CN109517809B - 一株缺失e蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒及制备方法与应用 - Google Patents

一株缺失e蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒及制备方法与应用。本发明将野生型传染性支气管炎病毒的E蛋白的第26位氨基酸由丙氨酸突变为苯丙氨酸，得到的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒。本发明通过构建缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒，以及获得了回复突变体，对突变后的病毒进行分离纯化方法及其特性分析，有助于开发特异性的抗病毒药物和预防病毒感染的有效疫苗，对冠状病毒的研究具有重大的公共卫生和经济意义。

Description

一株缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒及 制备方法与应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别涉及一株缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒及制备方法与应用。
背景技术
鸡的传染性支气管炎病毒是一种冠状病毒，在1937年首次被分离出，这种冠状病毒对全世界家禽产业造成重大经济损失。冠状病毒具有高度的传染性，造成呼吸道、肾脏和输卵管疾病的发生，引起机体体重变轻，肾脏出现故障，产蛋数量和质量下降。相关研究表明冠状病毒可以跨越物种屏障并成为致命的人畜共患病的病原体。目前，对冠状病毒感染无有效的治疗手段，开发减毒疫苗和特异性抗病毒药物是有前途的战略。
E蛋白是冠状病毒致病性的关键，它是一种小蛋白(76～109个氨基酸，约8～10kDa)，在感染细胞和成熟病毒体中含量较低的结构蛋白，对于冠状病毒的组装起到关键作用。在某些冠状病毒中，敲除E基因的重组病毒仍能保持复制能力，但其形成病毒体的形态具有严重缺陷，且滴度出现显著下降，例如在SARS-CoV中使缺失E蛋白，减少致病性和死亡数，而重组SARS-CoV缺乏E基因导致了细胞凋亡增加，下调了感染细胞相关的炎症因子。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒，以供研究IBV E蛋白离子通道活性缺失对E蛋白的结构、病毒增殖能力、形成病毒空斑的大小及其对细胞凋亡的影响，判断病毒的复制能力和致病力是否发生改变，并且为研制IBV减毒疫苗提供了参考方法。
本发明的另一目的在于提供上述缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一株缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒，是将野生型传染性支气管炎病毒的E蛋白的第26位氨基酸由丙氨酸A突变为苯丙氨酸F，得到的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒。
所述的野生型传染性支气管炎病毒的E蛋白的氨基酸序列如下：
MNLLNKSLEENGSFLTALYIIVGFLALYLLGRALQAFVQAADACCLFWYTWVVIPGAKGTAFVYKYTYGRKINNPELEAVIVNEFPKNGWNNKNPANFQDVQRDKLYS。
编码所述的野生型传染性支气管炎病毒的E蛋白的核苷酸序列如下：
ATGAATTTATTGAATAAGTCGCTAGAGGAGAATGGAAGTTTTCTAACAGCGCTTTACATAATTGTAGGATTTTTAGCACTTTATCTTCTAGGTAGAGCACTTCAAGCATTTGTACAGGCTGCTGATGCTTGTTGTTTATTTTGGTATACATGGGTAGTAATTCCAGGAGCTAAGGGTACAGCCTTTGTATACAAGTATACATATGGTAGAAAAATTAACAATCCGGAATTAGAAGCAGTTATTGTTAACGAGTTTCCTAAGAACGGTTGGAATAATAAAAATCCAGCAAATTTTCAAGATGTCCAACGAGACAAATTGTACTCTTGA。
所述的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的E蛋白的氨基酸序列如下：
MNLLNKSLEENGSFLTALYIIVGFLFLYLLGRALQAFVQAADACCLFWYTWVVIPGAKGTAFVYKYTYGRKINNPELEAVIVNEFPKNGWNNKNPANFQDVQRDKLYS。
编码所述的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的E蛋白的核苷酸序列如下：
ATGAATTTATTGAATAAGTCGCTAGAGGAGAATGGAAGTTTTCTAACAGCGCTTTACATAATTGTAGGATTTTTATTTCTTTATCTTCTAGGTAGAGCACTTCAAGCATTTGTACAGGCTGCTGATGCTTGTTGTTTATTTTGGTATACATGGGTAGTAATTCCAGGAGCTAAGGGTACAGCCTTTGTATACAAGTATACATATGGTAGAAAAATTAACAATCCGGAATTAGAAGCAGTTATTGTTAACGAGTTTCCTAAGAACGGTTGGAATAATAAAAATCCAGCAAATTTTCAAGATGTCCAACGAGACAAATTGTACTCTTGA。
上述缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的制备，包含如下步骤：
(1)将横跨整个传染性支气管炎病毒(IBV)基因组的名称为片段A、片段B、片段C、片段D和片段E的克隆入克隆载体中，得到重组载体A、重组载体B、重组载体C、重组载体D、重组载体E，其中，E蛋白在重组载体E上；在构建过程中，将限制性位点分别导入到5个片段的5’端和3’端，在A片段中还将T7启动子序列插入IBV基因组5’端的上游，利用T7聚合酶促进体外转录；
(2)以重组载体E为模板，通过带有突变位点的引物扩增，获得E蛋白突变的E片段；将E蛋白突变的E片段克隆入克隆载体中，得到重组载体E’；
(3)将片段A、片段B、片段C、片段D和E蛋白突变的E片段，得到的连接产物进行纯化，再在体外转录，得到全长转录本；以线性化的pKTO-IBV-N质粒为模板，体外转录得到N转录本；用DNaseⅠ处理全长转录本和N转录本，纯化，得到纯化后的全长转录本和N转录本；
(4)用步骤(3)纯化后的全长转录本和N转录本电转至非洲绿猴肾细胞株Vero细胞，出现典型细胞病变(细胞融合)，即获得缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒。
上述缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的制备，还包含如下步骤：
(5)收集含有缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的细胞上清，用无血清的培养基稀释；
(6)将稀释好的上清病毒感染到铺好Vero细胞的6孔培养板中，待Vero细胞吸附病毒后弃去上清，用无血清的培养基清洗细胞；然后在细胞上覆盖一层含琼脂的培养基，37℃培养至细胞出现病变；
(7)在步骤(6)最终处理好的6孔板中加入中性红溶液，染色，未被感染的细胞呈现红色，而形成的空斑变为透明色；用记号笔将空斑的轮廓描画出来，空斑尽量选择相距比较远的并且形态大小不同的；
(8)用无血清的培养基清洗铺好Vero细胞的12孔板，加入无血清培养基；将步骤(7)中做好记号的空斑上的琼脂转移到铺好Vero细胞的12孔板的中；
(9)放进37℃培养箱中培养；当在某些孔中观察到细胞100％病变，将该细胞冻融若干次，取部分样品提取其RNA进行基因测试，将序列正确的病毒扩增病冻存起来，得到纯化后的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒。
步骤(1)中所述的将限制性位点分别导入到5个片段的5’端和3’端是通过扩增所用的引物引入。
所述的片段A是传染性支气管炎病毒的第1～5751位核苷酸，引入的限制性位点为BsmBI；
所述的片段B是传染性支气管炎病毒的第5752～8693位核苷酸，引入的限制性位点为BsaI；
所述的片段C是传染性支气管炎病毒的第8694～15520位核苷酸，引入的限制性位点为BsaI；
所述的片段D是传染性支气管炎病毒的第15521～20900位核苷酸，引入的限制性位点为BsaI；
所述的片段E是传染性支气管炎病毒的第20901～27608位核苷酸，引入的限制性位点为BsaI。
步骤(1)中所述的克隆载体包括pKTO、pCR-XL-TOPO和pGEM-T Easy。
其中，所述的片段A适用的克隆载体优选为pKTO；
所述的片段B适用的克隆载体优选为pGEM-T Easy；
所述的片段C适用的克隆载体优选为pCR-XL-TOPO；
所述的片段D适用的克隆载体优选为pGEM-T Easy；
所述的片段E适用的克隆载体优选为pGEM-T Easy。
步骤(1)中所述的将T7启动子序列插入IBV基因组5’端的上游是通过扩增所用的引物引入。
步骤(1)中所述的克隆的技术为无缝克隆技术，其中所用的引物优选如下：
T7-IBV：5’-CGCTAGCTAATACGACTCACTATAGGACTTAAGATAGATATTAATA-3’；
IBV-5753R：5’-CGGGATCCGTCTCGCGACAACACTCTTAAC-3’；
IBV-5748F：5’-ATTATGGTCTCTGTCGCTAGCTATAAGACCG-3’；
IBV-8694R：5’-GGGTCTCGGCCTCAAATTTATCACCTATC-3’；
IBV-8689F：5’-CGGGATCCGGTCTCGAGGCCTACCTTTCAGCG-3’；
IBV-15532R：5’-GCAAAAGGTCTCAATGAATCAC-3’；
IBV-15511F：5’-CGGGATCCGTGATTCATTGAGACCTTTTGC-3’；
IBV-20930R：5’-ACACCTGCAGATGTAACATC-3’；
IBV-20887F：5’-GTTTACACCTCTAATGAGACCATAG-3’；
IBV-27608R：5’-GGAATTCGGTCTCG(T)30TGCTCTAACTCTATACTAGC-3’。
步骤(2)中所述的带有突变位点的引物如下：
IBVE_ampF：5’-CGCTCCAACAACTAATACAAG-3’；
IBVE_ampR：5’-AATGTTAAGGGGCCAAAAGC-3’。
步骤(3)中所述的片段A、片段B、片段C、片段D和E蛋白突变的E片段是通过引入的酶切位点对重组载体A、重组载体B、重组载体C、重组载体D、重组载体E’酶切得到。
步骤(3)中所述的连接是通过使用T4连接酶连接。
步骤(3)中所述的纯化的步骤为先通过苯酚/氯仿/异戊醇提取，再通过乙醇沉淀。
步骤(3)中所述的体外转录所使用到的试剂盒为mMessagemMachineT7试剂盒。
步骤(3)中所述的全长转录本的体外转录条件优选为：GTP：CAP类似物＝1：1进行转录反应，反应体系为30μL，反应条件为：40.5℃25min；37.5℃50min；40.5℃25min；37.5℃20min。
步骤(3)中所述的N转录本的体外转录条件优选为：GTP：CAP类似物＝1：2进行转录反应，反应体系为30μL，反应条件为：40.5℃25min；37.5℃50min；40.5℃25min；37.5℃20min。
步骤(4)中所述的电转的具体步骤优选如下：待Vero细胞生长密度达到90％，胰酶消化，用预冷的PBS洗涤两次，重悬于PBS中；将400μl浓度为2×106个细胞/mL的Vero细胞悬液加入4mm电转杯中，加入纯化后的全长转录本和N转录本，于450V、50μF的条件下进行一次脉冲；电转后的Vero细胞置于60mm培养皿或6孔板中，用含1％FBS的MEM培养基培养过夜后换成不含FBS的MEM培养基继续培养。
步骤(5)中所述的细胞上清在细胞刚好完全病变时收集最佳。
步骤(5)中所述的培养基优选为DMEM培养基。
步骤(5)中所述的稀释优选为按10的倍数倍比稀释。
步骤(6)中所述的吸附的时间优选为2h。
步骤(6)中所述的无血清的培养基优选为DMEM培养基。
步骤(6)中所述的含琼脂的培养基中琼脂的用量是使得含琼脂的培养基处于半流体或质地软的固体为宜(如用Tip头即可以吸取的程度)；琼脂的用量优选为在培养基中的浓度为质量体积比0.2％～0.8％，更优选为在培养基中的浓度为质量体积比0.3％～0.5％。
步骤(6)中所述的含琼脂的培养基中的培养基优选为DMEM培养基。
步骤(6)中所述的培养的时间优选为48h。
步骤(7)中所述的中性红溶液的用量优选为能完全覆盖住琼脂培养基的平面为宜，优选为500μl。
步骤(7)中所述的中性红溶液的浓度优选为质量体积比0.1％。
步骤(8)中所述的无血清的培养基优选为DMEM培养基。
步骤(9)中所述的冻融的次数优选为3次。
上述缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒在传染性支气管炎病毒功能研究和/或制备疫苗中的应用。
所述的疫苗优选为减毒疫苗。
所述的传染性支气管炎病毒功能研究包括利用上述缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒制备回复突变体，研究不同的突变体的功能，从而了解传染性支气管炎病毒功能。
一种传染性支气管炎病毒回复突变体，为利用上述缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒制备得到。
所述的传染性支气管炎病毒回复突变体的氨基酸序列如下所示：
MNLLNKSLEENGSNLTALYIIVGFLFLYLLGRALQAFVQAADACCLFWYTWVVIPGAKGTAFVYKYTYGRKINNPELEAVIVNEFPKNGWNNKNPANFQDVQRDKLYS。
编码所述的传染性支气管炎病毒回复突变体的核苷酸序列如下所示：
ATGAATTTATTGAATAAGTCGCTAGAGGAGAATGGAAGTAACCTAACAGCGCTTTACATAATTGTAGGATTTTTATTTCTTTATCTTCTAGGTAGAGCACTTCAAGCATTTGTACAGGCTGCTGATGCTTGTTGTTTATTTTGGTATACATGGGTAGTAATTCCAGGAGCTAAGGGTACAGCCTTTGTATACAAGTATACATATGGTAGAAAAATTAACAATCCGGAATTAGAAGCAGTTATTGTTAACGAGTTTCCTAAGAACGGTTGGAATAATAAAAATCCAGCAAATTTTCAAGATGTCCAACGAGACAAATTGTACTCTTGA。
所述的传染性支气管炎病毒回复突变体的制备方法，包括如下步骤：
(A)将上述缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒对Vero细胞进行感染，37℃培养24小时，收集上清，再用该上清病毒感染新铺好板的Vero细胞，以此类推感染到30代；
(B)收集，裂解并提取第5，10，15，20，25，30代感染病毒后的细胞RNA，RT-PCR，E基因测序，比对序列，观察E基因的新突变，得到传染性支气管炎病毒回复突变体。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供了一株E蛋白离子通道缺失的传染性支气管炎病毒(即IBV突变株)，并提供了一株回复体，生物物理学的电压钳实验结果表明，纯化的IBV E蛋白具有离子通道活性，而带有T16A或A26F的蛋白丧失此活性。该传染性支气管炎病毒的E蛋白离子通道活性缺失后引起的细胞病变，凋亡变弱，其可用于制备减毒疫苗。
(2)本发明通过测定病毒增殖曲线，发现IBV E蛋白离子通道缺失不影响病毒在细胞内的增殖，这有利于获得IBV突变株。
(3)本发明提供的IBV突变株的获得有助于研究IBV E蛋白离子通道缺失对E蛋白的结构、病毒的增殖能力、形成空斑的大小及其对细胞凋亡的影响，并可判断病毒的复制能力和致病力是否发生改变。
(4)本发明提供了一种可行的IBV病毒纯化分析方法及应用。
综上，本发明通过构建一株缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒，以及获得了回复突变体，对突变后的病毒进行分离纯化方法及其特性分析，这有助于开发特异性的抗病毒药物和预防病毒感染的有效疫苗，对冠状病毒的研究具有重大的公共卫生和经济意义。
附图说明
图1是IBV的基因组结构图；其中，图a为蛋白结构示意图，其中，包括多蛋白复制酶，结构蛋白S、E、M和N，附属蛋白3a、3b、5a和5b，5′UTR和3′UTR；图b是本发明构建时的片段分布示意图，其中，包括了A～E片段的长度、所使用的酶切位点，在A片段的5’端添加了T7启动子序列。
图2是各株病毒在不同时间点的TCID50的检测结果图；其中，WT-rIBV为野生型病毒，A26F为缺失突变型病毒，F14N/A26F为回复突变型病毒；横坐标代表时间，单位为h。
图3是各株病毒在不同时间点的相关基因的检测结果图；其中，WT-rIBV为野生型病毒，A26F为缺失突变型病毒，F14N/A26F为回复突变型病毒；纵坐标代表以GAPDH为内参计算特定基因的折叠诱导，横坐标代表每个病毒感染的时间，单位为h。
图4是各株病毒在不同时间点的竞争实验的检测结果图；其中，图A是野生型病毒WT和缺失突变型病毒A26F的竞争结果图，图B是野生型病毒WT和回复突变型病毒F14N/A26F的竞争结果图，图C是缺失突变型病毒A26F和回复突变型病毒F14N/A26F的竞争结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1基于无缝克隆技术的IBV感染性cDNA克隆
基于无缝技术，对传染性支气管炎病毒的E蛋白基因位点序列进行突变设计，获得横跨整个IBV基因组的5个片段，分别为片段A、片段B、片段C、片段D和片段E，将限制性位点分别导入到5个片段的5’端和3’端，结合T7启动子，体外连接得到克隆株，在体外转录得到全长的RNA(如图1所示)；具体步骤如下：
(1)用鸡IBV感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞，ATCC)，IBV来源及感染方式见文献“S.Shen,et al.Emergence of a coronavirus infectious bronchitis virus mutantwith a truncated 3b gene:functional characterization of the 3b protein inpathogenesis and replication.”。
(2)通过TrizoL从IBV感染的非洲绿猴肾细胞(Vero细胞，ATCC)提取的总RNA，利用RT-PCR技术扩增出片段，引物见表1。然后将PCR产物纯化并克隆到pKTO(pKTO载体已在文献“An arginine-to-proline mutation in a domain with undefined functions withinthe helicase protein(Nsp13)is lethal to the coronavirus infectious bronchitisvirus in cultured cells”中公开)，pCR-XL-TOPO(Invitrogen)或pGEM-T Easy(Promega)载体中，得到如下的重组载体：pKTO-A、pGEM-B、pCR-XL-TOPO-C、pGEM-D、pGEM-E。
表1构建IBV全长感染性克隆的引物
Figure BDA0001886376480000041
(3)用如表2所示的引物对E蛋白所在的pGEM-E载体进行点突变。
表2E蛋白点突变引物
Figure BDA0001886376480000051
PCR反应体系如下：模板(pGEM-E)1ng、2×pfu PCR mix 25μL、IBVE_ampF(20μM)1μL、IBVE_ampR(20μM)1μL、去离子水补足50μL
PCR条件为：预变性：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸7min，进行18个循环；72℃终延伸10min。然后试剂盒回收纯化PCR产物，得到平末端线性化质粒；接着用T4连接酶连接，得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性初筛、用表2中引物进行复筛得到的单克隆送测序公司测序，得到突变了E蛋白离子通道缺失的E片段质粒pGEM-E(A26F)。
(4)将步骤(2)和步骤(3)得到的质粒用BsmBI(含A段)(NEB)或BsaI(含B、C、D段、突变了E蛋白离子通道活性缺失的E片段)(NEB)酶切消化，用0.8％琼脂糖凝胶进行结晶紫染色，电泳回收纯化。在16℃下用T4DNA连接酶(Thermo)连接过夜，用苯酚/氯仿/异戊醇提取连接产物，乙醇沉淀，使用高产量加帽RNA转录试剂盒(mMessagemMachine T7kit，Ambion)在体外产生全长转录RNA。全长转录本的体外转录条件优为：GTP：CAP类似物＝1：1进行转录反应，反应体系为30μL，反应条件为：40.5℃25min；37.5℃50min；40.5℃25min；37.5℃20min。
(5)以线性化的pKTO-IBV-N质粒(含IBV N基因和3’UTR区，其已在文献“Anarginine-to-proline mutation in a domain with undefined functions within thehelicase protein(Nsp13)is lethal to the coronavirus infectious bronchitisvirus in cultured cells”中公开)为模板，构建N转录RNA。用DNaseⅠ处理体外转录的全长RNA和N转录RNA，用酚/氯仿进行纯化(参照《分子克隆》操作)。N转录本的体外转录条件为：GTP：CAP类似物＝1：2进行转录反应，反应体系为30μL，反应条件为：40.5℃25min；37.5℃50min；40.5℃25min；37.5℃20min。
(6)用含10％(v/v)FBS的MEM培养基培养Vero细胞生长密度达到90％，胰酶(Gibco)消化，用预冷的PBS(80mM Na2HPO4，20mM NaH2PO4，100mM NaCl，pH7.5)洗涤两次，重悬于PBS中。将400μl Vero细胞悬液(2×106个细胞/mL)加入4mm电转杯(Bio-Rad)中，加入8μg步骤(4)制备的全长转录本以及1μg步骤(5)制备的N转录RNA，放置于Bio-Rad GenePulser II电转仪内，用450V、50μF进行一次脉冲。电转后的Vero细胞置于60mm培养皿或6孔板中，用含1％FBS(Gibco)的MEM(Gibco)培养基培养过夜后换成不含FBS的MEM培养基继续培养。发现典型细胞病变(细胞融合)，说明成功构建了感染性克隆。将细胞连同培养基冻融三次后离心取上清保存于-80℃，获得突变型IBV，将其命名为rIBV-A26F。
突变的E蛋白的核苷酸序列如下：
ATGAATTTATTGAATAAGTCGCTAGAGGAGAATGGAAGTTTTCTAACAGCGCTTTACATAATTGTAGGATTTTTATTTCTTTATCTTCTAGGTAGAGCACTTCAAGCATTTGTACAGGCTGCTGATGCTTGTTGTTTATTTTGGTATACATGGGTAGTAATTCCAGGAGCTAAGGGTACAGCCTTTGTATACAAGTATACATATGGTAGAAAAATTAACAATCCGGAATTAGAAGCAGTTATTGTTAACGAGTTTCCTAAGAACGGTTGGAATAATAAAAATCCAGCAAATTTTCAAGATGTCCAACGAGACAAATTGTACTCTTGA。
突变的E蛋白的氨基酸序列如下：
MNLLNKSLEENGSFLTALYIIVGFLFLYLLGRALQAFVQAADACCLFWYTWVVIPGAKGTAFVYKYTYGRKINNPELEAVIVNEFPKNGWNNKNPANFQDVQRDKLYS。
实施例2缺失E蛋白离子通道活性的rIBV-A26F的重组和纯化方法，包括如下步骤：
(1)首先通过无缝克隆技术对传染性支气管炎病毒的E蛋白基因位点序列进行缺失设计，结合T7启动子，体外连接得到完整RNA克隆株；接着将上述的克隆株进行感染性克隆，即将得到的克隆序列通过电转化方法导入到Vero细胞中，获得缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒：具体操作同
实施例1。
(2)收集感染了rIBV-A26F的细胞上清，接着用无血清的DMEM进行10倍的稀释，通过空斑纯化实验进行病毒滴度的测试。
(3)将稀释好的上清病毒感染到铺好6孔板Vero细胞的板中，经过2个小时病毒被吸附，抽掉上清，用无血清的DMEM清洗细胞。最后将含有0.4％琼脂糖的DMEM覆盖在细胞上，37℃培养2天；
(4)在纯化的前一天铺好一个12孔板的Vero细胞板，在上述的6孔板中加入500μl浓度为0.1％的中性红溶液到琼脂糖上，染色1-2小时。未被感染的细胞呈现红色，而形成的空斑变为透明色。
(5)用记号笔将空斑的轮廓描画出来，空斑尽量选择相距比较远的并且形态大小不同的。
(6)用无血清的DMEM清洗铺好的12孔板的Vero细胞，并加入600μl无血清的DMEM。用1ml蓝色枪头吸取覆盖在空斑上的琼脂，转移到铺好的12孔板的Vero细胞中。
(7)放进37℃培养箱中培养24-36小时，观察细胞的病变反应。
(8)当在某些孔中观察到细胞100％病变，将该细胞冻融3次，最后冻存在-80℃冰箱中，提取其RNA进行基因测试，最后将序列正确的病毒扩增病冻存起来。rIBV-A26F突变病毒即被纯化。
实施例3适应Vero细胞的缺失E蛋白离子通道活性IBV突变体弱毒株的稳定性分析
(1)将rIBV-A26F突变病毒对Vero细胞进行感染，37℃培养24小时，收集上清，再用该上清病毒感染新铺好板的Vero细胞，以此类推感染到30代；
(2)收集，裂解并提取第5，10，15，20，25，30代感染病毒后的细胞RNA，RT-PCR，E基因测序，比对序列，看有无E基因的新突变，从而确定该毒株的遗传稳定性,其中扩增的E基因的引物同表2引物，测序引物为上游引物。
(3)测序结果分析，在第10代开始，rIBV-A26F突变病毒的第26个氨基酸苯丙氨酸的第二个T逐渐被替换成C，由原来的TTT密码子转变成TCT，即由苯丙氨酸转变为丝氨酸；同理，第58个氨基酸赖氨酸AAG的G逐渐变为T形成天冬酰胺AAT；第64个氨基酸酪氨酸TAC中的T逐渐转变为C形成组氨酸CAC；可见E基因有新突变的趋势。
实施例4离子通道活性回复突变体型毒株(rIBV-F14N/A26F)的纯化分离
(1)将测序结果含有回复突变体毒株(rIBV-F14N/A26F)的E蛋白缺失型重组病毒(rIBV-A26F)感染Vero细胞；
回复突变体毒株(rIBV-F14N/A26F)的E蛋白的核苷酸序列是：
ATGAATTTATTGAATAAGTCGCTAGAGGAGAATGGAAGTAACCTAACAGCGCTTTACATAATTGTAGGATTTTTATTTCTTTATCTTCTAGGTAGAGCACTTCAAGCATTTGTACAGGCTGCTGATGCTTGTTGTTTATTTTGGTATACATGGGTAGTAATTCCAGGAGCTAAGGGTACAGCCTTTGTATACAAGTATACATATGGTAGAAAAATTAACAATCCGGAATTAGAAGCAGTTATTGTTAACGAGTTTCCTAAGAACGGTTGGAATAATAAAAATCCAGCAAATTTTCAAGATGTCCAACGAGACAAATTGTACTCTTGA。
回复突变体毒株(rIBV-F14N/A26F)的E蛋白的氨基酸序列是：
MNLLNKSLEENGSNLTALYIIVGFLFLYLLGRALQAFVQAADACCLFWYTWVVIPGAKGTAFVYKYTYGRKINNPELEAVIVNEFPKNGWNNKNPANFQDVQRDKLYS。
(2)收集感染病毒的细胞上清，接着用无血清的DMEM进行10倍的稀释，通过空斑纯化实验获得回复突变体毒株(rIBV-F14N/A26F)，详细步骤同实施例2。
(3)提取其病毒RNA进行RT-PCR，E基因测试，送公司测序，最后将比对序列正确的病毒进行扩增并冻存起来。该回复型毒株(rIBV-F14N/A26F)即被纯化，其中扩增的E基因的引物同表2引物，测序引物为上游引物。
实施例5离子通道活性缺失型突变体和回复型突变体的复制能力及致病性分析
(1)收集野生型病毒(WT-rIBV)，缺失突变型病毒(rIBV-A26F)和回复突变型病毒(rIBV-F14N/A26F)在0h，8h，16h，24h，32h，40h这6个时间点的上清和Trizol裂解液(碧云天)裂解细胞提取RNA。
(2)对上述收集的上清进行TCID50的实验，测试和比较分析三个病毒的滴度情况，进而得出其复制能力，结果如图2所示，显示三个病毒的复制能力没有明显的区别。
(3)对上述提取的RNA进行RT-PCR，q-PCR检测gRNA，sgRNA2，Il-6，Il-8，ISG-15，ISG-20，CHOP这几个基因在三个病毒中的表达情况，引物见表3，进行数据分析和比较分析，得出细胞的免疫能力，如图3所示。
表3qPCR相关引物序列表
Figure BDA0001886376480000061
Figure BDA0001886376480000071
(4)将野生型病毒(WT-rIBV)，缺失突变型病毒(rIBV-A26F)和回复突变型病毒(rIBV-F14N/A26F)这三个病毒两两进行组合，调整相应比例(分别是WT-rIBV：rIBV-A26F＝WT-rIBV：rIBV-F14N/A26F＝rIBV-F14N/A26F：rIBV-A26F＝1：50)进行竞争传代实验，每组各竞争传代6代，每代在细胞完全病变时收集上清进行传代感染，再收集提取每代细胞的RNA，进行RT-PCR，E基因PCR验证，送测序，比对结果绘制竞争曲线，得出竞争趋势，进行致病性分析，如图4所示，其中扩增的E基因的引物同表2引物，测序引物为上游引物。结果显示，缺失突变型病毒(rIBV-A26F)相比于野生型病毒(WT-rIBV)和回复突变型病毒(rIBV-F14N/A26F)，其致病性明显较弱。
(5)收集野生型病毒(WT-rIBV)，缺失突变型病毒(rIBV-A26F)和回复突变型病毒(rIBV-F14N/A26F)这三个病毒在18h，20h，22h，24h，26h，28h这6个时间点感染Vero细胞之后的蛋白，Western blot实验，孵凋亡基因蛋白PARP，得出三个病毒各自影响细胞凋亡能力。
上面所述缺失E蛋白离子通道活性的重组rIBV-A26F突变病毒的构建和其回复突变型毒株的分离纯化及特性分析有助于制备相关疫苗，减弱病毒。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一株缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒及制备方法与应用
<130> 1
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> 鸡(Gallus gallus)
<220>
<223> 野生型传染性支气管炎病毒的E蛋白的氨基酸序列
<400> 1
Met Asn Leu Leu Asn Lys Ser Leu Glu Glu Asn Gly Ser Phe Leu Thr
1 5 10 15
Ala Leu Tyr Ile Ile Val Gly Phe Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Gly Arg
20 25 30
Ala Leu Gln Ala Phe Val Gln Ala Ala Asp Ala Cys Cys Leu Phe Trp
35 40 45
Tyr Thr Trp Val Val Ile Pro Gly Ala Lys Gly Thr Ala Phe Val Tyr
50 55 60
Lys Tyr Thr Tyr Gly Arg Lys Ile Asn Asn Pro Glu Leu Glu Ala Val
65 70 75 80
Ile Val Asn Glu Phe Pro Lys Asn Gly Trp Asn Asn Lys Asn Pro Ala
85 90 95
Asn Phe Gln Asp Val Gln Arg Asp Lys Leu Tyr Ser
100 105
<210> 2
<211> 327
<212> DNA
<213> 鸡(Gallus gallus)
<220>
<223> 野生型传染性支气管炎病毒的E蛋白的核苷酸序列
<400> 2
atgaatttat tgaataagtc gctagaggag aatggaagtt ttctaacagc gctttacata 60
attgtaggat ttttagcact ttatcttcta ggtagagcac ttcaagcatt tgtacaggct 120
gctgatgctt gttgtttatt ttggtataca tgggtagtaa ttccaggagc taagggtaca 180
gcctttgtat acaagtatac atatggtaga aaaattaaca atccggaatt agaagcagtt 240
attgttaacg agtttcctaa gaacggttgg aataataaaa atccagcaaa ttttcaagat 300
gtccaacgag acaaattgta ctcttga 327
<210> 3
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> E蛋白离子通道活性缺失的传染性支气管炎病毒的E蛋白的氨基酸序列
<400> 3
Met Asn Leu Leu Asn Lys Ser Leu Glu Glu Asn Gly Ser Phe Leu Thr
1 5 10 15
Ala Leu Tyr Ile Ile Val Gly Phe Leu Phe Leu Tyr Leu Leu Gly Arg
20 25 30
Ala Leu Gln Ala Phe Val Gln Ala Ala Asp Ala Cys Cys Leu Phe Trp
35 40 45
Tyr Thr Trp Val Val Ile Pro Gly Ala Lys Gly Thr Ala Phe Val Tyr
50 55 60
Lys Tyr Thr Tyr Gly Arg Lys Ile Asn Asn Pro Glu Leu Glu Ala Val
65 70 75 80
Ile Val Asn Glu Phe Pro Lys Asn Gly Trp Asn Asn Lys Asn Pro Ala
85 90 95
Asn Phe Gln Asp Val Gln Arg Asp Lys Leu Tyr Ser
100 105
<210> 4
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> E蛋白离子通道活性缺失的传染性支气管炎病毒的E蛋白的核苷酸序列
<400> 4
atgaatttat tgaataagtc gctagaggag aatggaagtt ttctaacagc gctttacata 60
attgtaggat ttttatttct ttatcttcta ggtagagcac ttcaagcatt tgtacaggct 120
gctgatgctt gttgtttatt ttggtataca tgggtagtaa ttccaggagc taagggtaca 180
gcctttgtat acaagtatac atatggtaga aaaattaaca atccggaatt agaagcagtt 240
attgttaacg agtttcctaa gaacggttgg aataataaaa atccagcaaa ttttcaagat 300
gtccaacgag acaaattgta ctcttga 327
<210> 5
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 传染性支气管炎病毒回复突变体的氨基酸序列
<400> 5
Met Asn Leu Leu Asn Lys Ser Leu Glu Glu Asn Gly Ser Asn Leu Thr
1 5 10 15
Ala Leu Tyr Ile Ile Val Gly Phe Leu Phe Leu Tyr Leu Leu Gly Arg
20 25 30
Ala Leu Gln Ala Phe Val Gln Ala Ala Asp Ala Cys Cys Leu Phe Trp
35 40 45
Tyr Thr Trp Val Val Ile Pro Gly Ala Lys Gly Thr Ala Phe Val Tyr
50 55 60
Lys Tyr Thr Tyr Gly Arg Lys Ile Asn Asn Pro Glu Leu Glu Ala Val
65 70 75 80
Ile Val Asn Glu Phe Pro Lys Asn Gly Trp Asn Asn Lys Asn Pro Ala
85 90 95
Asn Phe Gln Asp Val Gln Arg Asp Lys Leu Tyr Ser
100 105
<210> 6
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 传染性支气管炎病毒回复突变体的核苷酸序列
<400> 6
atgaatttat tgaataagtc gctagaggag aatggaagta acctaacagc gctttacata 60
attgtaggat ttttatttct ttatcttcta ggtagagcac ttcaagcatt tgtacaggct 120
gctgatgctt gttgtttatt ttggtataca tgggtagtaa ttccaggagc taagggtaca 180
gcctttgtat acaagtatac atatggtaga aaaattaaca atccggaatt agaagcagtt 240
attgttaacg agtttcctaa gaacggttgg aataataaaa atccagcaaa ttttcaagat 300
gtccaacgag acaaattgta ctcttga 327
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物T7-IBV
<400> 7
cgctagctaa tacgactcac tataggactt aagatagata ttaata 46
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物IBV-5753R
<400> 8
cgggatccgt ctcgcgacaa cactcttaac 30
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物IBV-5748F
<400> 9
attatggtct ctgtcgctag ctataagacc g 31
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物IBV-8694R
<400> 10
gggtctcggc ctcaaattta tcacctatc 29
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物IBV-8689F
<400> 11
cgggatccgg tctcgaggcc tacctttcag cg 32
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物IBV-15532R
<400> 12
gcaaaaggtc tcaatgaatc ac 22
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物IBV-15511F
<400> 13
cgggatccgt gattcattga gaccttttgc 30
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物IBV-20930R
<400> 14
acacctgcag atgtaacatc 20
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物IBV-20887F
<400> 15
gtttacacct ctaatgagac catag 25
<210> 16
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物IBV-27608R
<400> 16
ggaattcggt ctcgtttttt tttttttttt tttttttttt tttttgctct aactctatac 60
tagc 64
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物IBVE_ampF
<400> 17
cgctccaaca actaatacaa g 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物IBVE_ampR
<400> 18
aatgttaagg ggccaaaagc 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物gRNA-F
<400> 19
gttctcgcat aaggtcggct a 21
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物gRNA-R
<400> 20
gctcactaaa caccaccaga ac 22
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物IBV-sgRNA2-rtqF
<400> 21
gccttgcgct agatttttaa ctg 23
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物IBV-sgRNA2-rtqR
<400> 22
agtgcacaca aaagagtcac ta 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物Vero_IL6_rtqF
<400> 23
aaagtcctga tccagttcct gc 22
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物Vero_IL6_rtqR
<400> 24
ttctgcgcct gcagcttc 18
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物Vero_IL8_rtqF
<400> 25
aagacgtact ccaaacctat ccac 24
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物Vero_IL8_rtqR
<400> 26
tggacagatg cgatgaacct c 21
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物Vero_ISG15_rtqF
<400> 27
ttcaccattc ggtcgatcag ag 22
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物Vero_ISG15_rtqR
<400> 28
gtcagctgta cctcgtaggt g 21
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物vero_ISG20_rtqF
<400> 29
ctcgttgcag cctcgtgaa 19
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物vero_ISG20_rtqR
<400> 30
ccgtgttctg taatcggtga tctc 24
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物CHOP_rtqF
<400> 31
gaacggctca agcaggaaat c 21
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物CHOP_rtqR
<400> 32
ttcaccattc ggtcgatcag ag 22

Claims (9)

1.一株缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒，其特征在于：是将野生型传染性支气管炎病毒的E蛋白的第26位氨基酸由丙氨酸突变为苯丙氨酸，得到的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒；
所述的野生型传染性支气管炎病毒的E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒，其特征在于：
编码所述的野生型传染性支气管炎病毒的E蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
编码所述的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的E蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.权利要求1或2所述的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
（1）将横跨整个传染性支气管炎病毒基因组的名称为片段A、片段B、片段C、片段D和片段E的克隆入克隆载体中，得到重组载体A、重组载体B、重组载体C、重组载体D、重组载体E，其中，E蛋白在重组载体E上；在构建过程中，将限制性位点分别导入到5个片段的5’端和3’端，在A片段中还将T7启动子序列插入IBV基因组5’端的上游，利用T7聚合酶促进体外转录；
（2）以重组载体E为模板，通过带有突变位点的引物扩增，获得E蛋白突变的E片段；将E蛋白突变的E片段克隆入克隆载体中，得到重组载体E’；
（3）将片段A、片段B、片段C、片段D和E蛋白突变的E片段，得到的连接产物进行纯化，再在体外转录，得到全长转录本；以线性化的pKTO-IBV-N质粒为模板，体外转录得到N转录本；用DNaseⅠ处理全长转录本和N转录本，纯化，得到纯化后的全长转录本和N转录本；
（4）用步骤（3）纯化后的全长转录本和N转录本电转至非洲绿猴肾细胞株Vero细胞，出现典型细胞病变，即获得缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒。
4.根据权利要求3所述的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，其特征在于还包括如下步骤：
（5）收集含有缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的细胞上清，用无血清的培养基稀释；
（6）将稀释好的上清病毒感染到铺好Vero细胞的6孔培养板中，待Vero细胞吸附病毒后弃去上清，用无血清的培养基清洗细胞；然后在细胞上覆盖一层含琼脂的培养基，37℃培养至细胞出现病变；
（7）在步骤（6）最终处理好的6孔板中加入中性红溶液，染色，未被感染的细胞呈现红色，而形成的空斑变为透明色；用记号笔将空斑的轮廓描画出来，空斑尽量选择相距比较远的并且形态大小不同的；
（8）用无血清的培养基清洗铺好Vero细胞的12孔板，加入无血清培养基；将步骤（7）中做好记号的空斑上的琼脂转移到铺好Vero细胞的12孔板的中；
（9）放进37℃培养箱中培养；当在某些孔中观察到细胞100%病变，将该细胞冻融若干次，取部分样品提取其RNA进行基因测试，将序列正确的病毒扩增病冻存起来，得到纯化后的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒。
5.根据权利要求4所述的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤（1）中：
所述的片段A是传染性支气管炎病毒的第1～5751位核苷酸，引入的限制性位点为BsmBI；
所述的片段B是传染性支气管炎病毒的第5752～8693位核苷酸，引入的限制性位点为BsaI；
所述的片段C是传染性支气管炎病毒的第8694～15520位核苷酸，引入的限制性位点为BsaI；
所述的片段D是传染性支气管炎病毒的第15521～20900位核苷酸，引入的限制性位点为BsaI；
所述的片段E是传染性支气管炎病毒的第20901～27608位核苷酸，引入的限制性位点为BsaI；
所述的克隆载体包括pKTO、pCR-XL-TOPO和pGEM-T Easy；
所述的将T7启动子序列插入IBV基因组5’端的上游是通过扩增所用的引物引入；
步骤（2）中：
所述的带有突变位点的引物如下：
IBVE_ampF：5’-CGCTCCAACAACTAATACAAG-3’；
IBVE_ampR：5’-AATGTTAAGGGGCCAAAAGC-3’；
步骤（3）中：
所述的片段A、片段B、片段C、片段D和E蛋白突变的E片段是通过引入的酶切位点对重组载体A、重组载体B、重组载体C、重组载体D、重组载体E’酶切得到；
所述的体外转录所使用到的试剂盒为mMessagemMachineT7试剂盒；
所述的全长转录本的体外转录条件为：GTP：CAP类似物=1：1进行转录反应，反应体系为30μL，反应条件为：40.5℃25 min；37.5℃50 min；40.5℃ 25 min；37.5℃ 20 min；
所述的N转录本的体外转录条件为：GTP：CAP类似物=1：2进行转录反应，反应体系为30μL，反应条件为：40.5℃25 min；37.5℃50 min；40.5℃ 25 min；37.5℃ 20 min；
步骤（4）中：
所述的电转的具体步骤如下：待Vero细胞生长密度达到90%，胰酶消化，用预冷的PBS洗涤两次，重悬于PBS中；将400μl 浓度为2×106个细胞/mL的Vero细胞悬液加入4 mm电转杯中，加入纯化后的全长转录本和N转录本，于450 V、50 μF的条件下进行一次脉冲；电转后的Vero细胞置于60 mm培养皿或6孔板中，用含1%FBS的MEM培养基培养过夜后换成不含FBS的MEM培养基继续培养；
步骤（5）中：
所述的细胞上清在细胞刚好完全病变时收集；
所述的培养基为DMEM培养基；
所述的稀释按10的倍数倍比稀释；
步骤（6）中：
所述的吸附的时间为2h；
所述的无血清的培养基为DMEM培养基；
所述的含琼脂的培养基中琼脂的用量为在培养基中的浓度为质量体积比0.2%～0.8%；
所述的含琼脂的培养基中的培养基为DMEM培养基；
所述的培养的时间为48h；
步骤（7）中：
所述的中性红溶液的用量为500µl；
所述的中性红溶液的浓度为质量体积比0.1%；
步骤（8）中所述的无血清的培养基为DMEM培养基；
步骤（9）中所述的冻融的次数为3次。
6.根据权利要求5所述的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，其特征在于：
所述的片段A适用的克隆载体为pKTO；
所述的片段B适用的克隆载体为pGEM-T Easy；
所述的片段C适用的克隆载体为pCR-XL-TOPO；
所述的片段D适用的克隆载体为pGEM-T Easy；
所述的片段E适用的克隆载体为pGEM-T Easy。
7.根据权利要求3或4所述的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的克隆的技术为无缝克隆技术，其中所用的引物如下：
T7-IBV：5’-CGCTAGCTAATACGACTCACTATAGGACTTAAGATAGATATTAATA-3’；
IBV-5753R：5’-CGGGATCCGTCTCGCGACAACACTCTTAAC-3’；
IBV-5748F：5’-ATTATGGTCTCTGTCGCTAGCTATAAGACCG-3’；
IBV-8694R：5’-GGGTCTCGGCCTCAAATTTATCACCTATC-3’；
IBV-8689F：5’-CGGGATCCGGTCTCGAGGCCTACCTTTCAGCG-3’；
IBV-15532R：5’-GCAAAAGGTCTCAATGAATCAC-3’；
IBV-15511F：5’-CGGGATCCGTGATTCATTGAGACCTTTTGC-3’；
IBV-20930R：5’-ACACCTGCAGATGTAACATC-3’；
IBV-20887F：5’-GTTTACACCTCTAATGAGACCATAG-3’；
IBV-27608R：5’- GGAATTCGGTCTCGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
GCTCTAACTCTATACTAGC -3’。
8.权利要求1或2所述的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒在传染性支气管炎病毒功能研究和/或制备疫苗中的应用。
9.一种传染性支气管炎病毒回复突变体，其特征在于：利用权利要求1或2所述的缺失E蛋白离子通道活性的传染性支气管炎重组病毒制备得到；
所述的传染性支气管炎病毒回复突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
编码所述的传染性支气管炎病毒回复突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
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