CN106831960B

CN106831960B - 一种人乳头瘤病毒6型l1蛋白的突变体

Info

Publication number: CN106831960B
Application number: CN201611095710.2A
Authority: CN
Inventors: 李少伟; 王大宁; 李智海; 范飞; 郑清炳; 夏宁邵
Original assignee: Xiamen University; Xiamen Innovax Biotech Co Ltd
Current assignee: Xiamen University; Xiamen Innovax Biotech Co Ltd
Priority date: 2015-12-04
Filing date: 2016-12-02
Publication date: 2019-11-05
Anticipated expiration: 2036-12-02
Also published as: CN106831960A

Abstract

本发明涉及一种突变的HPV6 L1蛋白(或其变体)，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白(或其变体)和病毒样颗粒能够诱发抗至少两个型别的HPV(例如，HPV6和HPV11)的中和抗体，从而可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。

Description

一种人乳头瘤病毒6型L1蛋白的突变体

技术领域

本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体地，本发明涉及一种突变的HPV6 L1蛋白(或其变体)，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白(或其变体)和病毒样颗粒能够诱发抗至少两个型别的HPV(例如，HPV6和HPV11)的中和抗体，从而可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗可用于预防所述至少两个型别的HPV感染以及由所述感染所导致的疾病，例如宫颈癌和尖锐湿疣。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)主要引起皮肤和粘膜的疣状病变。根据其与肿瘤发生的关系，HPV可分为高危型与低危型，其中高危型的HPV感染被证实是诱发包括女性宫颈癌在内的生殖器癌症的主要原因；低危型则主要引起尖锐湿疣。预防与控制HPV感染的最有效方式是施用HPV疫苗，特别是针对能引起宫颈癌的高危型HPV的疫苗。

HPV的主要衣壳蛋白L1具有自组装为空心病毒样颗粒(Virus-Like Particle,VLP)的特性。HPV VLP是由72个主要衣壳蛋白L1的五聚体构成的20面体立体对称结构(Doorbar,J.and P.H.Gallimore.1987.J Virol,61(9):2793-9)。HPV VLP的结构与天然HPV高度相似，保留了天然病毒的绝大多数中和表位，可诱导高滴度的中和抗体(Kirnbauer，R.，F.Booy，et al.1992.Proc Natl Acad Sci U S A 89(24):12180-4)。

然而，现有的研究显示，HPV VLP主要诱导针对同型HPV的中和抗体，产生针对同型HPV的保护性免疫，而仅在一些同源性高的型别之间存在低的交叉保护作用(SaraL.Bissett,Giada Mattiuzzo,et al.2014.Vaccine.32:6548-6555)。因此，现有的HPV疫苗的保护范围非常有限。通常，一个型别的HPV VLP只能用于预防该型别的HPV感染。在这种情况下，如果要扩大HPV疫苗的保护范围，那就只能在疫苗中增加更多型别的HPV VLP。目前已上市的HPV疫苗，包括Merck公司的(其为针对HPV16，18，6和11的四价疫苗)，GSK公司的(其为针对HPV16，18的二价疫苗)和Merck公司的9(其为九价疫苗)，均是通过混合多个型别的HPV VLP而制成。然而，这种方案将导致HPV疫苗的生产成本大大提高，并且可能因为免疫剂量的增加而导致潜在的安全性问题。

因此，本领域需要开发能够诱导针对多个型别的HPV的保护性中和抗体的HPV病毒样颗粒，以更经济、有效地预防多个型别的HPV感染和由此导致的疾病，例如宫颈癌和尖锐湿疣。

发明内容

本发明至少部分基于发明人的下述出人意料的发现：将人乳头瘤病毒(HPV)6型L1蛋白中的特定区段置换为第二型别的HPV(例如HPV11)L1蛋白的相应区段后，所获得的突变的HPV6 L1蛋白能够诱导机体产生针对HPV6和第二型别的HPV(例如HPV11)的高滴度中和抗体，其保护效果与混合的HPV6 VLP和第二型别的HPV VLP相当，并且针对HPV6的保护效果与单独的HPV6 VLP相当，且针对第二型别的HPV(例如HPV11)的保护效果与单独的第二型别的HPV VLP相当。

因此，在一个方面，本发明提供了一种突变的HPV6 L1蛋白或其变体，其中，所述突变的HPV6 L1蛋白与野生型HPV6 L1蛋白相比，具有下述突变：

(1)N端截短了2-5个氨基酸，例如2个、3个、4个、或5个氨基酸；和

(2)位于野生型HPV6 L1蛋白第119-139位的氨基酸残基被替换为第二型别的野生型HPV L1蛋白的相应位置的氨基酸残基；

并且，所述变体与所述突变的HPV6 L1蛋白相异仅在于一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)氨基酸的置换(优选保守置换)、添加或缺失，且保留了所述突变的HPV6 L1蛋白的功能，即，能够诱导针对至少两个型别的HPV(例如，HPV6和HPV11)的中和抗体。

在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV6 L1蛋白与野生型HPV6 L1蛋白相比，N端截短了2个、3个、4个、或5个氨基酸。

在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV6 L1蛋白与野生型HPV6 L1蛋白相比，N端截短了5个氨基酸。

在某些优选的实施方案中，所述第二型别的野生型HPV为HPV11。在某些优选的实施方案中，(2)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV11 L1蛋白第119-140位的氨基酸残基。

在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV6 L1蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV11 L1蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

在某些优选的实施方案中，所述野生型HPV11 L1蛋白第119-140位的氨基酸残基的序列如SEQ ID NO:35所示。

在某些优选的实施方案中，所述突变的HPV6 L1蛋白具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码如上所述的突变的HPV6 L1蛋白或其变体。在另一个方面，本发明提供了一种载体，其包含所述分离的核酸。在某些优选的实施方案中，本发明的分离的核酸具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。

可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等等。

在另一个方面，本发明还涉及包含上述分离的核酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。

在另一个方面，本发明涉及一种HPV病毒样颗粒，其中该病毒样颗粒含有本发明的突变的HPV6 L1蛋白或其变体，或者由本发明的突变的HPV6 L1蛋白或其变体组成或形成。

在某些优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV6 L1蛋白，其与野生型HPV6 L1蛋白相比，N端截短了2-5个氨基酸，例如2个、3个、4个、或5个氨基酸，并且位于野生型HPV6 L1蛋白第119-139位的氨基酸残基被替换为野生型HPV11 L1蛋白第119-140位的氨基酸残基。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的HPV病毒样颗粒包含突变的HPV6 L1蛋白，其具有SEQ ID NO:6所示的序列。

在另一个方面，本发明还涉及包含上述突变的HPV6 L1蛋白或其变体，或上述分离的核酸或载体或宿主细胞或HPV病毒样颗粒的组合物。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的突变的HPV6 L1蛋白或其变体。在某些优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的HPV病毒样颗粒。

在另一个方面，本发明还涉及一种药物组合物或疫苗，其包含本发明的HPV病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。本发明的药物组合物或疫苗可以用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病例如宫颈癌和尖锐湿疣。

在某些优选的实施方案中，所述HPV病毒样颗粒以预防HPV感染或由HPV感染导致的疾病的有效量存在。在某些优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV6感染和/或HPV11感染)。在某些优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病选自宫颈癌和尖锐湿疣。

本发明的药物组合物或疫苗可通过本领域公知的方法进行施用，例如但不限于通过口服或者注射进行施用。在本发明中，特别优选的施用方式是注射。

在某些优选的实施方案中，本发明的药物组合物或疫苗以单位剂量形式进行施用。例如但不意欲限定本发明，每单位剂量中包含的HPV病毒样颗粒的量为5μg－80μg，优选20μg－40μg。

在另一个方面，本发明涉及一种制备如上所述的突变的HPV6 L1蛋白或其变体的方法，其包括，在宿主细胞中表达所述突变的HPV6 L1蛋白或其变体，然后从所述宿主细胞的培养物中回收所述突变的HPV6 L1蛋白或其变体。

在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

在某些优选的实施方案中，所述方法包括步骤：在大肠杆菌中表达所述突变的HPV6 L1蛋白或其变体，然后从所述大肠杆菌的裂解上清中纯化得到所述突变的HPV6 L1蛋白或其变体。在某些优选的实施方案中，通过色谱法(例如，阳离子交换色谱，羟基磷灰石色谱和/或疏水相互作用色谱)，从所述大肠杆菌的裂解上清中回收所述突变的HPV6 L1蛋白或其变体。

在另一个方面，本发明涉及一种制备疫苗的方法，其包括将本发明的HPV病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合。

在另一个方面，本发明涉及一种预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病的方法，其包括将预防有效量的根据本发明的HPV病毒样颗粒或药物组合物或疫苗施用给受试者。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV6感染和/或HPV11感染)。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，宫颈癌和尖锐湿疣。在另一个优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在另一个方面，还涉及根据本发明的突变的HPV6 L1蛋白或其变体或HPV病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是一个或多个型别的HPV感染(例如，HPV6感染和/或HPV11感染)。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，宫颈癌和尖锐湿疣。

本发明中相关术语的说明及解释

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

根据本发明，术语“第二型别的野生型HPV”是指，不同于HPV6的另一型别的野生型HPV。在本发明中，第二型别的野生型HPV优选为野生型HPV11。

根据本发明，表述“相应位置”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中的等同位置。

根据本发明，术语“野生型HPV6 L1蛋白”是指，天然存在于人乳头瘤病毒6型(HPV6)中的主要衣壳蛋白L1。野生型HPV6 L1蛋白的序列是本领域公知的，并且可参见各种公共数据库(例如NCBI数据库登录号AF067042.1，AF092932.1，L41216.1，XOO203.1等所编码的HPV6 L1蛋白)。

在本发明中，当提及野生型HPV6 L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO：1所示的序列来进行描述。例如，表述“野生型HPV6 L1蛋白的第119-139位氨基酸残基”是指，SEQID NO：1所示的多肽的第119-139位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，野生型HPV6可包括多种分离株，并且各种分离株的L1蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。进一步，本领域技术人员理解，尽管可能存在着序列差异，但是HPV6的不同分离株的L1蛋白在氨基酸序列上具有极高的同一性(通常高于95％，例如高于96％，高于97％，高于98％，或高于99％)，并且具有实质上相同的生物学功能。因此，在本发明中，术语“野生型HPV6 L1蛋白”不仅包括SEQ ID NO:1所示的蛋白，而且应包括各种HPV6分离株的L1蛋白(例如NCBI数据库登录号AF067042.1，AF092932.1，L41216.1，XOO203.1等所编码的HPV6 L1蛋白)。并且，当描述野生型HPV6 L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：1的序列片段，还包括各种HPV6分离株的L1蛋白中的相应序列片段。例如，表述“野生型HPV6 L1蛋白的第119-139位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：1的第119-139位氨基酸残基，以及各种HPV6分离株的L1蛋白中的相应片段。

根据本发明，术语“野生型HPV11 L1蛋白”是指，天然存在于人乳头瘤病毒11型(HPV11)中的主要衣壳蛋白L1。野生型HPV11 L1蛋白的序列是本领域公知的，并且可参见各种公共数据库(例如NCBI数据库登录号M14119.1，AF335603.1，AF335602.1等所编码的HPV11 L1蛋白)。

在本发明中，当提及野生型HPV11 L1蛋白的氨基酸序列时，参照SEQ ID NO：2所示的序列来进行描述。例如，表述“野生型HPV11 L1蛋白的第119-140位氨基酸残基”是指，SEQID NO：2所示的多肽的第119-140位氨基酸残基。然而，本领域技术人员理解，野生型HPV11可包括多种分离株，并且各种分离株的L1蛋白的氨基酸序列之间可能存在着差异。进一步，本领域技术人员理解，尽管可能存在着序列差异，但是HPV11的不同分离株的L1蛋白在氨基酸序列上具有极高的同一性(通常高于95％，例如高于96％，高于97％，高于98％，或高于99％)，并且具有实质上相同的生物学功能。因此，在本发明中，术语“野生型HPV11 L1蛋白”不仅包括SEQ ID NO:2所示的蛋白，而且应包括各种HPV11分离株的L1蛋白(例如NCBI数据库登录号M14119.1，AF335603.1，AF335602.1等所编码的HPV11 L1蛋白)。并且，当描述野生型HPV11 L1蛋白的序列片段时，其不仅包括SEQ ID NO：2的序列片段，还包括各种HPV11分离株的L1蛋白中的相应序列片段。例如，表述“野生型HPV11 L1蛋白的第119-140位氨基酸残基”包括，SEQ ID NO：2的第119-140位氨基酸残基，以及各种HPV11分离株的L1蛋白中的相应片段。

根据本发明，表述“相应序列片段”或“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。

根据本发明，表述“N端截短了X个氨基酸”是指，用起始密码子(用于起始蛋白质翻译)编码的甲硫氨酸残基置换蛋白质N末端的第1-X位氨基酸残基。例如，N端截短了5个氨基酸的HPV6 L1蛋白是指，用起始密码子编码的甲硫氨酸残基置换野生型HPV6 L1蛋白N末端的第1-5位氨基酸残基所获得的蛋白质。

根据本发明，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与本发明的突变的HPV6L1蛋白(如SEQ ID NO：6所示的蛋白)的氨基酸序列相比，具有一个或几个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)氨基酸的置换(优选保守置换)、添加或缺失，或者具有至少90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性，并且其保留了所述突变的HPV6 L1蛋白的功能。在本发明中，术语“突变的HPV6 L1蛋白的功能”是指：能够诱导机体产生针对至少两个型别的HPV(例如，HPV6和HPV11)的中和抗体。术语“同一性”是对核苷酸序列或氨基酸序列的相似性的量度。通常将序列排列起来，以获得最大限度的匹配。“同一性”本身具有本领域公知的意义并且可用公开的算法(例如BLAST)来计算。

根据本发明，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的必要特性的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，保守置换通常是指，用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。

根据本发明，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸所编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质粒等等。

根据本发明，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:MackPublishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

根据本发明，术语“有效量”是指能够有效实现预期目的的量。例如，预防疾病(例如HPV感染)有效量是指，能够有效预防，阻止，或延迟疾病(例如HPV感染)的发生的量。测定这样的有效量在本领域技术人员的能力范围之内。

根据本发明，术语“色谱层析”包括但不限于：离子交换色谱(例如阳离子交换色谱)、疏水相互作用色谱、吸附层析法(例如羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤(凝胶排阻)层析、亲和层析法。

根据本发明，术语“裂解上清”是指通过下述步骤所产生的溶液：将宿主细胞(例如大肠杆菌)在裂解液中破碎，然后将含有经破碎的宿主细胞的裂解液中的不溶物去除。各种裂解液是本领域技术人员公知的，包括但不限于Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。此外，可通过本领域技术人员熟知的各种方法来实现宿主细胞的破碎，包括但不限于匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理等等。去除裂解液中的不溶物的方法也是本领域技术人员公知的，包括但不限于过滤和离心。

发明的有益效果

研究表明，虽然HPV6和其他型别的HPV(例如HPV11)之间存在一定的交叉保护，但是这种交叉保护的能力很低，通常低于自身型别的VLP的保护水平的百分之一，甚至低于千分之一。因此，对于接种了HPV6疫苗的受试者来说，其感染其他型别的HPV(例如HPV11)的风险依然很高。

本发明提供了一种突变的HPV6 L1蛋白以及由其形成的HPV病毒样颗粒。本发明的HPV病毒样颗粒能够在HPV6和其他型别的HPV(例如HPV11)之间提供显著的交叉保护能力。特别地，在同等免疫剂量下，本发明的HPV病毒样颗粒能够诱发机体产生针对至少两个型别的HPV(例如，HPV6和HPV11)的高滴度中和抗体，并且其效果与多个型别的HPV VLP的混合物(例如，HPV6 VLP和HPV11 VLP的混合物)相当。因此，本发明的HPV病毒样颗粒能够用于同时预防至少两个型别的HPV(例如，HPV6和HPV11)的感染以及与此相关的疾病，具有显著的有利技术效果。这在扩大HPV疫苗的保护范围和降低HPV疫苗的生产成本等方面具有特别显著的优势。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。

附图说明

图1显示了实施例1中经纯化的突变蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M：蛋白分子量标记；泳道1:HPV6N5(N端截短了5个氨基酸的HPV6 L1蛋白)；泳道2:H6N5-11T1；泳道3:H6N5-11T2；泳道4:H6N5-11T3；泳道5:H6N5-11T4；泳道6:H6N5-11T5。结果显示，经过色谱纯化后，蛋白H6N5-11T1、H6N5-11T2、H6N5-11T3、H6N5-11T4和H6N5-11T5的纯度达到95％以上。

图2A-2F显示了HPV6N5 VLP、H6N5-11T1 VLP、H6N5-11T2 VLP、H6N5-11T3 VLP、H6N5-11T4 VLP和H6N5-11T5 VLP的沉降速率分析的结果。图2A，HPV6N5 VLP；图2B，H6N5-11T1 VLP；图2C，H6N5-11T2 VLP；图2D，H6N5-11T3 VLP；图2E，H6N5-11T4 VLP；图2F，H6N5-11T5 VLP。结果显示，H6N5-11T1 VLP、H6N5-11T2 VLP、H6N5-11T3 VLP、H6N5-11T4 VLP和H6N5-11T5 VLP的沉降系数分别为136S、109S、113S、109S和108S。这表明，如上制备的5种突变的HPV6 L1蛋白各自能够组装成大小、形态与野生型VLP(HPV6N5 VLP，99.5S)相似的病毒样颗粒。

图3A-3F显示了各种VLP样品的透射电镜观察结果(放大倍数为100,000倍，Bar＝0.1μm)。图3A，HPV6N5 VLP；图3B，H6N5-11T1 VLP；图3C，H6N5-11T2 VLP；图3D，H6N5-11T3VLP；图3E，H6N5-11T4 VLP；图3F，H6N5-11T5 VLP。结果显示，H6N5-11T1、H6N5-11T2、H6N5-11T3、H6N5-11T4和H6N5-11T5与HPV6N5类似，都能够组装成半径为25nm左右的VLP。

图4A-4F显示了HPV6N5、H6N5-11T1、H6N5-11T2、H6N5-11T3、H6N5-11T4和H6N5-11T5所形成的VLP的热稳定性评价的结果。图4A，HPV6N5 VLP；图4B，H6N5-11T1 VLP；图4C，H6N5-11T2 VLP；图4D，H6N5-11T3 VLP；图4E，H6N5-11T4 VLP；图4F，H6N5-11T5 VLP。结果显示，各个蛋白所形成的VLP均具有极高的热稳定性。

图5显示了实验组H6N5-11T1、H6N5-11T2、H6N5-11T3、H6N5-11T4和H6N5-11T5与对照组HPV6N5 VLP、HPV11N4 VLP和HPV6/11双价疫苗在小鼠体内的免疫保护性的评价结果。结果显示，H6N5-11T2 VLP可在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV6和HPV11的中和抗体；并且其针对HPV6的保护效果与单独的HPV6N5 VLP、混合的HPV6/HPV11 VLP相当，且显著高于单独的HPV11N4 VLP；并且其针对HPV11的保护效果与单独的HPV11N4 VLP、混合的HPV6/HPV11VLP相当，且显著高于单独的HPV6N5 VLP。结果表明，H6N5-11T2 VLP可用作预防HPV6感染和HPV11感染的有效疫苗，可用于代替含有HPV6 VLP和HPV11 VLP的混合疫苗。

图6A-6B显示了用H6N5-11T2 VLP免疫小鼠后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价结果。图6A：铝佐剂组1(免疫剂量为10μg，使用铝佐剂)；图6B：铝佐剂组2(免疫剂量为1.0μg，使用铝佐剂)。结果显示，H6N5-11T2 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV6的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV6N5 VLP、混合的HPV6/HPV11 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV11N4 VLP；并其能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV11的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV11N4 VLP、混合的HPV6/HPV11 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV6N5 VLP。这表明，H6N5-11T2 VLP对HPV6和HPV11具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。

序列信息

本发明涉及的部分序列的信息提供于下面的表1中。

表1：序列的描述

SEQ ID NO:	描述
		1	野生型HPV6 L1蛋白
2	野生型HPV11 L1蛋白
		3	N端截短了5个氨基酸的HPV6 L1蛋白，HPV6N5
4	N端截短了4个氨基酸的HPV11 L1蛋白，HPV11N4
		5	含有HPV11 L1蛋白的区段1的突变的HPV6 L1蛋白，H6N5-11T1
6	含有HPV11 L1蛋白的区段2的突变的HPV6 L1蛋白，H6N5-11T2
		7	含有HPV11 L1蛋白的区段3的突变的HPV6 L1蛋白，H6N5-11T3
8	含有HPV11 L1蛋白的区段4的突变的HPV6 L1蛋白，H6N5-11T4
		9	含有HPV11 L1蛋白的区段5的突变的HPV6 L1蛋白，H6N5-11T5
10	编码SEQ ID NO:3的DNA序列
		11	编码SEQ ID NO:4的DNA序列
12	编码SEQ ID NO:5的DNA序列
		13	编码SEQ ID NO:6的DNA序列
14	编码SEQ ID NO:7的DNA序列
		15	编码SEQ ID NO:8的DNA序列
16	编码SEQ ID NO:9的DNA序列
		35	野生型HPV11 L1蛋白第119-140位的氨基酸残基的序列

序列1(SEQ ID NO:1)：

MWRPSDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVTRTNIFYHASSSRLLAVGHPYFSIKRANKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPFLNKYDDVENSGSGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGKQCTNTPVQAGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPIDICGTTCKYPDYLQMAADPYGDRLFFFLRKEQMFARHFFNRAGEVGEPVPDTLIIKGSGNRTSVGSSIYVNTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCASVTTSSTYTNSDYKEYMRHVEEYDLQFIFQLCSITLSAEVVAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKQKPDPYKNLSFWEVNLKEKFSSELDQYPLGRKFLLQSGYRGRSSIRTGVKRPAVSKASAAPKRKRAKTKR

序列2(SEQ ID NO:2)：

MWRPSDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVKRTNIFYHASSSRLLAVGHPYYSIKKVNKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPLLNKYDDVENSGGYGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGTQCSNTSVQNGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPLDICGTVCKYPDYLQMAADPYGDRLFFYLRKEQMFARHFFNRAGTVGEPVPDDLLVKGGNNRSSVASSIYVHTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNHLFVTVVDTTRSTNMTLCASVSKSATYTNSDYKEYMRHVEEFDLQFIFQLCSITLSAEVMAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKEKQDPYKDMSFWEVNLKEKFSSELDQFPLGRKFLLQSGYRGRTSARTGIKRPAVSKPSTAPKRKRTKTKK

序列3(SEQ ID NO:3)：

MDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVTRTNIFYHASSSRLLAVGHPYFSIKRANKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPFLNKYDDVENSGSGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGKQCTNTPVQAGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPIDICGTTCKYPDYLQMAADPYGDRLFFFLRKEQMFARHFFNRAGEVGEPVPDTLIIKGSGNRTSVGSSIYVNTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCASVTTSSTYTNSDYKEYMRHVEEYDLQFIFQLCSITLSAEVVAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKQKPDPYKNLSFWEVNLKEKFSSELDQYPLGRKFLLQSGYRGRSSIRTGVKRPAVSKASAAPKRKRAKTKR

序列4(SEQ ID NO:4)：

MSDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVKRTNIFYHASSSRLLAVGHPYYSIKKVNKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPLLNKYDDVENSGGYGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGTQCSNTSVQNGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPLDICGTVCKYPDYLQMAADPYGDRLFFYLRKEQMFARHFFNRAGTVGEPVPDDLLVKGGNNRSSVASSIYVHTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNHLFVTVVDTTRSTNMTLCASVSKSATYTNSDYKEYMRHVEEFDLQFIFQLCSITLSAEVMAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKEKQDPYKDMSFWEVNLKEKFSSELDQFPLGRKFLLQSGYRGRTSARTGIKRPAVSKPSTAPKRKRTKTKK

序列5(SEQ ID NO:5)：

MDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVTRTNIFYHASSSRLLAVGHPYYSIKKVNKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPFLNKYDDVENSGSGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGKQCTNTPVQAGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPIDICGTTCKYPDYLQMAADPYGDRLFFFLRKEQMFARHFFNRAGEVGEPVPDTLIIKGSGNRTSVGSSIYVNTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCASVTTSSTYTNSDYKEYMRHVEEYDLQFIFQLCSITLSAEVVAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKQKPDPYKNLSFWEVNLKEKFSSELDQYPLGRKFLLQSGYRGRSSIRTGVKRPAVSKASAAPKRKRAKTKR

序列6(SEQ ID NO:6)：

MDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVTRTNIFYHASSSRLLAVGHPYFSIKRANKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPLLNKYDDVENSGGYGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGKQCTNTPVQAGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPIDICGTTCKYPDYLQMAADPYGDRLFFFLRKEQMFARHFFNRAGEVGEPVPDTLIIKGSGNRTSVGSSIYVNTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCASVTTSSTYTNSDYKEYMRHVEEYDLQFIFQLCSITLSAEVVAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKQKPDPYKNLSFWEVNLKEKFSSELDQYPLGRKFLLQSGYRGRSSIRTGVKRPAVSKASAAPKRKRAKTKR

序列7(SEQ ID NO:7)：

MDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVTRTNIFYHASSSRLLAVGHPYFSIKRANKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPFLNKYDDVENSGSGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGTQCSNTSVQNGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPIDICGTTCKYPDYLQMAADPYGDRLFFFLRKEQMFARHFFNRAGEVGEPVPDTLIIKGSGNRTSVGSSIYVNTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCASVTTSSTYTNSDYKEYMRHVEEYDLQFIFQLCSITLSAEVVAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKQKPDPYKNLSFWEVNLKEKFSSELDQYPLGRKFLLQSGYRGRSSIRTGVKRPAVSKASAAPKRKRAKTKR

序列8(SEQ ID NO:8)：

MDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVTRTNIFYHASSSRLLAVGHPYFSIKRANKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPFLNKYDDVENSGSGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGKQCTNTPVQAGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPIDICGTTCKYPDYLQMAADPYGDRLFFFLRKEQMFARHFFNRAGTVGEPVPDDLLVKGGNNRSSVASSIYVNTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCASVTTSSTYTNSDYKEYMRHVEEYDLQFIFQLCSITLSAEVVAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKQKPDPYKNLSFWEVNLKEKFSSELDQYPLGRKFLLQSGYRGRSSIRTGVKRPAVSKASAAPKRKRAKTKR

序列9(SEQ ID NO:9)：

MDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVTRTNIFYHASSSRLLAVGHPYFSIKRANKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPFLNKYDDVENSGSGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGKQCTNTPVQAGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPIDICGTTCKYPDYLQMAADPYGDRLFFFLRKEQMFARHFFNRAGEVGEPVPDTLIIKGSGNRTSVGSSIYVNTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCASVSKSATYTNSDYKEYMRHVEEYDLQFIFQLCSITLSAEVVAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKQKPDPYKNLSFWEVNLKEKFSSELDQYPLGRKFLLQSGYRGRSSIRTGVKRPAVSKASAAPKRKRAKTKR

序列10(SEQ ID NO:10)：

ATGGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCTAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGGATGCTTATGTTACTCGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTTCTTGCAGTGGGTCATCCTTATTTTTCCATAAAACGGGCTAACAAAACTGTTGTGCCAAAGGTGTCAGGATATCAATACAGGGTATTTAAGGTGGTGTTACCAGATCCTAACAAATTTGCATTGCCTGACTCGTCTCTTTTTGATCCCACAACACAACGTTTGGTATGGGCATGCACAGGCCTAGAGGTGGGCAGGGGACAGCCATTAGGTGTGGGTGTAAGTGGACATCCTTTCCTAAATAAATATGATGATGTTGAAAATTCAGGGAGTGGTGGTAACCCTGGACAGGATAACAGGGTTAATGTTGGTATGGATTATAAACAAACACAATTATGCATGGTTGGATGTGCCCCCCCTTTGGGCGAGCATTGGGGTAAAGGTAAACAGTGTACTAATACACCTGTACAGGCTGGTGACTGCCCGCCCTTAGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGCGATATGGTTGACACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCTGATTTGCAGACCAATAAATCAGATGTTCCTATTGATATATGTGGCACTACATGTAAATATCCAGATTATTTACAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGATTATTTTTTTTTCTACGGAAGGAACAAATGTTTGCCAGACATTTTTTTAACAGGGCTGGCGAGGTGGGGGAACCTGTGCCTGATACTCTTATAATTAAGGGTAGTGGAAATCGAACGTCTGTAGGGAGTAGTATATATGTTAACACCCCAAGCGGCTCTTTGGTGTCCTCTGAGGCACAATTGTTTAATAAGCCATATTGGCTACAAAAAGCCCAGGGACATAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCAACTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACCAACATGACATTATGTGCATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTATGATTTACAATTTATTTTTCAATTATGTAGCATTACATTGTCTGCTGAAGTAGTGGCCTATATTCACACAATGAATCCCTCTGTTTTGGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACATTAGAAGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACAGGCCATTACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGCAAAAGCCAGATCCCTATAAGAACCTTAGTTTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTAGTGAATTGGATCAGTATCCTTTGGGACGCAAGTTTTTGTTACAAAGTGGATATAGGGGACGGTCCTCTATTCGTACCGGTGTTAAGCGCCCTGCTGTTTCCAAAGCCTCTGCTGCCCCTAAACGTAAGCGCGCCAAAACTAAAAGGTAA

序列11(SEQ ID NO:11)：

ATGAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCACGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCTCTGTTTGACCCCACTACACAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCGTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCAGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAATAGGTCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGATCCTTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATATATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCCGAAAAAGAAAAACAGGACCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCTTCTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAAGCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA

序列12(SEQ ID NO:12)：

ATGGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCTAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGGATGCTTATGTTACTCGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTTCTTGCAGTGGGTCATCCTTATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATACAGGGTATTTAAGGTGGTGTTACCAGATCCTAACAAATTTGCATTGCCTGACTCGTCTCTTTTTGATCCCACAACACAACGTTTGGTATGGGCATGCACAGGCCTAGAGGTGGGCAGGGGACAGCCATTAGGTGTGGGTGTAAGTGGACATCCTTTCCTAAATAAATATGATGATGTTGAAAATTCAGGGAGTGGTGGTAACCCTGGACAGGATAACAGGGTTAATGTTGGTATGGATTATAAACAAACACAATTATGCATGGTTGGATGTGCCCCCCCTTTGGGCGAGCATTGGGGTAAAGGTAAACAGTGTACTAATACACCTGTACAGGCTGGTGACTGCCCGCCCTTAGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGCGATATGGTTGACACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCTGATTTGCAGACCAATAAATCAGATGTTCCTATTGATATATGTGGCACTACATGTAAATATCCAGATTATTTACAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGATTATTTTTTTTTCTACGGAAGGAACAAATGTTTGCCAGACATTTTTTTAACAGGGCTGGCGAGGTGGGGGAACCTGTGCCTGATACTCTTATAATTAAGGGTAGTGGAAATCGAACGTCTGTAGGGAGTAGTATATATGTTAACACCCCAAGCGGCTCTTTGGTGTCCTCTGAGGCACAATTGTTTAATAAGCCATATTGGCTACAAAAAGCCCAGGGACATAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCAACTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACCAACATGACATTATGTGCATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTATGATTTACAATTTATTTTTCAATTATGTAGCATTACATTGTCTGCTGAAGTAGTGGCCTATATTCACACAATGAATCCCTCTGTTTTGGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACATTAGAAGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACAGGCCATTACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGCAAAAGCCAGATCCCTATAAGAACCTTAGTTTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTAGTGAATTGGATCAGTATCCTTTGGGACGCAAGTTTTTGTTACAAAGTGGATATAGGGGACGGTCCTCTATTCGTACCGGTGTTAAGCGCCCTGCTGTTTCCAAAGCCTCTGCTGCCCCTAAACGTAAGCGCGCCAAAACTAAAAGGTAA

序列13(SEQ ID NO:13)：

ATGGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCTAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGGATGCTTATGTTACTCGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTTCTTGCAGTGGGTCATCCTTATTTTTCCATAAAACGGGCTAACAAAACTGTTGTGCCAAAGGTGTCAGGATATCAATACAGGGTATTTAAGGTGGTGTTACCAGATCCTAACAAATTTGCATTGCCTGACTCGTCTCTTTTTGATCCCACAACACAACGTTTGGTATGGGCATGCACAGGCCTAGAGGTGGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACACAATTATGCATGGTTGGATGTGCCCCCCCTTTGGGCGAGCATTGGGGTAAAGGTAAACAGTGTACTAATACACCTGTACAGGCTGGTGACTGCCCGCCCTTAGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGCGATATGGTTGACACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCTGATTTGCAGACCAATAAATCAGATGTTCCTATTGATATATGTGGCACTACATGTAAATATCCAGATTATTTACAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGATTATTTTTTTTTCTACGGAAGGAACAAATGTTTGCCAGACATTTTTTTAACAGGGCTGGCGAGGTGGGGGAACCTGTGCCTGATACTCTTATAATTAAGGGTAGTGGAAATCGAACGTCTGTAGGGAGTAGTATATATGTTAACACCCCAAGCGGCTCTTTGGTGTCCTCTGAGGCACAATTGTTTAATAAGCCATATTGGCTACAAAAAGCCCAGGGACATAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCAACTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACCAACATGACATTATGTGCATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTATGATTTACAATTTATTTTTCAATTATGTAGCATTACATTGTCTGCTGAAGTAGTGGCCTATATTCACACAATGAATCCCTCTGTTTTGGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACATTAGAAGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACAGGCCATTACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGCAAAAGCCAGATCCCTATAAGAACCTTAGTTTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTAGTGAATTGGATCAGTATCCTTTGGGACGCAAGTTTTTGTTACAAAGTGGATATAGGGGACGGTCCTCTATTCGTACCGGTGTTAAGCGCCCTGCTGTTTCCAAAGCCTCTGCTGCCCCTAAACGTAAGCGCGCCAAAACTAAAAGGTAA

序列14(SEQ ID NO:14)：

ATGGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCTAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGGATGCTTATGTTACTCGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTTCTTGCAGTGGGTCATCCTTATTTTTCCATAAAACGGGCTAACAAAACTGTTGTGCCAAAGGTGTCAGGATATCAATACAGGGTATTTAAGGTGGTGTTACCAGATCCTAACAAATTTGCATTGCCTGACTCGTCTCTTTTTGATCCCACAACACAACGTTTGGTATGGGCATGCACAGGCCTAGAGGTGGGCAGGGGACAGCCATTAGGTGTGGGTGTAAGTGGACATCCTTTCCTAAATAAATATGATGATGTTGAAAATTCAGGGAGTGGTGGTAACCCTGGACAGGATAACAGGGTTAATGTTGGTATGGATTATAAACAAACACAATTATGCATGGTTGGATGTGCCCCCCCTTTGGGCGAGCATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCGTTAGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGCGATATGGTTGACACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCTGATTTGCAGACCAATAAATCAGATGTTCCTATTGATATATGTGGCACTACATGTAAATATCCAGATTATTTACAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGATTATTTTTTTTTCTACGGAAGGAACAAATGTTTGCCAGACATTTTTTTAACAGGGCTGGCGAGGTGGGGGAACCTGTGCCTGATACTCTTATAATTAAGGGTAGTGGAAATCGAACGTCTGTAGGGAGTAGTATATATGTTAACACCCCAAGCGGCTCTTTGGTGTCCTCTGAGGCACAATTGTTTAATAAGCCATATTGGCTACAAAAAGCCCAGGGACATAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCAACTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACCAACATGACATTATGTGCATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTATGATTTACAATTTATTTTTCAATTATGTAGCATTACATTGTCTGCTGAAGTAGTGGCCTATATTCACACAATGAATCCCTCTGTTTTGGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACATTAGAAGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACAGGCCATTACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGCAAAAGCCAGATCCCTATAAGAACCTTAGTTTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTAGTGAATTGGATCAGTATCCTTTGGGACGCAAGTTTTTGTTACAAAGTGGATATAGGGGACGGTCCTCTATTCGTACCGGTGTTAAGCGCCCTGCTGTTTCCAAAGCCTCTGCTGCCCCTAAACGTAAGCGCGCCAAAACTAAAAGGTAA

序列15(SEQ ID NO:14)：

ATGGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCTAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGGATGCTTATGTTACTCGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTTCTTGCAGTGGGTCATCCTTATTTTTCCATAAAACGGGCTAACAAAACTGTTGTGCCAAAGGTGTCAGGATATCAATACAGGGTATTTAAGGTGGTGTTACCAGATCCTAACAAATTTGCATTGCCTGACTCGTCTCTTTTTGATCCCACAACACAACGTTTGGTATGGGCATGCACAGGCCTAGAGGTGGGCAGGGGACAGCCATTAGGTGTGGGTGTAAGTGGACATCCTTTCCTAAATAAATATGATGATGTTGAAAATTCAGGGAGTGGTGGTAACCCTGGACAGGATAACAGGGTTAATGTTGGTATGGATTATAAACAAACACAATTATGCATGGTTGGATGTGCCCCCCCTTTGGGCGAGCATTGGGGTAAAGGTAAACAGTGTACTAATACACCTGTACAGGCTGGTGACTGCCCGCCCTTAGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGCGATATGGTTGACACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCTGATTTGCAGACCAATAAATCAGATGTTCCTATTGATATATGTGGCACTACATGTAAATATCCAGATTATTTACAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGATTATTTTTTTTTCTACGGAAGGAACAAATGTTTGCCAGACATTTTTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAATAGGTCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTTAACACCCCAAGCGGCTCTTTGGTGTCCTCTGAGGCACAATTGTTTAATAAGCCATATTGGCTACAAAAAGCCCAGGGACATAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCAACTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACCAACATGACATTATGTGCATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTATGATTTACAATTTATTTTTCAATTATGTAGCATTACATTGTCTGCTGAAGTAGTGGCCTATATTCACACAATGAATCCCTCTGTTTTGGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACATTAGAAGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACAGGCCATTACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGCAAAAGCCAGATCCCTATAAGAACCTTAGTTTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTAGTGAATTGGATCAGTATCCTTTGGGACGCAAGTTTTTGTTACAAAGTGGATATAGGGGACGGTCCTCTATTCGTACCGGTGTTAAGCGCCCTGCTGTTTCCAAAGCCTCTGCTGCCCCTAAACGTAAGCGCGCCAAAACTAAAAGGTAA

序列16(SEQ ID NO:16)：

ATGGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCTAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGGATGCTTATGTTACTCGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTTCTTGCAGTGGGTCATCCTTATTTTTCCATAAAACGGGCTAACAAAACTGTTGTGCCAAAGGTGTCAGGATATCAATACAGGGTATTTAAGGTGGTGTTACCAGATCCTAACAAATTTGCATTGCCTGACTCGTCTCTTTTTGATCCCACAACACAACGTTTGGTATGGGCATGCACAGGCCTAGAGGTGGGCAGGGGACAGCCATTAGGTGTGGGTGTAAGTGGACATCCTTTCCTAAATAAATATGATGATGTTGAAAATTCAGGGAGTGGTGGTAACCCTGGACAGGATAACAGGGTTAATGTTGGTATGGATTATAAACAAACACAATTATGCATGGTTGGATGTGCCCCCCCTTTGGGCGAGCATTGGGGTAAAGGTAAACAGTGTACTAATACACCTGTACAGGCTGGTGACTGCCCGCCCTTAGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGCGATATGGTTGACACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCTGATTTGCAGACCAATAAATCAGATGTTCCTATTGATATATGTGGCACTACATGTAAATATCCAGATTATTTACAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGATTATTTTTTTTTCTACGGAAGGAACAAATGTTTGCCAGACATTTTTTTAACAGGGCTGGCGAGGTGGGGGAACCTGTGCCTGATACTCTTATAATTAAGGGTAGTGGAAATCGAACGTCTGTAGGGAGTAGTATATATGTTAACACCCCAAGCGGCTCTTTGGTGTCCTCTGAGGCACAATTGTTTAATAAGCCATATTGGCTACAAAAAGCCCAGGGACATAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCAACTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACCAACATGACATTATGTGCATCCGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTATGATTTACAATTTATTTTTCAATTATGTAGCATTACATTGTCTGCTGAAGTAGTGGCCTATATTCACACAATGAATCCCTCTGTTTTGGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACATTAGAAGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACAGGCCATTACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGCAAAAGCCAGATCCCTATAAGAACCTTAGTTTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTAGTGAATTGGATCAGTATCCTTTGGGACGCAAGTTTTTGTTACAAAGTGGATATAGGGGACGGTCCTCTATTCGTACCGGTGTTAAGCGCCCTGCTGTTTCCAAAGCCTCTGCTGCCCCTAAACGTAAGCGCGCCAAAACTAAAAGGTAA

序列35(SEQ ID NO:35)：

LLNKYDDVENSGGYGGNPGQDN

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons，Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

实施例1.突变的HPV6 L1蛋白的表达与纯化

表达载体的构建

采用多点突变PCR反应来构建编码含有来源于HPV11 L1蛋白的特定区段的突变的HPV6 L1蛋白(H6N5-11T1)的表达载体，其中，所使用的初始模板为pTO-T7-HPV6N5C质粒(其编码N端截短了5个氨基酸的HPV6 L1蛋白；在表2中简写为6L1N5)。用于各个PCR反应的模板和引物见表2，并且，PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟；25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火一定时间，72℃延伸7分30秒)；最后72℃延伸10分钟。所使用的PCR引物的具体序列列于表3。

向扩增产物(50μL)中加入2μL DpnI限制性内切酶，并在37℃温育60min。取10μL酶切产物，用于转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566(购自新英格兰生物实验室公司)。将经转化的大肠杆菌涂布于含卡那霉素(终浓度25mg/mL，下同)的固体LB培养基(LB培养基成分：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，下同)，并在37℃静置培养10-12小时，直至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含有4mL液体LB培养基(含卡那霉素)的试管中，并在37℃220转/分钟下振荡培养10小时。随后，取1mL菌液于-70℃保存。从大肠杆菌中提取质粒，并利用T7引物对质粒中插入的目的片段的核苷酸序列进行测序。测序结果显示，所构建的质粒(表达载体)中插入的目的片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：12，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：5(所对应的蛋白命名为H6N5-11T1)。突变蛋白H6N5-11T1与HPV6N5的区别在于：位于野生型HPV6 L1蛋白第49-63位的氨基酸残基被替换为野生型HPV11 L1蛋白第49-63位的氨基酸残基。

采用Gibson装配(Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,Hutchison CA,Smith HO.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundredkilobases.Nat Methods.2009；6:343–5.doi:10.1038/nmeth.1318)来构建编码其他的突变HPV6 L1蛋白的表达载体，所述突变的HPV6 L1蛋白含有来源于HPV11 L1的特定区段。简言之，首先采用PCR反应来获得一个包含突变的短片段和一个不包含突变的长片段，然后再采用Gibson装配体系将这两个片段连接成环。所使用的初始模板包括pTO-T7-HPV6N5C质粒和pTO-T7-HPV11N4C质粒(其编码N端截短了4个氨基酸的HPV11 L1蛋白；在表2中简写为11L1N4)。用于各个PCR反应的模板和引物见表2，并且，用于扩增短片段的PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟；25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火一定时间，72℃延伸1分钟)；最后72℃延伸10分钟。用于扩增长片段的PCR反应的扩增条件设为：94℃变性10分钟；25个循环的(94℃变性50秒，指定温度退火一定时间，72℃延伸7分30秒)；最后72℃延伸10分钟。所使用的PCR引物的具体序列列于表3。将扩增产物进行电泳，随后使用DNA回收试剂盒回收目的片段并测定其浓度。按2:1的摩尔比将扩增得到的短片段和长片段混合(总体积3μL)，随后添加3μL 2X Gibson装配预混试剂(2X Gibson Assembly Master Mix，购自NEB，包含T5 exonuclease，Phusion DNA polymerase，Taq DNA ligase)，并在50℃反应1小时。

用装配后的产物(6μL)转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠杆菌ER2566(购自新英格兰生物实验室公司)。将经转化的大肠杆菌涂布于含卡那霉素的固体LB培养基，并在37℃静置培养10-12小时，直至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含有4mL液体LB培养基(含卡那霉素)的试管中，并在37℃220转/分钟下振荡培养10小时。随后，取1mL菌液于-70℃保存。从大肠杆菌中提取质粒，并利用T7引物对质粒中插入的目的片段的核苷酸序列进行测序。测序结果显示，所构建的各个质粒(表达载体)中插入的目的片段的核苷酸序列分别为SEQID NO：13、14、15、16，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：6、7、8、9(所对应的蛋白分别命名为H6N5-11T2，H6N5-11T3，H6N5-11T4，和H6N5-11T5)。

突变蛋白H6N5-11T2与HPV6N5的区别在于：位于野生型HPV6 L1蛋白第119-139位的氨基酸残基被替换为野生型HPV11 L1蛋白第119-140位的氨基酸残基。突变蛋白H6N5-11T3与HPV6N5的区别在于：位于野生型HPV6 L1蛋白第164-183位的氨基酸残基被替换为野生型HPV11 L1蛋白第165-184位的氨基酸残基。突变蛋白H6N5-11T4与HPV6N5的区别在于：位于野生型HPV6 L1蛋白第256-287位的氨基酸残基被替换为野生型HPV11 L1蛋白第257-288位的氨基酸残基。突变蛋白H6N5-11T5与HPV6N5的区别在于：位于野生型HPV6 L1蛋白第345-350位的氨基酸残基被替换为野生型HPV11 L1蛋白第346-351位的氨基酸残基。

表2：用于构建表达载体的PCR反应的模板和引物

模板	上游引物	下游引物	产物
				6L1N5	H6N5-11T1-F	H6N5-11T1-R	H6N5-11T1
6L1N5	G-V-H6N5-11T2-F	G-V-H6N5-11T2-R	H6N5-11T2长片段
				11L1N4	G-H11N4T2-F	G-H11N4T2-R	H6N5-11T2短片段
6L1N5	G-V-H6N5-11T3-F	G-V-H6N5-11T3-R	H6N5-11T3长片段
				11L1N4	G-H11N4T3-F	G-H11N4T3-R	H6N5-11T3短片段
6L1N5	G-V-H6N5-11T4-F	G-V-H6N5-11T4-R	H6N5-11T4长片段
				11L1N4	G-H11N4T4-F	G-H11N4T4-R	H6N5-11T4短片段
6L1N5	G-V-H6N5-11T5-F	G-V-H6N5-11T5-R	H6N5-11T5长片段
				11L1N4	G-H11N4T5-F	G-H11N4T5-R	H6N5-11T5短片段

表3：所使用的引物的具体序列(SEQ ID NO:17-34)

突变蛋白的大量表达

从-70℃冰箱中取出携带重组质粒pTO-T7-H6N5-11T1、pTO-T7-H6N5-11T2、pTO-T7-H6N5-11T3、pTO-T7-H6N5-11T4、pTO-T7-H6N5-11T5的大肠杆菌菌液，分别接种入100ml含卡那霉素的LB液体培养基中，在200rpm，37℃下培养大约8小时；然后分别转接入500ml含卡那霉素的LB培养基中(接入1ml菌液)，并继续进行培养。当细菌浓度达到OD₆₀₀为0.6左右时，将培养温度降至25℃，并向各培养瓶中加入500μL IPTG，继续培养8小时。培养结束后，离心收集菌体。获得表达了H6N5-11T1、H6N5-11T2、H6N5-11T3、H6N5-11T4和H6N5-11T5蛋白的菌体。

表达突变蛋白的菌体破碎

按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris缓冲液，pH7.2，300mM NaCl)的比例重悬上述得到的菌体。用超声波仪破碎菌体30min。以13500rpm(30000g)离心含有经破碎的菌体的裂解液15min，留取上清(即，菌体破碎上清)。

突变蛋白的色谱纯化

仪器系统：GE Heal thcare公司(原Amershan Pharmacia公司)生产的AKTAexplorer 100型制备型液相色谱系统。

层析介质：SP Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare公司)、CHT-Ⅱ(购自Bio－RAD)和Butyl Sepharose 4Fast Flow(GE Heal thcare公司)。

缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液，pH8.0，20mM DTT；以及，20mM磷酸盐缓冲液，pH8.0，20mM DTT，2M NaCl。

样品：如上获得的含有H6N5-11T1、H6N5-11T2、H6N5-11T3、H6N5-11T4和H6N5-11T5的菌体破碎上清。

洗脱程序为：

(1)用SP Sepharose 4Fast Flow对菌体破碎上清进行阳离子交换纯化：将样品上柱，然后用含有400mM NaCl的缓冲液洗脱杂蛋白，然后用含有800mM NaCl的缓冲液洗脱目的蛋白，并收集由含有800mM NaCl的缓冲液洗脱的级分；

(2)用CHTⅡ(羟基磷灰石色谱)对前一步获得的洗脱级分进行色谱纯化：对前一步骤获得的洗脱级分进行稀释，以使得NaCl的浓度降至0.5M；将样品上柱，然后用含有500mMNaCl的缓冲液洗脱杂蛋白，然后用含有1000mM NaCl的缓冲液洗脱目的蛋白，并收集由含有1000mM NaCl的缓冲液洗脱的级分；

(3)用HIC(疏水相互作用色谱)对前一步骤获得的洗脱级分进行色谱纯化：将样品上柱，然后用含有1000mM NaCl的缓冲液洗脱杂蛋白，然后用含有200mM NaCl的缓冲液洗脱目的蛋白，并收集由含有200mM NaCl的缓冲液洗脱的级分。

取步骤(3)获得的洗脱级分150μL，加入30μL 6X Loading Buffer中，混匀，并于80℃水浴中温育10min。然后取10μl样品于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min；然后以考马斯亮兰染色显示电泳条带。电泳结果示于图1中。结果显示，经过上述纯化步骤后，H6N5-11T1、H6N5-11T2、H6N5-11T3、H6N5-11T4和H6N5-11T5蛋白的纯度大于95％。

通过类似的方法，使用大肠杆菌和pTO-T7-HPV6N5C质粒制备和纯化了HPV6N5蛋白；并且，使用大肠杆菌和pTO-T7-HPV11N4C质粒制备和纯化了HPV11N4蛋白。

实施例2：HPV病毒样颗粒的组装与颗粒形态学检测

HPV病毒样颗粒的组装

取一定体积(约10ml)的蛋白H6N5-11T1、H6N5-11T2、H6N5-11T3、H6N5-11T4和H6N5-11T5，分别在2L储存缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，0.5M NaCl)中去除DTT，进行颗粒组装。

通过类似的方法，将HPV6N5和HPV11N4蛋白分别组装为HPV6N5 VLP和HPV11N4VLP。

沉降速率分析

沉降速率分析所使用的仪器为Beckman XL-A分析型超速离心机，其配有光学检测系统及An-50Ti和An-60Ti转头。采用沉降速率法分析HPV6N5 VLP、H6N5-11T1 VLP、H6N5-11T2 VLP、H6N5-11T3 VLP、H6N5-11T4 VLP和H6N5-11T5 VLP的沉降系数。结果如图2A-2F所示。结果显示，H6N5-11T1 VLP、H6N5-11T2 VLP、H6N5-11T3 VLP、H6N5-11T4 VLP和H6N5-11T5 VLP的沉降系数分别为136S、109S、113S、109S和108S。这表明，如上制备的5种突变的HPV6 L1蛋白各自能够组装成大小、形态与野生型VLP(HPV6N5 VLP，99.5S)相似的病毒样颗粒。

病毒样颗粒的形态学检测

取100μL含有VLP的样品进行透射电镜观察。所使用的仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜，放大倍数为100,000倍。简言之，取13.5μL样品，用2％磷钨酸pH7.0进行负染，并固定于喷炭的铜网上，然后进行透射电镜观察。观察结果如图3A-3F所示。结果显示，H6N5-11T1、H6N5-11T2、H6N5-11T3、H6N5-11T4和H6N5-11T5均可组装成病毒样颗粒。此外，结果还显示，这些突变蛋白所组装形成的颗粒的半径均在25nm左右，大小均一。这表明，这些突变蛋白与野生型HPV6的L1蛋白(HPV6N5 VLP)类似，能够形成大小均一的VLP。

实施例3：病毒样颗粒的热稳定性的评价

使用购自美国GE公司(原MicroCal公司)的差温量热仪VP Capillary DSC来评价HPV6N5、H6N5-11T1、H6N5-11T2、H6N5-11T3、H6N5-11T4和H6N5-11T5所形成的VLP的热稳定性，其中，使用所述蛋白的储存缓冲液作为对照，并且以1.5℃/min的升温速率在10℃-90℃区间对各蛋白进行扫描。检测结果如图4A-4F所示。结果显示，各个蛋白所形成的VLP均具有极高的热稳定性。

实施例4：病毒样颗粒在动物体内的免疫保护性的评价

使用小鼠来评价由H6N5-11T1、H6N5-11T2、H6N5-11T3、H6N5-11T4和H6N5-11T5形成的VLP的免疫保护性。用于免疫接种的动物为，5-6周龄BalB/c普通级小鼠(购自上海斯莱康实验动物有限公司)。

将如上制备的HPV6N5 VLP、HPV11N4 VLP、H6N5-11T1 VLP、H6N5-11T2 VLP、H6N5-11T3 VLP、H6N5-11T4 VLP、H6N5-11T5 VLP和混合的HPV6/HPV11 VLP(即，HPV6N5 VLP和HPV11N4 VLP的混合物)分别吸附于铝佐剂上。按不同的免疫原将小鼠分为8组，每组包含4只小鼠。免疫程序为：在0周时进行初次免疫；在第2和4周时各进行加强免疫一次。免疫方式为皮下注射，所使用的免疫原与剂量如表4所示。在初次免疫后的第8周，抽取眼球静脉血，并分离血清，随后检测血清中的中和抗体的滴度。检测结果如图5所示。结果显示，H6N5-11T2 VLP可在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV6和HPV11的中和抗体；并且其针对HPV6的保护效果与单独的HPV6N5 VLP、混合的HPV6/HPV11 VLP相当，且显著高于单独的HPV11N4VLP；并且其针对HPV11的保护效果与单独的HPV11N4 VLP、混合的HPV6/HPV11 VLP相当，且显著高于单独的HPV6N5 VLP。这些结果表明，H6N5-11T2 VLP可用作预防HPV6感染和HPV11感染的有效疫苗，可用于代替含有HPV6 VLP和HPV11 VLP的混合疫苗。

表4：免疫方案

免疫抗原	佐剂	免疫剂量	数量	免疫程序(周)
					HPV6N5 VLP	铝佐剂	5μg	4	0、2、4
HPV11N4 VLP	铝佐剂	5μg	4	0、2、4
					混合的HPV6/HPV11 VLP	铝佐剂	每种VLP各5μg	4	0、2、4
H6N5-11T1 VLP	铝佐剂	5μg	4	0、2、4
					H6N5-11T2 VLP	铝佐剂	5μg	4	0、2、4
H6N5-11T3 VLP	铝佐剂	5μg	4	0、2、4
					H6N5-11T4 VLP	铝佐剂	5μg	4	0、2、4
H6N5-11T5 VLP	铝佐剂	5μg	4	0、2、4

实施例5：用VLP免疫后小鼠血清中的中和抗体滴度的评价

在本实验中，将所有小鼠(6周龄BalB/c雌性小鼠)分为2个组：铝佐剂组1(免疫剂量为10μg，使用铝佐剂)，和铝佐剂组2(免疫剂量为1μg，使用铝佐剂)。各个组又细分为4个亚组，对照亚组1-3分别用单独的HPV6N5 VLP、单独的HPV11N4 VLP和混合的HPV6/HPV11VLP(即，HPV11N4 VLP和HPV6N5 VLP的混合物，其中每种VLP均以指定的免疫剂量施用)进行免疫，实验亚组用H6N5-11T2 VLP进行免疫。

采用腹腔注射方式免疫6只小鼠/亚组，免疫剂量分别为10μg、1μg，注射体积为1ml。所有小鼠均在第0周进行初次免疫，然后在第2和4周各自进行加强免疫一次。在第8周对小鼠进行眼眶采血，并分析血清中的抗HPV6和HPV11抗体的滴度。分析结果如图6A-6B所示。结果显示，H6N5-11T2 VLP能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV6的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV6N5 VLP、混合的HPV6/HPV11 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV11N4 VLP；并其能诱导小鼠产生高滴度的针对HPV11的中和抗体，其保护效果与同剂量的单独的HPV11N4 VLP、混合的HPV6/HPV11 VLP相当，且显著优于同剂量的单独的HPV6N5VLP。这表明，H6N5-11T2 VLP对HPV6和HPV11具有良好的交叉免疫原性和交叉保护性。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 一种人乳头瘤病毒6型L1蛋白的突变体

<130> IDC150227

<160> 35

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 500

<212> PRT

<213> HPV 6

<400> 1

Met Trp Arg Pro Ser Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro

1 5 10 15

Val Ser Lys Val Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Thr Arg Thr Asn Ile

20 25 30

Phe Tyr His Ala Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr

35 40 45

Phe Ser Ile Lys Arg Ala Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly

50 55 60

Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe

65 70 75 80

Ala Leu Pro Asp Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val

85 90 95

Trp Ala Cys Thr Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val

100 105 110

Gly Val Ser Gly His Pro Phe Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn

115 120 125

Ser Gly Ser Gly Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly

130 135 140

Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro

145 150 155 160

Leu Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Lys Gln Cys Thr Asn Thr Pro Val

165 170 175

Gln Ala Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln

180 185 190

Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp

195 200 205

Leu Gln Thr Asn Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile Cys Gly Thr Thr

210 215 220

Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp

225 230 235 240

Arg Leu Phe Phe Phe Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe

245 250 255

Phe Asn Arg Ala Gly Glu Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Thr Leu Ile

260 265 270

Ile Lys Gly Ser Gly Asn Arg Thr Ser Val Gly Ser Ser Ile Tyr Val

275 280 285

Asn Thr Pro Ser Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn

290 295 300

Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys

305 310 315 320

Trp Gly Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr

325 330 335

Asn Met Thr Leu Cys Ala Ser Val Thr Thr Ser Ser Thr Tyr Thr Asn

340 345 350

Ser Asp Tyr Lys Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln

355 360 365

Phe Ile Phe Gln Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Val Ala

370 375 380

Tyr Ile His Thr Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly

385 390 395 400

Leu Ser Pro Pro Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val

405 410 415

Gln Ser Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Gln Lys

420 425 430

Pro Asp Pro Tyr Lys Asn Leu Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu

435 440 445

Lys Phe Ser Ser Glu Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu

450 455 460

Leu Gln Ser Gly Tyr Arg Gly Arg Ser Ser Ile Arg Thr Gly Val Lys

465 470 475 480

Arg Pro Ala Val Ser Lys Ala Ser Ala Ala Pro Lys Arg Lys Arg Ala

485 490 495

Lys Thr Lys Arg

500

<210> 2

<211> 501

<212> PRT

<213> HPV 11

<400> 2

Met Trp Arg Pro Ser Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro

1 5 10 15

Val Ser Lys Val Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Lys Arg Thr Asn Ile

20 25 30

Phe Tyr His Ala Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr

35 40 45

Tyr Ser Ile Lys Lys Val Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly

50 55 60

Tyr Gln Tyr Arg Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe

65 70 75 80

Ala Leu Pro Asp Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val

85 90 95

Trp Ala Cys Thr Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val

100 105 110

Gly Val Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn

115 120 125

Ser Gly Gly Tyr Gly Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val

130 135 140

Gly Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro

145 150 155 160

Pro Leu Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Thr Gln Cys Ser Asn Thr Ser

165 170 175

Val Gln Asn Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile

180 185 190

Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala

195 200 205

Asp Leu Gln Thr Asn Lys Ser Asp Val Pro Leu Asp Ile Cys Gly Thr

210 215 220

Val Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly

225 230 235 240

Asp Arg Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His

245 250 255

Phe Phe Asn Arg Ala Gly Thr Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Asp Leu

260 265 270

Leu Val Lys Gly Gly Asn Asn Arg Ser Ser Val Ala Ser Ser Ile Tyr

275 280 285

Val His Thr Pro Ser Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe

290 295 300

Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile

305 310 315 320

Cys Trp Gly Asn His Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser

325 330 335

Thr Asn Met Thr Leu Cys Ala Ser Val Ser Lys Ser Ala Thr Tyr Thr

340 345 350

Asn Ser Asp Tyr Lys Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Phe Asp Leu

355 360 365

Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Met

370 375 380

Ala Tyr Ile His Thr Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe

385 390 395 400

Gly Leu Ser Pro Pro Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr

405 410 415

Val Gln Ser Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Glu

420 425 430

Lys Gln Asp Pro Tyr Lys Asp Met Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys

435 440 445

Glu Lys Phe Ser Ser Glu Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe

450 455 460

Leu Leu Gln Ser Gly Tyr Arg Gly Arg Thr Ser Ala Arg Thr Gly Ile

465 470 475 480

Lys Arg Pro Ala Val Ser Lys Pro Ser Thr Ala Pro Lys Arg Lys Arg

485 490 495

Thr Lys Thr Lys Lys

500

<210> 3

<211> 496

<212> PRT

<213> 合成的肽

<220>

<223> HPV6N5

<400> 3

Met Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys Val

1 5 10 15

Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Thr Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His Ala

20 25 30

Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Ser Ile Lys

35 40 45

Arg Ala Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Tyr Gln Tyr Arg

50 55 60

Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro Asp

65 70 75 80

Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Thr

85 90 95

Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser Gly

100 105 110

His Pro Phe Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly Met Asp Tyr Lys

130 135 140

Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly Glu His

145 150 155 160

Trp Gly Lys Gly Lys Gln Cys Thr Asn Thr Pro Val Gln Ala Gly Asp

165 170 175

Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly Asp Met

180 185 190

Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln Thr Asn

195 200 205

Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile Cys Gly Thr Thr Cys Lys Tyr Pro

210 215 220

Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu Phe Phe

225 230 235 240

Phe Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn Arg Ala

245 250 255

Gly Glu Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Thr Leu Ile Ile Lys Gly Ser

260 265 270

Gly Asn Arg Thr Ser Val Gly Ser Ser Ile Tyr Val Asn Thr Pro Ser

275 280 285

Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp

290 295 300

Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln

305 310 315 320

Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu

325 330 335

Cys Ala Ser Val Thr Thr Ser Ser Thr Tyr Thr Asn Ser Asp Tyr Lys

340 345 350

Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln

355 360 365

Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Val Ala Tyr Ile His Thr

370 375 380

Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Ser Pro Pro

385 390 395 400

Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser Gln Ala

405 410 415

Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Gln Lys Pro Asp Pro Tyr

420 425 430

Lys Asn Leu Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ser

435 440 445

Glu Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Gly

450 455 460

Tyr Arg Gly Arg Ser Ser Ile Arg Thr Gly Val Lys Arg Pro Ala Val

465 470 475 480

Ser Lys Ala Ser Ala Ala Pro Lys Arg Lys Arg Ala Lys Thr Lys Arg

485 490 495

<210> 4

<211> 498

<212> PRT

<213> 合成的肽

<220>

<223> HPV11N4

<400> 4

Met Ser Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys

1 5 10 15

Val Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Lys Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His

20 25 30

Ala Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Tyr Ser Ile

35 40 45

Lys Lys Val Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Tyr Gln Tyr

50 55 60

Arg Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro

65 70 75 80

Asp Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys

85 90 95

Thr Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser

100 105 110

Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Gly

115 120 125

Tyr Gly Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly Met Asp

130 135 140

Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly

145 150 155 160

Glu His Trp Gly Lys Gly Thr Gln Cys Ser Asn Thr Ser Val Gln Asn

165 170 175

Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly

180 185 190

Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln

195 200 205

Thr Asn Lys Ser Asp Val Pro Leu Asp Ile Cys Gly Thr Val Cys Lys

210 215 220

Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu

225 230 235 240

Phe Phe Tyr Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn

245 250 255

Arg Ala Gly Thr Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Asp Leu Leu Val Lys

260 265 270

Gly Gly Asn Asn Arg Ser Ser Val Ala Ser Ser Ile Tyr Val His Thr

275 280 285

Pro Ser Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro

290 295 300

Tyr Trp Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly

305 310 315 320

Asn His Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met

325 330 335

Thr Leu Cys Ala Ser Val Ser Lys Ser Ala Thr Tyr Thr Asn Ser Asp

340 345 350

Tyr Lys Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Phe Asp Leu Gln Phe Ile

355 360 365

Phe Gln Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Met Ala Tyr Ile

370 375 380

His Thr Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Ser

385 390 395 400

Pro Pro Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser

405 410 415

Gln Ala Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Glu Lys Gln Asp

420 425 430

Pro Tyr Lys Asp Met Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe

435 440 445

Ser Ser Glu Leu Asp Gln Phe Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln

450 455 460

Ser Gly Tyr Arg Gly Arg Thr Ser Ala Arg Thr Gly Ile Lys Arg Pro

465 470 475 480

Ala Val Ser Lys Pro Ser Thr Ala Pro Lys Arg Lys Arg Thr Lys Thr

485 490 495

Lys Lys

<210> 5

<211> 496

<212> PRT

<213> 合成的肽

<220>

<223> H6N5-11T1

<400> 5

Met Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys Val

1 5 10 15

Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Thr Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His Ala

20 25 30

Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Tyr Ser Ile Lys

35 40 45

Lys Val Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Tyr Gln Tyr Arg

50 55 60

Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro Asp

65 70 75 80

Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Thr

85 90 95

Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser Gly

100 105 110

His Pro Phe Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly Met Asp Tyr Lys

130 135 140

Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly Glu His

145 150 155 160

Trp Gly Lys Gly Lys Gln Cys Thr Asn Thr Pro Val Gln Ala Gly Asp

165 170 175

Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly Asp Met

180 185 190

Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln Thr Asn

195 200 205

Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile Cys Gly Thr Thr Cys Lys Tyr Pro

210 215 220

Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu Phe Phe

225 230 235 240

Phe Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn Arg Ala

245 250 255

Gly Glu Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Thr Leu Ile Ile Lys Gly Ser

260 265 270

Gly Asn Arg Thr Ser Val Gly Ser Ser Ile Tyr Val Asn Thr Pro Ser

275 280 285

Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp

290 295 300

Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln

305 310 315 320

Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu

325 330 335

Cys Ala Ser Val Thr Thr Ser Ser Thr Tyr Thr Asn Ser Asp Tyr Lys

340 345 350

Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln

355 360 365

Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Val Ala Tyr Ile His Thr

370 375 380

Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Ser Pro Pro

385 390 395 400

Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser Gln Ala

405 410 415

Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Gln Lys Pro Asp Pro Tyr

420 425 430

Lys Asn Leu Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ser

435 440 445

Glu Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Gly

450 455 460

Tyr Arg Gly Arg Ser Ser Ile Arg Thr Gly Val Lys Arg Pro Ala Val

465 470 475 480

Ser Lys Ala Ser Ala Ala Pro Lys Arg Lys Arg Ala Lys Thr Lys Arg

485 490 495

<210> 6

<211> 497

<212> PRT

<213> 合成的肽

<220>

<223> H6N5-11T2

<400> 6

Met Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys Val

1 5 10 15

Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Thr Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His Ala

20 25 30

Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Ser Ile Lys

35 40 45

Arg Ala Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Tyr Gln Tyr Arg

50 55 60

Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro Asp

65 70 75 80

Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Thr

85 90 95

Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser Gly

100 105 110

His Pro Leu Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Gly Tyr

115 120 125

Gly Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly Met Asp Tyr

130 135 140

Lys Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly Glu

145 150 155 160

His Trp Gly Lys Gly Lys Gln Cys Thr Asn Thr Pro Val Gln Ala Gly

165 170 175

Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly Asp

180 185 190

Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln Thr

195 200 205

Asn Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile Cys Gly Thr Thr Cys Lys Tyr

210 215 220

Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu Phe

225 230 235 240

Phe Phe Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn Arg

245 250 255

Ala Gly Glu Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Thr Leu Ile Ile Lys Gly

260 265 270

Ser Gly Asn Arg Thr Ser Val Gly Ser Ser Ile Tyr Val Asn Thr Pro

275 280 285

Ser Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr

290 295 300

Trp Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn

305 310 315 320

Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr

325 330 335

Leu Cys Ala Ser Val Thr Thr Ser Ser Thr Tyr Thr Asn Ser Asp Tyr

340 345 350

Lys Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe

355 360 365

Gln Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Val Ala Tyr Ile His

370 375 380

Thr Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Ser Pro

385 390 395 400

Pro Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser Gln

405 410 415

Ala Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Gln Lys Pro Asp Pro

420 425 430

Tyr Lys Asn Leu Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser

435 440 445

Ser Glu Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser

450 455 460

Gly Tyr Arg Gly Arg Ser Ser Ile Arg Thr Gly Val Lys Arg Pro Ala

465 470 475 480

Val Ser Lys Ala Ser Ala Ala Pro Lys Arg Lys Arg Ala Lys Thr Lys

485 490 495

Arg

<210> 7

<211> 496

<212> PRT

<213> 合成的肽

<220>

<223> H6N5-11T3

<400> 7

Met Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys Val

1 5 10 15

Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Thr Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His Ala

20 25 30

Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Ser Ile Lys

35 40 45

Arg Ala Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Tyr Gln Tyr Arg

50 55 60

Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro Asp

65 70 75 80

Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Thr

85 90 95

Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser Gly

100 105 110

His Pro Phe Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly Met Asp Tyr Lys

130 135 140

Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly Glu His

145 150 155 160

Trp Gly Lys Gly Thr Gln Cys Ser Asn Thr Ser Val Gln Asn Gly Asp

165 170 175

Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly Asp Met

180 185 190

Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln Thr Asn

195 200 205

Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile Cys Gly Thr Thr Cys Lys Tyr Pro

210 215 220

Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu Phe Phe

225 230 235 240

Phe Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn Arg Ala

245 250 255

Gly Glu Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Thr Leu Ile Ile Lys Gly Ser

260 265 270

Gly Asn Arg Thr Ser Val Gly Ser Ser Ile Tyr Val Asn Thr Pro Ser

275 280 285

Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp

290 295 300

Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln

305 310 315 320

Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu

325 330 335

Cys Ala Ser Val Thr Thr Ser Ser Thr Tyr Thr Asn Ser Asp Tyr Lys

340 345 350

Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln

355 360 365

Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Val Ala Tyr Ile His Thr

370 375 380

Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Ser Pro Pro

385 390 395 400

Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser Gln Ala

405 410 415

Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Gln Lys Pro Asp Pro Tyr

420 425 430

Lys Asn Leu Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ser

435 440 445

Glu Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Gly

450 455 460

Tyr Arg Gly Arg Ser Ser Ile Arg Thr Gly Val Lys Arg Pro Ala Val

465 470 475 480

Ser Lys Ala Ser Ala Ala Pro Lys Arg Lys Arg Ala Lys Thr Lys Arg

485 490 495

<210> 8

<211> 496

<212> PRT

<213> 合成的肽

<220>

<223> H6N5-11T4

<400> 8

Met Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys Val

1 5 10 15

Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Thr Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His Ala

20 25 30

Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Ser Ile Lys

35 40 45

Arg Ala Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Tyr Gln Tyr Arg

50 55 60

Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro Asp

65 70 75 80

Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Thr

85 90 95

Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser Gly

100 105 110

His Pro Phe Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly Met Asp Tyr Lys

130 135 140

Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly Glu His

145 150 155 160

Trp Gly Lys Gly Lys Gln Cys Thr Asn Thr Pro Val Gln Ala Gly Asp

165 170 175

Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly Asp Met

180 185 190

Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln Thr Asn

195 200 205

Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile Cys Gly Thr Thr Cys Lys Tyr Pro

210 215 220

Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu Phe Phe

225 230 235 240

Phe Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn Arg Ala

245 250 255

Gly Thr Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Asp Leu Leu Val Lys Gly Gly

260 265 270

Asn Asn Arg Ser Ser Val Ala Ser Ser Ile Tyr Val Asn Thr Pro Ser

275 280 285

Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp

290 295 300

Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln

305 310 315 320

Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu

325 330 335

Cys Ala Ser Val Thr Thr Ser Ser Thr Tyr Thr Asn Ser Asp Tyr Lys

340 345 350

Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln

355 360 365

Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Val Ala Tyr Ile His Thr

370 375 380

Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Ser Pro Pro

385 390 395 400

Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser Gln Ala

405 410 415

Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Gln Lys Pro Asp Pro Tyr

420 425 430

Lys Asn Leu Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ser

435 440 445

Glu Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Gly

450 455 460

Tyr Arg Gly Arg Ser Ser Ile Arg Thr Gly Val Lys Arg Pro Ala Val

465 470 475 480

Ser Lys Ala Ser Ala Ala Pro Lys Arg Lys Arg Ala Lys Thr Lys Arg

485 490 495

<210> 9

<211> 496

<212> PRT

<213> 合成的肽

<220>

<223> H6N5-11T5

<400> 9

Met Asp Ser Thr Val Tyr Val Pro Pro Pro Asn Pro Val Ser Lys Val

1 5 10 15

Val Ala Thr Asp Ala Tyr Val Thr Arg Thr Asn Ile Phe Tyr His Ala

20 25 30

Ser Ser Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro Tyr Phe Ser Ile Lys

35 40 45

Arg Ala Asn Lys Thr Val Val Pro Lys Val Ser Gly Tyr Gln Tyr Arg

50 55 60

Val Phe Lys Val Val Leu Pro Asp Pro Asn Lys Phe Ala Leu Pro Asp

65 70 75 80

Ser Ser Leu Phe Asp Pro Thr Thr Gln Arg Leu Val Trp Ala Cys Thr

85 90 95

Gly Leu Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro Leu Gly Val Gly Val Ser Gly

100 105 110

His Pro Phe Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Asn Pro Gly Gln Asp Asn Arg Val Asn Val Gly Met Asp Tyr Lys

130 135 140

Gln Thr Gln Leu Cys Met Val Gly Cys Ala Pro Pro Leu Gly Glu His

145 150 155 160

Trp Gly Lys Gly Lys Gln Cys Thr Asn Thr Pro Val Gln Ala Gly Asp

165 170 175

Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Thr Ser Val Ile Gln Asp Gly Asp Met

180 185 190

Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met Asn Phe Ala Asp Leu Gln Thr Asn

195 200 205

Lys Ser Asp Val Pro Ile Asp Ile Cys Gly Thr Thr Cys Lys Tyr Pro

210 215 220

Asp Tyr Leu Gln Met Ala Ala Asp Pro Tyr Gly Asp Arg Leu Phe Phe

225 230 235 240

Phe Leu Arg Lys Glu Gln Met Phe Ala Arg His Phe Phe Asn Arg Ala

245 250 255

Gly Glu Val Gly Glu Pro Val Pro Asp Thr Leu Ile Ile Lys Gly Ser

260 265 270

Gly Asn Arg Thr Ser Val Gly Ser Ser Ile Tyr Val Asn Thr Pro Ser

275 280 285

Gly Ser Leu Val Ser Ser Glu Ala Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp

290 295 300

Leu Gln Lys Ala Gln Gly His Asn Asn Gly Ile Cys Trp Gly Asn Gln

305 310 315 320

Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr Thr Arg Ser Thr Asn Met Thr Leu

325 330 335

Cys Ala Ser Val Ser Lys Ser Ala Thr Tyr Thr Asn Ser Asp Tyr Lys

340 345 350

Glu Tyr Met Arg His Val Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln

355 360 365

Leu Cys Ser Ile Thr Leu Ser Ala Glu Val Val Ala Tyr Ile His Thr

370 375 380

Met Asn Pro Ser Val Leu Glu Asp Trp Asn Phe Gly Leu Ser Pro Pro

385 390 395 400

Pro Asn Gly Thr Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Tyr Val Gln Ser Gln Ala

405 410 415

Ile Thr Cys Gln Lys Pro Thr Pro Glu Lys Gln Lys Pro Asp Pro Tyr

420 425 430

Lys Asn Leu Ser Phe Trp Glu Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ser

435 440 445

Glu Leu Asp Gln Tyr Pro Leu Gly Arg Lys Phe Leu Leu Gln Ser Gly

450 455 460

Tyr Arg Gly Arg Ser Ser Ile Arg Thr Gly Val Lys Arg Pro Ala Val

465 470 475 480

Ser Lys Ala Ser Ala Ala Pro Lys Arg Lys Arg Ala Lys Thr Lys Arg

485 490 495

<210> 10

<211> 1491

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HPV6N5

<400> 10

atggacagca cagtatatgt gcctcctcct aaccctgtat ccaaagttgt tgccacggat 60

gcttatgtta ctcgcaccaa catattttat catgccagca gttctagact tcttgcagtg 120

ggtcatcctt atttttccat aaaacgggct aacaaaactg ttgtgccaaa ggtgtcagga 180

tatcaataca gggtatttaa ggtggtgtta ccagatccta acaaatttgc attgcctgac 240

tcgtctcttt ttgatcccac aacacaacgt ttggtatggg catgcacagg cctagaggtg 300

ggcaggggac agccattagg tgtgggtgta agtggacatc ctttcctaaa taaatatgat 360

gatgttgaaa attcagggag tggtggtaac cctggacagg ataacagggt taatgttggt 420

atggattata aacaaacaca attatgcatg gttggatgtg cccccccttt gggcgagcat 480

tggggtaaag gtaaacagtg tactaataca cctgtacagg ctggtgactg cccgccctta 540

gaacttatta ccagtgttat acaggatggc gatatggttg acacaggctt tggtgctatg 600

aattttgctg atttgcagac caataaatca gatgttccta ttgatatatg tggcactaca 660

tgtaaatatc cagattattt acaaatggct gcagaccctt atggtgatag attatttttt 720

tttctacgga aggaacaaat gtttgccaga cattttttta acagggctgg cgaggtgggg 780

gaacctgtgc ctgatactct tataattaag ggtagtggaa atcgaacgtc tgtagggagt 840

agtatatatg ttaacacccc aagcggctct ttggtgtcct ctgaggcaca attgtttaat 900

aagccatatt ggctacaaaa agcccaggga cataacaatg gtatttgttg gggtaatcaa 960

ctgtttgtta ctgtggtaga taccacacgc agtaccaaca tgacattatg tgcatccgta 1020

actacatctt ccacatacac caattctgat tataaagagt acatgcgtca tgtggaagag 1080

tatgatttac aatttatttt tcaattatgt agcattacat tgtctgctga agtagtggcc 1140

tatattcaca caatgaatcc ctctgttttg gaagactgga actttgggtt atcgcctccc 1200

ccaaatggta cattagaaga tacctatagg tatgtgcagt cacaggccat tacctgtcaa 1260

aagcccactc ctgaaaagca aaagccagat ccctataaga accttagttt ttgggaggtt 1320

aatttaaaag aaaagttttc tagtgaattg gatcagtatc ctttgggacg caagtttttg 1380

ttacaaagtg gatatagggg acggtcctct attcgtaccg gtgttaagcg ccctgctgtt 1440

tccaaagcct ctgctgcccc taaacgtaag cgcgccaaaa ctaaaaggta a 1491

<210> 11

<211> 1497

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HPV11N4

<400> 11

atgagcgaca gcacagtata tgtgcctcct cccaaccctg tatccaaggt tgttgccacg 60

gatgcgtatg ttaaacgcac caacatattt tatcacgcca gcagttctag actccttgct 120

gtgggacatc catattactc tatcaaaaaa gttaacaaaa cagttgtacc aaaggtgtct 180

ggatatcaat atagagtgtt taaggtagtg ttgccagatc ctaacaagtt tgcattacct 240

gattcatctc tgtttgaccc cactacacag cgtttagtat gggcgtgcac agggttggag 300

gtaggcaggg gtcaaccttt aggcgttggt gttagtgggc atccattgct aaacaaatat 360

gatgatgtag aaaatagtgg tgggtatggt ggtaatcctg gtcaggataa tagggttaat 420

gtaggtatgg attataaaca aacccagcta tgtatggtgg gctgtgctcc accgttaggt 480

gaacattggg gtaagggtac acaatgttca aatacctctg tacaaaatgg tgactgcccc 540

ccgttggaac ttattaccag tgttatacag gatggggaca tggttgatac aggctttggt 600

gctatgaatt ttgcagactt acaaaccaat aaatcggatg ttccccttga tatttgtgga 660

actgtctgca aatatcctga ttatttgcaa atggcagcag acccttatgg tgataggttg 720

tttttttatt tgcgaaagga acaaatgttt gctagacact tttttaatag ggccggtact 780

gtgggggaac ctgtgcctga tgacctgttg gtaaaagggg gtaataatag gtcatctgta 840

gctagtagta tttatgtaca tacacctagt ggatccttgg tgtcttcaga ggctcaatta 900

tttaataaac catattggct tcaaaaggct cagggacata acaatggtat ttgctgggga 960

aaccacttgt ttgttactgt ggtagatacc acacgcagta caaatatgac actatgtgca 1020

tctgtgtcta aatctgctac atacactaat tcagattata aggaatatat gcgccatgtg 1080

gaggagtttg atttacagtt tatttttcaa ttgtgtagca ttacattatc tgcagaagtc 1140

atggcctata tacacacaat gaatccttct gttttggagg actggaactt tggtttatcg 1200

cctccaccaa atggtacact ggaggatact tatagatatg tacagtcaca ggccattacc 1260

tgtcagaaac ccacacccga aaaagaaaaa caggacccct ataaggatat gagtttttgg 1320

gaggttaact taaaagaaaa gttttcttct gaattagatc agtttcccct tggacgtaag 1380

tttttattgc aaagtggata tcgaggacgg acgtctgctc gtacaggtat aaagcgccca 1440

gctgtgtcta agccctctac agcccccaaa cgaaaacgta ccaaaaccaa aaagtaa 1497

<210> 12

<211> 1491

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H6N5-11T1

<400> 12

atggacagca cagtatatgt gcctcctcct aaccctgtat ccaaagttgt tgccacggat 60

gcttatgtta ctcgcaccaa catattttat catgccagca gttctagact tcttgcagtg 120

ggtcatcctt attactctat caaaaaagtt aacaaaacag ttgtaccaaa ggtgtctgga 180

tatcaataca gggtatttaa ggtggtgtta ccagatccta acaaatttgc attgcctgac 240

tcgtctcttt ttgatcccac aacacaacgt ttggtatggg catgcacagg cctagaggtg 300

ggcaggggac agccattagg tgtgggtgta agtggacatc ctttcctaaa taaatatgat 360

gatgttgaaa attcagggag tggtggtaac cctggacagg ataacagggt taatgttggt 420

atggattata aacaaacaca attatgcatg gttggatgtg cccccccttt gggcgagcat 480

tggggtaaag gtaaacagtg tactaataca cctgtacagg ctggtgactg cccgccctta 540

gaacttatta ccagtgttat acaggatggc gatatggttg acacaggctt tggtgctatg 600

aattttgctg atttgcagac caataaatca gatgttccta ttgatatatg tggcactaca 660

tgtaaatatc cagattattt acaaatggct gcagaccctt atggtgatag attatttttt 720

tttctacgga aggaacaaat gtttgccaga cattttttta acagggctgg cgaggtgggg 780

gaacctgtgc ctgatactct tataattaag ggtagtggaa atcgaacgtc tgtagggagt 840

agtatatatg ttaacacccc aagcggctct ttggtgtcct ctgaggcaca attgtttaat 900

aagccatatt ggctacaaaa agcccaggga cataacaatg gtatttgttg gggtaatcaa 960

ctgtttgtta ctgtggtaga taccacacgc agtaccaaca tgacattatg tgcatccgta 1020

actacatctt ccacatacac caattctgat tataaagagt acatgcgtca tgtggaagag 1080

tatgatttac aatttatttt tcaattatgt agcattacat tgtctgctga agtagtggcc 1140

tatattcaca caatgaatcc ctctgttttg gaagactgga actttgggtt atcgcctccc 1200

ccaaatggta cattagaaga tacctatagg tatgtgcagt cacaggccat tacctgtcaa 1260

aagcccactc ctgaaaagca aaagccagat ccctataaga accttagttt ttgggaggtt 1320

aatttaaaag aaaagttttc tagtgaattg gatcagtatc ctttgggacg caagtttttg 1380

ttacaaagtg gatatagggg acggtcctct attcgtaccg gtgttaagcg ccctgctgtt 1440

tccaaagcct ctgctgcccc taaacgtaag cgcgccaaaa ctaaaaggta a 1491

<210> 13

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H6N5-11T2

<400> 13

atggacagca cagtatatgt gcctcctcct aaccctgtat ccaaagttgt tgccacggat 60

gcttatgtta ctcgcaccaa catattttat catgccagca gttctagact tcttgcagtg 120

ggtcatcctt atttttccat aaaacgggct aacaaaactg ttgtgccaaa ggtgtcagga 180

tatcaataca gggtatttaa ggtggtgtta ccagatccta acaaatttgc attgcctgac 240

tcgtctcttt ttgatcccac aacacaacgt ttggtatggg catgcacagg cctagaggtg 300

ggcaggggtc aacctttagg cgttggtgtt agtgggcatc cattgctaaa caaatatgat 360

gatgtagaaa atagtggtgg gtatggtggt aatcctggtc aggataatag ggttaatgta 420

ggtatggatt ataaacaaac acaattatgc atggttggat gtgccccccc tttgggcgag 480

cattggggta aaggtaaaca gtgtactaat acacctgtac aggctggtga ctgcccgccc 540

ttagaactta ttaccagtgt tatacaggat ggcgatatgg ttgacacagg ctttggtgct 600

atgaattttg ctgatttgca gaccaataaa tcagatgttc ctattgatat atgtggcact 660

acatgtaaat atccagatta tttacaaatg gctgcagacc cttatggtga tagattattt 720

ttttttctac ggaaggaaca aatgtttgcc agacattttt ttaacagggc tggcgaggtg 780

ggggaacctg tgcctgatac tcttataatt aagggtagtg gaaatcgaac gtctgtaggg 840

agtagtatat atgttaacac cccaagcggc tctttggtgt cctctgaggc acaattgttt 900

aataagccat attggctaca aaaagcccag ggacataaca atggtatttg ttggggtaat 960

caactgtttg ttactgtggt agataccaca cgcagtacca acatgacatt atgtgcatcc 1020

gtaactacat cttccacata caccaattct gattataaag agtacatgcg tcatgtggaa 1080

gagtatgatt tacaatttat ttttcaatta tgtagcatta cattgtctgc tgaagtagtg 1140

gcctatattc acacaatgaa tccctctgtt ttggaagact ggaactttgg gttatcgcct 1200

cccccaaatg gtacattaga agatacctat aggtatgtgc agtcacaggc cattacctgt 1260

caaaagccca ctcctgaaaa gcaaaagcca gatccctata agaaccttag tttttgggag 1320

gttaatttaa aagaaaagtt ttctagtgaa ttggatcagt atcctttggg acgcaagttt 1380

ttgttacaaa gtggatatag gggacggtcc tctattcgta ccggtgttaa gcgccctgct 1440

gtttccaaag cctctgctgc ccctaaacgt aagcgcgcca aaactaaaag gtaa 1494

<210> 14

<211> 1491

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H6N5-11T3

<400> 14

atggacagca cagtatatgt gcctcctcct aaccctgtat ccaaagttgt tgccacggat 60

gcttatgtta ctcgcaccaa catattttat catgccagca gttctagact tcttgcagtg 120

ggtcatcctt atttttccat aaaacgggct aacaaaactg ttgtgccaaa ggtgtcagga 180

tatcaataca gggtatttaa ggtggtgtta ccagatccta acaaatttgc attgcctgac 240

tcgtctcttt ttgatcccac aacacaacgt ttggtatggg catgcacagg cctagaggtg 300

ggcaggggac agccattagg tgtgggtgta agtggacatc ctttcctaaa taaatatgat 360

gatgttgaaa attcagggag tggtggtaac cctggacagg ataacagggt taatgttggt 420

atggattata aacaaacaca attatgcatg gttggatgtg cccccccttt gggcgagcat 480

tggggtaagg gtacacaatg ttcaaatacc tctgtacaaa atggtgactg ccccccgtta 540

gaacttatta ccagtgttat acaggatggc gatatggttg acacaggctt tggtgctatg 600

aattttgctg atttgcagac caataaatca gatgttccta ttgatatatg tggcactaca 660

tgtaaatatc cagattattt acaaatggct gcagaccctt atggtgatag attatttttt 720

tttctacgga aggaacaaat gtttgccaga cattttttta acagggctgg cgaggtgggg 780

gaacctgtgc ctgatactct tataattaag ggtagtggaa atcgaacgtc tgtagggagt 840

agtatatatg ttaacacccc aagcggctct ttggtgtcct ctgaggcaca attgtttaat 900

aagccatatt ggctacaaaa agcccaggga cataacaatg gtatttgttg gggtaatcaa 960

ctgtttgtta ctgtggtaga taccacacgc agtaccaaca tgacattatg tgcatccgta 1020

actacatctt ccacatacac caattctgat tataaagagt acatgcgtca tgtggaagag 1080

tatgatttac aatttatttt tcaattatgt agcattacat tgtctgctga agtagtggcc 1140

tatattcaca caatgaatcc ctctgttttg gaagactgga actttgggtt atcgcctccc 1200

ccaaatggta cattagaaga tacctatagg tatgtgcagt cacaggccat tacctgtcaa 1260

aagcccactc ctgaaaagca aaagccagat ccctataaga accttagttt ttgggaggtt 1320

aatttaaaag aaaagttttc tagtgaattg gatcagtatc ctttgggacg caagtttttg 1380

ttacaaagtg gatatagggg acggtcctct attcgtaccg gtgttaagcg ccctgctgtt 1440

tccaaagcct ctgctgcccc taaacgtaag cgcgccaaaa ctaaaaggta a 1491

<210> 15

<211> 1491

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H6N5-11T4

<400> 15

atggacagca cagtatatgt gcctcctcct aaccctgtat ccaaagttgt tgccacggat 60

gcttatgtta ctcgcaccaa catattttat catgccagca gttctagact tcttgcagtg 120

ggtcatcctt atttttccat aaaacgggct aacaaaactg ttgtgccaaa ggtgtcagga 180

tatcaataca gggtatttaa ggtggtgtta ccagatccta acaaatttgc attgcctgac 240

tcgtctcttt ttgatcccac aacacaacgt ttggtatggg catgcacagg cctagaggtg 300

ggcaggggac agccattagg tgtgggtgta agtggacatc ctttcctaaa taaatatgat 360

gatgttgaaa attcagggag tggtggtaac cctggacagg ataacagggt taatgttggt 420

atggattata aacaaacaca attatgcatg gttggatgtg cccccccttt gggcgagcat 480

tggggtaaag gtaaacagtg tactaataca cctgtacagg ctggtgactg cccgccctta 540

gaacttatta ccagtgttat acaggatggc gatatggttg acacaggctt tggtgctatg 600

aattttgctg atttgcagac caataaatca gatgttccta ttgatatatg tggcactaca 660

tgtaaatatc cagattattt acaaatggct gcagaccctt atggtgatag attatttttt 720

tttctacgga aggaacaaat gtttgccaga cattttttta atagggccgg tactgtgggg 780

gaacctgtgc ctgatgacct gttggtaaaa gggggtaata ataggtcatc tgtagctagt 840

agtatttatg ttaacacccc aagcggctct ttggtgtcct ctgaggcaca attgtttaat 900

aagccatatt ggctacaaaa agcccaggga cataacaatg gtatttgttg gggtaatcaa 960

ctgtttgtta ctgtggtaga taccacacgc agtaccaaca tgacattatg tgcatccgta 1020

actacatctt ccacatacac caattctgat tataaagagt acatgcgtca tgtggaagag 1080

tatgatttac aatttatttt tcaattatgt agcattacat tgtctgctga agtagtggcc 1140

tatattcaca caatgaatcc ctctgttttg gaagactgga actttgggtt atcgcctccc 1200

ccaaatggta cattagaaga tacctatagg tatgtgcagt cacaggccat tacctgtcaa 1260

aagcccactc ctgaaaagca aaagccagat ccctataaga accttagttt ttgggaggtt 1320

aatttaaaag aaaagttttc tagtgaattg gatcagtatc ctttgggacg caagtttttg 1380

ttacaaagtg gatatagggg acggtcctct attcgtaccg gtgttaagcg ccctgctgtt 1440

tccaaagcct ctgctgcccc taaacgtaag cgcgccaaaa ctaaaaggta a 1491

<210> 16

<211> 1491

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H6N5-11T5

<400> 16

atggacagca cagtatatgt gcctcctcct aaccctgtat ccaaagttgt tgccacggat 60

gcttatgtta ctcgcaccaa catattttat catgccagca gttctagact tcttgcagtg 120

ggtcatcctt atttttccat aaaacgggct aacaaaactg ttgtgccaaa ggtgtcagga 180

tatcaataca gggtatttaa ggtggtgtta ccagatccta acaaatttgc attgcctgac 240

tcgtctcttt ttgatcccac aacacaacgt ttggtatggg catgcacagg cctagaggtg 300

ggcaggggac agccattagg tgtgggtgta agtggacatc ctttcctaaa taaatatgat 360

gatgttgaaa attcagggag tggtggtaac cctggacagg ataacagggt taatgttggt 420

atggattata aacaaacaca attatgcatg gttggatgtg cccccccttt gggcgagcat 480

tggggtaaag gtaaacagtg tactaataca cctgtacagg ctggtgactg cccgccctta 540

gaacttatta ccagtgttat acaggatggc gatatggttg acacaggctt tggtgctatg 600

aattttgctg atttgcagac caataaatca gatgttccta ttgatatatg tggcactaca 660

tgtaaatatc cagattattt acaaatggct gcagaccctt atggtgatag attatttttt 720

tttctacgga aggaacaaat gtttgccaga cattttttta acagggctgg cgaggtgggg 780

gaacctgtgc ctgatactct tataattaag ggtagtggaa atcgaacgtc tgtagggagt 840

agtatatatg ttaacacccc aagcggctct ttggtgtcct ctgaggcaca attgtttaat 900

aagccatatt ggctacaaaa agcccaggga cataacaatg gtatttgttg gggtaatcaa 960

ctgtttgtta ctgtggtaga taccacacgc agtaccaaca tgacattatg tgcatccgtg 1020

tctaaatctg ctacatacac taattcagat tataaagagt acatgcgtca tgtggaagag 1080

tatgatttac aatttatttt tcaattatgt agcattacat tgtctgctga agtagtggcc 1140

tatattcaca caatgaatcc ctctgttttg gaagactgga actttgggtt atcgcctccc 1200

ccaaatggta cattagaaga tacctatagg tatgtgcagt cacaggccat tacctgtcaa 1260

aagcccactc ctgaaaagca aaagccagat ccctataaga accttagttt ttgggaggtt 1320

aatttaaaag aaaagttttc tagtgaattg gatcagtatc ctttgggacg caagtttttg 1380

ttacaaagtg gatatagggg acggtcctct attcgtaccg gtgttaagcg ccctgctgtt 1440

tccaaagcct ctgctgcccc taaacgtaag cgcgccaaaa ctaaaaggta a 1491

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

gtcatcctta ttattccata aaaaaggtta acaaaactgt tgtgc 45

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

gcacaacagt tttgttaacc ttttttatgg aataataagg atgac 45

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

aaacaaacac aattatgcat ggctgg 26

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

caccacctta aataccctgt 20

<210> 21

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

tcaatacagg gtatttaagg tggtgttgcc agatcctaac aagtttgc 48

<210> 22

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

ccagccatgc ataattgtgt ttgtttataa tccataccta cat 43

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

attgatatat gtggcactac 20

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

agccatgcat aattgtgttt gt 22

<210> 25

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

aaacaaacac aattatgcat ggctggctgt gctccaccgt tagg 44

<210> 26

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

catgtagtgc cacatatatc aatgggaaca tccgatttat tgg 43

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

aacaccccaa gcggatcctt 20

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

gcaaacattt gttccttccg tag 23

<210> 29

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

tttctacgga aggaacaaat gtttgctaga cactttttta atag 44

<210> 30

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

aaggatccgc ttggggtgtt tacataaata ctactagcta c 41

<210> 31

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

gacattatgt gcatccgtat ctaaatctgc cacctacacc aattctgatt 50

<210> 32

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

aatcagaatt ggtgtaggtg gcagatttag atacggatgc acataatgt 49

<210> 33

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

cactatgtgc atctgtgact acatcttcta catacactaa ttcag 45

<210> 34

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

ctgaattagt gtatgtagaa gatgtagtca cagatgcaca tagtg 45

<210> 35

<211> 22

<212> PRT

<213> HPV 11

<400> 35

Leu Leu Asn Lys Tyr Asp Asp Val Glu Asn Ser Gly Gly Tyr Gly Gly

1 5 10 15

Asn Pro Gly Gln Asp Asn

20

Claims

1.一种突变的HPV6 L1蛋白，其中，所述突变的HPV6 L1蛋白与野生型HPV6 L1蛋白相比，具有下述突变：

(1)N端截短了2-5个氨基酸；和

(2)位于野生型HPV6 L1蛋白第119-139位的氨基酸残基被替换为野生型HPV11 L1蛋白的相应位置的氨基酸残基。

2.权利要求1所述的突变的HPV6 L1蛋白，其中，所述突变的HPV6 L1蛋白与野生型HPV6L1蛋白相比，N端截短了2个、3个、4个、或5个氨基酸。

3.权利要求1所述的突变的HPV6 L1蛋白，其中，所述突变的HPV6 L1蛋白与野生型HPV6L1蛋白相比，N端截短了5个氨基酸。

4.权利要求1-3任一项所述的突变的HPV6 L1蛋白，其中，(2)中所述的相应位置的氨基酸残基为野生型HPV11 L1蛋白第119-140位的氨基酸残基。

5.权利要求1-3任一项所述的突变的HPV6 L1蛋白，其中，所述野生型HPV6 L1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

6.权利要求1-3任一项所述的突变的HPV6 L1蛋白，其中，所述野生型HPV11 L1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

7.权利要求1所述的突变的HPV6 L1蛋白，其中，所述突变的HPV6 L1蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO:6所示。

8.一种分离的核酸，其编码权利要求1-7任一项所述的突变的HPV6 L1蛋白。

9.包含权利要求8所述的分离的核酸的载体。

10.包含权利要求8所述的分离的核酸和/或权利要求9所述的载体的宿主细胞。

11.一种HPV病毒样颗粒，其含有权利要求1-7任一项所述的突变的HPV6 L1蛋白，或者由权利要求1-7任一项所述的突变的HPV6 L1蛋白组成。

12.一种组合物，其包含权利要求1-7任一项所述的突变的HPV6 L1蛋白，或权利要求8的分离的核酸，或权利要求9的载体，或权利要求10的宿主细胞，或权利要求11的HPV病毒样颗粒。

13.一种药物组合物或疫苗，其包含权利要求11的HPV病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。

14.权利要求13的药物组合物或疫苗，其中，所述HPV病毒样颗粒以预防HPV感染或由HPV感染导致的疾病的有效量存在。

15.权利要求13的药物组合物或疫苗，其中，所述HPV感染是HPV6感染和/或HPV11感染。

16.权利要求13的药物组合物或疫苗，其中，所述由HPV感染所导致的疾病选自宫颈癌和尖锐湿疣。

17.制备权利要求1-7任一项所述的突变的HPV6 L1蛋白的方法，其包括，在宿主细胞中表达所述突变的HPV6 L1蛋白，然后从所述宿主细胞的培养物中回收所述突变的HPV6 L1蛋白。

18.权利要求17的方法，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

19.权利要求17的方法，其中，所述方法包括步骤：在大肠杆菌中表达所述突变的HPV6L1蛋白，然后从所述大肠杆菌的裂解上清中纯化得到所述突变的HPV6 L1蛋白。

20.权利要求19的方法，其中，通过色谱法从所述大肠杆菌的裂解上清中回收所述突变的HPV6 L1蛋白。

21.权利要求20的方法，其中，所述色谱法为阳离子交换色谱，羟基磷灰石色谱和/或疏水相互作用色谱。

22.一种制备疫苗的方法，其包括将权利要求11的HPV病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合。

23.权利要求1-7任一项所述的突变的HPV6 L1蛋白或权利要求11的HPV病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。

24.权利要求23的用途，其中，所述HPV感染是HPV6感染和/或HPV11感染。

25.权利要求23的用途，其中，所述由HPV感染所导致的疾病选自宫颈癌和尖锐湿疣。