CN1478790A - 乳头瘤病毒衣壳蛋白的原核制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了乳头瘤病毒衣壳L1蛋白氨基酸序列的三维空间结构和一个利用原核细胞特别是大肠杆菌大量表达和制备乳头瘤病毒衣壳蛋白L1或L2或L1+L2的技术方法。编码乳头瘤病毒L1或L2衣壳蛋白的基因片段被组装到一个原核表达载体上。重组后的表达载体导入特定细菌细胞后能够在给定条件下大量表达L1或L2蛋白多肽。L1或L2多肽在给定条件下聚合形成多聚体。纯化的L1或L2或L1+L2重组蛋白多聚体可替代乳头瘤病毒而作为抗原、免疫原、诊断试剂或抗病毒疫苗的核心成份。同时，这种病毒衣壳蛋白多聚体的结构特征还可用作研制其他抗病毒疫苗或诊断试剂的载体平台。
Description
一.发明领域
本发明涉及使用原核细胞表达体系大量制备乳头瘤病毒衣壳蛋白L1或L2或L1+L2多聚体的方法以及这些重组蛋白的实际用途。用途的一个例子是可溶性人乳头瘤病毒L1蛋白分子的多聚体能够作为免疫原引发人体对人乳头瘤病毒的免疫反应，因而能够作为预防和治疗由人乳头瘤病毒侵染所造成的疾病，包括良性肉疣和子宫颈癌。
二.发明背景
乳头瘤病毒(Papilloma virus)是一大类侵染人类和其他动物的DNA病毒。其中人乳头瘤病毒(Human papillomavirus；HPV)与人类多种疾病有关，包括良性疣和癌症。预防和治疗由任何病毒侵染所引起疾病最有效的方法是使用抗病毒的特异性疫苗。长期以来人们一直努力研制抗人乳头瘤病毒的疫苗，特别是针对能引起子宫颈癌的HPV16和HPV18亚型的疫苗。
乳头瘤病毒含有两个用于保护病毒染色体的结构蛋白或衣壳蛋白，分别为L1和L2。L1的72个五聚体形成病毒颗粒的外壳；L2位于L1外壳的内部，又称内衣壳蛋白。通常每一个L2分子与一个L1五聚体相联系。因此，L1和L2是重要的候选免疫原。
由于乳头瘤病毒在长期进化过程中所形成的寄主专化性，该病毒很难通过常规的细胞培养来繁殖扩增。必须用蛋白重组的方法来生产该病毒衣壳蛋白。原核细菌表达方法虽然是一种经济有效的生产重组蛋白的方法，但直到本发明出现以前很难用原核细菌细胞产生大量的乳头瘤病毒L1和L2衣壳蛋白。
三.发明概括
本发明提供了一个利用原核细胞特别是大肠杆菌细胞大量表达和制备乳头瘤病毒L1蛋白或L2蛋白或L1+L2组合蛋白作为免疫原和诊断试剂的方法。编吗L1或L2蛋白的乳头瘤病毒基因片段被组装到一个原核表达载体上。表达载体转入细菌细胞后在给定条件下表达L1或L2多肽。L1或L2多肽在给定条件下聚合形成多聚体或L1+L2组合蛋白。 纯化的L1蛋白、L2蛋白或L1+L2组合蛋白可作为免疫原或诊断试剂。
发明的构成之一是对人体接种以预防和治疗人乳头瘤病毒侵染的方法。重组人乳头瘤病毒L1蛋白、L2蛋白或L1+L2组合蛋白的多聚体以免疫有效剂量接种给人体后可引诱人体产生对这些重组蛋白的免疫反应。人体的这种特异免疫反应可帮助人体预防人乳头瘤病毒的入侵或中和清除已经入侵的人乳头瘤病毒。
发明的又一构成是检测生物样品中是否存在乳头瘤病毒抗原的诊断方法。由L1、L2或L1+L2重组蛋白引诱所产生并制备的特异抗体与生物样品接触后，样品中与抗体特异结合的病毒抗原可被捡测出。
发明的又一构成是检测生物样品中乳头瘤病毒抗体是否存在的诊断方法。生物样品与L1、L2或L1+L2蛋白多聚体接触后，样品中与多聚体特异结合的抗体可被捡测出。
发明的另一构成是在生物样品中捡测乳头瘤病毒亚型或株系的方法。生物样品与乳头瘤病毒不同亚型的特异抗原或特异抗体接触后，样品中乳头瘤病毒亚型或株系可被捡测出。
另外，发明的又一构成是产生乳头瘤病毒N-末端截短型L1或L1+L2蛋白可溶性多聚体的方法。重组L1蛋白由1-505个氨基酸组成。L1蛋白倾向于由氨基酸5-505，6-505，7-505，8-505，9-505，10-505，11-505，12-505，13-505，14-505，16-505，16-505，甚至17-505组成。重组L1蛋白在处理中除去细菌寄主细胞蛋白以形成可溶性HPV L1蛋白多聚体。
本发明因此提供了一个简单和有效生产大量乳头瘤病毒L1或L2蛋白的方法。制备的衣壳蛋白除了别的因素外，能用作免疫原和诊断工具。四.详细描述
本发明发现了乳头瘤病毒衣壳蛋白L1或L2或L1+L2能够在细菌细胞特别是在大肠杆菌里大量表达。所表达的蛋白经特殊工艺处理后被纯化形成可溶性L1或L2或L1+L2多聚体。这些多聚体能够被用作免疫原引诱寄主产生特异抗乳头瘤病毒的抗体、或作为诊断工具检测样品中乳头瘤病毒抗原或抗体的存在。这些多聚体还可作为指导定位特异受体相互作用的工具。名称和定义乳头瘤病毒：英文拉丁名Papilloma virus，一类专性侵染人类和其他动物的DNA病毒。这类病毒有基本相同或同源的染色体结构、性质、编码基因数目、外观形态结构以及侵染寄主细胞的机理。其中侵染人类的乳头瘤病毒称人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus)简称HPV；侵染狗的乳头瘤病毒简称CoPV；侵染牛的简称BPV；侵染兔的简称CRPV；侵染鹿的简称DPV；
乳头瘤病毒染色体上编码有两个用于保护病毒染色体的结构蛋白或衣壳蛋白，分别为L1和L2。L1的72个五聚体形成病毒颗粒的外壳；L2位于L1外壳的内部，又称内衣壳蛋白。通常每一个L2分子与一个L1五聚体相联系。L1蛋白：指由乳头瘤病毒基因组编码的用于保护病毒DNA的主要外衣壳蛋白，又简称衣壳蛋白。本发明描述中使用的“L1蛋白”包括L1蛋白多肽分子的自然氨基酸全长序列、任何N-末端或C-末端截短或两端都经截短或修饰的多肽分子以及这些多肽分子的二聚体、五聚体或多聚体。“L1蛋白”在本发明中包括来自下列按寄主划分的乳头瘤病毒株系：人(HPV1，HPV2，HPV3，HPV4，HPV5，HPV6，HPV7，HPV8，HPV9，HPV10，HPV11，HPV12，HPV13，HPV14，HPV15，HPV16，HPV17，HPV18，HPV19，HPV20，HPV21，HPV22，HPV23，HPV24，HPV25，HPV26，HPV27，HPV28，HPV31，HPV33，HPV34，HPV35，HPV36，HPV37，HPV38，HPV42，HPV43，HPV44，HPV45，HPV51，HPV52，HPV56，HPV58和HPV66)；牛(BPV1，BPV2，BPV3，BPV4)；狗(CoPV)；兔(CRPV)和鹿(DPV)。L2蛋白：指由乳头瘤病毒基因组编码的用于保护病毒DNA的次要内衣壳蛋白，又简称衣壳蛋白。本发明描述中使用的“L2蛋白”包括L2蛋白多肽分子的自然氨基酸全长序列、任何N-末端或C-末端截短或两端都经截短或修饰的多肽分子以及这些多肽分子的二聚体或多聚体。“L2蛋白”在本发明中包括来自下列按寄主划分的乳头瘤病毒株系：人(HPV1，HPV2，HPV3，HPV4，HPV5，HPV6，HPV7，HPV8，HPV9，HPV10，HPV11，HPV12，HPV13，HPV14，HPV15，HPV16，HPV17，HPV18，HPV19，HPV20，HPV21，HPV22，HPV23，HPV24，HPV25，HPV26，HPV27，HPV28，HPV31，HPV33，HPV34，HPV35，HPV36，HPV37，HPV38，HPV42，HPV43，HPV44，HPV45，HPV51，HPV52，HPV56，HPV58和HPV66)；牛(BPV1，BPV2，BPV3，BPV4)；狗(CoPV)；兔(CRPV)和鹿(DPV)。L1+L2蛋白：指由乳头瘤病毒基因组编码的用于保护病毒DNA的两种内外衣壳蛋白的组合形式，仍称衣壳蛋白。本发明描述中使用的“L1+L2蛋白”意指通过特定基因工程方法在原核细胞中表达的L1和L2蛋白以某一分子比例构成的组合形式，包括L1蛋白和L2蛋白多肽分子的自然氨基酸全长序列、任何N-末端或C-末端截短或两端都经截短或修饰的多肽分子以及这些多肽分子的二聚体、五聚体、六聚体或多聚体。“L1+L1蛋白”在本发明中包括来自下列按寄主划分的乳头瘤病毒株系：人(HPV1，HPV2，HPV3，HPV4，HPV5，HPV6，HPV7，HPV8，HPV9，HPV10，HPV11，HPV12，HPV13，HPV14，HPV15，HPV16，HPV17，HPV18，HPV19，HPV20，HPV21，HPV22，HPV23，HPV24，HPV25，HPV26，HPV27，HPV28，HPV31，HPV33，HPV34，HPV35，HPV36，HPV37，HPV38，HPV42，HPV43，HPV44，HPV45，HPV51，HPV52，HPV56，HPV58和HPV66)；牛(BPV1，BPV2，BPV3，BPV4)；狗(CoPV)；兔(CRPV)和鹿(DPV)。L1五聚体：L1蛋白在纯化过程中在给定条件下的一种聚合形式。L1五聚体由五个分子量相同的L1蛋白多肽分子单体组成。L1多聚体：L1蛋白纯化过程中在给定条件下的一种或多种聚合形式。L1五聚体又可为新的单位聚合形成含1、2、3、4、5、直到200个五聚体单位的多聚体。L1多聚体的其中一种形态在结构上是与乳头瘤病毒外观结构相似的类病毒颗粒(VLP)。L1+L2多聚体：外衣壳蛋白L1与内衣壳蛋白L2聚合形成的六聚体或多聚体。一个六聚体由一个L1五聚体和一个L2单体聚合形成。多个L1+L2六聚体可以相互结合形成多个六聚体的聚合体。该聚合体可含1、2、3、4、5、......直至200个六聚体，通称L1+L2多聚体。可溶性：本发明描述中“可溶”指通过原核表达产生的L1蛋白、L2蛋白纯化后的在常规的PBS缓冲液中经桌面离心机在10,000rpm下常温离心5分种后仍然留在上清液中。稳定性：本发明描述中“稳定”指制备的乳头瘤病毒衣壳蛋白当保存在摄氏4度、150mM的钠盐、0.1mMEDTA和中性酸碱度条件下48小时不被可能污染的蛋白酶所降解或变性。表达体系构建
原核表达乳头瘤病毒的工艺开始是以牛乳头瘤病毒4亚型(BPV-4)和人乳头瘤病毒16亚型(HPV16)L1蛋白为例发展起来的。后来证实该工艺也可用来表达和纯化其他乳头瘤病毒的L1蛋白、L2蛋白和L1+L2多聚体。
表达L1蛋白载体的构建部分地取决于对L1蛋白晶体通过X-衍射法所获得的蛋白结构数据信息的分析。有关的数据信息能构提供构成L1衣壳蛋白的氨基酸序列的空间折叠构象以及影响分子构象的重要或关键氨基酸残基及其位置。这些数据信息的大部分已经公开发表在有关学术期刊杂志上。
编码乳头瘤L1蛋白的核酸碱基序列可以通过常规分子生物学的克隆方法插入到一个原核表达载体。所表达的L1蛋白可以聚合形成可溶性多聚体。以人乳头瘤病毒衣壳蛋白表达为例，HPV蛋白的氨基酸序列以及编码L1蛋白的核酸序列可以通过数据库如GenBank，Swiss-prot，EMBL.PIR Protein Data Base，PDBProtein Data Bank，或从HPV序列库(http：//hpv-web.lanl.gov)得到。
一个L1表达构件包含有一个在所选择的细菌细胞里发挥功能的启动子。熟练的专业技术人员能够凭专业常识从大量的细胞特异性启动子中选择自己所需要的启动子。表达构建还包含在所选择细胞里发挥功能的mRNA转录启动和终止信号。表达构建还包含有编码目标乳头瘤病毒L1蛋白目标区段的核苷酸序列的片段。编码核苷酸位于启动子的下游。核酸转录在启动子部位起始。表达构建可以是线性也可以是闭环状以便自动复制。
L2蛋白表达体系可以用与上述相同的原理构建。同时也可以把L1与L2基因在适当位置连接构建成融合表达体系。
常规的多种细菌细胞可被用来表达目标蛋白或复制表达构件。稳定的细菌细胞包括大肠杆菌E.coli和Bacillus。L1蛋白更容易在E.coli中表达。构建好的表达构件可以通过任何常规分子生物学的的转移方式导入寄主细胞。表达产物纯化
为了方便纯化，L1蛋白可以以融合蛋白的方式表达，例如GST融合蛋白。但L1表达不限于与GST融合；它还可以与其他蛋白如热休克蛋白融合。表达融合蛋白的细胞被破碎之后，经过2.0mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM、5.5mM或6.0mM ATP处理和3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、4.5mM、5.0mM5.5mM、6.0mM或6.5mM镁粒子(Mg++)处理；或用2.8M脲素处理。两者也可同时处理。此处理方法是该工艺中重要步骤，用于解决他人未能解决的L1可溶性问题。在重组融合蛋白成功表达之后，可以通特定的工艺处理除去重组蛋白中混有的寄主细胞蛋白。这种处理可以通过任何已知的常规分子生物学方式进行。我们纯化原核表达的HPV16亚型L1蛋白的大致过程在图1显示。
L2蛋白表达后本身不容解于溶液中。但当L2与L1在同一细胞里表达、并用本发明的上述工艺处理之后，可溶性L1+L2六聚体便可提纯获得。
经纯化的L1五聚体在大于0.8M NaCl或酸碱度低于6时可以形成多聚体。多聚体的其中一种表形形式是类病毒颗粒(VLP)。
组成多聚体的L1蛋白可以是经过表达修饰的短截L1分子。例如，缺少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，或16个氨基酸的HPV16 L1截短蛋白可被用来形成L1多聚体。但为了可溶，所表达的HPV L1蛋白必须有至少由16-505氨基酸如组成。
在多聚体中的L1分子的梭基端可以是自然梭基也可以是截短多达30残基。确切的截断程度取决于L1蛋白的特定氨基酸序列。
本发明所涉及的L1、L2或L1+L2多聚体均可以作为疫苗的复合物。例如，HPV16亚型L1多聚体可以用来增强或引诱人体对HPV的免疫反应。使用本工艺技术所纯化的HPV组成特定L1多聚体的复合成份可用以检测其引诱免疫反应的能力。例如，此多聚体可以被用以注射诸如兔子和老鼠之类的实验动物，然后观察象抗体之类的免疫反应物的出现。象CTL这样的测试也可进行以确定某一特定L1多聚体的复合组分具有免疫原性。
本发明的免疫组分也包括一种生理上可接受的载体，包括(但不限于)能保持L1多聚体完整性的简单低浓度盐溶液，例如10mM NaCl，0.1mM EDTA；或者更大范围上讲，那些代谢缓慢的大分子如蛋白质、多糖、聚乳糖酸、聚甘油酸、复合氨基酸、以及失活病毒粒子等。药理上适用的盐也可在L1多聚体的复合物中使用。例如，矿物盐象盐酸盐，溴化盐、磷酸盐、硫酸盐等；有机盐类如乙酸盐、proprionates、甘露糖、苯甲酸等。复合物还包括液体，如水、生理盐水、甘油、酒精，以及其他一些物质如可湿剂、乳化剂、和pH缓冲剂。
多种方法可将HPV L1多聚体作为疫苗对人体使用，包括静脉、肌肉和皮下注射。本发明的疫苗复合物在能引发对L1蛋白免疫反应的有效剂量的范围使用。用于增强免疫反应的复合物的特定剂量依照L1复合物不同而变化。一般而言，L1多聚体的用量大约在1-500μg/kg体重之间。
上述剂量范围并不排除更高或更低剂量的可能。例如，具体的剂量会根据是否环伴有其他药物剂量而定，或取决于个人的药代动力学、药物积累和代谢速率。诊断检测
HPV L1多聚体可以用来产生对HPV L1蛋白有特异亲和力的抗体。这些抗体可以被用来直接检测生物样品中是否存在或与特定病理阶段相联系的特定HPV亚型。L1多聚体还能在免疫测定中用来检测生物样品中是否存在HPV病毒的抗体。
包括特异结合到L1蛋白的单链抗体在内的多克隆或单克隆抗体能够被业内人士用成熟的技术产生出来。这些由特异抗原例如HPV不同亚型引诱产生的抗体具有识别特定的HPV亚型的特异性。如HPV16和HPV18型。
利用抗体反应的免疫测定来检测L1蛋白包括ELISAs、Western blot、放射免疫测定、免疫组化测定、免疫沉淀、或其他方法。抗体和L1多聚体都可作为检测标记，例如酶联免疫、放射标记、荧光或化学荧光。
抗体或L1多聚体可以固定在某个固体支持物上，例如玻璃或塑料波片，组织培养板、多孔板、试管、交换拄、交换柱填充物、蛋白；或者颗粒上如微球体，包括但不限于乳胶、聚苯乙希或玻璃球；或者薄膜上如醋酸纤维或尼龙膜。偶联蛋白组分的方法业内熟知。只要不防碍抗体原抗体特异结合的能力，任何偶联方式都可使用。
生物样品可以是任何被怀疑含有HPV病毒的样品，例如组织活检、涂片、组织切样如皮肤、子宫、生殖上皮细胞、喉、上呼吸道、结膜、或口腔内组织。
特提供下述例证以便进一步说明本发明。该例证并不局限本发明的应用范围。
HPV L1五聚体的表达
我们在大肠杆菌里表达了HPV16型L1蛋白。我们观察到在大肠杆菌XA90株系所表达的L1多肽在含有10-505个氨基酸残基时(505是L1蛋白的C-末端)是可溶解的。可溶蛋白在桌面小离心机上离心10000rpm5分钟后仍然留在上清液中。由C-末端到第13残基止的L1多胎不可溶。
L1蛋白在表达时与GST蛋白联合组成了融合蛋白，结合点是一个对蛋白酶敏感的部位。其他可以酶切的融合方式也可使用。例如，C-末端融合的融合蛋白被用来表达HPV11型L1蛋白。过量表达的L1融合蛋白的主要留分与GroEL(大肠杆菌中协助蛋白折叠的一种蛋白)混合在一起。为纯化融合蛋白，细胞裂解物用2mM ATP，3.3M脲、5mM氯化镁处理，然后上样到谷光甘肽交换柱并用2.3M脲盐洗脱以除去GroEL。使用其他融合机制时，合适的其他亲和离子交换方法可以采用。交换柱在经缓冲液洗柱后，一种蛋白酶被用来切除融合在L1蛋白上的蛋白。L1蛋白最后被从交换柱上洗脱并经凝胶过滤进一步纯化。这个过程在用于纯化HPV16或HPV11亚型L1蛋白时可将L1蛋白纯化到无杂质的均质水平(图1)。
五.附图说明图1。蛋白质凝胶电泳显示纯化大肠杆菌表达的HPV16亚型GST-L1过程。纯化的L1蛋白可溶并稳定。图2。电镜照片显示纯化了的HPV16亚型L1五聚体及聚合形成的T＝1和T＝3的类病毒颗粒。图3。HPV16L1五聚体的三维结构。正面两个L1单体未显示以便观察。图4。ELISA结果显示小鼠经接种L1五聚体所引诱产生的抗HPV16-L1抗体。
Claims (8)
- 一.通过原核细胞特别是大肠杆菌表达和制备侵染人和重要经济动物的乳头瘤病毒(papilloma virus)L1或L2或L1+L2衣壳蛋白的技术方法，包括这些衣壳蛋白任何可溶性多聚体的技术方法。
- 二.权利要求一中的衣壳蛋白L1或L2或L1+L2的表达与制备包括以任何融合蛋白或非融合蛋白的方式原核表达的氨基酸自然全长序列或截短序列的L1和L2蛋白多肽，包括它们的任何形式的可溶性多聚体。
- 三.权利要求二中的L1或L2或L1+L2衣壳蛋白包括来自下列人乳头瘤病毒亚型或株系：HPV1，HPV2，HPV3，HPV4，HPV5，HPV6，HPV7，HPV8，HPV9，HPV10，HPV11，HPV12，HPV13，HPV14，HPV15，HPV16，HPV17，HPV18，HPV19，HPV20，HPV21，HPV22，HPV23，HPV24，HPV25，HPV26，HPV27，HPV28，HPV31，HPV33，HPV34，HPV35，HPV36，HPV37，HPV38，HPV42，HPV43，HPV44，HPV45，HPV51，HPV52，HPV56，HPV58，和HPV66；同时也包括来自下列动物乳头瘤病毒亚型或株系：牛(BPV1，BPV2，BPV3，BPV4)，狗(COPV)，兔(CRPV)和鹿(DPV)。
- 四.权利要求一、二、和三中所包含的L1或L2或L1+L2衣壳蛋白及其多聚体作为人体抗HPV病毒疫苗使用；用以预防和治疗任何HPV亚型侵染所引起的癌症或其他病变，包括子宫颈癌和梅毒。
- 五.权利要求一、二、和三中所包含的L1或L2或L1+L2衣壳蛋白及其多聚体作为牛、狗、兔或鹿等动物抗乳头瘤病毒的疫苗使用；用以预防和治疗由乳头瘤病毒侵染所引起的任何病变。
- 六.权利要求一、二、和三中所包含的L1或L2或L1+L2衣壳蛋白及其多聚体作为其他多种疫苗的研究和应用载体使用；通过蛋白质工程或基因工程将任何多肽抗原移植到L1蛋白上后制备成新的疫苗，用以预防和治疗人体与新疫苗相关的其他疾病。
- 七.权利要求一、二、和三中所包含的L1或L2或L1+L2衣壳蛋白及其多聚体作为免疫诊断抗原使用；用以检测生物样品中是否有抗乳头瘤病毒的抗体存在。
- 八.权利要求一、二、和三中所包含的L1或L2或L1+L2蛋白及其多聚体作为免疫原使用；用于在动物体或动物细胞系中诱发免疫反应并制备由特定免疫原所决定的特异性抗体，并用此类特异性抗体检测生物样品中是否带有乳头瘤病毒作为抗原存在。
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