KR20210018351A - 타입 39 인유두종 바이러스 l1 단백질의 돌연변이체 - Google Patents

타입 39 인유두종 바이러스 l1 단백질의 돌연변이체 Download PDF

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Abstract

돌연변이된 HPV39 L1 단백질 (또는 이의 변이체), 이를 암호화하는 서열, 제조 방법, 및 상기를 포함하는 바이러스-유사 입자를 개시하며, 여기에서 상기 단백질 (또는 이의 변이체) 및 상기 바이러스-유사 입자는 적어도 2개 타입의 HPV(예를 들어 HPV39 및 HPV68, 또는 HPV39, HPV68 및 HPV70)에 대한 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고 따라서 이들을 상기 적어도 2개 타입의 HPV에 의한 감염, 상기 감염에 의해 유발된 질환, 예를 들어 자궁경부암 및 뾰족콘딜로마(condyloma acuminatum)의 예방에 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 적어도 2개 타입의 HPV에 의한 감염 및 상기 감염에 의해 유발된 질환, 예를 들어 자궁경부암 및 뾰족콘딜로마를 예방하기 위한 약학적 조성물 또는 백신의 제조에서 상기 단백질 및 상기 바이러스-유사 입자의 용도에 관한 것이다.

Description

타입 39 인유두종 바이러스 L1 단백질의 돌연변이체
본 발명은 분자 바이러스학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 돌연변이된 HPV39 L1 단백질(또는 이의 변이체), 이를 암호화하는 서열, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 바이러스-유사 입자에 관한 것으로, 상기 단백질(또는 이의 변이체) 및 바이러스-유사 입자는 적어도 2개 타입(types)의 HPV(예를 들어 HPV39 및 HPV68, 또는 HPV39, HPV68 및 HPV70)에 대한 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고 따라서 이들을 상기 적어도 2개 타입의 HPV에 의한 감염, 상기 감염에 의해 유발된 질환, 예를 들어 자궁경부암 및 뾰족콘딜로마(condyloma acuminatum)의 예방에 사용할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 적어도 2개 타입의 HPV에 의한 감염 및 상기 감염에 의해 유발된 질환, 예를 들어 자궁경부암 및 뾰족콘딜로마를 예방하기 위한 약학적 조성물 또는 백신의 제조에서 상기 단백질 및 상기 바이러스-유사 입자의 용도에 관한 것이다.
인유두종 바이러스(Human Papillomavirus: HPV)는 주로 피부 및 점막에 사마귀를 유발한다. HPV 타입은 종양형성과의 관련성에 따라 고위험 타입 및 저위험 타입으로 분류된다. 이 중에서, 고위험 HPV 타입에 의한 감염은 여성에서 자궁경부암을 포함한 생식기 암의 주요 원인인 것으로 입증되었으며; 저위험 HPV 타입은 주로 뾰족콘딜로마를 유발한다. HPV 감염의 예방 및 억제에 가장 유효한 방법은 HPV 백신, 특히 자궁경부암을 일으키는 고위험 HPV 타입에 대한 백신을 접종하는 것이다.
HPV의 주요 캡시드 단백질 L1은 속이 빈 바이러스-유사 입자(Virus-Like Particle: VLP)로 자가조립하는 특성을 가지고 있다 (Doorbar, J. and P.H. Gallimore. 1987. J Virol, 61(9): 2793-9). HPV VLP는 주요 캡시드 단백질 L1의 72개 오량체로 구성된 대칭적인 정이십면체 구조를 가진다. HPV VLP는 구조 면에서 천연 HPV와 매우 유사하고, 천연 바이러스의 중화 에피토프 대부분을 유지하며, 고역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있다 (Kirnbauer, R., F. Booy, et al. 1992 Proc Natl Acad Sci U S A 89(24): 12180-4).
그러나, 기존 연구들은 HPV VLP가 주로 동일한 HPV 타입에 대한 중화 항체 생성을 유도하고, 동일한 HPV 타입에 대한 보호 면역을 생성하며, 매우 상동성이 높은 몇가지 HPV 타입들 간에는 낮은 교차-보호 효과만을 가진다 (Sara L. Bissett, Giada Mattiuzzo, et al. 2014 Vaccine. 32:6548-6555). 따라서, 기존의 HPV 백신들은 보호 범위가 매우 제한적이다. 일반적으로, 하나의 HPV 타입의 VLP는 동일한 HPV 타입에 의한 감염의 예방에만 사용될 수 있다. 이 경우에, HPV 백신의 보호 범위를 확대해야 하는 경우, 유일한 방법은 백신에 보다 많은 타입의 HPV의 VLP를 추가하는 것이다. 현재, Merck의 가다실®(HPV16, 18, 6 및 11에 대한 4가 백신), GSK의 서바릭스®(HPV16 및 18에 대한 2가 백신), 및 Merck의 가다실®9(HPV6, 11, 16, 18, 31, 33, 45, 52 및 58에 대한 9가 백신)를 포함하는 상업적으로 입수가능한 HPV 백신들은 다수의 HPV 타입의 VLP들을 혼합하여 제조된다. 그러나, 이와 같은 방법은 HPV 백신의 생산비용을 크게 증가시키고, 예방접종 용량의 증가로 인해 안전성 문제를 야기할 수 있다.
따라서, 다수의 HPV 타입에 의한 감염, 및 상기 감염에 의해 유발된 질환, 예를 들어 자궁경부암 및 뾰족콘딜로마를 보다 경제적이고 효과적으로 예방하기 위해, 다수의 HPV 타입에 대한 보호 중화 항체의 생성을 유도할 수 있는 HPV 바이러스-유사 입자의 개발이 당업계에서 시급하다.
본 발명은 적어도 부분적으로 본 발명자들의 놀라운 발견: 타입 39 인유두종 바이러스(HPV)의 특정 조각을 제2 타입 HPV (예를 들어 HPV68)의 L1 단백질의 상응하는 조각으로 치환 후에, 이에 따라 수득된 돌연변이된 HPV39 L1 단백질이 유기체에서 HPV39및 제2 타입 HPV (예를 들어 HPV68)에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있으며, 이의 보호 효과는 HPV39 VLP 및 제2 타입 HPV의 VLP의 혼합물의 효과에 필적하고, HPV68에 대한 이의 보호 효과는 HPV68 VLP 단독의 경우에 필적하며, 제2 타입 HPV (예를 들어 HPV68)에 대한 이의 보호 효과는 제2 타입 HPV VLP 단독의 경우에 필적한다는 발견에 기초한다.
또한, 상기 치환에 기초하여, HPV39 L1 단백질의 다른 1개 또는 2개의 특정 조각은 제3 타입 HPV (예를 들어 HPV70)의 L1 단백질의 상응하는 조각으로 추가적으로 치환될 수 있고, 이에 따라 수득된 이중 치환을 갖는 돌연변이된 HPV39 L1 단백질은 HPV39, 제2 타입 HPV (예를 들어 HPV68) 및 제3 타입 HPV (예를 들어 HPV70)에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고; 이의 보호 효과는 HPV39 VLP, 제2 타입 HPV VLP 및 제3 타입 HPV VLP의 혼합물의 효과에 필적하고, HPV39에 대한 이의 보호 효과는 HPV39 VLP 단독의 경우에 필적하며, 제2 타입 HPV (예를 들어 HPV68)에 대한 이의 보호 효과는 제2 타입 HPV VLP 단독의 경우에 필적하고, 제3 타입 HPV (예를 들어 HPV70)에 대한 이의 보호 효과는 제3 타입 HPV VLP 단독의 경우에 필적한다.
따라서, 일 양상에서, 본 발명은 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체를 제공하며, 야생형 HPV39 L1 단백질과 비교하여, 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질은 하기 돌연변이를 갖고:
(1) 1-25개 아미노산, 예를 들어, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 5-15, 10-15, 10-20, 또는 15-20개 아미노산의 N-말단 절단; 및
(2) 상기 야생형 HPV39 L1 단백질의 269-288번 위치의 아미노산 잔기의, 제2 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환;
상기 변이체는 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질과 오직 하나 또는 그 이상 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개) 아미노산의 치환 (바람직하게는 보존적 치환), 부가 또는 치환만이 상이하고, 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질의 기능, 즉 적어도 2개 타입의 HPV (예를 들어 HPV39 및 HPV68, 또는 HPV39, HPV68 및 HPV70)에 대한 중화 항체의 생성을 유도하는 능력을 유지한다.
일부 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질은 선택적으로, 추가로 하기 돌연변이를 갖는다:
(3)(a) 상기 야생형 HPV39 L1 단백질의 117-140번 위치의 아미노산 잔기의, 제3 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환; 또는
(b) 상기 야생형 HPV39 L1 단백질의 169-181번 위치의 아미노산 잔기의, 제3 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환; 또는
(c) 상기 야생형 HPV39 L1 단백질의 347-358번 위치의 아미노산 잔기의, 제3 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환.
일부 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이된 L1 단백질은 야생형 HPV39 L1 단백질과 비교하여, N-말단에서 절단된 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18, 20 또는 22개의 아미노산을 갖는다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질은 야생형 HPV39 L1 단백질과 비교하여, N-말단에서 절단된 15개의 아미노산을 갖는다.
일부 바람직한 구체예에서, 상기 제2 타입의 야생형 HPV는 HPV68이다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 (2)에 기재된 상응하는 위치의 아미노산 잔기는 야생형 HPV68 L1 단백질의 270-289번 위치의 아미노산 잔기이다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 제3 타입의 야생형 HPV는 HPV70이다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 (3)(a)에 기재된 상응하는 위치의 아미노산 잔기는 야생형 HPV70 L1 단백질의 117-141번 위치의 아미노산 잔기이다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 (3)(b)에 기재된 상응하는 위치의 아미노산 잔기는 야생형 HPV70 L1 단백질의 170-182번 위치의 아미노산 잔기이다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 (3)(c)에 기재된 상응하는 위치의 아미노산 잔기는 야생형 HPV70 L1 단백질의 348-359번 위치의 아미노산 잔기이다.
일부 바람직한 구체예에서, 상기 야생형 HPV39 L1 단백질은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 바람직한 구체예에서, 상기 야생형 HPV68 L1 단백질은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 바람직한 구체예에서, 상기 야생형 HPV70 L1 단백질은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 바람직한 구체예에서, 야생형 HPV68 L1 단백질의 270-289번 위치의 아미노산 잔기는 서열번호 25에 제시된 서열을 갖는다.
일부 바람직한 구체예에서, 야생형 HPV70 L1 단백질의 117-141번 위치의 아미노산 잔기는 서열번호 26에 제시된 서열을 갖는다.
일부 바람직한 구체예에서, 야생형 HPV70 L1 단백질의 170-182번 위치의 아미노산 잔기는 서열번호 27에 제시된 서열을 갖는다.
일부 바람직한 구체예에서, 야생형 HPV70 L1 단백질의 348-359번 위치의 아미노산 잔기는 서열번호 28에 제시된 서열을 갖는다.
일부 바람직한 구체예에서, 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질은 서열번호 7, 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 또 다른 양상에서, 본 발명은 상기 단리된 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 상기 단리된 핵산은 서열번호 19, 22, 23 및 24로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
관심 폴리뉴클레오타이드의 삽입에 유용한 벡터는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함하지만 이에 제한되지 않으며 당업계에 잘 알려져 있다. 일 구체예에서, 상기 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지 등이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 또한 상기 단리된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는 E. coli 세포와 같은 원핵생물 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포(예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 마우스 세포, 인간 세포 등)와 같은 진핵 세포를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 상기 숙주 세포는 또한 세포주, 예를 들어 293T 세포 및 293TT 세포일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 그의 변이체를 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 HPV 바이러스-유사 입자에 관한 것이다.
일부 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 상기 HPV 바이러스-유사 입자는 N-말단에서 절단된 1-25개 아미노산, 예를 들어, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 5-15, 10-15, 10-20 또는 15-20개 아미노산, 예를 들어 야생형 HPV39 L1 단백질과 비교하여, 3, 5, 8, 11, 13, 15, 18, 20 또는 22개의 아미노산, 및 야생형 HPV39 L1 단백질의 269-288번 위치의 아미노산 잔기의 야생형 HPV68 L1 단백질의 270-289번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는 돌연변이된 HPV39 L1 단백질을 포함한다.
일부 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 상기 HPV 바이러스-유사 입자는 N-말단에서 절단된 1-25개 아미노산, 예를 들어, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 5-15, 10-15, 10-20 또는 15-20개 아미노산, 예를 들어 야생형 HPV39 L1 단백질과 비교하여, 3, 5, 8, 11, 13, 15, 18, 20 또는 22개의 아미노산, 및 야생형 HPV39 L1 단백질의 269-288번 위치의 아미노산 잔기의 야생형 HPV68 L1 단백질의 270-289번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환, 및 야생형 HPV39 L1 단백질의 117-140번 위치의 아미노산 잔기의 야생형 HPV70 L1 단백질의 117-141번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는 돌연변이된 HPV39 L1 단백질을 포함한다.
일부 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 상기 HPV 바이러스-유사 입자는 N-말단에서 절단된 1-25개 아미노산, 예를 들어, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 5-15, 10-15, 10-20 또는 15-20개 아미노산, 예를 들어 야생형 HPV39 L1 단백질과 비교하여, 3, 5, 8, 11, 13, 15, 18, 20 또는 22개의 아미노산, 및 야생형 HPV39 L1 단백질의 269-288번 위치의 아미노산 잔기의 야생형 HPV68 L1 단백질의 270-289번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환, 및 야생형 HPV39 L1 단백질의 169-181번 위치의 아미노산 잔기의 야생형 HPV70 L1 단백질의 170-182번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는 돌연변이된 HPV39 L1 단백질을 포함한다.
일부 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 상기 HPV 바이러스-유사 입자는 N-말단에서 절단된 1-25개 아미노산, 예를 들어, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 5-15, 10-15, 10-20 또는 15-20개 아미노산, 예를 들어 야생형 HPV39 L1 단백질과 비교하여, 3, 5, 8, 11, 13, 15, 18, 20 또는 22개의 아미노산, 및 야생형 HPV39 L1 단백질의 269-288번 위치의 아미노산 잔기의 야생형 HPV68 L1 단백질의 270-289번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환, 및 야생형 HPV39 L1 단백질의 347-358번 위치의 아미노산 잔기의 야생형 HPV70 L1 단백질의 348-359번 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환을 갖는 돌연변이된 HPV39 L1 단백질을 포함한다.
특정 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 상기 HPV 바이러스-유사 입자는 서열번호 7, 10, 11 또는 12에 제시된 서열을 갖는 돌연변이된 HPV39 L1 단백질을 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 또한 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체, 상기 단리된 핵산, 상기 벡터, 상기 숙주 세포 또는 상기 HPV 바이러스-유사 입자를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 본 발명에 따른 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 조성물은 본 발명에 따른 HPV 바이러스-유사 입자를 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 HPV 바이러스-유사 입자 및 임의로 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물 또는 백신에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 백신을 HPV 감염, 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질환, 예를 들어 자궁경부암 및 뾰족콘딜로마의 예방에 사용할 수 있다.
일부 바람직한 구체예에서, 상기 HPV 바이러스-유사 입자는 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질환의 예방에 유효한 양으로 존재한다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 HPV 감염은 하나 이상의 HPV 타입에 의한 감염 (예를 들어 HPV39 감염, HPV68 감염 및/또는 HPV70 감염)이다. 일부 바람직한 구체예에서, 상기 HPV 감염에 의해 유발된 질환은 자궁경부암 및 뾰족콘딜로마로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 백신은 당업계에 잘 알려진 방법, 예를 들어 경구 또는 주사에 의해 투여될 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서, 특히 바람직한 투여 경로는 주사이다.
일부 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 백신을 단위 투여형으로 투여한다. 예를 들어, 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 각각의 단위 투여량은 5 ㎍ 내지 80 ㎍, 바람직하게는 20 ㎍ 내지 40 ㎍ 의 HPV 바이러스-유사 입자를 함유한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 상술한 바와 같은 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체를 숙주 세포에서 발현시키는 단계, 및 그런 다음 상기 숙주 세포의 배양물로부터 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체를 회수하는 단계를 포함한다.
일부 바람직한 구체예에서, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli)이다.
일부 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체를 E. coli에서 발현시키는 단계, 그런 다음 E. coli의 용해물 상층액을 정제함으로써 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체를 수득하는 단계를 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, 크로마토그래피(예를 들어 양이온-교환 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피)에 의해 상기 E.coli의 용해물 상층액으로부터 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체를 회수한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 HPV 바이러스-유사 입자를 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제와 혼합하는 단계를 포함하는 백신의 제조방법에 관한 것이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질환을 예방하는 방법에 관한 것으로, 대상체에 예방학적 유효량의 HPV 바이러스-유사 입자 또는 약학적 조성물 또는 백신을 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 HPV 감염은 하나 이상의 HPV 타입에 의한 감염 (예를 들어 HPV39 감염, HPV68 감염 및/또는 HPV70 감염)이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 HPV 감염에 의해 유발된 질환은 자궁경부암 및 뾰족콘딜로마를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 대상체는 포유동물, 예를 들어 인간이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 또한 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질환의 예방을 위한 약학적 조성물 또는 백신의 제조에서 본 발명에 따른 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체 또는 HPV 바이러스-유사 입자의 용도에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 HPV 감염은 하나 이상의 HPV 타입에 의한 감염 (예를 들어 HPV39 감염, HPV68 감염 및/또는 HPV70 감염)이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 HPV 감염에 의해 유발된 질환은 자궁경부암 및 뾰족콘딜로마를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 또한 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질환의 예방을 위한 본 발명에 따른 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체 또는 HPV 바이러스-유사 입자에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 상기 HPV 감염은 하나 이상의 HPV 타입에 의한 감염 (예를 들어 HPV39 감염, HPV68 감염 및/또는 HPV70 감염)이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 HPV 감염에 의해 유발된 질환은 자궁경부암 및 뾰족콘딜로마를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어의 정의
본 발명에서, 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 과학 및 기술 용어들은 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 더욱이, 본원에서 사용되는 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학 및 면역학의 실험 작업들은 해당 분야에서 널리 사용되는 통상적인 작업들이다. 한편, 본 발명의 이해를 돕기 위해, 관련 용어의 정의 및 설명을 하기와 같이 제공한다.
본 발명에 따르면, 용어 "제2 타입의 야생형 HPV"는 HPV39 이외의 야생형 HPV 타입을 지칭한다. 본 발명에서, 제2 타입의 야생형 HPV는 바람직하게는 야생형 HPV68이다.
본 발명에 따르면, 용어 "제3 타입의 야생형 HPV"는 HPV39 및 제2 타입의 야생형 HPV 이외의 야생형 HPV 타입을 지칭한다. 본 발명에서, 제3 타입의 야생형 HPV는 바람직하게는 야생형 HPV70이다.
본 발명에 따르면, 표현 "상응하는 위치"는 서열들을 최적으로 정렬시킬 때, 즉 서열들을 가장 높은 백분율의 동일성이 획득되도록 정렬시킬 때 비교되는 상기 서열들의 등가(equivalent) 위치를 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "야생형 HPV39 L1 단백질"은 66형 인유두종 바이러스(HPV39)의 천연 주요 캡시드 단백질 L1을 지칭한다. 야생형 HPV39 L1 단백질의 서열은 당업계에 주지되어 있으며, 공개된 데이터베이스에서 찾을 수 있다 (예를 들어 NCBI 데이터베이스의 등록 번호 P24838.1, ARQ82617.1, AGU90549.1 및 AEP23084.1).
본 발명에서, 야생형 HPV39 L1 단백질의 아미노산 서열을 언급하는 경우, 이는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 서열을 참조하여 설명된다. 예를 들어, 표현 "야생형 HPV39 L1 단백질의 53-61번 위치의 아미노산 잔기"는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 폴리펩타이드의 53-61번 위치의 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러나, 당업자는 야생형 HPV39가 다양한 단리물을 포함할 수 있으며 다양한 단리물들 간에 L1 단백질의 아미노산 서열의 차이가 있을 수도 있음을 이해한다. 더욱이, 당업자는 서열의 차이가 있을 수도 있지만, L1 단백질의 아미노산 서열은 상이한 HPV39 단리물들간에 매우 높은 동일성 (일반적으로 95% 초과, 예를 들어 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과)을 가지며, 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 가짐을 이해한다. 따라서, 본 발명에서, 용어 "야생형 HPV39 L1 단백질"이란 용어는 서열번호 1에 제시된 바와 같은 단백질뿐만 아니라 다양한 HPV39 단리물의 L1 단백질 (예를 들어 P24838.1, ARQ82617.1, AGU90549.1 및 AEP23084.1로 제시되는 HPV39 L1 단백질)을 포함한다. 더욱이, 야생형 HPV39 L1 단백질의 서열 단편이 기술될 때, 이는 서열번호 1의 서열 단편뿐만 아니라, 다양한 HPV39 단리물의 L1 단백질의 상응하는 서열 단편도 포함한다. 예를 들어, 표현 "야생형 HPV39 L1 단백질의 53-61번 위치의 아미노산 잔기"는 서열번호 1의 53-61번 위치의 아미노산 잔기 및 다양한 HPV39 단리물의 L1 단백질의 상응하는 단편을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "야생형 HPV68 L1 단백질"은 56형 인유두종 바이러스(HPV68)의 천연 주요 캡시드 단백질 L1을 지칭한다. 야생형 HPV68 L1 단백질의 서열은 당업계에 주지되어 있으며, 공개된 데이터베이스에서 찾을 수 있다 (예를 들어 NCBI 데이터베이스의 등록 번호 AAZ39498.1, AGU90717.1, P4669.1 및 AGU90703.1).
본 발명에서, 야생형 HPV68 L1 단백질의 아미노산 서열을 언급하는 경우, 이는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 서열을 참조하여 설명된다. 예를 들어, 표현 "야생형 HPV68 L1 단백질의 53-61번 위치의 아미노산 잔기"는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 폴리펩타이드의 53-61번 위치의 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러나, 당업자는 야생형 HPV68이 다양한 단리물을 포함할 수 있으며 다양한 단리물들 간에 L1 단백질의 아미노산 서열의 차이가 있을 수도 있음을 이해한다. 더욱이, 당업자는 서열의 차이가 있을 수도 있지만, L1 단백질의 아미노산 서열은 상이한 HPV68 단리물들간에 매우 높은 동일성 (일반적으로 95% 초과, 예를 들어 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과)을 가지며, 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 가짐을 이해한다. 따라서, 본 발명에서, 용어 "야생형 HPV68 L1 단백질"이란 용어는 서열번호 2에 제시된 바와 같은 단백질뿐만 아니라 다양한 HPV68 단리물의 L1 단백질 (예를 들어 AAZ39498.1, AGU90717.1, P4669.1 및 AGU90703.1로 제시되는 HPV68 L1 단백질)을 포함한다. 더욱이, 야생형 HPV68 L1 단백질의 서열 단편이 기술될 때, 이는 서열번호 2의 서열 단편뿐만 아니라, 다양한 HPV68 단리물의 L1 단백질의 상응하는 서열 단편도 포함한다. 예를 들어, 표현 "야생형 HPV68 L1 단백질의 53-61번 위치의 아미노산 잔기"는 서열번호 2의 53-61번 위치의 아미노산 잔기 및 다양한 HPV68 단리물의 L1 단백질의 상응하는 단편을 포함한다.
본 발명에 따르면, 용어 "야생형 HPV70 L1 단백질"은 53형 인유두종 바이러스(HPV70)의 천연 주요 캡시드 단백질 L1을 지칭한다. 야생형 HPV70 L1 단백질의 서열은 당업계에 주지되어 있으며, 공개된 데이터베이스에서 찾을 수 있다 (예를 들어 NCBI 데이터베이스의 등록 번호 AGU90846.1, AGU90854.1, AAC54879.1 및 P50793.1).
본 발명에서, 야생형 HPV70 L1 단백질의 아미노산 서열을 언급하는 경우, 이는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 서열을 참조하여 설명된다. 예를 들어, 표현 "야생형 HPV70 L1 단백질의 117-141번 위치의 아미노산 잔기"는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 폴리펩타이드의 117-141번 위치의 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러나, 당업자는 야생형 HPV70이 다양한 단리물을 포함할 수 있으며 다양한 단리물들 간에 L1 단백질의 아미노산 서열의 차이가 있을 수도 있음을 이해한다. 더욱이, 당업자는 서열의 차이가 있을 수도 있지만, L1 단백질의 아미노산 서열은 상이한 HPV70 단리물들간에 매우 높은 동일성 (일반적으로 95% 초과, 예를 들어 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 99% 초과)을 가지며, 실질적으로 동일한 생물학적 기능을 가짐을 이해한다. 따라서, 본 발명에서, 용어 "야생형 HPV70 L1 단백질"이란 용어는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 단백질뿐만 아니라 다양한 HPV70 단리물의 L1 단백질 (예를 들어 AGU90846.1, AGU90854.1, AAC54879.1 및 P50793.1로 제시되는 HPV70 L1 단백질)을 포함한다. 더욱이, 야생형 HPV70 L1 단백질의 서열 단편이 기술될 때, 이는 서열번호 3의 서열 단편뿐만 아니라, 다양한 HPV70 단리물의 L1 단백질의 상응하는 서열 단편도 포함한다. 예를 들어, 표현 "야생형 HPV70 L1 단백질의 117-141번 위치의 아미노산 잔기"는 서열번호 3의 117-141번 위치의 아미노산 잔기 및 다양한 HPV70 단리물의 L1 단백질의 상응하는 단편을 포함한다.
본 발명에 따르면, 표현 "상응하는 서열 단편" 또는 "상응하는 단편"은 서열들을 최적으로 정렬시킬 때, 즉 서열들을 가장 높은 백분율의 동일성이 획득되도록 정렬시킬 때 비교되는 상기 서열들의 등가(equivalent) 위치에 위치하는 단편을 지칭한다.
본 발명에 따르면, 표현 "X 아미노산의 N-말단 절단" 또는 "N-말단에서 절단된 X 아미노산을 가짐"은 단백질의 N-말단의 1 내지 X번 위치의 아미노산 잔기의, 개시 코돈 (단백질 번역을 개시하기 위한)에 의해 암호화된 메티오닌 잔기에 의한 치환을 지칭한다. 예를 들어 N-말단에서 절단된 15개 아미노산을 갖는 HPV39 L1 단백질은 야생형 HPV39 L1 단백질의 N-말단의 1 내지 15번 위치의 아미노산 잔기를, 개시 코돈에 의해 암호화된 메티오닌 잔기로 치환하여 얻으지는 단백질을 지칭한다.
본 발명에 따르면, 용어 "변이체"는 단백질의 아미노산 서열이 하나 이상 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개) 아미노산의 치환 (바람직하게는 보존적 치환), 부가 또는 결실을 갖거나, 또는 본 발명에 따른 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 (예를 들어 서열번호 7, 8, 9, 10 또는 11에 제시된 바와 같은 단백질)과 비교하여 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가지며, 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질의 기능을 유지하는 단백질을 지칭한다. 본 발명에서, 용어 "돌연변이된 HPV39 L1 단백질의 기능"이란 용어는 적어도 2개 타입의 HPV(예를 들어 HPV39 및 HPV68, 또는 HPV39, HPV68 및 HPV70)에 대한 중화 항체의 생성을 유도하는 능력을 지칭한다. 용어 "동일성(identity)"은 뉴클레오타이드 서열들 또는 아미노산 서열들 간의 유사성의 척도를 지칭한다. 일반적으로, 서열들은 최대 일치가 획득되도록 정렬되었다. "동일성"은 당업계에서 잘 알려진 의미를 가지며 공개된 알고리즘 (예를 들어 BLAST)에 의해 계산될 수 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "동일성"은 2개의 폴리펩타이드 또는 2개의 핵산 간의 일치 정도를 지칭한다. 비교를 위한 2개의 서열이 특정 위치에서 염기 또는 아미노산의 동일한 단량체 서브유닛을 갖는 경우 (예를 들어 2개의 DNA 분자가 각각 특정한 위치에서 아데닌을 갖거나, 또는 2개의 폴리펩타이드가 각각 특정한 위치에서 리신을 갖는 경우), 상기 2개의 분자는 상기 부위에서 일치한다. 2개 서열 간의 동일성 백분율은 비교를 위한 부위의 총 수에 걸쳐 상기 2개 서열에 의해 공유된 일치하는 부위 수 x 100의 함수이다. 예를 들어 2개 서열의 10개 부위 중 6개가 일치하는 경우, 이들 2개 서열은 60%의 동일성을 갖는다. 예를 들어, DNA 서열: CTGACT 및 CAGGTT는 50%의 동일성을 공유한다 (6개 부위 중 3개가 일치). 일반적으로 2개 서열의 비교를 최대 일치를 생성시키는 방식으로 수행한다. 상기와 같은 정렬을 예를 들어 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 Needleman, et al의 방법(J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970)에 기초한 Align 프로그램 (DNAstar, Inc)을 사용하여 수행할 수 있다. 2개 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 또한, ALIGN 프로그램에 통합된 E. Meyers 및 W. Miller의 알고리즘 (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))을 사용하여 결정될 수 있고, 이는 PAM120 가중치 잔기 표를 사용하고, 12의 갭 길이 페널티 (gap length penalty) 및 4의 갭 페널티 (gap penalty)를 사용한다. 또한, 2개 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 GCG 소프트웨어 패키지 (http://www.gcg.com에서 사용가능)에서 GAP 프로그램에 통합된 Needleman 및 Wunsch의 알고리즘 (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970)을 사용하여 결정될 수 있고, 이는 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스를 사용하고, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치 (gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치 (length weight)를 사용한다.
본원에서 사용되는, 용어 "보존적 치환"은 아미노산 서열을 포함하는 단백질/폴리펩타이드의 필수적인 성질에 불리한 영향을 미치거나 또는 상기 성질을 변화시키지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 예를 들어, 보존적 치환은 당업계에 공지된 표준 기술, 예를 들어 부위-지향된 돌연변이 유발 및 PCR-매개된 돌연변이 유발에 의해 도입시킬 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 사이드 체인을 갖는 또 다른 아미노산 잔기, 예를 들어 상응하는 아미노산 잔기와 물리적으로 또는 기능적으로 유사한 (예를 들어 유사한 크기, 모양, 전하, 공유 결합 또는 수소 결합을 형성시키는 능력을 포함한 화학적 성질 등을 갖는) 잔기로 치환되는 치환을 포함한다. 유사한 사이드 체인을 갖는 아미노산 잔기의 패밀리(families)가 당업계에 정의되었다. 이들 패밀리는 염기성 사이드 체인을 갖는 아미노산 (예를 들어 리신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 사이드 체인을 갖는 아미노산 (예를 들어 아스파트산 및 글루탐산), 하전되지 않은 극성 사이드 체인을 갖는 아미노산(예를 들어 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 사이드 체인을 갖는 아미노산 (예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지된 사이드 체인을 갖는 아미노산 (예를 들어 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 사이드 체인을 갖는 아미노산(예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 일반적으로 보존적 치환은 상응하는 아미노산 잔기의, 동일한 사이드 체인 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기에 의한 치환을 지칭한다. 아미노산 보존적 치환의 확인 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다 (예를 들어 Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993); [Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999); 및 Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997), 이는 본원에 참조로 포함됨).
본 발명에 따르면, 용어 "E.coli 발현 시스템"은 E.coli(균주) 및 벡터로 이루어지는 발현 시스템을 지칭하며, 여기에서 상기 E.coli (균주)는 상업적으로 입수할 수 있는 균주로부터 유래하고, ER2566, BL21 (DE3), B834 (DE3), 및 BLR (DE3)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따르면, 용어 "벡터"는 삽입된 폴리뉴클레오티드를 가질 수 있는 핵산 운반체 도구를 지칭한다. 벡터가 삽입된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 단백질의 발현을 허용하는 경우, 상기 벡터를 발현 벡터라 한다. 상기 벡터는 숙주 세포 내로의 형질전환, 형질도입 또는 형질감염에 의해 상기 숙주 세포에서 발현되는 운반되는 유전물질 요소를 가질 수 있다. 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 플라스미드, 파지, 코스미드 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따르면, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제"는 대상체 및 활성 성분에 약물학적으로 및/또는 생리학적으로 적합한 담체 및/또는 부형제를 지칭하며, 이들은 당업계에 주지되어 있고 (예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), pH 조절제, 계면활성제, 항원보강제, 및 이온 강도 증강제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, pH 조절제는 포스페이트 버퍼를 포함하나 이에 제한되지 않고; 계면활성제는 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제, 또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈-80을 포함하나 이에 제한되지 않고; 어쥬번트는 알루미늄 어쥬번트(예를 들어 수산화 알루미늄), 및 프로인트 어쥬번트(예를 들어 프로인트 완전 어쥬번트)를 포함하나 이에 제한되지 않고; 이온 강도 증강제는 NaCl을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따르면, 용어 "유효량"은 의도하는 목적을 유효하게 성취할 수 있는 양을 지칭한다. 예를 들어, 질환 (예를 들어 HPV 감염) 예방 유효량은 질환 (예를 들어 HPV 감염)의 발생을 예방하거나, 억제하거나 또는 지연시키기에 유효한 양을 지칭한다. 상기와 같은 유효량의 측정은 당업자의 능력 내에 있다.
본 발명에 따르면, 용어 "크로마토그래피"는 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어 양이온 교환 크로마토그래피), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 흡수성 크로마토그래피 (예를 들어 하이드록시아파타이트 크로마토그래피), 젤 여과 크로마토그래피 (젤 배제 크로마토그래피), 및 친화성 크로마토그래피를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따르면, 용어 "용해물 상층액(lysate supernatant)"은 다음의 단계에 의해 생성된 용액을 지칭한다: 숙주 세포 (예를 들어 E.coli)를 용해 버퍼에서 파쇄시키고, 이어서 불용성 물질을 상기 파쇄된 숙주 세포를 함유하는 용해된 용액으로부터 제거한다. 다양한 용해 버퍼가 당업계에 주지되어 있으며, 트리스 버퍼, 포스페이트 버퍼, HEPES 버퍼, MOPS 버퍼 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 숙주 세포의 파쇄는 당업자에 의해 균질화 파쇄, 초음파 처리, 분쇄, 고압 압출, 리소자임 처리 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 주지된 방법에 의해 달성될 수 있다. 불용성 물질의 제거 방법 또한, 당업자에게 잘 알려져 있고 여과 및 원심분리를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
연구에 따르면 HPV39 및 다른 HPV 타입(들)(예를 들어 HVP68 및 HPV70) 간에 어느 정도의 교차-보호가 존재하지만, 이러한 교차-보호는 매우 낮으며, 일반적으로 동일한 HPV 타입의 보호 수준의 1% 미만, 심지어는 1000 분의 1에 불과하다. 따라서, HPV39 백신을 접종 받은 피험자는 여전히 다른 HPV 타입(들)(예를 들어 HPV68 및 HPV70)에 의해 감염될 위험이 높다.
본 발명은 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 및 이에 의해 형성된 HPV 바이러스-유사 입자를 제공한다. 본 발명에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 HPV39 및 다른 HPV 타입(들)(예를 들어 HPV68 및 HPV70)에 대해 현저한 교차-보호를 제공할 수 있다. 특히, 동일한 예방접종 용량에서, 본 발명에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 유기체에서 적어도 2개 타입의 HPV(예를 들어 HPV39 및 HPV68, 또는 HPV39, HPV68 및 HPV70)에 대해 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있으며, 그 효과는 다수 HPV 타입의 VLP의 혼합물(예를 들어 HPV39 VLP 및 HPV68 VLP의 혼합물, 또는 HPV39 VLP, HPV68 VLP 및 HPV70 VLP의 혼합물)의 효과와 비슷하다. 따라서, 본 발명에 따른 HPV 바이러스-유사 입자는 동시에 적어도 2개 타입의 HPV(예를 들어 HPV39 및 HPV68, 또는 HPV39, HPV68 및 HPV70)에 의한 감염뿐만 아니라 상기 감염과 관련된 질환을 예방할 수 있으며, 현저하게 이로운 기술적 효과를 가진다. 이는 특히 HPV 백신의 보호 범위의 확대 및 HPV 백신의 생산 비용을 줄이는 측면에서 상당한 이점을 갖는다.
본 발명의 구체예는 도면 및 실시예를 참조하여 더욱 상세하게 설명된다. 그러나, 당업자는 하기 도면 및 실시예가 본 발명의 범위를 한정하기 보다는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것임을 이해할 것이다. 하기 도면 및 바람직한 실시예의 상세한 설명에 따르면, 본 발명의 다양한 목적 및 이점들은 당업자에게 자명하다.
도 1은 실시예 1의 정제된 돌연변이된 단백질의 SDS-PAGE 결과를 나타낸다. 레인 1: 단백질 분자량 마커; 레인 2: HPV39N15 (N-말단에서 절단된 15개 아미노산을 갖는 HPV39 L1 단백질); 레인 3: HPV68N0 (N-말단에서 절단된 0개 아미노산을 갖는 HPV68 L1 단백질, 즉, 전장 야생형 HPV68 L1 단백질); 레인 4: H39N15-68T1; 레인 5: H39N15-68T2; 레인 6: H39N15-68T3; 레인 7: H39N15-68T4; 레인 8: H39N15-68T5; 레인 9: 단백질 분자량 마커; 레인 10: H39N15-68T4; 레인 11: HPV70N10 (N-말단에서 절단된 10개 아미노산을 갖는 HPV70 L1 단백질); 레인 12: H39N15-68T4-70S1; 레인 13: H39N15-68T4-70S2; 레인 14: H39N15-68T4-70S3; 레인 15: H39N15-68T4-70S5. 상기 결과는 크로마토그래피 정제 후, H39N15-68T1, H39N15-68T2, H39N15-68T3, H39N15-68T4, H39N15-68T5, H39N15-68T4-70S1, H39N15-68T4-70S2, H39N15-68T4-70S3, 및 H39N15-68T4-70S5 단백질이 약 90%의 순도를 가짐을 보였다.
도 2는 HPV L1 광범위 항체 4B3을 사용하여 결정된, 실시예 1에서 준비한 돌연변이된 단백질 H39N15-68T1, H39N15-68T2, H39N15-68T3, H39N15-68T4, H39N15-68T5, H39N15-68T4-70S1, H39N15-68T4-70S2, H39N15-68T4-70S3, 및 H39N15-68T4-70S5의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. 레인 1: HPV39N15; 레인 2: HPV68N0; 레인 3: H39N15-68T1; 레인 4: H39N15-68T2; 레인 5: H39N15-68T3; 레인 6: H39N15-68T4; 레인 7: H39N15-68T5; 레인 8: H39N15-68T4; 레인 9: HPV70N10; 레인 10: H39N15-68T4-70S1; 레인 11: H39N15-68T4-70S2; 레인 12: H39N15-68T4-70S3; 레인 13: H39N15-68T4-70S5. 상기 결과는 돌연변이된 단백질 H39N15-68T1, H39N15-68T2, H39N15-68T3, H39N15-68T4, H39N15-68T5, H39N15-68T4-70S1, H39N15-68T4-70S2, H39N15-68T4-70S3, 및 H39N15-68T4-70S5가 광범위 항체 4B3에 의해 특이적으로 인식될 수 있음을 보였다.
도 3은 단백질 HPV39N15, H39N15-68T1, H39N15-68T2, H39N15-68T3, H39N15-68T4, 및 H39N15-68T5를 포함하는 샘플들을 분자체 크로마토그래피(molecular sieve chromatography)로 분석한 결과를 나타낸다. 상기 결과는 단백질 H39N15-68T1, H39N15-68T2, H39N15-68T3, H39N15-68T4, 또는 H39N15-68T5를 포함하는 샘플들의 첫번째 단백질 피크가 약 13-14분째에 나타났으며, 이는 HPV39N15의 경우에 필적함을 보였다. 이는 이들 돌연변이된 단백질들이 모두 VLP로 조립될 수 있음을 나타낸다.
도 4는 단백질 HPV39N15, HPV68L1N0, HPV70N10, H39N15-68T4, H39N15-68T4-70S1, H39N15-68T4-70S2, H39N15-68T4-70S3, 및 H39N15-68T4-70S5을 포함하는 샘플들을 분자체 크로마토그래피로 분석한 결과를 나타낸다. 상기 결과는 단백질 H39N15-68T4-70S1, H39N15-68T4-70S2, H39N15-68T4-70S3, 또는 H39N15-68T4-70S5를 포함하는 샘플들의 첫번째 단백질 피크가 약 13-14분째에 나타났으며, 이는 HPV39N15, HPV68L1N0, HPV70N10 및 H39N15-68T4 VLP의 경우에 필적함을 보였다. 이는 이들 돌연변이된 단백질들이 모두 VLP로 조립될 수 있음을 나타낸다.
도 5A-5L은 HPV39N15 VLP, HPV68L1N0 VLP, HPV70N10 VLP, H39N15-68T1 VLP, H39N15-68T2 VLP, H39N15-68T3 VLP, H39N15-68T4 VLP, H39N15-68T5 VLP, H39N15-68T4-70S1 VLP, H39N15-68T4-70S2 VLP, H39N15-68T4-70S3 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP의 침강 속도 분석 결과를 나타낸다. 도 5A, HPV39N15 VLP; 도 5B, HPV68L1N0 VLP; 도 5C, H39N15-68T1 VLP; 도 5D, H39N15-68T2 VLP; 도 5E, H39N15-68T3 VLP; 도 5F, H39N15-68T4 VLP; 도 5G, H39N15-68T5 VLP; 도 5H, HPV70N10 VLP; 도 5I, H39N15-68T4-70S1 VLP; 도 5J, H39N15-68T4-70S2 VLP; 도 5K, H39N15-68T4-70S3 VLP; 도 5L, H39N15-68T4-70S5 VLP. 상기 결과는 H39N15-68T1 VLP, H39N15-68T2 VLP, H39N15-68T3 VLP, H39N15-68T4 VLP, H39N15-68T5 VLP, H39N15-68T4-70S1 VLP, H39N15-68T4-70S2 VLP, H39N15-68T4-70S3 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP의 침강 계수가 각각 136S, 151S, 138S, 145S, 135S, 124S, 108S, 99S 및 127S임을 보였다. 이는 돌연변이된 단백질 H39N15-68T1, H39N15-68T2, H39N15-68T3, H39N15-68T4, H39N15-68T5, H39N15-68T4-70S1, H39N15-68T4-70S2, H39N15-68T4-70S3 및 H39N15-68T4-70S5가 크기 및 형태 면에서 야생형 VLP (HPV39N15 VLP, 115S; HPV68N0 VLP, 153S; HPV70N10 VLP, 144S)와 유사한 바이러스-유사 입자로 조립될 수 있음을 나타낸다.
도 6A-6L은 다양한 VLP 샘플의 TEM 사진 (100,000 x 배율로 촬영됨, Bar=0.1μm)을 나타낸다. 도6A, HPV39N15 VLP; 도6B, HPV68L1N0 VLP; 도 6C, HPV70N10 VLP; 도 6D, H39N15-68T1 VLP; 도 6E, H39N15-68T2 VLP; 도 6F, H39N15-68T3 VLP; 도 6G, H39N15-68T4 VLP; 도 6H, H39N15-68T5 VLP; 도 6I, H39N15-68T4-70S1 VLP; 도 6J, H39N15-68T4-70S2 VLP; 도 6K, H39N15-68T4-70S3 VLP; 도 6L, H39N15-68T4-70S5 VLP. 상기 결과는 H39N15-68T1, H39N15-68T2, H39N15-68T3, H39N15-68T4, H39N15-68T5, H39N15-68T4-70S1, H39N15-68T4-70S2, H39N15-68T4-70S3, 및 H39N15-68T4-70S5가 HPV39N15, HPV68L1N0 및 HPV70N10와 유사하고, 약 25-30 nm의 반경을 갖는 VLP로 조립될 수 있음을 보였다.
도 7A-7C는 마우스를 H39N15-68T1 VLP, H39N15-68T2 VLP, H39N15-68T3 VLP, H39N15-68T4 VLP, 또는 H39N15-68T5 VLP로 접종한 후 마우스 혈청 내 중화 항체 역가 결과를 나타낸다. 도 7A: 알루미늄 어쥬번트 그룹 1(면역화 용량 5 μg, 알루미늄 어쥬번트 사용); 도 7B: 알루미늄 어쥬번트 그룹 2 (면역화 용량 1 μg, 알루미늄 어쥬번트 사용); 도 7C: 알루미늄 어쥬번트 그룹 3 (면역화 용량 0.2 μg, 알루미늄 어쥬번트 사용). 상기 결과는 H39N15-68T4 VLP가 마우스에서 HPV39에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 이의 보호 효과는 동일한 용량의 HPV39N15 VLP 단독의 경우보다 살짝 약했지만, 동일한 용량에서 HPV68N0 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 높고; 마우스에서 HPV68에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 이의 보호 효과는 동일한 용량의 HPV68N0 VLP 단독의 경우보다 살짝 약했지만, 동일한 용량에서 HPV39N15 VLP 단독의 경우보다 현저하게 더 높음을 보였다. 이는 H39N15-68T4 VLP가 HPV39 및 HPV68에 대해 우수한 교차-면역원성 및 교차-보호를 가짐을 나타낸다.
도 8A-8C는 마우스를 H39N15-68T4-70S1 VLP, H39N15-68T4-70S2 VLP, H39N15-68T4-70S3 VLP, 및 H39N15-68T4-70S5 VLP로 접종한 후 마우스 혈청 내 중화 항체 역가 결과를 나타낸다. 도 8A: 알루미늄 어쥬번트 그룹 1(면역화 용량 5 μg, 알루미늄 어쥬번트 사용); 도 8B: 알루미늄 어쥬번트 그룹 2 (면역화 용량 1 μg, 알루미늄 어쥬번트 사용); 도 8C: 알루미늄 어쥬번트 그룹 3 (면역화 용량 0.2 μg, 알루미늄 어쥬번트 사용). 상기 결과는 H39N15-68T4-70S2, H39N15-68T4-70S3, 및 H39N15-68T4-70S5 VLP가 마우스에서 HPV39에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 이들의 보호 효과는 동일한 용량의 HPV39N15 VLP 단독 및 혼합된 HPV39/HPV68/HPV70 VLP의 경우보다 살짝 약했지만, 동일한 용량에서 HPV68N0 VLP 단독 및 HPV70N10 VLP의 경우보다 현저히 높고; 마우스에서 HPV68에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 이의 보호 효과는 동일한 용량의 HPV68N0 VLP 단독 및 혼합된 HPV39/HPV68/HPV70 VLP의 효과에 필적하며, 동일한 용량의 HPV39N15 VLP 단독 및 HPV70N10 VLP의 경우보다 현저히 높고; 마우스에서 HPV70에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 이의 보호 효과는 동일한 용량의 HPV70N10 VLP 단독 및 혼합된 HPV39/HPV68/HPV70 VLP의 효과에 필적하며, 동일한 용량에서 HPV39N15 VLP 단독 및 HPV68N0 VLP 단독의 경우보다 현저히 높음을 보였다. 이는 H39N15-68T4-70S2 VLP, H39N15-68T4-70S3 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP가 HPV39, HPV68 및 HPV70에 대해 우수한 교차-면역원성 및 교차-보호를 가짐을 나타낸다.
도 9는 HPV39N15 VLP, HPV68N0 VLP, HPV70N10 VLP, H39N15-68T4 VLP, H39N15-68T4-70S2 VLP, 및 H39N15-68T4-70S5 VLP의 열안정성 검측 결과를 나타내며, A는 HPV39N15 VLP의 열안정성 검측 결과를 나타내고; B는 HPV68L1N0 VLP의 열안정성 검측 결과를 나타내고; C는 HPV70N10 VLP의 열안정성 검측 결과를 나타내고; D는 H39N15-68T4 VLP VLP의 열안정성 검측 결과를 나타내고; E는 H39N15-68T4-70S2 VLP의 열안정성 검측 결과를 나타내고; F는 H39N15-68T4-70S5 VLP의 열안정성 검측 결과를 나타낸다. 상기 결과는 이들 단백질에 의해 형성된 모든 VLP들이 매우 높은 열안정성을 가짐을 나타낸다.
도 10은 H39N15-68T4-70S2 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP의 초저온-전자 현미경법(cryo-EM) 사진 및 복원된 3차원 구조를 나타내며, A는 H39N15-68T4-70S2 VLP의 초저온-전자 현미경법 사진을 나타내고; B는 H39N15-68T4-70S2 VLP의 복원된 3차원 구조를 나타내고; C는 H39N15-68T4-70S5 VLP의 초저온-전자 현미경법 사진을 나타내고; D는 H39N15-68T4-70S5 VLP의 복원된 3차원 구조를 나타낸다. 상기 복원된 3차원 구조는 H39N15-68T4-70S2 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP 둘 다 72개 캡소머(capsomers)(형태학적 서브유닛, 펜타머)를 가진 T=7 정이십면체 구조 (h=1, k=2)를 가짐을 보였다. 준평형 원리 (quasi-equivalence)와 일치하는 전통적인 정이십면체 바이러스 캡시드와 달리, H39N15-68T4-70S2 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP의 구조에서 모든 구성요소 서브유닛은 헥사머가 없는 펜타머였다. 더욱이, 상기 2개 VLP들은 55 nm의 외부 직경을 가졌다. 이는 이전에 보고된 천연 HPV 바이러스 입자 및 진핵 발현 시스템 (예를 들어 폭스바이러스 발현 시스템)에서 제조된 HPV VLP의 3차원 구조와 유사했다 (Baker TS, Newcomb WW, Olson NH. et al. Biophys J. (1991), 60(6): 1445-1456. Hagensee ME, Olson NH, Baker TS, et al. J Virol. (1994), 68(7):4503-4505. Buck CB, Cheng N, Thompson CD. et al. J Virol. (2008), 82(11): 5190-7).
본 발명에 관련된 서열들 중 일부를 하기 표 1에 제공한다.
서열번호 설명
1 야생형 HPV39 L1 단백질
2 야생형 HPV68 L1 단백질, HPV68N0
3 야생형 HPV70 L1 단백질
4 HPV68 L1 단백질의 조각 1을 포함하는 돌연변이된 HPV39 L1 단백질, H39N15-68T1
5 HPV68 L1 단백질의 조각 2를 포함하는 돌연변이된 HPV39 L1 단백질, H39N15-68T2
6 HPV68 L1 단백질의 조각 3을 포함하는 돌연변이된 HPV39 L1 단백질, H39N15-68T3
7 HPV68 L1 단백질의 조각 4를 포함하는 돌연변이된 HPV39 L1 단백질, H39N15-68T4
8 HPV68 L1 단백질의 조각 5를 포함하는 돌연변이된 HPV39 L1 단백질, H39N15-68T5
9 HPV68 L1 단백질의 조각 4 및 HPV70 L1 단백질의 조각 1을 포함하는 돌연변이된 HPV39 L1 단백질, H39N15-68T4-70S1
10 HPV68 L1 단백질의 조각 4 및 HPV70 L1 단백질의 조각 2를 포함하는 돌연변이된 HPV39 L1 단백질, H39N15-68T4-70S2
11 HPV68 L1 단백질의 조각 4 및 HPV70 L1 단백질의 조각 3을 포함하는 돌연변이된 HPV39 L1 단백질, H39N15-68T4-70S3
12 HPV68 L1 단백질의 조각 4 및 HPV70 L1 단백질의 조각 5을 포함하는 돌연변이된 HPV39 L1 단백질, H39N15-68T4-70S5
13 서열번호 1을 암호화하는 DNA 서열
14 서열번호 2를 암호화하는 DNA 서열
15 서열번호 3을 암호화하는 DNA 서열
16 서열번호 4를 암호화하는 DNA 서열
17 서열번호 5를 암호화하는 DNA 서열
18 서열번호 6을 암호화하는 DNA 서열
19 서열번호 7을 암호화하는 DNA 서열
20 서열번호 8을 암호화하는 DNA 서열
21 서열번호 9를 암호화하는 DNA 서열
22 서열번호 10을 암호화하는 DNA 서열
23 서열번호 11을 암호화하는 DNA 서열
24 서열번호 12를 암호화하는 DNA 서열
25 야생형 HPV68 L1 단백질의 270-289번 위치의 아미노산 서열, 즉 HPV68 L1 단백질의 조각 4
26 야생형 HPV70 L1 단백질의 117-141번 위치의 아미노산 서열, 즉 HPV70 L1 단백질의 조각 2
27 야생형 HPV70 L1 단백질의 170-182번 위치의 아미노산 서열, 즉 HPV70 L1 단백질의 조각 3
28 야생형 HPV70 L1 단백질의 348-359번 위치의 아미노산 서열, 즉 HPV70 L1 단백질의 조각 5
29 N-말단에서 절단된 15개 아미노산을 갖는 HPV39 L1 단백질, HPV39N15
30 서열번호 29를 암호화하는 DNA 서열
31 N-말단에서 절단된 10개 아미노산을 갖는 HPV70 L1 단백질, HPV70N10
32 서열번호 31을 암호화하는 DNA 서열
33 야생형 HPV68 L1 단백질의 53-61번 위치의 아미노산 서열, 즉 HPV68 L1 단백질의 조각 1
34 야생형 HPV68 L1 단백질의 117-151번 위치의 아미노산 서열, 즉 HPV68 L1 단백질의 조각 2
35 야생형 HPV68 L1 단백질의 170-182번 위치의 아미노산 서열, 즉 HPV68 L1 단백질의 조각 3
36 야생형 HPV68 L1 단백질의 348-359번 위치의 아미노산 서열, 즉 HPV68 L1 단백질의 조각 5
37 야생형 HPV70 L1 단백질의 53-61번 위치의 아미노산 서열, 즉 HPV70 L1 단백질의 조각 1
서열 1 (서열번호 1):
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서열 2 (서열번호 2):
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서열 3 (서열번호 3):
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서열 4 (서열번호 4):
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서열 5 (서열번호 5):
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서열 6 (서열번호 6):
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서열 7 (서열번호 7):
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서열 8 (서열번호 8):
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서열 9 (서열번호 9):
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서열 10 (서열번호 10):
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서열 11 (서열번호 11):
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서열 12 (서열번호 12):
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서열 13 (서열번호 13):
ATGGCCCTCTGGCGCAGCTCCGATTCCATGGTCTACCTCCCCCCCCCCAGCGTCGCCAAGGTCGTGAACACCGACGACTACGTCACCCGCACCGGGATCTACTACTACGCCGGGTCCAGCCGCCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTCGGCATGAACGGCGGGCGCAAGCAGGATATCCCCAAGGTCAGCGCCTACCAGTACCGCGTGTTCCGCGTCACCCTCCCAGACCCCAACAAGTTCTCCATCCCCGACGCCAGCCTGTACAACCCCGAGACCCAGCGCCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGGCGCGGGCAGCCCCTCGGCGTCGGCATCTCCGGCCACCCCCTGTACAACCGCCAGGACGACACCGAGAATAGCCCCTTCAGCAGCACAACAAACAAGGATTCCCGCGACAACGTCAGCGTCGACTACAAGCAGACCCAGCTCTGTATCATCGGGTGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGGCAAGGGCAAGGCCTGTAAGCCAAACAACGTGAGCACCGGCGATTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAATACACCCATCGAAGACGGCGACATGATCGACACCGGGTACGGCGCCATGGATTTCGGCGCCCTCCAGGAGACAAAGTCCGAAGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTCCAGATGAGCGCCGACGTCTACGGCGATTCCATGTTCTTCTGCCTGCGCCGCGAGCAGCTCTTCGCCCGCCACTTCTGGAACCGCGGCGGCATGGTCGGCGATGCAATCCCCGCACAGCTCTACATCAAGGGGACCGACATCCGCGCCAATCCAGGCTCCAGCGTGTATTGTCCAAGCCCATCCGGCAGCATGGTGACAAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCACAGGGGCATAATAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCCTGACCGTCGTCGATACCACACGCTCCACAAATTTCACCCTGAGCACAAGCATCGAAAGCAGCATCCCCAGCACCTACGACCCCAGCAAGTTCAAGGAGTACACACGCCACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTCTGCACCGTGACCCTGACCACCGACGTCATGAGCTACATCCACACCATGAACAGCAGCATCCTCGATAACTGGAACTTCGCCGTGGCCCCCCCCCCCAGCGCATCCCTCGTGGATACCTATCGCTATCTGCAGAGCGCCGCAATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCCGCCCCCGAGAAGAAGGACCCCTACGATGGCCTGAAGTTCTGGAACGTCGATCTGCGCGAGAAGTTCTCCCTGGAGCTGGACCAGTTCCCCCTCGGCCGCAAGTTCCTCCTCCAGGCACGCGTGCGCCGCCGCCCCACCATCGGCCCACGCAAGCGCCCCGCCGCCAGCACCAGCAGCAGCAGCGCCACCAAGCACAAGCGCAAGCGCGTCAGCAAGTGA
서열 14 (서열번호 14):
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서열 15 (서열번호 15):
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서열 16 (서열번호 16):
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서열 17 (서열번호 17):
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서열 18 (서열번호 18):
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서열 19 (서열번호 19):
ATGCCCAGCGTCGCCAAGGTCGTGAACACCGACGACTACGTCACCCGCACCGGGATCTACTACTACGCCGGGTCCAGCCGCCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTCGGCATGAACGGCGGGCGCAAGCAGGATATCCCCAAGGTCAGCGCCTACCAGTACCGCGTGTTCCGCGTCACCCTCCCAGACCCCAACAAGTTCTCCATCCCCGACGCCAGCCTGTACAACCCCGAGACCCAGCGCCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGGCGCGGGCAGCCCCTCGGCGTCGGCATCTCCGGCCACCCCCTGTACAACCGCCAGGACGACACCGAGAATAGCCCCTTCAGCAGCACAACAAACAAGGATTCCCGCGACAACGTCAGCGTCGACTACAAGCAGACCCAGCTCTGTATCATCGGGTGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGGCAAGGGCAAGGCCTGTAAGCCAAACAACGTGAGCACCGGCGATTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAATACACCCATCGAAGACGGCGACATGATCGACACCGGGTACGGCGCCATGGATTTCGGCGCCCTCCAGGAGACAAAGTCCGAAGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTCCAGATGAGCGCCGACGTCTACGGCGATTCCATGTTCTTCTGCCTGCGCCGCGAGCAGCTCTTCGCCCGCCACTTCTGGAACAGAGGCGGCATGGTCGGCGACACCATCCCCACCGACATGTACATCAAGGGCACCGACATCAGAGAGACACCCAGCAGCTACGTGTACTGT CCAAGCCCATCCGGCAGCATGGTGACAAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCACAGGGGCATAATAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCCTGACCGTCGTCGATACCACACGCTCCACAAATTTCACCCTGAGCACAAGCATCGAAAGCAGCATCCCCAGCACCTACGACCCCAGCAAGTTCAAGGAGTACACACGCCACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTCTGCACCGTGACCCTGACCACCGACGTCATGAGCTACATCCACACCATGAACAGCAGCATCCTCGATAACTGGAACTTCGCCGTGGCCCCCCCCCCCAGCGCATCCCTCGTGGATACCTATCGCTATCTGCAGAGCGCCGCAATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCCGCCCCCGAGAAGAAGGACCCCTACGATGGCCTGAAGTTCTGGAACGTCGATCTGCGCGAGAAGTTCTCCCTGGAGCTGGACCAGTTCCCCCTCGGCCGCAAGTTCCTCCTCCAGGCACGCGTGCGCCGCCGCCCCACCATCGGCCCACGCAAGCGCCCCGCCGCCAGCACCAGCAGCAGCAGCGCCACCAAGCACAAGCGCAAGCGCGTCAGCAAGTGA
서열 20 (서열번호 20):
ATGCCCAGCGTCGCCAAGGTCGTGAACACCGACGACTACGTCACCCGCACCGGGATCTACTACTACGCCGGGTCCAGCCGCCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTCGGCATGAACGGCGGGCGCAAGCAGGATATCCCCAAGGTCAGCGCCTACCAGTACCGCGTGTTCCGCGTCACCCTCCCAGACCCCAACAAGTTCTCCATCCCCGACGCCAGCCTGTACAACCCCGAGACCCAGCGCCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGGCGCGGGCAGCCCCTCGGCGTCGGCATCTCCGGCCACCCCCTGTACAACCGCCAGGACGACACCGAGAATAGCCCCTTCAGCAGCACAACAAACAAGGATTCCCGCGACAACGTCAGCGTCGACTACAAGCAGACCCAGCTCTGTATCATCGGGTGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGGCAAGGGCAAGGCCTGTAAGCCAAACAACGTGAGCACCGGCGATTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAATACACCCATCGAAGACGGCGACATGATCGACACCGGGTACGGCGCCATGGATTTCGGCGCCCTCCAGGAGACAAAGTCCGAAGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTCCAGATGAGCGCCGACGTCTACGGCGATTCCATGTTCTTCTGCCTGCGCCGCGAGCAGCTCTTCGCCCGCCACTTCTGGAACCGCGGCGGCATGGTCGGCGATGCAATCCCCGCACAGCTCTACATCAAGGGGACCGACATCCGCGCCAATCCAGGCTCCAGCGTGTATTGTCCAAGCCCATCCGGCAGCATGGTGACAAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCACAGGGGCATAATAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCCTGACCGTCGTCGATACCACACGCTCCACAAATTTCACCCTGAGCACAAGCACCGACAGCACCGTGCCCGCCGTGTACGACAGCAATAAGTTCAAGGAGTACACACGCCACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTCTGCACCGTGACCCTGACCACCGACGTCATGAGCTACATCCACACCATGAACAGCAGCATCCTCGATAACTGGAACTTCGCCGTGGCCCCCCCCCCCAGCGCATCCCTCGTGGATACCTATCGCTATCTGCAGAGCGCCGCAATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCCGCCCCCGAGAAGAAGGACCCCTACGATGGCCTGAAGTTCTGGAACGTCGATCTGCGCGAGAAGTTCTCCCTGGAGCTGGACCAGTTCCCCCTCGGCCGCAAGTTCCTCCTCCAGGCACGCGTGCGCCGCCGCCCCACCATCGGCCCACGCAAGCGCCCCGCCGCCAGCACCAGCAGCAGCAGCGCCACCAAGCACAAGCGCAAGCGCGTCAGCAAGTGA
서열 21 (서열번호 21):
ATGCCCAGCGTCGCCAAGGTCGTGAACACCGACGACTACGTCACCCGCACCGGGATCTACTACTACGCCGGGTCCAGCCGCCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTTAAGGTACCTGTAAATGGTGGCCGCAAGCAGGAAATACCTAAGGTGTCTGCCTACCAGTACCGCGTGTTCCGCGTCACCCTCCCAGACCCCAACAAGTTCTCCATCCCCGACGCCAGCCTGTACAACCCCGAGACCCAGCGCCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGGCGCGGGCAGCCCCTCGGCGTCGGCATCTCCGGCCACCCCCTGTACAACCGCCAGGACGACACCGAGAATAGCCCCTTCAGCAGCACAACAAACAAGGATTCCCGCGACAACGTCAGCGTCGACTACAAGCAGACCCAGCTCTGTATCATCGGGTGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGGCAAGGGCAAGGCCTGTAAGCCAAACAACGTGAGCACCGGCGATTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAATACACCCATCGAAGACGGCGACATGATCGACACCGGGTACGGCGCCATGGATTTCGGCGCCCTCCAGGAGACAAAGTCCGAAGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTCCAGATGAGCGCCGACGTCTACGGCGATTCCATGTTCTTCTGCCTGCGCCGCGAGCAGCTCTTCGCCCGCCACTTCTGGAACAGAGGCGGCATGGTCGGCGACACCATCCCCACCGACATGTACATCAAGGGCACCGACATCAGAGAGACACCCAGCAGCTACGTGTACTGT CCAAGCCCATCCGGCAGCATGGTGACAAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCACAGGGGCATAATAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCCTGACCGTCGTCGATACCACACGCTCCACAAATTTCACCCTGAGCACAAGCATCGAAAGCAGCATCCCCAGCACCTACGACCCCAGCAAGTTCAAGGAGTACACACGCCACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTCTGCACCGTGACCCTGACCACCGACGTCATGAGCTACATCCACACCATGAACAGCAGCATCCTCGATAACTGGAACTTCGCCGTGGCCCCCCCCCCCAGCGCATCCCTCGTGGATACCTATCGCTATCTGCAGAGCGCCGCAATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCCGCCCCCGAGAAGAAGGACCCCTACGATGGCCTGAAGTTCTGGAACGTCGATCTGCGCGAGAAGTTCTCCCTGGAGCTGGACCAGTTCCCCCTCGGCCGCAAGTTCCTCCTCCAGGCACGCGTGCGCCGCCGCCCCACCATCGGCCCACGCAAGCGCCCCGCCGCCAGCACCAGCAGCAGCAGCGCCACCAAGCACAAGCGCAAGCGCGTCAGCAAGTGA
서열 22 (서열번호 22):
ATGCCCAGCGTCGCCAAGGTCGTGAACACCGACGACTACGTCACCCGCACCGGGATCTACTACTACGCCGGGTCCAGCCGCCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTCGGCATGAACGGCGGGCGCAAGCAGGATATCCCCAAGGTCAGCGCCTACCAGTACCGCGTGTTCCGCGTCACCCTCCCAGACCCCAACAAGTTCTCCATCCCCGACGCCAGCCTGTACAACCCCGAGACCCAGCGCCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGTAGAGGCCAGCCATTGGGCGTTGGTGTTAGTGGACATCCTTTATATAATAGATTGGATGATACTGAAAATTCACATTTTTCCTCTGCTGTTAATACACAGGACAGTAGGGACAATGTGTCTGTGGACTATAAGCAGACCCAGCTCTGTATCATCGGGTGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGGCAAGGGCAAGGCCTGTAAGCCAAACAACGTGAGCACCGGCGATTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAATACACCCATCGAAGACGGCGACATGATCGACACCGGGTACGGCGCCATGGATTTCGGCGCCCTCCAGGAGACAAAGTCCGAAGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTCCAGATGAGCGCCGACGTCTACGGCGATTCCATGTTCTTCTGCCTGCGCCGCGAGCAGCTCTTCGCCCGCCACTTCTGGAACAGAGGCGGCATGGTCGGCGACACCATCCCCACCGACATGTACATCAAGGGCACCGACATCAGAGAGACACCCAGCAGCTACGTGTAC TGTCCAAGCCCATCCGGCAGCATGGTGACAAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCACAGGGGCATAATAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCCTGACCGTCGTCGATACCACACGCTCCACAAATTTCACCCTGAGCACAAGCATCGAAAGCAGCATCCCCAGCACCTACGACCCCAGCAAGTTCAAGGAGTACACACGCCACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTCTGCACCGTGACCCTGACCACCGACGTCATGAGCTACATCCACACCATGAACAGCAGCATCCTCGATAACTGGAACTTCGCCGTGGCCCCCCCCCCCAGCGCATCCCTCGTGGATACCTATCGCTATCTGCAGAGCGCCGCAATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCCGCCCCCGAGAAGAAGGACCCCTACGATGGCCTGAAGTTCTGGAACGTCGATCTGCGCGAGAAGTTCTCCCTGGAGCTGGACCAGTTCCCCCTCGGCCGCAAGTTCCTCCTCCAGGCACGCGTGCGCCGCCGCCCCACCATCGGCCCACGCAAGCGCCCCGCCGCCAGCACCAGCAGCAGCAGCGCCACCAAGCACAAGCGCAAGCGCGTCAGCAAGTGA
서열 23 (서열번호 23):
ATGCCCAGCGTCGCCAAGGTCGTGAACACCGACGACTACGTCACCCGCACCGGGATCTACTACTACGCCGGGTCCAGCCGCCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTCGGCATGAACGGCGGGCGCAAGCAGGATATCCCCAAGGTCAGCGCCTACCAGTACCGCGTGTTCCGCGTCACCCTCCCAGACCCCAACAAGTTCTCCATCCCCGACGCCAGCCTGTACAACCCCGAGACCCAGCGCCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGGCGCGGGCAGCCCCTCGGCGTCGGCATCTCCGGCCACCCCCTGTACAACCGCCAGGACGACACCGAGAATAGCCCCTTCAGCAGCACAACAAACAAGGATTCCCGCGACAACGTCAGCGTCGACTACAAGCAGACCCAGCTCTGTATCATCGGGTGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGCAAAGGGCAAGGCCTGTAAGTCCACTACTGTACAACAGGGCGATTGTCCACCACTGGAGCTGGTGAATACACCCATCGAAGACGGCGACATGATCGACACCGGGTACGGCGCCATGGATTTCGGCGCCCTCCAGGAGACAAAGTCCGAAGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTCCAGATGAGCGCCGACGTCTACGGCGATTCCATGTTCTTCTGCCTGCGCCGCGAGCAGCTCTTCGCCCGCCACTTCTGGAACAGAGGCGGCATGGTCGGCGACACCATCCCCACCGACATGTACATCAAGGGCACCGACATCAGAGAGACACCCAGCAGCTACGTGTACTGT CCAAGCCCATCCGGCAGCATGGTGACAAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCACAGGGGCATAATAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCCTGACCGTCGTCGATACCACACGCTCCACAAATTTCACCCTGAGCACAAGCATCGAAAGCAGCATCCCCAGCACCTACGACCCCAGCAAGTTCAAGGAGTACACACGCCACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTCTGCACCGTGACCCTGACCACCGACGTCATGAGCTACATCCACACCATGAACAGCAGCATCCTCGATAACTGGAACTTCGCCGTGGCCCCCCCCCCCAGCGCATCCCTCGTGGATACCTATCGCTATCTGCAGAGCGCCGCAATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCCGCCCCCGAGAAGAAGGACCCCTACGATGGCCTGAAGTTCTGGAACGTCGATCTGCGCGAGAAGTTCTCCCTGGAGCTGGACCAGTTCCCCCTCGGCCGCAAGTTCCTCCTCCAGGCACGCGTGCGCCGCCGCCCCACCATCGGCCCACGCAAGCGCCCCGCCGCCAGCACCAGCAGCAGCAGCGCCACCAAGCACAAGCGCAAGCGCGTCAGCAAGTGA
서열 24 (서열번호 24):
ATGCCCAGCGTCGCCAAGGTCGTGAACACCGACGACTACGTCACCCGCACCGGGATCTACTACTACGCCGGGTCCAGCCGCCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTCGGCATGAACGGCGGGCGCAAGCAGGATATCCCCAAGGTCAGCGCCTACCAGTACCGCGTGTTCCGCGTCACCCTCCCAGACCCCAACAAGTTCTCCATCCCCGACGCCAGCCTGTACAACCCCGAGACCCAGCGCCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGGCGCGGGCAGCCCCTCGGCGTCGGCATCTCCGGCCACCCCCTGTACAACCGCCAGGACGACACCGAGAATAGCCCCTTCAGCAGCACAACAAACAAGGATTCCCGCGACAACGTCAGCGTCGACTACAAGCAGACCCAGCTCTGTATCATCGGGTGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGGCAAGGGCAAGGCCTGTAAGCCAAACAACGTGAGCACCGGCGATTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAATACACCCATCGAAGACGGCGACATGATCGACACCGGGTACGGCGCCATGGATTTCGGCGCCCTCCAGGAGACAAAGTCCGAAGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTCCAGATGAGCGCCGACGTCTACGGCGATTCCATGTTCTTCTGCCTGCGCCGCGAGCAGCTCTTCGCCCGCCACTTCTGGAACAGAGGCGGCATGGTCGGCGACACCATCCCCACCGACATGTACATCAAGGGCACCGACATCAGAGAGACACCCAGCAGCTACGTGTACTGT CCAAGCCCATCCGGCAGCATGGTGACAAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCACAGGGGCATAATAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCCTGACCGTCGTCGATACCACACGCTCCACAAATTTCACCCTGAGCACAAGCACCGAAACAGCCATACCTGCTGTATATAGCCCTACAAAGTTCAAGGAGTACACACGCCACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTCTGCACCGTGACCCTGACCACCGACGTCATGAGCTACATCCACACCATGAACAGCAGCATCCTCGATAACTGGAACTTCGCCGTGGCCCCCCCCCCCAGCGCATCCCTCGTGGATACCTATCGCTATCTGCAGAGCGCCGCAATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCCGCCCCCGAGAAGAAGGACCCCTACGATGGCCTGAAGTTCTGGAACGTCGATCTGCGCGAGAAGTTCTCCCTGGAGCTGGACCAGTTCCCCCTCGGCCGCAAGTTCCTCCTCCAGGCACGCGTGCGCCGCCGCCCCACCATCGGCCCACGCAAGCGCCCCGCCGCCAGCACCAGCAGCAGCAGCGCCACCAAGCACAAGCGCAAGCGCGTCAGCAAGTGA
서열 25 (서열번호 25):
TIPTDMYIKGTDIRETPSSY
서열 26 (서열번호 26):
VSGHPLYNRLDDTENSHFSSAVNTQ
서열 27 (서열번호 27):
AKGKACKSTTVQQ
서열 28 (서열번호 28):
TETAIPAVYSPT
서열 29 (서열번호 29):
MPSVAKVVNTDDYVTRTGIYYYAGSSRLLTVGHPYFKVGMNGGRKQDIPKVSAYQYRVFRVTLPDPNKFSIPDASLYNPETQRLVWACVGVEVGRGQPLGVGISGHPLYNRQDDTENSPFSSTTNKDSRDNVSVDYKQTQLCIIGCVPAIGEHWGKGKACKPNNVSTGDCPPLELVNTPIEDGDMIDTGYGAMDFGALQETKSEVPLDICQSICKYPDYLQMSADVYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRGGMVGDAIPAQLYIKGTDIRANPGSSVYCPSPSGSMVTSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFLTVVDTTRSTNFTLSTSIESSIPSTYDPSKFKEYTRHVEEYDLQFIFQLCTVTLTTDVMSYIHTMNSSILDNWNFAVAPPPSASLVDTYRYLQSAAITCQKDAPAPEKKDPYDGLKFWNVDLREKFSLELDQFPLGRKFLLQARVRRRPTIGPRKRPAASTSSSSATKHKRKRVSK
서열 30 (서열번호 30):
ATGCCCAGCGTCGCCAAGGTCGTGAACACCGACGACTACGTCACCCGCACCGGGATCTACTACTACGCCGGGTCCAGCCGCCTGCTGACCGTGGGCCACCCCTACTTCAAGGTCGGCATGAACGGCGGGCGCAAGCAGGATATCCCCAAGGTCAGCGCCTACCAGTACCGCGTGTTCCGCGTCACCCTCCCAGACCCCAACAAGTTCTCCATCCCCGACGCCAGCCTGTACAACCCCGAGACCCAGCGCCTGGTGTGGGCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGGCGCGGGCAGCCCCTCGGCGTCGGCATCTCCGGCCACCCCCTGTACAACCGCCAGGACGACACCGAGAATAGCCCCTTCAGCAGCACAACAAACAAGGATTCCCGCGACAACGTCAGCGTCGACTACAAGCAGACCCAGCTCTGTATCATCGGGTGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGGCAAGGGCAAGGCCTGTAAGCCAAACAACGTGAGCACCGGCGATTGCCCCCCCCTGGAGCTGGTGAATACACCCATCGAAGACGGCGACATGATCGACACCGGGTACGGCGCCATGGATTTCGGCGCCCTCCAGGAGACAAAGTCCGAAGTCCCCCTGGACATCTGCCAGAGCATCTGCAAGTACCCCGACTACCTCCAGATGAGCGCCGACGTCTACGGCGATTCCATGTTCTTCTGCCTGCGCCGCGAGCAGCTCTTCGCCCGCCACTTCTGGAACCGCGGCGGCATGGTCGGCGATGCAATCCCCGCACAGCTCTACATCAAGGGGACCGACATCCGCGCCAATCCAGGCTCCAGCGTGTATTGTCCAAGCCCATCCGGCAGCATGGTGACAAGCGACAGCCAGCTGTTCAACAAGCCCTACTGGCTGCACAAGGCACAGGGGCATAATAACGGCATCTGCTGGCACAACCAGCTGTTCCTGACCGTCGTCGATACCACACGCTCCACAAATTTCACCCTGAGCACAAGCATCGAAAGCAGCATCCCCAGCACCTACGACCCCAGCAAGTTCAAGGAGTACACACGCCACGTCGAAGAATACGACCTGCAGTTCATCTTCCAGCTCTGCACCGTGACCCTGACCACCGACGTCATGAGCTACATCCACACCATGAACAGCAGCATCCTCGATAACTGGAACTTCGCCGTGGCCCCCCCCCCCAGCGCATCCCTCGTGGATACCTATCGCTATCTGCAGAGCGCCGCAATCACCTGCCAGAAGGACGCCCCCGCCCCCGAGAAGAAGGACCCCTACGATGGCCTGAAGTTCTGGAACGTCGATCTGCGCGAGAAGTTCTCCCTGGAGCTGGACCAGTTCCCCCTCGGCCGCAAGTTCCTCCTCCAGGCACGCGTGCGCCGCCGCCCCACCATCGGCCCACGCAAGCGCCCCGCCGCCAGCACCAGCAGCAGCAGCGCCACCAAGCACAAGCGCAAGCGCGTCAGCAAGTGA
서열 31 (서열번호 31):
MVYLPPPSVAKVVNTDDYVTRTGIYYYAGSSRLLTVGHPYFKVPVNGGRKQEIPKVSAYQYRVFRVSLPDPNKFGLPDPSLYNPDTQRLVWACIGVEIGRGQPLGVGVSGHPLYNRLDDTENSHFSSAVNTQDSRDNVSVDYKQTQLCIIGCVPAMGEHWAKGKACKSTTVQQGDCPPLELVNTAIEDGDMIDTGYGAMDFRTLQETKSEVPLDICQSVCKYPDYLQMSADVYGDSMFFCLRKEQLFARHFWNRGGMVGDTIPSELYIKGTDIRDRPGTHVYSPSPSGSMVSSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFITVVDTTRSTNFTLSACTETAIPAVYSPTKFKEYTRHVEEYDLQFIFQLCTITLTADVMAYIHTMNPAILDNWNIGVTPPPSASLVDTYRYLQSAAIACQKDAPAPEKKDPYDDLKFWNVDLKEKFSTELDQFPLGRKFLLQVGARRRPTIGPRKRPASAKSSSSASKHKRKRVSK
서열 32 (서열번호 32):
ATGGTGTATTTGCCACCCCCTTCTGTGGCGAAGGTTGTCAATACAGATGATTATGTAACACGTACAGGCATATATTATTATGCTGGAAGCTCTCGCTTATTAACAGTAGGGCATCCTTATTTTAAGGTACCTGTAAATGGTGGCCGCAAGCAGGAAATACCTAAGGTGTCTGCATATCAGTATAGGGTATTTAGGGTATCCCTACCTGATCCTAATAAGTTTGGCCTTCCGGATCCTTCCCTTTATAATCCTGACACACAACGCCTGGTATGGGCCTGTATAGGTGTGGAAATTGGTAGAGGCCAGCCATTGGGCGTTGGTGTTAGTGGACATCCTTTATATAATAGATTGGATGATACTGAAAATTCACATTTTTCCTCTGCTGTTAATACACAGGACAGTAGGGACAATGTGTCTGTGGACTATAAGCAGACACAGTTATGTATTATAGGCTGTGTTCCTGCTATGGGAGAGCACTGGGCAAAGGGCAAGGCCTGTAAGTCCACTACTGTACAACAGGGCGATTGTCCACCATTAGAATTAGTTAATACTGCAATTGAGGATGGCGATATGATAGATACAGGCTATGGAGCCATGGACTTTCGTACATTGCAGGAAACCAAAAGTGAGGTACCACTAGATATTTGCCAATCCGTGTGTAAATATCCTGATTATTTGCAGATGTCTGCTGATGTATATGGGGACAGTATGTTTTTTTGTTTGCGCAAGGAACAGTTATTTGCCAGACACTTTTGGAATAGAGGTGGCATGGTGGGCGACACAATACCTTCAGAGTTATATATTAAAGGCACGGATATACGTGATCGTCCTGGTACTCATGTATATTCCCCTTCCCCAAGTGGCTCTATGGTTTCTTCTGATTCCCAGTTGTTTAATAAGCCCTATTGGTTGCATAAGGCCCAGGGACACAATAATGGCATTTGTTGGCATAACCAGTTGTTTATTACTGTGGTGGACACTACACGTAGTACTAATTTTACATTGTCTGCCTGCACCGAAACAGCCATACCTGCTGTATATAGCCCTACAAAGTTTAAGGAATATACTAGGCATGTGGAGGAATATGATTTACAATTTATATTTCAGTTGTGTACTATCACATTAACTGCAGACGTTATGGCCTACATCCATACTATGAATCCTGCAATTTTGGACAATTGGAATATAGGCGTTACCCCTCCACCATCTGCAAGCTTGGTGGACACGTATAGGTATTTACAATCAGCAGCTATAGCATGTCAGAAGGATGCTCCTGCACCTGAAAAAAAGGATCCCTATGACGATTTAAAATTTTGGAATGTTGATTTAAAGGAAAAGTTTAGTACAGAACTAGATCAGTTTCCTTTGGGGCGCAAATTTTTACTACAGGTAGGGGCTCGCAGACGTCCTACTATAGGCCCTCGCAAACGCCCTGCATCAGCTAAATCGTCTTCCTCAGCCTCTAAACACAAACGGAAACGTGTGTCCAAGTAA
서열 33 (서열번호 33):
PMSGGRKQG
서열 34 (서열번호 34):
LSGHPLYNRLDDTENSPFSSNKNPKDSRDNVAVDC
서열 35 (서열번호 35):
AKGKSCKPTNVQQ
서열 36 (서열번호 36):
TDSTVPAVYDSN
서열 37 (서열번호 37):
PVNGGRKQE
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 추가로 설명되며, 여기서 실시예는 본 발명을 제한한다기 보다는 본 발명을 설명하기 위한 목적으로만 사용된다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명에 사용된 분자생물학적 실험방법 및 면역학적 분석들은 실질적으로 문헌[Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989], 및 문헌[F. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995]에 기재된 바와 같은 방법에 따라 실질적으로 수행되며; 제한 효소는 제조사가 권장하는 조건하에서 사용된다. 당업자는 상기 실시예가 본 발명을 설명하기 위해 사용되지만, 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아님을 이해한다.
실시예 1. 돌연변이된 HPV39 L1 단백질의 발현 및 정제
발현 벡터의 구축
HPV68 L1 단백질로부터의 조각을 포함하는 돌연변이된 HPV39 L1 단백질을 암호화하는 발현 벡터를 다중-부위 돌연변이유발을 위해 PCR에 의해 구축하였으며, 이 때 사용된 초기 주형은 플라스미드 pTO-T7-HPV39N15C (N-말단에서 절단된 15개 아미노산을 갖는 HPV39 L1 단백질을 암호화; 표 2에서 39L1N15로 약칭)였다. 각각의 PCR에 대한 주형 및 프라이머를 표 2에 나타내었으며, PCR에 대한 증폭 조건은 다음과 같았다: 94℃에서 10분간 변성; 25 사이클 (94℃에서 50초간 변성, 일정 기간 동안 주어진 온도에서 어닐링, 및 72℃에서 7.5분간 연장); 및 최종적으로 72℃에서 10분간 연장. 어닐링 온도 및 시간을 표 2에 나열하였다. 상기 사용된 PCR 프라이머의 서열을 표 3에 나열하였다.
증폭 산물(50 ㎕)에 대하여, 2 ㎕의 제한 엔도뉴클레아제 DpnI (Fermentas (MBI), Cat.No.FD1704, 2500U/튜브)를 첨가하고, 생성 혼합물을 37℃에서 60분간 배양하였다. 10 ㎕의 소화 산물을 사용하여 염화 칼슘 방법에 의해 제조된 40 ㎕ 수용성 E. coli ER2566(New England Biolabs로부터 구입)을 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 E. coli를 카나마이신(25 ㎎/㎖ 의 최종 농도로, 본 명세서에서 이후에도 동일함)을 함유하는 고형 LB 배지(상기 LB 배지의 성분들: 10 g/L 펩톤, 5 g/L 효모 분말, 10 g/L NaCl, 본 명세서에서 이후에도 동일함)상에 도말하고, 단일 콜로니가 명확하게 관찰될 때까지 37℃에서 10 내지 12시간 동안 정적 배양하였다. 단일 콜로니를 수집하여 4 ㎖ 액체 LB 배지(카나마이신 함유)를 함유하는 튜브에 접종하고, 37℃에서 10시간 동안 220 rpm으로 진탕 배양한 다음, 이어서 1 ㎖ 박테리아 용액을 취하여 -70℃에서 보관하였다. 플라스미드를 E. coli로부터 추출하고, T7 프라이머를 사용하여 상기 플라스미드에 삽입된 관심 단편의 뉴클레오타이드 서열을 시퀀싱하였다. 시퀀싱 결과, 상기 구축된 플라스미드(발현 벡터)에 삽입된 관심 단편의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 16이고, 이의 암호화된 아미노산 서열은 서열번호 4인 것으로 나타났다 (상응하는 단백질을 H39N15-68T1로 표시함). 상기 돌연변이된 H39N15-68T1은, 야생형 HPV39 L1 단백질의 53-61번째 아미노산 잔기를 야생형 HPV68 L1 단백질의 53-61번째 아미노산 잔기로 치환한다는 점에서 HPV39N15와 다르다.
깁슨(Gibson) 조립 (Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 2009; 6:343-5. doi: 10.1038/nmeth.1318)을 사용하여 다른 돌연변이된 HPV39 L1 단백질을 암호화하는 발현 벡터를 구축하였으며, 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질은 HPV68 L1로부터의 특정 조각 및 HPV70L1로부터의 특정 조각을 포함하였다. 간단히 말해서, 돌연변이를 포함하는 짧은 단편 및 돌연변이를 포함하지 않는 긴 단편을 PCR에 의해 얻은 다음, 깁슨 조립 시스템을 사용하여 두 단편을 결찰(ligate)하여 고리를 형성하였다. 사용된 초기 주형은 플라스미드 pTO-T7-HPV39N15 (N-말단에서 절단된 15개 아미노산을 갖는 HPV39 L1 단백질을 암호화; 표 2에서 39L1N15로 약칭), 플라스미드 pTO-T7-HPV68L1 (HPV68 L1 단백질을 암호화; 표 2에서 68L1N0로 약칭), 플라스미드 pTO-T7-H39N15-68T4 (돌연변이된 단백질 H39N15-68T4를 암호화; 표 2에서 H39N15-68T4로 약칭) 및 플라스미드 pTO-T7-HPV70N10 (N-말단에서 절단된 10개 아미노산을 갖는 HPV70 L1 단백질을 암호화; 표 2에서 70L1N10로 약칭)를 포함하였다. 각각의 PCR에 대한 주형 및 프라이머를 표 2에 나타내었으며, 짧은 단편을 증폭하기 위한 PCR의 증폭 조건은 다음과 같았다: 94℃에서 10분간 변성; 25 사이클 (94℃에서 50초간 변성, 일정 기간 동안 주어진 온도에서 어닐링, 및 72℃에서 1분간 연장); 및 최종적으로 72℃에서 10분간 연장. 긴 단편을 증폭하기 위한 PCR의 증폭 조건은 다음과 같았다: 94℃에서 10분간 변성; 25 사이클 (94℃에서 50초간 변성, 일정 기간 동안 주어진 온도에서 어닐링, 및 72℃에서 7.5분간 연장); 및 최종적으로 72℃에서 10분간 연장. 상기 사용된 PCR 프라이머의 서열을 표 3에 나타내었다. 상기 증폭 산물을 전기영동한 후, DNA 추출 키트 (BEYOTIME, Cat.No.D0033)를 사용하여 관심 단편을 회수하고, 농도를 측정하였다. 증폭에 의해 얻은 짧은 단편 및 긴 단편을 2:1의 몰비 (총 부피 3 μL)로 혼합하고, 이어서 3μL의 2 X 깁슨 조립 Master Mix (NEB로부터 구입, T5 엑소뉴클레아제, Phusion DNA 폴리머라제, Taq DNA 리가아제를 포함)를 첨가하고, 50℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
상기 조립된 생성물 (6μL)을 사용하여 40 μL 수용성 E. coli ER2566 (New England Biolabs로부터 구입)을 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 E. coli를 카나마이신을 함유하는 고형 LB 배지 상에 도말하고, 단일 콜로니가 명확하게 관찰될 때까지 37℃에서 10 내지 12시간 동안 정적 배양하였다. 단일 콜로니를 수집하여 4 ㎖ 액체 LB 배지(카나마이신 함유)를 함유하는 튜브에 접종하고, 37℃에서 10시간 동안 220 rpm으로 진탕 배양한 다음, 이어서 1 ㎖ 박테리아 용액을 취하여 -70℃에서 보관하였다. 플라스미드를 E. coli로부터 추출하고, T7 프라이머를 사용하여 상기 플라스미드에 삽입된 관심 단편의 뉴클레오타이드 서열을 시퀀싱하였다. 시퀀싱 결과, 상기 구축된 플라스미드(발현 벡터)에 삽입된 관심 단편의 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 및 24인 것으로 나타났다 (상응하는 단백질들을 각각 H39N15-68T2, H39N15-68T3, H39N15-68T4, H39N15-68T5, H39N15-68T4-70S1, H39N15-68T4-70S2, H39N15-68T4-70S3, 및 H39N15-68T4-70S5로 표시함).
상기 돌연변이된 단백질 H39N15-68T2는, 야생형 HPV39 L1 단백질의 117-150번째 아미노산 잔기를 야생형 HPV68 L1 단백질의 117-151번째 아미노산 잔기로 치환한다는 점에서 HPV39N15와 다르다. 상기 돌연변이된 단백질 H39N15-68T3은, 야생형 HPV39 L1 단백질의 169-181번째 아미노산 잔기를 야생형 HPV68 L1 단백질의 170-182번째 아미노산 잔기로 치환한다는 점에서 HPV39N15와 다르다. 상기 돌연변이된 단백질 H39N15-68T4는, 야생형 HPV39 L1 단백질의 269-288번째 아미노산 잔기를 야생형 HPV68 L1 단백질의 270-289번째 아미노산 잔기로 치환한다는 점에서 HPV39N15와 다르다. 상기 돌연변이된 단백질 H39N15-68T5는, 야생형 HPV39 L1 단백질의 347-358번째 아미노산 잔기를 야생형 HPV68 L1 단백질의 348-359번째 아미노산 잔기로 치환한다는 점에서 HPV39N15와 다르다.
상기 돌연변이된 단백질 H39N15-68T4-70S1은, 야생형 HPV39 L1 단백질의 269-288번째 아미노산 잔기를 야생형 HPV68 L1 단백질의 270-289번째 아미노산 잔기로 치환, 및 야생형 HPV39 L1 단백질의 53-61번째 아미노산 잔기를 야생형 HPV70 L1 단백질의 53-61번째 아미노산 잔기로 치환한다는 점에서 HPV39N15와 다르다. 상기 돌연변이된 단백질 H39N15-68T4-70S2는, 야생형 HPV39 L1 단백질의 269-288번째 아미노산 잔기를 야생형 HPV68 L1 단백질의 270-289번째 아미노산 잔기로 치환, 및 야생형 HPV39 L1 단백질의 117-140번째 아미노산 잔기를 야생형 HPV70 L1 단백질의 117-141번째 아미노산 잔기로 치환한다는 점에서 HPV39N15와 다르다. 상기 돌연변이된 단백질 H39N15-68T4-70S3은, 야생형 HPV39 L1 단백질의 269-288번째 아미노산 잔기를 야생형 HPV68 L1 단백질의 270-289번째 아미노산 잔기로 치환, 및 야생형 HPV39 L1 단백질의 169-181번째 아미노산 잔기를 야생형 HPV70 L1 단백질의 170-182번째 아미노산 잔기로 치환한다는 점에서 HPV39N15와 다르다. 상기 돌연변이된 단백질 H39N15-68T4-70S5는, 야생형 HPV39 L1 단백질의 269-288번째 아미노산 잔기를 야생형 HPV68 L1 단백질의 270-289번째 아미노산 잔기로 치환, 및 야생형 HPV39 L1 단백질의 347-358번째 아미노산 잔기를 야생형 HPV70 L1 단백질의 348-359번째 아미노산 잔기로 치환한다는 점에서 HPV39N15와 다르다.
주형 상류 프라이머 하류 프라이머 생성물 어닐링 온도
/시간
39L1N15 H39N15-68T1-F H39N15-68T1-R H39N15-68T1 56℃/50s
39L1N15 G-V-H39N15-68T2-F G-V-H39N15-68T2-R H39N15-68T2
긴 단편		 56℃/50s
39L1N15 G-V-H39N15-68T3-F G-V-H39N15-68T3-R H39N15-68T3
긴 단편		 56℃/50s
39L1N15 G-V-H39N15-68T4-F G-V-H39N15-68T4-R H39N15-68T4
긴 단편		 56℃/50s
39L1N15 G-V-H39N15-68T5-F G-V-H39N15-68T5-R H39N15-68T5
긴 단편		 56℃/50s
68L1N0 G-H39N15-68T2-F G-H39N15-68T2-R H39N15-68T2
짧은 단편		 56℃/30s
68L1N0 G-H39N15-68T3-F G-H39N15-68T3-R H39N15-68T3
짧은 단편		 56℃/30s
68L1N0 G-H39N15-68T4-F G-H39N15-68T4-R H39N15-68T4
짧은 단편		 56℃/30s
68L1N0 G-H39N15-68T5-F G-H39N15-68T5-R H39N15-68T5
짧은 단편		 56℃/30s
H39N15-68T4 G-V-H39N15-68T4-70S1-F G-V-H39N15-68T4-70S1-R H39N15-68T4-70S1
긴 단편		 56℃/50s
H39N15-68T4 G-V-H39N15-68T4-70S2-F G-V-H39N15-68T4-70S2-R H39N15-68T4-70S2
긴 단편		 56℃/50s
H39N15-68T4 G-V-H39N15-68T4-70S3-F G-V-H39N15-68T4-70S3-R H39N15-68T4-70S3
긴 단편		 56℃/50s
H39N15-68T4 G-V-H39N15-68T4-70S5-F G-V-H39N15-68T4-70S5-R H39N15-68T4-70S5
긴 단편		 56℃/50s
70L1N10 G-H39N15-68T4-70S1-F G-H39N15-68T4-70S1-R H39N15-68T4-70S1
짧은 단편		 56℃/30s
70L1N10 G-H39N15-68T4-70S2-F G-H39N15-68T4-70S2-R H39N15-68T4-70S2
짧은 단편		 56℃/30s
70L1N10 G-H39N15-68T4-70S3-F G-H39N15-68T4-70S3-R H39N15-68T4-70S3
짧은 단편		 56℃/30s
70L1N10 G-H39N15-68T4-70S5-F G-H39N15-68T4-70S5-R H39N15-68T4-70S5
짧은 단편		 56℃/30s
서열번호 프라이머 이름 서열(5'-3')
38 H39N15-68T1-F TTCAAGGTCCCCATGAGCGGCGGGCGCAAGCAGGATATCCCCAAGGTC
39 H39N15-68T1-R CCCGCCGCTCATGGGGACCTTGAAGTAGGGGTGGCCCACGGTCAGCAG
40 G-V- H39N15-68T2-F GACTTCGACGCCCACGCAGGCCCA
41 G-V- H39N15-68T2-R AAGCAGACCCAGCTCTGTATCATC
42 G-V- H39N15-68T3-F TTCGCCGATTGCTGGGACGCACCC
43 G-V- H39N15-68T3-R CTGGAGCTGGTGAATACACCCATC
44 G-V- H39N15-68T4-F GTGGCGGGCGAAGAGCTGCTCGCG
45 G-V- H39N15-68T4-R TGTCCAAGCCCATCCGGCAGCATG
46 G-V- H39N15-68T5-F GCTTGTGCTCAGGGTGAAATTTGTGGAGCG
47 G-V- H39N15-68T5-F TTCAAGGAGTACACACGCCACGTCGAAGAA
48 G- H39N15-68T2-F TGGGCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGCAGAGGCCAGCCCCTGGGC
49 G- H39N15-68T2-R GATGATACAGAGCTGGGTCTGCTTGCAGTCCACGGCCACGTTGTC
50 G- H39N15-68T3-F GGGTGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGCCAAGGGCAAGAGC
51 G- H39N15-68T3-R GATGGGTGTATTCACCAGCTCCAGAGGGGGGCAGTCGCCCTGCTG
52 G- H39N15-68T4-F CGCGAGCAGCTCTTCGCCCGCCACTTCTGGAACAGAGGCGGCATG
53 G- H39N15-68T4-R CATGCTGCCGGATGGGCTTGGACAGTACACGTAGCTGCTGGGTGT
54 G- H39N15-68T5-F CGCTCCACAAATTTCACCCTGAGCACAAGCACCGACAGCACCGTGCCCGCC
55 G- H39N15-68T5-R TTCTTCGACGTGGCGTGTGTACTCCTTGAACTTATTGCTGTCGTACACGGC
56 G-V- H39N15-68T4-70S1-F GTAGGGGTGGCCCACGGTCAG
57 G-V- H39N15-68T4-70S1-R GCCTACCAGTACCGCGTGTTC
58 G-V- H39N15-68T4-70S2-F GACTTCGACGCCCACGCAGGC
59 G-V- H39N15-68T4-70S2-R AAGCAGACCCAGCTCTGTATC
60 G-V- H39N15-68T4-70S3-F TTCGCCGATTGCTGGGACGCA
61 G-V- H39N15-68T4-70S3-R CTGGAGCTGGTGAATACACCC
62 G-V- H39N15-68T4-70S5-F GCTTGTGCTCAGGGTGAAATT
63 G-V- H39N15-68T4-70S5-R TTCAAGGAGTACACACGCCAC
64 G- H39N15-68T4-70S1-F CTGACCGTGGGCCACCCCTACTTTAAGGTACCTGTAAATGGT
65 G- H39N15-68T4-70S1-R GAACACGCGGTACTGGTAGGCAGACACCTTAGGTATTTCCTG
66 G- H39N15-68T4-70S2-F GCCTGCGTGGGCGTCGAAGTCGGTAGAGGCCAGCCATTGGGC
67 G- H39N15-68T4-70S2-R GATACAGAGCTGGGTCTGCTTATAGTCCACAGACACATTGTC
68 G- H39N15-68T4-70S3-F TGCGTCCCAGCAATCGGCGAACACTGGGCAAAGGGCAAGGCC
69 G- H39N15-68T4-70S3-R GGGTGTATTCACCAGCTCCAGTGGTGGACAATCGCCCTGTTGTAC
70 G- H39N15-68T4-70S5-F AATTTCACCCTGAGCACAAGCACCGAAACAGCCATACCTGCT
71 G- H39N15-68T4-70S5-R GTGGCGTGTGTACTCCTTGAACTTTGTAGGGCTATATACAGC
돌연변이된 단백질의 대규모 발현
재조합 플라스미드 pTO-T7-H39N15-68T1, pTO-T7- H39N15-68T2, pTO-T7-H39N15-68T3, pTO-T7-H39N15-68T4, pTO-T7-H39N15-68T5, pTO-T7-H39N15-68T4-70S1, pTO-T7-H39N15-68T4-70S2, pTO-T7-H39N15-68T4-70S3, 및 pTO-T7-H39N15-68T4-70S5을 각각 포함하는 E. coli 용액을 -70℃ 냉장고에서 꺼내어, 카나마이신을 함유하는 100 mL LB 액체 배지에 접종하고, 각각 200 rpm 및 37℃ 조건에서 약 8시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 배양물을 카나마이신을 함유하는 500mL LB 배지로 옮기고 (1 mL 박테리아 용액을 옮기고), 추가로 배양하였다. 상기 박테리아 농도가 약 0.6의 OD600에 도달했을 때, 배양 온도를 25℃로 낮추고 500 ㎕의 IPTG를 각 배양 보틀에 첨가하였다. 상기 배양을 8시간 동안 추가로 수행하였다. 배양을 끝낸 후에, 박테리아를 원심분리에 의해 수집하였다. 각각 H39N15-68T1, H39N15-68T2, H39N15-68T3, H39N15-68T4, H39N15-68T5, H39N15-68T4-70S1, H39N15-68T4-70S2, H39N15-68T4-70S3 및 H39N15-68T4-70S5 단백질을 발현하는 박테리아를 수득하였다.
돌연변이된 단백질을 발현하는 박테리아의 파쇄
상기 수득된 박테리아를 1g 박테리아 대 10 ㎖ 용해 버퍼(20 mM Tris 버퍼, pH 7.2, 300 mM NaCl)의 비율로 재-현탁하였다. 상기 박테리아를 초음파 기구를 사용하여 30분 동안 파쇄하였다. 상기 파쇄된 박테리아를 함유하는 용해 버퍼를 13500 rpm(30000 g)에서 15분 동안 원심분리하고, 상층액(즉 파쇄된 박테리아의 상층액)을 수득하였다.
돌연변이된 단백질의 크로마토그래피 정제
장비: GE Healthcare (즉 the original Amershan Pharmacia Co.)에 의해 제조된 AKTA Explorer 100 분취용 액체 크로마토그래피 시스템
크로마토그래피 매질: SP 세파로스 4 패스트 플로우 (GE Healthcare Co.), CHT-II (Bio-RAD로부터 구입) 및 부틸 세파로스 4 패스트 플로우 (GE Healthcare Co.)
버퍼: 버퍼 A (20 mM 포스페이트 버퍼, pH8.0, 20 mM DTT); 및 버퍼 B (20 mM 포스페이트 버퍼, pH8.0, 20 mM DTT, 2M NaCl). 하기 용출(elution) 프로토콜에서 사용되는 서로 다른 농도의 NaCl을 포함하는 버퍼들은 버퍼 A 및 버퍼 B를 특정 비율로 혼합하여 준비하였다.
샘플: 상기에서 수득한, 각각의 H39N15-68T1, H39N15-68T2, H39N15-68T3, H39N15-68T4, H39N15-68T5, H39N15-68T4-70S1, H39N15-68T4-70S2, H39N15-68T4-70S3, 및 H39N15-68T4-70S5를 함유하는 파쇄된 박테리아의 상층액
용출 프로토콜:
(1) SP 세파로스 4 패스트 플로우에 의해 파쇄된 박테리아 상층액의 양이온 교환 정제: 상기 샘플을 상기 컬럼에 로딩한 다음, 불필요한 단백질을 400 mM NaCl을 함유하는 버퍼 (80% 버퍼 A + 20% 버퍼 B)로 용출시킨 다음 관심 단백질을 800 mM NaCl을 함유하는 버퍼 (60% 버퍼 A + 40% 버퍼 B)로 용출시키고, 상기 800 mM NaCl을 함유하는 버퍼로 용출된 분획을 수집하였다;
(2) CHTII(하이드록시아파타이트 크로마토그래피)에 의한 상기 단계 (1)에서 수득한 용출 분획의 크로마토그래피 정제: 상기 단계 (1)에서 수득한 용출 분획을 NaCl 농도가 0.5M로 감소되도록 희석시키고; 상기 샘플을 상기 컬럼에 로딩한 다음, 불필요한 단백질을 500 mM NaCl을 함유하는 버퍼 (75% 버퍼 A + 25% 버퍼 B)로 용출시킨 다음, 관심 단백질을 1000 mM NaCl을 함유하는 버퍼 (50% 버퍼 A + 50% 버퍼 B)로 용출시키고, 상기 1000 mM NaCl을 함유하는 버퍼로 용출된 분획을 수집하였다;
(3) HIC(소수성 상호작용 크로마토그래피)에 의한 상기 단계 (2)에서 수득된 용출 분획의 크로마토그래피 정제: 상기 샘플을 상기 컬럼에 로딩한 다음, 불필요한 단백질을 1000 mM NaCl을 함유하는 버퍼로 용출시키고, 관심 단백질을 200 mM NaCl을 함유하는 버퍼 (90% 버퍼 A + 10% 버퍼 B)로 용출시키고, 상기 200 mM NaCl을 함유하는 버퍼로 용출된 분획을 수집하였다.
상기 단계 (3)에서 수득한 150 ㎕ 용출 분획을 30 ㎕ 의 6x 로딩 버퍼 (1L, 300ml의 1M TB 6.8, 600ml의 100% 글리세롤, 120g의 SDS, 6g의 브로모페놀 블루, 및 50ml의 β-머캅토에탄올을 포함)에 첨가하였다. 상기 생성된 용액을 균일하게 혼합하고 80℃ 워터 배스에서 10분 동안 배양하였다. 그런 다음 10 ㎕ 의 상기 생성된 샘플에 120 V에서 120분 동안 10% SDS-PAGE를 가하고; 쿠마씨 브릴리언트 블루에 의해 상기 전기영동 밴드를 염색하였다. 상기 전기영동 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 결과는 상기 정제 단계 후, H39N15-68T1, H39N15-68T2, H39N15-68T3, H39N15-68T4, H39N15-68T5, H39N15-68T4-70S1, H39N15-68T4-70S2, H39N15-68T4-70S3, 및 H39N15-68T4-70S5 단백질이 90%의 순도를 가짐을 보였다.
유사한 방법에 의해, E. coli 및 플라스미드 pTO-T7-HPV39N15를 사용하여 HPV39N15 단백질을 제조 및 정제하고; E. coli 및 플라스미드 pTO-T7-HPV68L1N0를 사용하여 HPV68N0 단백질을 제조 및 정제하고; E. coli 및 플라스미드 pTO-T7-HPV70N10를 사용하여 HPV70N5 단백질을 제조 및 정제하였다.
돌연변이된 단백질의 웨스턴 블롯 분석
상기 방법으로 정제된 H39N15-68T1, H39N15-68T2, H39N15-68T3, H39N15-68T4, H39N15-68T5, H39N15-68T4-70S1, H39N15-68T4-70S2, H39N15-68T4-70S3, 및 H39N15-68T4-70S5 단백질을 전기영동하였다. 전기영동 후, HPV L1 단백질에 대한 광범위 항체 4B3을 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 상기 결과는 H39N15-68T1, H39N15-68T2, H39N15-68T3, H39N15-68T4, H39N15-68T5, H39N15-68T4-70S1, H39N15-68T4-70S2, H39N15-68T4-70S3 및 H39N15-68T4-70S5가 광범위 항체 4B3에 의해 특이적으로 인식될 수 있음을 보였다.
실시예 2: HPV 바이러스-유사 입자의 조립 및 입자의 형태학적 검출
HPV 바이러스-유사 입자의 조립
제공된 부피(약 2 ㎖)의 단백질 H39N15-68T1, H39N15-68T2, H39N15-68T3, H39N15-68T4, H39N15-68T5, H39N15-68T4-70S1, H39N15-68T4-70S2, H39N15-68T4-70S3 또는 H39N15-68T4-70S5를 (1) 2L 저장 버퍼 (20 mM 소듐 포스페이트 버퍼 pH 6.5, 0.5 M NaCl); (2) 2L 재생 버퍼 (50 mM 소듐 포스페이트 버퍼 pH 6.0, 2 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 0.5 M NaCl); 및 (3) 20 mM 소듐 포스페이트 버퍼 pH 7.0, 0.5 M NaCl에 연속적으로 투석시켰다. 상기 투석을 상기 각각의 3개의 버퍼에서 12시간 동안 수행하였다.
유사한 방법에 의해, HPV39N15, HPV68N0 및 HPV70N10 단백질을 각각 HPV39N15 VLP, HPV68N0 VLP 및 HPV70N10 VLP로 조립하였다.
분자체 크로마토그래피 분석
상기 투석된 샘플에 대해 1120 컴팩트 LC 고성능 액체 크로마토그래피 시스템 (Agilent Technologies)의 분자체 크로마토그래피 분석을 수행하였으며, 여기에서 상기 사용된 분석 컬럼은 TSK Gel PW5000xl 7.8x300 ㎜ 였다. 상기 분석 결과를 도 3 및 4에 나타내었다. 상기 결과는 단백질 H39N15-68T1, H39N15-68T2, H39N15-68T3, H39N15-68T4, H39N15-68T5, H39N15-68T4-70S1, H39N15-68T4-70S2, H39N15-68T4-70S3 또는 H39N15-68T4-70S5를 포함하는 샘플의 첫번째 단백질 피크가 약 13-14분째에 나타나고, 이는 HPV39N15 VLP, HPV68N0 VLP 및 HPV70N10 VLP의 경우에 필적함을 보였다. 이는 이들 단백질 모두가 VLP로 조립될 수 있음을 나타낸다.
침강 속도 분석
침강 속도 분석용 기구는 Beckman XL-A 분석학적 초원심분리기로, 광학 검사 시스템 및 An-50Ti 및 An-60Ti 로터가 구비되어있다. HPV39N15 VLP, HPV68N0 VLP, HPV70N10 VLP, H39N15-68T1 VLP, H39N15-68T2 VLP, H39N15-68T3 VLP, H39N15-68T4 VLP, H39N15-68T5 VLP, H39N15-68T4-70S1 VLP, H39N15-68T4-70S2 VLP, H39N15-68T4-70S3 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP의 침강 계수를 침강 속도 방법에 의해 분석하였다. 상기 결과를 도 5A-5L에 나타내었다. 상기 결과는 H39N15-68T1 VLP, H39N15-68T2 VLP, H39N15-68T3 VLP, H39N15-68T4 VLP, H39N15-68T5 VLP, H39N15-68T4-70S1 VLP, H39N15-68T4-70S2 VLP, H39N15-68T4-70S3 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP의 침강 계수가 각각 136S, 151S, 138S, 145S, 135S, 124S, 108S, 99S 및 127S임을 보였다. 이는 상기 제조된 H39N15-68T1, H39N15-68T2, H39N15-68T3, H39N15-68T4, H39N15-68T5, H39N15-68T4-70S1, H39N15-68T4-70S2, H39N15-68T4-70S3 및 H39N15-68T4-70S5가 크기 및 형태 면에서 야생형 VLP (HPV39N15 VLP, 115S; HPV68N0 VLP, 153S; HPV70N10 VLP, 144S)와 유사한 바이러스-유사 입자로 조립될 수 있음을 나타낸다.
바이러스-유사 입자의 형태학적 시험
VLP를 포함하는 100 ㎕ 샘플을 투과 전자 현미경(TEM)으로 관찰하였다. 사용된 장비는 JEOL Ltd에 의해 공급된 100kV 투과 전자 현미경이다 (100,000x 배율). 간단히 말해서, 13.5 ㎕ 샘플을 2% 포스포텅스텐산 (pH 7.0)으로 음으로 염색하고, 탄소-코팅된 구리 격자에 고정시킨 다음, TEM으로 관찰하였다. 상기 결과를 도 6A-6L에 나타내었다. 상기 결과는 H39N15-68T1, H39N15-68T2, H39N15-68T3, H39N15-68T4, H39N15-68T5, H39N15-68T4-70S1, H39N15-68T4-70S2, H39N15-68T4-70S3 및 H39N15-68T4-70S5가 바이러스-유사 입자로 조립될 수 있고, 이들 돌연변이된 단백질들에 의해 조립된 바이러스-유사 입자들이 균일한 크기를 가지며, 약 25- 30 nm의 반경을 가짐을 보였다. 야생형 HPV39N15, HPV68N0 및 HPV70N10에 의해 조립된 바이러스-유사 입자들 또한 약 25-30 nm의 반경을 가졌으며, 균일한 크기를 가졌다. 이는 이들 돌연변이된 단백질들이 야생형 HPV39, HPV68 및 HPV70 L1 단백질과 유사하며, 균일한 크기를 갖는 VLP로 조립될 수 있음을 암시한다.
실시예 3: 바이러스-유사 입자로 면역화된 마우스 혈청의 중화 항체 역가 평가 1
이 실험에서, 사용된 바이러스-유사 입자는 H39N15-68T1 VLP, H39N15-68T2 VLP, H39N15-68T3 VLP, H39N15-68T4 VLP 및 H39N15-68T5 VLP이다.
이 실험에서, 백신 접종 스케쥴은 표 4에 나타내었다. 모든 마우스 (6주령의 BalB/c 암컷 마우스)를 3개 그룹으로 나누었다: 알루미늄 어쥬번트 그룹 1 (면역화 용량 5 μg, 알루미늄 어쥬번트 사용), 알루미늄 어쥬번트 그룹 2 (면역화 용량 1 μg, 알루미늄 어쥬번트 사용), 및 알루미늄 어쥬번트 그룹 3 (면역화 용량 0.2 μg, 알루미늄 어쥬번트 사용). 각 그룹은 8개의 하위 그룹으로 더 나누어졌다. 대조군 하위그룹 1 및 2는 각각 HPV39N15 VLP 단독 및 HPV68N0 VLP 단독으로 면역화되었고, 대조군 하위그룹 3은 혼합된 HPV39/HPV68 VLP (즉 HPV39N15 VLP 및 HPV68N0 VLP 의 혼합물, 각 VLP에 대해 주어진 면역화 용량으로 혼합됨)로 면역화되었다. 실험군 하위그룹 1, 2, 3, 4 및 5는 각각 H39N15-68T1 VLP, H39N15-68T2 VLP, H39N15-68T3 VLP, H39N15-68T4 VLP 및 H39N15-68T5 VLP 로 면역화되었다.
알루미늄 어쥬번트 그룹 1-3에서, 5마리의 마우스/하위그룹을 각각 5 μg, 1 μg, 및 0.2 μg의 면역화 용량 및 1 mL의 주사 부피로 복강내 주사하였다. 모든 마우스들은 0주차에 첫번째 백신 접종을 받은 다음, 각각 2주차, 4주차에 부스터 백신 접종을 받았다. 6주차에, 안와 출혈을 통해 혈액 샘플을 수집하고, 혈청 내 HPV39 및 HPV68에 대한 항체 역가를 분석하였다. 상기 분석 결과를 도 7A-7C에 나타내었다. 상기 결과는 H39N15-68T4 VLP가 마우스에서 HPV39에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있음을 나타내며, 이의 보호 효과는 동일한 용량의 HPV39N15 VLP 단독의 경우보다 살짝 약했으나, 동일한 용량에서 HPV68N0 VLP 단독의 경우보다 현저히 우수하였고; 마우스에서 HPV68에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있고, 이의 보호 효과는 동일한 용량의 HPV68N0 VLP 단독보다 살짝 약했으나, 동일한 용량에서 HPV39N15 VLP 단독의 경우보다 현저히 우수하였다. 이는 H39N15-68T4 VLP가 HPV39 및 HPV68에 대해 우수한 교차-면역원성 및 교차-보호를 가짐을 나타낸다.
그룹 백신접종 항원 어쥬번트 면역화 용량 수 백신접종 절차(주)
알루미늄 어쥬번트 그룹 1 HPV39N15 VLP 알루미늄 어쥬번트 5μg 5 0, 2, 4
HPV68N0 VLP 알루미늄 어쥬번트 5μg 5 0, 2, 4
혼합된 HPV39/HPV68 VLP 알루미늄 어쥬번트 각 VLP에 대해 5μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T1 VLP 알루미늄 어쥬번트 5μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T2 VLP 알루미늄 어쥬번트 5μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T3 VLP 알루미늄 어쥬번트 5μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T4 VLP 알루미늄 어쥬번트 5μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T5 VLP 알루미늄 어쥬번트 5μg 5 0, 2, 4
알루미늄 어쥬번트 그룹 2 HPV39N15 VLP 알루미늄 어쥬번트 1μg 5 0, 2, 4
HPV68N0 VLP 알루미늄 어쥬번트 1μg 5 0, 2, 4
혼합된 HPV39/HPV68 VLP 알루미늄 어쥬번트 각 VLP에 대해 1μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T1 VLP 알루미늄 어쥬번트 1μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T2 VLP 알루미늄 어쥬번트 1μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T3 VLP 알루미늄 어쥬번트 1μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T4 VLP 알루미늄 어쥬번트 1μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T5 VLP 알루미늄 어쥬번트 1μg 5 0, 2, 4
알루미늄 어쥬번트 그룹 3 HPV39N15 VLP 알루미늄 어쥬번트 0.2μg 5 0, 2, 4
HPV68N0 VLP 알루미늄 어쥬번트 0.2μg 5 0, 2, 4
혼합된 HPV39/HPV68 VLP 알루미늄 어쥬번트 각 VLP에 대해 0.2μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T1 VLP 알루미늄 어쥬번트 0.2μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T2 VLP 알루미늄 어쥬번트 0.2μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T3 VLP 알루미늄 어쥬번트 0.2μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T4 VLP 알루미늄 어쥬번트 0.2μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T5 VLP 알루미늄 어쥬번트 0.2μg 5 0, 2, 4
실시예 4: 혈청전환 유도에 대한 바이러스-유사 입자의 ED 50 평가 1
이 실험에서, 사용된 바이러스-유사 입자는 H39N15-68T4 VLP이다.
6주령의 BalB/c 암컷 마우스 (8마리 마우스)를 단일 복강내 주사로 알루미늄 어쥬번트로 백신 접종했으며, 여기에서 H39N15-68T4 VLP는 (면역화 용량 0.900μg, 0.300μg, 0.100μg, 0.033μg 또는 0.011μg) 실험군에서 사용하였고, HPV68N0 VLP 단독 (면역화 용량 0.900μg, 0.300μg, 0.100μg, 0.033μg 또는 0.011μg), HPV39N15 VLP 단독 (면역화 용량 0.900μg, 0.300μg, 0.100μg, 0.033μg 또는 0.011μg) 또는 혼합된 HPV39/HPV68 VLP (즉 HPV39N15 VLP 및 HPV68N0 VLP의 혼합물, 각 VLP에 대해 면역화 용량 0.900μg, 0.300μg, 0.100μg, 0.033μg 또는 0.011μg); 면역화 부피는 1mL였다. 또한, 백신 희석에 사용된 희석제를 블랭크 대조군으로 사용하였다. 각 그룹에서 8마리의 마우스가 백신 접종 되었고, 백신 접종 후 5주차에 안구에서 정맥혈을 수집하였다. 혈청에서 HPV에 대한 항체를 검출하고, Reed-Muench 방법 (Reed LJ MH. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg. 1938; 27:493-7)으로, 혈청전환 유도에 대한 ED50 (즉 마우스에서 항체 생성을 유도)을 각 샘플에서 계산하였다. 상기 결과를 표 5-8에 나타내었다.
타입 용량 (μg) 마우스의 총 수 양의 전환을 갖는
마우스의 수		 양의 전환율 ED50(μg)
HPV39 0.900 8 8 100.00% 0.019
0.300 8 8 100.00%
0.100 8 6 88.89%
0.033 8 8 83.33%
0.011 8 2 20.00%
HPV68 0.900 8 0 0.00% >0.9
0.300 8 0 0.00%
0.100 8 0 0.00%
0.033 8 0 0.00%
0.011 8 8 0.00%
타입 용량 (μg) 마우스의 총 수 양의 전환을 갖는
마우스의 수		 양의 전환율 ED50(μg)
HPV39 0.900 8 0 0.00% >0.9
0.300 8 0 0.00%
0.100 8 0 0.00%
0.033 8 0 0.00%
0.011 8 0 0.00%
HPV68 0.900 8 8 100.00% 0.021
0.300 8 8 100.00%
0.100 8 7 93.75%
0.033 8 7 80.00%
0.011 8 1 10.00%
타입 용량 (μg) 마우스의 총 수 양의 전환을 갖는
마우스의 수		 양의 전환율 ED50(μg)
HPV39 0.900 8 6 90.48% 0.091
0.300 8 6 76.47%
0.100 8 6 53.85%
0.033 8 1 7.14%
0.11 8 0 0.00%
HPV68 0.900 8 4 75.00% 0.300
0.300 8 4 50.00%
0.100 8 2 22.22%
0.033 8 2 9.09%
0.011 8 0 0.00%
타입 용량 (μg) 마우스의 총 수 양의 전환을 갖는
마우스의 수		 양의 전환율 ED50(μg)
HPV39 0.900 8 7 97.06% 0.017
0.300 8 8 96.30%
0.100 8 8 94.74%
0.033 8 8 90.91%
0.011 8 2 22.22%
HPV68 0.900 8 7 96.88% 0.021
0.300 8 8 96.00%
0.100 8 8 94.12%
0.033 8 7 80.00%
0.011 8 1 10.00%
상기 결과는 마우스 백신 접종 5주 후, 마우스에서 HPV39에 대한 항체 생성을 유도하기 위한 H39N15-68T4 VLP의 ED50은 HPV39N15 VLP 단독의 경우에 필적하고, HPV68N0 VLP 단독의 경우보다 현저히 우수하며; 마우스에서 HPV68에 대한 항체 생성을 유도하기 위한 이의 ED50은 HPV68N0 VLP 단독의 경우에 비해 살짝 약하지만, HPV39N15 VLP 단독의 경우보다는 현저히 우수함을 보였다. 이는 H39N15-68T4 VLP가 HPV68 및 HPV39에 대해 우수한 교차-면역원성 및 교차-보호를 가짐을 나타낸다.
실시예 5: 바이러스-유사 입자로 면역화된 마우스 혈청의 중화 항체 역가 평가 2
이 실험에서, 사용된 바이러스-유사 입자는 H39N15-68T4-70S1 VLP, H39N15-68T4-70S2 VLP, H39N15-68T4-70S3 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP이다.
이 실험에서, 백신 접종 스케쥴은 표 9에 나타내었다. 모든 마우스 (6주령의 BalB/c 암컷 마우스)를 3개 그룹으로 나누었다: 알루미늄 어쥬번트 그룹 1 (면역화 용량 5 μg, 알루미늄 어쥬번트 사용), 알루미늄 어쥬번트 그룹 2 (면역화 용량 1 μg, 알루미늄 어쥬번트 사용), 및 알루미늄 어쥬번트 그룹 3 (면역화 용량 0.2 μg, 알루미늄 어쥬번트 사용). 각 그룹은 8개의 하위 그룹으로 더 나누어졌다. 대조군 하위그룹 1, 2 및 3은 각각 HPV39N15 VLP 단독, HPV68N0 VLP 단독 및 HPV70N10 VLP 단독으로 면역화되었고, 대조군 하위그룹 4는 혼합된 HPV39/HPV68/HPV70 VLP (즉 HPV39N15 VLP, HPV68N0 VLP 및 HPV70N10 VLP의 혼합물, 각 VLP에 대해 주어진 면역화 용량으로 혼합됨)로 면역화되었다. 실험군 하위그룹 1, 2, 3 및 4는 각각 H39N15-68T4-70S1 VLP, H39N15-68T4-70S2 VLP, H39N15-68T4-70S3 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP 로 면역화되었다.
알루미늄 어쥬번트 그룹 1-3에서, 5마리의 마우스/하위그룹을 각각 5 μg, 1 μg, 및 0.2 μg의 면역화 용량 및 1 mL의 주사 부피로 복강내 주사하였다. 모든 마우스들은 0주차에 첫번째 백신 접종을 받은 다음, 각각 2주차, 4주차에 부스터 백신 접종을 받았다. 6주차에, 안와 출혈을 통해 혈액 샘플을 수집하고, 혈청 내 HPV39, HPV68 및 HPV70에 대한 항체 역가를 분석하였다. 상기 분석 결과를 도 8A-8C에 나타내었다. 상기 결과는 H39N15-68T4-70S2 VLP, H39N15-68T4-70S3 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP 가 마우스에서 HPV39에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있음을 나타내며, 이들의 보호 효과는 동일한 용량에서 HPV39N15 VLP 단독 및 혼합된 HPV39/HPV68/HPV70 VLP의 경우보다 살짝 약했으나, 동일한 용량에서 HPV68N0 VLP 단독 및 HPV70N10 VLP 단독의 경우보다 현저히 우수하였고; 마우스에서 HPV68에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었으며, 이들의 보호 효과는 동일한 용량에서 HPV68N0 VLP 단독 및 혼합된 HPV39/HPV68/HPV70 VLP의 경우에 필적하였고, 동일한 용량에서 HPV39N15 VLP 단독 및 HPV70N10 VLP 보다 현저히 우수하였고; 마우스에서 HPV70에 대한 고-역가 중화 항체의 생성을 유도할 수 있었으며, 이들의 보호 효과는 동일한 용량에서 HPV70N10 VLP 단독 및 혼합된 HPV39/HPV68/HPV70 VLP의 경우에 필적하였고, 동일한 용량에서 HPV39N15 VLP 단독 및 HPV68N0 VLP 단독보다 현저히 우수함을 보였다. 이는 H39N15-68T4-70S2 VLP, H39N15-68T4-70S3 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP가 HPV39, HPV68 및 HPV70에 대해 우수한 교차-면역원성 및 교차-보호를 가짐을 나타낸다.
그룹 백신접종 항원 어쥬번트 면역화 용량 수 백신접종 절차(주)
알루미늄 어쥬번트 그룹 1 HPV39N15 VLP 알루미늄 어쥬번트 5μg 5 0, 2, 4
HPV68N0 VLP 알루미늄 어쥬번트 5μg 5 0, 2, 4
HPV70N10 VLP 알루미늄 어쥬번트 5μg 5 0, 2, 4
혼합된 HPV39/HPV68/HPV70 VLP 알루미늄 어쥬번트 각 VLP에 대해 5μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T4-70S1 VLP 알루미늄 어쥬번트 5μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T4-70S2 VLP 알루미늄 어쥬번트 5μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T4-70S3 VLP 알루미늄 어쥬번트 5μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T4-70S5 VLP 알루미늄 어쥬번트 5μg 5 0, 2, 4
알루미늄 어쥬번트 그룹 2 HPV39N15 VLP 알루미늄 어쥬번트 1μg 5 0, 2, 4
HPV68N0 VLP 알루미늄 어쥬번트 1μg 5 0, 2, 4
HPV70N10 VLP 알루미늄 어쥬번트 1μg 5 0, 2, 4
혼합된 HPV39/HPV68/HPV70 VLP 알루미늄 어쥬번트 각 VLP에 대해 1μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T4-70S1 VLP 알루미늄 어쥬번트 1μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T4-70S2 VLP 알루미늄 어쥬번트 1μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T4-70S3 VLP 알루미늄 어쥬번트 1μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T4-70S5 VLP 알루미늄 어쥬번트 1μg 5 0, 2, 4
알루미늄 어쥬번트 그룹 3 HPV39N15 VLP 알루미늄 어쥬번트 0.2μg 5 0, 2, 4
HPV68N0 VLP 알루미늄 어쥬번트 0.2μg 5 0, 2, 4
HPV70N10 VLP 알루미늄 어쥬번트 0.2μg 5 0, 2, 4
혼합된 HPV39/HPV68/HPV70 VLP 알루미늄 어쥬번트 각 VLP에 대해 0.2μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T4-70S1 VLP 알루미늄 어쥬번트 0.2μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T4-70S2 VLP 알루미늄 어쥬번트 0.2μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T4-70S3 VLP 알루미늄 어쥬번트 0.2μg 5 0, 2, 4
H39N15-68T4-70S5 VLP 알루미늄 어쥬번트 0.2μg 5 0, 2, 4
실시예 6: 혈청전환 유도에 대한 바이러스-유사 입자의 ED 50 평가 2
이 실험에서, 사용된 바이러스-유사 입자는 H39N15-68T4-70S2 VLP, H39N15-68T4-70S3 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP이다.
6주령의 BalB/c 암컷 마우스 (8마리 마우스)를 단일 복강내 주사로 알루미늄 어쥬번트로 백신 접종했으며, 여기에서 H39N15-68T4-70S2 VLP, H39N15-68T4-70S3 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP (면역화 용량 0.900μg, 0.300μg, 0.100μg, 0.033μg 또는 0.011μg) 는 실험군에서 사용하였고, HPV39N15 VLP 단독, HPV68N0 VLP 단독, HPV70N10 VLP 단독 (면역화 용량 0.900μg, 0.300μg, 0.100μg, 0.033μg 또는 0.011μg) 또는 혼합된 HPV39/HPV68/HPV70 VLP (즉 HPV39N15 VLP, HPV68N0 VLP 및 HPV70N10 VLP의 혼합물, 각 VLP에 대해 면역화 용량 0.900μg, 0.300μg, 0.100μg, 0.033μg 또는 0.011μg); 면역화 부피는 1mL였다. 또한, 백신 희석에 사용된 희석제를 블랭크 대조군으로 사용하였다. 각 그룹에서 8마리의 마우스가 백신 접종 되었고, 백신 접종 후 5주차에 안구에서 정맥혈을 수집하였다. 혈청에서 HPV에 대한 항체를 검출하고, Reed-Muench 방법 (Reed LJ MH. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg. 1938; 27:493-7)으로, 혈청전환 유도에 대한 ED50 (즉 마우스에서 항체 생성을 유도)을 각 샘플에서 계산하였다. 상기 결과를 표 10-16에 나타내었다.
타입 백신접종용량 (μg) 마우스의 총 수 양의 전환을 갖는
마우스의 수		 양의 전환율 ED50(μg)
HPV39 0.900 8 8 100.00% 0.019
0.300 8 8 100.00%
0.100 8 8 100.00%
0.033 8 7 88.89%
0.011 8 1 11.11%
HPV68 0.900 8 0 11.11% >0.9
0.300 8 0 5.88%
0.100 8 0 4.00%
0.033 8 1 3.13%
0.011 8 0 0.00%
HPV70 0.900 8 0 11.11% >0.9
0.300 8 1 6.25%
0.100 8 0 0.00%
0.033 8 0 0.00%
0.011 8 0 0.00%
타입 백신접종용량 (μg) 마우스의 총 수 양의 전환을 갖는
마우스의 수		 양의 전환율 ED50(μg)
HPV39 0.900 8 0 20.00% >0.9
0.300 8 0 11.11%
0.100 8 1 8.00%
0.033 8 1 3.23%
0.011 8 0 0.00%
HPV68 0.900 8 8 100.00% 0.021
0.300 8 8 100.00%
0.100 8 8 100.00%
0.033 8 6 77.78%
0.011 8 1 10.00%
HPV70 0.900 8 2 50.00% >0.9
0.300 8 2 25.00%
0.100 8 0 9.09%
0.033 8 2 7.14%
0.011 8 0 0.00%
타입 백신접종용량 (μg) 마우스의 총 수 양의 전환을 갖는 마우스의 수 양의 전환율 ED50(μg)
HPV39 0.900 8 2 40.00% >0.9
0.300 8 0 12.50%
0.100 8 1 8.70%
0.033 8 1 3.45%
0.011 8 0 0.00%
HPV68 0.900 8 0 0.00% >0.9
0.300 8 0 0.00%
0.100 8 0 0.00%
0.033 8 0 0.00%
0.011 8 0 0.00%
HPV70 0.900 8 8 100.00% 0.017
0.300 8 8 100.00%
0.100 8 8 100.00%
0.033 8 7 90.00%
0.011 8 2 22.22%
타입 백신접종용량 (μg) 마우스의 총 수 양의 전환을 갖는
마우스의 수		 양의 전환율 ED50(μg)
HPV39 각 VLP에 대해 0.900μg 8 8 100.00% 0.021
각 VLP에 대해 0.300μg 8 8 100.00%
각 VLP에 대해 0.100μg 8 7 93.75%
각 VLP에 대해 0.033μg 8 7 80.00%
각 VLP에 대해 0.011μg 8 1 10.00%
HPV68 각 VLP에 대해 0.900μg 8 8 100.00% 0.019
각 VLP에 대해 0.300μg 8 8 100.00%
각 VLP에 대해 0.100μg 8 7 94.12%
각 VLP에 대해 0.033μg 8 7 81.82%
각 VLP에 대해 0.011μg 2 20.00%
HPV70 각 VLP에 대해 0.900μg 8 8 100.00% 0.021
각 VLP에 대해 0.300μg 8 8 100.00%
각 VLP에 대해 0.100μg 8 7 93.75%
각 VLP에 대해 0.033μg 8 7 80.00%
각 VLP에 대해 0.011μg 8 1 10.00%
타입 백신접종용량 (μg) 마우스의 총 수 양의 전환을 갖는
마우스의 수		 양의 전환율 ED50(μg)
HPV39 0.900 8 8 100.00% 0.017
0.300 8 7 96.15%
0.100 8 8 94.74%
0.033 8 8 90.91%
0.011 8 2 22.22%
HPV68 0.900 8 6 100.00% 0.028
0.300 8 8 91.67%
0.100 8 7 82.35%
0.033 8 6 58.33%
0.011 8 1 7.69%
HPV70 0.900 8 7 96.30% 0.033
0.300 8 7 90.48%
0.100 8 5 70.59%
0.033 8 6 50.00%
0.011 8 1 6.67%
타입 백신접종용량 (μg) 마우스의 총 수 양의 전환을 갖는 마우스의 수 양의 전환율 ED50(μg)
HPV39 0.900 8 3 50.00% 0.9
0.300 8 1 14.29%
0.100 8 0 4.76%
0.033 8 1 3.57%
0.011 8 0 0.00%
HPV68 0.900 8 7 96.88% 0.020
0.300 8 7 92.31%
0.100 8 7 85.00%
0.033 8 8 76.92%
0.011 8 2 18.18%
HPV70 0.900 8 4 63.64% 0.611
0.300 8 3 25.00%
0.100 8 0 0.00%
0.033 8 0 0.00%
0.011 8 0 0.00%
타입 백신접종용량 (μg) 마우스의 총 수 양의 전환을 갖는 마우스의 수 양의 전환율 ED50(μg)
HPV39 0.900 8 7 96.97% 0.019
0.300 8 7 92.59%
0.100 8 8 90.00%
0.033 8 8 83.33%
0.011 8 2 20.00%
HPV68 0.900 8 8 100.00% 0.148
0.300 8 8 100.00%
0.100 8 1 22.22%
0.033 8 1 6.67%
0.011 8 0 0.00%
HPV70 0.900 8 7 96.30% 0.042
0.300 8 6 86.36%
0.100 8 8 81.25%
0.033 8 4 41.67%
0.011 8 1 6.67%
상기 결과는 마우스 백신 접종 5주 후, 마우스에서 HPV39에 대한 항체 생성을 유도하기 위한 H39N15-68T4-70S2 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP의 ED50은 HPV39N15 VLP 단독 및 혼합된 HPV39/HPV68/HPV70 VLP의 경우에 필적하고, HPV68N0 VLP 단독 및 HPV70N10 VLP 단독의 경우보다 현저히 우수하며; 마우스에서 HPV68에 대한 항체 생성을 유도하기 위한 이의 ED50은 HPV68N0 VLP 단독 및 혼합된 HPV39/HPV68/HPV70 VLP의 경우에 필적하고, HPV39N15 VLP 단독 및 HPV70N10 VLP 단독의 경우보다 현저히 우수하며; 마우스에서 HPV70에 대한 항체 생성을 유도하기 위한 이의 ED50은 HPV70N10 VLP 단독 및 혼합된 HPV39/HPV68/HPV70 VLP 의 경우에 필적하고, HPV39N15 VLP 단독 및 HPV68N0 VLP 단독의 경우보다 현저히 우수함을 보였다. 이는 H39N15-68T4-70S2 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP가 HPV68, HPV39 및 HPV70에 대해 우수한 교차-면역원성 및 교차-보호를 가짐을 나타낸다.
실시예 7: 바이러스-유사 입자의 열안정성 평가
GE Company (즉 the original MicroCal Co.)로부터 구입한 시차주사열량계 VP 캐필러리 DSC를 사용하여 HPV39N15 단백질, HPV68N0 단백질, HPV70N10 단백질, H39N15-68T4 단백질, H39N15-68T4-70S2 단백질 및 H39N15-68T4-70S5 단백질에 의해 형성된 VLP의 열안정성에 대해 평가하였으며, 여기에서 상기 단백질용 저장 버퍼가 대조군으로 사용되었고, 상기 단백질들은 10℃-90℃의 온도 범위 내에서 1.5℃/분의 가열속도로 스캐닝되었다. 검측 결과를 도 9에 나타내었다. 상기 결과는 상기 단백질들에 의해 형성된 이들 VLP가 모두 매우 높은 열안정성을 가짐을 보였다.
실시예 8: H39N15-68T4-70S2 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP의 3차원 구조의 복원
초저온-전자 현미경법(cryo-EM)을 사용한 3차원 구조 복원 실험을 통해 H39N15-68T4-70S2 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP의 3차원 구조를 복원하였다 (Wolf M, Garcea RL, Grigorieff N. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. (2010), 107(14): 6298-303). 간단히 말해서, H39N15-68T4-70S2 VLP의 초저온-전자 현미경법(cryo-EM) 사진 (도 10의 A), 균일한 크기 및 50 nm 초과의 직경을 갖는 6410개 입자를 선택하여 컴퓨터 오버래핑(computer overlapping) 및 구조적 복원(structural reconstruction)을 수행하였고, H39N15-68T4-70S2 VLP의 3차원 구조를 얻었다. 상기 얻어진 3차원 구조를 도 10의 B에 나타내었다 (14.51Å의 해상도). 또한, H39N15-68T4-70S5 VLP의 초저온-전자 현미경법(cryo-EM) 사진 (도 10의 C), 균일한 크기 및 50 nm 초과의 직경을 갖는 617개 입자를 선택하여 컴퓨터 오버래핑 및 구조적 복원을 수행하였고, H39N15-68T4-70S5 VLP의 3차원 구조를 얻었다. 상기 얻어진 3차원 구조를 도 10의 D에 나타내었다 (17.64Å의 해상도). 상기 결과는 H39N15-68T4-70S2 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP 둘 다 72개 캡소머(capsomers)(형태학적 서브유닛, 펜타머)로 이루어진 T=7 정이십면체 구조 (h=1, k=2)를 가짐을 보였다. 준평형 원리 (quasi-equivalence)와 일치하는 전통적인 정이십면체 바이러스 캡시드와 달리, H39N15-68T4-70S2 VLP 및 H39N15-68T4-70S5 VLP의 구조에서 모든 구성요소 서브유닛은 헥사머가 없는 펜타머였다. 더욱이, 상기 2개 VLP들은 약 60 nm의 외부 직경을 가졌다. 이는 이전에 보고된 천연 HPV 바이러스 입자 및 진핵 발현 시스템 (예를 들어 폭스바이러스 발현 시스템)에서 제조된 HPV VLP의 3차원 구조와 유사했다 (Baker TS, Newcomb WW, Olson NH. et al. Biophys J. (1991), 60(6): 1445-1456. Hagensee ME, Olson NH, Baker TS, et al. J Virol. (1994), 68(7):4503-4505. Buck CB, Cheng N, Thompson CD. et al. J Virol. (2008), 82(11): 5190-7).
본 발명의 구체적인 실시예를 상세히 기재하였지만, 당업자라면 본 명세서에 개시된 교시에 따라 다양한 수정 및 변경이 가능하며, 이러한 수정 및 변경은 본 발명의 범위 내에 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 범위는 첨부된 특허청구의 범위 및 그의 임의의 균등물에 의해 제공된다.
<110> Xiamen University Xiamen Innovax Biotech Co., Ltd. <120> Mutant of L1 protein of Human Papillomavirus Type 39 <130> PM038277KR <150> CN201810563378.0 <151> 2018-06-04 <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 505 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 39 <400> 1 Met Ala Leu Trp Arg Ser Ser Asp Ser Met Val Tyr Leu Pro Pro Pro 1 5 10 15 Ser Val Ala Lys Val Val Asn Thr Asp Asp Tyr Val Thr Arg Thr Gly 20 25 30 Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly His Pro 35 40 45 Tyr Phe Lys Val Gly Met Asn Gly Gly Arg Lys Gln Asp Ile Pro Lys 50 55 60 Val Ser Ala Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Thr Leu Pro Asp Pro 65 70 75 80 Asn Lys Phe Ser Ile Pro Asp Ala Ser Leu Tyr Asn Pro Glu Thr Gln 85 90 95 Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro 100 105 110 Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Tyr Asn Arg Gln Asp Asp 115 120 125 Thr Glu Asn Ser Pro Phe Ser Ser Thr Thr Asn Lys Asp Ser Arg Asp 130 135 140 Asn Val Ser Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Ile Gly Cys 145 150 155 160 Val Pro Ala Ile Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Lys Ala Cys Lys Pro 165 170 175 Asn Asn Val Ser Thr Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Val Asn Thr 180 185 190 Pro Ile Glu Asp Gly Asp Met Ile Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met Asp 195 200 205 Phe Gly Ala Leu Gln Glu Thr Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile Cys 210 215 220 Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp Val 225 230 235 240 Tyr Gly Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe Ala 245 250 255 Arg His Phe Trp Asn Arg Gly Gly Met Val Gly Asp Ala Ile Pro Ala 260 265 270 Gln Leu Tyr Ile Lys Gly Thr Asp Ile Arg Ala Asn Pro Gly Ser Ser 275 280 285 Val Tyr Cys Pro Ser Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ser Gln 290 295 300 Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln Gly His Asn Asn 305 310 315 320 Gly Ile Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Leu Thr Val Val Asp Thr Thr 325 330 335 Arg Ser Thr Asn Phe Thr Leu Ser Thr Ser Ile Glu Ser Ser Ile Pro 340 345 350 Ser Thr Tyr Asp Pro Ser Lys Phe Lys Glu Tyr Thr Arg His Val Glu 355 360 365 Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr Val Thr Leu Thr 370 375 380 Thr Asp Val Met Ser Tyr Ile His Thr Met Asn Ser Ser Ile Leu Asp 385 390 395 400 Asn Trp Asn Phe Ala Val Ala Pro Pro Pro Ser Ala Ser Leu Val Asp 405 410 415 Thr Tyr Arg Tyr Leu Gln Ser Ala Ala Ile Thr Cys Gln Lys Asp Ala 420 425 430 Pro Ala Pro Glu Lys Lys Asp Pro Tyr Asp Gly Leu Lys Phe Trp Asn 435 440 445 Val Asp Leu Arg Glu Lys Phe Ser Leu Glu Leu Asp Gln Phe Pro Leu 450 455 460 Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ala Arg Val Arg Arg Arg Pro Thr Ile 465 470 475 480 Gly Pro Arg Lys Arg Pro Ala Ala Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Thr 485 490 495 Lys His Lys Arg Lys Arg Val Ser Lys 500 505 <210> 2 <211> 505 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 68 <400> 2 Met Ala Leu Trp Arg Ala Ser Asp Asn Met Val Tyr Leu Pro Pro Pro 1 5 10 15 Ser Val Ala Lys Val Val Asn Thr Asp Asp Tyr Val Thr Arg Thr Gly 20 25 30 Met Tyr Tyr Tyr Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly His Pro 35 40 45 Tyr Phe Lys Val Pro Met Ser Gly Gly Arg Lys Gln Gly Ile Pro Lys 50 55 60 Val Ser Ala Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Arg Val Thr Leu Pro Asp Pro 65 70 75 80 Asn Lys Phe Ser Val Pro Glu Ser Thr Leu Tyr Asn Pro Asp Thr Gln 85 90 95 Arg Met Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Ile Gly Arg Gly Gln Pro 100 105 110 Leu Gly Val Gly Leu Ser Gly His Pro Leu Tyr Asn Arg Leu Asp Asp 115 120 125 Thr Glu Asn Ser Pro Phe Ser Ser Asn Lys Asn Pro Lys Asp Ser Arg 130 135 140 Asp Asn Val Ala Val Asp Cys Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Ile Gly 145 150 155 160 Cys Val Pro Ala Ile Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Lys Ser Cys Lys 165 170 175 Pro Thr Asn Val Gln Gln Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Val Asn 180 185 190 Thr Pro Ile Glu Asp Gly Asp Met Ile Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met 195 200 205 Asp Phe Gly Thr Leu Gln Glu Thr Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile 210 215 220 Cys Gln Ser Val Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp 225 230 235 240 Val Tyr Gly Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe 245 250 255 Ala Arg His Phe Trp Asn Arg Gly Gly Met Val Gly Asp Thr Ile Pro 260 265 270 Thr Asp Met Tyr Ile Lys Gly Thr Asp Ile Arg Glu Thr Pro Ser Ser 275 280 285 Tyr Val Tyr Ala Pro Ser Pro Ser Gly Ser Met Val Ser Ser Asp Ser 290 295 300 Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu His Lys Ala Gln Gly His Asn 305 310 315 320 Asn Gly Ile Cys Trp His Asn Gln Leu Phe Leu Thr Val Val Asp Thr 325 330 335 Thr Arg Ser Thr Asn Phe Thr Leu Ser Thr Thr Thr Asp Ser Thr Val 340 345 350 Pro Ala Val Tyr Asp Ser Asn Lys Phe Lys Glu Tyr Val Arg His Val 355 360 365 Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr Ile Thr Leu 370 375 380 Ser Thr Asp Val Met Ser Tyr Ile His Thr Met Asn Pro Ala Ile Leu 385 390 395 400 Asp Asp Trp Asn Phe Gly Val Ala Pro Pro Pro Ser Ala Ser Leu Val 405 410 415 Asp Thr Tyr Arg Tyr Leu Gln Ser Ala Ala Ile Thr Cys Gln Lys Asp 420 425 430 Ala Pro Ala Pro Val Lys Lys Asp Pro Tyr Asp Gly Leu Asn Phe Trp 435 440 445 Asn Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ser Glu Leu Asp Gln Phe Pro 450 455 460 Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln 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aagttctgga acgtcgatct gcgcgagaag 1320 ttctccctgg agctggacca gttccccctc ggccgcaagt tcctcctcca ggcacgcgtg 1380 cgccgccgcc ccaccatcgg cccacgcaag cgccccgccg ccagcaccag cagcagcagc 1440 gccaccaagc acaagcgcaa gcgcgtcagc aagtga 1476 <210> 22 <211> 1479 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The DNA sequence encoding H39N15-68T4-70S2 <400> 22 atgcccagcg tcgccaaggt cgtgaacacc gacgactacg tcacccgcac cgggatctac 60 tactacgccg ggtccagccg cctgctgacc gtgggccacc cctacttcaa ggtcggcatg 120 aacggcgggc gcaagcagga tatccccaag gtcagcgcct accagtaccg cgtgttccgc 180 gtcaccctcc cagaccccaa caagttctcc atccccgacg ccagcctgta caaccccgag 240 acccagcgcc tggtgtgggc ctgcgtgggc gtcgaagtcg gtagaggcca gccattgggc 300 gttggtgtta gtggacatcc tttatataat agattggatg atactgaaaa ttcacatttt 360 tcctctgctg ttaatacaca ggacagtagg gacaatgtgt ctgtggacta taagcagacc 420 cagctctgta tcatcgggtg cgtcccagca atcggcgaac actggggcaa gggcaaggcc 480 tgtaagccaa acaacgtgag caccggcgat tgcccccccc tggagctggt gaatacaccc 540 atcgaagacg gcgacatgat 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<220> <223> The DNA sequence encoding H39N15-68T4-70S5 <400> 24 atgcccagcg tcgccaaggt cgtgaacacc gacgactacg tcacccgcac cgggatctac 60 tactacgccg ggtccagccg cctgctgacc gtgggccacc cctacttcaa ggtcggcatg 120 aacggcgggc gcaagcagga tatccccaag gtcagcgcct accagtaccg cgtgttccgc 180 gtcaccctcc cagaccccaa caagttctcc atccccgacg ccagcctgta caaccccgag 240 acccagcgcc tggtgtgggc ctgcgtgggc gtcgaagtcg ggcgcgggca gcccctcggc 300 gtcggcatct ccggccaccc cctgtacaac cgccaggacg acaccgagaa tagccccttc 360 agcagcacaa caaacaagga ttcccgcgac aacgtcagcg tcgactacaa gcagacccag 420 ctctgtatca tcgggtgcgt cccagcaatc ggcgaacact ggggcaaggg caaggcctgt 480 aagccaaaca acgtgagcac cggcgattgc ccccccctgg agctggtgaa tacacccatc 540 gaagacggcg acatgatcga caccgggtac ggcgccatgg atttcggcgc cctccaggag 600 acaaagtccg aagtccccct ggacatctgc cagagcatct gcaagtaccc cgactacctc 660 cagatgagcg ccgacgtcta cggcgattcc atgttcttct gcctgcgccg cgagcagctc 720 ttcgcccgcc acttctggaa cagaggcggc atggtcggcg acaccatccc caccgacatg 780 tacatcaagg gcaccgacat 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tgttcctgac cgtcgtcgat 960 accacacgct ccacaaattt caccctgagc acaagcatcg aaagcagcat ccccagcacc 1020 tacgacccca gcaagttcaa ggagtacaca cgccacgtcg aagaatacga cctgcagttc 1080 atcttccagc tctgcaccgt gaccctgacc accgacgtca tgagctacat ccacaccatg 1140 aacagcagca tcctcgataa ctggaacttc gccgtggccc ccccccccag cgcatccctc 1200 gtggatacct atcgctatct gcagagcgcc gcaatcacct gccagaagga cgcccccgcc 1260 cccgagaaga aggaccccta cgatggcctg aagttctgga acgtcgatct gcgcgagaag 1320 ttctccctgg agctggacca gttccccctc ggccgcaagt tcctcctcca ggcacgcgtg 1380 cgccgccgcc ccaccatcgg cccacgcaag cgccccgccg ccagcaccag cagcagcagc 1440 gccaccaagc acaagcgcaa gcgcgtcagc aagtga 1476 <210> 31 <211> 497 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 70 <400> 31 Met Val Tyr Leu Pro Pro Pro Ser Val Ala Lys Val Val Asn Thr Asp 1 5 10 15 Asp Tyr Val Thr Arg Thr Gly Ile Tyr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ser Arg 20 25 30 Leu Leu Thr Val Gly His Pro Tyr Phe Lys Val Pro Val Asn Gly Gly 35 40 45 Arg Lys Gln Glu Ile Pro Lys Val Ser Ala Tyr Gln Tyr Arg Val Phe 50 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Ala Lys Ser Ser Ser Ser Ala Ser Lys His Lys Arg Lys Arg Val Ser 485 490 495 Lys <210> 32 <211> 1494 <212> DNA <213> Human papillomavirus type 70 <400> 32 atggtgtatt tgccaccccc ttctgtggcg aaggttgtca atacagatga ttatgtaaca 60 cgtacaggca tatattatta tgctggaagc tctcgcttat taacagtagg gcatccttat 120 tttaaggtac ctgtaaatgg tggccgcaag caggaaatac ctaaggtgtc tgcatatcag 180 tatagggtat ttagggtatc cctacctgat cctaataagt ttggccttcc ggatccttcc 240 ctttataatc ctgacacaca acgcctggta tgggcctgta taggtgtgga aattggtaga 300 ggccagccat tgggcgttgg tgttagtgga catcctttat ataatagatt ggatgatact 360 gaaaattcac atttttcctc tgctgttaat acacaggaca gtagggacaa tgtgtctgtg 420 gactataagc agacacagtt atgtattata ggctgtgttc ctgctatggg agagcactgg 480 gcaaagggca aggcctgtaa gtccactact gtacaacagg gcgattgtcc accattagaa 540 ttagttaata ctgcaattga ggatggcgat atgatagata caggctatgg agccatggac 600 tttcgtacat tgcaggaaac caaaagtgag gtaccactag atatttgcca atccgtgtgt 660 aaatatcctg attatttgca gatgtctgct gatgtatatg gggacagtat gtttttttgt 720 ttgcgcaagg aacagttatt tgccagacac ttttggaata gaggtggcat ggtgggcgac 780 acaatacctt cagagttata tattaaaggc acggatatac gtgatcgtcc tggtactcat 840 gtatattccc cttccccaag tggctctatg gtttcttctg attcccagtt gtttaataag 900 ccctattggt tgcataaggc ccagggacac aataatggca tttgttggca taaccagttg 960 tttattactg tggtggacac tacacgtagt actaatttta cattgtctgc ctgcaccgaa 1020 acagccatac ctgctgtata tagccctaca aagtttaagg aatatactag gcatgtggag 1080 gaatatgatt tacaatttat atttcagttg tgtactatca cattaactgc agacgttatg 1140 gcctacatcc atactatgaa tcctgcaatt ttggacaatt ggaatatagg cgttacccct 1200 ccaccatctg caagcttggt ggacacgtat aggtatttac aatcagcagc tatagcatgt 1260 cagaaggatg ctcctgcacc tgaaaaaaag gatccctatg acgatttaaa attttggaat 1320 gttgatttaa aggaaaagtt tagtacagaa ctagatcagt ttcctttggg gcgcaaattt 1380 ttactacagg taggggctcg cagacgtcct actataggcc ctcgcaaacg ccctgcatca 1440 gctaaatcgt cttcctcagc ctctaaacac aaacggaaac gtgtgtccaa gtaa 1494 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 68 <400> 33 Pro Met Ser Gly Gly Arg Lys Gln Gly 1 5 <210> 34 <211> 35 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 68 <400> 34 Leu Ser Gly His Pro Leu Tyr Asn Arg Leu Asp Asp Thr Glu Asn Ser 1 5 10 15 Pro Phe Ser Ser Asn Lys Asn Pro Lys Asp Ser Arg Asp Asn Val Ala 20 25 30 Val Asp Cys 35 <210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 68 <400> 35 Ala Lys Gly Lys Ser Cys Lys Pro Thr Asn Val Gln Gln 1 5 10 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 68 <400> 36 Thr Asp Ser Thr Val Pro Ala Val Tyr Asp Ser Asn 1 5 10 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 70 <400> 37 Pro Val Asn Gly Gly Arg Lys Gln Glu 1 5 <210> 38 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 ttcaaggtcc ccatgagcgg cgggcgcaag caggatatcc ccaaggtc 48 <210> 39 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 cccgccgctc atggggacct tgaagtaggg gtggcccacg gtcagcag 48 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 gacttcgacg 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Sequence <220> <223> Primer <400> 49 gatgatacag agctgggtct gcttgcagtc cacggccacg ttgtc 45 <210> 50 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 gggtgcgtcc cagcaatcgg cgaacactgg gccaagggca agagc 45 <210> 51 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 51 gatgggtgta ttcaccagct ccagaggggg gcagtcgccc tgctg 45 <210> 52 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 52 cgcgagcagc tcttcgcccg ccacttctgg aacagaggcg gcatg 45 <210> 53 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 53 catgctgccg gatgggcttg gacagtacac gtagctgctg ggtgt 45 <210> 54 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 54 cgctccacaa atttcaccct gagcacaagc accgacagca ccgtgcccgc c 51 <210> 55 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 55 ttcttcgacg tggcgtgtgt actccttgaa cttattgctg tcgtacacgg c 51 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 56 gtaggggtgg cccacggtca g 21 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 57 gcctaccagt accgcgtgtt c 21 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 58 gacttcgacg cccacgcagg c 21 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 59 aagcagaccc agctctgtat c 21 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 60 ttcgccgatt gctgggacgc a 21 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 61 ctggagctgg tgaatacacc c 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 62 gcttgtgctc agggtgaaat t 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 63 ttcaaggagt acacacgcca c 21 <210> 64 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 64 ctgaccgtgg gccaccccta ctttaaggta cctgtaaatg gt 42 <210> 65 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 65 gaacacgcgg tactggtagg cagacacctt aggtatttcc tg 42 <210> 66 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 66 gcctgcgtgg gcgtcgaagt cggtagaggc cagccattgg gc 42 <210> 67 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 67 gatacagagc tgggtctgct tatagtccac agacacattg tc 42 <210> 68 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 68 tgcgtcccag caatcggcga acactgggca aagggcaagg cc 42 <210> 69 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 69 gggtgtattc accagctcca gtggtggaca atcgccctgt tgtac 45 <210> 70 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 70 aatttcaccc tgagcacaag caccgaaaca gccatacctg ct 42 <210> 71 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 71 gtggcgtgtg tactccttga actttgtagg gctatataca gc 42

Claims (12)

  1. 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체로서, 야생형 HPV39 L1 단백질과 비교하여, 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질은 하기 돌연변이를 갖고:
    (1) 1-25개 아미노산, 예를 들어, 1-5, 1-10, 1-15, 1-20, 5-15, 10-15, 10-20, 또는 15-20개 아미노산의 N-말단 절단; 및
    (2) 상기 야생형 HPV39 L1 단백질의 269-288번 위치의 아미노산 잔기의, 제2 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환;
    상기 변이체는 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질과 오직 하나 또는 그 이상 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개) 아미노산의 치환 (바람직하게는 보존적 치환), 부가 또는 결실만이 상이하고, 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질의 기능, 즉 적어도 2개 타입타입의 HPV (예를 들어 HPV39 및 HPV68, 또는 HPV39, HPV68 및 HPV70)에 대한 중화 항체의 생성을 유도하는 능력을 유지하며;
    바람직하게는, 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질은 선택적으로, 추가로 하기 돌연변이를 갖고:
    (3)(a) 상기 야생형 HPV39 L1 단백질의 117-140번 위치의 아미노산 잔기의, 제3 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환; 또는
    (b) 상기 야생형 HPV39 L1 단백질의 169-181번 위치의 아미노산 잔기의, 제3 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환; 또는
    (c) 상기 야생형 HPV39 L1 단백질의 347-358번 위치의 아미노산 잔기의, 제3 타입의 야생형 HPV의 L1 단백질의 상응하는 위치의 아미노산 잔기에 의한 치환;
    바람직하게는, 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질은 야생형 HPV39 L1 단백질과 비교하여, N-말단에서 절단된 3, 5, 8, 10, 12, 15, 18, 20 또는 22개의 아미노산을 갖고;
    바람직하게는, 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질은 야생형 HPV39 L1 단백질과 비교하여, N-말단에서 절단된 15개의 아미노산을 갖고;
    바람직하게는, 상기 제2 타입의 야생형 HPV는 HPV68이고; 바람직하게는, 상기 (2)에 기재된 상응하는 위치의 아미노산 잔기는 야생형 HPV68 L1 단백질의 270-289번 위치의 아미노산 잔기이고;
    바람직하게는, 상기 제3 타입의 야생형 HPV는 HPV70이고; 바람직하게는, 상기 (3)(a)에 기재된 상응하는 위치의 아미노산 잔기는 야생형 HPV70 L1 단백질의 117-141번 위치의 아미노산 잔기이고; 바람직하게는, 상기 (3)(b)에 기재된기재된 상응하는 위치의 아미노산 잔기는 야생형 HPV70 L1 단백질의 170-182번 위치의 아미노산 잔기이고; 바람직하게는, 상기 (3)(c)에 기재된기재된 상응하는 위치의 아미노산 잔기는 야생형 HPV70 L1 단백질의 348-359번 위치의 아미노산 잔기이고;
    바람직하게는, 상기 야생형 HPV39 L1 단백질은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 갖고;
    바람직하게는, 상기 야생형 HPV68 L1 단백질은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 갖고;
    바람직하게는, 상기 야생형 HPV70 L1 단백질은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 갖고;
    바람직하게는, 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질은 서열번호 7, 10, 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는
    돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체.
  2. 청구항 1에 따른 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체를 암호화하는 단리된 핵산으로서;
    바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 단리된 핵산은 서열번호 19, 22, 23 및 24로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 단리된 핵산.
  3. 청구항 2에 따른 단리된 핵산을 포함하는 벡터.
  4. 청구항 2에 따른 단리된 핵산 및/또는 청구항 3에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  5. 청구항 1에 따른 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체를 포함하거나 이들로 이루어지는 HPV 바이러스-유사 입자.
  6. 청구항 1에 따른 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체, 또는 청구항 2에 따른 단리된 핵산, 또는 청구항 3에 따른 벡터, 또는 청구항 4에 따른 숙주 세포, 또는 청구항 5에 따른 HPV 바이러스-유사 입자를 포함하는 조성물.
  7. 청구항 5에 따른 HPV 바이러스-유사 입자, 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물 또는 백신으로,
    바람직하게는, 상기 HPV 바이러스-유사 입자는 HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발되는 질환의 예방에 유효한 양으로 존재하고;
    바람직하게는, 상기 HPV 감염은 하나 이상의 HPV 타입 (예를 들어 HPV39 감염, HPV68 감염 및/또는 HPV70 감염)에 의한 감염이고;
    바람직하게는, 상기 HPV 감염에 의해 유발되는 질환은 자궁경부암 및 뾰족콘딜로마로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물 또는 백신.
  8. 청구항 1에 따른 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체의 제조방법으로서, 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체를 숙주 세포에서 발현시키는 단계, 및 그런 다음 상기 숙주 세포의 배양물로부터 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체를 회수하는 단계를 포함하며;
    바람직하게는, 상기 숙주 세포는 E.coli이고;
    바람직하게는, 상기 방법은 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체를 E.coli에서 발현시키는 단계, 그런 다음 E.coli의 용해물 상층액을 정제함으로써 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체를 수득하는 단계; 바람직하게는, 크로마토그래피 (예를 들어 양이온-교환 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피)에 의해 상기 E.coli의 용해물 상층액으로부터 상기 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 것인 제조방법.
  9. 청구항 5에 따른 HPV 바이러스-유사 입자를 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제와 혼합하는 단계를 포함하는 것인 백신의 제조방법.
  10. HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질환을 예방하는 방법으로, 대상체에 예방학적 유효량의 청구항 5에 따른 HPV 바이러스-유사 입자 또는 청구항 7에 따른 약학적 조성물 또는 백신을 투여하는 것을 포함하고,
    바람직하게는, 상기 HPV 감염은 하나 이상의 HPV 타입 (예를 들어 HPV39 감염, HPV68 감염 및/또는 HPV70 감염)에 의한 감염이고;
    바람직하게는, 상기 HPV 감염에 의해 유발된 질환은 자궁경부암 및 뾰족콘딜로마로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 약학적 조성물 또는 백신의 제조에 있어서 청구항 1에 따른 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체 또는 청구항 5에 따른 HPV 바이러스-유사 입자의 용도로서,
    바람직하게는, 상기 HPV 감염은 하나 이상의 HPV 타입 (예를 들어 HPV39 감염, HPV68 감염 및/또는 HPV70 감염)에 의한 감염이고;
    바람직하게는, 상기 HPV 감염에 의해 유발된 질환은 자궁경부암 및 뾰족콘딜로마로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 용도.
  12. HPV 감염 또는 HPV 감염에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 청구항 1에 따른 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체 또는 청구항 5에 따른 HPV 바이러스-유사 입자로서;
    바람직하게는, 상기 HPV 감염은 하나 이상의 HPV 타입 (예를 들어 HPV39 감염, HPV68 감염 및/또는 HPV70 감염)에 의한 감염이고;
    바람직하게는, 상기 HPV 감염에 의해 유발된 질환은 자궁경부암 및 뾰족콘딜로마로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 돌연변이된 HPV39 L1 단백질 또는 이의 변이체 또는 HPV 바이러스-유사 입자.
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