CN104761623A - 一种以α-螺旋5为靶标的抑制HPV L1五聚体形成的抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以α-螺旋5为靶标的抑制人乳头瘤病毒L1五聚体形成的抑制剂，是以人乳头瘤病毒L1蛋白C末端α-螺旋5为结构基础制备的靶向性小肽药物，属于生物制药技术领域。

Description

一种以α-螺旋5为靶标的抑制HPV L1五聚体形成的抑制剂

技术领域：

本发明公开了一种以α-螺旋5为靶标的抑制人乳头瘤病毒L1五聚体形成的抑制剂，是以人乳头瘤病毒L1蛋白C末端α-螺旋5为结构基础制备的靶向性小肽药物，属于生物制药技术领域。

背景技术：

人乳头瘤病毒（human papillomavirus简称：HPV）属于乳头状瘤病毒科，为小型的、非包膜的双链DNA病毒^[1]。HPV主要侵染人体器官的表皮组织（如皮肤、口、咽喉、食道、生殖器等部位），可引起鳞状上皮增生，高致病亚型可引发恶性肿瘤，并可引起女性宫颈癌的发生^[2]。目前，大约有100多种亚型的HPV已经通过鉴定，其中有15种亚型别可感染生殖系统并致癌，被认为是高风险型别（如HPV 16、18、33和58亚型等），它们是诱发宫颈癌、直肠癌以及其它生殖系统癌症的主要原因^[3,4]。尽管感染HPV的潜在危害十分巨大，但目前的研究已表明该过程以及其诱发的相关疾病可以通过预防性疫苗进行预防。现今已开发并上市的HPV L1类病毒颗粒（VLP）疫苗有两种，包括Cervarix（针对HPV 16/18的二价疫苗）以及Gardasil（针对HPV 16/18/6/11的四价疫苗）^[5]。但是，这些上市的预防性疫苗不仅具有免疫上的亚型别严格限制性，而且稳定性差、造价高，严重阻碍了其在宫颈癌高发的发展中国家的推广使用^[6]；研发第二代疫苗的研发势在必行。为了解决第一代疫苗的缺陷并为第二代疫苗的研发提供理论基础，对HPV主要衣壳蛋白L1结构与功能的研究越发显得至关重要。

HPV病毒粒子的外壳由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2组成。无论是原核还是真核表达系统表达的L1在近生理环境中均可自发地形成稳定的五聚体，并经进一步自组装后形成二十面体结构的类病毒粒子（VLPs）。VLPs形态与免疫原性均与天然的病毒颗粒相似^[7]，因此其生理活性与构筑单元的高级结构密不可分。为了进一步研究L1结构与功能的关系，我们利用定点突变的方法对保守氨基酸位点进行诱变，以观察突变体结构与生理行为的特征关系以及突变体与野生型L1在结构和功能上的差别。

在已报道的文献中，对乳突状瘤病毒主要衣壳蛋白L1结构功能学的研究主要集中在五聚体之间而非单体之间各亚基相互作用的界面区域^[8-10]，如Conway等将HPV 16亚型L1中高度保守的半胱氨酸——C175、C185、C428分别突变成丝氨酸S后，由于破坏了五聚体之间的二硫键而导致病毒的滴度下降、并致使病毒粒子的稳定性低于野生型^[8]；同样SAPP等^[9]对HPV-33亚型L1的 C176、C427任意单点进行丝氨酸突变，同样由于破坏了分子间二硫键而阻止了VLPs的形成；而Wolf等^[10]对BPV亚基之间相互作用的研究发现，L1 C-末端区域形成的“手臂”结构是五聚体之间亚基相互作用的重要因素。

发明内容：

本发明提供了一种以α-螺旋5为靶标的抑制HPV L1五聚体形成的抑制剂，是以人乳头瘤病毒 L1蛋白C末端α-螺旋5为结构基础制备的靶向性小肽药物。

本发明的技术解决方案如下：

通过对HPV 16、18型别主要衣壳蛋白L1 C-末端α-螺旋5（h5）上的高度保守氨基酸序列（h5中FPL*G*R*KFLLQAG）中的亮氨酸L*、甘氨酸G*、精氨酸R*位点依次进行单氨基酸位点突变成丙氨酸A、丙氨酸A、丙氨酸A/组氨酸H，破坏了L1蛋白五聚体的形成，获得了其突变体L1的单体蛋白，并对HPV衣壳蛋白的结构机理进行研究。

本发明公开的一种人乳头瘤病毒L1 蛋白的突变体，其特征在于：HPV L1蛋白C末端α-螺旋5中PL*GRKFL中的亮氨酸L*突变成丙氨酸（Ala，A）；

本发明公开的一种人乳头瘤病毒L1 蛋白的突变体，其特征在于：HPV L1蛋白C末端α-螺旋5中PLG*RKFL中的甘氨酸G*突变成丙氨酸；

本发明公开的一种人乳头瘤病毒L1 蛋白的突变体，其特征在于：HPV L1蛋白C末端α-螺旋5中PLGR*KFL中的精氨酸R*突变成丙氨酸；

本发明公开的一种人乳头瘤病毒L1 蛋白的突变体，其特征在于：HPV L1蛋白C末端α-螺旋5中PLGR*KFL中的精氨酸R*突变成组氨酸（His, H）。

本发明公开的一种抑制人乳头瘤病毒L1五聚体的形成的抑制剂，是以HPV L1蛋白C末端α-螺旋5为结构基础制备的靶向性小肽药物。

本发明所述人乳头瘤病毒 L1 蛋白的突变体的核苷酸序列，如：SEQ NO. 2、SEQ NO. 3、SEQ NO. 4、SEQ NO. 5、SEQ NO. 7。

本发明所述的人乳头瘤病毒L1 蛋白的突变体，其特征在于所述：HPV L1蛋白是指6、11、16、18、26、31、33、34、35、39、45，5l、52、53、56、58、59、66、67、68、69、70、72、73或82、85、97型HPV中一种和/或几种的组合。

本发明所述的编码人乳头瘤病毒L1 蛋白的突变体的多核苷酸表达载体。

本发明所述的含有人乳头瘤病毒 L1 蛋白的突变体的表达载体的细胞。

本发明公开的一种人乳头瘤病毒L1 蛋白的突变体的制备方法，包括以下步骤：

1、以N端去掉4个氨基酸、C端去掉29个氨基酸的截短野生型人乳头瘤病毒HPV 16L1（简称：16WT）和HPV 18L1（简称：18WT）基因序列为模板，设计带有突变位点的寡聚脱氧核糖核酸引物，利用PCR技术，对含有突变位点的核苷酸片段进行扩增；

2、以pGEX-6p-1为载体片段，将突变体DNA片段连接于载体的多克隆位点上：BamH Ι和Not Ι，并将重组载体转化入宿主细胞（E. coli，DH5α）中进行重组子的筛选；

3、获得重组载体后，以XA90 （E. coli）为表达宿主细胞进行突变体蛋白的表达；

4、利用亲和层析以及凝胶过滤层析纯化人乳头瘤病毒HPV L1 蛋白的突变体；

5、利用体积排阻色谱（size-exclusion chromatography，SEC）鉴定了突变体蛋白在50 mM Tris-HCl缓冲液（pH8.0）条件下的结构及存在状态。

与对应截短野生型16 WT和18WT相比，所述的突变体蛋白HPV 16L1 L464A（简称：L464A），HPV 16L1 G465A（简称：G465A），HPV 16L1 R466H（简称：R466H），HPV 16L1 R466A（简称：R466A），HPV 18 L1 R467H（简称：R467H）无法形成五聚体，而只是以单体的形式存在。

本发明的积极效果在于：

HPV L1蛋白C末端 h5中FPL*G*R*KFLLQAG中的亮氨酸L*、甘氨酸G*、精氨酸R*位点对于L1蛋白五聚体的形成具有重要作用，而且这些位点位于五聚体中两个L1单体间的结合界面处，直接参与了L1四级结构的形成。制备得到一段含有这些位点的小肽分子，其序列为PLGRKFLLQAGLKAK；以此小肽分子作为靶向性小肽抑制剂，有效地抑制了L1五聚体的形成，有望成为新的靶向性小肽类药物。

附图说明

图1：HPV 16L1、18L1 突变体基因片段的扩增；

图2：BamH Ι/Not Ι双酶切后回收的片段；

图3：BamH Ι/Not Ι双酶切鉴定重组载体；

图4：突变体蛋白的Western-blot鉴定图；

图5：SEC检测HPV 16L1截短野生型与其突变体四级结构的差异；

图6：SEC检测HPV 18L1截短野生型与其突变体四级结构的差异；

图7：SEC分析小肽分子（PeP15）靶向性抑制HPV16 L1五聚体的形成；

图8：SEC分析小肽分子（PeP14）靶向性抑制HPV16 L1五聚体的形成；

图9：SEC分析小肽分子（PeP14）靶向性抑制HPV58 L1五聚体的形成；

图10：为27个不同HPV型别的L1蛋白α-螺旋5（h5）序列对比图。

具体实施方式：

以下实施例旨在进一步举例说明，而不是限制本发明。在不违背本发明的精神和原则的前提下，对发明个别技术步骤进行的任何改动和改变都将落入本发明待批权利要求范围。

实施例1

根据下述的操作技术，分别以含有截短野生型HPV 16L1、18L1 DNA片段的载体pGEX-6p-1-HPV-16L1（简称：p-16WT）、pGEX-6p-1-HPV-18L1（简称：p-18WT）为模版，包含突变点的寡聚核苷酸链为引物，进行突变体核苷酸片段的合成。16L1突变片段的突变位点位于16L1 464、465、466位氨基酸而18L1 位于467位氨基酸。

1、突变体片段L464A， G465A， R466H， R466A， R467H的获得：

根据截短野生型16WT、18WT的基因序列（由于截短野生型L1基因序列为密码子优化后的基因序列与NCBI基因库中野生型基因序列存在差异；命名为SEQ NO.1以及SEQ NO.6），利用Primer Premier5引物设计软件设计突变体引物。对应引物序列如下：

合成HPV 16L1突变体DNA片段引物：

上游引物（F1）：5’ TATATAGGATCCATGCCGTCTGAAGC 3’

下游引物（A1）：5’

TATATAGCGGCCGCTTAAGCTTTCAGACCAGCCTGCAGCAGGAATTTACGACCCGCCGGGAACTG 3’

下游引物（A2）：5’

TATATAGCGGCCGCTTAAGCTTTCAGACCAGCCTGCAGCAGGAATTTACGCGCCAGCGGGAACTG 3’

下游引物（A3）：5’ TATATAGCGGCCGCTTAAGCTTTCAGACCAGCCTGCAGCAGGAATTTATGACCCAGCGGGAACTG 3’

下游引物（A4）：5’ TATATAGCGGCCGCTTAAGCTTTCAGACCAGCCTGCAGCAGGAATTTCGCACCCAGCGGGAACTG 3’

合成HPV 18L1突变体DNA片段引物：

上游引物（F2）：5’ ATAATAGGATCCATGCCGTCTGATAACACC 3’

下游引物（A2′）：5’ TATATAGCGGCCGCTTAACGACGCAGACCAGCCTGAACCAGGAATTTATGACCCAGCGGGTACTG 3’

利用引物A1 、A2的核苷酸CGC代替原相应位点的核苷酸；利用A3、A2′的核苷酸ATG代替ACG，对应在L1的氨基酸序列上产生L464A、G465A、R466H、R467H的突变。同时利用引物A4的核苷酸AGC代替ACG，对应在氨基酸序列上产生R466A的突变。

反应条件：分别以p-16WT、p-18WT为模版，F1A1、F1A2、F1A3、 F1A4、F2A2′为引物，扩增突变体HPV 16L1 L464A（SEQ NO.2）、G465A（SEQ NO.3）、R466H（SEQ NO.4）、R466A（SEQ NO.5）以及HPV 18L1 R467H（SEQ NO.7）的基因片段，反应体系100 μL：

2×EasyTaq mixture  50 μL

上游引物           2 μL

下游引物           2 μL

模版               0.5 μL

ddH₂O             45.5 μL

PCR扩增程序：

反应条件：预变性 94 ℃ 45 sec；变性95 ℃ 1 min；退火 55 ℃ 1 min 30 sec；延伸72 ℃ 1 min 30 sec；30个循环；再延伸72 ℃ 10 min；4 ℃保存（见图1，泳道1：HPV 16L1 L464A；泳道2：HPV 16L1 G465A；泳道3：HPV 16L1 R466H；泳道4：HPV 16L1 R466A；泳道5：HPV 18L1 R467H）。

2、突变重组载体的构建及鉴定：

将含有BamHⅠ和NotⅠ酶切位点的突变体基因以及pGEX-6P-1进行BamHⅠ/NotⅠ双酶切处理（见图2，泳道1：HPV 16L1 L464A；泳道2：HPV 16L1 G465A；泳道3：HPV 16L1 R466H；泳道4：HPV 16L1 R466A；泳道5：HPV 18L1 R467H），之后利用T4 ligase将回收的突变体基因与含有对应粘性末端的pGEX-6P-1进行连接反应，16 ℃ 12 h。连接反应后转化连接产物到宿主菌DH5α中进行重组子的筛选。将筛选的单克隆菌落进行扩大培养并进行质粒的提取，之后进行BamHⅠ和NotⅠ双酶切鉴定（见图3，泳道1：pGEX-6p-1-16L1 L464A；泳道2：pGEX-6p-1-16L1 G465A；泳道3：pGEX-6p-1-16L1 R466H；泳道4：pGEX-6p-1-16L1 R466A；泳道5：pGEX-6p-1-18L1 R467H）。连接有基因片段的载体由上海生工生物公司进行测序。

3、突变体蛋白HPV 16L1 L464A、G465A、R466H、R466A以及HPV 18L1 R467H的表达与纯化：

将测序结果正确的重组载体转入氯化钙方法制备的XA90，并作为表达宿主进行截断野生型和突变体蛋白的表达。宿主培养基为2 *YT培养基（16 g/L胰化蛋白胨；10 g/L酵母粉；5 g/L NaCl），当重组工程菌生长至OD_600nm≈0.8时，加入终浓度为0.2 mM的IPTG，在28 ℃的条件下进行16 h重组蛋白的诱导表达。

对培养液进行离心（4000 rpm×30 min），弃上清，回收菌体沉淀；利用buffer L（pH 8.0，50 mM Tris-HCl，200 mM NaCl，1 mM EDTA, 2 mM DTT, 10 mM PMSF）洗涤沉淀，之后将其重悬于buffer L中并在冰水混合浴中进行超声波破碎；将裂解液进行离心（16000 rpm×30 min），收集上清、弃沉淀。利用GST亲和层析柱将上清中的融合蛋白纯化，并在GST柱中加入含有PreScission蛋白酶的酶切缓冲液（含有20 mM DTT的buffer L）以去除GST标签获得L1蛋白。

为进一步纯化L1蛋白，利用体积排阻色谱柱（SEC）——Superdex-200（16/60）进行样品的分离纯化。流动相为buffer L，流速为1 ml/min，检测波长为280 nm，收集分离后各对应峰位的流穿液。将纯化得到的截断野生型16WT和突变体L1蛋白用免疫印迹法（Western-blot）检测：将转印后纤维素膜用3%的PBS脱脂奶粉室温封闭1 h，之后用PBST（含有0.2% Tween-20的PBS缓冲液）漂洗3~5min，重复3次；加入HPV 16L1多克隆抗体（1:5000稀释）室温孵育1 h，之后再用PBST漂洗3~5 min，重复3次；加入碱性磷酸酶（AP）标记的山羊抗兔抗体（1:2000稀释）室温孵育1 h，之后用PBST漂洗3~5 min，重复3次；避光显色5~10 min。结果显示纯化后获得的蛋白为HPV 16L1蛋白（见图4）。

4、突变体HPV 16 L1L464A、G465A、R466H以及HPV 18 L1R467H蛋白结构的表征：

体积排阻色谱（SEC）：利用SEC分析GST亲和层析柱初步纯化出的目标蛋白L1，以检测突变体蛋白与野生型蛋白在天然条件下的结构、存在状态及含量。结果表明：野生型L1以五聚体形式稳定存在，而突变体L1则均以单体的形式存在（见图5、图6）。

5、利用含有h5的小肽分子作为靶点抑制HPV五聚体的形成：

分别将1 L含有16WT重组载体细胞的培养液利用上述方案收集上清液后，利用GST亲和层析柱进行GST-L1的分离纯化。在5 ml酶切缓冲液中加入2.73 mg的小肽PeP15（PLGRKFLLQAGLKAK）（0.33mM）使其充分溶解，之后加入到上述含有GST-L1的亲和层析中与柱料充分混合并在4 ℃条件下孵育1h，之后再加入PreScission蛋白酶消化16 h后回收酶切产物。利用Superdex-200分析酶切产品、并与未经小肽孵育的酶切产物对比列出，以示两者L1五聚体和单体相对含量的差别。根据结果（见图7）本发明小肽PeP15明显抑制了L1五聚体的形成。

综合以上结果，突变体HPV 18L1 R467H出现了与突变体HPV 16L1 R466H相似的现象。突变体无法自发的形成五聚体，L1中h5的保守氨基酸位点的突变使其丧失了正常生理活性，突变体能否诱导中和抗体的产生还有待进一步检验。

6、另设计氨基酸序列如下的小肽PeP14（DLDQFPLGRKFLLQ）参照上述实验分别与含有HPV L1 16WT和 HPVL1 58重组载体细胞的培养液进行反应，结果见图8、图9。

图8显示随着PeP14：GST-L1比例的提高，L1五聚体的形成逐渐减少，L1单体产物逐渐增多，发明小肽PeP14明显抑制了HPV16 L1五聚体的形成。图9显示PeP14同样抑制了HPV58 L1五聚体的形成。

实施例2

HPV L1蛋白α-螺旋5 “FPL*G*R*KFLLQAG” 中的亮氨酸L*、甘氨酸G*、精氨酸R*突变的普遍性

HPV L1蛋白α-螺旋5 “FPL*G*R*KFLLQAG” 中的亮氨酸L*、甘氨酸G*、精氨酸R*突变成丙氨酸A或组氨酸H,突变体均无法形成五聚体，而只是以单体的形式存在。通过实验比较HPV 6、11、16、18、26、31、33、34、35、39、45，5l、52、53、56、58、59、66、67、68、69、70、72、73或82、85、97型L1蛋白的h5序列（参见图10），在h5中的亮氨酸L*、甘氨酸G*、精氨酸R*这些位点是高度保守的，证明在h5中的这一点在L1蛋白结构和功能上具有重要的作用，并且这一点突变具有普适性，因而可以推广到上述HPV型别中。

　　<110> 北京康乐卫士生物技术股份有限公司

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　　<160> F1

　　<210> F1

　　<211> 26

　　<212> DNA

　　<213> 引物

　　<400> F1

tatataggat ccatgccgtc tgaagc                                             26

    <120>

　　<140>

　　<160> A1

　　<210> A1

　　<211> 65

　　<212> DNA

　　<213> 引物

　　<400> A1

tatatagcgg ccgcttaagc tttcagacca gcctgcagca ggaatttacg acccgccggg        60

aactg                                                                    65

    <120>

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　　<160> A2

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　　<213> 引物

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    <120>

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　　<160> A3

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　　<212> DNA

　　<213> 引物

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aactg                                                                    65                           

                 <120>

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　　<160> A4

　　<210> A4

　　<211> 65

　　<212> DNA

　　<213> 引物

　　<400> A4

tatatagcgg ccgcttaagc tttcagacca gcctgcagca ggaatttcgc acccagcggg        60

aactg                                                                    65

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　　<140>

　　<160> F2

　　<210> F2

　　<211> 30

　　<212> DNA

　　<213> 引物

　　<400> F2

ataataggat ccatgccgtc tgataacacc                                         30

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　　<160> A2′

　　<210> A2′

　　<211> 65

　　<212> DNA

　　<213> 引物

　　<400> A2′

tatatagcgg ccgcttaacg acgcagacca gcctgaacca ggaatttatg acccagcggg        60

tactg                                                                    65                

　　<120>

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　　<160> SEQ NO. 1

　　<210> SEQ NO. 1

　　<211> 1419

　　<212> DNA

　　<213> 人乳头瘤病毒 16亚型主要衣壳蛋白L1（Human papillomavirus type 16）

　　<400> SEQ NO. 1

atgccgtctg aagcgaccgt gtatctgccg ccggtgccgg tgtctaaagt ggtgtctacc        60

gatgaatatg tggcgcgtac caacatctac taccacgctg gtacctctcg tctgctggct       120

gttggtcacc cgtacttccc gatcaaaaaa ccgaacaaca acaaaatcct ggttccgaaa       180

gtttctggtc tgcagtaccg tgttttccgt atccacctgc cggacccgaa caaattcggt       240

ttcccggaca cctctttcta caacccggac acccagcgtc tggtttgggc ttgcgttggt       300

gttgaagttg gtcgtggtca gccgctgggt gttggtatct ctggtcaccc gctgctgaac       360

aaactggacg acaccgaaaa cgcttctgct tacgctgcta acgctggtgt tgacaaccgt       420

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cagatcttca acaaaccgta ctggctgcag cgtgctcagg gtcacaacaa cggtatctgc       960

tggggtaacc agctgttcgt taccgttgtt gacaccaccc gttctaccaa catgtctctg      1020

tgcgctgcta tctctacctc tgaaaccacc tacaaaaaca ccaacttcaa agaatacctg      1080

cgtcacggtg aagaatacga cctgcagttc atcttccagc tgtgcaaaat caccctgacc      1140

gctgacgtta tgacctacat ccactctatg aactctacca tcctcgagga ctggaacttc      1200

ggtctgcagc cgccgccggg tggtaccctg gaagacacct accgtttcgt tacctctcag      1260

gctatcgctt gccagaaaca caccccgccg gctccgaaag aagacccgct gaaaaaatac      1320

accttctggg aagttaacct gaaagaaaaa ttctctgctg acctggacca gttcccgctg      1380

ggtcgtaaat tcctgctgca ggctggtctg aaagcttaa                             1419

    <120>

　　<140>

　　<160> SEQ NO. 2

　　<210> SEQ NO. 2

　　<211> 1419

　　<212> DNA

　　<213> 人乳头瘤病毒 16亚型主要衣壳蛋白L1（Human papillomavirus type 16）

　　<400> SEQ NO. 2

atgccgtctg aagcgaccgt gtatctgccg ccggtgccgg tgtctaaagt ggtgtctacc        60

gatgaatatg tggcgcgtac caacatctac taccacgctg gtacctctcg tctgctggct       120

gttggtcacc cgtacttccc gatcaaaaaa ccgaacaaca acaaaatcct ggttccgaaa       180

gtttctggtc tgcagtaccg tgttttccgt atccacctgc cggacccgaa caaattcggt       240

ttcccggaca cctctttcta caacccggac acccagcgtc tggtttgggc ttgcgttggt       300

gttgaagttg gtcgtggtca gccgctgggt gttggtatct ctggtcaccc gctgctgaac       360

aaactggacg acaccgaaaa cgcttctgct tacgctgcta acgctggtgt tgacaaccgt       420

gaatgcatct ctatggacta caaacagacc cagctgtgcc tgatcggttg caaaccgccg       480

atcggtgaac actggggtaa aggttctccg tgcaccaacg ttgctgttaa cccgggtgac       540

tgcccgccgc tggaactgat caacaccgtt atccaggacg gtgacatggt tgacaccggt       600

ttcggtgcta tggacttcac caccctgcag gctaacaaat ctgaagttcc gctggacatc       660

tgcacctcta tctgcaaata cccggactac atcaaaatgg tttctgaacc gtacggtgac       720

tctctgttct tctacctgcg tcgtgaacag atgttcgttc gtcacctgtt caaccgtgct       780

ggtgctgttg gtgaaaacgt tccggacgac ctgtacatca aaggttctgg ttctaccgct       840

aacctggctt cttctaacta cttcccgacc ccgtctggtt ctatggttac ctctgacgct       900

cagatcttca acaaaccgta ctggctgcag cgtgctcagg gtcacaacaa cggtatctgc       960

tggggtaacc agctgttcgt taccgttgtt gacaccaccc gttctaccaa catgtctctg      1020

tgcgctgcta tctctacctc tgaaaccacc tacaaaaaca ccaacttcaa agaatacctg      1080

cgtcacggtg aagaatacga cctgcagttc atcttccagc tgtgcaaaat caccctgacc      1140

gctgacgtta tgacctacat ccactctatg aactctacca tcctcgagga ctggaacttc      1200

ggtctgcagc cgccgccggg tggtaccctg gaagacacct accgtttcgt tacctctcag      1260

gctatcgctt gccagaaaca caccccgccg gctccgaaag aagacccgct gaaaaaatac      1320

accttctggg aagttaacct gaaagaaaaa ttctctgctg acctggacca gttcccggcg      1380

ggtcgtaaat tcctgctgca ggctggtctg aaagcttaa                             1419

    <120>

　　<140>

　　<160> SEQ NO. 3

　　<210> SEQ NO. 3

　　<211> 1419

　　<212> DNA

　　<213> 人乳头瘤病毒 16亚型主要衣壳蛋白L1（Human papillomavirus type 16）

　　<400> SEQ NO. 3

atgccgtctg aagcgaccgt gtatctgccg ccggtgccgg tgtctaaagt ggtgtctacc        60

gatgaatatg tggcgcgtac caacatctac taccacgctg gtacctctcg tctgctggct       120

gttggtcacc cgtacttccc gatcaaaaaa ccgaacaaca acaaaatcct ggttccgaaa       180

gtttctggtc tgcagtaccg tgttttccgt atccacctgc cggacccgaa caaattcggt       240

ttcccggaca cctctttcta caacccggac acccagcgtc tggtttgggc ttgcgttggt       300

gttgaagttg gtcgtggtca gccgctgggt gttggtatct ctggtcaccc gctgctgaac       360

aaactggacg acaccgaaaa cgcttctgct tacgctgcta acgctggtgt tgacaaccgt       420

gaatgcatct ctatggacta caaacagacc cagctgtgcc tgatcggttg caaaccgccg       480

atcggtgaac actggggtaa aggttctccg tgcaccaacg ttgctgttaa cccgggtgac       540

tgcccgccgc tggaactgat caacaccgtt atccaggacg gtgacatggt tgacaccggt       600

ttcggtgcta tggacttcac caccctgcag gctaacaaat ctgaagttcc gctggacatc       660

tgcacctcta tctgcaaata cccggactac atcaaaatgg tttctgaacc gtacggtgac       720

tctctgttct tctacctgcg tcgtgaacag atgttcgttc gtcacctgtt caaccgtgct       780

ggtgctgttg gtgaaaacgt tccggacgac ctgtacatca aaggttctgg ttctaccgct       840

aacctggctt cttctaacta cttcccgacc ccgtctggtt ctatggttac ctctgacgct       900

cagatcttca acaaaccgta ctggctgcag cgtgctcagg gtcacaacaa cggtatctgc       960

tggggtaacc agctgttcgt taccgttgtt gacaccaccc gttctaccaa catgtctctg      1020

tgcgctgcta tctctacctc tgaaaccacc tacaaaaaca ccaacttcaa agaatacctg      1080

cgtcacggtg aagaatacga cctgcagttc atcttccagc tgtgcaaaat caccctgacc      1140

gctgacgtta tgacctacat ccactctatg aactctacca tcctcgagga ctggaacttc      1200

ggtctgcagc cgccgccggg tggtaccctg gaagacacct accgtttcgt tacctctcag      1260

gctatcgctt gccagaaaca caccccgccg gctccgaaag aagacccgct gaaaaaatac      1320

accttctggg aagttaacct gaaagaaaaa ttctctgctg acctggacca gttcccgctg      1380

gcgcgtaaat tcctgctgca ggctggtctg aaagcttaa                             1419

    <120>

　　<140>

　　<160> SEQ NO. 4

　　<210> SEQ NO. 4

　　<211> 1419

　　<212> DNA

　　<213> 人乳头瘤病毒 16亚型主要衣壳蛋白L1（Human papillomavirus type 16）

　　<400> SEQ NO. 4

atgccgtctg aagcgaccgt gtatctgccg ccggtgccgg tgtctaaagt ggtgtctacc        60

gatgaatatg tggcgcgtac caacatctac taccacgctg gtacctctcg tctgctggct       120

gttggtcacc cgtacttccc gatcaaaaaa ccgaacaaca acaaaatcct ggttccgaaa       180

gtttctggtc tgcagtaccg tgttttccgt atccacctgc cggacccgaa caaattcggt       240

ttcccggaca cctctttcta caacccggac acccagcgtc tggtttgggc ttgcgttggt       300

gttgaagttg gtcgtggtca gccgctgggt gttggtatct ctggtcaccc gctgctgaac       360

aaactggacg acaccgaaaa cgcttctgct tacgctgcta acgctggtgt tgacaaccgt       420

gaatgcatct ctatggacta caaacagacc cagctgtgcc tgatcggttg caaaccgccg       480

atcggtgaac actggggtaa aggttctccg tgcaccaacg ttgctgttaa cccgggtgac       540

tgcccgccgc tggaactgat caacaccgtt atccaggacg gtgacatggt tgacaccggt       600

ttcggtgcta tggacttcac caccctgcag gctaacaaat ctgaagttcc gctggacatc       660

tgcacctcta tctgcaaata cccggactac atcaaaatgg tttctgaacc gtacggtgac       720

tctctgttct tctacctgcg tcgtgaacag atgttcgttc gtcacctgtt caaccgtgct       780

ggtgctgttg gtgaaaacgt tccggacgac ctgtacatca aaggttctgg ttctaccgct       840

aacctggctt cttctaacta cttcccgacc ccgtctggtt ctatggttac ctctgacgct       900

cagatcttca acaaaccgta ctggctgcag cgtgctcagg gtcacaacaa cggtatctgc       960

tggggtaacc agctgttcgt taccgttgtt gacaccaccc gttctaccaa catgtctctg      1020

tgcgctgcta tctctacctc tgaaaccacc tacaaaaaca ccaacttcaa agaatacctg      1080

cgtcacggtg aagaatacga cctgcagttc atcttccagc tgtgcaaaat caccctgacc      1140

gctgacgtta tgacctacat ccactctatg aactctacca tcctcgagga ctggaacttc      1200

ggtctgcagc cgccgccggg tggtaccctg gaagacacct accgtttcgt tacctctcag      1260

gctatcgctt gccagaaaca caccccgccg gctccgaaag aagacccgct gaaaaaatac      1320

accttctggg aagttaacct gaaagaaaaa ttctctgctg acctggacca gttcccgctg      1380

ggtcataaat tcctgctgca ggctggtctg aaagcttaa                             1419

    <120>

　　<140>

　　<160> SEQ NO. 5

　　<210> SEQ NO. 5

　　<211> 1419

　　<212> DNA

　　<213> 人乳头瘤病毒 16亚型主要衣壳蛋白L1（Human papillomavirus type 16）

　　<400> SEQ NO. 5

atgccgtctg aagcgaccgt gtatctgccg ccggtgccgg tgtctaaagt ggtgtctacc        60

gatgaatatg tggcgcgtac caacatctac taccacgctg gtacctctcg tctgctggct       120

gttggtcacc cgtacttccc gatcaaaaaa ccgaacaaca acaaaatcct ggttccgaaa       180

gtttctggtc tgcagtaccg tgttttccgt atccacctgc cggacccgaa caaattcggt       240

ttcccggaca cctctttcta caacccggac acccagcgtc tggtttgggc ttgcgttggt       300

gttgaagttg gtcgtggtca gccgctgggt gttggtatct ctggtcaccc gctgctgaac       360

aaactggacg acaccgaaaa cgcttctgct tacgctgcta acgctggtgt tgacaaccgt       420

gaatgcatct ctatggacta caaacagacc cagctgtgcc tgatcggttg caaaccgccg       480

atcggtgaac actggggtaa aggttctccg tgcaccaacg ttgctgttaa cccgggtgac       540

tgcccgccgc tggaactgat caacaccgtt atccaggacg gtgacatggt tgacaccggt       600

ttcggtgcta tggacttcac caccctgcag gctaacaaat ctgaagttcc gctggacatc       660

tgcacctcta tctgcaaata cccggactac atcaaaatgg tttctgaacc gtacggtgac       720

tctctgttct tctacctgcg tcgtgaacag atgttcgttc gtcacctgtt caaccgtgct       780

ggtgctgttg gtgaaaacgt tccggacgac ctgtacatca aaggttctgg ttctaccgct       840

aacctggctt cttctaacta cttcccgacc ccgtctggtt ctatggttac ctctgacgct       900

cagatcttca acaaaccgta ctggctgcag cgtgctcagg gtcacaacaa cggtatctgc       960

tggggtaacc agctgttcgt taccgttgtt gacaccaccc gttctaccaa catgtctctg      1020

tgcgctgcta tctctacctc tgaaaccacc tacaaaaaca ccaacttcaa agaatacctg      1080

cgtcacggtg aagaatacga cctgcagttc atcttccagc tgtgcaaaat caccctgacc      1140

gctgacgtta tgacctacat ccactctatg aactctacca tcctcgagga ctggaacttc      1200

ggtctgcagc cgccgccggg tggtaccctg gaagacacct accgtttcgt tacctctcag      1260

gctatcgctt gccagaaaca caccccgccg gctccgaaag aagacccgct gaaaaaatac      1320

accttctggg aagttaacct gaaagaaaaa ttctctgctg acctggacca gttcccgctg      1380

ggtgcgaaat tcctgctgca ggctggtctg aaagcttaa                             1419

    <120>

　　<140>

　　<160> SEQ NO. 6

　　<210> SEQ NO. 6

　　<211> 1422

　　<212> DNA

　　<213> 人乳头瘤病毒 18亚型主要衣壳蛋白L1（Human papillomavirus type 18）

　　<400> SEQ NO. 6

atgccgtctg ataacaccgt gtatctgccg ccgccgtctg tggcgcgtgt ggtgaacacc        60

gatgattatg tgacccgtac ctctatcttc taccacgctg gttcttctcg tctgctgacc       120

gttggtaacc cgtacttccg tgttccggct ggtggtggta acaaacagga catcccgaaa       180

gtttctgctt accagtaccg tgttttccgt gttcagctgc cggacccgaa caaattcggt       240

ctgccggaca cctctatcta caacccggaa acccagcgtc tggtttgggc ttgcgctggt       300

gttgaaatcg gtcgtggtca gccgctgggt gttggtctgt ctggtcaccc gttctacaac       360

aaactggacg acaccgaatc ttctcacgct gctacctcta acgtttctga agacgttcgt       420

gacaacgttt ctgttgacta caaacagacc cagctgtgca tcctgggttg cgctccggct       480

atcggtgaac actgggctaa aggtaccgct tgcaaatctc gtccgctgtc tcagggtgac       540

tgcccgccgc tggaactgaa aaacaccgtt ctggaagacg gtgacatggt tgacaccggt       600

tacggtgcta tggacttctc taccctgcag gacaccaaat gcgaagttcc gctggacatc       660

tgccagtcta tctgcaaata cccggactac ctgcagatgt ctgctgaccc gtacggtgac       720

tctatgttct tctgcctgcg tcgtgaacag ctgttcgctc gtcacttctg gaaccgtgct       780

ggtaccatgg gtgacaccgt tccgcagtct ctgtacatca aaggtaccgg tatgcgtgct       840

tctccgggtt cttgcgttta ctctccgtct ccgtctggtt ctatcgttac ctctgactct       900

cagctgttca acaaaccgta ctggctgcac aaagctcagg gtcacaacaa cggtgtttgc       960

tggcacaacc agctgttcgt taccgttgtt gacaccaccc gttctaccaa cctgaccatc      1020

tgcgcttcta cccagtctcc ggttccgggt cagtacgacg ctaccaaatt caaacagtac      1080

tctcgtcacg ttgaagaata cgacctgcag ttcatcttcc agctgtgcac catcaccctg      1140

accgctgacg ttatgtctta catccactct atgaactctt ctatcctcga ggactggaac      1200

ttcggtgttc cgccgccgcc gaccacctct ctggttgaca cctaccgttt cgttcagtct      1260

gttgctatca cctgccagaa agacgctgct ccggctgaaa acaaagaccc gtacgacaaa      1320

ctgaaattct ggaacgttga cctgaaagaa aaattctctc tggacctgga ccagtacccg      1380

ctgggtcgta aattcctggt tcaggctggt ctgcgtcgtt aa                         1422

    <120>

　　<140>

　　<160> SEQ NO. 7

　　<210> SEQ NO. 7

　　<211> 1422

　　<212> DNA

　　<213> 人乳头瘤病毒 18亚型主要衣壳蛋白L1（Human papillomavirus type 18）

　　<400> SEQ NO. 7

atgccgtctg ataacaccgt gtatctgccg ccgccgtctg tggcgcgtgt ggtgaacacc        60

gatgattatg tgacccgtac ctctatcttc taccacgctg gttcttctcg tctgctgacc       120

gttggtaacc cgtacttccg tgttccggct ggtggtggta acaaacagga catcccgaaa       180

gtttctgctt accagtaccg tgttttccgt gttcagctgc cggacccgaa caaattcggt       240

ctgccggaca cctctatcta caacccggaa acccagcgtc tggtttgggc ttgcgctggt       300

gttgaaatcg gtcgtggtca gccgctgggt gttggtctgt ctggtcaccc gttctacaac       360

aaactggacg acaccgaatc ttctcacgct gctacctcta acgtttctga agacgttcgt       420

gacaacgttt ctgttgacta caaacagacc cagctgtgca tcctgggttg cgctccggct       480

atcggtgaac actgggctaa aggtaccgct tgcaaatctc gtccgctgtc tcagggtgac       540

tgcccgccgc tggaactgaa aaacaccgtt ctggaagacg gtgacatggt tgacaccggt       600

tacggtgcta tggacttctc taccctgcag gacaccaaat gcgaagttcc gctggacatc       660

tgccagtcta tctgcaaata cccggactac ctgcagatgt ctgctgaccc gtacggtgac       720

tctatgttct tctgcctgcg tcgtgaacag ctgttcgctc gtcacttctg gaaccgtgct       780

ggtaccatgg gtgacaccgt tccgcagtct ctgtacatca aaggtaccgg tatgcgtgct       840

tctccgggtt cttgcgttta ctctccgtct ccgtctggtt ctatcgttac ctctgactct       900

cagctgttca acaaaccgta ctggctgcac aaagctcagg gtcacaacaa cggtgtttgc       960

tggcacaacc agctgttcgt taccgttgtt gacaccaccc gttctaccaa cctgaccatc      1020

tgcgcttcta cccagtctcc ggttccgggt cagtacgacg ctaccaaatt caaacagtac      1080

tctcgtcacg ttgaagaata cgacctgcag ttcatcttcc agctgtgcac catcaccctg      1140

accgctgacg ttatgtctta catccactct atgaactctt ctatcctcga ggactggaac      1200

ttcggtgttc cgccgccgcc gaccacctct ctggttgaca cctaccgttt cgttcagtct      1260

gttgctatca cctgccagaa agacgctgct ccggctgaaa acaaagaccc gtacgacaaa      1320

ctgaaattct ggaacgttga cctgaaagaa aaattctctc tggacctgga ccagtacccg      1380

ctgggtcata aattcctggt tcaggctggt ctgcgtcgtt aa                         1422

Claims (12)

1.一种人乳头瘤病毒L1 蛋白的突变体，其特征在于：

人乳头瘤病毒 L1蛋白C末端α-螺旋5中FPL*GRKFLLQAG中的亮氨酸L*突变成丙氨酸A。

2.一种人乳头瘤病毒L1 蛋白的突变体，其特征在于：

人乳头瘤病毒 L1蛋白C末端α-螺旋5中FPLG*RKFLLQAG中的甘氨酸G*突变成丙氨酸A。

3.一种人乳头瘤病毒L1 蛋白的突变体，其特征在于：

人乳头瘤病毒L1蛋白C末端α-螺旋5中FPLGR*KFLLQAG中的精氨酸R*突变成丙氨酸A或组氨酸H。

4.根据权利要求1~3所述的人乳头瘤病毒L1 蛋白的突变体，其特征在于：

所述HPV L1蛋白是指6、11、16、18、26、31、33、34、35、39、45，5l、52、53、56、58、59、66、67、68、69、70、72、73或82、85、97型人乳头瘤病毒中一种和/或几种的组合。

5.编码权利要求1~3所述的人乳头瘤病毒L1 蛋白的突变体的多核苷酸为：SEQ NO. 2、SEQ NO. 3、SEQ NO.4、SEQ NO. 5、SEQ NO. 7。

6.包括权利要求1~3的编码人乳头瘤病毒L1 蛋白的突变体的多核苷酸表达载体。

7.包含权利要求1~3的含有人乳头瘤病毒L1 蛋白的突变体的表达载体的细胞。

8.根据权利要求1~3所述的人乳头瘤病毒L1 蛋白的突变体的制备方法，包括以下步骤：

以N端去掉4个氨基酸、C端去掉29个氨基酸的截短野生型人乳头瘤病毒HPV 16L1和HPV 18L1基因序列为模板，设计带有突变位点的寡聚脱氧核糖核酸引物，利用PCR技术，对含有突变位点的核苷酸片段进行扩增；

以pGEX-6p-1为载体片段，将突变体核苷酸片段连接于载体的多克隆位点上：BamH Ι和Not Ι，并将重组载体转化入宿主细胞DH5α中进行重组子的筛选；

获得重组载体后，以XA90为表达宿主细胞进行突变体蛋白的表达；

利用亲和层析以及凝胶过滤层析纯化人乳头瘤病毒L1 蛋白的突变体。

9.一种抑制人乳头瘤病毒L1五聚体形成的抑制剂，是以人乳头瘤病毒 L1蛋白C末端α-螺旋5为结构基础制备的靶向性小肽药物。

10.根据权利要求9所述的抑制人乳头瘤病毒L1五聚体形成的抑制剂，其氨基酸序列为DLDQFPLGRKFLLQ或PLGRKFLLQAGLKAK。

11.根据权利要求1~3所述的人乳头瘤病毒L1 蛋白的突变体在制备预防和/或治疗包括HPV感染及导致疾病的靶向性小肽类药物中的应用。

12.根据权利要求9或10所述的靶向性小肽在制备预防和/或治疗包括HPV感染及导致疾病的药物中的应用。