CN110951778A

CN110951778A - 犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用

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Publication number: CN110951778A
Application number: CN201910985048.5A
Authority: CN
Inventors: 薛向红; 闫喜军; 卜研; 陈杰; 赵建军; 赵传芳; 胡博
Original assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Current assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Priority date: 2019-10-16
Filing date: 2019-10-16
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2039-10-16
Also published as: CN110951778B

Abstract

本发明公开了犬瘟热病毒CDV‑3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用。本发明以犬瘟热病毒CDV‑3株为模板，将CDV‑3的全长分5个片段进行RT‑PCR扩增。经酶切拼接，将5个片段顺次插入到真核载体，同时在F1首端和F5末端分别加入锤头状核酶和丁型肝炎核酶序列，获得犬瘟热病毒CDV‑3株感染性cDNA克隆。然后，构建表达CDV‑3N、P、L蛋白的三个辅助质粒。将犬瘟热病毒CDV‑3株感染性cDNA克隆和三个辅助质粒共转染293T细胞，获得拯救后的重组CDV‑3病毒(rCDV‑3)。研究发现，获得的rCDV‑3病毒滴度最高达到10^7.667TCID₅₀/mL，比wtCDV‑3高出10倍。rCDV‑3感染Vero细胞后，于感染后36h迅速达到最高病毒滴度，而wtCDV‑3于感染后72h时病毒含量达到最高。本发明的提出为犬瘟热病毒新型疫苗研制、致病机理研究奠定了基础。

Description

犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种感染性cDNA克隆及其构建方法和应用，特别涉及一种犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用，本发明属于生物技术领域。

背景技术

犬瘟热(Canie Distemper，CD)是由犬瘟热病毒(Canie Distemper Virus， CDV)感染犬、水貂等多种肉食动物而引起的一种高度接触性传染病。该病传染性高，发病率高，临床症状多样，感染后期容易形成继发和混合感染。近年来，犬瘟热病毒自然感染宿主不断扩大。据报道，野生动物老虎、狮子、豹和海豹，甚至大熊猫群体中都暴发过犬瘟热。2015年1月，我国陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心圈养的5只大熊猫因感染CDV强毒而死亡，冯娜等在实验室对组织病料进行了CDV分离鉴定，及其全基因组序列测定与进化分析，证实：此毒株属于Aisa I型强毒株，命名为giant panda/SX/2014(FENG NA,YU YICONG,TIECHENG.W,et al.Fatal canine distemper virus infection of giant pandas inChina. [J].Scientific Report,2016,6:27518-7.)。实际上，我国和日本学者都曾报道：CDV 能够自然感染非人灵长类动物，如我国猕猴和日本食蟹猴。而且，在人变形性骨炎Paget’s患者体内检测到CDV核酸。可见，犬瘟热病毒正在给全球动物养殖业和生物多样化带来极大的损失和危害。因此，预防和消除犬瘟热迫在眉睫。

目前世界范围内，犬瘟热的预防一直依靠弱毒活疫苗。但，犬瘟热病毒的感染和传播依然不容乐观。近几年数据显示，虽然许多动物接种弱毒活疫苗，但仍然存在免疫后犬瘟热发病的案例(RENATA DA FONTOURA BUDASZEWSKI, LUCIANE DUBINA PINTO,MATHEUSNUNES WEBER,et al.Genotyping of canine distemper virus strains circulating inBrazil from 2008 to 2012.[J].Virus Research,2014,180:76-83.MARTELLA V,ELIA G,BUONAVOGLIA C.Canine distemper virus.[J].Vet Clin North Am Small Anim Pract,2008,38(4):787-97)。

犬瘟热病毒属于副粘病毒科麻疹病毒属成员，是单股负链、不分节段RNA 病毒。CDV基因组大小为15690bp，从3’到5’端依次是3’端前导序列、核蛋白基因(N)、磷蛋白基因(P)、基质蛋白基因(M)、融合蛋白基因(F)、血凝素蛋白基因(H)和大转录蛋白基因(L)和5’端尾随序列。

反向遗传技术是新兴的一种定向修饰或改造病毒的重要技术，应用前景非常广阔。近十几年，国内外许多学者利用反向遗传学技术拯救出多株犬瘟热病毒。 2000年UtaGassen等利用痘病毒提供T7RNA聚合酶，从位于T7启动子下游的 Onderstepoort株全长cDNA拯救获得感染性病毒(UTA GASSEN F M C,W.PAUL DUPREX AND BERTK.RIMA.Establishment of a Rescue System forCDV.[J]. Journal of Virology,2000,74(22):10737-44.)。2001年Christopher L.Parks等拯救出高效表达荧光素酶的重组Onderstepoort株(CHRISTOPHER L.PARKS H-P W, GERALD R.KOVACS,NIKOS VASILAKIS,JACEK KOWALSKI,REBECCA M. NOWAK,ROBERT A.LERCH,PRAMILAWALPITA,MOHINDERJITS.SIDHU, STEPHEN A.UDEM.Expression of a foreign gene by recombinant canine.[J].Virus Research,2001,83:131-47.)。2004年Philippe Plattet等建立了CDV野毒A75/17 Vero细胞适应株A75/17-V的感染性克隆，在基因组3’端插入eGFP基因，重组病毒能在细胞上持续性表达eGFP(PLATTET P,ZWEIFEL C,WIEDERKEHR C, et al.Recovery of apersistent Canine distemper virus expressing the enhanced green fluorescentprotein from cloned cDNA.[J].Virus Research,2004,101(2):147-53.)。 2007年Kentaro Fujita等在日本CDV野毒Yanaka株骨架上插入eGFP，获得表达 eGFP的重组犬瘟热病毒(FUJITA K,MIURA R,YONEDA M,et al.Host range and receptor utilization ofcanine distemper virus analyzed by recombinant viruses: Involvement ofheparin-like molecule in CDV infection.[J].Virology,2007,359(2): 324-35.)。2012年王喜军等构建了弱毒疫苗株CDV/R-20/8感染性克隆，获得了表达狂犬病病毒G蛋白的重组犬瘟热病毒，在小鼠和犬体内，能诱发针对两种病原的高水平抗体(WANG X,FENG N,GE J,et al.Recombinant canine distemper virus serves as bivalent live vaccineagainst rabies and canine distemper.[J].Vaccine, 2012,30(34):5067-72.)。2015年李智丽等构建了CDV-L株感染性克隆(LI Z, WANG J,YUAN D,et al.A recombinantcanine distemper virus expressing a modified rabies virus glycoproteininduces immune responses in mice.[J].Virus Genes,2015,50(3):434-41.)。

近年来，副粘病毒科麻疹病毒属成员犬瘟热病毒的自然感染宿主不断扩大，流行毒株不断变异，毒力也有增强。这不仅对宠物犬猫饲养，毛皮动物养殖造成了巨大经济损失，而且还严重威胁了人类公共卫生安全。因此，建立犬瘟热病毒疫苗毒CDV-3株的反向遗传操作平台，有利于我们针对流行变异毒株，精准设计和研发安全高效的新型或多联疫苗，从而防控犬瘟热及其他疫病的流行。本发明以国内商品化水貂犬瘟热病毒疫苗所用毒株CDV-3为亲本毒株，构建了CDV-3 株反向遗传操作平台，为毛皮动物CDV基因工程重组活载体疫苗的开发提供基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用，以期为犬瘟热病毒新型疫苗研制、致病机理研究奠定基础。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明以国内商品化水貂犬瘟热病毒疫苗所用毒株CDV-3为模板，设计13 对引物对其全基因组序列测定，分析单一酶切位点，将CDV-3的全长分5个片段进行RT-PCR扩增。经酶切拼接，将5个片段顺次插入到酶切位点改造后的真核载体pcDNA3.2的多酶切位点处，同时在F1首端和F5末端分别加入锤头状核酶和丁型肝炎核酶序列，获得CDV-3株的全长cDNA质粒(pcDNA3.2-CDV-3)，即犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆。然后，本发明构建表达CDV-3N、P、 L蛋白的三个辅助质粒。利用转染试剂Lipofectamine^TM 2000将犬瘟热病毒CDV-3 株感染性cDNA克隆和三个辅助质粒共转染293T细胞，3d后，上清接种到Vero 细胞。观察犬瘟热病毒典型合胞体病变，对重组病毒进行免疫荧光鉴定和标签鉴定。最后，比较野生型犬瘟热病毒wtCDV-3和重组犬瘟热病毒rCDV-3的生长特性。结果表明：拯救的重组犬瘟热病毒rCDV-3能在Vero细胞上形成典型的合胞体病变，经RT-PCR、间接免疫荧光和电镜观察鉴定，证明成功拯救出重组犬瘟热病毒rCDV-3株。rCDV-3的病毒滴度最高达到10^7.667TCID₅₀/mL，比wtCDV-3 的滴度10^6.667TCID₅₀/mL高出10倍。rCDV-3感染Vero细胞后，迅速大量增殖，于感染后36h达到最高病毒滴度。而wtCDV-3增殖平缓，感染后72h时病毒含量达到最大。

在上述研究的基础上，本发明提出了一种犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA 克隆的构建方法，包括以下步骤：

(1)取冻存的犬瘟热病毒CDV-3株细胞培养悬液，提取总RNA，反转录合成cDNA；

(2)将CDV-3的全长cDNA分成5个片段进行RT-PCR扩增，扩增产物依次命名为：F1、F2、F3、F4和F5，其中，用于扩增F1片段的引物为QF1-F以及QF1-R，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1以及SEQ ID NO.2所示，用于扩增F2 片段的引物为QF2-F以及QF2-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4所示，用于扩增F3片段的引物为QF3-F以及QF3-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示，用于扩增F4片段的引物为QF4-F以及QF4-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7以及SEQ ID NO.8所示，用于扩增F5片段的引物为QF5-F以及QF5-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.10所示；

(3)经酶切拼接，将5个片段顺次插入到真核载体中，获得克隆有CDV-3 株全长cDNA的质粒，即犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆。

其中，优选的，步骤(3)中所述的真核载体为改造后的真核载体pcDNA3.1，改造后的真核载体pcDNA3.1中多克隆位点变为NheI-NotI-BsiwI-Bsp1407I-CpoI- 部分丁型肝炎核酶序列，改造后的pcDNA3.1称为pcDNA3.2。

其中，优选的，pcDNA3.1通过以下步骤进行改造：用内切酶PmeI酶切 pcDNA3.1，回收大片段后，与事先制备的双链DNA连接，其中所述的双链DNA 的上链如SEQ ID NO.11所示，所述的双链DNA的下链如SEQ ID NO.12所示，得到改造后真核载体pcDNA3.2。

其中，优选的，步骤(3)中所述的CDV-3株全长cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

进一步的，本发明还提出了按照以上任一项所述的方法构建得到的犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆，以及所述的犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA 克隆在拯救犬瘟热病毒rCDV-3株中的应用。

更进一步的，本发明还提出了一种犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆的病毒拯救方法，包括以下步骤：构建表达犬瘟热病毒CDV-3株N、P、L蛋白的三个辅助质粒，利用转染试剂Lipofectamine^TM 2000将按照本发明所述的方法构建得到的犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆和三个辅助质粒共转染293T 细胞，3d后，上清接种到Vero细胞，观察犬瘟热病毒典型合胞体病变，出现犬瘟热病毒典型的合胞体样细胞病变时，反复冻融收获病毒液，对重组病毒进行免疫荧光鉴定和标签鉴定，得到拯救后的具有感染性的犬瘟热病毒rCDV-3株。

其中，优选的，所述的三个辅助质粒通过以下方法制备：针对CDV-3株N、 P和L基因的开放阅读框区域，以合成的CDV-3株的全长cDNA为模板，进行 PCR扩增，获得扩增产物N、P和L，回收纯化片段N、P和L，分别连接至pcDNA3.1，得到pcDNA3.1-N，pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L三个辅助质粒，其中，优选的，用于扩增N基因的开放阅读框区域的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14 以及SEQ ID NO.15所示，用于扩增P基因的开放阅读框区域的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.16以及SEQ ID NO.17所示，用于扩增L基因的开放阅读框区域的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.18以及SEQ ID NO.19所示。

其中，优选的，转染前24h，于6孔板中接种2×10⁵个293T细胞/孔，第二天细胞生长密度至90％以上，开始转染，每个质粒用量为：犬瘟热病毒CDV-3 株感染性cDNA克隆5μg，辅助质粒pcDNA3.1-N 1μg，pcDNA3.1-P 0.8μg和 pcDNA3.1-L 0.5μg，转染试剂22μL，按照Lipofectamine^TM2000说明书进行操作，共转染3h，更换为含10％v/v FBS的DMEM细胞培养液，37℃5％CO₂条件下培养3d，刮取细胞悬液，取300μL至单层Vero细胞，观察细胞病变，出现犬瘟热病毒典型的合胞体样细胞病变时，反复冻融收获病毒液，对重组病毒进行免疫荧光鉴定和标签鉴定，得到拯救后的具有感染性的犬瘟热病毒rCDV-3株。

最后，本发明还提出了一种按照所述的方法拯救获得的重组犬瘟热病毒 rCDV-3株，所述的重组犬瘟热病毒rCDV-3株的病毒滴度最高达到 10^7.667TCID₅₀/mL，比野生型犬瘟热病毒wtCDV-3株的滴度10^6.667TCID₅₀/mL高出 10倍，重组犬瘟热病毒rCDV-3株感染Vero细胞后，迅速大量增殖，于感染后 36h达到最高病毒滴度。而野生型犬瘟热病毒wtCDV-3株增殖平缓，感染后72h 时病毒含量达到最大。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明以高表达效率的pcDNA3.1为骨架，率先构建了水貂用犬瘟热病毒疫苗毒株CDV-3株全基因组cDNA感染性克隆以及3个辅助质粒，建立了水貂用犬瘟热病毒疫苗毒株CDV-3株的反向遗传操作系统，利用该系统能够实现重组病毒的稳定高效拯救，拯救效率稳定到达90％。拯救的重组犬瘟热病毒rCDV-3的生长速度显著高于野生型犬瘟热病毒wtCDV-3。rCDV-3在感染Vero细胞3天内，能使95％的Vero细胞发生病变，而wtCDV-3则需要5天能致使95％的Vero细胞病变。两种病毒的一步生长曲线也证明了这一点，rCDV-3在感染后36h，上清和细胞相关病毒滴度均达到最高值，而wtCDV-3在感染后72h，达到峰值。且 wtCDV-3病毒增殖速度平缓。rCDV-3传代中，最高病毒滴度能较为稳定地达到 10^7.667TCID₅₀/mL，wtCDV-3的病毒滴度一般稳定在10^6.667TCID₅₀/mL。多次重复测定，结果证明，两种病毒的最高滴度存在显著性差异p＜0.05。建立一个稳定高效的CDV-3株反向遗传系统，为未来以犬瘟热病毒为活载体，开发水貂用其他多联多价高效基因工程疫苗奠定基石。

附图说明

图1为CDV-3株全长cDNA克隆构建策略；

图2为犬瘟热病毒CDV-3株全长重组cDNA质粒和辅助质粒的鉴定；

其中：(A)CDV-3株全基因组序列扩增结果；1-13：覆盖CDV-3株全基因组的13个片段的扩增结果，M：Trans 4K DNA marker；(B)CDV-3株分段扩增结果；1-5：CDV-3株全长cDNA分5个长片段的扩增结果，M：DL DNA 15000 marker；(C)pcDNA3.2-CDV-3鉴定结果；1：重组质粒pcDNA3.2-CDV-3，2： Pme I和Bsp1407I双酶切pcDNA3.2-CDV-3的鉴定结果，M：DNA15000 marker； (D)辅助质粒鉴定结果；N：Kpn I和Not I双酶切pcDNA3.1-N的鉴定结果，P：Afl II和Not I双酶切pcDNA3.1-P的鉴定结果，L：Kpn I和Not I双酶切pcDNA3.1-L 的鉴定结果，M：DNA 15000 marker；

图3为重组犬瘟热病毒rCDV-3的鉴定；

其中：(A)rCDV-3细胞病变(×100)；(B)阴性Vero细胞(×100)；(C)rCDV-3 免疫荧光染色(×100)；(D)阴性Vero细胞免疫荧光染色(×100)；(E)rCDV-3 的Pme I标签鉴定；1，3：rCDV-3和wtCDV-3的P-M区域RT-PCR扩增结果，2， 4：PmeI分别酶切扩增产物1和3，M：DLDNA2000 Marker；(F)rCDV-3的电镜形态。

图4为重组犬瘟热病毒rCDV-3的生长特性；

其中：(A)rCDV-3的传代稳定性；(B)wtCDV-3和rCDV-3的一步生长曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆的构建以及病毒拯救

1材料与方法

1.1材料

1.1.1毒株和细胞

犬瘟热病毒CDV-3株由中国农业科学院特产研究所动物疫病研究室保存； 293T和Vero细胞由中国农业科学院特产研究所疫病防控团队保存；

1.1.2主要试剂

培养液DMEM、青链霉素和小牛血清FBS，均购自Gibco；真核表达载体 pcDNA3.1购自Invitrogen；克隆载体pEASY-Blunt或pEASY-Simple-Blunt、高保真酶Trans StartFastPfu DNA Polymerase和FITC标记的羊抗鼠二抗购自北京全式金；各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购自Thermo公司；转染试剂 Lipofectamine^TM2000和反转录试剂盒SuperScriptⅢFirst-Strand Synthesis SuperMix购自Invitrogen公司；质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒，购自AXYGEN公司；RNeasy Mini Kit和EndoFreePlasmidMaxiKit购自QIAGEN；抗体CDV-NP购自Veterinary Medical research and developent公司。

1.2方法

1.2.1 CDV-3株全基因组克隆及序列测定

取冻存的犬瘟热病毒CDV-3株细胞培养悬液200μL，根据RNeasy Mini Kit 操作说明，提取总RNA。用SuperScriptⅢFirst-Strand Synthesis SuperMix试剂盒反转录合成cDNA。根据GenBank已公布的CDV-3株参考序列，用软件Primer Premier 5.0设计了13对特异性引物(如表1)，送上海生工合成。以反转录合成的cDNA为模板，分别以合成的13对特异性引物用Trans Start FastPfu DNA Polymerase试剂盒进行PCR扩增，对目的片段进行回收纯化，连接至pEASY-Blunt 载体，转化至Trans-T1感受态，涂菌至含有Ampicillin抗性的平板，每对引物筛选3个以上的阳性克隆子送上海生工进行序列测定。

表1全基因组扩增用引物序列

1.2.2 CDV-3株全基因组cDNA重组质粒的构建

利用软件DNAMAN分析1.2.1中所获得的CDV-3株全基因组序列的单一性酶切位点，选取适当的位置作为衔接点。利用Primer Premier5.0设计特异性引物(如表2)，为了便于拼接，引物两端携带相应的酶切位点。用1.2.1中合成的cDNA 为模板，进行PCR扩增，扩增产物依次命名为：F1、F2、F3、F4和F5。其中，引物F1F的5’端加入了SpeI酶切位点和锤头状核酶序列。引物F5R的5’端加入了部分丁型肝炎核酶序列。之后，改造载体pcDNA3.1的多克隆位点，用内切酶 PmeI酶切pcDNA3.1，连接入事先制备的双链DNA(上链，SEQ ID NO.11所示：5-GGCCGCATTTCGTACGAATTTTGTACATTTCGGTCCGACCTGGGCATCCG AAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCG-3；下链，， SEQ ID NO.12所示： 5-CGCCCTCCCTTAGCCATCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATGC CCAGGTCGGACCGAAATGTACAAAATTCGTACGAAATGC-3)，最终 pcDNA3.1的多克隆位点变为NheI-NotI-BsiwI-Bsp1407I-CpoI-部分丁型肝炎核酶序列，改造后的pcDNA3.1称为pcDNA3.2。将F1连接至pEASY-Blunt上，获得 pEASY-Blunt-F1，SpeI和NotI双酶切pEASY-Blunt-F1，回收纯化F1片段；NheI 和NotI双酶切pcDNA3.2，回收纯化载体片段；SpeI和NheI属于同尾酶，T4连接酶连接F1片段和pcDNA3.2载体片段，获得pcDNA3.2-F1。将F2和F3分别连接到克隆载体pEASY-Blunt Simple或pEASY-Blunt上获得pEASY-Blunt-F3和pEASY-Blunt-F2。用NotI和NdeI分别双酶切pEASY-Blunt-F3和pEASY-Blunt-F2，回收纯化F2片段和F3载体部分，T4连接酶连接，获得pBlunt-F2-F3。将F4和 F5片段分别连接到克隆载体pEASY-Blunt上，获得pEASY-Blunt-F4和 pEASY-Blunt-F5。NotI和Bsp1407I分别双酶切pEASY-Blunt-F4和 pEASY-Blunt-F5，回收纯化F4片段和F5载体片段，T4连接酶连接，获得 pBlunt-F4-F5。用BsiwI和CpoI双酶切pBlunt-F4-F5和pcDNA3.2-F1，回收纯化 F4-F5片段部分和pcDNA3.2-F1载体部分，连接酶连接获得pcDNA3.2-F1-F4-F5。 PmeI和BsiwI双酶切pcDNA3.2-F1-F4-F5和pBlunt-F2-F3，回收纯化F2-F3片段和pcDNA3.2-F1-F4-F5载体部分，T4连接酶连接，获得CDV-3全基因组cDNA 重组质粒pcDNA3.2-CDV-3，即CDV-3株感染性cDNA克隆。最后用PmeI和 Bsp1407I双酶切鉴定全长重组质粒，筛选出正确的重组子pcDNA3.2-CDV-3(图 1)。按照EndoFree Plasmid Maxi Kit的操作说明，大量提取全长重组质粒 pcDNA3.2-CDV-3，测定浓度后分装，于-70℃保存待用。

表2 CDV-3株感染性cDNA克隆构建用引物序列

注：□为每条引物携带的酶切位点。

1.2.3 CDV-3株辅助质粒的构建

针对CDV-3株N、P和L基因的开放阅读框区域，利用Primer Premier5.0设计特异性引物(如表2)，用1.2.1中合成的cDNA为模板，进行PCR扩增，获得扩增产物N、P和L。回收纯化片段N、P和L，分别连接至pEASY-Blunt-Simple 上，获得pEASY-Blunt-Simple-N、pEASY-Blunt-Simple-P和 pEASY-Blunt-Simple-L。KpnI和NotI双酶切pEASY-Blunt-Simple-N和pEASY-Blunt-Simple-L，AflII和NotI双酶切pEASY-Blunt-Simple-P，同时用相同内切酶组合双切载体pcDNA3.1。回收纯化N、P、L片段和pcDNA3.1载体片段， T4连接酶连接。筛选出正确的重组子pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L。按照EndoFree Plasmid Maxi Kit的操作说明，大量提取辅助质粒pcDNA3.1-N、 pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L，测定浓度后分装，于-70℃保存待用。

1.2.4重组犬瘟热病毒rCDV-3株的拯救

转染前24h，于6孔板中接种2×10⁵个293T细胞/孔，第二天细胞生长密度至90％以上，开始转染，每个质粒用量为：全长质粒pcDNA3.2-CDV-3 5μg，辅助质粒pcDNA3.1-N 1μg，pcDNA3.1-P 0.8μg和pcDNA3.1-L0.5μg，转染试剂 22μL。按照Lipofectamine^TM2000说明书进行操作。共转染3h，更换为含10％FBS 的DMEM细胞培养液，37℃5％CO₂条件下培养3d。刮取细胞悬液，取300μL 至单层Vero细胞，观察细胞病变。出现犬瘟热病毒典型的合胞体样细胞病变时，反复冻融收获病毒液。

1.2.5重组犬瘟热病毒rCDV-3的鉴定

将收获的rCDV-3病毒液接种至Vero细胞，培养72h，4％多聚甲醛固定，0.5％Triton X-100打孔，加入一抗CDV-NP，37℃1h，1％BSA封闭，加入FITC标记抗羊抗鼠IgG荧光二抗染色。最后，DAPI染核。在荧光显微镜下观察绿色荧光。分别提取野生型wtCDV-3和rCDV-3细胞毒的总RNA，反转录合成病毒基因组 cDNA。根据P-M处设计引物(JD-F：5-TGGTATTACTCTGGGCTCA-3和JD-R： 5-CTTTGAACATGCTCAAATTA-3)，以各自的cDNA为模板，进行PCR扩增， 1％琼脂糖凝胶电泳后回收片段，用PmeI酶切。rCDV-3由于基因组中被人为引入 PmeI位点，因此可以被切割开；而wtCDV-3序列中并无PmeI位点，无法被切割。分别取病毒wtCDV-3和rCDV-3上清液100μL，磷钨酸负染，电子显微镜观察和比较两种病毒粒子的形态大小。

1.2.6重组犬瘟热病毒rCDV-3的生长特性研究

将rCDV-3在Vero细胞上传代10次，取每一代病毒液300μL，测定TCID₅₀。在Vero细胞上分别按感染复数(MOI＝0.1)接种wtCDV-3和rCDV-3，35℃5％CO₂培养5d。于感染后12h、24h、48h、72h、96h和120h，分别取病毒液上清和细胞，测定上清和细胞中病毒的TCID₅₀。以上试验至少重复3次。

2结果

2.1 CDV-3全基因序列测定结果与分析

覆盖CDV-3株全基因组的13个目的片段，用RT-PCR方法扩增后，经1％琼脂糖凝胶电泳，可以看到：13个目的条带，大小跟预期结果一致(图2A)。拼接获得了本实验所用CDV-3全基因组序列，与GenBankCDV-3的序列比对发现：全基因组共5个碱基不同，分别引起P蛋白1个、G蛋白2个和L蛋白2个氨基酸发生改变。

2.2 CDV-3全基因组cDNA重组质粒的鉴定

CDV-3株全长分5段进行PCR克隆，获得5个片段，大小依次为：3400bp， 2500bp，4300bp，3100bp和2500bp，与预期大小一致(图2B)。获得克隆有CDV-3 株全长cDNA的质粒pcDNA3.2-CDV-3，即犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆，其中CDV-3株的全长cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。质粒 pcDNA3.2-CDV-3经PmeI和Bsp1407I双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，得到大小约9 000bp和12 000bp的目的条带(图2C)，同预期结果一致。

2.3辅助质粒鉴定

辅助质粒pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L分别用构建时，各自上下游引物添加的单一性限制内切酶进行双酶切鉴定，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，分别得到约1700、1600、6500和5400bp目的条带，同预期结果一致(图 2D)。

2.4重组犬瘟热病毒rCDV-3的鉴定

4个质粒共转染后，接种到Vero细胞，观察到典型的合胞体细胞病变(图3A)，同时空白对照组Vero无病变(图3B)。为了进一步确定，用免疫荧光鉴定，可以看到，发生病变的细胞能特异性与CDV-NP抗体结合，呈阳性信号(图3C)，空白对照组为阴性(图3D)。为区别wtCDV-3污染，利用特异性鉴定引物JD-F/R PCR 扩增，纯化后的扩增产物用预先添加的PmeI酶切，可以看到rCDV-3能被切割开，而wtCDV-3不能被切开(图3E)。电镜观察rCDV-3，可以看到大小为100nm有囊膜的犬瘟热病毒粒子(图3F)。

2.5重组犬瘟热病毒rCDV-3的生长特性

将重组犬瘟热病毒rCDV-3连续传代培养，分别测定每代病毒悬液的TCID₅₀ (图4A)。重组病毒rCDV-3传代稳定后，按MOI＝0.1接种Vero细胞，于不同时间点收集上清和细胞，测定TCID₅₀，绘制出生长曲线。同样绘制wtCDV-3的生长曲线，并进行比较(图4B)。

结果表明：拯救的重组犬瘟热病毒rCDV-3的生长速度显著高于wtCDV-3。 rCDV-3在感染Vero细胞3天内，能使95％的Vero细胞发生病变，而wtCDV-3 则需要5天能致使95％的Vero细胞病变。两种病毒的一步生长曲线结果证明， rCDV-3在感染后36h，上清和细胞相关病毒滴度均达到最高值，而wtCDV-3在感染后72h，达到峰值，wtCDV-3病毒增殖速度平缓。rCDV-3传代中，病毒滴度最高能较为稳定地达到10^7.667TCID₅₀/mL，wtCDV-3的病毒滴度一般稳定在 10^6.667TCID₅₀/mL。多次重复测定，结果证明，两种病毒的最高滴度存在显著性差异p＜0.05。

序列表

<110> 中国农业科学院特产研究所

<120> 犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用

<130> KLPI190705

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 85

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 1

actagtgtta agcgtctgat gagtccgtga ggacgaaact ataggaaagg aattcctata 60

gtcaccagac aaagttggct atgga 85

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

gatgtttaaa ccagttttgc gccgg 25

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

gtttaaacat cgcttaaaag caattata 28

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

tctgcccaac taattcacat gacat 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

catatgtcat gtgaattagt tgggc 25

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

ccgtacgttt tctgctgctg tt 22

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

cagaaaacgt acggaaacac atgaatcaac 30

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 8

ggatttgtac agatatttct tggtatgacg ac 32

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 9

gagtcccagg gctcagaaat gtcg 24

<210> 10

<211> 61

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 10

tcggaccgcg aggaggtgga gatgccatgc cgacccacca gacaaagctg ggtatgataa 60

c 61

<210> 11

<211> 90

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 11

ggccgcattt cgtacgaatt ttgtacattt cggtccgacc tgggcatccg aaggaggacg 60

cacgtccact cggatggcta agggagggcg 90

<210> 12

<211> 86

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 12

cgccctccct tagccatccg agtggacgtg cgtcctcctt cggatgccca ggtcggaccg 60

aaatgtacaa aattcgtacg aaatgc 86

<210> 13

<211> 15836

<212> DNA

<213> CDV-3

<400> 13

tgtttagcgt ctgatgagtc cgtgaggacg aaactatagg aaaggaattc ctatagtcac 60

cagacaaagt tggctaagga tagttaaatt attgaatatt ttattaaaaa cttagggtca 120

atgatcctac cttagagaac aaggtcaggg ttcagaccta ccaatatggc tagccttctt 180

aaaagcctca cactgttcaa gaggactcgg gaccaacccc ctcttgcctc tggctccggg 240

ggagcaataa gaggaataaa gcatgtcatt atagtcctaa tcccgggtga ttcaagcatt 300

gttacaagat ctcgactatt ggatagactt gttaggttgg ttggtgatcc agaaatcaac 360

ggccctaaat taactgggat cttaatcagt atcctctcct tgttcgtgga atcccctgga 420

cagttgatcc agaggatcat agacgaccct gatgtaagca tcaagttagt agaggtaata 480

ccaagcatca actctgtttg cggtcttaca tttgcatcca gaggagcaag tctggattct 540

gaggcagatg agttcttcaa aattgtagac gaagggtcga aagctcaagg gcaattaggc 600

tggttggaga ataaggatat agtagacata gaagttgatg atgctgagca attcaatata 660

ttactagctt ccatcttggc tcaaatttgg atcctgctag ctaaagcggt gactgctcct 720

gatactgcag ccgactcgga gatgagaagg tggattaagt atacccagca aagacgtgtg 780

gtcggagaat ttagaatgaa caaaatctgg cttgatattg ttagaaacag gattgctgag 840

gacctatctt tgaggcgatt catggtggca ctcattttgg acatcaaaag atccccaggg 900

aacaagccta gaattgctga aatgatttgt gatatagata actacattgt ggaagctggg 960

ttagctagtt tcatcctaac tatcaagttt ggcattgaaa ctatgtatcc ggctcttggg 1020

ttgcatgagt tttccggaga attaacaact attgaatccc tcatgatgct atatcaacag 1080

atgggtgaaa cagcaccata catggttatc ttggaaaact ctgttcaaaa caaatttagt 1140

gcagggtcct acccattgct ctggagttat gctatggggg ttggtgttga acttgaaaac 1200

tccatgggag gattaaattt cggtcgatct tactttgacc cagcctactt cagactcggg 1260

caagaaatgg ttagacgatc tgccggcaaa gtaagctccg cacttgctgc cgagcttggc 1320

atcaccaagg aggaagctca gctggtgtca gaaatagcat ccaagacaac agaggaccgg 1380

acgattcgag ctactggtcc caagcaatcc caaattacct tcctgcactc ggaaagatcc 1440

gaagtcgcta atcaacaacc cccgaccatc aacaagaggt ccgaaaacca gggaggagac 1500

agatacccca ttcacttcag tgatgaaagg cctccagggc acaccccaga cgtcaacagc 1560

tctgaacgga gtgagccacg ccacgacacc caaattaccc aagatgatgg aaatgatgat 1620

gaccggaaat cgatggaagc aatcgccaag atgaggatgc ttactaagat gctcagtcaa 1680

cctgggacca gtgaagatag ttctcctgtt tataatgata gagagctact caattaaata 1740

ttcaagacca gtcctgcatc agtcaacaat tatcattcta aactcattat aaaaaactta 1800

ggacccaggt ccaacaaacc cgatcaacca ttcatccgac cacccgttct atccctaaat 1860

ggcagaggaa caggcctacc atgtcagcaa agggctggaa tgcctcaaag ccctcagaga 1920

gaatcctcct gacattgagg agattcaaga ggtcagcagc atcagatacc aaacctgcaa 1980

cccaggccaa gagaatggaa ccacaggcat gcaggaagag gaggactctc agaatctcga 2040

tgaatcacac gagccaacaa aaggatcaaa ctatgtcggc catgtactcc aaaataatcc 2100

gggatgtgga gaaagcaact ctgcgcttgt ggaagcagag cagctcccta aagaggacat 2160

ccaaccagga cctggaatac gatgttatca tgtttatgat cacagcggtg aagaggttaa 2220

gggaatcgaa gatgctgaca gtctcgtggt acctgcaggc actgtcggta atcgaggatt 2280

cgagagcgga gaaggaagcc ctgatgatag cactgaggat tctggcgaag attattccga 2340

aggaaatgct tcatctaact ggggatattc tttcggcctt aaaccagaca gggcagctga 2400

tgtgagcatg ctgatggaag aggaattaag tgctctgctc aagacaagca gaaatgtagg 2460

gattcagaaa agggatggga agactctgca gttcccacat aatcccgaag gtaagacaag 2520

ggttccggag tgtggatcca ttaaaaaggg cacagaagag aggtcagtct cacagggaat 2580

ggggatagtt gctggatcga caagtggtgc aacccaatct gcactcaagt caactggggg 2640

atcatcagag ccaagtgtgt ctgcggggaa tgtccgccaa cctgcaatga atgcaaagat 2700

gacccagaaa tgcaaactcg agtctggtac gcaactccct cccaggacct caaatgaggc 2760

tgagtctgac agtgagtacg atgatgagct tttctctgag atacaagaaa ttcgatctgc 2820

cattactaaa ctaactgaag ataatcaagc aatactttct aaactggata ccttattact 2880

gcttaaagga gagactgatt caattaagaa acaaatcagc aaacaaaata ttgcgatttc 2940

cacgattgag gggcatctat caagcattat gatagctata cctggttttg gaaaggacac 3000

gggagaccct acggcaaatg tcgacattaa tccagagctc cgccctatca tagggaggga 3060

ttcaggaaga gcactagcgg aagttctcaa gcagcccgca tcatcccgcg gtaatcggaa 3120

ggacagtggt attactctgg gctcaaaagg tcaactattg agagacctcc agctgaaacc 3180

cattgacaaa gagtctagct cggcaatcgg atacaaacca aaggataccg caccttctaa 3240

agctgtactt gcatcattga tcagatcaag cagagttgat caaagtcaca aacataacat 3300

gctggctctg cttaaaaata tcaagggaga tgacaaccta aacgagttct accagatggt 3360

caagagtatt actcatgctt aatctgtagc gttgactaat ctactaaccg gcgcaaaact 3420

ggtttaaaca tcgcttaaaa gcaattataa aaaacttagg acacaagagc ctaagtcctc 3480

tcctaaaaaa tgactgaggt gtacgacttc gatcagtctt cttgggacac caagggctta 3540

ttggccccta ttttgcctac cacttatccc gatggtaggc tcatacccca agtcagagta 3600

atagatccag gactcggcga taggaaagat gaatgcttca tgtatatttt tctactgggt 3660

ataatagaag acaatgatgg cctcggaccc ccaattggaa gaacatttgg attgctgcct 3720

ttgggagttg ggcgtactac agccagacct gaggagttat tgaaagaagc caccctgttg 3780

gatattgtgg taaggcgaac tgcaggtgtc aaggaacaac tggtatttta taataacacc 3840

ccattgcaca tcttaactcc gtggaaaaag gtccttacga gtggaagtgt gttcagtgca 3900

aatcaagtct gtaacgcagt caatctaata ccattagaca tagcacaaag attcagggtg 3960

gtatatatga gcatcactcg actatcagac gatggaagtt acagaattcc ccgcgggatg 4020

tttgaattcc gctccaggaa tgctttagca tttaacattt tagtcaccat tcaagttgag 4080

ggagatgtct gttcaagccg aggtaatttg agcatgttca aagatcacca agtaacattc 4140

atggtccgta tcggcaattt cagccgtaag aaaaaccaag cttactctgc tgattattgt 4200

aaactgaaaa ttgaaaagat gggattagtg tttgctctag gagggatagg aggaacaagt 4260

cttcacatac gatgtactgg taagatgagc aaggccttga atgcccagct aggtttcaag 4320

aaaatcctgt gttacccgct catggagatc aatgaagatt tgaatcgatc tctatggaga 4380

ttagagtgca aaatagtaag gatccaagca gtcttgcaac catcagtccc acaagatttc 4440

agagtttata atgatgttat catcagcgat gatcagggtc ttttcaaatt tctctaaatc 4500

attagttcat gaactaaaac tcaaacgcct tagtagcatt gcccaagatc ccttgatccc 4560

cgcaagcgag gattgagggt ataaatatcg actgtctaga tgttgctcct gcattttgag 4620

cgtggcctat aggtttctaa actgcccatc cgtgcccaca attccagtga cgcctcaata 4680

tgaaaatagc tgaatcaaaa cagttcttgc ttaagattgg gttgatcatt atcggaccaa 4740

gaaatgaatg gatgcctggg gttttgagct tcgcttctag gaatctcact ttaacagtta 4800

tactcccacg cacttgcctg atctcaagcc atcactagta gtcttgtttc acggagtgat 4860

gactgtccat ctttctatca cagctcatta ataattaatc aaaacttagg gtccaggaca 4920

tagcaagcca acaggccaac caagtccacc agcccgaggc caggcaggaa cccccacaaa 4980

cagccaagcc ccatgcacaa ggaaatcccc aaaagctcca aaacccacac acatacccaa 5040

caaaaccgcc ccccacaacc cagcaccgga cccgacgaga ccaggacctc ccgagcacga 5100

cacagcataa cgtcagctca gcgatccacg aactatgatc ctcgaacatt ggacagaccc 5160

gtctcctaca ccatgaacag gaccaggtct cgcaagcaaa ccagctacag attggagaac 5220

atctcagttc acggaaacca cgaggctatt atccagcaca tgccagagag tgtctccaaa 5280

ggagcgagat cccagatcga aaggcggcaa cccaatgcaa tcaactcagg ctctcagtgc 5340

tcctggttag tcctgtggtg cctcggaata gccagtctct ttctttgttc caaggctcag 5400

atacattgga ataatttgtc aactattggg attattggga ctgatagtgt ccattataag 5460

atcatggcta ggcccagtca ccagtacttg gtcataaaac tgatgcctaa tgtttcactt 5520

atagataatt gtaccaaagc agaattaggt gagtatgaga aattattgaa ttcagtcctc 5580

gaaccaatca accaagctct gactctaatg accaagaatg tgaagccctt gcagtcatta 5640

gggtcagcta ggagacaaag gcgttttgca ggagtggtac ttgcaggtgc agctttagga 5700

gtggctacag ctgcacaaat cactgcagga atagctttac atcaatccaa cctcaatgct 5760

caagcaatcc aatctcttag aaccagcctt gaacagtcta acaaagctat tgaagaaatt 5820

agggaggcta cccaagaaac cgtcattgcc gttcagggag tccaggatta cgttaacaac 5880

gaactcgtcc ctgctatgca acatatgtca tgtgaattag ttgggcagag attagggtta 5940

aaactgctta ggtattatac tgagttattg tcaatatttg gcccgagttt acgtgaccct 6000

atttcagccg agatatcaat tcaagcactg agttatgctc ttggaggaga aattcataag 6060

atacttgaga agttgggata ctctggaggt gatatgattg caatcttgga gagtcggggg 6120

ataaaaacaa aaataactca tgttgatatt cccgggaaat tcatcatcct aagtatctca 6180

tacccaactt tatcagaagt caagggggtt atagtccaca gactggaagc agtttcttac 6240

aacataggat cacaagagtg gtacaccact gtcccgaggt atattgcaac taatggttac 6300

ttaatatcta attttgatga gtcatcctgt gtattcgtct cagagtcagc catttgtagc 6360

cagaactccc tgtaccccat gagcccactc ttacaacaat gtattagggg cgacacttca 6420

tcttgtgccc ggaccttggt atctgggact atgggcaaca aatttattct gtcaaaaggt 6480

aacatcgtcg caaattgtgc gtctatacta tgtaagtgtt atagcacaag cacaattatt 6540

aatcagagtc ctgataagtt gctgacattc attgcctccg atacctgccc actggttgaa 6600

atagatggtg taactatcca agttggaggc aggcaatacc ctgatatggt atatgaaagc 6660

aaagttgcct taggccctgc tatatcactt gagaggttag atgtaggtac aaatttaggg 6720

aacgccctta agaaactgga tgatgctaag gtactgatag actcctctaa ccagatcctt 6780

gagacagtta ggcgctcttc ctttaatttt ggcagtctcc tcagcgttcc tatattaagt 6840

ggtacagccc tggctttgct gttgctgatt tactgttgta aaagacgcta ccaacagaca 6900

ctcaagcgga atactaaggt cgatccggca tttaaacctg atctaaccgg aacttcgaaa 6960

tcctatgtga gatcactctg aagtattctg gtcatatatc tcgcttgatt gccagatttg 7020

atatctatta accccgccca attttcttca agagtcactc aactgcaata aacattggaa 7080

aagactgacc atgattatcg taattaaaga aaacttagga ctcaggtagt ccagcaatgc 7140

tctcctacca agacaaggtg ggtgccttct acaaggacaa tgcaagagcc aattcatcca 7200

agctgtcccc agtgacagaa gagcatgggg gcaggagacc accttatttg ttgtttgtcc 7260

ttctcatcct attggttgga atcctggccc tgcttgctat cactggagtt cgatttcacc 7320

aagtatcaac tagcaatatg gaatttagca gattgctgaa agaggatatg gagaaatcag 7380

aggccgtaca tcatcaagtc atagatgtct tgacaccgct cttcaagatt attggggatg 7440

agattgggtt acggttgcca caaaagctaa acgagatcaa acaatttatc cttcaaaaga 7500

caaatttctt caatccgaac agagaattcg atttccgcga tctccactgg tgcattaacc 7560

cgcctagtaa ggtcaaggtg aattttacaa attactgtga gacaattggg atcagaaaat 7620

ctattgcatc ggcagcaaat cccatccttt tatcagccct ctctgggggc aggagtgaca 7680

tattcccacc atacagatgc agtggagcta ctacttcagt aggcaaagtt ttccccctat 7740

cagtctcgtt atccatgtct ttgatctcaa gaacctcaga gataatcaat atgctgaccg 7800

ctacctcaga cggcgtgtat ggcaaaactt acttgctagt gcctgatgat atagaacggg 7860

agttcgacac tcaagagatt cgagtctttg aaatagggtt cattaaaagg tggctgaatg 7920

acatgccatt actccaaaca accaactata tggtcctccc ggagaattcc aaagccaagg 7980

tatgtaccat agcagtgggt gagttgacac tggcttcctt gtgtgtagaa gagagcactg 8040

tattattata ccatgacagc aggggttcac aagatggtat tctagtagtg acactgggga 8100

tatttggggc aacacctatg gatcatattg aggaagtgat acctgtcgct cacccatcaa 8160

tggagaaaat acatataaca aaccaccgtg gttttataaa agattcaatt gcaacctgga 8220

tggtgcctgc cctggcctct gagaaacaag aagaacaaaa aggttggctg gagtcagctt 8280

gtcaaagaaa aacctacccc atgtgcaacc aaacgtcatg ggaacccttc ggaggaggac 8340

agttgccatc ttatgggcgg ttgacattac ctctagatgc aagtgttgac cttcaactta 8400

acatatcgtt cacatacggt ccggttatac tgaatggaga tggtatggat tattatgaaa 8460

gcccactttt gaactccgga tggcttacca ttcctcctaa aaacggaaca atccttggat 8520

tgataaacaa agcaagtaga ggagaccagt tcactgtgat accccaagta ttaacatttg 8580

cgcccaggga atcatgtgga aattgttatt tacctattca aacatctcaa attatagata 8640

gagatgtcct catcgagtcc aatgtagtgg tgttgcctac acagagtttt agatatgtca 8700

tagcaacgta tgatatatca cgaaatgatc atgcgattgt ttattatgtt tatgacccaa 8760

tccggacgat ttcttatacg cacccattta gactaactac caagggtaga cctgatttcc 8820

taaggattga atgttttgtg tgggatgata atttgtggtg tcaccaattt tacagatacg 8880

aggctaacat cgccaactct acaaccagtg ttgagaattt agtccgtata agattctcat 8940

gtaaccgttc aaatccctga cagtataatg atacacatct caattggact taggcatgat 9000

gagtatggtg aaaaatccct tacagatgat tgaattaaac catctccagc attataaaaa 9060

aactaaggat ccaggatcct tttagccatg gactctgtgt cagtgaacca gattctatac 9120

cctgaggtcc atctagatag cccaattgta accaataagc tagtagctat tttagaatac 9180

gcacgaatta gacatagcta tcaactcctt gatacaacat tagtgcgtaa tatcaaagag 9240

agaatttcag aagggttctc aaaccagatg atcattaact gcatcgaaat cgggagcatt 9300

attaatcaga ccttgttatc ttatcccaaa cacaaccatg tgatataccc aaattgcaac 9360

aaacttctat ttcatgcaca ggatcgagtc atctctctga ggctgagaaa tatattcaaa 9420

agaggaaata gcatctatag caaaataaca gacggggtca aaaaatgctt aaacgatatt 9480

aatcttaata ttggtttagg gggtgcactg gacaagacta ttgggaccaa aattgatgaa 9540

gcaggcataa ttatgcaaag ctcacagtgg ttcgaacctt tccttctatg gtttacaatt 9600

aaaacagaaa tgagatcagt gattaaatcc tctactcaca actgtcgcaa gcggaggcag 9660

aatcctgtct ttgtaaaagg tgaatcattt aatgtgttag tgtctaggga ccttgtatgt 9720

attattgatc tcaccagtca caatgtttat tacctaacat ttgaaatggt cttgatgtac 9780

tgtgatgtaa tagaagggag gctaatgact gatactgcta tggcaattga tcaacgttac 9840

tcaactttgc atgtcaggat caggtatctc tgggatctaa ttgacggatt tttcccggat 9900

ctgggaaatt caacctatca attggtggct ctactggagc ctctctcatt ggcttacttg 9960

cagttaaaag acatcacctt ctctctcagg ggtgcttttc tgagtcactg ctttgctgaa 10020

attcaggaga ttttacagga caatggcttc tatactgaag agacgttcca aactttaacc 10080

caagctctag acttcgtttt catcacagag gatatacata taacaggaga aatcttttcc 10140

ttctttagaa gtttcggtca cccaaggtta gaagcaataa cagcagcaga aaacgtacgg 10200

aaacacatga atcaacccaa agttgtctct tatgagacta tgatgaaggg acatgctata 10260

ttctgtggga taatcattaa cggttatcgg gatagacatg ggggaacttg gcctccgatg 10320

gatcttcctg ttcatgcatc tcccatcatc agaaatgctc atgcctcagg ggagggaatc 10380

acctatagtc aatgtataga aaactggaaa tcctttgcag gaattcgatt taaatgcttt 10440

atgcctctta gcctagacag tgatttgacc atgtacctga aagataaggc tttggcagcc 10500

ctaagaaaag agtgggactc agtgtaccca aaagaattcc tcaggtacaa tccacctcgc 10560

tccactgagt ctcggagact tgttaatgtg tttctagagg actctcagtt tgacccttat 10620

aacatgatta tgtacgttat ctcaggtcaa tatctagaag atcctgattt caacctatca 10680

tacagtctca aagagaaaga gattaaagag gtagggaggc tattcgctaa aatgacctac 10740

aaaatgcgag cctgtcaggt catagcagaa aacttgatat ctaatggaat tgggaagtac 10800

ttcaaggaca atgggatggc aaaggatgaa cacgatctca ctaaagcatt gcacactctg 10860

gctgtgtccg gggttccgaa agacaagaaa gacttccatc gtggcctcac taaccagagt 10920

aaatccctga aacctgcacc ttatcgagga gcacttcact ccgtctcttc cccaagtagt 10980

agatatatag acccaaaccc aaatttttgc accagtagaa gagaagacaa tgacatagag 11040

atctatgaaa ctgtaagtgc atttataact acggatctca aaaagtactg tctgaattgg 11100

cgttatgaga ccatcagtat ttttgctcag agattaaatg aaatctacgg tctcccctca 11160

tttttccaat ggttacacag aagattggaa cagtcgatct tatacgtaag tgacccccac 11220

tgccctccag atctcgatcg tcatgtggac ttgaatacag cccctaactc tcaaatattc 11280

atcaaatacc caatgggggg ggtggagggt tattgtcaga agttgtggac tattagcacc 11340

ataccttatt tgtacttggc ggcacatgag agcggtgtca gaattgcatc acttgtccaa 11400

ggtgataacc aaactattgc tgtcactaaa agagtaccaa gcacctggtc ctatgccttg 11460

aagaaatctg aagccagtcg agtgaccaca gaatacttta tagccttgag acagaggtta 11520

catgatgtcg gacatcattt gaaagcaaat gaaacaataa tctcttccca cttttttgta 11580

tactcaaaag ggatctatta tgacgggatg ttaatctcac aatccctgaa gagtatagct 11640

aggtgtgtat tttggtcaga aacaatagtg gatgagaccc gagccgcgtg cagcaacatt 11700

tcaacaacat tagcgaaagc cattgagaaa gggtttgacc gatatttagc ctacgcactg 11760

aacattttaa aaatcattca acaagtatta atttcattag gattcactat caattcagct 11820

atgacacggg atgtgataga acccctcgta caagatcact gtctcttgac caagatggca 11880

attctccccg cacccattgg cggtcttaat tacctcaata tgagtaggct ctttgtcagg 11940

aatatcgggg atcccgtgac atcttctatt gctgacctca aacgaatgat ccgatcaggc 12000

cttcttggag tggagattct acatcaggtc atgacccaat acccaggtga ctcttcttat 12060

ttagattggg caagtgaccc ttattctgcc aatctgccct gtgtccagag cataacccga 12120

ctccttaaaa atatcacagc caggcatgtc cttatcaaca gtccaaatcc gatgctgaga 12180

ggattgttcc atgatgaaag tcaggatgag gatgaagctt tagcagcttt cttaatggat 12240

aggaaaatta ttatcccaag ggctgcacat gaaattctag ataacacgat cacaggtgca 12300

agagaggcaa tcgccggaat gctagacacc acaaaggggt tgatacgagc aagcatgaaa 12360

agaggaggtc taacccctag aataataacc cgtttgtcaa cttatgatta tgaacaattt 12420

agggcaggta tcagactgtt gtcagggaag gggcatgatc cgctcatcga tcaagactca 12480

tgttccgtcc agctagcgag agcattaagg aaccacatgt gggccaagct ggcgaagggt 12540

cgtcctattt atggtctaga agtcccggat atccttgaat caatgaaggg ttatatgatc 12600

agaagacatg aatcctgttt gctttgtgca tcaggctctc ataactatgg ttggtttttt 12660

gtaccagcga attgccaatt ggatagtatt acagagggaa catctgcact gagggtgcca 12720

tacatagggt ccacaacaga agaaagaaca gacatgaaac tagcattcgt caaatctcct 12780

agtaggtctc tgaaatcagc agtgagaata gcaactgtgt actcatgggc ctatggtgat 12840

gatgacgaat cttggcaaga ggcttggacc ttggcaaaac agagagcgaa catctcactt 12900

gaggaattac ggatgattac cccaatttcc acttctacta atctagctca ccgactaaga 12960

gacaagagta ctcaagtcaa atactcaggg acctctctca tcagagtggc acgttatgca 13020

actatctcga atgataatct ttcttttatt atagatgaca agaaagtgga cacaaatttt 13080

atttatcaac aaggtatgct cctgggcctg gggatccttg agcacttatt tagattgtct 13140

tcaaccaccg gcgactctaa caccgtatta catttacatg ttgaaacaga ttgttgcgta 13200

atacccatga gcgaccatcc aagagtccca gggctcagaa atgtcgtcat accaagaaat 13260

atctgtacaa atcctttgat ttatgacagt aaccctatta ttgagaaaga tgcagtcaga 13320

ctttataacc agagtcacag aaagcacatt gtagagtttg tcacatggac aacagggcag 13380

ctttatcatg tgctagctaa gtctactgct atgtctatgg ttgagatgat tacaaagttt 13440

gaaaaggacc acctaaatga agtctctgcg ttaattggcg atgatgatat caatagtttt 13500

atcactgagt ttcttctagt tgagcctaga ttatttactg tatatctagg ccaatgtgct 13560

gcaatcaact ggggctttga aattcattat caccgacctt ctggaaagta ccaaatgggt 13620

gagttgttgt tctctttcct gagtagaatg agtaaaggag tcttcaaaat tttaaccaat 13680

gcattgagcc atcctaaagt atatagacgg ttttgggaca gtgggatgat tgaacctatt 13740

catggaccct ctcttgactc ccaaaaccta catataactg tatgcaacct gatctataac 13800

tgttacatga tttacctaga ccttctgtta aatgatgaat tagatgattt ctcattcatt 13860

ttatgcgaaa gtgacgagga tgtcatacct gaaagatttg acaacataca agccaggcac 13920

ctatgcatct tatctgacct ttattgtaac cctcgtgatt gtccccagat tcgtgggttg 13980

acaccaacac agaaatgtgc tgtgttatcg gggtacttaa agtcaaaagc cctagaatcc 14040

catgttggtc tgacatggaa tgacaaacct atcttaatag atcaatattc atgttccctg 14100

acatatctta gaagaggctc aatcaagcag ataagactga gagtggatcc cggattcatc 14160

actgatgctg ttggatgctt agaaaggcgt cctctaagaa ataattctac ctctaaggcc 14220

tcagaattaa agtcagaatt tgacccaccg aaagatgacc tggccaaact tctgagtcag 14280

ctgtcaacaa ggacacataa cttacccatt acaggattag gagtccggaa ctatgaggtt 14340

cactcattca gaagaattgg gatcaactct actgcatgtt acaaggcagt tgaaatagct 14400

tctgtgatta agaacgaatt tacgtctgaa gaacacggat tattcctagg agaaggttca 14460

ggtgcaatgt tgacagtata taaagagcta ttaagattgt caagatgtta ttataacagt 14520

ggtgtgtcag tagagtccag aactggacaa cgagagattt caccttaccc ttctgaggtc 14580

agtctggtgg aacatcaatt aggactcgat aaattggcga ctgtgctttt caatggcaga 14640

ccagaagtaa cttgggttgg gagtgttgat tgttacaagt acatactgag ccagatctct 14700

gctagcagtc ttgggttgat tcactcggat atagagtcac taccggacaa agacataatc 14760

gaaaagttgg aggaattgtc tgctatatta tcaatgactt tgatattagg gaaggtaggg 14820

tcagtgttag taattaagat catgccagct agtggcgact gggttcaagg atttatttta 14880

tatgcactcc cacattttct tcgaagtttc atagtttacc caagatacag caattttgtg 14940

tcaacagagg cctaccttgt ttttactggt cttagagcag ggagactagt caatccggag 15000

gggattaaac aacagatttt gcgagtcggt attcgaactt cacctgggtt ggtagggcac 15060

atcctttcat caaagcaggc agcatgtgtg cagtctttac acggacctcc atttcatgct 15120

gaatccttca atcctcacct ccagggttta acaagtattg agaaggtatt aatcaattgt 15180

gggcttacaa ttaatggtct taaggtatgt aagaacctgc ttcaccatga tatttcgtca 15240

ggcgaggaag ggctgaaagg atctatcacg atcctttacc gggaactcgc aaggttcaag 15300

gataaccacc aatcttcaca tggaatgttc catgcatacc ctgtgttaat cgcaagtcag 15360

gaaagggagc tcgtatctat cattgcaaag aagtactgtg gctatatttt gctttactcg 15420

ggagacttat acgaaattac caggattgtc cgaaacctga aagccaacca cataattttc 15480

gacttgcatc gtaacttatt tatggataat ctgtccagat ctgacaggtc tctcatccta 15540

acgacaatcc ccaaaaagaa ttggctcttt cagcttgaga caaaagagat aaaggagtgg 15600

ttcaaattgt taggttatag tgcactgatt agaaatcact aacaggttag tctggctcct 15660

agccccctac tattcattgc tatcaaactt ggttatacga aaaaaaacaa cggttattaa 15720

taagttatca tacccagctt tgtctggtgg gtcggcatgg catctccacc tcctcgcggt 15780

ccgacctggg catccgaagg aggacgcacg tccactcgga tggctaaggg agggcg 15836

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 14

gggtcaatga tggtacctta gaga 24

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 15

gcggccgctt aattgagtag 20

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 16

gaccttaagt tctatcccta aatggcag 28

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 17

gcggccgctt aagcatgagt a 21

<210> 18

<211> 37

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 18

caggtacctt ttagccatgg actctgtgtc agtgaac 37

<210> 19

<211> 42

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 19

gcggccgctt agtgatttct aatcagtgca ctataaccta ac 42

Claims

1.一种犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)将CDV-3的全长cDNA分成5个片段进行RT-PCR扩增，扩增产物依次命名为：F1、F2、F3、F4和F5，其中，用于扩增F1片段的引物为QF1-F以及QF1-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示，用于扩增F2片段的引物为QF2-F以及QF2-R，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3以及SEQ ID NO.4所示，用于扩增F3片段的引物为QF3-F以及QF3-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5以及SEQ ID NO.6所示，用于扩增F4片段的引物为QF4-F以及QF4-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7以及SEQ ID NO.8所示，用于扩增F5片段的引物为QF5-F以及QF5-R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9以及SEQ ID NO.10所示；

(3)经酶切拼接，将5个片段顺次插入到真核载体中，获得克隆有CDV-3株全长cDNA的质粒，即犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述的真核载体为改造后的真核载体pcDNA3.1，改造后的真核载体pcDNA3.1中多克隆位点变为NheI-NotI-BsiwI-Bsp1407I-CpoI-部分丁型肝炎核酶序列，改造后的pcDNA3.1称为pcDNA3.2。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，pcDNA3.1通过以下步骤进行改造：用内切酶PmeI酶切pcDNA3.1，回收大片段后，与事先制备的双链DNA连接，其中所述的双链DNA的上链如SEQ ID NO.11所示，所述的双链DNA的下链如SEQ ID NO.12所示，得到改造后真核载体pcDNA3.2。

4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述的CDV-3株全长cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

5.按照权利要求1-4任一项所述的方法构建得到的犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆。

6.权利要求5所述的犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆在拯救犬瘟热病毒rCDV-3株中的应用。

7.一种犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆的病毒拯救方法，其特征在于，包括以下步骤：构建表达犬瘟热病毒CDV-3株N、P、L蛋白的三个辅助质粒，利用转染试剂Lipofectamine^TM 2000将按照权利要求1-4任一项所述的方法构建得到的犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆和三个辅助质粒共转染293T细胞，3d后，上清接种到Vero细胞，观察犬瘟热病毒典型合胞体病变，出现犬瘟热病毒典型的合胞体样细胞病变时，反复冻融收获病毒液，对重组病毒进行免疫荧光鉴定和标签鉴定，得到拯救后具有感染性的犬瘟热病毒rCDV-3株。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的三个辅助质粒通过以下方法制备：针对CDV-3株N、P和L基因的开放阅读框区域，以合成的CDV-3株的全长cDNA为模板，进行PCR扩增，获得扩增产物N、P和L，回收纯化片段N、P和L，分别连接至pcDNA3.1，得到pcDNA3.1-N，pcDNA3.1-P和pcDNA3.1-L三个辅助质粒，其中，优选的，用于扩增N基因的开放阅读框区域的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.14以及SEQ ID NO.15所示，用于扩增P基因的开放阅读框区域的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.16以及SEQ ID NO.17所示，用于扩增L基因的开放阅读框区域的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.18以及SEQ ID NO.19所示。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，转染前24h，于6孔板中接种2×10⁵个293T细胞/孔，第二天细胞生长密度至90％以上，开始转染，每个质粒用量为：犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆5μg，辅助质粒pcDNA3.1-N 1μg，pcDNA3.1-P 0.8μg和pcDNA3.1-L 0.5μg，转染试剂22μL，按照Lipofectamine^TM2000说明书进行操作，共转染3h，更换为含10％v/vFBS的DMEM细胞培养液，37℃5％CO₂条件下培养3d，刮取细胞悬液，取300μL至单层Vero细胞，观察细胞病变，出现犬瘟热病毒典型的合胞体样细胞病变时，反复冻融收获病毒液，对重组病毒进行免疫荧光鉴定和标签鉴定，得到拯救后的具有感染性的犬瘟热病毒rCDV-3株。

10.按照权利要求7-9任一项所述的方法拯救获得的重组犬瘟热病毒rCDV-3株，所述的重组犬瘟热病毒rCDV-3株的病毒滴度最高达到10^7.667TCID₅₀/mL，比野生型犬瘟热病毒wtCDV-3株的滴度10^6.667TCID₅₀/mL高出10倍，重组犬瘟热病毒rCDV-3株感染Vero细胞后，迅速大量增殖，于感染后36h达到最高病毒滴度，而野生型犬瘟热病毒wtCDV-3株增殖平缓，感染后72h时病毒含量达到最大。