CN1364193A - BHV-l基因缺失的病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

产生一种安全的重组活病毒及疫苗,方法如下:缺失牛疱疹病毒1(BHV-I)的天然糖蛋白E(gE)编码区部分,随后在gE基因座插入含有外源功能性β-gal的质粒。gE基因的缺失使该病毒稳定地减毒,且可作为免疫学标记物来区分疫苗接种过的动物与感染的动物。另外,产生β-gal易于评估疫苗接种动物中的gE△3.1IBRβ病毒复制,且可作为表型标记物来与感染动物中野生型病毒的复制相区分。

Description

BHV-I基因缺失的病毒疫苗
1.发明领域
本发明主要涉及重组牛疱疹病毒疫苗及其相应的构建方法。具体说,本发明涉及传染性重组牛疱疹病毒I型(BHV-I)的构建,其缺失天然糖蛋白E(gE)编码区,在gE基因座上插入了功能性β-半乳糖苷酶基因(β-gal)。天然gE编码区的缺失使该病毒减毒,且可作为基因型或免疫学标记,可将缺失gE的重组病毒与天然类型的病毒感染区分开。另外,插入β-gal基因提供一种通过宿主细胞中β-gal活性的表达,来检测是否存在缺失gE的重组病毒感染的表型方法。
2.现有技术的描述
牛疱疹病毒I型(BHV-I),也称为传染性牛鼻气管炎病毒(IBRV),与牛的许多临床疾病相关,包括鼻气管炎、结膜炎、生殖道感染和偶然性流产、肠炎、脑炎和牛全身系统的感染。BHV-I基因组由约140kb的线性dsDNA分子构成。由侧接于内部和反向末端重复序列(分别为IR和TR)的单一长(UL)区域和单一短(US)区域构成。BHV-I基因组编码约70种蛋白质(Misra等人,牛疱疹病毒1的特异性蛋白质(传染性牛鼻气管炎,J.Virol.40:367-378(1981)))。与其他几种动物的疱疹病毒相似,BHV-I基因组编码糖蛋白(g)gE基因。已报道了两种不同的菌株BHV-IgE基因序列,其编码575氨基酸(aa)残基(Leung-Taek,P.等人,“牛疱疹病毒I型菌株(ST株)短单一区域(US)的完整DNA序列和基因组成”,Virology 199:409-421(1994);Rebordosa,X.等人,“对牛疱疹病毒I型的编码糖蛋白的基因(与HSV-1的gE基因同源)的作图、克隆和测序”,Gene,149:203-209(1994))。预计gE氨基酸在N端(推定的信号序列)和C端(跨膜序列)附近含有几段疏水性氨基酸,其通常是I类膜内在蛋白质。已显示BHV-IgE和其在其他疱疹病毒中的同类物在体外复制中不是必须的,但假性狂犬病病毒(PRV)基因组整个gE编码序列的缺失将导致活疫苗菌株Norden和Bartha的毒性减少(Petrovskis,E.A.等人,“假性狂犬病病毒疫苗菌株中的缺失和它们对合成糖蛋白gp63的影响”,J.Virol.60:1166-1169(1986))和神经侵袭性的改变(Card,J.P.等人,“在大鼠目视系统的感染中假性狂犬病病毒包膜糖蛋白gI影响向神经性和毒性”J.Virol.66:3032-3041(1992))。所以,在动物病毒的全致病效力中需要gE基因的表达但在组织培养物的生长中则不需要(Kritas等人,“鼻内接种后在猪三叉神经路径中假狂犬病病毒(ADV)单一糖蛋白缺失突变体的侵入和蔓延”,Vet.Microbiol.50:323-334(1994);Kritas等人,“在猪嗅觉神经路径中假狂犬病病毒的侵入和蔓延中包膜糖蛋白gI、gp63和gIII的作用”,J,General Virol,75:2319-2327(1994))。
最近,人们产生了将PRV和IBR的缺失gE基因的突变体用作不同标记疫苗的兴趣。近期,欧洲正将缺失gE的标记疫苗用于根除IBR。但欧洲的这种gE缺失型疫苗菌株没有β-gal标记物,这种标记物可以用于检测β-gal酶活性的原位组织化学方法和检测β-gal蛋白质的原位组织化学方法和免疫印迹方法。β-gal的编码区也可作为该重组病毒的基因型标记物。不难用Southern印迹杂交检测此病毒,也可用PCR测试来确定野生型疫苗病毒的遗传纯度。所以,需要的是一种无毒的gE缺失型IBRV菌株,其含有合适的表型/组织化学/基因型β-gal标记物。
发明概述
已构建了一种BHV-I重组病毒(gEΔ3.1IBRβ),该病毒中缺失了含有编码gE基因序列部分的gE开放读框(ORF′s),在其位置插入了一嵌合的报道基因/标记基因。这种插入的β-半乳糖苷酶(β-gal)基因在病毒的复制中无调节作用,但可作为gEΔ3.1IBRβ病毒的表型标记物。
为了构建这种重组BHV-I,克隆了BHV-IgE基因编码区和侧翼上游和下游序列。为了在gE基因编码区产生缺失,用合适的酶消化上述克隆的DNA,释放出该区域的三分之二的氨基,并连接于β-gal基因。将得到的质粒DNA与全长野生型IBR病毒株Cooper共转染到MDBK细胞中。噬斑纯化表达β-gal的重组病毒(蓝色噬斑),并进一步进行分析:用印迹杂交分析遗传特性,免疫印迹分析其对BHV-IgE肽的特异性兔多克隆抗体的反应性。对一种重组病毒gEΔ3.1IBRβ进行了体外生长特性和牛体内致病性的分析。用噬斑减少试验研究了这种重组病毒诱导受感染小牛中BHV-I中和抗体的能力。
嵌合性β-gal基因的调节和表达对这种重组BHV-I病毒有两种独特的方式。这种重组病毒的第一种独特方面是β-gal基因受人巨细胞病毒立即早期(HCMV-IE)强启动子(不受BHV-I-衍生的调节序列)的调节。第二个独特的方面是在感染的早期和晚期该基因以BHV-I-编码的基因表达。通过与亲代IBRV菌株Cooper相比较,分析了这种gE缺失型重组病毒的体外和体内特性。
在组织培养试验中,感染后早期时间中gEΔ3.1IBRβ病毒生长比野生型(亲代菌株Cooper)的滴度较低,但在感染后期该重组病毒的生长几乎达到与野生型菌株相同的滴度。与野生型菌株Cooper相比,比重组病毒通常产生的噬斑明显较小,这可能是因为缺少细胞与细胞间的传播,这与其他疱疹病毒的结果相一致。
在动物试验中,在整个病毒排出期间,受gEΔ3.1IBRβ病毒感染的小牛比受亲代菌株Cooper感染的小牛排出少约100倍。病毒排出的持续时间gEΔ3.1IBRβ感染的小牛也短2天。受gEΔ3.1IBRβ病毒感染的小牛保持健康状态,而受亲代菌株Cooper感染的小牛表现出典型的IBR症状和病变。血清中和结果表明:受野生型和gE缺失型IBRV感染的小牛都诱生了相当的BHVI中和抗体。已有报道表明:胸苷激酶(TK)基因缺失型IBRV在体外和体内生长的滴度明显较低(Chowdhury,S.I.,“减毒牛疱疹病毒I型(BHV-I)重组病毒的构建和特性分析”,Vet.Microbiol.52:13-23(1996))。综合而言,这些结果表明即使与TK缺失型IBR相比重组gEΔ3.1IBRβ病毒生长相对良好,但gEΔ3.1IBRβ病毒对小牛实际上是无毒的。由重组gEΔ3.1IBRβ病毒所表现的减毒特性与如下所表现出的相一致:1)如Chowdhury,S.I.,在“减毒牛疱疹病毒I型(BHV-I)重组病毒的构建和特性分析”(Vet.Microbiol.52:13-23(1996)中所显示的BHV-I中的TK缺失;2)如Kritas等人在“鼻内接种后假狂犬病病毒(ADV)的单一糖蛋白缺失突变体在猪的三叉神经路径中的侵入和蔓延”(Vet.Microbiol.50:323-334(1994))和Kritas等人,“在猪嗅觉神经路径中假狂犬病病毒的侵入和蔓延中包膜糖蛋白gI、gp63和gIII的作用”(J,General Virol,75:2319-2327(1994))中所显示的PRV中gE的缺失;和3)如Kaashoek等人,在“基于牛疱疹病毒1的糖蛋白E-阴性菌株的灭活疫苗诱导预期的免疫力并进行血清学鉴别”(Vaccine 13:342-346(1995))和Van Englenburg等人在“牛疱疹病毒1的糖蛋白E缺失型突变体感染与野生型病毒感染相同的有限量小牛组织但时间过程较短”(J.Gen.Virol.76:2387-2392(1994))中所显示的欧洲gE缺失型IBRV疫苗分离物。
本研究还证明了在该病毒的gE基因座上缺失gE ORF序列和插入功能性β-gal基因稳定地减弱了该病毒毒性。这种病毒的实际运用是其作为针对IBR的安全活疫苗的用途。gE基因的缺失可作为一种免疫标记来区分接受疫苗接种的动物与受感染的动物。另外,β-gal的产生使得在与欧洲目前的gE缺失型疫苗菌株(缺少表型β-gal标记物)相比时,能够容易地评估接种疫苗动物的鼻上皮中gEΔ3.1IBRβ病毒的复制,以及鉴别其与野生型IBR病毒引起的感染。
附图简述
图1是构建gE缺失型BHV-I病毒(gEΔ3.1IBRβ)、和插入/缺失含有替代gE编码区三分之二氨基端的功能性β-gal基因的载体质粒的流程图;
图2是qE编码区缺失和在gE基因座上插入β-gal序列的Southern印迹杂交的再现;
图3显示了在野生型亲代Cooper菌株中检测到但在gE缺失型重组病毒(gEΔ3.1IBRβ)中未检测到的BHV-IgE蛋白质;
图4是说明一步生长试验的结果的图,在MDBK细胞中gE缺失型IBR生长速率与野生型IBR生长速率相比较,各数据点代表由每组小牛得到的结果的平均值;
图5将gE缺失型IBR感染的小牛每天的临床评分与受野生型IBR感染的小牛每天的临床评分相比,其中各数据点代表由每组小牛得到的结果的平均值;
图6将gE缺失型IBR感染的小牛每天的直肠温度与受野生型IBR感染的小牛的每天直肠温度相比,其中各数据点代表由每组小牛得到的结果的平均值;和
图7gE缺失型IBR的鼻病毒排泄与野生型IBR的鼻病毒排泄相比较,各数据点代表自每组小牛得到的结果的平均值。
优选实施例详述
以下实施例描述了传染性重组BHV-I的构建,其含有缺失的天然gE编码区,从而使病毒减毒,并含有插入在gE基因座的功能性β-gal基因;一种用该重组BHV-I作为疫苗免疫接种动物抵抗BHV-I导致的疾病的方法;通过基因型和表型检测和鉴别该重组病毒与野生型病毒感染的方法。以下实施例仅起说明作用,对本发明的总体范围没有限制作用。
实施例1
材料和方法
本试验产生了gE基因缺失型的和表达β-半乳糖苷酶的重组IBRV并对其特性作分析。构建的该重组病毒含有一嵌合基因(4.5Kb长),其替代了BHV-I的gE编码区。较佳地该嵌合基因由HCMV-IE启动子和其连接于β-gal基因编码序列(连接于SV40聚腺苷酸化位点)的增强子序列构成。较佳地,β-gal编码序列是细菌的,但据信任何β-gal基因编码序列都能起作用。
为了构建重组BHV-I并对其特性进行分析,从美国典型培养物保藏中心获得IBRV的Cooper(Colorado-1)株。用Chowdhury S.I.,“呼吸道牛疱疹病毒1(BHV-I)和神经毒力BHV-5的糖蛋白C(gC)之间抗原性变异的分子基础”,Virology213:558-568(1995)的方法(本文将此方法引入作为参考),在Madin-Darby小牛肾细胞中增殖和滴定病毒。如Chowdhury等人,“在利比扎马(lipizzaner stud)中马疱疹病毒I型(EHV-I)诱导的流产和麻痹:马疱疹病毒的分布和分类”,Arch.Virol.90:273-288(1986)中所述,用月桂基磺酸钠和蛋白质K裂解、苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀来分离病毒DNA,此方法本文纳入作为参考。
根据预计的区域亲水性和抗原性合成了BHV-IgE特异性抗肽兔多克隆血清。合成了含有残基378-398的这种gE肽,如Leung-Taek,P.等人,“牛疱疹病毒I型菌株(ST菌株)单一短区域(US)的整个DNA序列和基因组成”,Virology 199:409-421(1994)所述,该序列和基因组成本文纳入作为参考。用如Abdelmagid等人,“用型特异性多克隆抗体对牛疱疹病毒-1(BHV-I)糖蛋白D(gD)中和表位精细作图并与BHV-5gD作序列比较”,Virology 206:242-253(1995)所述的9-芴基-甲氧基羰基(FMOC)试剂来合成此gE肽,此方法本文纳入作为参考。为了便于与匙孔戚血蓝蛋白(KLH)偶联,在此肽的C端加入另一个无关的半胱氨酸(C)(标记有a*)。将17肽[H]-TSDRLVRAVTDHTRPEC*-[OH]与KLH偶联,如Kyte,J.,Doolittle,R.F.,“一种展示蛋白质亲水性的简单方法”,J,Mol.Biol.157:105-132(1982)所述制备了抗血清,本文将此方法纳入作为参考。
在如Chowdhury S.I.,“呼吸道牛疱疹病毒I(BHV-I)和神经毒力BHV-5的糖蛋白C(gC)之间抗原性变异的分子基础”,Virology 213:558-568(1995)和Laemli,U.K.,“在噬菌体T4头部装配过程中结构蛋白的切割”,Nature(London)227:680-685(1970)所述的还原条件下(本文将它们引入作为参考),进行模拟和病毒感染细胞蛋白质的SDS-PAGE和Western印迹分析。
通过从Dr.W.Lawrence(U.Pennsylvania,Philadelphia,USA)获得质粒pBHV1HK和pBHV1HF实现重组质粒的构建。这些质粒分别含有BHV-IDNA的HindIII-K和HindIII-F片段。质粒pBHV1HK的4.4Kb XhoI/HindIII亚片段含有完整的gD、gI和一个部分,优选将gE编码区的三分之二氨基端亚克隆入质粒pGEM7Z(pBHV1gE5′)的XhoI/HindIII位点。然后将pBHV1HF的1.15KbHindIII/Bsu36I(用Klenow做成平头),其含有gE编码区三分之一羧基端和完整US9 ORF编码序列,亚克隆入质粒PBluescript KS(pBHV1gE3′)的HindIII/HincII位点。最后,为了将整个gE基因编码区及其侧翼序列装配起来,将pBHV1gE5′的4.4KbHindIII/XbaI载体位点片段(含有HindIII/XhoI片段)克隆入质粒pBHV1gE3′的HindIII/XbaI位点。将得到的克隆命名为pBHV1gE5′3′。
为了去除gE编码区,用AsuII部分消化pBHV1gE5′3′DNA,然后用HindIII再消化至完全。凝胶纯化较大的片段,将其连接于pCMVβ(获自Clontch,Palo Alto,CA,USA)的4.5Kb PstI片段(用T4聚合酶做成平头),其含有CMV早期启动子调节的β-gal序列。得到的gE缺失型/β-gal插入质粒,pBHV1gEΔβ缺失了1KbBHV-IDNA序列(含有编码前372个氨基酸的基因序列),插入了在CMV启动子调节下的β-gal基因。该β-gal基因侧接有病毒特异性3.32Kb上游序列(含有完整的gD和gI基因序列和gE启动子序列)和1.15Kb下游序列(含有gE编码区三分之一的羧基端和整个US9基因序列),这是与病毒DNA重组所需要的。
为了产生gE缺失型IBR重组病毒,通过脂质转染,将线性化的pBHV1gEΔβ(ATCC登录号No.VR-2637)和全长野生型IBRV(菌株Cooper)共转染入Madin-Darby牛肾(MDBK)细胞中。全长IBRV的gE基因座上β-gal的正确插入和随后的野生型IBRVgE编码区部分的缺失,都是因为含有病毒DNA复制的该质粒中BHV-I特异性侧翼序列的同源性重组。将病毒特异性侧翼序列掺入到新合成的病毒DNA中,产生该编码区的缺失和在同一区域中的插入。如Chowdery,S.I.,“减毒牛疱疹病毒I型(BHV-I)重组病毒的构建和特性分析”,Vet.Microbiol.52:13-23(1996)所述,在卤代吲哚基-β-D-半乳糖苷(Bluo-Gal)覆盖层下筛选蓝色噬斑,以噬斑纯化表达β-gal的重组病毒三次,该法本文纳入作为参考。用印迹杂交和用抗BHV-IgE特异性抗肽兔多克隆血清进行免疫印迹进一步对几个重组分离物作特性分析。使用Chowdery,S.I.,“减毒牛疱疹病毒I型(BHV-I)重组病毒的构建和特性分析”,Vet.Microbiol.52:13-23(1996)所述的印迹杂交方法,本文将其纳入作为参考。还使用Chowdhury S.I.,“呼吸道牛疱疹病毒1(BHV-I)和神经毒力BHV-5的糖蛋白C(gC)之间抗原性变异的分子基础”,Virology 213:558-568(1995)所述的免疫印迹方法,本文将其纳入作为参考。
结果
用Southern印迹杂交分析了两种重组病毒,即gEΔ3.1IBRβ(ATCC登录号No.VR-2367)和gEΔ3.5IBRβ的DNA中预计的gE基因座上的缺失和β-gal序列的插入,如图2所示。在分离物gEΔ3.1IBRβ和gEΔ3.5IBRβ中,gE基因氨基端不存在编码前372个氨基酸的1Kb AsuII-HindIII片段序列,而存在β-gal序列证明在这些分离物中以位点特异性方式发生了预期的重组。与此发现相一致,用BHV-IgE特异性抗肽兔多克隆血清在野生型亲代Cooper菌株中检测到92-95Kd BHV-IgE蛋白质,但在gE缺失型重组病毒gEΔ3.1IBRβ中则没有。结果见图3,该分离物用于进一步研究。另外,通过用含有野生型IBRV的初始gE序列和侧翼序列的质粒共转染,gEΔ3.1IBRβ可以回复到野生型IBRV。这基本与用于产生gEΔ3.1IBRβ的共转染过程相反。
在感染后3、6、12和24小时,用组织化学法测定了病毒感染的MDBK细胞中β-gal表达的动力学。早至感染后3小时,晚至感染后24小时测得β-gal的活性。这表明在早期和晚期都表达gEΔ3.1IBRβ病毒的CMV-IE启动子调节的β-半乳糖苷酶基因。另外,即使该嵌合基因由外源性人疱疹病毒HCMV-IE启动子调节且含有非病毒的β-gal序列以及增强子(对β-gal和BHV-I是外源的),它也作为真正的BHV-I基因受到调节和表达。所以,β-gal对BHV-I而言是外源的(天然状态的BHV-I中不存在),且HCMV-IE及其增强子序列对BHV-I和β-gal(受它们调节和/增强的)而言是外源的。
gE基因的缺失可作为免疫学标记物来区分疫苗接种过的动物和受感染的动物。由疫苗菌株诱导的抗体应答将缺少gE特异性抗体,从而可与含有gE特异性抗体的野生型BHV-I感染诱导的应答相区分。所以可以在疫苗接种过的牧群中鉴定出和选出受感染的动物。这种血清学标记物对消灭牧群中的BHV-I而言非常重要。
用于产生重组病毒的质粒(pBHV1gEΔβ)及产生的重组病毒gEΔ3.1IBRβ已保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。质粒(pBHV1gEΔβ)被命名为ATCC登录号No.203607,重组病毒(gEΔ3.1IBRβ)被命名为ATCC登录号No.VR-2637。
实施例2
材料和方法
本试验测定gEΔ3.1IBRβ病毒对牛的致病性,并将这些结果与亲代Cooper菌株IBRV的致病性相比较。将10头6个月大的Holstein牛(无IBRV和牛病毒性腹泻病毒)随机分成两组(A和B),每组各5头牛。在相同的条件下将两组关养在分开的厩里。在试验前,所有牛都是健康的,且直到试验开始都保持血清阴性。
用重组gE缺失型IBRV鼻内接种组A的各头牛。用亲代Cooper菌株IBRV鼻内接种组B的各头牛。每头动物的接种物中含有1×107TCID50个各自的病毒。所有接种都是用DEVILBIS型号50喷雾器(Delvis Co.,Somerset,Pennsylvania)进行喷雾接种,每个鼻孔用2ml接种物为时30秒到1分钟。
接触病毒(接种)后连续14天每日对所有牛进行密集的临床观察。每天记录直肠温度。特别注意以下状况:行为(抑郁)、食欲、咳嗽、眼睛和鼻的分泌物、鼻和口腔粘膜充血或病变、结膜炎和异常呼吸。分别给各种状况评分,将每头牛每天的临床评分以及各组的平均每天临床评分输入电脑(通过将各状况的分数加在一起)。评分参数如下:鼻分泌物      正常=0;中等浆液性=1;严重浆液性=2,轻度微化脓
          性=2;中等微化脓性=3;和严重微化脓性=4行为(抑郁)    没有=0;轻度=1;中等=2;严重=3鼻粘膜充血/发红=1鼻粘膜溃疡=2结膜炎=2咳嗽=2呼吸困难=2每天直肠温度    39.7-39.99℃=1;40.0-40.5℃=2;40.6-41.0℃=3;超过
            41.0℃=4
结果
受IBRV亲代Cooper菌株(野生型IBRV)感染的B组牛表现出典型的感染信号:抑郁、食欲降低、眼睛和鼻有分泌物、鼻溃疡/鼻生斑和咳嗽。这些临床发现结果产生了如图5所示的数天内的高临床评分。而受重组gEΔ3.1IBRβ病毒(组A)感染的牛未表现出任何可检测到的临床信号(如图5所示),且它们的行为和食欲保持正常。图6比较了各组(A和B)牛的平均直肠温度。在亲代菌株Cooper感染的牛(组A)中记录到数天内高的直肠温度(39.7-40.5℃)。在gEΔ3.1IBRβ感染的牛(组A)中未记录到高于38.9℃的直肠温度。
实施例3
材料和方法
本试验比较了MDBK细胞中的gEΔ3.1IBRβ和MDBK细胞中的亲代IBR菌株Cooper之间的生长动力学。分别用5噬斑形成单位(PFU)/细胞的重组gEΔ3.1IBRβ病毒或亲代菌株Cooper感染MDBK细胞的一系列复制培养物。感染后以连续间隔收获感染的培养物,制备病毒原液用于病毒滴度试验。
结果
如图4显示了一步生长试验的结果。病毒生长曲线表明gEΔ3.1IBRβ病毒和亲代菌株Cooper之间的后代病毒(增殖)时间过程相类似。但在感染后早期重组病毒的产量较少。
实施例4
材料和方法
本试验分离和定量测定了组A和B(上述实施例3)中各动物的病毒。将一普通棉签插入各鼻腔。在粘膜上旋转此棉签3次。室温将棉签上的病毒洗到3ml样品培养液(含有100μg/ml庆大霉素、3%v/v FBS、25μg/ml两性霉素B的MEM)中1小时。1000g离心5分钟使样品澄清,-70℃储存。用100μl 1∶10稀释的棉签悬浮液进行MDBK细胞中的病毒分离。在微量滴定板上滴定病毒阳性样品。用培养液进行一系列10倍稀释,将50μl各稀释液加到96孔板上8个含有1.5×105个MDBK细胞的孔中。37℃培养5天后,显微镜读取板上的细胞病变效应(CPE)。按Reed,L.J.,和Muench,H.,Am.J.Hyg.27:493(1938)所述的方法(本文将此方法纳入作为参考),计算TCID50病毒滴度。
结果
从鼻棉签分离出的病毒量表明:与亲代菌株Coope相比,gEΔ3.1IBRβ病毒在鼻上皮细胞中生长的效率较低。图7显示了鼻分泌物中病毒的排出。就病毒的排出而言gEΔ3.1IBRβ病毒比野生型BHV-I(亲代菌株Cooper)低约15-550倍。而且gEΔ3.1IBRβ感染的牛比受野生型病毒感染的牛病毒排出的持续时间也要短2天。
实施例5
材料和方法
本试验测定了采自A和B组牛(上述实施例3和4)的血清中BHV-I中和抗体的滴度。在感染后第13天从A和B组各牛采集血液样品。如Chowdhury,S.I.,等人“分离自反刍动物宿主的马疱疹病毒1(EHV-1)的分子生物学特性”,VirusRes.11:127-139(1988)所述的噬斑减少方法(本文将此方法纳入作为参考),用12孔板测定了血清中BHV-I中和抗体的滴度。
结果
在牛中野生型(亲代菌株Cooper)和gE缺失型IBRV病毒(gEΔ3.1IBRβ)都诱导BHV-I中和抗体。但野生型感染的牛的血清中和滴度(1∶20-1∶35,平均滴度为1∶30)比gE缺失型抗体滴度(1∶11-1∶30,平均滴度1∶16)略高。

Claims (30)

1.一种减毒重组牛疱疹病毒I型病毒,其特征在于,所述的病毒中天然糖蛋白E编码区的一部分被缺失并被基因插入件所替换,所述的插入件含有外源β-半乳糖苷酶基因的编码区,所述的重组病毒在宿主细胞中表达β-半乳糖苷酶。
2.如权利要求1所述的病毒,其特征在于,所述的插入件含有人巨细胞病毒早期启动子和所述的人巨细胞病毒早期启动子的增强子序列。
3.如权利要求2所述的病毒,其特征在于,所述的缺失部分含有约三分之二所述的天然糖蛋白E编码区。
4.如权利要求2所述的病毒,其特征在于,所述的插入件连接于SV40聚腺苷酸化位点。
5.如权利要求1所述的病毒,其特征在于,所述的外源β-半乳糖苷酶基因作为真正的牛疱疹病毒I型编码基因表达。
6.如权利要求1所述的病毒,其特征在于,所述的缺失的天然编码区可作为基因型标记物。
7.如权利要求1所述的病毒,其特征在于,所述的基因插入件可作为表型标记物。
8.如权利要求1所述的病毒,其特征在于,所述的缺失的天然编码区可作为免疫学标记物。
9.如权利要求1所述的病毒,其特征在于,感染的早期和晚期所述的β-半乳糖苷酶编码序列可在所述的宿主细胞中表达。
10.一种能有效诱导牛疱疹病毒I型中和抗体的疫苗,其特征在于,所述的疫苗包含权利要求1所述的重组病毒。
11.如权利要求10所述的疫苗,其特征在于,所述的缺失部分含有约三分之二所述的天然糖蛋白E编码区。
12.如权利要求11所述的疫苗,其特征在于,所述插入件含有人巨细胞病毒早期启动子和所述的人巨细胞病毒早期启动子的增强子序列。
13.如权利要求10所述的疫苗,其特征在于,所述插入件连接于SV40聚腺苷酸化位点。
14.如权利要求10所述的疫苗,其特征在于,所述的β-半乳糖苷酶基因作为真正的牛疱疹病毒I型编码基因表达。
15.如权利要求10所述的疫苗,其特征在于,感染的早期和晚期所述的β-半乳糖苷酶编码序列可在所述的宿主细胞中表达。
16.如权利要求10所述的疫苗,其特征在于,所述的缺失的天然糖蛋白E编码区可作为基因型记物。
17.如权利要求10所述的疫苗,其特征在于,所述的插入件的β-半乳糖苷酶编码区可作为表型标记物。
18.如权利要求10所述的疫苗,其特征在于,所述的缺失的天然编码区可作为免疫学标记物。
19.一种区分受权利要求10所述的重组病毒疫苗感染的动物与受野生型牛疱疹病毒I型感染的动物的方法,其特征在于,所述的方法包括如下步骤:
(a)从动物获得液体样品
(b)分析各样品;和
(c)根据所述的分析将样品分组。
20.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述步骤(b)的分析包括检测β-半乳糖苷酶的存在与否。
21.如权利要求20所述的方法,其特征在于,所述步骤(c)的分组是根据是否存在β-半乳糖苷酶的表达。
22.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述步骤(b)的分析包括检测对糖蛋白E的特异性抗体应答反应。
23.如权利要求22所述的方法,其特征在于,所述步骤(c)的分组是根据是否存在对糖蛋白E的特异性抗体应答反应。
24.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述步骤(b)的分析包括用原位组织化学方法检测β-半乳糖苷酶的活性。
25.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述步骤(b)的分析包括用原位免疫-组织化学方法检测β-半乳糖苷酶蛋白质。
26.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述步骤(b)的分析包括用免疫印迹检测β-半乳糖苷酶蛋白质。
27.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述步骤(b)的分析包括用原位组织化学方法检测糖蛋白E的方法。
28.一种重组病毒,其ATCC登录号为No.VR-2367。
29.一种质粒,其ATCC登录号为No.203607。
30.一种免疫接种牛以抵抗牛疱疹病毒I型的方法,其特征在于,所述的方法包括用权利要求10所述的重组病毒疫苗接种所述的牛。
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