JP2559384B2

JP2559384B2 - ウイルスワクチン

Info

Publication number: JP2559384B2
Application number: JP61503474A
Authority: JP
Inventors: ポスト，レオナルド・イー; トムセン，ダレル・アール
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1985-07-29
Filing date: 1986-06-17
Publication date: 1996-12-04
Anticipated expiration: 2011-12-04
Also published as: FI871362A0; HK32696A; WO1987000862A1; DK157087D0; DK170948B1; DK157087A; EP0231209A1; JPH08333279A; PH25776A; ES2001752A6; NO871313L; FI871362A; JPS63500449A; ZA865277B; KR880700070A; AU591145B2; CN1018845B; KR950000887B1; DE3677494D1; ATE60799T1

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は血清学的に同定可能なウイルスワクチンに関
する。本発明のワクチンは該ワクチンに対して血清学的
に異なるウイルスを利用することによつて、ビルレント
野性型ウイルスで感染した動物と、ワクチン接種した動
物とを区別することを可能とする。

発明の背景偽狂犬病ウイルス（PRV）は全世界的に動物の多くの
種に感染する病気である。PRV感染は種々に呼ばれる感
染性延髄麻痺、マウジエスキー病、および仮性恐水病で
ある。感染はブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ラツト
およびミンクの如き重要な家畜において知られている。
宿主の範囲は非常に広く、ほとんどの哺乳類、および実
験的には少くとも、多くの種類の鳥類も包含する（宿主
の詳細なリストについては、デイー・ピー・グスタフソ
ン（D.P.Gustafson）、「シユードラビエス（Pseudorab
ies）」、デイジージズ・オブ・スワイン（Diseases of
Swine）、第５版、エイ・デイー・リーマンら（A.D.Le
man et al.）編、（1981）を参照）。ほとんどの感染動
物について、該病気は致命的である。しかし、成長した
ブタおよび恐らくラツトは該病気によつては死なず、従
つて該病気についての媒介者である。

ブタの集団は特にPRVに罹り易い。成長したブタは稀
にしか徴候を示さずまたは該疾患で死なないが、子ブタ
は感染した場合すぐに病気となり、しばしば明確な臨床
的徴候を伴わずして24ないし48時間のうちに通常死ぬと
いう結果となる（テイー・シー・ジヨーンズおよびアー
ル・デイー・ハント（T.C.Jones and R.D.Hunt）、ベテ
リナリ・パソロジー（Veterinary Pathology）、第５
版、リー・アンド・フエビガー（Lea ＆ Febiger）（19
83））。

PRVワクチンはこれまで多種類の技術によつて生産さ
れ、ヨーロツパの該病気流行地方におけるワクチン接種
は15年間以上実施されてきた。損害はワクチン接種によ
つて減少されてきたが、ワクチン接種は該ウイルスを環
境中に維持してきた。感染を防止するワクチンは生産さ
れたことがない。ビルレントウイルスに暴露された、ワ
クチン接種を受けた動物は感染しても生き残り、次いで
さらにビルレント・ウイルスを放出する。従つて、ワク
チン接種した動物は再び発病する可能性がある潜伏感染
を有しうる（デイー・ピー・グスタフソン（D.P.Gustaf
son）、前掲参照）。

PRV用の生弱毒化および不活性化ワクチンが米国で商
業的に入手可能であり、USDAによつて認可されてきた
（シー・イー・アロンソン（C.E.Aronson）編、ベテリ
ナリ・フアルマシユーテイカルズ・アンド・バイオロジ
カルズ（Veterinary Pharmaceuticals ＆ Biological
s）、（1983）参照）。

成長したブタはPRVの媒介者であるので、多くの州は
感染動物を検知するためのスクリーニングプログラムを
制定している。ビルレントPRVを持つ動物とワクチン接
種されたことのある動物とを区別するうえで問題が生じ
る。ビルレントウイルスとワクチンで用いるウイルスの
抗原特性は同一であり、従つて感染した動物とワクチン
接種した動物とを区別するのは不可能でありうる。その
ため、血清陽性のブタの移動に関する規定はワクチン接
種したブタと以前にPRVに感染したブタの双方に適用さ
れる（シー・イー・アロンソン（C.E.Aronson）、前
掲）。

PRVはヘルペスウイルスである。一般に、ヘルペスウ
イルスは最も複雑な動物ウイルスの１つである。それら
のゲノムは少くとも50個のウイルス特異的蛋白質をコー
ド付けし、150000個までのヌクレオチドを含有する。ヘ
ルペスウイルスの最も免疫学的に反応性の蛋白質のうち
には、とりわけビリオン膜および感染細胞の膜中に見い
出される糖蛋白質がある。PRV糖蛋白質についての文献
は少くとも４つのウイルス性糖蛋白質に言及している
（テイー・ベン−ポラートおよびエイ・エス・カプラン
（T.Ben−Porat and A.S.Kaplan）、バイロロジー（Vir
ology）、41、265〜73頁（1970）；エイ・エス・カプラ
ンおよびテイー・ベン−ポラート（A.S.Kaplan and T.B
en−Porat）、プロシーデイングズ・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.S
ci.）USA、66、799〜806頁（1970））。

いくつかのヘルペスウイルスは感染細胞の培地中に糖
蛋白質を分泌すると報告されている。単純疱疹ウイルス
（HSV）は糖蛋白質Ｃおよびいくつかの糖蛋白質Ｄの切
断形を培地中に放出する（ビー・ノリルドおよびビー・
エフ・ベステルガード（B.Norrild and B.F.Vestergaar
d）、インターバイロロジー（Intervirology）、11、10
4〜10頁（1979）；アール・イー・ランダルら（R.E.Ran
dall et al.）、ジヤーナル・オブ・ジエネラル・バイ
ロロジー（J.Gen.Virol.）、48、297〜310頁（198
0））。マレク病ウイルスはビリオン糖蛋白質Ａのかな
りの量を培地中に放出し（デイー・バン・ツアーネら
（D.Van Zaane、et al.）、バイロロジー（Virolog
y）、121、116〜32頁（1982））；ヘルペス・サイミリ
（Saimiri）・ウイルスもビリオン糖蛋白質を培地中に
放出する（アール・イー・ランダルおよびアール・ダブ
リユー・ホネス（R.E.Randall and R.W.Honess）、ジヤ
ーナル・オブ・ジエネラル・バイロロジー（J.Gen.Viro
l.）、51、445〜49頁（1980））。PRVはウイルス粒子中
に取り込まれないと報告されている糖蛋白質を培地中に
放出する（テイー・ベン−ポラートおよびエイ・エス・
カプラン（T.Ben−Porat and A.S.Kaplan）、バイロロ
ジー（Virology）、41、265〜73頁（1970））；テイー
・ジエイ・リーら（T.J.Rea、et al.）、ジヤーナル・
オブ・バイロロジー（J.Virol.）、54、21〜29頁（198
5））。

培地中に分泌されるPRV蛋白質はこれまで3aと称され
（テイー・ベン−ポラートおよびエイ・エス・カプラン
（T.Ben−Porat and A.S.Kaplan）、前掲）、糖蛋白質
Ｘ（gX）とも称されてきた（テイー・ジエイ・リーら
（T.J.Rea、et al.）、前掲）。gXはPRV感染細胞から単
離された場合、以下の特徴を有する。

（１）それは培養中のPRV感染動物細胞の培地中での主
要な蛋白質である。

（２）それは糖蛋白質である。

（３）それはSDSポリアクリルアミドゲル上で約95kdの
分子量を有する。

（４）それは硫酸化された蛋白質である。

（５）それは約１％過塩素酸に可溶である。および（６）それは標準的な実験室のマウスにおいて免疫原性
である。

本発明は野性型ウイルスから免疫学的に区別されるPR
V株を提供し、かくしてテストした動物を殺す必要なく
してワクチン接種した動物と感染した動物を区別できる
ようにすることにより、例えばPRV感染についてのブタ
のスクリーニングにおいて、前記した問題を解決する。

これらの抗原的差異は１つまたはそれ以上の検出可能
な抗原ポリペプチドをワクチンウイルスから欠失させる
結果でありうる。これらの遺伝子的変化の結果、テスト
した動物を殺す必要なくしてそれらの血清学的特性に基
づき感染した動物とワクチン接種した動物とを免疫学的
に区別することが可能となる。

情報の開示エム・ダブリユー・ウエイセンおよびエル・ケイ・ウ
エイセン（M.W.Wathen and L.K.Wathen）〔ジヤーナル
・オブ・バイロロジー（J.Virol.）、51、57〜62頁（19
84）〕はウイルス性糖蛋白質（gp50）に突然変異を含有
するPRV、およびgp50に対する単クローン抗体の中和を
利用する突然変異体を選択する方法について言及してい
る。ウエイセンおよびウエイセン（Wathen and wathe
n）はこのウイルスのワクチンとしての使用を記載して
いない。さらに、このウイルスで免疫化した動物は感染
した動物から血清学的に区別可能であろう。

テイー・シー・ホランドら（T.C.Holland、et al.）
〔ジヤーナル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）、45、
672〜682頁（1983）〕は糖蛋白質特異単クローン抗体で
選択したHSVの抗原変異体について言及している。選択
された変異体のうちにはHSV糖蛋白質gCを発現しない２
種が包含される。ホランドら（Holland、et al.）もこ
れらの変異体のワクチンについての使用を教示しおよび
示唆していない。

ヨーロツパ特許出願第0133200号はPRVの媒介者と非媒
介者を区別するために、あるレクチンと結合したPRV糖
蛋白質サブユニツトワクチンと共に用いられるべき診断
用抗原フアクターについて言及している。

ヨーロツパ特許出願第0074808号はヘルペスウイルス
・チミジン・キナーゼ遺伝子より成る選択可能なDNA配
列の使用を通じて安定に生じる真核細胞またはウイルス
のゲノムにおける特異的なDNA配列の挿入、欠失および
置換について言及している。操作に感受性としてリスト
されているゲノムのうちにPRVがある。もう１つの関連
した出願も同様の方法を開示している（エル・イー・ポ
ストおよびビー・ロイツマン（L.E.Post and B.Roizma
n）、「大型ゲノムにおける特定遺伝子の欠失のための
普遍技術：ヘルペス・シンプレツクスウイルス１のα遺
伝子22は増殖に必須ではない」、セル（Cell）、25、22
7〜32頁（1981））。これらの文献中に開示されている
方法は本発明のPRVを生産するのに用いられる（後
記）。

エイ・ジエイ・エム・ベルンズおよびエイ・エル・ジ
エイ・ギールケンズ（A.J.M.Berns and A.L.J.Gielken
s）、ヨーロツパ特許出願第0141458号はPRVの欠失突然
変異体について言及している。該欠失は分泌された糖蛋
白質をコード付けする遺伝子の範囲内ではない。さらに
ベルンズ（Berns）はワクチンウイルスと野生型ウイル
スを血清学的に区別する該突然変異体を示唆も記載もし
ていない。

エイ・エル・ジエイ・ギールケンズら（A.L.J.Gielke
ns、et al.）〔「偽狂犬病ウイルスの野生単離体とワク
チン株の間のゲノムの差」、ジヤーナル・オブ・バイロ
ロジー（J.Gen.Virol.）、66、69〜82頁（1985）〕はBa
mHI制限マツピングによつて異なる野生単離体のゲノム
と偽狂犬病ウイルス（PRV）の修飾生ウイルスワクチン
株とを比較することに言及している。彼らは変異の２つ
の型、（１）PRVゲノムのTRsおよびIRs領域由来のフラ
グメントへのヌクレオチド配列の添加および／または欠
失および（２）該ゲノムのU_L領域内のBamHI切断部位の
損失または獲得の観察を報告した。彼らは制限エンドヌ
クレアーゼでのウイルス性DNAの分析はPRVの野生株を区
別する方法を提供できうると推測している。

現在商業的に利用可能なPRVワクチンの１つが、メテ
ンライターら（Mettenleiter、et al.）〔ジヤーナル・
オブ・バイロロジー（J.Virol.）、56、307〜11頁（198
5）〕が示した如く、糖蛋白質Ｉをコード付けする遺伝
子についての欠失を含有することを発明者らは決定し
た。発明者らはもう１つの商業的株（バルサ（Barth
a））がgp63を欠くことも示した。これらのワクチンは
後記の如く本発明のある具体例において有用であり得
る。

ビー・ロムニツクツイら（B.Lomniczi、et al.）
〔「偽狂犬病ウイルスワクチン株のゲノムにおける欠失
およびゲノムの４つの異性体の存在」、〔ジヤーナル・
オブ・バイロロジー（J.Virol.）、49、970〜79頁（198
4）〕は（バルサ（Bartha）およびノルデン（Norden）
からの）２種の商業的PRVのワクチン株が0.855と0.882
の地図単位間にPRVゲノムの独特な短配列に欠失を有す
ることを示す該株の特徴づけについて言及している。こ
の領域はPRVのBamHI7フラグメントの範囲内である。こ
れらの文献は分泌糖蛋白質を欠くPRV、かかる突然変異
体より成るワクチンまたはかかるPRV突然変異体を用い
ることによるワクチン接種した動物と感染した動物とを
区別する方法をどこにも記載または示唆していない。

米国特許第4514497号はPRV tk^-欠失について言及して
いる。それはビルレント野性型ウイルスで感染した動物
とワクチン接種した動物とを血清学的に区別することを
可能とする欠失を有するPRVについては言及していな
い。

発明の要約本明細書中で用いる如く、「適当に不活性化したウイ
ルス」なる表現およびその表現の変形、および「アルビ
ルレント」は共に殺したウイルスおよび弱毒化したウイ
ルスを言う。

本明細書中で用いる如く、「分泌糖蛋白質」は培養に
おいて感染細胞の培地内に蓄積された糖蛋白質を言う。

本発明は少くとも１つの検出可能な野生型ウイルスの
抗原を欠く適当に不活性化されたウイルスより成るワク
チンに関し、それはワクチン接種した動物と感染動物と
の間の血清学的区別を可能とする。

さらに詳しくは、本発明は野生型PRVの血清学的に検
知可能なポリペプチドを欠く偽狂犬病ウイルスに関す
る。

さらに詳しくは、本発明は野生型PRVの分泌糖蛋白質
を欠く偽狂犬病ウイルスに関する。

さらに詳しくは、本発明は糖蛋白質Ｘを欠く偽狂犬病
ウイルスに関する。

本発明は、また、ワクチン接種した動物と感染動物と
を区別する方法および前記ウイルスおよびワクチンより
成る多価ワクチンを提供する。

発明の詳細な説明本発明はテストした動物を殺す必要なくしてワクチン
接種した動物と感染した動物とを血清学的に区別するこ
とを可能とするワクチンに関する。該ワクチンは抗原性
ポリペプチド、好ましくは分泌ポリペプチド、およびさ
らに好ましくは分泌糖蛋白質について欠失を有するウイ
ルスより成る。

発明者らは組換え体DNA法を用いることによつて該PRV
を生産した。もう１つの公に入手可能なプラスミド（pA
CYC184）と共に、発明者らが欠失しようと望むgX遺伝子
を包含する容易に入手可能なプラスミド（pPRXh1、また
pUC1129としても公知）で出発して、発明者らは好都合
な操作についてサブクローンしたgX遺伝子を担持するプ
ラスミド（pPRXK4）を組立てた。次いで、発明者らはpP
RXK4からgXプロモーターを除去し、プラスミドpPGX1を
組立てるためにそれをもう１つの公に入手可能なプラス
ミド、pUC9にクローンした。次に、本発明者らはプラス
ミドpRB103からHSVチミジンキナーゼ（tk）の遺伝子を
除去し、該gXプロモーターと融合してプラスミドpGXTK2
を生産するようにそれをpPGX1中の部位中に挿入した。
次いで、本発明者らは該gX遺伝子のＣ末端コーデイング
領域を含有するPRVのBamHI7フラグメントをpPRXh1から
除去し、それをpGXTK2中のtk遺伝子から下流に挿入して
該HSV tk遺伝子がその中で該PRV gXプロモーターおよび
該gX遺伝子についてのＣ末端コーデイング領域によつて
フランキングされるプラスミド（pGXTK3）を形成した。
本発明者らは、次にエル・イー・ポストおよびビー・ロ
イツマン（L.E.Post and B.Roizman）の方法（後記）に
よつてウサギの皮膚細胞をtk^-gX⁺pRVおよびpGXTK3（tk⁺
gX^-）で供トランスフエクトしてtk⁺gX^-PRVを生産した。
最後に、本発明者らは該tk⁺gX^-PRVをtk^-gX^-PRVに変換し
てワクチンとして用いるために該ウイルスを弱毒化し
た。本発明者らは、また、偽狂犬病に対するワクチンと
して該tk^-gX^-PRVの有効性を証明した。

チヤートＡ〜Ｋは本発明の組立てを説明するために掲
げた。プラスミドおよびDNAフラグメントを説明するの
にある約束を用いる。

（１）単一線の図は環状および直線状の二本鎖DNAを表
わす。

（２）星印（^*）は表わされた該分子が環状であること
を表わす。星印が無いものは該分子が直線状であること
を示す。

（３）エンドヌクレアーゼ制限部位は直線の上方に示し
ている。

（４）遺伝子は直線の下方に示している。

（５）遺伝子と制限部位間の距離はスケール通りではな
い。図はそれらの相対的な位置のみを示す。

プラスミドの組立てで用いる方法は当業者によく知ら
れた標準的な組換え体DNA法である。これらの方法は、
例えば、テイー・マニアテイスら（T.Maniatis、et a
l.）モレキユラー・クローニング（Molecular Clonin
g）、コウルド・スプリング・ハーバー（Cold Spring H
arbor）研究所（1982）およびビー・ペルバル（B.Perba
l）、ア・プラクテイカル・ガイド・トウ・モレキユラ
ー・クローニング（A Practical Guide to MolecularCl
oning）、ジヨン・ウイリー・アンド・サンズ（John Wi
ley ＆ Sons）中に記載されており、ここに参照のため
に挙げる。

本明細書中で用いる特定の方法の多くはエル・イー・
ポストおよびビー・ロイツマン（L.E.Post and B.Roizm
an）、「大型ゲノムにおける特定遺伝子の欠失のための
普遍技術：ヘルペス・シンプレツクスウイルス１のα遺
伝子22は増殖に必須ではない」、セル「Cell）、25、22
7〜32頁（1981）中に述べられており、ここに参照のた
めに挙げる。特に、共トランスフエクシヨンおよび選択
方法がそこに見い出される。

実施例１ 1.pPRXK4の組立て以下、チヤートＡを参照し、完全なgX遺伝子をサブク
ローンするプラスミドの組立てを記載する。

PRVからのgX遺伝子およびgXプロモーターを含有する
（pUC1129としても公知であつてイリノイ州、ペオリ
ア、米国農務省、ノーザン・リージヨナル・リサーチ・
ラボラトリー（Northern Regional Research Laborator
y）から寄託番号Ｂ−15772として入手可能な）プラスミ
ドpPRXh1を制限エンドヌクレアーゼXhoIおよびKpnIで消
化する。産生された４個のフラグメントのうち３番目に
大きいもの（フラグメント１、約2.6kb）をポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によつて単離する。フラグメント
１をT4DNAポリメラーゼで平滑末端とし、EcoRIリンカー
を加える（アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシ
ヨン（American Type Culture Collection）、12301パ
ークローン・ドライブ（Parklawn Drive）、ロツクビル
（Rockville）、メリーランド（Maryland）20852から寄
託番号37033として入手可能な）ベクターpACYC184をEco
RIで消化し、細菌アルカリホスフアターゼ（BAP）で処
理してフラグメント２を得る。EcoRIがCm^r遺伝子を切断
する。

次いでフラグメント１と２を結び、プラスミドpPRXK4
を産生する。このプラスミドは完全なgX遺伝子を含有
し、有望なgXプロモーターを包含する（リーら（Rea、e
t al.）、前掲参照）。

2.pPGX1の組立て以下、チヤートＢを参照し、gXプロモーターのサブク
ローニングを記載する。

制限エンドヌクレアーゼMstI（TGCGCA）によつて認識
されるヌクレオチド配列をgX mRNAの５′−非翻訳領域
をコード付けすると推定されるDNA配列中に位置させる
（リーら（Rea、et al.）、前掲）。pPRXK4をMstIで消
化し、２番目に大きいフラグメント（フラグメント３、
約2.1kb）を単離する。次いで、フラグメント３をEcoRI
で切断し、より小さな切断片（フラグメント４、約400b
p）を単離する。（フアルマシア（Pharmacia）P/L社、
ピスカタウエイ（Piscataway）、ニユージヤージー州、
米国から入手可能な）プラスミドpUC9をEcoRIおよびSma
Iで消化し、より大きなフラグメント（フラグメント
５、約2.6kb）を単離する。次いでフラグメント４と５
をEcoRI部位で結び、MstI/SmaI融合によつてpPGX1を産
生する。このプラスミドはgXプロモーターから直ぐ下流
のBamHI切断部位と共にgXプロモーターを含有する。

3.pGXTK2の組立て以下、チヤートＣを参照し、gXプロモーターがHST tk
遺伝子と融合されるプラスミドの組立てを記載する。

前記からのプラスミドpPGX1をBamHIで消化し、BAPで
処理してフラグメント６を得る。プラスミドpRB103はHS
V−１株ＦからのBamHI Qフラグメントを含有する（エル
・イー・ポストら（L.E.Post、et al.）、プロシーデイ
ングズ・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、77、4201〜05頁
（1980））。（別法としてベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ（Bethesda Research Laboratories）〔ガイセ
ルズブルグ（Gaithersburg）、メリーランド州、米国〕
から商業的に入手可能なプラスミドpHSV106もBamHI Qフ
ラグメントを含有し、この組立てにおいて用いることが
できる。）pRB103をBamHIとBglIIで消化し、２番目に大
きいフラグメント（フラグメント７、約2.9kb）を単離
する。このフラグメントはそのプロモーターが無いHSV
tk遺伝子を含有する。消化したpPGX1（フラグメント
６）とBamHI部位にtk遺伝子（フラグメント７）を含有
するフラグメントとの結紮およびBglII/BamHI融合によ
つて反対に配位するtkフラグメントを含有する２個のプ
ラスミドを得る。BamHIとEcoRIの消化パターンの調査に
よつて、gXプロモーターから直ぐ下流にtk遺伝子を有す
るプラスミドを選択し、これをpGXTK2と命名する。

4.pGXTK3の組立て以下、チヤートＤを参照し、HSV tk遺伝子およびそれ
をフランキングするPRV配列より成るプラスミドを記載
する。

pPRXh1（前記１参照）をBamHIで消化し、フラグメン
ト８（約6.9kb）を単離する。（このフラグメントはBam
HI7として文献で公知である（リーら（Rea、et al.）参
照、前掲）。）pGXTK2をBamHIで消化し、BAPで処理して
フラグメント９を産生する。フラグメント８を結合して
pGXTK2のBamHI部位（フラグメント９）中に入れる。gX
プロモーターと同一の配位であるフラグメント８を有す
る得られたプラスミドをpGXTK3と命名する。このプラス
ミドはgXプロモーターから直ぐの下流にあつてgXのＮ末
端アミノ酸をコーデイングするDNAを置換するtk遺伝子
を有する。

5.共トランスフエクシヨン以下、チヤートＥを参照して、pGXTK3をClaIで切断す
る。gX（効果的にはgX^-）のＣ末端領域を含有する得ら
れたDNAフラグメントおよびgXプロモーターに融合した
全HSV tk遺伝子を用いてタタロブ（Tatarov）〔ツエン
トラルブラト・ベーターインネールメデイツイン（Zent
ralblatt Veterinarmedizin）、15、847〜53頁（196
8）〕の方法に従い、ヨードデオキシウリジンの存在に
おいてPRVの増殖によつて選択された（発明者らがPRV H
Rと命名する）PRVのtk^-gX⁺突然変異体からのDNAと共に
ウサギの皮膚細胞を共トランスフエクトする。

（適当な不活性化の後、ワクチンに用いることができ
る）tk⁺gX^-組換え体ウイルスはHAT培地（エル・イー・
ポストおよびビー・ロイツマン（L.E.Post and B.Roizm
an）、前掲）におけるtk^-ヒト143細胞における増殖によ
つて選択される（ジエイ・ピー・ウエイルら（J.P.Wei
r、et al.）、プロシーデイングズ・オブ・ナシヨナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.S
ci.）USA、79、1210〜14頁（1982）；パニカリおよびパ
オレツテイ（Panicali and Paoletti）、プロシーデイ
ングズ・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、79、4927〜31頁
（1982）；カンピオネーピツカルドら（Campione−Picc
ardo、et al.）、ジヤーナル・オブ・バイロロジー（J.
Virol.）、31、281〜87頁（1982）；ケイ・エル・ポフ
エンベルガーら（K.F.Poffenberger、et al.）、プロシ
ーデイングズ・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、80、2690〜
94頁（1983）；エム・エフ・ステインスキーら（M.F.St
inski、et al.）ジヤーナル・オブ・バイロロジー（J.V
irol.）、55、431〜41頁（1985））。本発明者らは得ら
れたウイルスをPRV△gX1またはDT−Ａと命名した。DT−
Ａはtk⁺であつて十分にマウスを殺す能力がある。

³⁵S−メチオニンまたは¹⁴C−グルコサミンでウイルス
性蛋白質をラベルし、ひき続く抗gX血清での免疫沈降に
より、HAT（例えば、DT−Ａ）中での増殖により選択し
たウイルスをgXの合成について分析する。gXは検出され
ない。

抗gX血清でのウエスタン・ブロツテイング法によりtk
⁺gX^-ウイルスで感染した細胞からの蛋白質も分析した
が、突然変異体ウイルスで感染した細胞においてgXは検
出されない。

全gX遺伝子を除去するのも可能である。例えば、フラ
グメント８をNarIで消化することによつて、全gX遺伝子
が欠失されたフラグメントが産生される（チヤートＤ参
照）。次いで、このフラグメントをフラグメント８の代
りに用いてgX遺伝子を全く欠くgX^-PRVを産生できる。

tk^-PRVはアビルレントであつて良好なワクチンが製造
されることは少し前から知られていた。従つて、DT−Ａ
を適当に不活性化してワクチンとして有用なtk^-ウイル
スを製造するには、タタロブの方法（例えば、ジー・タ
タロブ（G.Tatarov）、「５−ヨード−２−デオキシウ
リジン（IUDR）によつて誘導されたアウジエスキー・ウ
イルスの非病原性変異株」、ツエントラルブラト・ベテ
リナルメデイツイン（Zentralblatt Veterinarmedizi
n）、15、847〜53頁（1968）；ジー・タタロブら（G.Ta
tarov、et al.）、「アウジエスキー・ウイルスMK株の
無害性および免疫原性の調査」、ベト・ナウキ（Vet.Na
uki）、６、49〜54頁（1969）；ジー・タタロブ（G.Tat
arov）、「アウジエスキー病に対する生ワクチンMK−25
の使用結果」、ベト・シビルカ（Vet.Sbirka）、７、10
〜12頁（1974）；ジー・タタロブ（G.Tatarov）、「ア
ウジエスキー病に対するブルガリアンMK−25ワクチ
ン」、カー・メド・ベト（Cah.Med.Vet.）、43、347〜5
2頁（1974）；ジー・タタロブら（G.Tatarov.et al.）
「５−ブロモデオキシウリジンの影響下におけるアウジ
エスキー病ウイルスのアビルレント変異株の開発」、ベ
テリナリ・サイエンス（Veterinary Science）、18、３
〜12頁（1981）；ブイ・クリストーバら（V.Khristov
a、et al.）、「アウジエスキー病ウイルスのビルレン
トおよびワクチン株のチミジンキナーゼ活性」、ベテリ
ナリ・サイエンス（Veterinary Science）、22、15〜22
頁（1985）参照）によつて；または同様の技術（ダブリ
ユー・シー・トツプ（W.C.Topp）、バイロロジー（Viro
logy）、113、408〜11頁（1981）；エス・キツトら（S.
Kit、et al.）、イクスペリメンタル・セル・リサーチ
（Exp.Cell Res.）、31、297〜312頁（1963）；エス・
キツトら（S.Kit et al.）、バイロロジー（Virolog
y）、130、381〜89頁（1983））によつて突然変異を起
こさせtk^-PRVについて選択できる。

エル・イー・ポストおよびビー・ロイツマン（L.E.Po
st and B.Roizman）（前掲）の以下の方法に従い、この
tk⁺gX^-PRVおよびgX欠失を持つプラスミドでウサギの皮
膚細胞を共トランスフエクトし、araTでtk^-組換え体に
ついて選択することによるHSV tk遺伝子を除去する組換
えの結果によつて、HSV tk遺伝子を含むPRV△gX₁もtk^-P
RVに変換できる。

以下、チャートＦを参照して、チヤートＣ、工程
（ａ）に示した如くプラスミドpPGX1をBamHIで消化し、
BAPで処理してgXプロモーターより成るフラグメント６
を産生する。前記およびチヤートＤ、工程（ａ）に示し
た如く、プラスミドpPRXh1をBamHIで消化してgXのＣ末
端コーデイング領域より成るフラグメント８を産生す
る。このフラグメントもPRV BamHI7フラグメントとして
公知である。次いでフラグメント６と８を一緒に結紮
し、イー・コリ中に形質転換し、EcoRIとPvuIIでの消化
によつて該クローンをBamHI7フラグメントの所望する配
位についてスクリーニングを行う。適当な配位は消化に
よる2.0kbフラグメントの生成によつて示される。得ら
れたプラスミドをｐ△GXB7と命名する。

リン酸カルシウムトランスフエクシヨン法（モカルス
キーら（Mocarski、et al.）、セル（Cell）、22:243
（1980））を用い、PRV△gX1からのウイルス性DNAでプ
ラスミドｐ△GXB7を共トランスフエクトしてウサギの皮
膚細胞に入れる。モカルスキーら（Mocarski、et al.）
（前掲）によつて記載された如く、100μg/mlのaraTの
存在下、このトランスフエクシヨン由来のウイルスをベ
ロ（vero）細胞上で平板培養する。モカルスキーら（Mo
carski、et al.）（前掲）によつて記載された如く、DN
Aの制限酵素消化によつて、個々のプラークを選択して
所望するtk^-組換え体ウイルスについて分析する。この
ウイルスは命名したPRV△GXTK^-またはDT−Ｂである（チ
ヤートＧ）。以下の実施例２に示す如く、これらのtk^-P
RVはワクチンに対して有用な弱毒化ウイルスである。

これらのウイルスを用いて感染した動物とワクチン接
種した動物とを区別するには、例えばエライサ（ELIS
A）アツセイを用いることができる。一般に、例えば組
換え体DNA法（リーら（Rea、et al.）、前掲）によつて
イー・コリ中で産生されたgX蛋白質を適当なプラスチツ
ク板のウエルに加え、十分な時間放置して該プラスチツ
クに吸収させる（一晩、20〜25℃）。該プレートを洗浄
し、ブロツキング剤（例えば、BSA）を加えて該プラス
チツク表面上の未反応部位を中和する。ひき続いて洗浄
し、次いでブタの血清を該ウエルに加える。20〜25℃で
の約１時間のインキユベーシヨンの後、該ウエルを洗浄
し、蛋白質Ａ−西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体を20
〜25℃での１時間のインキユベーシヨンの間に各ウエル
に加える。ひき続いてもう一度洗浄し、酵素基質（ｏ−
フエニレンジアミン）を該ウエルに加え、酸で反応を停
止する。492ナノメーターで吸光度を測定して血清中に
存在するgX抗体の量を定量する。gX抗体の不存在は動物
が感染していないことを示す。他の抗原についてテスト
することによつて与えられた動物がワクチン接種されて
いるか否かを決定できる。

PRV△GXTK^-は効果的なワクチンではあるが、ヨードデ
オキシウリジン中の増殖によつて選択されたPRV tk^-突
然変異は点突然変異である可能性がある。もしそれが点
突然変異だとすると、それはtk⁺に復帰し、しかも恐ら
くビルレントである可能性がある。従つて、欠失を有す
るtk^-PRVが好ましい。米国特許第4514497号はPRV tk^-欠
失について言及している。tk^-PRVをつくるのにそこで用
いるマーカー救済法は単純疱疹ウイルスにおいてtk^-欠
失をつくるのに初めて用いられた（ジエイ・アール・ス
マイリー（J.R.Smiley）、ネイチヤー（Nature）、285:
333〜35（1980）およびエル・イー・ポストら（L.E.Pos
t、et al.）、セル（Cell）、24:555〜65（1981））。

以下、チヤートＨを参照して、PRVのBamHI11フラグメ
ントに対してPRV tk^-遺伝子の地図が作成されている
（テイー・ベン−ポラートら（T.Ben−Porat、et a
l.）、バイロロジー（Virology）、127:194〜204（198
3））。PRVライス（Rice）株からのBamHIで消化したDNA
のアガロースゲル電気泳動によつてBamHI11フラグメン
トを単離し、クローンしてpBR322に入れてプラスミドpT
K11を産生する。pTK11はtk遺伝子内に単一のXhoI切断部
位を有する。pTK11をXhoIで切断し、エキソヌクレアー
ゼBal31で種々の時間消化し、リガーゼで再環化し、イ
ー・コリDH1中に形質転換した（マニアテイス（Maniati
s）、前掲、505頁）。これによりtk遺伝子中に種々の欠
失を有する一連のプラスミドが産生された。

これらのプラスミドのうち２つを選択し、CsCl密度勾
配遠心法によつて精製し、マクシアムおよびギルベルト
（Maxam and Gilbert）〔メソツズ・イン・エンザイモ
ロジー（Methods in Enzymology）、65（パート１）、4
97〜559頁（1980）〕の方法によつて配列付けした。プ
ラスミドｐ△tk−３はtk遺伝子内からの329個の塩基対
の欠失を有しており、プラスミドｐ△tk−４は275個の
塩基対の欠失を有していた。

tk欠失がgX^-ウイルス中に交差できる前に、tk^-欠失組
換え体を選択できるように、まずウイルスtk⁺をつくる
必要があった。PRV△GXTK^-DNAをプラスミドpTK11で共ト
ランスフエクトしてウサギの皮膚細胞中に入れた。得ら
れた組換え体ウイルスを単離し、HAT培地中の143細胞中
で増殖させて本発明者らがPRV△gXtk⁺PRVと命名したtk⁺
ウイルスを選択した。次いでこのウイルスからのDNAを
ｐ△tk−4DNAで共トランスフエクトしてウサギの皮膚細
胞中に入れた。araTの存在において、得られたウイルス
をベロ（vero）細胞上で平板培養してtk^-組換え体につ
いて選択した。DNAの調製および制限酵素分析によつ
て、得られたウイルスを適当な粗換え体についてスクリ
ーニングした。これらの組換え体はtk欠失を一体化し
た。本発明者らがPRV△gX△tkまたはDT−Ｃと命名した
これらのウイルスのうちの１つは予期されたtk欠失およ
びgX欠失を含有していた。本発明者らはDT−ＣのLD₅₀は
マウスにおける10⁷プラーク形成単位（pfu）よりも大き
いと決定した。比較のため、PRV△gXPRVTK⁺のLD₅₀は3pf
uであつた。

本明細書中に記載した特定の具体例はPRVに関するも
のであつて組換え体DNA法を利用するものであるが、分
泌糖蛋白質について欠失を含有する同様のワクチンは他
の技術、およびマレク病ウイルスおよび感染性ウシ鼻気
管炎ウイルスの如き他のウイルスを利用することによつ
ても産生することができる。

本明細書中の開示は主としてPRVに関するものである
が、本明細書中で用いる該技術はPRVに関する場合の如
くワクチン接種した動物と感染した動物とを区別するの
に有利ないずれの状況においても血清学的に区別される
ヘルペスウイルスを産生するのに用いることができる。
例えば、マレク病ウイルスおよび感染性ウシ鼻気管炎ウ
イルスが包含される。

本発明者らはHSV tk遺伝子をgXプロモーターの制御下
に置いたが、tkを含有するDNAフラグメントはそれがも
う１つのPRVプロモーター、またはtk遺伝子の発現につ
いて機能できるいずれの他のプロモーターの制御下にあ
るようにも挿入できる。PRV感染細胞中に表現できる、
例えば、他のHSVプロモーター、例えば、HSV ICP4 プロ
モーターも用いることができる。例えば、PRV感染細胞
中に発現できるプロモーターの制御下、PRV tk遺伝子を
gX遺伝子中に挿入でき、またはいずれの他のtk遺伝子も
挿入できる。

本発明者らはtk遺伝子を標識遺伝子の挿入として用い
たが、標識がそれを欠くウイルスからのその標識を持つ
ウイルスの選択を許す限り、いずれの標識遺伝子もgX遺
伝子中に挿入してそれを不活性化できる。例えば、抗生
物質耐性遺伝子はG418またはハイグロマイシンに対する
耐性の如き標識遺伝子として用いることができる。

選択可能な標識以外の遺伝子をgX遺伝子中に挿入する
ことも可能である。かかるウイルスを組立てるには、tk
配列を置換する外来性遺伝子を用いて外来性遺伝子をpG
XTK3の如きプラスミド中に入れることができる。次いで
このプラスミドをチヤートＥで説明したtk⁺gX^-ウイルス
からのDNAで共トランスフエクトできる。araTでの選択
により外来性遺伝子が挿入され、発現された組換え体ウ
イルスが得られる。かかる遺伝子は、例えば、もう１つ
のタイプのウイルス、例えば伝播性胃腸炎ウイルスまた
はブタのパルボウイルス、あるいはイー・コリの如き細
菌の抗原をコード付けすることができ、それにより次い
でその他のウイルスに対する免疫応答を生ぜしめる。従
つて本発明のこの具体例において、２つまたはそれ以上
のタイプのウイルスまたは他の病原体についての抗原よ
り成る「多価」ワクチンが産生できる。

前記の例として、本発明者らは組織プラスミノーゲン
アクチーベーター（tPA）遺伝子を以下の如くにしてgX
遺伝子中に挿入した。

pPSA18はコーデイング領域の５′−非翻訳領域におけ
る独特のBamHI切断部位と共にtPAについての全コーデイ
ング領域を含有するプラスミドである。それは1985年７
月26日に出願された同時係属の米国特許出願第758517号
に示されている如く組立てられる。以下、チヤートＩを
参照すると、pPSA18をBalIで切断し、BamHIリンカーを
加えてフラグメント11を産生する。次いでフラグメント
11をBamHIで消化してtPAの全コーデイング領域を含有す
る1.95kbフラグメント（フラグメント12）を産生する。
次いでプラスミドpPGX1（チヤートＢ）をBamHIで切断し
てフラグメント６を産生する。次いでフラグメント12と
６を結び、プラスミドpGXTPAを産生する。gXプロモータ
ーに関するtPA cDNAの配位が適当な場合、該適当な配位
を1.1kbフラグメントを産生するEcoRIでの消化によつて
決定する。

以下、チヤートＪを参照して、プラスミドpGXTPAをHi
ndIIIで消化してフラグメント13を産生する。PRV DNAの
BamHI7フラグメントを前記（フラグメント８）の如く単
離し、HindIIIリンカーを加えてフラグメント14を産生
する。次いでフラグメント13と14を一緒に結び、pGXTPA
−B7を産生する。このプラスミド中に挿入されたBamHI7
フラグメントの適当な配位をEcoRIとSphIでの消化によ
つて決定する。該配位が適当な場合、それにより5.8kb
フラグメントが産生される。

次いでプラスミドpGXTPA−B7をPRV△GX1からのウイル
ス性DNAで共トランスフエクトしてウサギの皮膚細胞に
入れる。araTの存在下で、得られたウイルスをベロ（ve
ro）細胞上で平板培養してtk^-組換え体を選択する。本
発明者らはかく選択したウイルスの１つをPRV−GXTPAと
命名した。このウイルスが細胞に感染した場合、抗tPA
抗血清での免疫沈降によつて検知される如く、該細胞は
tPAを産生しかつそれを分泌する。20ng/mlのtPA活性を
フイブリン可溶化アツセイによつて検出した（ウンケレ
スら（Unkeless、et al.）、ジヤーナル・オブ・イクス
ペリメンタル・メデイシン（J.Exp.Med.）、137、85〜1
11頁（1973）；ルスクトフら（Luskutoff、et al.）、
プロシーデイングズ・オブ・ナシヨナル・アカデミー・
オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、74、
3903〜07（1977））。

実施例２本実施例において、本発明者らはPRVのチミジンキナ
ーゼ欠乏糖蛋白質Ｘ欠失突然変異体（tk^-gX^-）でワクチ
ン接種することによるマウスとブタのPRV誘発死からの
防御を示す。

1.動物５週令の雌のCF−１マウスをチヤールズ・リバー（Ch
arles River）社から得た。

５〜６週令で雌雄混合である交雑育種したブタ18頭を
ジエイ・ギルモア・エンタープライズ（J.Gilmore Ente
rprise）より入手した。１室当たり６頭のブタとなるよ
うにブタをランダムに３部屋に割当てた。

ブタおよびマウスには適宜薬品を含まない飼料および
水を与えた。

2.ウイルスおよび細胞前記の如く、親PRV（HR株；tk^-gX⁺）からPRV欠失突然
変異体DT−Ａ（HSV tk⁺gX^-）およびDT−Ｂ（tk^-gX^-）を
組立てた。DT−Ｂはチミジンキナーゼを合成せず、かつ
それはgX遺伝子の欠失のためにgXを合成しない。全ての
防御試験において、ビルレントPRV（ライス（Rice）
株）を攻撃ウイルスとして用いた。ベロ（Vero）細胞ま
たはブタ腎臓−15（PK−15）細胞のいずれかの中でウイ
ルスを増殖させた。

3.ミクロ中和アツセイテイー・シー・ホランドら（T.C.Holland et al.）
〔ジヤーナル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）、45、
672〜82頁（1983）〕によつて記載されている如くミク
ロ中和アツセイを行つた。マウス血清をウイルスおよび
10％ウサギ補体と共に37℃にて３時間インキユベート
し、一方、ブタ血清は補体の不存在下においてウイルス
と共に37℃にて１時間インキユベートした。中和滴定量
は細胞変性効果から細胞の50％以上を防御する血清の最
大希釈の逆数として表わした。

4.免疫酵素法（ELISA） gX融合蛋白質（p60−11,1986年４月17日出願の同時係
属の米国特許出願第853087号に示されている如く産生し
たもの）をボラーの（Voller's）緩衝液（50mM NaHC
O₃、0.03％NaN₃、NaOHでpH9.6に調整）中で20μg/mlま
で希釈することによつて抗原溶液を調製した。0.45ミク
ロンの滅菌フイルター（サルトリウス（Sartorius）SM1
65 55K）を通してこれを過した。要すれば、使用前に
該過した溶液をボラーの緩衝液でさらに希釈した。

ボラーの緩衝液中のp60−11蛋白質100μｌ（濃度約２
μg/ml）を96ウエルプレート（コスター（Costar）3590
EIA）の各ウエルに加えた。一晩の室温でのインキユベ
ーシヨンの間に吸着が起つた。ダルベツコ（Dulbecco'
s）PBS（8g/l NaCl、0.2g/l KCl、0.2g/l KH₂PO₄、およ
び1.14g/l Na₂HPO₄；得られたpHは7.3〜7.4であつた）3
00μｌで該ウエルを３度洗浄した。プラスチツク表面上
の未反応部位を２時間の37℃でのインキユベーシヨン間
にダルベツコPBS（ウエル当たり200μｌ）中の３％BSA
で中和した。ひき続いて、ダルベツコのPBS300μｌで各
ウエルを１回洗浄した。次いで吸着した抗原を希釈した
（PRVに暴露したブタから得た）血清100μｌ中の抗体と
反応させ、４℃で一晩インキユベートした。ダルベツコ
のPBS（300ml/ウエル）で３回洗浄することによつて未
反応抗体を除去した。次いで蛋白質Ａ−西洋ワサビペル
オキシダーゼ接合体（マウス血清には1/800およびブタ
血清には1/15000に希釈;50mMトリス、0.05％ツイーン
（Tween）−20、１％BSA、0.02％NaN₃中に希釈、pH8.
0）100mlを２時間の37℃でのインキユベーシヨン中に各
ウエルに加えた。再度該ウエルをダルベツコのPBS（300
ml/ウエル）で３回洗浄した。基質溶液100μｌを各ウエ
ルに加えた。（あらかじめCH₃OH 0.5ml中に溶解した）
ｏ−フエニレンジアミン100mgおよび30％（w/v）H₂O₂ 2
5μｌを緩衝液（NaOHでpH6.3に調整した17mMクエン酸、
65mMリン酸塩および0.01％マーシオレート）49.5μｌに
加えることによつてこの溶液を調製した。酵素反応は室
温で10分間継続し、その後4.5M H₂SO₄ 100μｌを各ウ
エルに加えた。タイターテツク・マルチスカン（Titert
ek Multiskan）を用いて発色団の吸光度を492ナノメー
ターで測定した。

5.鼻綿球からのウイルスの単離ブタから収集した鼻綿球を３％胎児ウシ血清（FBS）
および抗生物質を補足したイーグルの基礎培地（BME;エ
ム・エイ・バイオプロダクツ（M.A.Bioproducts））1ml
中に各々置いた。ウイルスの存在についてアツセイを行
うまで綿球を−70℃で保存した。ウイルス単離アツセイ
については、BME中の鼻綿球を解かし、個々の綿球を捨
てた。試料（0.1ml）をブタ腎臓（PK−15;ATCC CCL33）
細胞単層上でｎ＝２で接種し、37℃にて１時間インキユ
ベートしてウイルスを吸着させる。４％FBS、抗生物
質、および１％寒天を補足した培地−199（フロウ・ラ
ボラトリーズ（Flow Laboratories））の重層を該細胞
培養物上に置いた。３日後、細胞単層をニユートラルレ
ツドで染色し、プラークを数えた。

6.マウス研究についての実験計画各株の50％致死量（LD₅₀）を決定することによつて４
種のPRV株の毒性をマウスにおいて評価した。４種のPRV
株は１）野生型（ライス（Rice）株）、２）DT−Ａ、
３）DT−Ｂ、および４）HRであつた。各ウイルス株をマ
ウスの５つまたは６つの群（マウス10匹／群）に種々の
投与量で投与した。マウスを足肉趾経路により各ウイル
ス50μｌでインキユベートした（第０日）。ウイルスの
投与の14日後（第14日）にLD₅₀の決定を行い、各ウイル
スの最高投与量を与えられた群の生存するマウスから血
清を得た。スペアマン−カーバー（Spearman−Karber）
法によつて各ウイルス株についてのLD₅₀を計算した。

第14日に、PRVライス（Rice）株について（腹腔内経
路で決定した）LD₅₀の約10倍量（10LD50＝5.4×10²pfu/
マウス）にて、LD₅₀毒性試験から生き残つたマウスをPR
Vライス（Rice）株で腹腔内攻撃した。該試験は攻撃の1
4日後（第28日）に結果を得た。

7.ブタの実験についての実験計画第０日にDT−Ｂ株（約1.5×10⁷pfu/ブタ）2ml、製造
者によつて推奨された如きノルデン（Norden）生ワクチ
ン（PR−Vac）2ml、または食塩水をブタに筋肉内注射し
た。第20日に、ビルレントPRV（ライス（Rice）株）のL
D₅₀の約40倍量（40 LD50）＝1.1×10⁵pfu/ブタ）で全て
のブタを攻撃した。該実験は第34日に終了した。

第１日、第20日および第34日に血清試料を得、各ブタ
の体重を測った。第19日ないし第34日に鼻綿球を毎日採
取した。

8.有効性評価の基準 PRV DT−Ｂ株（tk^-gX^-）のワクチンとしての有効性を
PRV誘発死に対する防御およびPRV DT−Ｂ処理ブタと野
生型ウイルスに暴露したブタとを血清学的に区別する能
力に基づいて評価した。

第１表は各LD₅₀の決定の見地からマウスの４種のPRV
株の相対的毒性を示す。野生型株およびDT−Ａに比して
DT−ＢおよびHRは大いに低い毒性を有し、少くとも1/10
00以下の毒性である。

ひき続いて第14日に、各種PRV株の投与に対して生き
残つたマウスをLD₅₀の10倍（5.4×10²pfu/マウス）の投
与量にてビルレント野生型PRVでの腹腔内経路によつて
攻撃した。第２表に示す如く、１×10³pfuまたはそれ以
上のDT−Ｂの投与量を与えられたマウスおよび2.3×10³
pfuまたはそれ以上のHRの投与量を与えられたマウスは
ビルレント野生型PRVの攻撃から防御された。加えて、D
T−Ｂを与えられたマウスから攻撃に先立つて採取した
血清は高力価の中和抗体（中和力価＝1024）を含有して
おり、一方、エライサデータに基づくとgX抗原決定基と
の反応は相対的に有意ではなかつた（ELISA吸光度＝0.0
5）。HRを与えられたマウスから攻撃に先立つて採取し
た血清は高力価の中和抗体（中和力価＝2048）を含有し
ており、一方gX抗原決定基との反応は十分であつた（EL
ISA吸光度＝0.60）。

PRV DT−Ｂ株の防御効果および診断的関係を評価する
ために、第０日に筋肉内経路によりDT−Ｂ、ノルデン
（Norden）生ワクチン（PR−Vac）または食塩水をブタ
に接種し、第14日に野生型ライス（Rice）株で鼻腔内攻
撃した。第３表に示す結果により、有意な中和抗体応答
を惹起することおよびビルレントライス（Rice）株の攻
撃からの防御を提供することにおいて、DT−Ｂ株はノル
デン（Norden）生ワクラン（PR−Vac）に匹敵すること
が証明される。gX融合蛋白質を用いてELISA法から得ら
れたデータにより、野生型ライス（Rice）株への暴露に
対して生き残つた回復期のブタから採取した血清はgXに
対する抗体を有するがDT−Ｂで免疫化したブタはgXに対
する抗体を有さないことが示唆される。この実験におい
てノルデン（Norden）生ワクラン（PR−Vac）を与えら
れたブタから採取した血清はgX抗原決定基と統計的に有
意な程度（ｐ＞0.05）に反応しなかつたが、従来の研究
に基づくと、ノルデン（Norden）株はgXをコード付けす
る遺伝子を有しているのでノルデン（Norden）生ワクラ
ン（PR−Vac）を与えられたブタはgXに対する抗体を形
成するかも知れない。従つて、ノルデン（Norden）生ワ
クチン（PR−Vac）でワクチン接種したブタから採取し
た血清はgX抗原決定基との反応性の点で異なるかも知れ
ない。

食塩水で処理したブタはほとんどの場合死に至るまで
継続的にウイルスを放出したが、DT−Ｂとノルデン（No
rden）生ワクチンで処理したブタは攻撃後ウイルスを散
発的に放出した。DT−Ｂで処理した１頭のブタおよびノ
ルデン（Norden）生ワクチン（PR−Vac）で処理した１
頭のブタの鼻分泌物中でウイルスは検出されなかつた。
これらの結果よりワクチン接種したブタはワクチン接種
しないブタと同じくらい容易にはウイルスを放出しない
ことが示唆される。

DT−Ｂで処理したブタの（攻撃に先立つ）第20日にお
ける平均体重は食塩水で処理した対照ブタの平均体重と
有意には差がなく（ｐ＞0.05）、DT−Ｂでのワクチン接
種は逆にブタの発育に影響を及さないことが示される。

これらの結果よりDT−ＢはビルレントPRV攻撃からブ
タを防御し、ワクチン接種したブタと以前にビルレント
PRVに暴露されて回復期にあるブタとの血清学的区別を
可能とすることが示される。DT−Ｂは処理したブタの発
育を低下させなかつた。加えて、マウスにおける毒性試
験によりDT−Ｂはブタ以外の種においてtk⁺PRVよりも弱
い毒性であることが証明された。

実施例３実施例２に示したのと実質的に同一の方法に従つて、
本発明者らはPRVのDT−Ｃ株についても同様の実験を行
つた。DT−ＣはPRV tk遺伝子について欠失を有し、それ
故に本発明の好ましい具体例である。これらの実験の結
果を第４表〜第８表に示す。第４表と第８表はブタ、ヒ
ツジ、およびウシにおいてDT−Ｃの低減化された毒性を
示す。第５表と第６表はDT−Ｃの防御能力を示す。第７
表はブタにおけるDT−Ｃについて投与量の滴定を示す。

本発明のもう１つの態様において、本発明のgX^-tk^-PR
Vと該野生における野生型PRV間の理論的に可能な組換え
からgX^-tk⁺ビルレントPRVが生じないことを保証するた
めに、さらにgX^-tk^-PRVを作成する。前記で示した一般
法に従うことにより、そのもとの座のPRVgp50遺伝子に
おいて欠失を作成し、gp50遺伝子のコピーを密接リンケ
ージ中に挿入するかまたはtk遺伝子内部に挿入する。も
とのgp50遺伝子を欠失するには、フラグメント８（チヤ
ートＤ参照）のPvuII/BamHIフラグメントを用いて前記
の如くマーカー救済実験を行う。産生物ウイルスはgX^-t
k^-であり、tk遺伝子配列の残存体に密接に連結した、あ
るいはその内部にあるgp50遺伝子のコピーを有する。gp
50はウイルスの活性にとつて必要欠くべからざるもので
あるので、組換えから生じるいずれのgX^-ウイルスもgp5
0^-であつて非活性である。従つて、該野生における組換
えによつてgX^-とtk^-の欠失を分離してビルレントgX^-PRV
を産生するのは不可能である。

さらに詳しくは、以下、チヤートＫを参照して、前記
からのｐ△TK−４をSphIとBamHIで消化してtk欠失を含
有するフラグメントを産生し、次いで該フラグメントを
単離する。（フアルマシア（Pharmacia）/PLから入手可
能な）pUC19をBamHIとSphIで消化し、かく産生されたよ
り大きいフラグメントを単離する。次いで、これらの２
個のフラグメントを結び、tk欠失に隣接する単一のSalI
部位を含有するプラスミドpUC△TK4−Ｖを産生する。次
いで、SalIでpUC△TK4−Ｖを切断し、T4 DNAポリメラー
ゼで末端を平滑としてフラグメントＡを産生する。

前記（BamHI7）からのフラグメント８をNdeIで消化
し、それによりgXとgp50遺伝子間を切断し、次いでStuI
で消化し、それによりgp63遺伝子内で切断してgp50遺伝
子を含有するNdeI/StuIフラグメント（フラグメント
Ｂ、約1.8kb）を産生する。これをT4 DNAポリメラーゼ
と共に充填し、次いでフラグメントＡとＢを結んでプラ
スミドｐ△TK4gp50−８を産生する。

プラスミドｐ△TK4gp50−８をHind IIIで切断し、次
いでPRV DNAで共トランスフエクトしてウサギの皮膚細
胞に入れる。得られたウイルスをaraTを含有する選択培
地上で増殖させてチヤートＫ（ｃ）に示す構造を有する
tk^-組換え体を単離する。本発明者らはこのウイルスをP
RV△TKgp50と命名した。

次いで、PRV△TKgp50を前記からのpGXTK3で共トラン
スフエクトし、tk⁺ウイルスをHAT培地中の143細胞上で
選択する。PRV△TKgp50tk⁺（HSV）と命名したこのウイ
ルスはgX^-である。

次に、BamHI 7をこれらの酵素で消化することによつ
て作成したgp63およびgI遺伝子を含有するPvuII/BamHI
フラグメントをサブクローンしてpBR322のPvuII/BamHI
フラグメント中に入れてプラスミドpPR28−１を産生す
る（1986年３月26日出願の同時係属の米国特許出願第84
4113号参照）。プラスミドpPR28−１をPvuIIで切断し、
BamHIリンカーを加え、かく産生されたフラグメントをB
amHIで消化して5kbのPvuII/BamHIフラグメントを変換し
てBamHIフラグメント中に入れる。次いで、このフラグ
メントをクローンして（前記で産生された）pPGX1のBam
HI部位中に入れる。得られたプラスミドをPRV△TKgp50t
k⁺（HSV）で共トランスフエクトする。得られたウイル
スをaraT上の増殖によつてtk^-表現型について選択す
る。選択したウイルスはtk遺伝子の残存部中に挿入され
並びにその正常座から欠失されたgp50遺伝子を有する。
それらもまたgX^-である。従つて、tk⁺gX^-ウイルスを与
える野生ウイルスとのいずれの組換えもgp50遺伝子を欠
くウイルスを産生する。gp50は必要欠くべからざる遺伝
子なので、かかるウイルスは不活性である。

本発明者らの実施例はPRVに関するものであるが、他
のヘルペスウイルスにおいて同様の組換え無しのワクチ
ンウイルスを産生するのに同一の技術が有用であること
は当業者にとつて明らかであろう。一般に、該工程は
１）無毒性を与える突然変異に隣接する必要欠くべから
ざる遺伝子の挿入、および２）分泌蛋白質についての欠
失した遺伝子に連結したその正常座からのその必要欠く
べからざる遺伝子の欠失を包含する。さらに一般には、
それらの正常位置から必要欠くべからざる遺伝子を移動
させることにより野生型ウイルスとの組換えの確率が低
下されよう。gXを欠くPRVを組立てるには選択可能な標
識の挿入は必ずしも必要とされない。例えば、gXコーデ
イング領域において欠失を含むプラスミドはgX遺伝子内
から塩基対BamHIフラグメントを欠失することによつて
作成できる。次いで、このプラスミドをPRV DNAで共ト
ランスフエクトし、ひき続いて核酸交雑によるDNAの欠
失片のいずれかの欠損についてそのトランスフエクシヨ
ンに由来するウイルスをスクリーニングするか、あるい
は抗体スクリーンによるgXの欠損についてスクリーニン
グする（ホランドら（Holland、et al.）、ジヤーナル
・オブ・バイロロジー（J.Virol.）、46、649〜52頁（1
983））。

本発明のワクチンで用いるポリペプチド（例えば、gX
^-）欠失ウイルスは突然変異を誘発しひき続いてポリペ
プチド（例えば、gX）を欠くウイルスについてスクリー
ニングを行う他の技術、あるいはワクチンウイルスを野
生型ウイルスから血清学的に区別させしめる欠失を有す
るウイルスを産生するのに用いられるいずれの他の技術
によつても産生できる。例えば、gX^-PRVを選択すること
はできないが（抗gX抗体はPRVを中和しない）、テイー
・シー・ホランドら（T.C.Holland、et al.）（前掲）
の方法を用いてPRVにおけるgIまたはgIII（ウエイセン
（Wathen）、ジヤーナル・オブ・バイロロジー（J.Viro
l.）、58、173〜78頁（1986））欠失について選択で
き、これは本発明のワクチンにおいて有用である。

tk遺伝子を不活性化するかまたは欠失することによる
弱毒化（タタロブ（Tatarov）、前掲；ポストおよびロ
イツマン（Post and Roizman）、前掲）は好ましい方法
であるが、本発明のgX^-ウイルスは、それによつてウイ
ルスが無毒性とされるがなおその抗原特性を保持する通
常の化学的または物理的不活性化処理に付すことができ
る。これらの不活性化ワクチンは適当なアジユバント、
例えばミヨウバンと共に処方してもよい。各種ワクチン
の調製技術の一般的記載については、ジエイ・アイ・ド
ウフイ（J.I.Duffy）、バクシーン・プレパレイシヨン
・テクニツクス（Vaccine Preparation Techniques）、
ノイエス・デイタ（Noyes Data）社（1980）、およびジ
ー・ダブリユー・ワール（G.W.Warr）、「抗原の調製お
よび免疫の原理」、ジエイ・ジエイ・マルカロニスおよ
びジー・ダブリユー・ワール（J.J.Marchalonis and G.
W.Warr）編、「道具としての抗体−免疫化学の応用」、
21〜58頁、ジヨン・ウイリー・アンド・サンズ（John W
iley ＆ Sons）（1982）を参照。

ビルレントPRVウイルスを動物の組織培養物中で増殖
させて該ウイルスを非病原性、すなわち無毒とすること
ができる。例えば、ひよこ胎児、アヒル胎児、ブタ腎
臓、ブタ精巣、ウシ胎児腎臓、ネコ腎臓、イヌ腎臓およ
びサル腎臓を包含する多種類の組織培養系において、お
よび例えば、マジン・ダービイ（Madin Darby）ウシ腎
臓（MDBK）、およびマジン・ダービイ（Madin Darby）
イヌ腎臓（MDCK）の如き株化細胞系においてPRVを増殖
できる。

PRVの弱毒化は罹患組織培養において十分な数の継代
を用いてウイルスが免疫原生を喪失することなく非病原
性とされる末端希釈継代法を包含する標準的な系列継代
によつて達成できる。

継代時間間隔はウイルスを継代間に十分複製させしめ
るようなものとするべきであり、インキユベーシヨン温
度は好ましくは約30〜38℃である。最適継代時間は用い
る特定のウイルス、培養系および温度に依存する。

最終的なワクチン産生物は罹患動物において免疫応答
を刺激し、しかもなお非病原性であるに十分なアビルレ
ントPRV量を含有させるべきである。罹患動物に投与さ
れるべき推奨滴定量は約10³〜10⁵プラーク形成単位、好
ましくは約10⁴プラーク形成単位である。

本発明のウイルス調製物は水で希釈してその能力を調
整してもよく、デキストロースおよびラクトースの如き
安定剤、または他の無毒性物質を加えてもよい。該ウイ
ルス調製物は、また、貯蔵の目的またはひき続いての液
体ワクチンへの処方用には、例えば凍結乾燥法により乾
燥してもよい。

該ワクチンは筋肉内、静脈内、皮下、気道内および鼻
腔内を包含する種々の経路によつて動物に投与できる。
好ましい投与経路は筋肉内である。

雌ブタのワクチン接種については２回投与法を用いる
ことができる。１回目の投与は分娩の約数ケ月前から約
５ないし７週間前に行うことができる。次いで、ワクチ
ンの２回目の投与は１回目の投与の数週間後、例えば約
２ないし４週間後に行うべきであり、次いでワクチンを
分娩前であつて分娩に至るまでに与えることができる。
別法として、単一の2ml投与量として、例えば分娩の約
５ないし７週間前にワクチンを投与できる。しかし２回
投与法は生後まもないブタの最も効果的な免疫化として
は好ましいものであると考えられている。半年後の再ワ
クチン接種は飼育動物に対して推奨される。雄ブタはい
つ再ワクチン接種してもよい。また、雌ブタは飼育前に
再ワクチン接種することができる。ワクチン接種してい
ない雌ブタから生まれた子ブタは約３日目にワクチン接
種してもよい。

該ワクチンを他の疾患用の他のワクチンと組合せて前
記のいずれの経路によつて投与してもよい多価ワクチン
を生産することができる。それは、また、他の薬剤、例
えば抗生物質と組合せてもよい。

本発明により調製されるワクチンはビルレントウイル
スによつてひき起こされる臨床的徴候をいずれの有意な
程度まで生じさせることなく疾患にかかつた動物におい
て免疫応答を刺激する。該ワクチンの医薬的有効量を医
薬上許容される担体または希釈剤と共に用いてブタ、ウ
シ、ヒツジ、ヤギ、および他の哺乳動物の如き動物をワ
クチン接種できる。

チヤートA.pPRXK4の組立て（ａ）pPRXh1をXhoIとKpnIで消化してフラグメント１
（2.6kb）を得る。

（ｂ）フラグメント１をT4 DNAポリメラーゼで平滑末端
とし、EcoRIリンカーを加える。

（ｃ）pACYC184をEcoRIで消化し、BAPで処理してフラグ
メント２を得る。

（ｄ）フラグメント１と２を結び、pPRXK4を産生する。

Ｘ＝糖蛋白質Ｘ遺伝子 Cm^γ＝クロラムフエニコール耐性遺伝子 Tet^γ＝テトラサイクリン耐性遺伝子 Pgx＝gXプロモーターチヤートB.pPGX1の組立て（ａ）pPRXK4をMstIで消化してフラグメント３（2.1k
b）を得る。

（ｂ）フラグメント３をEcoRIで切断してフラグメント
４（400bp）を産生する。

（ｃ）pUC9をEcoRIとSmaIで消化してフラグメント５
（2.5kb）を得る。

（ｄ）フラグメント４と５を結び、pPGX1を得る。

チヤートC.pGXTK2の組立て（ａ）pPGX1をBamHIで消化し、BAPで処理してフラグメ
ント６を得る。

（ｂ）pRB103をBamHIとBglIIで消化してフラグメント７
（2.9kb）を産生する。

（ｃ）フラグメント６と７を結び、pGXTK2を産生する。

Ptk＝チミジン・キナーゼ・プロモーターｔ＝チミジン・キナーゼ遺伝子チヤートD.pGXTK3の組立て（ａ）pPRXh1をBamHIで消化してフラグメント８（6.9k
b）を産生する。

（ｂ）pGXTK2をBamHIで消化し、BAPで処理してフラグメ
ント９を得る。

（ｃ）フラグメント８と９を結び、pGXTK3を産生する。

gX−Ct＝gX遺伝子のＣ末端コーデイング領域 50＝糖蛋白質50遺伝子 63＝糖蛋白質63遺伝子Ｉ＝糖蛋白質Ｉ遺伝子チヤートE.pGXTK3およびtk^-PRVとの共トランスフエクシ
ヨン（ａ）pGXTK3とtk^-gX^-PRVの共トランスフエクシヨンに
よりtk⁺gX^-産生物PRV△gX1（またはDT−Ａ）を産生す
る。

チヤートF.p△GXB7の組立て（ａ）pPGX1をBamHIで消化し、BAPで処理してフラグメ
ント６を得る。

（ｂ）pPRXh1をBamHIで消化してフラグメント８（6.9k
b）を産生する。

（ｃ）フラグメント６と８を結び、プラスミドｐ△GXB7
を産生する。

チヤートG.組換えによるPRV△GXTK^-の組立て（ａ）PRV△GX1とｐ△GXB7の共トランスフエクシヨンお
よび組換えによりPRV△GXTK^-を産生する。

チヤートH.tk欠失プラスミドの組立て（ａ）BamHI 11をクローンしてpBR322に入れてプラスミ
ドpTK11を産生する。

（ｂ）pTK11をXhoIで消化してフラグメント10を産生す
る。

（ｃ）フラグメント10をBal31で消化し、次いで再環化
してtk遺伝子中に種々の長さの欠失を有するプラスミ
ド、例えばｐ△tk−３およびｐ△tk−４を産生する。

tk＝チミジン・キナーゼ遺伝子ｄ＝チミジン・キナーゼ遺伝子中の欠失チヤートI.pGXTPAの組立て（ａ）プラスミドpPSA18をBalIで切断し、BamHIリンカ
ーを加えてフラグメント11を産生する。

（ｂ）フラグメント11をBamHIで消化してフラグメント1
2（1.95kb）を産生する。

（ｃ）プラスミドpPGX1（チヤートＢ）をBamHIで切断し
てフラグメント６を産生する。

（ｄ）フラグメント６と12を結び、プラスミドpGXTPAを
産生する。

tp＝組織プラスミノーゲンアクチベーター遺伝子Ｌ＝BamHIリンカーチヤートJ.プラスミドpGXTPA−B7の組立て（ａ）プラスミドpGXTPAをHind IIIで消化してフラグメ
ント13を産生する。

（ｂ）Hind IIIリンカーをフラグメント８（チヤート
Ｄ）に加えてフラグメント14を産生する。

（ｃ）次いでフラグメント13と14を一緒に結びpGXTPA−
B7を産生する。

HL＝Hind IIIリンカーチヤートK.組換え無しのウイルスの産生

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/569 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ウイルスDNAが改変または欠失された結
果、複製に際して、糖蛋白質Ｘ（gX）を産生しない天然
に存在しない偽狂犬病ウイルスからなるワクチン。
【請求項２】該ウイルスが機能的チミジンキナーゼを産
生しない請求の範囲第１項記載のワクチン。
【請求項３】該ウイルスがgX遺伝子における欠失、挿入
または欠失および挿入の双方の結果、gXを産生しない請
求の範囲第１項記載のワクチン。
【請求項４】該ウイルスが機能的チミジンキナーゼを産
生しない請求の範囲第３項記載のワクチン。
【請求項５】gX遺伝子において欠失を有する請求の範囲
第３項記載のワクチン。
【請求項６】該ウイルスが機能的チミジンキナーゼを産
生しない請求の範囲第５項記載のワクチン。
【請求項７】gX遺伝子において挿入を有する請求の範囲
第３項記載のワクチン。
【請求項８】該ウイルスが機能的チミジンキナーゼを産
生しない請求の範囲第７項記載のワクチン。
【請求項９】ウイルスDNAが改変または欠失された結
果、複製に際して、糖蛋白質Ｘ（gX）を産生しない天然
に存在しない偽狂犬病ウイルス。
【請求項１０】該ウイルスがgX遺伝子における欠失、挿
入または欠失および挿入の双方の結果、gXを産生しない
請求の範囲第９項記載の偽狂犬病ウイルス。
【請求項１１】gX遺伝子において欠失を有する請求の範
囲第10項記載の偽狂犬病ウイルス。
【請求項１２】gX遺伝子において挿入を有する請求の範
囲第10項記載の偽狂犬病ウイルス。
【請求項１３】該ウイルスが、gX遺伝子における挿入を
有し、機能的チミジンキナーゼを産生しない請求の範囲
第９項記載の偽狂犬病ウイルス。
【請求項１４】該ウイルスが、gX遺伝子における挿入を
有し、機能的チミジンキナーゼを産生しない請求の範囲
第10項記載の偽狂犬病ウイルス。
【請求項１５】該ウイルスが、gX遺伝子における挿入を
有し、機能的チミジンキナーゼを産生しない請求の範囲
第11項記載の偽狂犬病ウイルス。
【請求項１６】該ウイルスが、gX遺伝子における挿入を
有し、機能的チミジンキナーゼを産生しない請求の範囲
第12項記載の偽狂犬病ウイルス。
【請求項１７】糖蛋白質Ｘについてコード付けする遺伝
子内に、免疫応答を生起できる異種ポリペプチドをコー
ド付けできるDNA配列が挿入された、適当に不活性化さ
れた偽狂犬病ウイルスから成る多価ワクチン。
【請求項１８】免疫応答を生起できる該ポリペプチドが
伝播性胃腸炎ウイルスまたはブタパルボウイルスからの
ポリペプチドより成る群から選択される請求の範囲第17
項記載のワクチン。