CN108690835B - 一株I型牛疱疹病毒gE缺失毒株及其获取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一株I型牛疱疹病毒gE缺失毒株，属于基因工程技术领域。本发明提供的I型牛疱疹病毒gE缺失毒株为快速制备IBRV基因缺失疫苗的研究奠定基础。

Description

一株I型牛疱疹病毒gE缺失毒株及其获取方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一株I型牛疱疹病毒gE缺失毒株及其获取方法。
背景技术
牛传染性鼻气管炎(Infectiousbovine Rhinotracheitis，简称IBR)又称坏死性鼻炎，是由I型牛疱疹病毒(BHV-1)引起的一类疾病，可诱发免疫抑制导致频繁的继发性细菌感染。BHV-1属于球形双股DNA病毒，大小为138kb，可编码10种囊膜糖蛋白，其中糖蛋白E(gE)是宿主免疫系统主要的致病因子和组成部分。目前，牛疱疹病毒I型(BHV-1)对畜牧业造成巨大的经济损失，因为没有任何可用的药物被证明是完全有效的，只有基因缺失病毒疫苗可能被用来根除IBR。在对北方六省的1235份牛血清进行检测时发现牛鼻气管炎在我国奶牛中发病率极高，因此研制当前流行毒株的缺失疫苗迫在眉睫。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株I型牛疱疹病毒gE缺失毒株，为快速制备BHV-1基因缺失疫苗的研究奠定基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株I型牛疱疹病毒gE缺失毒株，所述I型牛疱疹病毒gE缺失毒株的获取方法，包括以下步骤：
1)以I型牛疱疹病毒基因组为模板，分别利用gE基因上游同源臂引物对和下游同源臂引物对扩增，分别得到gE基因上游同源臂和gE基因下游同源臂；
所述gE基因上游同源臂引物对的上游引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述gE基因上游同源臂引物对的上游引物5’端加入酶切位点HindIII后再进行扩增；所述gE基因上游同源臂引物对的下游引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述gE基因上游同源臂引物对的下游引物5’端加入酶切位点KpnI后再进行扩增；
所述gE基因下游同源臂引物对的上游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述gE基因下游同源臂引物对的上游引物5’端加入酶切位点BamHI后再进行扩增；所述gE基因下游同源臂引物对的下游引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，所述gE基因下游同源臂引物对的下游引物5’端加入酶切位点EcoRI后再进行扩增；
2)将所述步骤1)得到的gE基因上游同源臂采用HindIII和KpnI进行双酶切，得到gE基因上游同源臂酶切产物；将所述步骤1)得到的gE基因下游同源臂采用BamHI和EcoRI进行双酶切，得到gE基因下游同源臂酶切产物；
3)将所述步骤2)得到的gE基因上游同源臂酶切产物与PCDNA3.1(+)进行连接，得到gE基因上游同源臂连接产物；所述PCDNA3.1(+)质粒是用HindIII和KpnI进行酶切处理后得到；
4)将所述步骤3)得到的gE基因上游同源臂连接产物依次进行转化、提取质粒，得到质粒pBHV-3；
5)将所述步骤4)得到的质粒pBHV-3采用BamHI和EcoRI进行双酶切，得到质粒pBHV-3酶切产物，将所述质粒pBHV-3酶切产物与步骤2)得到的gE基因下游同源臂酶切产物进行连接，得到gE基因下游同源臂连接产物；
6)将所述步骤5)得到的gE基因下游同源臂连接产物依次进行转化、提取质粒，得到重组质粒pBHV-1；
7)在sgRNA-1上游引物和sgRNA-1下游引物的5’端分别加入酶切位点BbsI后进行变性退火延伸，得到sgRNA-1；所述sgRNA-1上游引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，所述sgRNA-1下游引物具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；
在sgRNA-2上游引物和sgRNA-2下游引物的5’端分别加入酶切位点BbsI后进行变性退火延伸，得到sgRNA-2；所述sgRNA-2上游引物具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，所述sgRNA-2下游引物具有SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；
8)将pSpCas9-2A-Puro经BbsI酶切后，得到pSpCas9-2A-Puro酶切产物，将所述pSpCas9-2A-Puro酶切产物分别与步骤7)所述的sgRNA-1和sgRNA-2连接，得到含有sgRNA-1的pSpCas9-2A-Puro和含有sgRNA-2的pSpCas9-2A-Puro；
9)将步骤8)得到的含有sgRNA-1的pSpCas9-2A-Puro和含有sgRNA-2的pSpCas9-2A-Puro分别依次经转化、提取质粒后，得到切割质粒pSpCas9-2A-Puro-1和切割质粒pSpCas9-2A-Puro-2；
10)将所述步骤6)得到的重组质粒pBHV-1与步骤9)得到的切割质粒pSpCas9-2A-Puro-1、切割质粒pSpCas9-2A-Puro-2混合后转染vero细胞，转染5～7h后以MOI为0.1感染I型牛疱疹病毒，1.5～2.5d后得到空白斑，将所述空白斑接种于DMEM液体培养基后进行冻融，将得到的冻融物接种于单层MDBK细胞上进行感染，4h后将得到的感染物接种于含有胎牛血清的培养基中，出现病变后挑取噬斑，得到I型牛疱疹病毒gE缺失毒株；所述重组质粒pBHV-1与切割质粒pSpCas9-2A-Puro-1、切割质粒pSpCas9-2A-Puro-2的质量比为4:1:1。
本发明还提供了上述技术方案所述的I型牛疱疹病毒gE缺失毒株的获取方法，包括以下步骤：
1)以I型牛疱疹病毒为模版，分别利用gE基因上游同源臂引物对和下游同源臂引物对扩增，分别得到gE基因上游同源臂和gE基因下游同源臂；
所述gE基因上游同源臂引物对的上游引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述gE基因上游同源臂引物对的上游引物5’端上加入酶切位点HindIII后再进行扩增；所述gE基因上游同源臂引物对的下游引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述gE基因上游同源臂引物对的下游引物5’端上加入酶切位点KpnI后再进行扩增；
所述gE基因下游同源臂引物对的上游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述gE基因下游同源臂引物对的上游引物5’端上加入酶切位点BamHI后再进行扩增；所述gE基因下游同源臂引物对的下游引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，所述gE基因下游同源臂引物对的下游引物5’端上加入酶切位点EcoRI后再进行扩增；
2)将所述步骤1)得到的gE基因上游同源臂采用HindIII和KpnI进行双酶切，得到gE基因上游同源臂酶切产物；将所述步骤1)得到的gE基因下游同源臂采用BamHI和EcoRI进行双酶切，得到gE基因下游同源臂酶切产物；
3)将所述步骤2)得到的gE基因上游同源臂酶切产物与PCDNA3.1(+)进行连接，得到gE基因上游同源臂连接产物；所述PCDNA3.1(+)质粒是用HindIII和KpnI进行酶切处理后得到；
4)将所述步骤3)得到的gE基因上游同源臂连接产物依次进行转化、提取质粒，得到质粒pBHV-3；
5)将所述步骤4)得到的质粒pBHV-3采用BamHI和EcoRI进行双酶切，得到质粒pBHV-3酶切产物，将所述质粒pBHV-3酶切产物与步骤2)得到的得到gE基因下游同源臂酶切产物进行连接，得到gE基因下游同源臂连接产物；
6)将所述步骤5)得到的gE基因下游同源臂连接产物依次进行转化、提取质粒，得到重组质粒pBHV-1；
7)在sgRNA-1上游引物和sgRNA-1下游引物的5’端分别加入酶切位点BbsI后进行变性退火延伸，得到sgRNA-1；所述sgRNA-1上游引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，所述sgRNA-1下游引物具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；
在sgRNA-2上游引物和sgRNA-2下游引物的5’端分别加入酶切位点BbsI后进行变性退火延伸，得到sgRNA-2；所述sgRNA-2上游引物具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，所述sgRNA-2下游引物具有SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；
8)将pSpCas9-2A-Puro经BbsI酶切后，得到pSpCas9-2A-Puro酶切产物，将所述pSpCas9-2A-Puro酶切产物分别与步骤7)所述的sgRNA-1和sgRNA-2连接，得到含有sgRNA-1的pSpCas9-2A-Puro和含有sgRNA-2的pSpCas9-2A-Puro；
9)将步骤8)得到的含有sgRNA-1的pSpCas9-2A-Puro和含有sgRNA-2的pSpCas9-2A-Puro分别分别依次经转化、提取质粒后，得到切割质粒pSpCas9-2A-Puro-1和切割质粒pSpCas9-2A-Puro-2；
10)将所述步骤6)得到的重组质粒pBHV-1与步骤9)得到的切割质粒pSpCas9-2A-Puro-1、切割质粒pSpCas9-2A-Puro-2混合后转染vero细胞，转染5～7h后以MOI为0.1感染I型牛疱疹病毒，1.5～2.5d后得到空白斑，将所述空白斑接种于DMEM液体培养基后进行冻融，将得到的冻融物接种于单层MDBK细胞上进行感染，4h后将得到的感染物接种于含有胎牛血清的培养基中，出现病变后挑取噬斑，得到I型牛疱疹病毒gE缺失毒株；所述重组质粒pBHV-1与切割质粒pSpCas9-2A-Puro-1、切割质粒pSpCas9-2A-Puro-2的质量比为4:1:1。
优选的，所述步骤1)扩增gE基因上游同源臂使用的体系每50μl包括：100ng I型牛疱疹病毒基因组模板，4μl dNTP，gE基因上游同源臂引物对的上游引物和gE基因上游同源臂引物对的下游引物各2μl，5×buffer 10μl，La taq 1μl，ddH2O补至50μl；
所述步骤1)扩增gE基因下游同源臂使用的体系每50μl包括：100ng I型牛疱疹病毒基因组模板，4μl dNTP，gE基因下游同源臂引物对的上游引物和gE基因下游同源臂引物对的下游引物各2μl，5×buffer 10μl，La taq 1μl，ddH2O补至50μl。
优选的，所述扩增gE基因上游同源臂和gE基因下游同源臂的程序独立的为：94℃预变性2min，94℃变性30s、66℃退火30s、72℃延伸80s，35个循环，72℃终延伸10min。
优选的，所述步骤2)gE基因上游同源臂的酶切体系每20μl包括10×Buffer 2μl，gE基因上游同源臂1μg，HindIII和KpnI各1μl，ddH2O补加至20μl；所述gE基因上游同源臂的酶切条件为37℃固浴1h；
所述gE基因下游同源臂的酶切体系每20μl包括10×Buffer 2μl，gE基因下游同源臂1μg，HindIII和KpnI各1μl，ddH2O补加至20μl；所述gE基因下游同源臂的酶切条件为37℃固浴1h。
优选的，所述步骤3)gE基因上游同源臂酶切产物与PCDNA3.1(+)连接使用的体系每10μl包括gE基因上游同源臂酶切产物4μl，PCDNA3.1(+)1μl，SolutionI 5μl；所述连接的条件为在16℃过夜；
所述步骤3)PCDNA3.1(+)质粒用HindIII和KpnI酶切使用的体系每20μl包括10×Buffer 2μl，PCDNA3.1(+)质粒1μg，HindIII和KpnI各1μl，ddH2O补加至20μl；所述酶切的条件为在37℃下固浴1h。
优选的，所述步骤5)质粒pBHV-3采用BamHI和EcoRI酶切使用的体系每20μl包括10×Buffer 2μl，质粒pBHV-31μg，BamHI和EcoRI各1μl，ddH2O补加至20μl；所述酶切的条件为在37℃下固浴1h；
所述质粒pBHV-3酶切产物与gE基因下游同源臂酶切产物连接使用的体系每10μl包括gE基因下游同源臂酶切产物4μl，质粒pBHV-3酶切产物1μl，SolutionI 5μl；所述连接的条件为在16℃过夜。
优选的，所述步骤7)变性退火延伸使用的体系每10μl包括：sgRNA-1上游引物或sgRNA-2上游引物1μl，gRNA-1下游引物或sgRNA-2下游引物1μl，Solution 5μl，ddH2O 3μl；
所述变性退火延伸的程序为：95℃5min，85℃5s、25℃5s，置于16℃保存。
优选的，所述步骤8)pSpCas9-2A-Puro经BbsI酶切使用的体系每20μl包括10×Buffer 2μl，pSpCas9-2A-Puro 1μg，BbsI 1μl，ddH2O补加至20μl；所述酶切的条件为37℃固浴1h。
优选的，所述步骤8)pSpCas9-2A-Puro酶切产物与sgRNA-1或sgRNA-2连接使用的体系每10μl包括：sgRNA-1或sgRNA-2 4μl，pSpCas9-2A-Puro酶切产物1μl，SolutionI 5μl；所述连接的条件为在16℃过夜。
本发明实施例的结果显示：本发明提供的I型牛疱疹病毒gE缺失毒株能为快速制备IBRV基因缺失疫苗的研究奠定基础。
附图说明
图1为重组质粒pBHV-1ΔgE构建流程图；
图2为切割质粒构建流程图；
图3为重组质粒pBHV-3的酶切鉴定图，从左至右：maker5000、pBHV-3重复4个样；
图4为重组质粒pBHV-1的酶切鉴定图，从左至右maker5000、用HindIII和KpnI酶切pBHV-1、用BamHI和EcoRI酶切pBHV-1、用HindIII和EcoRI酶切pBHV-1；
图5为切割载体酶切鉴定图；
图6为质粒在不同细胞中的转染效率；
图7为不同细胞中感染IBRV的病毒滴度；
图8为不同细胞系感染IBRV后再感染MDBK的病毒滴度；
图9为重组病毒IBRV gE-的PCR鉴定图，从左至右：maker2000、亲本毒、重组毒(重复做五组)、maker2000；
图10为重组IBRV和亲本IBRV的病毒重组空斑形成单位(PFU)的测定；
图11为重组IBRV和亲本IBRV在MDBK细胞中体外生长曲线；
图12为重组IBRV和亲本IBRV在MDBK上清中体外生长曲线。
具体实施方式
本发明提供了一株I型牛疱疹病毒gE缺失毒株。本发明提供的I型牛疱疹病毒gE缺失毒株为快速制备IBRV基因缺失疫苗的研究奠定基础。
在本发明中，所述I型牛疱疹病毒gE缺失毒株可用来制备疫苗。
在本发明中，所述I型牛疱疹病毒gE缺失毒株的获取方法，包括以下步骤：
1)以I型牛疱疹病毒基因组为模版，分别利用gE基因上游同源臂引物对和下游同源臂引物对扩增，分别得到gE基因上游同源臂和gE基因下游同源臂；
所述gE基因上游同源臂引物对的上游引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述gE基因上游同源臂引物对的上游引物5’端加入酶切位点HindIII后再进行扩增；所述gE基因上游同源臂引物对的下游引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，所述gE基因上游同源臂引物对的下游引物5’端加入酶切位点KpnI后再进行扩增；
所述gE基因下游同源臂引物对的上游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述gE基因下游同源臂引物对的上游引物5’端加入酶切位点BamHI后再进行扩增；所述gE基因下游同源臂引物对的下游引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，所述gE基因下游同源臂引物对的下游引物5’端加入酶切位点EcoRI后再进行扩增；
2)将所述步骤1)得到的gE基因上游同源臂采用HindIII和KpnI进行双酶切，得到gE基因上游同源臂酶切产物；将所述步骤1)得到的gE基因下游同源臂采用BamHI和EcoRI进行双酶切，得到gE基因下游同源臂酶切产物；
3)将所述步骤2)得到的gE基因上游同源臂酶切产物与PCDNA3.1(+)进行连接，得到gE基因上游同源臂连接产物；所述PCDNA3.1(+)质粒是用HindIII和KpnI进行酶切处理后得到；
4)将所述步骤3)得到的gE基因上游同源臂连接产物依次进行转化、提取质粒，得到质粒pBHV-3；
5)将所述步骤4)得到的质粒pBHV-3采用BamHI和EcoRI进行双酶切，得到质粒pBHV-3酶切产物，将所述质粒pBHV-3酶切产物与步骤2)得到的得到gE基因下游同源臂酶切产物进行连接，得到gE基因下游同源臂连接产物；
6)将所述步骤5)得到的gE基因下游同源臂连接产物依次进行转化、提取质粒，得到重组质粒pBHV-1；
7)在sgRNA-1的上游引物和sgRNA-1下游引物的5’端分别加入酶切位点BbsI后进行变性退火延伸，得到sgRNA-1；所述sgRNA-1上游引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，所述sgRNA-1下游引物具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；
在sgRNA-2上游引物和sgRNA-2下游引物的5’端分别加入酶切位点BbsI后进行变性退火延伸，得到sgRNA-2；所述sgRNA-2上游引物具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，所述sgRNA-2下游引物具有SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；
8)将pSpCas9-2A-Puro经BbsI酶切后，得到pSpCas9-2A-Puro酶切产物，将所述pSpCas9-2A-Puro酶切产物分别与步骤7)所述的sgRNA-1和sgRNA-2连接，得到含有sgRNA-1的pSpCas9-2A-Puro和含有sgRNA-2的pSpCas9-2A-Puro；
9)将步骤8)得到的含有sgRNA-1的pSpCas9-2A-Puro和含有sgRNA-2的pSpCas9-2A-Puro分别依次经转化、提取质粒后，得到切割质粒pSpCas9-2A-Puro-1和切割质粒pSpCas9-2A-Puro-2；
10)将所述步骤6)得到的重组质粒pBHV-1与步骤9)得到的切割质粒pSpCas9-2A-Puro-1、切割质粒pSpCas9-2A-Puro-2混合后转染veroE细胞，转染5～7h后以MOI为0.1感染I型牛疱疹病毒，1.5～2.5d后得到空白斑，将所述空白斑接种于DMEM液体培养基后进行冻融，4h后将得到的冻融物接种于单层MDBK细胞上进行感染，将得到的感染物接种于含有胎牛血清的培养基中，出现病变后挑取噬斑，得到I型牛疱疹病毒gE缺失毒株；所述重组质粒pBHV-1与切割质粒pSpCas9-2A-Puro-1、切割质粒pSpCas9-2A-Puro-2的质量比为4:1:1。
本发明以I型牛疱疹病毒为模版，分别利用gE基因上游同源臂引物对和下游同源臂引物对扩增，分别得到gE基因上游同源臂和gE基因下游同源臂。
在本发明中，所述gE基因具有SEQ ID No.9所示的序列，具体序列如下所示：
atgcaacccaccgcgccgccccggcggcggttgctgccgctgctgctgccgcagttattgcttttcgggctgatggccgaggccaagcccgcgaccgaaaccccgggctcggcttcggtcgacacggtcttcacggcgcgcgctggcgcgcccgtctttctcccagggcccgcggcgcgcccggacgtgcgcgccgttcgcggctggagcgtcctcgcgggcgcctgctcgccgcccgtgccggagcccgtctgcctcgacgaccgcgagtgcttcaccgacgtggccctggacgcggcctgcctgcgaaccgcccgcgtggccccgctggccatcgcggagctcgccgagcggcccgactcaacgggcgacaaagagtttgttctcgccgacccgcacgtctcggcgcagctgggtcgcaacgcgaccggggtgctgatcgcggccgcagccgaggaggacggcggcgtgtacttcctgtacgaccggctcatcggcgacgccggcgacgaggagacgcagttggcgctgacgctgcaggtcgcgacggccggcgcgcagggcgccgcgcgggacgaggagagggaaccagcgaccgggcccacccccggcccgccgccccaccgcacgacgacacgcgcgcccccgcggcggcacggcgcgcgcttccgcgtgctgccgtaccactcccacgtatacaccccgggcgattcctttctgctatcggtgcgtctgcagtctgagtttttcgacgaggctcccttctcggccagcatcgactggtacttcctgcggacggccggcgactgcgcgctcatccgcatatacgagacgtgcatcttccaccccgaggcaccggcctgcctgcaccccgccgacgcgcagtgcagcttcgcgtcgccgtaccgctccgagaccgtgtacagccggctgtacgagcagtgccgcccggaccctgccggtcgctggccgcacgagtgcgagggcgccgcgtacgcggcgcccgttgcgcacctgcgtcccgccaataacagcgtagacctggtctttgacgacgcgccggctgcggcctccgggctttacgtctttgtgctgcagtacaacggccacgtggaagcttgggactacagcctagtcgttacttcggaccgtttggtgcgcgcggtcaccgaccacacgcgccccgaggccgcagccgccgacgctcccgagccaggcccaccgctcaccagcgagccggcgggcgcgcccaccgggcccgcgccctggcttgtggtgctggtgggcgcgcttggactcgcgggactggtgggcatcgcagccctcgccgttcgggtgtgcgcgcgccgcgcaagccagaagcgcacctacgacatcctcaaccccttcgggcccgtatacaccagcttgccgaccaacgagccgctcgacgtggtggtgccagttagcgacgacgaattttccctcgacgaagactcttttgcggatgacgacagcgacgatgacgggcccgctagcaacccccctgcggatgcctacgacctcgccggcgccccagagccaactagcgggtttgcgcgagcccccgccaacggcacgcgctcgagtcgctctgggttcaaagtttggtttagggacccgcttgaagacgatgccgcgccagcgcggaccccggccgcaccagattacaccgtggtagcagcgcgactcaagtccatcctccgctag。
在本发明中，所述gE基因上游同源臂引物对的上游引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具体如下所示：
gctgcagacgaaagctttcgcctcctgcccgcg。
在本发明中，所述gE基因上游同源臂引物对的上游引物5’端加入酶切位点HindIII后再进行扩增。
在本发明中，所述gE基因上游同源臂引物对的下游引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，具体如下所示：
ccaaatgcccttttggtaccctctcgcgtgcgc。
在本发明中，所述gE基因上游同源臂引物对的下游引物5’端加入酶切位点HindIII后再进行扩增。
本发明扩增gE基因上游同源臂使用的体系每50μl包括：100ng I型牛疱疹病毒基因组模板，4μl dNTP，gE基因上游同源臂引物对的上游引物和gE基因上游同源臂引物对的下游引物各2μl，5×buffer 10μl，La taq 1μl，ddH2O补至50μl。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规采用的市售产品即可。本发明对所述I型牛疱疹病毒基因组的提取方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规采用的提取基因组的方法即可。
在本发明中，所述扩增gE基因上游同源臂的程序优选为：94℃预变性2min，94℃变性30s、66℃退火30s、72℃延伸80s，35个循环，72℃终延伸10min。
在本发明中，所述gE基因下游同源臂引物对的上游引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，具体如下所示：
aaaggatccagtcgttacttcggaccgtttggtg。
在本发明中，所述gE基因下游同源臂引物对的上游引物5’端加入酶切位点BamHI后再进行扩增。
在本发明中，所述gE基因上游同源臂引物对的下游引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，具体如下所示：
aaggaattccagcgcctcgatagttttcgttgac。
在本发明中，所述gE基因上游同源臂引物对的下游引物5’端加入酶切位点EcoRI后再进行扩增。
本发明扩增gE基因下游同源臂使用的体系每50μl包括100ng I型牛疱疹病毒模板，4μl dNTP，gE基因下游同源臂引物对的上游引物和gE基因下游同源臂引物对的下游引物各2μl，5×buffer 10μl，La taq 1μl，ddH2O补至50μl。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规采用的市售产品即可。本发明对所述I型牛疱疹病毒基因组的提取方法没有特殊限定，采用本领域技术人员常规采用的提取基因组的方法即可。
在本发明中，所述扩增gE基因下游同源臂的程序优选为：94℃预变性2min，94℃变性30s、66℃退火30s、72℃延伸80s，35个循环，72℃终延伸10min。
得到gE基因上游同源臂后，本发明将所述gE基因上游同源臂采用HindIII和KpnI进行酶切，得到gE基因上游同源臂酶切产物。
在本发明中，所述gE基因上游同源臂的酶切体系优选每20μl包括10×Buffer2μl，gE基因上游同源臂1μg，HindIII和KpnI各1μl，ddH2O补加至20μl。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售商品即可。在本发明中，所述gE基因上游同源臂的酶切条件优选为37℃固浴1h。
得到gE基因下游同源臂片段后，本发明将所述gE基因下游同源臂片段采用BamHI和EcoRI进行双酶切，得到gE基因下游同源臂酶切产物。
在本发明中，所述gE基因下游同源臂的酶切体系优选每20μl包括10×Buffer 2μl，gE基因下游同源臂1μg，HindIII和KpnI各1μl，ddH2O补加至20μl。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。在本发明中，所述gE基因下游同源臂的酶切条件优选为37℃固浴1h。
得到gE基因上游同源臂酶切产物后，本发明将所述gE基因上游同源臂酶切产物与PCDNA3.1(+)进行连接，得到gE基因上游同源臂连接产物；所述PCDNA3.1(+)质粒是用HindIII和KpnI进行酶切处理后得到。
在本发明中，所述pBHV-3具有SEQ ID No.10所示的序列，具体序列如下所示：
gaggtgggggctaaaagcagagctctctggctactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcacTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTTCGCCTCCTGCCCGCGCGTCGCGAACGACGCCTTTCGCTCCTGCCTGCACGCCGACACGCGCCCCGCTCGCAGCGAGCGGCGCGCGAGCGCCGCGGTCGAAAACCACGTGCTCTTCTCCATCGCCCATCCGCGCCCAATAGACTCAGGGCTCTACTTTCTGCGCGTCGGCATCTACGGCGGCACCGCGGGCAGCGAGCGCCGCCGAGACGTCTTTCCCTTGGCCGCGTTTGTACACAGCTTCGGTGAGCCCGGAGACCCAGAGGCCGCGGCCGCGCACCCCGGCGCCGTCGAGGCAGTCGCGACCCGCTGCGAGCGGGGCCTCGACGCCAGCTCGGCGAGCCTCTACGACCGCGCGCTGGCGGCGTTCCCCGCAGGCGCCGCCACCACGCCCGGCCCCACCGCGAGCAGCGGGAGCGGGGCCGCGACGCCGGAGAGGGTCGACGAGACGACGGAAGTCAAGGCCGCGACGAGAGCGGGCTCGGCGTTTGCCCTCACCACGCCCCCGGCCGGCCTGACCGCCAGCCCCGCCGCCAGCCCCTCCCGTGCCTTTAGCGCGGCCGCCCCGGCCGCCGCTGCGCAGCCGGCCGGAGACACGCCCGCTCGCTTCCGGCGCCAACTGGCGTCGATCCTAGTGCCTCTGTGCGTGCTGGTGCTGCTGCTGCTTGCGCTCTGCGCCGCGACGGTAAACTGCGCGCTGCGCCGCCGCCTGCTGCCGTGCTCTCGGCGCGTTTACAAGCCGCGGACGTGCGCGACATGCGGGAGCGGCACTTGCGCGGGGCGGCCCCCCTGCCGCGGCGCGGCACCGAGCGCCCCAGCCACCGTCGTGGCACTGGGCTCCCGGCCAAAGGCGCCCCCCCTCGCCACCATCAGCGAAGAATAAACGCCGCGCGCGGCAAACGATCTCGCTCGCGTGTGTCTTGGTTTCTGCGCGGCGGGCGGGGTGGGGAGCGGGCAAGGCGGAGGAAGACCGGGGGCAGGAGCTGCGTGGAGGGCGGAGCCGTTGAGCGGCCCGACCGCCGCCGGGTTGTTAAATGGGTCTCGCGCGGCTCGTGGTTCCACACCGCGCCGGAGAACCAGCGCGAGCTTCGCTGCGTGTgtCCCGCGAGCTGCGTtCCgGGGAACGGCGCACGCGAGAGGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGaattctgcagatatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggccccgtaaccccc。
在本发明中，所述gE基因上游同源臂酶切产物与PCDNA3.1(+)连接使用的体系优选每10μl包括gE基因上游同源臂酶切产物4μl，PCDNA3.1(+)1μl，SolutionI 5μl；所述连接的条件为在16℃过夜。
在本发明中，所述PCDNA3.1(+)质粒用HindIII和KpnI进行酶切使用的体系优选每20μl包括10×Buffer 2μl，PCDNA3.1(+)质粒1μg，HindIII和KpnI各1μl，ddH2O补加至20μl；所述酶切的条件为在37℃下固浴1h。本发明对所述试剂和质粒的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。
本发明将得到的gE基因上游同源臂连接产物依次进行转化、提取质粒，得到质粒pBHV-1。
在本发明中，所述gE基因上游同源臂连接产物进行转化的条件包括：将所述gE基因上游同源臂连接产物与DH5α感受态细胞混合，将得到的混合物依次进行第一冰浴、热激和第二冰浴，得到第二冰浴产物，将所述第二冰浴产物与LB液体培养基混合后进行活化，将得到的培养物离心分离，得到沉淀和清液，将所述沉淀经占总清液体积的10％的清液稀释后涂布在含有氨苄抗生素的LB固体培养基上进行倒置培养，得到转化物。
在本发明中，所述gE基因上游同源臂连接产物与含DH5α感受态细胞的溶液的体积比优选为(8～12):(80～120)，更优选为10:100。在本发明中，所述第一冰浴的时间优选为25～35min，更优选为30min。在本发明中，所述热激的时间优选为80～100s，更优选为90s；所述热激的温度优选为35～45℃，更优选为42℃。在本发明中，所述第二冰浴的时间优选为1.5～2.5min，更优选为2min。在本发明中，所述第二冰浴产物与LB液体培养基的体积比优选为1:9。在本发明中，所述活化的时间优选为0.8～1.2h，更优选为1h；所述振荡培养的温度优选为35～42℃，更优选为37℃；所述活化的转速优选为200～240rpm，更优选为220rpm。在本发明中，所述离心分离的转速优选为4500～5500rpm，更优选为5000rpm，所述离心分离的时间优选为4～6min，更优选为5min。在本发明中，所述倒置培养的温度优选为35～42℃，优选为37℃；所述倒置培养的时间优选为10～14h，更优选为12h。
在本发明中，所述pBHV-1具有SEQ ID No.11所示的序列，具体序列如下所示：
gaggtgggggctaaaagcagagctctctggctactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcacTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTTCGCCTCCTGCCCGCGCGTCGCGAACGACGCCTTTCGCTCCTGCCTGCACGCCGACACGCGCCCCGCTCGCAGCGAGCGGCGCGCGAGCGCCGCGGTCGAAAACCACGTGCTCTTCTCCATCGCCCATCCGCGCCCAATAGACTCAGGGCTCTACTTTCTGCGCGTCGGCATCTACGGCGGCACCGCGGGCAGCGAGCGCCGCCGAGACGTCTTTCCCTTGGCCGCGTTTGTACACAGCTTCGGTGAGCCCGGAGACCCAGAGGCCGCGGCCGCGCACCCCGGCGCCGTCGAGGCAGTCGCGACCCGCTGCGAGCGGGGCCTCGACGCCAGCTCGGCGAGCCTCTACGACCGCGCGCTGGCGGCGTTCCCCGCAGGCGCCGCCACCACGCCCGGCCCCACCGCGAGCAGCGGGAGCGGGGCCGCGACGCCGGAGAGGGTCGACGAGACGACGGAAGTCAAGGCCGCGACGAGAGCGGGCTCGGCGTTTGCCCTCACCACGCCCCCGGCCGGCCTGACCGCCAGCCCCGCCGCCAGCCCCTCCCGTGCCTTTAGCGCGGCCGCCCCGGCCGCCGCTGCGCAGCCGGCCGGAGACACGCCCGCTCGCTTCCGGCGCCAACTGGCGTCGATCCTAGTGCCTCTGTGCGTGCTGGTGCTGCTGCTGCTTGCGCTCTGCGCCGCGACGGTAAACTGCGCGCTGCGCCGCCGCCTGCTGCCGTGCTCTCGGCGCGTTTACAAGCCGCGGACGTGCGCGACATGCGGGAGCGGCACTTGCGCGGGGCGGCCCCCCTGCCGCGGCGCGGCACCGAGCGCCCCAGCCACCGTCGTGGCACTGGGCTCCCGGCCAAAGGCGCCCCCCCTCGCCACCATCAGCGAAGAATAAACGCCGCGCGCGGCAAACGATCTCGCTCGCGTGTGTCTTGGTTTCTGCGCGGCGGGCGGGGTGGGGAGCGGGCAAGGCGGAGGAAGACCGGGGGCAGGAGCTGCGTGGAGGGCGGAGCCGTTGAGCGGCCCGACCGCCGCCGGGTTGTTAAATGGGTCTCGCGCGGCTCGTGGTTCCACACCGCGCCGGAGAACCAGCGCGAGCTTCGCTGCGTGTgtCCCGCGAGCTGCGTtCCgGGGAACGGCGCACGCGAGAGGGTACCGAGCTCGGATCCGCGCCCCCCCCCCCGCGCGCTGTGCCGTCTGACGGAAAGCACCCGCGTGTAGGGCTGCATATAAATGGAGCGCTCACACAAAGCCTCGTGCGGCTGCTTCGAAGGCATGGAGAGTCCACGCAGCGTCGTCAACGAAAACTATCGAGGCGCTGATGAGGCCGATGCAGCGCCCCCTTCACCGCCGCCGGAAGGCTCCATCGTGTCCATCCCCATCCTCGAGCTCACCATCGAGGACGCGCCGGCCAGCGCAGAAGCAACCGGCACCGCGGCAGCCGCACCCGCTGGGCGCACTCCAGACGCGAACGCAGCACCCGGCGGCTACGTGCCAGTTCCCGCGGCGGATGTGGACTGCTATTATAGCGAAAGCGACAGCGAGACGGCAGGCGAGTTTTTGATACGCATGGGGCGGCAGCAGCGGCGGCGGCATCGGCGGCGGCGCTGCATGATAGCAGCGGCCCTGACTTGCATTGGCCTCGGGGCCTGCGCGGCGGCGGCAGCGGCAGGCGCCGTCCTGGCGTTGGAGGTAGTGCCCCGGCCCTGAGGCCCCGAGACCCCCGGCCCTGAGGCCCTGGGGCGGGGCCCGACTGTCCCCTTCCCCCCTCCCCCCCGTCCGCCCGCGAGTAAAGGCTGTCTAATTTTTTCCGCACGCCCGCGCCTGTCTTCTTAGGGAGGGGAAGGAGGGGAGGGAGGGGAAGGAGGGGAGGGAGGGGAAGGAGGGGAGGGAGGGGAAGGAGGGGAGGGAGGGGAAGGAGGGGAGGGAGGGGAAGGAGGGGAGGGAGGGGAAGGAGGGGAGGGAGGGGAAGGAGGGGAGGGAGGGGAAGGAGGGGAGGGAGGGGAAGGAGGGGAGGGAGGGGAAGGAGGGGAGGGAGGGGAAGGAGGGGAGGGAGGGGAAGGAGGGGATTCGGGCCGGCCGAGGATTCGgaattctgcagatatccagcacagtggcggccgctcgagtctagagggccccgtaaccccc。
在本发明中，所述转化物优选为白色菌落。在本发明中，所述提取质粒的方法优选包括：将所述转化物的单个菌落接种于含有氨苄抗生素的LB液体培养基中进行培养，提取得到的培养物中的质粒，得到质粒pBHV-3。在本发明中，所述氨苄抗生素与LB液体培养基的体积比优选为1:1000。在本发明中，所述培养的时间优选为10～14h，更优选为12h；所述培养的温度优选为35～42℃，更优选为37℃；所述培养的转速优选为200～240rpm，更优选为220rpm。本发明优选采用质粒提取试剂盒提取质粒，对所述质粒提取试剂盒的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
本发明将得到的质粒pBHV-3采用BamHI和EcoRI进行双酶切，得到质粒pBHV-3酶切产物，将所述质粒pBHV-3酶切产物与得到的gE基因下游同源臂酶切产物进行连接。
在本发明中，所述质粒pBHV-3采用BamHI和EcoRI进行双酶切使用的体系优选每20μl包括10×Buffer2μl，质粒pBHV-31μg，BamHI和EcoRI各1μl，ddH2O补加至20μl；所述酶切的条件为在37℃下固浴1h。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规采用的市售产品即可。
在本发明中，所述质粒pBHV-3酶切产物与gE基因下游同源臂酶切产物连接使用的体系优选每10μl包括gE基因下游同源臂酶切产物4μl，质粒pBHV-3酶切产物1μl，SolutionI5μl；所述连接的条件为在16℃过夜。本发明对上述试剂的来源没有特殊限定，采用市售产品即可。
本发明将得到的gE基因下游同源臂连接产物依次进行转化、提取质粒，得到重组质粒pBHV-1。在本发明中，所述gE基因下游同源臂连接产物依次进行转化、提取质粒的方法与gE基因上游同源臂连接产物依次进行转化、提取质粒的方法相同，在此不再赘述。
本发明在sgRNA-1上游引物和sgRNA-1下游引物的5’端分别加入酶切位点BbsI后进行变性退火延伸，得到sgRNA-1；所述sgRNA-1上游引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，所述sgRNA-1下游引物具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；
在sgRNA-2上游引物和sgRNA-2下游引物的5’端分别加入酶切位点BbsI后进行变性退火延伸，得到sgRNA-2；所述sgRNA-2上游引物具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，所述sgRNA-2下游引物具有SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。
在本发明中，所述sgRNA-1上游引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，具体如下所示：
caccgCGAGCCCGGGGTTTCGGTCGCGG。
在本发明中，所述sgRNA-2上游引物具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，具体如下所示：
caccgCCACGCTGGTGAAGCACTCGCGG。
在本发明中，所述sgRNA-1下游引物具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，具体如下所示：
aaacCCGCGACCGAAACCCCGGGCTCGc；
在本发明中，所述sgRNA-2下游引物具有SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，具体如下所示：
aaacCCGCGAGTGCTTCACCGACGTGGc。
在本发明中，以所述具有SEQ ID No.5序列的上游引物和具有SEQ ID No.7序列的下游引物为引物对进行扩增，得到的sgRNA-1具有SEQ ID No.12所示的序列，具体序列如下所示：
AATTTGGGTTAAATCTTGGTGGAAGGGCGAAACACCGCGGCGACGAGGAGACGCAGTTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCTCTAGAGTCGACACTAGTCTCGAGATCGATAAGCTTCCTAGAGGTACCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTGTGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGAGGGGG；
以所述具有SEQ ID No.6序列的上游引物和具有SEQ ID No.8序列的下游引物为引物对进行扩增，得到的sgRNA-2具有SEQ ID No.13所示的序列，具体序列如下所示：
AATTTGGGTTAAATCTTGGTGGAAGGGCGAAACACCGCGCCGATGAGCCGGTCGTACAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCTCTAGAGTCGACACTAGTCTCGAGATCGATAAGCTTCCTAGAGGTACCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTGTGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGG。
在本发明中，所述变性退火延伸使用的体系每10μl包括：sgRNA-1上游引物或sgRNA-2上游引物1μl，gRNA-1下游引物或sgRNA-2下游引物1μl，Solution 5μl，ddH2O 3μl；
所述变性退火延伸的程序为：95℃5min，85℃5s、25℃5s，置于16℃保存。
本发明将pSpCas9-2A-Puro经BbsI酶切后，得到pSpCas9-2A-Puro酶切产物，将所述pSpCas9-2A-Puro酶切产物分别与步骤7)所述的sgRNA-1和sgRNA-2连接，得到含有sgRNA-1的pSpCas9-2A-Puro和含有sgRNA-2的pSpCas9-2A-Puro。
在本发明中，所述pSpCas9-2A-Puro经BbsI酶切使用的体系优选每20μl包括10×Buffer 2μl，pSpCas9-2A-Puro 1μg，BbsI 1μl，ddH2O补加至20μl；所述酶切的条件为37℃固浴1h。本发明对上述试剂和质粒的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的市售产品即可。
在本发明中，所述pSpCas9-2A-Puro酶切产物分别与sgRNA-1、sgRNA-2连接使用的体系优选每10μl包括sgRNA-1或sgRNA-2 4μl，pSpCas9-2A-Puro酶切产物1μl，SolutionI 5μl；所述连接的条件为在16℃过夜。
本发明将得到的含有sgRNA-1的pSpCas9-2A-Puro和含有sgRNA-2的pSpCas9-2A-Puro分别依次经转化、提取质粒后，得到切割质粒pSpCas9-2A-Puro-1和切割质粒pSpCas9-2A-Puro-2。在本发明中，所述含有sgRNA-1的pSpCas9-2A-Puro和含有sgRNA-2的pSpCas9-2A-Puro分别依次经转化、提取质粒的方法与gE基因上游同源臂连接产物依次进行转化、提取质粒的方法相同，在此不再赘述。本发明优选将DH5α感受态细胞替换为stbleIII感受态细胞后再进行转化。
本发明将得到的切割质粒pSpCas9-2A-Puro-1、切割质粒pSpCas9-2A-Puro-2与重组质粒pBHV-1混合后转染vero细胞，转染5～7h后以MOI为0.1感染I型牛疱疹病毒，1.5～2.5d后得到空白斑，将所述空白斑接种于DMEM液体培养基后进行冻融，4h后将得到的冻融物接种于单层MDBK细胞上进行感染，将得到的感染物接种于含有胎牛血清的培养基中，出现病变后挑取噬斑，得到I型牛疱疹病毒gE缺失毒株；所述重组质粒pBHV-1与切割质粒pSpCas9-2A-Puro-1、切割质粒pSpCas9-2A-Puro-2的质量比为4:1:1。
在本发明中，所述切割质粒pSpCas9-2A-Puro-1、切割质粒pSpCas9-2A-Puro-2与重组质粒混合后转染vero细胞的时间为5～7h，优选为6h。
在本发明中，所述冻融的次数优选为3次。
在本发明中，所述冻融物接种于单层MDBK细胞上进行感染的时间优选为3.5～4.5h，更优选为4h。
在本发明中，所述含胎牛血清的培养基以DMEM为溶剂，优选包括以下质量百分含量的组分：0.5～1.5％胎牛血清，0.5～1.5％双抗，0.6～1.0％琼脂糖；更优选包括1％胎牛血清，1％双抗，0.8％琼脂糖。在本发明中，所述双抗优选为产地为美国的gibco公司销售的产品，产品的型号为1910855。
本发明还提供了上述技术方案所述的I型牛疱疹病毒gE缺失毒株的获取方法，所述获取方法与上述技术方案所述的I型牛疱疹病毒gE缺失毒株的获取方法相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一株I型牛疱疹病毒gE缺失毒株及其获取方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一、牛传染性鼻气管炎gE基因缺失毒株的构建
1材料与方法
1.1试验材料
质粒pcDNA3.1购自美国Invitrogen公司，CRISPR/Cas9质粒pSpCas9-2A-Puro购自addgene公司。lipofectamineTM 3000购自Invitrogen公司，大肠杆菌DH5α、stableIII均购自北京全式金生物技术有限公司，HindIII、KpnI、BamHI、EcoRI、BbsI限制性内切酶、质粒小提试剂盒、DNA提取试剂盒、DNA纯化试剂盒均购自美国therom公司。Primer star GXL，pMD19T均购自大连宝生物公司。无内毒素质粒提取试剂盒购自Promega公司，DMEM高糖培养基、Opti-MEMTM无血清培养液、双抗、胎牛血清均购自Gbico公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2试验方法
1.2.1重组质粒和切割质粒构建流程图，见图1和2
1.2.1.1重组质粒的构建
1.2.1.1.1引物设计与合成
根据NCBI中发表的牛传染性鼻气管炎病毒中的gE基因阅读框架，利用引物设计软件Premier5.0设计一对上下游引物。
引物名称：上游引物为F-gE，下游引物为R-gE，引物序列见表1。
表1引物序列
Figure BDA0001679112030000131
Figure BDA0001679112030000141
扩增体系如下：100ngDNA模板，8μldNTP，上游引物和下游引物各1μl，5×buffer25μl，La taq0.5μl，补水至50μl。
PCR循环条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒、64℃退火30秒、72℃延伸140秒共进行35个循环，72℃终延伸10分钟，置于4℃保存。
将PCR产物送去华大公司进行测序，测得gE基因序列为1740bp。
再根据gE基因在全基因组中的位置设计上下游同源臂，分别在上游同源臂(LgE)引物5’端分别加入酶切位点HindIII和KpnI，在下游同源臂(RgE)引物5’端分别加入BamHI和EcoRI。扩增目的基因片段上游同源臂长度为1144bp，下游同源臂长度为747bp。
上游同源臂引物：上游引物为F-LgE，下游引物为R-LgE，引物序列见表1。
下游同源臂引物：上游引物为F-RgE，下游引物为R-RgE，引物序列见表1。
1.2.1.1.2 PCDNA3.1(+)质粒酶切
PCDNA3.1(+)质粒用HindIII和KpnI限制性内切酶进行双酶切处理，体系如下：10×Buffer 2μl，PCDNA3.1(+)质粒1μg，HindIII和KpnI各1μl，补加ddH2O至20μl，进行震荡混匀，置37℃固浴1小时，后使用凝胶回收试剂盒回收目的载体。
凝胶回收试剂盒回收步骤：
(1)加入350μl膜结合液，65℃或70℃融胶10～20min；
(2)室温冷却后移至柱上，静置2min；
(3)14000rmp/min离心2min，弃废液；
(4)加700μl膜洗脱液，14000rmp/min离心1min，弃废液；
(5)空转2min后换新离心管；
(6)加30～50μl ddH2O，静置2min，14000rmp/min离心1min；
(7)吸取管中液体置于柱子内，静置2min，14000rmp/min离心2min；
1.2.1.1.3上、下游同源臂片段的扩增
以提取的牛传染性鼻气管炎病毒基因组为模板进行PCR扩增，扩增体系如下：100ng DNA模板，4μldNTP，上游引物和下游引物各2μl，5×buffer10μl，La taq1μl，补水至50μl。
PCR循环条件为：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒、66℃退火30秒、72℃延伸80秒共进行35个循环，72℃终延伸10分钟，置于4℃保存。
扩增的PCR产物用胶回收试剂盒按步骤进行胶回收。
1.2.1.1.4上、下游同源臂片段的制备
按1.2.1.1.3中的体系进行PCR制备3管，使用凝胶回收试剂盒对上、下游同源臂分别进行胶回收。
回收的上游同源臂目的片段进行双酶切处理，体系如下：10×Buffer 2μl，目的片段1μg，HindIII和KpnI各1μl，补加ddH2O至20μl，进行震荡混匀，置37℃固浴1小时，后使用凝胶回收试剂盒回收目的片段。
回收的下游同源臂目的片段进行双酶切处理，体系如下：10×Buffer 2μl，目的片段1μg，BamHI和EcoRI各1μl，补加ddH2O至20μl，进行震荡混匀，置37℃固浴1小时，后使用凝胶回收试剂盒回收目的片段。
1.2.1.1.5载体PCDNA3.1(+)与目的片段(上游同源臂)的连接
在10μl体系中加入：目的片段4μl，用HindIII和KpnI酶切处理过的载体PCDNA3.1(+)1μl，SolutionI 5μl，混匀后置于16℃连接槽中过夜。
1.2.1.1.6连接产物的转化
取DH5α感受态细胞100μl，加入1.2.1.1.5中的连接产物10μl，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入不含氨苄抗生素的LB液体培养基900μl，37℃、220r/min活化1h，5000rpm离心5min，在生物安全柜中弃去900μl上清，利用剩余100μl上清重悬沉淀，均匀涂布于含氨苄抗生素的LB固体平板上，置于37℃培养箱中倒置培养12h。
1.2.1.1.7重组质粒(pBHV-3)的鉴定
将上述转化后的平板中挑取单个白色菌落并接种于含有5ml氨苄抗生素的LB液体培养基中37℃、220rmp/min培养12h，用质粒提取试剂盒进行提取。将提取的质粒命名为pBHV-3。以提取的质粒(pBHV-3)用HindIII和KpnI酶进行酶切鉴定。取酶切鉴定为阳性且插入方向正确的重组质粒pBHV-3送至华大基因有限公司进行测序，测序结果显示与预期一致，获得重组质粒pBHV-3。结果见图3。
1.2.1.1.8重组质粒(pBHV-3)的酶切
pBHV-3质粒用BamHI和EcoRI限制向内切酶进行双酶切处理，体系如下：10×Buffer 2μl，pBHV-3质粒1μg，BamHI和EcoRI各1μl，补加ddH2O至20μl，进行震荡混匀，置37℃固浴1小时，后使用凝胶回收试剂盒回收目的载体。
1.2.1.1.9载体pBHV-3与目的片段(下游同源臂)的连接
在10μl体系中加入：目的片段4μl，用BamHI和EcoRI酶切处理过的载体(pBHV-3)1μl，SolutionI 5μl，混匀后置于16℃连接槽中过夜。
1.2.1.1.10连接产物的转化
取DH5α感受态细胞100μl，加入1.2.1.1.9中的连接产物10μl，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入不含氨苄抗生素的LB液体培养基900μl，37℃、220r/min活化1h，5000rpm离心5min，在生物安全柜中弃去900μl上清，利用剩余100μl上清重悬沉淀，均匀涂布于含氨苄抗生素的LB固体平板上，置于37℃培养箱中倒置培养12h。
1.2.1.1.11重组质粒(pBHV-1)的鉴定
将上述转化后的平板中挑取单个白色菌落并接种于含有5ml氨苄抗生素的LB液体培养基中37℃、220rmp/min培养12h，用质粒提取试剂盒进行提取。将提取的质粒命名为pBHV-1。以提取的质粒(pBHV-1)用BamHI和EcoRI酶进行酶切鉴定(结果见图3)。取经PCR和酶切鉴定为阳性且插入方向正确的重组质粒pBHV-1送至华大基因有限公司进行测序，测序结果显示与预期一致，获得重组质粒pBHV-1。结果见图4。
1.2.1.2切割质粒的构建
1.2.1.2.1引物设计与合成
根据牛传染性鼻气管炎病毒gE基因测序结果在其起始密码子的250bp处，使用网站(http://crispr.mit.edu/)设计sgRNA，选择分数较高且GC含量约50％的2对sgRNA于5’端加入酶切位点BbsI进行合成，由华大公司合成该引物，引物序列见表1。
1.2.1.2.2 pSpCas9-2A-Puro质粒的酶切
pSpCas9-2A-Puro质粒用BbsI限制性内切酶进行双酶切处理，体系如下：10×Buffer 2μl，pSpCas9-2A-Puro质粒1μg，BbsI 1μl，补加ddH2O至20μl，进行震荡混匀，置37℃固浴1小时，后使用凝胶回收试剂盒回收目的载体。结果见图5。
1.2.1.2.3 sgRNA-1的制备
将合成回来的引物进行变性退火延伸。扩增体系如下：sgRNA1-F 1μl，sgRNA1-R 1μl，H2O 3μl，SolutionI 5μl，混匀。
PCR体系为：95℃5min，85℃5秒、25℃5秒，置于16℃保存。
1.2.1.2.4 pSpCas9-2A-Puro质粒与sgRNA-1的连接
在10μl体系中加入：目的片段sgRNA-14μl，用BbsI酶切处理过的载体(pSpCas9-2A-Puro)1μl，SolutionI 5μl，混匀后置于16℃连接槽中过夜。
1.2.1.1.5连接产物的转化
取stbleIII感受态细胞100μl，加入1.2.1.2.4中的连接产物10μl，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入不含氨苄抗生素的LB液体培养基900μl，37℃、220r/min活化1h，5000rpm离心5min，在生物安全柜中弃去900μl上清，利用剩余100μl上清重悬沉淀，均匀涂布于含氨苄抗生素(100μg/mL)的LB固体平板上，置于37℃培养箱中倒置培养12h。
1.2.1.1.6切割质粒(pSpCas9-2A-Puro-1)的鉴定
将上述转化后的平板中挑取单个白色菌落并接种于5ml含有氨苄抗生素(100μg/mL)的LB液体培养基中37℃、220rmp/min培养12h，用质粒提取试剂盒进行提取，命名为pSpCas9-2A-Puro-1。将提取的质粒送至华大基因有限公司进行测序鉴定。
1.2.1.2.7 sgRNA-2的制备
将合成回来的引物进行变性退火延伸。扩增体系如下：sgRNA2-F 1μl，sgRNA2-R 1μl，H2O 3μl，SolutionI 5μl，混匀。
PCR体系为：95℃5min，85℃5秒、25℃5秒，置于16℃保存。
1.2.1.2.8 pSpCas9-2A-Puro质粒与sgRNA-2的连接
在10μl体系中加入：目的片段sgRNA-24μl，用BbsI酶切处理过的载体(pSpCas9-2A-Puro)1μl，SolutionI 5μl，混匀后置于16℃连接槽中过夜。
1.2.1.1.9连接产物的转化
取stbleIII感受态细胞100μl，加入1.2.1.2.8中的连接产物10μl，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入不含氨苄抗生素的LB液体培养基900μl，37℃、220r/min活化1h，5000rpm离心5min，在生物安全柜中弃去900μl上清，利用剩余100μl上清重悬沉淀，均匀涂布于含氨苄抗生素(100μg/mL)的LB固体平板上，置于37℃培养箱中倒置培养12h。
1.2.1.1.10切割质粒(pSpCas9-2A-Puro-2)的鉴定
将上述转化后的平板中挑取单个白色菌落并接种于5ml含有氨苄抗生素(100μg/mL)的LB液体培养基中37℃、220rmp/min培养12h，用质粒提取试剂盒进行提取，命名为pSpCas9-2A-Puro-2。将提取的质粒送至华大基因有限公司进行测序鉴定。
1.2.2筛选高转染效率和感染能力的细胞株
1.2.2.1高转染效率细胞株的筛选
用Promega公司的无内毒素质粒提取试剂盒中提上述构建成功的重组质粒(pBHV-1)和切割质粒(pSpCas9-2A-Puro-1和pSpCas9-2A-Puro-2)备用，复苏MDBK细胞，牛睾丸细胞，293T细胞和，vero细胞，按传统的常规方法将上述细胞传至第三代，将细胞悬液传至六孔板中，待细胞长至90％左右对连有sgRNA的pSpCas9-2A-Puro-1载体、pSpCas9-2A-Puro-2载体和pBHV-1按照1:1:4进行转染。
(1)待细胞在六孔板中汇合度达70％～90％时进行转染。
(2)取200μl Opti-MEMTM无血清培养基加入7.5μl lipofectamineTM3000于1.5mlEP管内混合，得到溶液A。
(3)取200μl Opti-MEMTM无血清培养基加入5μg含切割载体和打靶载体的质粒和10μl P3000于EP管内混合均匀，得到溶液B。
(4)将溶液A和溶液B混合均匀，得到溶液C，将溶液C静止15min。
(5)步骤一中的细胞用Opti-MEMTM无血清培养基冲洗一遍，再取400μl溶液C逐孔加入六孔板中的细胞感作6小时。
(6)待48～72小时后查看转染水平。
结果见图6，结果发现MDBK的转染效率约为1％，牛睾丸细胞的转染效率为3％，293T的转染效率为80％，vero细胞的转染效率为50％。结果表明293T和vero细胞的转染效率较高。
1.2.2.2高感染能力细胞株的筛选
于12孔板接种MDBK细胞，牛睾丸细胞，293T细胞和vero细胞，待细胞长至80％后，弃去上层营养液，用PBS清洗两遍，加入100μl IBRV病毒液于900μl无血清DMEM中按1:10连续稀释至10-8，作感2h，换成1％胎牛血清，1％双抗，0.8％低熔点琼脂糖的DMEM培养基，感染36h后，10％甲醛固定12h，结晶紫染色后按Reed-Muench计算法计算病毒滴度，确定在上述细胞中病毒的感染能力，结果见图7和图8。
结果发现MDBK上的滴度达107，vero细胞的病毒滴度为103，牛睾丸细胞为105，293T的滴度为0。结果表明病毒在293T细胞上的复制速率过低，可能导致其无法测定病毒滴度。同时我们将感染不同细胞系的病毒收取，再次感染MDBK细胞，结果表明，病毒滴度都下降，但vero滴度与293T滴度差异显著。
1.2.3重组病毒的空斑筛选与纯化
对连有sgRNA的pSpCas9-2A-Puro-1载体、pSpCas9-2A-Puro-2载体和pBHV-1按照1:1:4转染vero细胞，转染6h后以MOI为0.1感染IBRV，2d后在显微镜下挑取空斑到200μlDMEM中，反复冻融3次后接于单层MDBK细胞上，感染4h后换成1％胎牛血清，1％双抗，0.8％低熔点琼脂糖的DMEM培养基，待36h细胞出现明显病变后，挑取噬斑。将挑取的病毒液，按照10-1、10-2、10-3和10-4稀释接入铺满MDBK细胞的96孔板，每个稀释度设计两个平行，36h后收取出现一个噬斑的细胞孔，反复冻融3次，将该病毒液接种于MDBK细胞中进行扩增，并提取病毒基因组，采用本实验室设计的检测引物(F-gE和R-gE)按照1.2.1.1.1的体系进行扩增序列，产物送往华大基因测序分析，序列如SEQ ID No.14所示。结果显示与预期一致，结果见图9。SEQ ID No.14的序列具体如下所示：
CGCCGGGTTGTTAAATGGGTCTCGCGCGGCTCGTGGTTCCACACCGCGCCGGAGAACCAGCGCGAGCTTCGCTGCGTGTGTCCCGCGAGCTGCGTTCCGGGGAACGGCGCACGCGAGAGGGTTCGAAAAGGGCATTTGGCAGCGCCCCCCCCCCCGCGCGCTGTGCCGTCTGACGGAAAGCACCCGCGTGTAGGGCTGCATATAAATGGAGCGCTCACACAAAGCCTCGTGCGGCTGCTTCGAAGGCATGGAGAGTCCACGCAGCGTCGTCAACGAAAACTATCGAGGCGCTGATGAGGCCGATGCAGCGCCCCCTTCACCGCCGCCGGAAGGCTCCATCGTGTCCATCCCCATCCTCGAGCTCACCATCGAGGACGCGCCCG。
1.2.4重组IBRV和亲本IBRV的病毒重组空斑形成单位(PFU)的测定
将MDBK细胞铺至12孔板中，待细胞长满单层后，将原有培养液弃去，用无血清DMEM将病毒按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9和10-10倍比稀释，吸取400μL病毒稀释液，接种于MDBK细胞上，同时设计阴性对照。将12孔板于37℃5％CO2的培养箱中孵育2h，弃掉细胞上清，用PBS液洗三次,每孔中加入1mL含2％血清的维持液并加入1.5mL加低熔点琼脂糖固定，36h之后加10％多聚甲醛固定4h，冲洗，加结晶紫染色30min后，洗涤，记录噬斑数，最终测得重组病毒毒价为MOI为2.5×107PFU/mL，亲本病毒毒价为MOI为1.5×108PFU/mL，结果见图10。
1.2.5重组IBRV和亲本IBRV在MDBK细胞上体外生长曲线的测定
将MDBK细胞铺至12孔板,待细胞长至单层,将培养液弃去更换无血清DMEM营养液；按每孔0.1个MOI分别接种重组病毒与亲本病毒。将12孔板于37℃含5％CO2的培养箱中孵育2h,弃掉细胞上清，用PBS液洗三次，每孔中加入1mL含2％血清的DMEM维持液。于接种后0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h分别收集上清培养液和细胞。在所收集的细胞中加入400μL无血清DMEM营养液，于-80℃反复冻融三次备用。测定各个时间段上清培养液和细胞冻融液的空斑形成单位(PFU)，记录并绘制生长曲线，结果如图11和12。
二、重组IBRVΔgE-缺失株的小鼠试验
1 MDBK细胞用含有10％胎牛血清的DMEM细胞培养液在37℃含有5％CO2的恒温培养箱中培养，当细胞长满单层约80％～90％后，弃去上层营养液，用PBS清洗两遍，将重组IBRVΔgE-基因缺失株接至消化好的MDBK细胞中，补加DMEM培养液至适量，于37℃含5％CO2的恒温培养箱中培养增值，在出现大约80％的病变时收毒，于-80℃冰箱冻融三次，收毒，按1.2.4测病毒毒价为MOI为2.5×107PFU/mL。
选取IBRV抗原及抗体均为阴性的清洁级5～7周龄、体重相近的雄性小鼠，随机将4只小鼠分为一组饲养于笼中，新采购小鼠需饲喂一周待其适应环境。
每只小鼠采血500μL做为对照：分别于第1d、7d、14d、21d进行免疫处理。免疫前将病毒样品与弗氏佐剂按1:1进行处理，两组分别用重组毒IBRVΔgE-和亲本毒IBRV背部皮下多点注射。免疫前一天对小鼠进行采血。另设一组4只小鼠做为对照。
2中和试验
首先测定病毒液TCID50，将测好TCID50的病毒液稀释成200个TCID50/0.1ml的病毒悬液。
病毒液TCID50测定方法：将MDBK细胞铺至96孔板内，第二天待细胞长至单层后，使用病毒液在离心管中做10倍连续稀释，从10-1～10-10。将稀释好的病毒接种到96孔板中，每一个稀释度做8个重复。弃去96孔细胞板中原有的培养基，每孔接种稀释好的病毒100μl，同时设最后两列做为阴性对照。逐日观察并记录结果，五天后按Reed-Muench两氏法计算结果。
采集免疫后的小鼠血液，分离血清，将血清置于60℃水浴30min进行灭活，置于96孔板做连续倍比稀释，共做10个稀释度，具体方法在96孔板中加入50μl无血清DMEM培养液，再加50μl待检血清，混匀后，吸50μl至下一孔，如此稀释直到1:256，每个稀释度做4孔，在第11孔加入50μlDMEM培养液，第12孔加入100μl无血清DMEM培养液。
将稀释好的重组病毒与亲本毒免小鼠制得的血清进行混合，亲本毒与重组毒免疫小鼠制得的血清进行混合。每孔加入50μl稀释好的相应的病毒，第12孔不加。将96孔板置于37℃含5％CO2的温箱中静置进行中和反应1h。同时设阴性、阳性、待检血清毒性对照，病毒对照，和正常细胞对照。中和1h后每孔加入100μlMDBK细胞悬液，置于37℃含5％CO2的培养箱中培养，5天后观察结果，按Reed-Muench两氏法计算结果。
3结果
测得IBRV的TCID50＝108/ml，IBRVΔgE-的TCID50＝107.5/ml。
采集血液分离血清测得各组攻毒后的中和抗体效价结果显示两组血清针对病毒的中和效价均达到了28，其中IBRVΔgE-组的中和抗体水平并没有因缺失gE这个基因而降低。
由以上实施例可以得出，通过免疫小鼠确定IBRV gE缺失毒株中和抗体水平并没有因为缺失gE基因而降低，证明IBRV gE缺失毒株具有良好的免疫原性；通过重组IBRV和亲本IBRV的病毒空斑形成单位(PFU)的测定确定IBRV gE缺失毒株的毒力降低，证明该基因缺失毒株应用于疫苗更为安全，为牛鼻气管炎病毒的预防、净化奠定基础，为快速制备牛传染性鼻气管炎基因缺失疫苗奠定研究基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 内蒙古元山生物科技有限公司
<120> 一株I型牛疱疹病毒gE缺失毒株及其获取方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctgcagacg aaagctttcg cctcctgccc gcg 33
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaaatgccc ttttggtacc ctctcgcgtg cgc 33
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaggatcca gtcgttactt cggaccgttt ggtg 34
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaggaattcc agcgcctcga tagttttcgt tgac 34
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccgcgagc ccggggtttc ggtcgcgg 28
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caccgccacg ctggtgaagc actcgcgg 28
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaacccgcga ccgaaacccc gggctcgc 28
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaacccgcga gtgcttcacc gacgtggc 28
<210> 9
<211> 1728
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgcaaccca ccgcgccgcc ccggcggcgg ttgctgccgc tgctgctgcc gcagttattg 60
cttttcgggc tgatggccga ggccaagccc gcgaccgaaa ccccgggctc ggcttcggtc 120
gacacggtct tcacggcgcg cgctggcgcg cccgtctttc tcccagggcc cgcggcgcgc 180
ccggacgtgc gcgccgttcg cggctggagc gtcctcgcgg gcgcctgctc gccgcccgtg 240
ccggagcccg tctgcctcga cgaccgcgag tgcttcaccg acgtggccct ggacgcggcc 300
tgcctgcgaa ccgcccgcgt ggccccgctg gccatcgcgg agctcgccga gcggcccgac 360
tcaacgggcg acaaagagtt tgttctcgcc gacccgcacg tctcggcgca gctgggtcgc 420
aacgcgaccg gggtgctgat cgcggccgca gccgaggagg acggcggcgt gtacttcctg 480
tacgaccggc tcatcggcga cgccggcgac gaggagacgc agttggcgct gacgctgcag 540
gtcgcgacgg ccggcgcgca gggcgccgcg cgggacgagg agagggaacc agcgaccggg 600
cccacccccg gcccgccgcc ccaccgcacg acgacacgcg cgcccccgcg gcggcacggc 660
gcgcgcttcc gcgtgctgcc gtaccactcc cacgtataca ccccgggcga ttcctttctg 720
ctatcggtgc gtctgcagtc tgagtttttc gacgaggctc ccttctcggc cagcatcgac 780
tggtacttcc tgcggacggc cggcgactgc gcgctcatcc gcatatacga gacgtgcatc 840
ttccaccccg aggcaccggc ctgcctgcac cccgccgacg cgcagtgcag cttcgcgtcg 900
ccgtaccgct ccgagaccgt gtacagccgg ctgtacgagc agtgccgccc ggaccctgcc 960
ggtcgctggc cgcacgagtg cgagggcgcc gcgtacgcgg cgcccgttgc gcacctgcgt 1020
cccgccaata acagcgtaga cctggtcttt gacgacgcgc cggctgcggc ctccgggctt 1080
tacgtctttg tgctgcagta caacggccac gtggaagctt gggactacag cctagtcgtt 1140
acttcggacc gtttggtgcg cgcggtcacc gaccacacgc gccccgaggc cgcagccgcc 1200
gacgctcccg agccaggccc accgctcacc agcgagccgg cgggcgcgcc caccgggccc 1260
gcgccctggc ttgtggtgct ggtgggcgcg cttggactcg cgggactggt gggcatcgca 1320
gccctcgccg ttcgggtgtg cgcgcgccgc gcaagccaga agcgcaccta cgacatcctc 1380
aaccccttcg ggcccgtata caccagcttg ccgaccaacg agccgctcga cgtggtggtg 1440
ccagttagcg acgacgaatt ttccctcgac gaagactctt ttgcggatga cgacagcgac 1500
gatgacgggc ccgctagcaa cccccctgcg gatgcctacg acctcgccgg cgccccagag 1560
ccaactagcg ggtttgcgcg agcccccgcc aacggcacgc gctcgagtcg ctctgggttc 1620
aaagtttggt ttagggaccc gcttgaagac gatgccgcgc cagcgcggac cccggccgca 1680
ccagattaca ccgtggtagc agcgcgactc aagtccatcc tccgctag 1728
<210> 10
<211> 1354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaggtggggg ctaaaagcag agctctctgg ctactagaga acccactgct tactggctta 60
tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga cccaagctgg ctagcgttta aacttaagct 120
ttcgcctcct gcccgcgcgt cgcgaacgac gcctttcgct cctgcctgca cgccgacacg 180
cgccccgctc gcagcgagcg gcgcgcgagc gccgcggtcg aaaaccacgt gctcttctcc 240
atcgcccatc cgcgcccaat agactcaggg ctctactttc tgcgcgtcgg catctacggc 300
ggcaccgcgg gcagcgagcg ccgccgagac gtctttccct tggccgcgtt tgtacacagc 360
ttcggtgagc ccggagaccc agaggccgcg gccgcgcacc ccggcgccgt cgaggcagtc 420
gcgacccgct gcgagcgggg cctcgacgcc agctcggcga gcctctacga ccgcgcgctg 480
gcggcgttcc ccgcaggcgc cgccaccacg cccggcccca ccgcgagcag cgggagcggg 540
gccgcgacgc cggagagggt cgacgagacg acggaagtca aggccgcgac gagagcgggc 600
tcggcgtttg ccctcaccac gcccccggcc ggcctgaccg ccagccccgc cgccagcccc 660
tcccgtgcct ttagcgcggc cgccccggcc gccgctgcgc agccggccgg agacacgccc 720
gctcgcttcc ggcgccaact ggcgtcgatc ctagtgcctc tgtgcgtgct ggtgctgctg 780
ctgcttgcgc tctgcgccgc gacggtaaac tgcgcgctgc gccgccgcct gctgccgtgc 840
tctcggcgcg tttacaagcc gcggacgtgc gcgacatgcg ggagcggcac ttgcgcgggg 900
cggcccccct gccgcggcgc ggcaccgagc gccccagcca ccgtcgtggc actgggctcc 960
cggccaaagg cgccccccct cgccaccatc agcgaagaat aaacgccgcg cgcggcaaac 1020
gatctcgctc gcgtgtgtct tggtttctgc gcggcgggcg gggtggggag cgggcaaggc 1080
ggaggaagac cgggggcagg agctgcgtgg agggcggagc cgttgagcgg cccgaccgcc 1140
gccgggttgt taaatgggtc tcgcgcggct cgtggttcca caccgcgccg gagaaccagc 1200
gcgagcttcg ctgcgtgtgt cccgcgagct gcgttccggg gaacggcgca cgcgagaggg 1260
taccgagctc ggatccacta gtccagtgtg gtggaattct gcagatatcc agcacagtgg 1320
cggccgctcg agtctagagg gccccgtaac cccc 1354
<210> 11
<211> 2258
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaggtggggg ctaaaagcag agctctctgg ctactagaga acccactgct tactggctta 60
tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga cccaagctgg ctagcgttta aacttaagct 120
ttcgcctcct gcccgcgcgt cgcgaacgac gcctttcgct cctgcctgca cgccgacacg 180
cgccccgctc gcagcgagcg gcgcgcgagc gccgcggtcg aaaaccacgt gctcttctcc 240
atcgcccatc cgcgcccaat agactcaggg ctctactttc tgcgcgtcgg catctacggc 300
ggcaccgcgg gcagcgagcg ccgccgagac gtctttccct tggccgcgtt tgtacacagc 360
ttcggtgagc ccggagaccc agaggccgcg gccgcgcacc ccggcgccgt cgaggcagtc 420
gcgacccgct gcgagcgggg cctcgacgcc agctcggcga gcctctacga ccgcgcgctg 480
gcggcgttcc ccgcaggcgc cgccaccacg cccggcccca ccgcgagcag cgggagcggg 540
gccgcgacgc cggagagggt cgacgagacg acggaagtca aggccgcgac gagagcgggc 600
tcggcgtttg ccctcaccac gcccccggcc ggcctgaccg ccagccccgc cgccagcccc 660
tcccgtgcct ttagcgcggc cgccccggcc gccgctgcgc agccggccgg agacacgccc 720
gctcgcttcc ggcgccaact ggcgtcgatc ctagtgcctc tgtgcgtgct ggtgctgctg 780
ctgcttgcgc tctgcgccgc gacggtaaac tgcgcgctgc gccgccgcct gctgccgtgc 840
tctcggcgcg tttacaagcc gcggacgtgc gcgacatgcg ggagcggcac ttgcgcgggg 900
cggcccccct gccgcggcgc ggcaccgagc gccccagcca ccgtcgtggc actgggctcc 960
cggccaaagg cgccccccct cgccaccatc agcgaagaat aaacgccgcg cgcggcaaac 1020
gatctcgctc gcgtgtgtct tggtttctgc gcggcgggcg gggtggggag cgggcaaggc 1080
ggaggaagac cgggggcagg agctgcgtgg agggcggagc cgttgagcgg cccgaccgcc 1140
gccgggttgt taaatgggtc tcgcgcggct cgtggttcca caccgcgccg gagaaccagc 1200
gcgagcttcg ctgcgtgtgt cccgcgagct gcgttccggg gaacggcgca cgcgagaggg 1260
taccgagctc ggatccgcgc cccccccccc gcgcgctgtg ccgtctgacg gaaagcaccc 1320
gcgtgtaggg ctgcatataa atggagcgct cacacaaagc ctcgtgcggc tgcttcgaag 1380
gcatggagag tccacgcagc gtcgtcaacg aaaactatcg aggcgctgat gaggccgatg 1440
cagcgccccc ttcaccgccg ccggaaggct ccatcgtgtc catccccatc ctcgagctca 1500
ccatcgagga cgcgccggcc agcgcagaag caaccggcac cgcggcagcc gcacccgctg 1560
ggcgcactcc agacgcgaac gcagcacccg gcggctacgt gccagttccc gcggcggatg 1620
tggactgcta ttatagcgaa agcgacagcg agacggcagg cgagtttttg atacgcatgg 1680
ggcggcagca gcggcggcgg catcggcggc ggcgctgcat gatagcagcg gccctgactt 1740
gcattggcct cggggcctgc gcggcggcgg cagcggcagg cgccgtcctg gcgttggagg 1800
tagtgccccg gccctgaggc cccgagaccc ccggccctga ggccctgggg cggggcccga 1860
ctgtcccctt cccccctccc ccccgtccgc ccgcgagtaa aggctgtcta attttttccg 1920
cacgcccgcg cctgtcttct tagggagggg aaggagggga gggaggggaa ggaggggagg 1980
gaggggaagg aggggaggga ggggaaggag gggagggagg ggaaggaggg gagggagggg 2040
aaggagggga gggaggggaa ggaggggagg gaggggaagg aggggaggga ggggaaggag 2100
gggagggagg ggaaggaggg gagggagggg aaggagggga gggaggggaa ggaggggagg 2160
gaggggaagg aggggattcg ggccggccga ggattcggaa ttctgcagat atccagcaca 2220
gtggcggccg ctcgagtcta gagggccccg taaccccc 2258
<210> 12
<211> 682
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aatttgggtt aaatcttggt ggaagggcga aacaccgcgg cgacgaggag acgcagttgg 60
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 120
ggcaccgagt cggtgctttt ttgttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag 180
tccgttttta gcgcgtgcgc caattctgca gacaaatggc tctagagtcg acactagtct 240
cgagatcgat aagcttccta gaggtacccg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 300
gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaatagt aacgccaata gggactttcc 360
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 420
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 480
gtgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 540
tcgctattac catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc atctcccccc 600
cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg 660
cggggggggg ggggggaggg gg 682
<210> 13
<211> 668
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aatttgggtt aaatcttggt ggaagggcga aacaccgcgc cgatgagccg gtcgtacagg 60
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 120
ggcaccgagt cggtgctttt ttgttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag 180
tccgttttta gcgcgtgcgc caattctgca gacaaatggc tctagagtcg acactagtct 240
cgagatcgat aagcttccta gaggtacccg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg 300
gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaatagt aacgccaata gggactttcc 360
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 420
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 480
gtgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 540
tcgctattac catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc atctcccccc 600
cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg 660
cggggggg 668
<210> 14
<211> 383
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgccgggttg ttaaatgggt ctcgcgcggc tcgtggttcc acaccgcgcc ggagaaccag 60
cgcgagcttc gctgcgtgtg tcccgcgagc tgcgttccgg ggaacggcgc acgcgagagg 120
gttcgaaaag ggcatttggc agcgcccccc cccccgcgcg ctgtgccgtc tgacggaaag 180
cacccgcgtg tagggctgca tataaatgga gcgctcacac aaagcctcgt gcggctgctt 240
cgaaggcatg gagagtccac gcagcgtcgt caacgaaaac tatcgaggcg ctgatgaggc 300
cgatgcagcg cccccttcac cgccgccgga aggctccatc gtgtccatcc ccatcctcga 360
gctcaccatc gaggacgcgc ccg 383

Claims (9)

1.I型牛疱疹病毒gE缺失毒株的获取方法，包括以下步骤：
1）以I型牛疱疹病毒基因组为模板，分别利用gE基因上游同源臂引物对和下游同源臂引物对扩增，分别得到gE基因上游同源臂和gE基因下游同源臂；
所述gE基因上游同源臂引物对的上游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No.1所示，所述gE基因上游同源臂引物对的上游引物5’端加入酶切位点HindIII后再进行扩增；所述gE基因上游同源臂引物对的下游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No.2所示，所述gE基因上游同源臂引物对的下游引物5’端加入酶切位点KpnI后再进行扩增；
所述gE基因下游同源臂引物对的上游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No.3所示，所述gE基因下游同源臂引物对的上游引物5’端加入酶切位点BamHI后再进行扩增；所述gE基因下游同源臂引物对的下游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No.4所示，所述gE基因下游同源臂引物对的下游引物5’端加入酶切位点EcoRI后再进行扩增；
2）将所述步骤1）得到的gE基因上游同源臂采用HindIII和KpnI进行双酶切，得到gE基因上游同源臂酶切产物；将所述步骤1）得到的gE基因下游同源臂采用BamHI和EcoRI进行双酶切，得到gE基因下游同源臂酶切产物；
3）将所述步骤2）得到的gE基因上游同源臂酶切产物与PCDNA3.1（+）进行连接，得到gE基因上游同源臂连接产物；所述PCDNA3.1（+）质粒是用HindIII和KpnI进行酶切处理后得到；
4）将所述步骤3）得到的gE基因上游同源臂连接产物进行转化、提取质粒，得到质粒pBHV-3；
5）将所述步骤4）得到的质粒pBHV-3采用BamHI和EcoRI进行双酶切，得到质粒pBHV-3酶切产物，将所述质粒pBHV-3酶切产物与步骤2）得到的gE基因下游同源臂酶切产物进行连接，得到gE基因下游同源臂连接产物；
6）将所述步骤5）得到的gE基因下游同源臂连接产物进行转化、提取质粒，得到重组质粒pBHV-1；
7）在sgRNA-1上游引物和sgRNA-1下游引物的5’端分别加入酶切位点BbsI后进行变性退火延伸，得到sgRNA-1；所述sgRNA-1上游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No.5所示，所述sgRNA-1下游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No.7所示；
在sgRNA-2上游引物和sgRNA-2下游引物的5’端分别加入酶切位点BbsI后进行变性退火延伸，得到sgRNA-2；所述sgRNA-2上游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No.6所示，所述sgRNA-2下游引物的核苷酸序列 如SEQ ID No.8所示；
8）将pSpCas9-2A-Puro经BbsI酶切后，得到pSpCas9-2A-Puro酶切产物，将所述pSpCas9-2A-Puro酶切产物分别与步骤7）所述的sgRNA-1和sgRNA-2连接，得到含有sgRNA-1的pSpCas9-2A-Puro和含有sgRNA-2的pSpCas9-2A-Puro；
9）将步骤8）得到的含有sgRNA-1的pSpCas9-2A-Puro和含有sgRNA-2的pSpCas9-2A-Puro分别经转化、提取质粒后，得到切割质粒pSpCas9-2A-Puro-1和切割质粒pSpCas9-2A-Puro-2；
10）将所述步骤6）得到的重组质粒pBHV-1与步骤9）得到的切割质粒pSpCas9-2A-Puro-1、切割质粒pSpCas9-2A-Puro-2混合后转染vero细胞，转染5~7h后以MOI为0.1感染I型牛疱疹病毒，1.5~2.5d后得到空白斑，将所述空白斑接种于DMEM液体培养基后进行冻融，将得到的冻融物接种于单层MDBK细胞上进行感染，4h后将得到的感染物接种于含有胎牛血清的培养基中，出现病变后挑取噬斑，得到I型牛疱疹病毒gE缺失毒株；所述重组质粒pBHV-1与切割质粒pSpCas9-2A-Puro-1、切割质粒pSpCas9-2A-Puro-2的质量比为4:1:1；
步骤7）中所述sgRNA是在gE基因起始密码子的250bp处设计而得到的。
2.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，所述步骤1）扩增gE基因上游同源臂使用的体系每50μl包括：100ng I型牛疱疹病毒基因组模板，4μl dNTP，gE基因上游同源臂上游引物和gE基因上游同源臂下游引物各2μl，5×buffer 10μl，La taq 1μl，ddH2O补至50μl；
所述步骤1）扩增gE基因下游同源臂使用的体系每50μl包括：100ng I型牛疱疹病毒基因组模板，4μl dNTP，gE基因下游同源臂引物对的上游引物和gE基因下游同源臂引物对的下游引物各2μl，5×buffer 10μl，La taq 1μl，ddH2O补至50μl。
3.根据权利要求1或2所述的获取方法，其特征在于，所述扩增gE基因上游同源臂和gE基因下游同源臂的程序独立的为：94℃预变性2min，94℃变性30s、66℃退火30s、72℃延伸80s，35个循环，72℃终延伸10min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）gE基因上游同源臂的酶切体系每20μl包括：10×Buffer 2μl，gE基因上游同源臂1μg，HindIII和KpnI各1μl，ddH2O补加至20μl；所述gE基因上游同源臂的酶切条件为37℃固浴1h；
所述gE基因下游同源臂的酶切体系每20μl包括：10×Buffer 2μl，gE基因下游同源臂1μg，HindIII和KpnI各1μl，ddH2O补加至20μl；所述gE基因下游同源臂的酶切条件为37℃固浴1h。
5.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，所述步骤3）gE基因上游同源臂酶切产物与PCDNA3.1（+）连接使用的体系每10μl包括：gE基因上游同源臂酶切产物4μl，PCDNA3.1（+） 1μl，SolutionI 5μl；所述连接的条件为在16℃过夜；
所述步骤3）PCDNA3.1（+）质粒用HindIII和KpnI酶切使用的体系每20μl包括：10×Buffer 2μl，PCDNA3.1（+）质粒1μg，HindIII和KpnI各1μl，ddH2O补加至20μl；所述酶切的条件为在37℃下固浴1h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5）质粒pBHV-3采用BamHI和EcoRI酶切使用的体系每20μl包括：10×Buffer 2μl，质粒pBHV-3 1μg，BamHI和EcoRI各1μl，ddH2O补加至20μl；所述酶切的条件为在37℃下固浴1h；
所述质粒pBHV-3酶切产物与gE基因下游同源臂酶切产物连接使用的体系每10μl包括：gE基因下游同源臂酶切产物4μl，质粒pBHV-3酶切产物1μl，SolutionI 5μl；所述连接的条件为在16℃下过夜。
7.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，所述步骤7）变性退火延伸使用的体系每10μl包括：sgRNA-1上游引物或sgRNA-2上游引物1μl，gRNA-1下游引物或sgRNA-2下游引物1μl，Solution 5μl，ddH2O 3μl；
所述变性退火延伸的程序为：95℃ 5min，85℃ 5s、25℃ 5s，置于16℃保存。
8.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，所述步骤8）pSpCas9-2A-Puro经BbsI酶切使用的体系每20μl包括：10×Buffer 2μl，pSpCas9-2A-Puro 1μg，BbsI 1μl，ddH2O补加至20μl；所述酶切的条件为37℃固浴1h。
9.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，所述步骤8）pSpCas9-2A-Puro酶切产物与sgRNA-1或sgRNA-2连接使用的体系每10μl包括：sgRNA-1或sgRNA-2 4μl，pSpCas9-2A-Puro酶切产物1μl，SolutionI 5μl；所述连接的条件为在16℃过夜。
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F.A.C. van Engelenburg 等.A glycoprotein E deletion mutant of bovine herpesvirus 1 is avirulent in calves.《JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY》.1994,第75卷(第9期),参见摘要. *

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