgaagat ggtgagcgag 720
ccctacggcg acatgctgtt tttttatcta cgaagggaac aaatgtttgt tagacattta 780
tttaataggg ctggtgctgt tggtgataat gtaccagacg atttatacat taaaggctct 840
gggtctactg caaatttagc cagttcaaat tattttccta cacctagtgg ttctatggtt 900
acctctgatg cccaaatatt caataaacct tactggttac aacgagcaca gggccacaat 960
aatggcattt gttggagcaa ccagctgttc gtgaccgtgg tggacaccac caggagcacc 1020
aacatgagcg tgtgcagcgc catcgccaac agcgacacca ccttcaagag cagcaacttc 1080
aaggagtacc tgaggcacgg cgaggagtac gacctgcagt tcatcttcca gctgtgcaag 1140
atcaccctga ccgccgacgt gatgacctac atccacagca tgaaccccag catcctggag 1200
gactggaact tcggcctgac cccccccccc agcggcaccc tggaggacac ctacaggtac 1260
gtgaccagcc aggccgtgac ctgccagaag cccagcgccc ccaagcccaa ggacgacccc 1320
ctgaagaact acaccttctg ggaggtggac ctgaaggaga agttcagcgc cgacctggac 1380
cagttccccc tgggcaggaa gttcctgctg caggccggcc tgaaggccag gcccaacttc 1440
aggctgggca agagggccgc ccccgccagc accagcaaga agagcagcac caagaggagg 1500
aaggtgaaga gctga 1515
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型HPV16 L1蛋白第76-87位的氨基酸残基的序列
<400> 33
Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Ile Leu
1 5 10
<210> 34
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型HPV16 L1蛋白第292-316位的氨基酸残基的序列
<400> 34
Ala Val Gly Asp Asn Val Pro Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly
1 5 10 15
Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser Ser Asn
20 25
<210> 35
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型HPV31 L1蛋白第127-140位的氨基酸残基的序列
<400> 35
Phe Asp Asp Thr Glu Asn Ser Asn Arg Tyr Ala Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型HPV31 L1蛋白第174-185位的氨基酸残基的序列
<400> 36
Ser Pro Cys Ser Asn Asn Ala Ile Thr Pro Gly Asp
1 5 10
<210> 37
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型HPV31 L1蛋白第261-291位的氨基酸残基的序列
<400> 37
Phe Phe Asn Arg Ser Gly Thr Val Gly Glu Ser Val Pro Thr Asp Leu
1 5 10 15
Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Thr Leu Ala Asn Ser Thr
20 25 30
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型HPV31 L1蛋白第349-359位的氨基酸残基的序列
<400> 38
Ile Ala Asn Ser Asp Thr Thr Phe Lys Ser Ser
1 5 10
<210> 39
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 野生型HPV31 L1蛋白第51-62位的氨基酸残基的序列
<400> 39
Ser Ile Pro Lys Ser Asp Asn Pro Lys Lys Ile Val
1 5 10
<210> 40
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
cacccctact tccccatcaa gaagccgaac aacaacaaga tcttcgtgcc caagg 55
<210> 41
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 41
ccttgggcac gaagatcttg ttgttgttcg gcttcttgat ggggaagtag gggtg 55
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
aggcccccca tcggcgagca ctg 23
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
ggtgcaggcc cacaccagcc tctgg 25
<210> 44
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
cagaggctgg tgtgggcctg caccggtgtt gaggtaggtc gtggtc 46
<210> 45
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
cagtgctcgc cgatgggggg cctgcaacca attaaacaca attgtg 46
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 46
ctgaacaccg tgctgcagga c 21
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 47
cctgcagccg atcaggcaca gc 22
<210> 48
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 48
cagctgtgcc tgatcggctg caggccacct ataggggaac actggg 46
<210> 49
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 49
ccgtcctgca gcacggtgtt cagtaactct aatggtggac aatc 44
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
tggagcaacc agctgttcgt gaccg 25
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
aacagcatgt cgccgtaggg ctcgc 25
<210> 52
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
agcgagccct acggcgacat gctgtttttt tatctacgaa gggaacaaat 50
<210> 53
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
ggtcacgaac agctggttgc tccaacaaat gccattattg tggccctgtg 50
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
gtgatgacct acatccacag c 21
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
gctgcacacg ctcatgttgg t 21
<210> 56
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
accaacatga gcgtgtgcag cgccatatct acttcagaaa ctac 44
<210> 57
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 57
atgctgtgga tgtaggtcat cacgtctgca gttaaggtta ttttg 45
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 58
atcggctgca ggccccccat cgg 23
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 59
cacgccggtg caggcccaca ccag 24
<210> 60
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 60
tggtgtgggc ctgcaccggc gtggaggtgg gcaggggcca gcc 43
<210> 61
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 61
ccgatggggg gcctgcagcc gatcaggcac agctgggtct gct 43
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 62
ctgaacaccg tgctgcagga cg 22
<210> 63
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
cctgcagccg atcaggcaca gc 22
<210> 64
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
cagctgtgcc tgatcggctg caggcccccc atcggcgagc actg 44
<210> 65
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
cgtcctgcag cacggtgttc agcagctcca ggggggggca gt 42
<210> 66
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
ctgcagaggg cccagggcca caac 24
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
catgtcgccg tagggctcgc tcac 24
<210> 68
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 68
gtgagcgagc cctacggcga catgctgttc ttctacctga ggaggg 46
<210> 69
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 69
gttgtggccc tgggccctct gcagccagta gggcttgttg aagatct 47
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 70
tacgacctgc agttcatctt cc 22
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 71
gctgcacacg ctcatgttgg tg 22
<210> 72
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 72
gcaccaacat gagcgtgtgc agcgccatcg ccaacagcga cac 43
<210> 73
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 73
tggaagatga actgcaggtc gtactcctcg ccgtgcctca ggt 43
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 74
aagctgcccg accccaacaa gt 22
<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 75
ggccagcagc ctgctgctgc cgg 23
<210> 76
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 76
cggcagcagc aggctgctgg ccgtgggcca cccctactac ag 42
<210> 77
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 77
cttgttgggg tcgggcagct tcaccctgaa caccctgtac tgc 43
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 78
atcggctgca ggccccccat cgg 23
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 79
cacgccggtg caggcccaca c 21
<210> 80
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 80
ctggtgtggg cctgcaccgg cgtggaggtg ggcaggggcc agcc 44
<210> 81
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 81
ccgatggggg gcctgcagcc gatcaggcac agctgggtct gcttg 45
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 82
ctgaacaccg tgctgcagga cg 22
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 83
cctgcagccg atcaggcaca gc 22
<210> 84
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 84
agctgtgcct gatcggctgc aggcccccca tcggcgagca ctg 43
<210> 85
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 85
ccgtcctgca gcacggtgtt cagcagctcc aggggggggc ag 42
<210> 86
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 86
tacgacctgc agttcatctt cc 22
<210> 87
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 87
gctgcacacg ctcatgttgg tg 22
<210> 88
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 88
gcaccaacat gagcgtgtgc agcgccatcg ccaacagcga cac 43
<210> 89
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 89
ctggaagatg aactgcaggt cgtactcctc gccgtgcctc agg 43

Claims (36)

1.一种突变的HPV35 L1蛋白，其中，所述突变的HPV35 L1蛋白与野生型HPV35 L1蛋白相比，具有下述突变：
(1)(a)位于野生型HPV35 L1蛋白第50-61位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；或
(1)(b)位于野生型HPV35 L1蛋白第266-288位的氨基酸残基被替换为野生型HPV16 L1蛋白的相应位置的氨基酸残基。
2.权利要求1所述的突变的HPV35 L1蛋白，其中，所述突变的HPV35 L1蛋白具有(1)(a)中所定义的突变，并且任选地，还具有下述突变：
(2)位于野生型HPV35 L1蛋白第126-139位的氨基酸残基被替换为野生型HPV31 L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；
(3)位于野生型HPV35 L1蛋白第173-184位的氨基酸残基被替换为野生型HPV31 L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；
(4)位于野生型HPV35 L1蛋白第260-288位的氨基酸残基被替换为野生型HPV31 L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；或
(5)位于野生型HPV35 L1蛋白第346-356位的氨基酸残基被替换为野生型HPV31 L1蛋白的相应位置的氨基酸残基。
3.权利要求1所述的突变的HPV35 L1蛋白，所述突变的HPV35L1蛋白具有(1)(b)中所定义的突变，并且任选地，还具有下述突变：
(6)位于野生型HPV35 L1蛋白第51-61位的氨基酸残基被替换为野生型HPV31 L1蛋白的相应位置的氨基酸残基。
4.权利要求1所述的突变的HPV35 L1蛋白，其中，(1)(a)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV16 L1蛋白第76-87位的氨基酸残基。
5.权利要求1所述的突变的HPV35 L1蛋白，其中，(1)(b)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV16 L1蛋白第292-316位的氨基酸残基。
6.权利要求2所述的突变的HPV35 L1蛋白，其中，(2)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV31 L1蛋白第127-140位的氨基酸残基。
7.权利要求2所述的突变的HPV35 L1蛋白，其中，(3)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV31 L1蛋白第174-185位的氨基酸残基。
8.权利要求2所述的突变的HPV35 L1蛋白，其中，(4)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV31 L1蛋白第261-291位的氨基酸残基。
9.权利要求2所述的突变的HPV35 L1蛋白，其中，(5)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV31 L1蛋白第349-359位的氨基酸残基。
10.权利要求3所述的突变的HPV35 L1蛋白，其中，(6)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV31 L1蛋白第51-62位的氨基酸残基。
11.权利要求1-10任一项所述的突变的HPV35 L1蛋白，其中，所述野生型HPV35 L1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
12.权利要求1-10任一项所述的突变的HPV35 L1蛋白，其中，所述野生型HPV16 L1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
13.权利要求2-10任一项所述的突变的HPV35 L1蛋白，其中，所述野生型HPV31 L1蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
14.权利要求1-10任一项所述的突变的HPV35 L1蛋白，其中，所述突变的HPV35 L1蛋白由选自下列的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:4、7、9、10、11、12或13。
15.一种分离的核酸，其编码权利要求1-14任一项所述的突变的HPV35 L1蛋白。
16.包含权利要求15所述的分离的核酸的载体。
17.包含权利要求15所述的分离的核酸和/或权利要求16所述的载体的宿主细胞。
18.一种HPV病毒样颗粒，其含有权利要求1-14任一项所述的突变的HPV35 L1蛋白，或者由权利要求1-14任一项所述的突变的HPV35 L1蛋白组成。
19.一种组合物，其包含权利要求1-14任一项所述的突变的HPV35 L1蛋白，或权利要求15的分离的核酸，或权利要求16的载体，或权利要求17的宿主细胞，或权利要求18的HPV病毒样颗粒。
20.一种药物组合物，其包含权利要求18的HPV病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。
21.权利要求20所述的药物组合物，其中，所述HPV病毒样颗粒以预防HPV感染或由HPV感染导致的疾病的有效量存在。
22.权利要求21所述的药物组合物，其中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染。
23.权利要求22所述的药物组合物，其中，所述HPV感染是HPV35感染、HPV16感染和/或HPV31感染。
24.权利要求21所述的药物组合物，其中，所述由HPV感染所导致的疾病选自宫颈癌和尖锐湿疣。
25.权利要求20-24任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物是疫苗。
26.制备权利要求1-14任一项所述的突变的HPV35 L1蛋白的方法，其包括，在宿主细胞中表达所述突变的HPV35 L1蛋白，然后从所述宿主细胞的培养物中回收所述突变的HPV35L1蛋白。
27.权利要求26所述的方法，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
28.权利要求27所述的方法，其中，所述方法包括步骤：在大肠杆菌中表达所述突变的HPV35 L1蛋白，然后从所述大肠杆菌的裂解上清中纯化得到所述突变的HPV35 L1蛋白。
29.权利要求26-28任一项所述的方法，其中，所述方法还包括通过色谱法，从所述大肠杆菌的裂解上清中回收所述突变的HPV35 L1蛋白的步骤。
30.权利要求29所述的方法，其中，所述色谱法为阳离子交换色谱，羟基磷灰石色谱和/或疏水相互作用色谱。
31.一种制备疫苗的方法，其包括将权利要求18的HPV病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合。
32.权利要求1-14任一项所述的突变的HPV35 L1蛋白或权利要求18的HPV病毒样颗粒在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。
33.权利要求32所述的用途，其中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染。
34.权利要求33所述的用途，其中，所述HPV感染为HPV35感染、HPV16感染和/或HPV31感染。
35.权利要求32所述的用途，其中，所述由HPV感染所导致的疾病选自宫颈癌和尖锐湿疣。
36.权利要求32-35任一项所述的用途，其中，所述药物组合物是疫苗。
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