CN116023446A - 人乳头瘤病毒hpv68 l1蛋白的表达和类病毒样颗粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药生物领域,具体涉及人乳头瘤病毒HPV68 L1蛋白的表达和类病毒样颗粒及其制备方法。对特定毒株尤其是AAZ39498.1的HPV68型L1蛋白的氨基酸序列进行截短,并针对该截短后的蛋白的编码核苷酸序列进行密码子优化得到优化的编码核苷酸序列,最后配合含有特定SD序列无标签表达载体实现无标签表达纯化。本发明通过上述改进使得在原核表达系统例如大肠杆菌表达系统中可以获得更高的蛋白表达量,且得到质量更均一的VLP。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物领域,具体涉及人乳头瘤病毒L1蛋白的表达和类病毒样颗粒及其制备方法。更具体涉及人乳头瘤病毒HPV68 L1蛋白VLP(类病毒样颗粒)的构建及表达。
背景技术
人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一种无包膜的闭环双链DNA病毒,属乳多空病毒科多瘤病毒亚科,主要侵犯人体的上皮黏膜组织,进而诱发各种良性及恶性增生病变。目前已鉴定出来的不同亚型HPV超过200种,HPV感染具有明显的组织特异性,不同型别的HPV对于皮肤和黏膜的嗜向性不同,能诱发不同的乳头状病变,大约有30多种HPV型别与生殖道感染有关,其中有20多种与肿瘤相关。
根据HPV诱发病变的良恶性不同,HPV可大致分为两类:1)高危型(如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68等):高危型HPV与人类多种组织恶性肿瘤密切相关,主要引起重度不典型增生和浸润癌;2)低危型(如HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV72、HPV81等):低危型HPV可引起表皮细胞良性增殖性性病,如尖锐湿疣和扁平湿疣等。HPV主要由病毒外壳和基因组DNA构成。基因组长约7900bp,有8个病毒蛋白编码基因。其中6个ORF编码的蛋白在病毒复制的早期表达,称为早期蛋白;2个ORF编码的蛋白在病毒复制的晚期表达,称为晚期蛋白。晚期蛋白包括主要外壳蛋白L1及次要外壳蛋白L2,并参与病毒外壳的形成。HPV病毒外壳蛋白能够进行自组装,目前在专利文献中,多采用酵母表达系统或者昆虫表达系统或者在哺乳动物细胞表达系统里面单独表达的L1蛋白或将L1 蛋白与L2蛋白共表达时均能自组装成病毒样颗粒(virus-like particle ,VLP),利用外源表达体系生产的VLP免疫后能够在体内诱发产生中和抗体,获得良好的免疫保护效果。但是利用真核表达系统在体内直接表达组装VLP,产生VLP的性质并不是很均一,并且真核表达系统的成本很高,不利于产业化。
目前针对HPV68型仅在专利CN201310184823 .X中报道,此专利用的是汉逊酵母表达系统产生HPV68 L1蛋白,汉逊酵母表达系统是真核表达系统,在体内直接组装成VLP,该专利中并没有提出是否在大肠杆菌原核表达系统里是否可以正常表达合格标准的蛋白,因为大肠杆菌原核表达系统并不具备汉逊酵母表达系统翻译后修饰等功能,所以在原核表达系统里表达HPV68 L1是有一定难度的。
因此,需要研究解决在原核表达系统里面表达HPV68L1蛋白困难的问题,来获得更均一的VLP以及在产业应用上有更低的成本。
发明内容
本发明人针对基于疫苗成品成本的考虑,在原核表达系统里面表达HPV68 L1 蛋白,并解决了在原核表达系统里面表达HPV68L1蛋白困难的问题。具体通过以下改进实现:对特定毒株尤其是AAZ39498.1的HPV68型L1蛋白的氨基酸序列进行截短,并针对该截短后的蛋白的编码核苷酸序列进行密码子优化得到优化的编码核苷酸序列,最后配合含有特定SD序列的无标签表达载体实现高效表达和纯化。
首先,申请人通过很多次试验发现,并不是所有毒株的HPV68型L1蛋白能够在大肠杆菌系统表达并组装成质量合格的VLP,例如毒株ACX32384.1等。因此本发明经过序列比对筛选改造,找到了与ACX32384.1毒株有29个氨基酸差异的序列做表达,比对结果见图,具体的野生型序列见序列1。本发明将序列1的氨基酸序列做N/C端截短处理,为了获得更好的蛋白表达率。N端截短不多于10个氨基酸,优选4个氨基酸。C端截短不多于30个氨基酸,优选28个氨基酸,具体的截短后的氨基酸见序列2。N/C端截短处理,能够使得蛋白性质从偏碱性到偏酸性的转换,在无标签表达载体上表达并且获得更高质量的蛋白及VLP。
因此,本发明首先提供一种截短的HPV68型L1蛋白,其是在野生型HPV68型L1蛋白的基础上,在其N端截短不多于10个氨基酸,优选4个氨基酸,且在其C端截短不多于30个氨基酸,优选28个氨基酸。优选地,野生型HPV68型L1蛋白的氨基酸序列如序列1所示。更优选地,截短的HPV68型L1蛋白的氨基酸序列如序列2所示。
其次,为了利用大肠杆菌系统高效的表达HPV68L1蛋白,发明人根据序列2所示的氨基酸序列,针对大肠杆菌系统进行核苷酸序列的密码子优化。优化原则包括:a)按照大肠杆菌遗传密码使用频率表选用使用频率最高或较高的密码子;b)消除常用的限制性内切酶识别位点。通过上述原则经过优化的核苷酸序列并进行多次筛选,获得了优化后的核苷酸序列如序列3所示。
由此本发明提供一种截短的HPV68型L1蛋白的编码核酸。优选地,其经过密码子优化的核酸。更优选地,其核苷酸序列如序列3所示。也进一步提供含有所述编码核酸的表达盒,表达载体和重组宿主细胞。优选地,其是大肠杆菌。
最后,本发明还研究采用了特定SD序列。大肠杆菌的质粒表达载体主要包括表达融合蛋白的表达载体和非融合蛋白的表达载体两类。蛋白药物类或疫苗类产品如果应用融合蛋白表达,由于引入新的外源蛋白或多肽(标签蛋白或切割酶的残留),可能增加药物安全性风险。SD序列(Shine-Dalgarno sequence)是1974年Shine和Dalgarno首先发现,在mRNA上有核糖体的结合位点,它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3~10 bp处的由3~9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸,刚好与16S rRNA 3’末端的富含嘧啶的序列互补,是核糖体RNA的识别与结合位点。此后人们将此序列命名为Shine-Dalgarno序列,简称SD序列。不同的SD序列及其与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一,某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合,从而影响蛋白质的翻译, 也就是影响重组外源因的表达水平。本发明经过研究和优化,最终确定用于本发明HPV68型L1蛋白重组表达的SD序列为:5`-AGGAGGAATTA-3`(反向序列为3`-TAATTCCTCCT-5`)。
在此基础上,本发明提供含所述SD序列的无标签表达载体以及含有截短的HPV68型L1蛋白的核酸分子。也进一步提供含有所述核酸分子的表达盒,表达载体和重组宿主细胞,更具体地,其是大肠杆菌细胞。
对于表达载体而言,表达融合蛋白的载体pGEX的特点是在载体上接上了一种26kDa的谷胱甘肽S-转移酶基因(GST),与其它的融合载体相比,它具有纯化条件温和、步骤简单、无变性剂加入,以及纯化后蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性的特点;具有较好的应用价值,但载体pGEX编码的GST融合蛋白标签可能会增加药用蛋白产品的安全性隐患。对此,本发明将该载体的GST标签去除,并且替换能够高效表达HPV68型L1蛋白的SD序列,而形成新的适合HPV68 L1蛋白的表达载体。
本发明最后还提供一种表达所述截短的HPV68型L1蛋白的方法,其培养如所述的重组宿主细胞以产生HPV68型L1蛋白,任选地,包括纯化步骤优选地所述纯化步骤为:取所述的重组宿主细胞的菌体用破菌缓冲液充分重悬,然后用高压均质机对菌体进行高压破碎,离心收集上清;上清进一步通过硫酸铵沉淀,硫酸铵的最终饱和度为30%,沉淀复溶后再次离心收集上清获得粗纯液;
粗纯液先上样进行Superdex200分子筛层析,根据L1目的蛋白的出峰位置收集其所在组分;
接着将分子筛收集样品上样进行Source15Q阴离子交换层析,通过NaCl线性洗脱收集L1目的蛋白所在组分,得到HPV68型L1蛋白。
本发明还提供一种制备HPV68型L1 VLP的方法,其特征在于,包括如下步骤: 根据所述的方法得到的HPV68型L1蛋白的步骤,调节其所在缓冲液的pH和盐浓度,使其自组装形成VLP。
优选地,所述缓冲液包括但不限于Tris缓冲液,磷酸盐缓冲液,醋酸缓冲液,HEPES缓冲液,MOPS缓冲液,枸橼酸缓冲液、组氨酸缓冲液,硼酸缓冲液,优选磷酸盐缓冲液;
缓冲液的pH在5-5.75,盐浓度在1.5-3.0M之间,优选pH5,pH5.25,pH5.5,pH5.75;其中的盐浓度在1.5M-3.0M之间,优选1.5M,2.0M,2.5M,3.0M;
任选地,还包括纯化所得HPV68L1a五聚体的步骤。
本发明通过上述改进使得在原核例如大肠杆菌表达系统中可以获得更高的蛋白表达量,且得到质量更均一的VLP。
附图说明
图1 XA90 pKL1-HPV68L1a小摇瓶表达电泳检测结果(SD未改造)。其中,M:marker;1.XA90pKL1阴性对照;2.XA90 pKL1-HPV68L1-1全菌;3.XA90 pKL1-HPV68L1-1上清;4.XA90pKL1-HPV68L1-1沉淀;5.HPV68L1-VLP;6.XA90 pKL1-HPV68L1-2全菌;7.XA90 pKL1-HPV68L1-2上清;8.XA90 pKL1-HPV68L1-2沉淀。
图2 XA90 pKL30-HPV68L1a小摇瓶表达电泳检测结果(SD改造)。其中,M:marker;1.XA90 pKL30阴性对照;2.XA90 pKL30-HPV68L1-1未诱导阴性对照;3.XA90 pKL30-HPV68L1-1全菌;4.XA90 pKL30-HPV68L1-1上清;5.XA90 pKL30-HPV68L1-1沉淀;6..XA90pKL30-HPV68L1-2全菌;7.XA90 pKL30-HPV68L1-2上清;8.XA90 pKL30-HPV68L1-2沉淀。
图3 毒株ACX32384.1HPV68 L1序列和本发明用的序列的对比。其中,HPV68 L1FF是未经改造毒株ACX32384.1HPV68 L1序列;HPV68 L1aFF是本发明所用序列。
图4 毒株ACX32384.1HPV68 L1序列蛋白表达结果图。其中,M:marker;1.XA90pKL30阴性对照;2.XA90 pKL30-HPV68L1-1未诱导阴性对照;3.XA90 pKL30-HPV68L1-1全菌;4.XA90 pKL30-HPV68L1-1上清;5.XA90 pKL30-HPV68L1-1沉淀;6. XA90 pKL30-HPV68L1-2全菌;7.XA90 pKL30-HPV68L1-2上清;8.XA90 pKL30-HPV68L1-2沉淀。
图5本发明改进后的序列表达结果。其中,M:marker;1.XA90 pKL30-HPV68La未诱导阴性对照;2.XA90 pKL30-HPV68L1a-1全菌;3.XA90 pKL30-HPV68L1a-1上清;4.XA90pKL30-HPV68L1a-1沉淀;5.XA90 pKL30-HPV68L1a-2全菌;6.XA90 pKL30-HPV68L1a-2上清;7.XA90 pKL30-HPV68L1a-2沉淀。
图6 纯化所得HPV68L1a五聚体电泳检测结果。其中,M:marker;1.HPV68L1a五聚体。
图7不同SD序列的蛋白表达检测结果。其中,M:marker;1.对照XA90 pKL1;2.未诱导XA90 pBSDm-68L1;3.诱导全菌XA90 pBSDm-68L1;4.诱导上清XA90 pBSDm-68L1;5.诱导沉淀XA90 pBSDm-68L1;6.未诱导XA90 pT1SDm-68L1;7.诱导全菌XA90 pT1SDm-68L1;8.诱导上清XA90 pT1SDm-68L1;9.诱导沉淀XA90 pT2SDm-68L1;10.未诱导XA90 pT2SDm-68L1;11.诱导全菌XA90 pT2SDm-68L1;12.诱导上清XA90 pT2SDm-68L1;13.诱导沉淀XA90pT2SDm-68L1;14.对照XA90 pKL1。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例一:含有特定SD序列的无标签表达载体的构建
pGEX质粒载体固有的SD,不能使HPV多型别L1等外源基因有效地以非融合方式实现可溶表达,即使有表达,其表达量也很低。因此在pGEX质粒载体基础上,通过对SD序列的改造、构建了一簇崭新的非融合SD序列表达载体。其中改造后的SD序列为:5’-AGGAGGAATTA-3’(反向序列为3’-TAATTCCTCCT-5’)。
1.通过突变PCR,在pGEX质粒中引入NdeI酶切位点:
PCR引物名称及序列如下:
正向引物:NdeImut-F (5'to3')
ATTTCA CACAGG AAACAG TACATA TGTCCC CTATAC TAGGTT ATTGGA AAATTA AG;
反向引物:NdeImut-R序列 (5'to3')
ATAACC TAGTAT AGGGGA CATATG TACTGT TTCCTG TGTGAA ATTGTT ATCC。
PCR反应体系如下: 5×phusion HF buffer10μL,ddH2O30.5μL,10mM dNTP 2μL,6PNE-SDm-F 1μL,6PNE-SDm-R 1μL,pGEX-6P-2(稀释20倍) 5μL,Phusion HF Enzyme 0.5μL。
PCR反应程序设置:95℃ 3min; 95℃ 1min,55℃ 1min,72℃ 10 min;循环20次;72℃ 15 min。
PCR产物用DpnI消化后转化到宿主菌DH5α中,过夜培养后获得单克隆菌落。将单克隆菌落进行扩大培养,之后由专业的基因测序公司对其中的载体序列进行测序,选出测序结果正确的克隆,然后将克隆扩繁并从中提取质粒,获得成功引入NdeI酶切位点的载体。
2.设计替换SD序列的突变PCR引物,然后通过PCR方法替换原载体的SD序列
引物信息如下:
SDm-F:CAATTTCACACAGGAGGAATTACATATGCCGTCTGAAGCTAC
SDm-R:GACGGCATATGTAATTCCTCCTGTGTGAAATTGTTATCC
PCR反应体系如下: 5×phusion HF buffer 10μL,ddH2O 30.5μL,10mM dNTP 2μL,SDm-F 1μL,SDm-R 1μL,第1步骤获得的质粒 5μL,Phusion HF Enzyme 0.5μL。
PCR反应程序设置:95℃3 min;95℃1 min,55℃1 min,72℃10 min;循环20次;72℃15 min。
PCR产物用DpnI消化模板DNA后,转化到
E.coliDH5α中,过夜培养后获得单克隆菌落。将单克隆菌落进行扩大培养,之后由专业的基因测序公司对其中的载体序列进行测序,选出测序结果正确的克隆,然后将克隆扩繁并从中提取质粒,获得成功替换SD序列的载体。申请人根据一样的方法设计不同的SD序列,命名为:pBSDm(SD序列5’-AGGAGGAATTA-3’),pT1SDm(SD序列5’-AGGAATAA-3’),pT2SDm(SD序列5’-AGAGGTATATA-3’),从3泳道可以看出只有第一种SD序列有表达,其他2种SD序列未见表达,与未诱导的对照相比,目标位置没有多出明显的条带,见图7。筛选优化得到适用HPV68型L1蛋白表达的载体。
3.载体进行NdeI和BamHI双酶切去除GST基因
酶切体系如下:Cutsmart buffer 3μl,ddH2O 3μl,1.2获得的载体 20μl,NdeI 2μl,BamHI 2μl。37℃酶切2h;0.8%琼脂糖凝胶电泳,120V,1h;切胶获得去除GST基因后的载体片段对应电泳条带,4℃保存。用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体片段,所得载体片段取3μl电泳检测回收结果。然后将双酶切产物用DNA polymerase I补齐粘性末端,反应体系如下:10×T4 DNA Ligase buffer 2.5μl,ddH2O 1.8μl,胶回收的酶切载体片段20μl,10mM dNTP0.2μl,DNA polymerase I 0.5μl,25℃反应15min,加入EDTA(EDTA终浓度为10mM)并且75℃加热20min终止反应。将酶切后并末端补齐的载体进行重新连接环化,连接体系如下:T4DNA Ligase buffer 2μl,线性平末端载体片段 16μl,T4 DNA ligase 2μl。16℃连接4h。连接产物消化后转化到到
E.coliDH5α中,过夜培养后获得单克隆菌落。将单克隆菌落进行扩大培养,之后由专业的基因测序公司对其中的载体序列进行测序,选出测序结果正确的克隆,然后将克隆扩繁并从中提取质粒,获得成功替换SD序列并去除GST基因的载体。
4.PCR扩增质粒,重新引入NdeI和BamHI的酶切位点
PCR引物如下:
6PNE-SDm-noG-F (5'to3'):CAGGAGATATACATATGGGATCCCCGGAATTCCCG;
6PNE-SDm-noG-R (5'to3'):GAATTCCGGGGATCCCATATGTATATCTCCTGTGTG。
PCR反应体系如下: 5×phusion HF buffer 10μL,ddH2O 30.5μL,10mM dNTP 2μL,6PNE-SDm-noG-F 1μL,6PNE-SDm-noG-R 1μL,模板质粒 5μL,Phusion HF Enzyme 0.5μL。
PCR反应程序设置:95℃3 min;95℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃10 min;循环20次;72℃ 15 min。PCR产物用DpnI消化模板DNA后,转化到E.coliDH5α中,过夜培养后获得单克隆菌落。将单克隆菌落进行扩大培养,之后由专业的基因测序公司对其中的载体序列进行测序,选出测序结果正确的克隆,然后将克隆扩繁并从中提取质粒,获得成功替换SD序列、去除GST基因,并重新引入NdeI和BamHI的载体。
通过对不同SD序列的改进发现,本发明所用的SD序列能够有效将HPV68L1蛋白表达出来,而用载体原有的SD序列,目的蛋白并不能表达,见图1。
通过SDS-PAGE的电泳结果显示,没有经过序列改进的SD序列(AGGAGATATACAT)的载体图1的目的蛋白表达明显差于经过序列改进的SD序列(AGGAGGAATTACAT)载体(如图2所示)。
XA90是转化的宿主菌。pKLL1是未经SD序列改造的载体,pKL L30是经过SD序列改造的载体。
实施例二:不同毒种的筛选
申请人通过很多次试验发现,并不是所有毒株的HPV68型L1蛋白能够在大肠杆菌系统表达并组装成质量较好的VLP,例如毒株ACX32384.1等。因此本发明经过序列比对筛选改造,找到了与ACX32384.1毒株有29个氨基酸差异的序列做表达,比对结果见图3,具体的野生型序列见SEQ ID NO.1。蛋白表达结果见实施例四。
实施例三: 含密码子优化的HPV68 L1基因的表达载体的构建
人乳头瘤病毒68型外壳蛋白L1(HPV68L1)基因为人工合成,序列见SEQ ID No.3(HPV68 L1),先PCR扩增HPV68 L1 的DNA片段,将含有NdeI和Xho1酶切位点的L1基因PCR片段以及重组载体分别进行NdeI/Xho1双酶切,之后利用T4 DNA连接酶将回收的基因片段与含有对应粘性末端的pKL1进行连接反应,16℃ 10~15 h。
连接体系如下:pKL1载体片段6μl,16L1基因片段2μl,T4 DNA ligase 1μl,T4 DNALigase buffer 1μl。连接反应后转化连接产物到
E. coli DH5α中进行重组子的筛选。将筛选的单克隆菌落进行扩大培养并进行质粒的提取,之后进行测序验证,得到重组表达载体-HPV68L1。
实施例四:HPV68 L1蛋白的表达
将实施例三测序结果正确的重组载体-HPV68L1转化大肠杆菌XA90宿主细胞,并作为表达重组蛋白质的工程菌进行HPV L1蛋白的表达。0.05%的接种量接种至LB培养基(Amp+)中,于37℃,220rpm培养16h进行活化。取活化后菌液按0.5%的接种量接种至2YT培养基中,于30℃,220rpm培养7h后添加终浓度为0.2mM的IPTG,于30℃,220rpm诱导培养16h后结束发酵,离心收集菌体用于表达量检测以及纯化实验。通过对SD序列的改造结合密码子优化和氨基酸截短三种改进方式,未经改造优化的蛋白表达多在沉淀里面,回收时没有成功(即回收不了),相当于表达失败;经过改造优化后蛋白表达量明显提高,并且在上清液中,利于回收:可以实现人乳头瘤病毒L1抗原蛋白表达从无到有。
从SDS-PAGE的结果来看,未经序列和SD序列改造的载体的目的蛋白表达量极低。经过技术方案改进之后的蛋白却是可溶高效表达的,HPV68L1蛋白的分子量约为59.5。
实施例五:HPV68L1蛋白VLP组装
取适量菌体按质量体积比1:10的比例用破菌缓冲液(20 mM PB,20 mM DTT,pH8.0)充分重悬,然后用高压均质机对菌体进行高压破碎,破碎条件为:800 bar,3次。菌体破碎液接着进行高速离心(4℃,12000 rpm,60 min)收集上清。上清进一步通过饱和度为30%的硫酸铵沉淀,离心(4℃,12000 rpm,60 min)收集沉淀,沉淀按质量体积比1:10的比例用复溶Buffer(20 mM PB,20 mM DTT,pH8.0)充分复溶后再次离心(4℃,12000 rpm,60min)收集上清获得粗纯液。粗纯液先上样进行Superdex200分子筛层析,分子筛Buffer(20mM PB,20 mM DTT,pH8.0),根据L1目的蛋白的出峰位置收集其所在组分。接着将分子筛收集样品上样进行Source15Q阴离子交换层析(SQ低盐Buffer:5 mM PB,10 mM DTT,pH8.0,SQ高盐Buffer:5 mM PB,1 M NaCl,10 mM DTT,pH8.0),通过0-20% 高盐Buffer,10个柱体积线性洗脱收集L1目的蛋白所在组分,改组分即为纯化后L1蛋白。最后调节L1蛋白所在缓冲液的pH和盐浓度至其自组装形成VLP,至此VLP的制备完成。最后通过动态光散射(DLS)法测定VLP的质量。
表1 HPV68L1蛋白组装前后DLS检测结果
从上述表1所示纯化实验结果可知,组装缓冲液的pH在5-5.75,优选PH5,pH5.25,pH5.5,pH5.75,以及盐浓度在1.5M-3.0M之间,优选1.5M,2.0M,2.5M,3.0M时候,新的HPV68L1的五聚体状态良好(PdI≤0.1),也能有效组装形成状态良好的VLP(45 nm≤粒径大小≤75 nm,PdI≤0.1),纯化所得HPV68L1a五聚体的电泳检测结果参见图6。
Claims (10)
1.一种截短的HPV68型L1蛋白,其是在野生型HPV68型L1蛋白的基础上,在其N端截短不多于10个氨基酸,不多于5个氨基酸,优选4个氨基酸,且在其C端截短不多于30个氨基酸,优选28个氨基酸;优选地,截短的HPV68型L1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码如权利要求1所述的截短的HPV68型L1蛋白的核酸;优选地,其经过密码子优化的核酸;更优选地,其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.含有SD序列和编码如权利要求1所述的截短的HPV68型L1蛋白的核苷酸序列的核酸,优选地,所述SD序列的核苷酸序列为5`-AGGAGGAATTA-3`。
4.含有如权利要求2或3所述的编码核酸的表达盒或表达载体。
5.如权利要求4所述的表达盒或表达载体,其特征在于,其是原核表达载体,更优选地是在载体pGEX基础上去除了GST标签序列,并且整合所述SD序列的截短的HPV68型L1蛋白的核酸分子而得到。
6.含有如权利要求2或3所述的编码核酸的表达盒或表达载体的重组宿主细胞。
7.如权利要求6所述的重组宿主细胞,其特征在于,其是大肠杆菌。
8.一种表达如权利要求1截短的HPV68型L1蛋白的方法,其特征在于,培养如权利要求6或7所述的重组宿主细胞以产生HPV68型L1蛋白,任选地,包括纯化步骤,优选地所述纯化步骤为:取所述的重组宿主细胞的菌体用破菌缓冲液充分重悬,然后用高压均质机对菌体进行高压破碎,离心收集上清;上清进一步通过硫酸铵沉淀,硫酸铵的最终饱和度为30%,沉淀复溶后再次离心收集上清获得粗纯液;
粗纯液先上样进行Superdex200分子筛层析,根据L1目的蛋白的出峰位置收集其所在组分;
接着将分子筛收集样品上样进行Source15Q阴离子交换层析,通过NaCl线性洗脱收集L1目的蛋白所在组分,得到HPV68型L1蛋白。
9.一种表达如权利要求1截短的HPV68型L1蛋白的方法,其特征在于,包括如下步骤:根据如权利要求8所述的方法得到的HPV68型L1蛋白的步骤,调节其所在缓冲液的pH和盐浓度,使其自组装形成VLP。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述缓冲液包括但不限于Tris缓冲液,磷酸盐缓冲液,醋酸缓冲液,HEPES缓冲液,MOPS缓冲液,枸橼酸缓冲液、组氨酸缓冲液,硼酸缓冲液,优选磷酸盐缓冲液;
缓冲液的PH在5-5.75,优选PH5,PH5.25,PH5.5,PH5.75;盐浓度在1.5M-3.0M之间,优选1.5M,2.0M,2.5M,3.0M;
任选地,还包括纯化所得HPV68L1a五聚体的步骤。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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