CN101343315B - 截短的人乳头瘤病毒6型l1蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种截短的人乳头瘤病毒6型L1蛋白，及由其组成的类病毒颗粒，含该类病毒颗粒的疫苗及其在预防尖锐湿疣或HPV感染中的用途。

Description

截短的人乳头瘤病毒6型L1蛋白
技术领域
本发明涉及一种截短的人乳头瘤病毒6型L1蛋白，及由其组成的类病毒颗粒，含该类病毒颗粒的疫苗及其在预防尖锐湿疣或HPV(特别是HPV6)感染中的用途。
背景技术
人乳头瘤病毒HPV(Human Papillomavirus)属乳头多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)乳头瘤病毒属，为无包膜DNA病毒。病毒基因组为双链闭环DNA，大小约为7.2～8kb，具有8个开放框。基因组按功能的不同可以分为三个区域：①早期区(E)，约4.5kb，编码E1、E2、E4～E76个与病毒复制，转录及转化有关的非结构蛋白；②晚期区(L)，约2.5kb，编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2；③长调控区(LCR)，位于L区末端与E区起始端之间，长约800～900bp，不编码任何蛋白，含DNA复制、表达调控元件。病毒颗粒直径为45～55nm，核衣壳呈20面体对称，有72个壳微粒，由L1及L2组成。
目前已知的HPV约有90多种亚型，在人群中主要引起皮肤，粘膜的疣状病变。根据其与肿瘤发生的关系又可分为3组：①低或无致癌风险组，包括HPV6、11、39、41、42、43；②中度致癌风险组，包括HPV31、33、35、51、52；③高度癌风险组，包括HPV16、18、45、56。
根据流行病学调查肛生殖器粘膜的HPV例如HPV6，11的感染仅次于衣原体和滴虫病而居于第三位，是一种常见的性传播疾病。而其中由HPV6，11引起的病变占了总数的90％左右。在美国，女性生殖道HPV感染的高峰在15-25岁，并与感染者的性行为关系密切。在我国，女性HPV的感染率的高峰期在20-29岁之间，感染率为1606.1/10万。35岁以上的妇女HPV感染率逐渐降低。但是由于HPV感染大多是亚临床感染，感染率难以准确估计，但美国CDC的估计一生中累计HPV感染风险大约10％。此外由于采集大样本男性标本困难，且男性感染HPV造成后果没有女性严重，所以关于男性感染的资料较少。不过据估计，男性的感染率应当接近女性。而在美国，可见的尖锐湿疣见于1％的性活动期成年男性。因此，开发安全有效的HPV6，11疫苗是预防性传播疾病有效的有效手段。
HPV L1蛋白为主要衣壳蛋白，分子量为55～60kDa，是HPV疫苗主要靶蛋白。在多种表达系统中表达的HPV L1蛋白无需L2蛋白辅助即可形成在形态结构与天然病毒颗粒相似的类病毒颗粒(Virus-LikeParticle，VLP)。该种类病毒颗粒为二十面体立体对称结构，由72个L1蛋白的五聚体组成。其保留了病毒颗粒的天然表位，具有较强的免疫原性，可诱导针对同型HPV病毒的中和抗体。(Kirnbauer，R.，F.Booy，et al.1992Proc Natl Acad Sci U S A 89(24)：12180-4.)并且，类病毒颗粒并不带有病毒核酸，无潜在致癌危险，具有良好的安全性。因此，VLP疫苗已成为HPV疫苗发展的主要方向。
HPV VLP疫苗研制的关键是能够大量高效制备VLP样品。目前较为常用的表达系统可以分为真核表达系统及原核表达系统。
常用的真核表达系统有痘病毒表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统。在真核表达系统中所表达的HPV L1蛋白天然构象破坏少，能自发的形成VLP，往往只需进行简单的密度梯度离心即可得到纯化的VLP，为纯化工作提供极大的便利。但是由于真核表达系统的表达量低，培养成本高，给大规模工业化生产带来了极大困难。目前已上市HPV疫苗Gardasil
Figure S2008101113904D00021
采用了酿酒酵母表达系统，其表达量低，生产成本高，因此该产品价位偏高，影响其广泛应用。
原核表达系统中利用大肠杆菌表达系统表达HPVL1蛋白已有报道。例如有报道利用大肠杆菌表达HPV16L1蛋白(Banks，L.，G.Matlashewski，et al.(1987).J Gen Virol 68(Pt 12)：3081-9)。但是由于大肠杆菌所表达的HPV L1蛋白大多失去其天然构象，不能产生针对HPV的保护抗体。或者上述蛋白虽然通过包含体纯化，复性等步骤也可得到HPV VLP(Kelsall，S.R.and J.K.Kulski(1995).J Virol Methods 53(1)：75-90)，但是在复性过程中蛋白损失量大，得率低，难以在大规模生产上应用。HPV L1蛋白虽然也可以在大肠杆菌中以正确构象可溶性地表达，溶解于菌体的裂解上清中，但是表达量较低，而且上清中杂蛋白种类多且量大，要从中纯化出目的蛋白难度相当大。虽然也有文献报道通过GST融合表达的方式可以增加上清中L1蛋白的表达量，而且有助目的蛋白的纯化(Li，M.，T.P.Cripe，et al.(1997).J Virol 71(4)：2988-95.)，但融和蛋白的切割往往需要价格昂贵的酶，依然无法应用于大规模生产。
因此，本领域仍然需要具有低成本，能够诱导产生针对HPV保护性抗体的HPVL1蛋白及由其组成的类病毒颗粒，从而使大规模工业化生产尖锐湿疣疫苗成为可能。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的HPV6L1蛋白，及由其组成的类病毒颗粒及含该类病毒颗粒的疫苗。
本发明人经研究出人意料地发现，在大肠杆菌表达系统能得到可以诱导针对HPV6的中和抗体的截短HPV6L1蛋白，该截短的HPV6L1蛋白经纯化后得到高产率，纯度至少50％的HPVL1蛋白。纯化后的HPVL1蛋白经进一步处理得到可诱导针对HPV6保护性抗体的类病毒颗粒，本发明基于以上发明现已完成。
因此，本发明第一方面涉及一种(与野生型HPV6L1蛋白相比)N端截短了2个、3个、4个、或5个氨基酸的HPV6L1蛋白。优选该截短蛋白具有序列1、2、3、或4，优选序列1。
本发明再一方面涉及编码本发明截短蛋白的多核苷酸以及含有该多核苷酸的载体。
本发明再一方面涉及包含上述载体的细胞。
本发明还涉及包含上述截短蛋白或多核苷酸或载体或细胞的组合物。
本发明再一方面涉及一种HPV6类病毒颗粒，其中该类病毒颗粒包含N端截短了2个、3个、4个、或5个氨基酸的HPV6L1蛋白例如具有序列1、2、3、或4的HPV6L1蛋白，或者由N端截短了2个、3个、4个、或5个氨基酸的HPV6L1蛋白例如具有序列1、2、3、或4的HPV6L1蛋白组成或形成。
本发明再一方面涉及一种获得HPV6L1蛋白的方法，其包括在大肠杆菌表达系统中表达截短的HPV6L1基因片段，然后将含有该截短蛋白的裂解上清进行纯化处理。
在一个优选实施方案中，获得HPV6L1蛋白的方法包括
a)在大肠杆菌表达系统中表达截短的HPV6L1基因片段，
b)将表达了截短HPV6L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度100mM-600mM中破碎，分离得到上清液，
c)用水或低盐溶液将b)上清液中盐浓度降至100mM或以下，最低至0，收集沉淀，
d)将c)中沉淀在150mM-2500mM盐溶液中重新溶解，同时加入还原剂，分离得到溶液，其中含纯度至少50％的截短HPV6L1蛋白。
更一般性地，本发明还涉及一种获得HPVL1蛋白例如本发明HPV6L1蛋白的方法，其包括
a)在大肠杆菌表达系统中表达编码HPVL1蛋白的HPVL1基因，
b)将表达了HPVL1蛋白的大肠杆菌在盐浓度100mM-600mM中破碎，分离得到上清液，
c)用水或低盐溶液将b)上清液中盐浓度降至100mM或以下，最低至0，收集沉淀，
d)将c)中沉淀在150mM-2500mM盐溶液中重新溶解，同时加入还原剂，分离得到溶液，其中含纯度至少50％的HPVL1蛋白。
本发明还涉及一种预防尖锐湿疣或HPV感染的疫苗，其包含本发明的HPV6L1蛋白类病毒颗粒。优选该疫苗还包含至少一种选自HPV18L1蛋白类病毒颗粒，HPV11L1蛋白类病毒颗粒，HPV16L1蛋白类病毒颗粒，HPV31L1蛋白类病毒颗粒，HPV33L1蛋白类病毒颗粒，HPV45L1蛋白类病毒颗粒，HPV52L1蛋白类病毒颗粒，HPV58L1蛋白类病毒颗粒的类病毒颗粒。该疫苗通常还包含疫苗用赋形剂或载体。
优选地，所述疫苗含有：HPV6类病毒颗粒和HPV11类病毒颗粒，特别是，含有具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV6类病毒颗粒，和含有具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV11类病毒颗粒。更优选所述疫苗还含有HPV16类病毒颗粒和HPV18类病毒颗粒，特别是含有具有SEQID NO：8所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV16类病毒颗粒，和含有具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV18类病毒颗粒。
在一个特别优选的实施方案中，所述疫苗包含：含有具有SEQ IDNO：4所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV6类病毒颗粒，含有具有SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV11类病毒颗粒，含有具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV16类病毒颗粒，和含有具有SEQ IDNO：9所示氨基酸序列的蛋白质或者由该蛋白质形成的HPV18类病毒颗粒。
本发明进一步涉及本发明HPV6L1蛋白或其类病毒颗粒在制备用于预防尖锐湿疣或HPV感染疫苗中的用途。
本发明还涉及一种预防尖锐湿疣或HPV感染的方法，其包括将含预防有效量的本发明HPV6L1蛋白疫苗给予需预防尖锐湿疣或HPV感染的人或动物。
本发明还涉及一种获得HPV6L1蛋白类病毒颗粒的方法，其包括：
e)将纯度至少50％的截短HPV6L1蛋白进一步通过色谱层析纯化，
f)将e)步骤中得到的HPV6L1蛋白去除还原剂。
本发明还涉及一种制备用于预防尖锐湿疣或HPV感染疫苗的方法，其包括将上述类病毒颗粒与任选的一种或多种选自HPV11，16，18，31，33，45，52，和58的HPV型别的类病毒颗粒及疫苗用载体或者赋形剂混合。
本发明中相关术语的说明及解释
根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的，在此举例但不限于：GI698，ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。
根据本发明，术语“载体”一词指的是，可将某编码蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。
根据本发明，术语“截短的HPV6L1蛋白基因片段”是指在野生型HPV6L1蛋白基因(cDNA)的5’端或3’端去掉编码一个或者多个氨基酸的核苷酸，其中野生型HPV6L1蛋白基因全长序列举例但不限于NCBI数据库中如下序列：：AF067042.1，AF092932.1，L41216.1，X00203.1等。
“截短的HPV6L1蛋白”是指在野生型HPV6L1蛋白的N端和/或C端去掉一个或者多个氨基酸后的蛋白质，其中野生型HPV6L1蛋白的例子有但不限于NCBI数据库中AF067042.1，AF092932.1，L41216.1，X00203.1等所编码的全长L1蛋白。
根据本发明，术语“疫苗用赋形剂或载体“是指选自一种或多种，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂举例但不限于磷酸盐缓冲液，表面活性剂包括阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂。举例但不限于：Tween-80。佐剂举例但不限于氢氧化铝，氟氏完全佐剂。离子强度增强剂举例但不限于氯化钠。
根据本发明，术语“色谱层析“包括但不限于：离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析、亲和层析法。
根据本发明，本发明的截短HPV6L1蛋白优选如下获得：将表达有截短HPV6L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100-600mM，优选200-500mM的缓冲液中进行破碎，分离破碎溶液，得到上清液，用水或低浓度盐(通常低于破碎用的盐浓度)降低所得上清液中盐浓度至盐浓度100mM-0M，分离盐浓度低至100Mm-0的上清液中的沉淀；将沉淀在含还原剂及盐浓度150-2000mM优选200mM以上的溶液中重新溶解，分离，得到纯度至少为50％，优选至少70％，更优选至少80％的截短HPV6L1蛋白溶液。
根据本发明，在本发明获得的截短HPV6L1蛋白的方法中，缓冲液是指可在一定范围内维持pH值稳定的溶液，包括但不限于，Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。
根据本发明，所述原核宿主细胞破碎包括但不限于通过匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理中的一项或者多项方法来实现；
根据本发明，在本发明获得的截短HPV6L1蛋白的方法中，所用的盐包括但不限于是中性盐，特别是碱金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐，硫酸盐，碳酸氢盐，磷酸盐或磷酸氢盐，特别是NaCl、KCl、NH4Cl、(NH4)2SO4中的一种或几种。优选NaCl。所用的还原剂包括但不限于DTT，2-巯基乙醇。所用量包括但不限于10mM-100mM。
根据本发明，本发明的截短HPV6L1蛋白类病毒颗粒如下获得：将上述纯度至少50％的截短HPVL1蛋白溶液通过例如色谱层析进一步分离，得到纯化的截短HPV6L1蛋白溶液。去除纯化的截短HPV6L1蛋白溶液中的还原剂，得到截短HPV6L1的类病毒颗粒。去除还原剂的方式包括但不限于本领域已知技术，例如，透析，超滤或者层析等。
根据本发明，本发明的截短HPVL1蛋白优选具有序列1。
根据本发明，本发明的疫苗可采用患者可接受的形式，包括但不限于口服或者注射，优选注射。
根据本发明，本发明疫苗优选单位剂型使用，其中单位剂型中截短HPV6L1蛋白类病毒颗粒的量为5μg-80μg，优选20μg-40μg。
有益效果
目前HPV类病毒颗粒的制备所采用的表达系统可以分为真核表达系统和原核表达系统。
在真核表达系统中所表达的HPVL1蛋白天然构象破坏少，能自发的形成VLP，往往只需进行简单的纯化过程即可获得具有正确构象的VLP。但目前真核表达系统所采用的杆状病毒表达系统及酵母表达系统均有表达量低，培养成本高等缺陷，给大规模工业化生产带来了极大困难。
在原核表达系统中，大肠杆菌表达系统具有培养成本低，表达量大的优点。但在大肠杆菌表达系统中表达的HPVL1蛋白往往失去正确天然构象，以包含体形式表达于沉淀中。目前对表达于包含体中蛋白进行复性依然是一个世界性难题。复性困难，效率低下，使得从包含体中获得有正确构象的VLP在大规模生产中难以实施，只能局限于小规模的实验室研究中。虽然HPVL1也可以正确构象可溶性形式表达于大肠杆菌裂解上清中，但是表达量低下，而且要从大肠杆菌裂解上清中种类繁多的可溶性蛋白纯化出HPVL1蛋白也相当困难，往往需要借助融合表达及亲和层析等手段进行纯化，以上手段往往需要昂贵的酶，难以进行工业化生产。
本发明在大肠杆菌表达系统中表达N端截短HPV6L1蛋白，并且采用温和的手段选择性沉淀表达在大肠杆菌裂解上清中的HPV6L1蛋白，进一步采用含盐缓冲液重溶HPV6L1蛋白，使得在保持HPV6L1蛋白正确构象前提下使其纯度有了显著提高且重溶后的目的蛋白可以直接进行离子交换层析及疏水交换层析纯化获得纯蛋白。通过以上步骤获得纯化后的截短HPV6L1截短蛋白可以组装为类病毒颗粒，具有良好的免疫原性，可以诱导高滴度的针对HPV6的中和抗体，预防HPV6对人体的感染，是一种良好的疫苗形式。此外，本发明中采用的截短HPV6L1蛋白在保留全长HPV6L1蛋白的抗原性及颗粒组装能力的同时，易于在大肠杆菌表达系统中表达，所采用的纯化方法无需使用昂贵的酶，成本低廉。而且目的蛋白在纯化过程中构象没有经过剧烈的变性复性过程，损失小，可应用于大规模工业化生产。
在参考下列详述和附图后，本发明的这些和其它方面将是显然的。此处公开的所有参考文献在此均完整引用作为参考。
附图说明
图1显示了在本发明方法步骤a)-d)中HPV6N3C-L1蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。1，裂解上清；2，经过切向流沉淀的HPV6N3C-L1；3，经重悬液重悬的HPV6N3C-L1。结果显示，HPV6N3C-L1蛋白在通过沉淀，复溶的步骤之后，纯度达到了约70％左右。
图2显示了步骤d)中所得的HPV6N3C-L1进一步经本发明步骤e)纯化后的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。1，经本发明步骤e)纯化所得HPV6N3C-L1上样10μl；2，经本发明步骤e)纯化所得HPV6N3C-L1上样20μl。结果显示，经过步骤e)纯化的HPV6N3C-L1蛋白纯度达到了98％左右。
图3显示了步骤f)中所得的HPV6N3C-L1类病毒颗粒透射电镜观察(50,000倍)结果。视野中可见大量半径为25nm左右的类病毒颗粒，颗粒大小与理论大小相符，均匀一致。
图4显示了步骤f)中所得的HPV6N3C-L1类病毒颗粒的动态光散射观测结果。结果显示，HPV6N3C-L1类病毒颗粒的水化分子动力学半径为24.70nm，颗粒组装百分比为100％。
图5显示了HPV6N3C-L1类病毒颗粒接种羊后不同阶段血清中和抗体滴度。图中箭头所示为免疫时间。在初免一周后，中和抗体滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，中和抗体的滴度即能达到107-108的较高水平。
图6显示了HPV6N3C-L1类病毒颗粒接种兔后不同阶段血清中和抗体滴度。图中箭头所示为免疫时间。在初免一周后，中和抗体滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，中和抗体的滴度即能达到106的较高水平。
图7显示了实施例5中HPV6/11二价疫苗接种小鼠后不同时间的血清中HPV6，HPV11中和抗体滴度变化情况。免疫程序为0，2W(周)。第一次免疫后，HPV6，HPV11中和抗体滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，抗体的滴度即能达到1×104-1×105。
图8显示了实施例5中HPV6/11/16/18四价疫苗接种小鼠后不同时间的血清中HPV6，HPV11，HPV16，HPV18中和抗体滴度变化情况。免疫程序为0，2W(周)。第一次免疫后，HPV6，HPV11，HPV16，HPV18中和抗体滴度即有明显上升，在经过一次加强免疫后，抗体的滴度即能达到1×105-1×106。
图9显示了在本发明方法步骤a)-e)中N端分别截短了2个、4个、或5个氨基酸的HPV6L1蛋白HPV6N2C-L1、HPV6N4C-L1、HPV6N5C-L1(其氨基酸序列分别见SEQ ID NO：2、3、4)的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。1，分子量Marker；2，经本发明步骤a)-e)纯化所得HPV6N2C-L1上样10μl；3，经本发明步骤a)-e)纯化所得HPV6N4C-L1上样10μl；4，经本发明步骤a)-e)纯化所得HPV6N5C-L1上样10μl；结果显示，N端截短了2个、4个、或5个氨基酸的HPV6L1蛋白HPV6N2C-L1、HPV6N4C-L1、HPV6N5C-L1经过步骤a)-e)处理，蛋白纯度均达到了98％左右。
图10显示了经过步骤a)-f)所得的N端分别截短了2个、4个、或5个氨基酸的HPV6L1蛋白HPV6N2C-L1、HPV6N4C-L1、HPV6N5C-L1类病毒颗粒透射电镜观察(50,000倍)结果。1，经过步骤a)-f)所得的HPV6N2C-L1类病毒颗粒透射电镜观察(50,000倍)结果；2，经过步骤a)-f)所得的HPV6N4C-L1类病毒颗粒透射电镜观察(50,000倍)结果；3经过步骤a)-f)所得的HPV6N5C-L1类病毒颗粒透射电镜观察(50,000倍)结果；结果显示，视野中可见大量半径为25nm左右的类病毒颗粒，颗粒大小与理论大小相符，均匀一致。
图11显示了经过步骤a)-f)所得的N端分别截短了2个、4个、或5个氨基酸的HPV6L1蛋白HPV6N2C-L1、HPV6N4C-L1、HPV6N5C-L1类病毒颗粒的动态光散射观测结果。1，经过步骤a)-f)所得的HPV6N2C-L1类病毒颗粒动态光散射观测结果；2，经过步骤a)-f)所得的HPV6N4C-L1类病毒颗粒动态光散射观测结果；3，经过步骤a)-f)所得的HPV6N5C-L1类病毒颗粒动态光散射观测结果；结果显示，HPV6N2C-L1、HPV6N4C-L1、HPV6N5C-L1类病毒颗粒的水化分子动力学半径25nm左右，颗粒组装百分比为100％。
                   序列
Figure S2008101113904D00111
Figure S2008101113904D00121
Figure S2008101113904D00131
下面结合实施例对本发明进一步举例描述。这些实施例是非限制性的。
实施例1：具有序列1的截短HPV6L1蛋白的表达
用做模板之HPV6L1基因片段的制备
HPV-6L1基因全长由上海博亚公司合成。所合成的基因片段全长为1503bp，其序列为序列5。在此人工合成的HPV-6L1基因全长片段的基础上制备本发明截短HPV6L1蛋白之模板。
截短HPV6L1基因的非融合表达载体的构建
以前一步骤所合成的HPV6L1全长基因片段用做再次PCR反应的模板。以6N3F：5’-CAT ATg CCT AGC GAC AGC ACA GTA TA-3’(SEQID NO：10)为正向引物，其5’端引入限制性内切酶NdeI位点，NdeI位点序列为CAT ATG，ATG为大肠杆菌系统中的起始密码子；6CR：5′-GTC GAC TTA CCT TTT AGT TTT GGC GC-3′(SEQ ID NO：11)为反向引物，其5’端引入限制型内切酶SalI位点。在PCR热循环仪(Biometra T3)按照如下条件进行PCR反应：
Figure S2008101113904D00132
扩增得到1.5kb左右大小特异的DNA片段。将该PCR产物与商售的pMD 18-T载体(TAKARA公司生产)连接，经NdeI/SalI酶切鉴定，得到插入截短HPV6L1基因的阳性克隆pMD 18-T-HPV6N3C-L1。
在上海博亚生物工程公司，利用M13(+)/(-)引物，测得pMD18-T-HPV6N3C-L1质粒中插入的目的核苷酸序列为序列6，其编码的氨基酸序列即为序列1：该序列对应的蛋白质为为N端被截短3个氨基酸、C端未被截短的HPV6L1蛋白，命名为HPV6N3C-L1。
将上述的pMD 18-T-HPV6N3C-L1质粒，经NdeI/SalI酶切，获得截短的HPV6N3C-L1基因片段。再将该片段与经NdeI/SalI酶切的pTrxFus原核表达载体(购自Invitrogen公司)相连接，由于融合蛋白已被切除，在起始氨基酸Met之后紧接着目的蛋白，不带其他融合多肽。NdeI/SalI酶切鉴定得到插入L1蛋白基因片段的阳性表达克隆pTRX-HPV-6N3C-L1。取1μL的pTRX-HPV-6N3C-L1质粒(0.15mg/ml)转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌GI698((购自Invitrogen公司)，涂布于氨苄(终浓度100mg/ml，下同)抗性的固体CAA培养基(6g Na2HPO4，3g KH2PO4，0.5g NaCl，1g NH4Cl，20g酪蛋白水解物，0.095g MgCl2，1.5g琼脂粉溶解于900ml去离子水中，加入50％甘油20ml)，30℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含4mL氨苄抗性的液体IMC培养基之试管，25℃220转/分振荡培养10小时，从中取1mL菌液于-70℃冻干保存。
HPV6N3C-L1的大量表达
从-70℃中取出带有重组质粒pTRX-HPV6N3C-L1的大肠杆菌冻干菌种，接入氨苄抗性的50ml IMC液体培养基，200rpm，30℃，培养大约8小时，然后转接入10瓶500ml培养基中，每瓶接入5ml菌液，200rpm，30℃，摇瓶培养过夜。
主要仪器，上海保兴生物公司50升发酵罐
校正发酵罐pH电极，配制30升培养基装入发酵罐，121℃灭菌30分钟，校正溶氧电极，以灭菌后未通气前为零点，以发酵时通气后未接种前初始搅拌速度100rpm时为100％。
补料准备，酪蛋白水解物配制浓度为30％(30g溶至100ml)，葡萄糖50％(50g溶至100ml)，121℃灭菌20分钟。
第二天将10瓶种子液5升接入发酵罐中，温度30℃，PH值7.0，手动调节搅拌速度及通气量，维持溶氧在40％以上。
流加补料，将50％葡萄糖和30％酪蛋白水解物按溶质质量比2∶1的比例混合。
流加速度如下：
100％为25ml/min
第一小时：5％；
第二小时：10％；
第三小时：20％；
第四小时：40％；
第五小时以后60％
培养至菌浓度达到OD600大约10左右时将培养温度降至25℃加入4g色氨酸诱导培养4小时。终浓度大约为40左右(OD600)下罐，离心收集菌体大约2.5kg
IMC培养基配方如下(1升)：
  Na2HPO4   6g
  KH2PO4   3g
  NaCl   0.5g
  NH4Cl   1g
  酪蛋白水解物   20g
  MgCl2   0.095g
实施例2：纯度约70％的HPV6N3C-L1的获得
按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液pH7.2，300mMNaCl)的比例重悬菌体，采用APV均质机(An Invensys Group产品)以600bar压力破碎菌体5次。JA-14转头13500rpm(30000g)，离心15min，留取上清，通过10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，此时上清中HPV6N3C-L1的纯度约为10％。采用CENTRASETTE 5切向流装置(PALL产品)对上清进行透析，所用膜包截留分子量为30kDa，透析液为10mM磷酸缓冲液pH 6.0缓冲液，透析体积为三倍上清体积，运行时压力为0.5psi，流速为500mL/min，切向流速为200mL/min。透析充分后，JA-10转头(Beckman J25高速离心机)9500rpm(12000g)，20min离心收获沉淀，用1/10上清体积的10mM磷酸缓冲液pH7.0，10mM DTT，300mM NaCl重悬沉淀，搅拌30min。JA-14转头(Beckman J25高速离心机)，13500rpm(30000g)，离心20min，离心得上清，使用0.22μm孔径滤膜过滤样品，以该样品进行下一步的阳离子交换色谱纯化。取150μL过滤后样品，加入6X Loading Buffer 30μL。混匀，于80℃水浴10min后取10μL于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带，电泳结果见图1。通过SDS-PAGE分析可知HPV6N3C-L1蛋白在通过沉淀、复溶的步骤之后，目的蛋白得到了纯化和富集，纯度达到了约70％左右。
实施例3：HPV6N3C-L1的色谱纯化
HPV6N3C-L1的阳离子交换色谱纯化
仪器系统：GE Healthcare原Amershan Pharmacia公司生产的AKTA explorer 100型制备型液相色谱系统。
层析介质：SP Sepharose 4 Fast Flow。
柱体积：5.5cm×20cm。
缓冲液：20mM磷酸缓冲液pH7.0，10mM DTT
20mM磷酸缓冲液pH7.010mM DTT 2M NaCl。
流速：25mL/min
检测器波长：280nm
样品为3L纯度约为70％HPV6N3C-L1溶液
洗脱程序为：200mM NaCl洗脱杂蛋白，500mM NaCl洗脱目的蛋白，收集500mM NaCl洗脱产物，共获得HPV6N3C-L1纯化样品900mL。
HPV6N3C-L1的CHT-II(羟基磷灰石色谱)纯化
仪器系统：GE Healthcare原Amershan Pharmacia公司生产的AKTA explorer 100型制备型液相色谱系统。
层析介质：CHT-II(购自Bio-RAD)
柱体积：5.5cm×20cm
缓冲液：10mM磷酸缓冲液pH7.0，10mM DTT，0.5M NaCl。
流速：20mL/min。
检测器波长：280nm。
样品为：SP Sepharose 4 Fast Flow 500mM NaCl洗脱产物
洗脱程序为：直接收取含目的蛋白的穿透
收集穿透产物，获得纯化的HPV6N3C-L1样品1000mL。取经本实施例方法纯化的HPV6N3C-L1样品150μL，加入6X Loading Buffer 30μL混匀，于80℃水浴10min后取10μl于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min。随后以考马斯亮兰染色显示电泳条带，电泳结果见图2。由电泳结果可知，目的蛋白浓度约为0.7mg/ml，SDS-PAGE考染纯度大于98％。
实施例4：HPV6N3C-L1类病毒颗粒的组装
仪器系统为PALL生产的CENTRASETTE 5切向流系统；膜包截留分子量为30kDa；样品为实施例3所得HPV6N3C-L1 1000ml。
样品的浓缩：调节系统切向流速为50mL/min，浓缩样品至总体积为800mL。
样品的复性：以10L复性缓冲液(20mM PB pH 6.0，2mM CaCl2，2mMMgCl2，0.5M NaCl，0.003％Tween-80)充分交换样品缓冲液。切向流装置运行时压力为0.5psi，切向流速度为10mL/min，待复性缓冲液交换完后，改为储存缓冲液(20L PBS：20mM PB pH 6.5，0.5M NaCl)进行交换，交换体积为20L。运行时压力为0.5psi，切向流速为25mL/min。待所有液体交换完毕后，使用PALL 0.20μm滤器无菌过滤样品，即得HPV6N3C-L1类病毒颗粒，将其置于4℃保存备用。
实施例5：HPV6N3C-L1 VLP的形态学检测及其免疫原性测定
HPV6N3C-L1类病毒颗粒透射电镜观察
仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜，放大倍数为100,000倍。HPV6N3C-L1类病毒颗粒经2％磷钨酸pH7.0负染，固定于喷炭的铜网上进行观察。结果如图3，可见实施例4所得样品大量半径为25nm左右的类病毒颗粒，大小均匀，呈现为空心形态。
HPV6N3C-L1类病毒颗粒动态光散射观察
仪器为美国Protein Solutions公司生产的DynaPro MS/X型动态光散射仪(含温度控制器)，使用算法为Regulation算法。样品为实施例4所得样品。样品经0.22μm滤膜过滤后进行测量。测量结果见图4。结果显示HPV6N3C-L1 VLP的水化分子动力学半径为25.46nm。
HPV6假病毒中和细胞模型的建立
由于HPV难以在体外进行培养，而且HPV宿主特异性强，难以在人以外的宿主上繁殖，缺乏合适的动物模型。因此，为了能对HPV疫苗的免疫保护性进行快速评估，需要建立有效体外中和实验模型。
假病毒(pseudovirions)体外感染模型：利用了HPV VLP可非特异包装核酸的特性，通过在细胞内表达HPV的L1和L2蛋白，通过包裹细胞内的游离体病毒DNA或外源导入的报告质粒组成HPV假病毒。(Yeager，M.D，Aste-Amezaga，M.et al(2000)Virology(278)570-7)具体方法有重组病毒表达系统法及多质粒共转染方法。
本发明采用的多质粒共转染方法，并且针对HPV系统采取了如下的改进：建立了对293FT细胞的优化的磷酸钙转染方法，可获得高达90％以上的转染效率，有利于进行较大规模的生产。获得了密码子优化的HPV结构蛋白的表达质粒，其可在哺乳动物细胞中高效表达HPV L1和L2基因，有利于高效组装假病毒。
HPV假病毒的构建
用CsCl密度梯度离心方法分别纯化带有HPV6L1基因的质粒p6L1h、带有HPV6L2基因的质粒p6L2h、及带有绿色荧光蛋白基因的质粒pN31-EGFP(以上质粒由NIH的John T.Schiller教授馈赠)。CsCl密度梯度离心纯化质粒的方法参照《分子克隆：第三版》。简言之：将质粒转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落接种到500mL LB培养基中，37℃摇瓶培养16小时。9000g离心5min，收集菌体。每1000mL菌液收获的菌体，依次加入40mL溶液I(50mM葡萄糖，25mMTris-Cl(pH8.0)，10mM EDTA(pH＝8.0))和2mL RNase A(1μg/μL)，40mL溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)，48mL溶液III(5M乙酸钾60.0mL，冰乙酸11.5mL，去离子水28.5mL)。在冰上放置10min后，15000g，4℃离心20min，取上清与0.6倍体积的异丙醇混合，15000g离心30min，弃去上清，用70％乙醇洗沉淀1次，用TE溶解沉淀，测定DNA含量。在DNA溶液中溶入CsCl(每克DNA对应1.01g CsCl)，再溶入100uL 10mg/mL的溴化乙锭溶液，用Beckman NVT65转子，62000rpm，20℃离心10hr。用注射器针头收集闭环DNA区带，用等体积的异戊醇重复抽提4次。加入3倍体积的水和8倍体积的无水乙醇，20000g，4℃离心30min，收集DNA沉淀。75％酒精洗涤1次，用1mL TE溶解DNA沉淀。测定DNA溶液的浓度，分装成小份储存于-20℃。
纯化后的p6L1h、p6L2h、pN31-EGFP用磷酸钙方法共转染培育于10cm细胞培养皿中的293FT细胞(Invitrogen)。磷酸钙转染方法：将p6L1h、p6L2h、pN31-EGFP各40ug加入1mL的HEPES溶液(每50mL去离子水含有pH＝7.3的1M Hepes 125uL，4℃储存)和1mL的0.5mol/LCaCl2溶液的混合溶液，混合后逐滴加入2mL 2×HeBS溶液(0.28M NaCl(16.36g)，0.05M HEPES(11.9g)，1.5mM Na2HPO4(0.213g)，溶解于1000mL去离子水，pH＝6.96，-70℃储存)中，室温下静置1min后将混合液加入培养有293FT细胞的10cm细胞培养皿中，6hr后弃去原培养液，加入10mL完全培养液(invitrogen公司产品)。转染48hr后，弃去培养基，用PBS洗2次，将细胞刮下收集细胞，细胞计数，每108个细胞用1mL裂解液(0.25％Brij58，9.5mM MgCl2)重悬。裂解完成后，5000g离心10min，收集上清，加入5M NaCl(终浓度为850mM)，即为假病毒液，分装为小份后置于-20℃保存。
将293FT细胞(Invitrogen)铺于96孔细胞培养板中(1.5×104/孔)。5hr后进行中和实验，将待测的血清样品分别用10％DMEM进行连续倍比稀释，然后取50μL分别与50μL稀释于10％DMEM的上文制备的假病毒液(moi＝0.1)混合。4℃孵育1h后分别加入预铺有293FT细胞的96孔细胞培养板中，37℃培养72h后先用荧光观察确定各样品大概的中和滴度，再用流式细胞仪(EPICS XL，美国Beckman Coulter公司)检测各孔细胞的感染率，计算单抗或多抗血清的准确中和滴度。感染率为细胞样品在阳性区中的细胞数量百分率减去未感染的对照细胞样品在阳性区的数量百分率。
感染抑制率＝(1-阻断孔的感染率/未阻断孔的感染率)×100％。
抗体中和滴度的定义为：达到高于50％感染抑制率的最大稀释倍数。经50倍稀释后能达到50％以上感染抑制率的单抗或多抗被视为具有中和能力。
HPV6 VLP疫苗免疫动物的免疫保护性评价
兔：普通级，雌性，6～8周龄，购自广西省疾病预防与控制中心，并在该中心饲养。实施例4所制备的HPV6N3C-L1类病毒颗粒初免与等量福氏完全佐剂混合，加强免疫则与等量福氏不完全佐剂混合进行制备，免疫方式为肌肉注射，初次免疫剂量为100ug/只，此后分别于4，10周各加强一次，加强免疫剂量为50ug/只。自免疫后，每周抽取外周静脉血，分离血清，保存待检。
羊：普通级，雌性，6～8周龄，购自广西省疾病预防与控制中心，并在该中心饲养。实施例4所制备的HPV6N3C-L1类病毒颗粒初免与等量福氏完全佐剂混合，加强免疫则与等量福氏不完全佐剂混合进行制备，免疫方式为肌肉注射，初次免疫剂量为1mg/只，此后分别于4，10，18周各加强一次，加强免疫剂量为0.5mg/只。自免疫后，每周抽取外周静脉血，分离血清，保存待检。
以上述假病毒中和细胞模型实验评估上述抗血清的中和效价，如图5和6所示。结果表明，本发明实施例4获得的HPV6N3C-L1类病毒颗粒(除了实验中用到的福氏佐剂外，也可以是商用或自制的氢氧化铝或磷酸铝佐剂)混合配制成为疫苗，具有良好的免疫原性，可在动物体内诱导高滴度的中和抗体，可作为预防HPV感染的疫苗。
HPV6/11二价疫苗免疫小鼠的免疫保护性评价
免疫用动物为4-5周龄SPF级BALB/c小鼠4只。按本发明实施例1-4所述类似方法制备HPV6N5C-L1和HPV11N4C-L1类病毒颗粒。将上述2种类病毒颗粒：HPV6N5C-L1和HPV11N4C-L1按1∶2(重量比)的比例混合，使得混合后的上述两种类病毒颗粒的浓度为40，80μg/ml。之后，对于初免，再加入等体积的福氏完全佐剂与之混合均匀。加强免疫则与等体积福氏不完全佐剂混合进行制备。免疫方式为肌肉注射，初次免疫剂量为HPV6N5C-L1类病毒颗粒10μg/只，HPV11N4C-L1类病毒颗粒20μg/只。此后分别于2周加强一次，加强免疫剂量为HPV6N5C-L1类病毒颗粒20μg/只，HPV11N4C-L1类病毒颗粒40μg/只。自免疫后，每周抽取外周静脉血，分离血清，按实施例5所述方法分别检测免疫小鼠中针对HPV6，HPV11假病毒颗粒的中和抗体滴度。检测结果如图7所示，结果表明，由本发明实施例1-4所述方法获得的HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1两种类病毒颗粒混合而制备的HPV6、HPV11二价疫苗具有良好的免疫原性，可在动物体内诱导高滴度的针对HPV6，HPV11的中和抗体，可作为预防HPV6/HPV11感染的有效疫苗(除了实施例中所采用的福氏佐剂外，该疫苗也可由本发明所制备的HPV16N5C-L1，HPV11N4C-L1两种类病毒颗粒与商用或自制的氢氧化铝或磷酸铝佐剂混合而成)。
上述的HPV11N4C-L1类病毒颗粒对应的氨基酸序列为(SEQ IDNO：7)：
Figure S2008101113904D00211
Figure S2008101113904D00221
HPV6/11/16/18四价疫苗免疫小鼠的免疫保护性评价
免疫动物：4-5周龄SPF级BALB/c小鼠4只。按本发明实施例1-4所述类似方法制备HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1，和HPV18N65C-L1的类病毒颗粒。将上述4种类病毒颗粒：HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1，HPV18N65C-L1按1∶2∶2∶1(重量比)的比例混合，使得混合后的上述四种类病毒颗粒的浓度为40，80，80，40μg/ml。之后，对于初免，再加入等体积的福氏完全佐剂与之混合均匀。加强免疫则与等体积福氏不完全佐剂混合进行制备。免疫方式为肌肉注射，初次免疫剂量为HPV6N5C-L1，HPV18N65C-L1类病毒颗粒各10μg/只，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1类病毒颗粒各20μg/只。此后分别于2周加强一次，加强免疫剂量为HPV6N5C-L1，HPV18N65C-L1类病毒颗粒各20μg/只，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1类病毒颗粒各40μg/只。自免疫后，每周抽取外周静脉血，分离血清，按实施例5所述方法分别检测免疫小鼠中针对HPV6，HPV11，HPV16，HPV18假病毒颗粒的中和抗体滴度。检测结果如图8所示，结果表明，由本发明实施例1-4所述方法获得的HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1，HPV18N65C-L1种类病毒颗粒混合而制备的HPV6、HPV11、HPV16、HPV18四价疫苗具有良好的免疫原性，可在动物体内诱导高滴度的针对HPV6，HPV11，HPV16，HPV18的中和抗体，可作为预防HPV6/HPV11/HPV16/HPV18感染的有效疫苗(除了实施例中所采用的福氏佐剂外，该疫苗也可由本发明所制备的HPV6N5C-L1，HPV11N4C-L1，HPV16N30C-L1，HPV18N65C-L1种类病毒颗粒与商用或自制的氢氧化铝或磷酸铝佐剂混合而成)。
上述的HPV6N5C-L1类病毒颗粒的L1氨基酸序列见SEQ ID NO：4。
上述的HPV16N30C-L1类病毒颗粒的L1氨基酸序列为(SEQ IDNO：8)：
Figure S2008101113904D00231
Figure S2008101113904D00241
Figure S2008101113904D00251
上述的HPV18N65C-L1类病毒颗粒的L1氨基酸序列为(SEQ IDNO：9)：
Figure S2008101113904D00252
Figure S2008101113904D00261
上述的HPV11N4C-L1类病毒颗粒对应的氨基酸序列显示如上(SEQID NO：7)。
实施例6：
依据本发明实施例1-5所采用的技术，制备具有序列2，3，4的截短HPV6L1蛋白，以上截短蛋白均可纯化得到纯度达到98％以上的蛋白，组装为半径25nm左右的类病毒颗粒。结果见图9、图10和图11。
                    序列表
Figure S2008101113904D00281
Figure S2008101113904D00291
Figure S2008101113904D00301
Figure S2008101113904D00311
Figure S2008101113904D00331
Figure S2008101113904D00341
Figure S2008101113904D00351
Figure S2008101113904D00371
Figure S2008101113904D00381
Figure S2008101113904D00391
Figure S2008101113904D00401

Claims (19)

1.N端截短了2个、3个、4个、或5个氨基酸的HPV6L1蛋白。
2.权利要求1的蛋白，其氨基酸序列是序列1、2、3、或4。
3.权利要求1的蛋白，其氨基酸序列是序列1。
4.编码权利要求1-3任一项的蛋白的多核苷酸。
5.包含权利要求4的多核苷酸的载体。
6.包含权利要求5的载体的细胞。
7.包含权利要求1-3任一项的蛋白的组合物。
8.一种HPV6类病毒颗粒，其中该类病毒颗粒含有权利要求1-3任一项的蛋白或者由权利要求1-3任一项的蛋白形成。
9.一种制备权利要求1-3任一项的蛋白的方法，其包括
a)在大肠杆菌表达系统中表达编码HPV L1的HPV L1基因，
b)将表达了HPV L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度100mM-600mM中破碎，分离得到上清液，
c)用水或低盐溶液将b)上清液中盐浓度降至100mM或以下，最低至0，收集沉淀，
d)将c)中沉淀在150mM-2500mM盐溶液中重新溶解，同时加入还原剂，分离得到溶液，其中含纯度至少50％的HPV L1蛋白。
10.一种用于预防尖锐湿疣或HPV感染的疫苗，其包含：(1)权利要求8的HPV6类病毒颗粒，(2)可有可无的至少一种选自11，16，18，31，33，45，52，和58型别的HPV类病毒颗粒，及(3)疫苗用赋形剂或载体。
11.权利要求10的疫苗，其中所述至少一种是2、3或4种。
12.权利要求10的疫苗，其中所述可有可无的至少一种选自11，16，18，31，33，45，52，和58型别的HPV类病毒颗粒是HPV L1类病毒颗粒。
13.权利要求10的疫苗，其中所述疫苗含有HPV6类病毒颗粒和HPV11类病毒颗粒。
14.权利要求13的疫苗，其中所述HPV6类病毒颗粒和HPV11类病毒颗粒是含有其氨基酸序列是SEQ ID NO：4的蛋白质的HPV6类病毒颗粒和含有其氨基酸序列是SEQ ID NO：7的蛋白质的HPV11类病毒颗粒。
15.权利要求13或14的疫苗，其中所述疫苗还含有HPV16类病毒颗粒和HPV18类病毒颗粒。
16.权利要求15的疫苗，其中所述HPV16类病毒颗粒和HPV18类病毒颗粒是含有其氨基酸序列是SEQ ID NO：8的蛋白质的HPV16类病毒颗粒和含有其氨基酸序列是SEQ ID NO：9的蛋白质的HPV18类病毒颗粒。
17.权利要求1-3任一项的蛋白或权利要求8的类病毒颗粒在制备用于预防尖锐湿疣或HPV感染的疫苗中的用途。
18.获得HPV6 L1蛋白类病毒颗粒的方法，其包括：
e)将纯度至少50％的权利要求1或2或3的HPV6 L1蛋白进一步通过色谱层析纯化，
f)将e)步骤中得到的HPV6 L1蛋白去除还原剂。
19.制备用于预防尖锐湿疣或HPV感染疫苗的方法，其包括将权利要求8的类病毒颗粒与任选的一种或多种选自HPV11，16，18，31，33，45，52，和58的HPV型别的类病毒颗粒及疫苗用载体或者赋形剂混合。
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