CN113528544B - 编码可溶性hpv23 l1蛋白的基因及其重组质粒的构建与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种编码可溶性HPV23 L1蛋白的基因及其重组质粒的构建与应用。本发明在综合多重复杂因素的基础上，对HPV23L1基因进行优化，并构建了重组质粒pUC‑23L1、pET32a‑23L1和pESUMO‑23L。本发明HPV23L1基因能显著提高目的蛋白可溶性表达的效率，且产品性质均一、稳定，发酵破菌液上清中的目的蛋白表达量可达到100μg/ml，从而满足工业化生产的要求；本发明提供了一种原核表达可溶性人乳头瘤病毒23亚型L1蛋白的方法，该方法将HPV23L1蛋白与SUMO蛋白融合表达，可以获得可溶性好、具有明显血凝活性的重组表达蛋白。

Description

编码可溶性HPV23 L1蛋白的基因及其重组质粒的构建与应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉一种编码可溶性HPV23 L1蛋白的基因及其重组质粒的构建与应用。

背景技术

人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus，HPV）是一类双链小分子DNA病毒，具有严格的种属特异性，主要感染人的皮肤和粘膜组织，引起相应部位上皮组织的增生性病变。1977年Laverty（Laverty,C.R.,Russell,P.et al.1977）在电镜中观察到宫颈癌组织中存在HPV颗粒

根据核酸序列同源性，目前发现的HPV约有200多种基因型 (Chen, Casini etal. 2001)。根据“属”的分类水平，HPV可分为α属、β属等(Dawes 2005)。α属，也被称为粘膜HPV，主要感染生殖器和粘膜，导致良性皮肤疣和其他疾病；β属HPV主要侵染部位是皮肤(deKoning, Struijk et al. 2007)。HPV23属于乳头瘤病毒科（Papillomaviridae）β-乳头瘤病毒属（Betapapillomavirus）的β-乳头瘤病毒2型（Betapapillomavirus2），是最常见的β属PV型(de Koning, Struijk et al. 2007)；其基因组由7.3kb的环状双链DNA以及两个较短片段组成(Atkinson, Bishop et al. 2017)。HPV为二十面体、立体对称的结构、不具有包膜，主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2构成了HPV的衣壳结构；HPV主要衣壳蛋白L1可自组装的病毒样颗粒（VLPs）(Huber, Wang et al. 2021)，它们是非常有效的预防性免疫原，具有类似HPV天然病毒的血凝活性(Chen, Liu et al. 2016)。

HPV基因组长约8kb，分子量约为5×10⁶道尔顿，直径为50～60nm，正二十面体结构。核心为单拷贝的基因组DNA，病毒衣壳由主要衣壳蛋白（L1）和次要衣壳蛋白（L2）组成；其中L1蛋白是较大的衣壳蛋白，分子量为55～60kDa，为主要衣壳蛋白，是高度保守的糖蛋白，具有高度的免疫原性，也是HPV分型的依据，同时体外表达的HPV L1蛋白可自组装成病毒样颗粒（virus-like particle，VLP）（Kirnbauer,R. et al.,1992）；L2蛋白为次要衣壳蛋白是高度可变核蛋白，反映HPV抗原的多态性（Wang, J.W., Roden, R.B., 2013）。而且在病毒壳粒中大多数L2蛋白在L1蛋白内部；因此，在开发宫颈癌疫苗时，针对衣壳蛋白L1开发具有更好的针对性。

HPV-23是一种具有临床意义的乳头状瘤病毒，与皮肤鳞状细胞癌（squamous cellcarcinoma，SCC）(Neale, Weissenbornet al. 2013)、非黑色素瘤皮肤癌(Arroyo Muhr,Hultin et al. 2021)、眼汗管瘤(Assadoullina, Bialasiewicz et al. 2000)、乳腺癌(Sigaroodi, Nadji et al. 2012)、基底细胞癌（BCC）(Iannacone, Gheit et al. 2013)、疣状表皮发育不良、非生殖性脂溢性角化病等有关(Atkinson, Bishop et al. 2017)。紫外线是皮肤癌发生的主要危险因素，研究发现，紫外线水平与HPV-23血清流行率升高有一定关系(Muschik, Braspenning-Wesch et al. 2011, Kricker, Weber et al. 2020)。因而，HPV23亚型具有十分重大的临床意义，但是目前关于HPV23亚型L1蛋白的研究还比较少，其制备及应用也有待加强。

发明内容

基于现有研究的不足和现实需要，本发明提供一种编码可溶性HPV23 L1蛋白的基因及其重组质粒、重组工程菌，并构建了HPV23 L1蛋白表达方法，旨在提高HPV 23 L1蛋白的可溶性、活性及表达量。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

基于野生型HPV 23L1基因进行改造，对其所有的氨基酸全部采用大肠杆菌中使用频率最高的核苷酸密码子；同时，为了避免翻译出来的mRNA的GC比例过高，mRNA的二级结构对翻译效率造成影响，并避开一些常用的酶切位点，对最优的密码子频率进行修正；最终，在综合考虑多重复杂因素的基础上，研究设计出一个全新的HPV23 L1 DNA序列，如SEQ IDNO.1所示。

合成优化获得的HPV23 L1 DNA基因装入pUC57质粒中，构成重组质粒pUC-23L1；并构建了重组质粒pET32a-23L1和pESUMO-23L。

构建表达可溶性HPV23 L1蛋白的重组质粒的方法，包括如下步骤：

（1）设计基因HPV23L1的扩增引物，且其正向引物包含EcoR I 或Bsa I限制性内切酶位点、反向引物包括位于终止密码子侧翼的Xho I限制性内切酶位点；

（2）以所述扩增引物PCR扩增基因HPV23L1；

（3）取pET32或pESUMO质粒与所得PCR扩增产物分别进行限制性内切核酸酶EcoR I 或Bsa I与Xho I双酶切消化，回收空载体质粒pET32或pE-SUMO和HPV23 L1基因的双酶切产物，用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，得到重组质粒；

（4）将上步所得重组质粒pET32a-23L1或pESUMO-23L1转化大肠杆菌感受态细胞BL21，涂布在Amp⁺/LB固体培养基上培养，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定，筛选阳性菌落，提取阳性菌落质粒，测序结果正确的即为表达可溶性HPV23 L1蛋白的重组质粒。

所述扩增引物的序列如下：

引物名称	酶切位点	序列5’-3’
			F-23-A	<i>EcoR I</i>	CGC<u><i>GAATTC</i></u>ATGACCCTGTGGCTGC
F-23-B	<i>Bas I</i>	TT<u><i>GGTCTC</i></u>TAGGTATGACCCTGTGGCTGC
			R-23	<i>Xho I</i>	CCG<u><i>CTCGAG</i></u>TTACAGCTGCACTTTTTTACGTT

可溶性人乳头瘤病毒23亚型L1蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）取权利要求3所述重组质粒pESUMO-23L1或权利要求4所述重组质粒pET32a-23L1接种于Amp⁺/LB液体培养基中培养至OD₄₅₀值至0.75～0.85时，在诱导剂IPTG浓度为0.3mmol/L、18℃条件下诱导表达；

（2）诱导表达结束后，离心收集菌体，清洗后破碎，并离心分离，收集上清液；

（3）将所述上清液通过Ni亲和层析柱进行洗脱纯化得SUMO-23 L1蛋白。

与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：

（1）本发明对HPV23L1基因进行优化，使其更适合在大肠杆菌宿主中高效率表达目标蛋白，同时，应用SUMO标签和TRX标签表达系统在大肠杆菌中融合表达，更进一步增加了目的蛋白的可溶性，使表达的目的蛋白具有更高活性。

（2）本发明能显著提高目的蛋白可溶性表达的效率，且产品性质均一、稳定，发酵破菌液上清中的目的蛋白表达量可达到100μg/ml，这一数值明显高于本发明目的蛋白在其它原核表达系统中的产量，从而满足工业化生产的要求。

（3）本发明提供了一种原核表达可溶性人乳头瘤病毒23亚型L1蛋白的方法，该方法将HPV23L1蛋白与SUMO蛋白融合表达，可以获得可溶性好、具有明显血凝活性的重组表达蛋白。

附图说明

图1为重组质粒pET28a-23L1、pET30a-23L1、pET32a-23L1、pESUMO-23L1的构建示意图。

图2为重组质粒的菌液PCR及双酶切鉴定图；其中，

A：pET28a-23L1、pET30a-23L1的菌液PCR鉴定；M. Marker； 泳道1- 5. pET28a-23L1扩增产物；泳道6-10. pET30-23L1扩增产物；

B：pET30a-23L1的菌液PCR鉴定；M. Marker；泳道11- 13. pET30a-23L1扩增产物；

C：pESUMO-23L1的菌液PCR鉴定；M. Marker；泳道1- 5. pESUMO-23L1扩增产物；

D：重组表达载体的双酶切鉴定：M. Marker；泳道1-5. 分别为pET30a-23L1、pET30a空载、pET32a-23L1、pET28a-23L1、pESUMO-23L1双酶切产物。

图3为HPV16 L1的大肠杆菌表达菌株蛋白表达SDS-PAGE鉴定图；图中，M. Marker；1. pET32a-23L1未加诱导剂IPTG的对照；2. pET32a-23L1诱导表达产物；3.pET28a-23L1诱导表达产物；4.pET30a-23L1诱导表达产物；5. pESUMO-23L1未加诱导剂IPTG的对照；6.pESUMO-23L1诱导表达产物。

图4为HPV23 L1重组蛋白的可溶性分析及Western Blot鉴定；其中，

图A和B为SDS-PAGE鉴定结果；M. Marker；泳道1为pET32a-23L1超声上清；泳道2为pET32a-23L1超声沉淀；泳道3为pESUMO-23L1超声上清；泳道4为pESUMO-23L1超声沉淀；

图C和图D为Western Blot 鉴定结果；泳道5为 pET32a-23L1超声上清；泳道6为pESUMO-23L1超声上清。

图5为SDS-PAGE鉴定重组蛋白的纯化结果；图中M为蛋白标准分子量Marker；泳道1和2为纯化的SUMO-23L1蛋白。

图6为HPV23L1蛋白同源建模及重组表达蛋白血凝活性鉴定；其中，

A图为HPV23L1蛋白同源建模的单体结构；

B为同源建模的HPV23L1蛋白五聚体结构；

C图为参考序列BPV1 L1蛋白三维结构（PDB：3iyj）。

图7为重组蛋白的血凝活性鉴定：图中1和2 为2次重复实验，其中1:2～1:32为纯化的SUMO-23L1蛋白2倍倍比稀释的结果； PBS 为阴性对照（NC）。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如（《分子克隆：实验室手册》原书第四版 2012）中所述的条件进行。

以下实施例中DNA延伸和PCR扩增试剂以及限制性内切酶BsaI、EcoRI和Xho I购自NEB（New England Biolabs, Inc.）；使用的抗HRP标记的羊抗鼠IgG购自Abcam公司。

以下实施例中，纯化步骤中使用的破菌缓冲液配方为：PBS（3-吗啉丙磺酸），pH7.4。

实施例一： 重组表达质粒的构建

1. HPV23 L1蛋白编码区基因的克隆

1.1 HPV23L1基因序列的设计合成

本发明HPV23L1基因序列是经过大肠杆菌偏爱密码子优化的DNA序列，具体如下：

首先，对野生型HPV 23L1基因进行改造，对其所有的氨基酸全部采用大肠杆菌中使用频率最高的核苷酸密码子；同时，为了避免翻译出来的mRNA的GC比例过高，mRNA的二级结构对翻译效率造成影响，并避开一些常用的酶切位点，对最优的密码子频率进行修正，最终研究设计出一个全新的HPV23 L1 DNA序列，如SEQ ID NO.1所示。

经优化获得的HPV23 L1 DNA送生工生物工程（上海）股份有限公司合成，合成后的基因直接装入pUC57质粒中，命名为重组质粒pUC-23L1。

2. HPV23 L1基因的PCR扩增及双酶切回收

2.1 引物序列的设计和合成

根据HPV23 L1基因序列设计合成正向引物，具体见表1；其中，正向引物F-23-A包括一个EcoR I限制性内切酶位点；F-23-B包括一个Bsa I限制性内切酶位点；反向引物包括位于终止密码子侧翼的XhoI限制性内切酶位点，所述酶切位点见引物序列中的下划线所示。

表1 引物列表

引物名称	酶切位点	序列(5’-3’)	目的片段（bp）
				F-23-A	<i>EcoR I</i>	CGC<u><i>GAATTC</i></u>ATGACCCTGTGGCTGC （SEQ ID NO.2）
F-23-B	<i>Bas I</i>	TT<u><i>GGTCTC</i></u>TAGGTATGACCCTGTGGCTGC （SEQ ID NO.3）	1521bp
				R-23	<i>Xho I</i>	CCG<u><i>CTCGAG</i></u>TTACAGCTGCACTTTTTTACGTT（SEQ ID NO.4）

2.2 PCR扩增

F-23-A与R-23引物扩增产物含有EcoRI/Xho I双酶切位点；F-23-B与R-23引物扩增产物含有Bas I/Xho I双酶切位点；

PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90 s；共30个循环；72℃延伸10 min。

将PCR扩增产物用质量分数1%琼脂糖凝胶电泳观察，结果显示PCR扩增产物大小约为1520bp，与预期相符，证明获得了全长密码子优化的HPV23L1基因。

2.3 PCR扩增产物及空载体质粒的双酶切回收

将pET28a、pET30a和pET32质粒和引物对F-23-A与R-23 PCR扩增产物（HPV23 L1基因）分别进行限制性内切核酸酶EcoR I和Xho I双酶切消化；将pESUMO质粒和引物对F-23-B与R-23的PCR扩增产物（HPV23 L1基因）分别进行限制性内切核酸酶Bsa I和Xho I双酶切消化，具体反应条件如下：

酶切消化体系为：HPV23L1基因或者载体质粒 20μL

10×Cut Smart Buffer 5 µL

EcoR I或Bsa I 1μL

Xho I 1μL

双蒸水 23μL。

总体系为50μL，反应条件为37℃，4h。随后分别回收空载体质粒pET28a、pET30a和pET32、pE-SUMO和HPV23 L1基因的双酶切产物，用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，得到重组质粒pET28a-23L1、pET30a-23L1、pET32a-23L1、pESUMO-23L1。HPV23 L1蛋白的重组表达载体的构建策略如图1所示。

HPV23 L1蛋白的重组表达菌的构建

分别将重组质粒pET28a-23L1、pET30a-23L1、pET32a-23L1、pESUMO-23L1转化大肠杆菌感受态细胞BL21，涂布在Kan⁺/LB（pET28a-23L1、pET30a-23L1）或Amp⁺/LB（pET32a-23L1、pESUMO-23L1）固体培养基上培养，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定，筛选阳性菌落（见图2），提取阳性菌落质粒进行测序，测序结果正确的，命名为重组质粒pSUMO-HPV16L1，即为表达可溶性人乳头瘤病毒16亚型L1蛋白的重组质粒。

实施例二： HPV23亚型L1蛋白的初步诱导表达及鉴定

1. HPV23L1的大肠杆菌表达菌株的表达和鉴定

将HPV23L1的大肠杆菌表达菌株pET28a-23L1、pET30a-23L1、pET32a-23L1、pESUMO-23L1分别接种于Kan⁺/LB（pET28a-23L1、pET30a-23L1）或Amp⁺/LB（pET32a-23L1、pESUMO-23L1）液体培养基中培养至OD₄₅₀值约为0.8时，加入IPTG，使其终浓度为0.3 mmol/L，然后于18℃诱导表达12h；诱导表达结束后，离心收集菌体，取一小部分菌体用SDS-PAGE及West-Blotting鉴定，同时设立空载大肠杆菌作为对照，结果如图3所示，从图中可以看出pET28a-23L1（HIS-23L1融合蛋白）和pET30a-23L1（HIS-S-23L1融合蛋白）几乎无目的蛋白表达，而pESUMO-23L1(SUMO-23L1)及pET32a-23L1（TRX-23L1）表达产物在在大约80kDa处有目的条带，SUMO 标签和TRX标签约12kDa，加上含有强阳离子的HIS-tag，预测位置一致，说明pESUMO-23L1(SUMO-23L1)及pET32a-23L1（TRX-23L1）表达菌株中有HPV 23L1重组蛋白表达。

2. 重组蛋白HPV23-L1的可溶性分析

在诱导剂IPTG浓度为0.3 mmol/L，16℃条件下诱导表达18 h后收集pESUMO-23L1及pET32a-23L1的表达菌体，PBS重悬后经超声破碎处理，上清和沉淀分别用12%SDS-PAGE进行鉴定。结果显示，在pET32a-23L1和pESUMO-23L1的超声上清和沉淀的大约80kDa的位置均存在蛋白条带（SUMO-23L1蛋白或TRX-23L1蛋白），而重组SUMO-23L1蛋白表达量整体高于TRX-23L1蛋白（见图4A、4B）。Western Blot结果显示，重组SUMO-23L1蛋白或TRX-23L1蛋白均可与His单抗发生反应。

实施例三：HPV23 L1重组蛋白的纯化及活性鉴定

1. HPV23 L1重组蛋白的纯化

将剩余的菌体与清洗缓冲液按照重量比1:5的比例混合，摇匀，12000r/min离心5min，收集菌体沉淀。将菌体沉淀和破菌缓冲液按照重量比1:10的比例混合，摇匀，高压破碎，将高压破碎的破菌液12000r/min、4℃离心30min，收集上清液。

将上清液通过Ni亲和层析柱进行纯化，洗脱方式为：Wash Buffer，pH8.0 的含有250mmol/LNaCl 的50 mmol/LTris-HCl缓冲液+20 mmol / L咪唑；Elution Buffer pH8.0的含有250mmol/LNaCl 的50 mmol/LTris-HCl缓冲液+200 mmol / L咪唑 ）进行洗脱，收集洗脱组分，并采用SDS-PAGE，Western-blot检测，结果如图5所示，纯化获得的SUMO-23 L1蛋白分子量大小在80kDa处与预期结果相符合，证明成功获得SUMO-23 L1蛋白。

2. HPV23L1重组蛋白的同源建模及生物信息学预测

用SWISS-MODEL软件对HPV23 L1蛋白进行同源建模，结果显示，HPV23L1蛋白单体结构（图6A）与五聚体结构（图6B）与参考序列牛乳突瘤病毒（Bovine papillomavirus type1，BPV1）的L1蛋白（PDB：3iyj）结构相似（图6C），二者序列同源性为49.39%。

3. 血凝试验（Hemagglutination, HA）

3.1 红细胞制备方法

用灭菌注射器吸取1ml新鲜小鼠血于含有1,000U的肝素（抗凝）的灭菌离心管内中；向上述离心管中加入9ml PBS中以1500r/min离心5min，弃上清液；用10ml PBS重悬血球，2000r/min离心10min，弃上清，如此将红细胞洗涤三次；最后根据所需用量，用PBS配成体积分数1%的小鼠红细胞悬液。

3.2 HA

血凝实验：取96孔微型血凝反应板，用微量移液器吸取PBS 25

，从第1孔加到第8孔，每孔25

。吸取25

纯化的HPV23 L1重组蛋白加入第1孔，充分混匀后从第1孔吸出25

，加入第2孔再次充分混匀后，从第2孔吸出25

加入第3孔混匀，以此类推，一直倍比稀释至第5孔，第6、7、8孔每孔加入25

PBS设置为阴性对照。25

%小鼠红细胞悬液从第8孔倒加至第1孔且要悬加，震荡混匀。室温下静置40min，拍照并记录实验结果。血凝实验显示纯化的蛋白有凝集小鼠红细胞的血凝活性（图7）。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明构思的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，或者是对相关方法及步骤进行等同替代，从而形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 郑州大学

<120> 编码可溶性HPV23 L1蛋白的基因及其重组质粒的构建与应用

<130> /

<160> 4

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 1521

<212> DNA

<213> HPV23 L1

<400> 1

atgaccctgt ggctgccagc ttctggtaag atctatctgc cgccgacccc accggtagcc 60

cgtgtgcagt ctaccgatga atatgtggaa cgtactgaca tctattatca tgcaacttct 120

gatcgtctgc tgactgtagg gcatccatac ttcgatgtac gttctccgga tggttctaaa 180

atcgatgtac caaaggtttc tggtaaccag ttccgtgcct ttcgtgttac ctttccagac 240

ccgaacaagt ttgcactggc agacatgact atctatgatc cggataaata ccgtctggtg 300

tgggcctgcg caggtctgga aattggccgc ggccagccgc tgggtgttgg ctctaccggc 360

catccgctgt tcaacaagct gagagatgca gaaaactctt ctgaacgtca ggaaggcact 420

gtagatgacc gtcgtaacat ttcttttgat ccgaagcagg tacagatgtt tatcattggt 480

tgcaccccgt gcctgggtga atattgggat accgctccgg tttgtaaaga tgcaggtagc 540

cagctgggtc tgtgtccacc gctggaactg aaaaacagcg taatcgaaga tggtgacatg 600

tttgacattg gctttggtaa catcaacaac aaaaccctgt cttttaaccg ttctgatgtt 660

tctctggatc tggtaaacga ggtatgcaaa tatccagact ttctgactat gtctaacgat 720

gtatatggtg atgcctgttt tttttgtgcc cgtcgtgagc agtgctatgc ccgtcactat 780

tttgttcgtg gtggtgtagt aggtgatgca atcccggatg gtgcagttca gcaggatcac 840

aaatattatc tgccggcaga ccagcagaac actctggaaa actctctgta ttttccgact 900

gtttctggtt ctctggttac ttctgactcg cagctgttca accggccatt ttggctgaaa 960

cgtgctcagg gccataacaa cggtattctg tggaacaacc agatgtttgt gactgtagca 1020

gataacaccc gtaacaccaa cttttctatc tctgttacca acgacagctc tctggaaaag 1080

tatgatgcca ctaaaattcg tgagtttacc cgtcatgttg aagaatatca gctgtctttt 1140

atcctgcagc tgtgtcgtat cccgctgaag gccgaggttc tgacccagat taacgccatg 1200

aactctgata ttctggagaa ctggcagctg ggttttgttc cgaccccaga taacgcagtt 1260

catgatactt accgttatct ggcttctaag gctactaaat gtccggatgc agtaccagat 1320

acacagaagg aggatccgtt cggcaagtat tctttttgga acgttgatat gaccgaaaaa 1380

ctgtctctgg acctggatca gtatccgtta ggccgtaagt tcctgttcca gattggtgtg 1440

cagcgtatcc gttccggtac caaacgtccg gcaactcgta aagtgaccaa aactgttaaa 1500

cgtaaaaaag tgcagctgta a 1521

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

cgcgaattca tgaccctgtg gctgc 25

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

ttggtctcta ggtatgaccc tgtggctgc 29

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

ccgctcgagt tacagctgca cttttttacg tt 32

Claims (8)

1.一种编码可溶性人乳头瘤病毒23亚型L1蛋白的基因HPV23L1，其DNA序列如SEQ IDNO.1所示。

2.一种载体质粒pUC-23L1，包括载体质粒pUC57及装载其中的权利要求1所述基因HPV23L1。

3.一种重组质粒pESUMO-23L1，包括载体质粒pE-SUMO及装载其中的权利要求1所述基因HPV23L1。

4.一种重组质粒pET32a-23L1，包括载体质粒pET32及装载其中的权利要求1所述基因HPV23L1。

5.一种表达可溶性HPV23 L1蛋白的重组质粒，含有权利要求1所述基因HPV23L1。

6.权利要求5所述表达可溶性HPV23 L1蛋白的重组质粒的构建方法，包括如下步骤：

（1）设计权利要求1所述基因HPV23L1的扩增引物，且其正向引物包含EcoR I 或Bsa I限制性内切酶位点、反向引物包括位于终止密码子侧翼的Xho I限制性内切酶位点；

（2）以所述扩增引物PCR扩增基因HPV23L1；

（3）取pET32或pESUMO质粒与所得PCR扩增产物分别进行限制性内切核酸酶EcoR I 或Bsa I与Xho I双酶切消化，回收空载体质粒pET32或pE-SUMO和HPV23 L1基因的双酶切产物，用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，得到重组质粒；

（4）将上步所得重组质粒pET32a-23L1或pESUMO-23L1转化大肠杆菌感受态细胞BL21，涂布在Amp⁺/LB固体培养基上培养，挑取单菌落进行菌液PCR鉴定，筛选阳性菌落，提取阳性菌落质粒，测序结果正确的即为表达可溶性HPV23 L1蛋白的重组质粒。

7.根据权利要求6所述重组质粒的构建方法，其特征在于，所述扩增引物的序列如下：

F-23-A 5’-CGC GAATTC ATGACCCTGTGGCTGC-3’， 酶切位点EcoR I

F-23-B 5’-TT GGTCTC TAGGTATGACCCTGTGGCTGC-3’，酶切位点Bas I

R-23 5’-CCG CTCGAG TTACAGCTGCACTTTTTTACGTT-3’，酶切位点Xho I。

8.一种可溶性人乳头瘤病毒23亚型L1蛋白的制备方法，包括如下步骤：

（1）取权利要求3所述重组质粒pESUMO-23L1或权利要求4所述重组质粒pET32a-23L1接种于Amp⁺/LB液体培养基中培养至OD₄₅₀值至0.75～0.85时，在诱导剂IPTG浓度为0.3 mmol/L、18℃条件下诱导表达；

（2）诱导表达结束后，离心收集菌体，清洗后破碎，并离心分离，收集上清液；

（3）将所述上清液通过Ni亲和层析柱进行洗脱纯化得SUMO-23 L1蛋白。

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