JP2810364B2 - 偽狂犬病ウイルス蛋白質 - Google Patents
偽狂犬病ウイルス蛋白質Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は偽狂犬病ウイルス糖蛋白質およびそれに関連
するポリペプチドをコード付けするDNA配列に関する。
これらのDNA配列は動物がPRVに感染しているかどうかを
決定する動物のスクリーニング、およびそれによつてコ
ード付けされた糖蛋白質の発現にも有用である。 発明の背景 偽狂犬病ウイルス（PRV）は世界的に多くの種の動物
に感染する病気である。PRVは種々に呼ばれる感染性延
髄麻痺、アウジエスキー病、および仮性恐水病である。
感染はブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ラツトおよび
ミンクの如き重要な家畜において知られている。宿主の
範囲は非常に広く、ほとんどの哺乳動物および、実験的
には少くとも多種類の鳥類を包含する〔宿主の詳細なリ
ストについては、デイ・ピイ・グスタフソン（D.P.Gust
afson）、「シウドラビエス（Pseudorabies）」、デイ
ジージズ・オブ・スワイン（Diseases of Swine）、第
５版、エイ・デイ・レマンら（A.D.Leman et al.）編
（1981）参照）。感染したほとんどの動物について該病
気は致命的なものである。しかし、成熟したブタおよび
恐らくラツトは該病気によつて殺されることはなく、従
つてキヤリアである。 ブタの集団は特にPRVに罹り易い。成熟したブタはま
れにしか徴候を示さずまたは該病気により死なないが、
子ブタは感染すると急性の病気になり、その結果、特異
的な臨床的様相なくして24ないし48時間のうちに通常死
んでしまう（テイ・シイ・ジヨーンズおよびアール・デ
イ・ハント（T.C.Jones and R.D.Hunt）、ベテリナリ・
パソロジー（Veterinary Pathology）、第５版、リー
・アンド・フエビガー（Lea ＆ Febiger）（1983））。 PRVワクチンが多種類の技術によつて生産されてきた
し、ヨーロツパの流行地においてはワクチン接種が15年
以上の間、行われてきた。ワクチン接種によつて損失は
減少されてきたが、ワクチン接種は環境中に該ウイルス
を維持しつづけてきた。感染を防止するワクチンは生産
されたことがない。ビルレントウイルスに暴露された、
ワクチン接種した動物は感染しても生き残り、次いでよ
り多くのビルレントウイルスを放出する。従つてワクチ
ン接種した動物は再び突発する可能性がある潜伏感染を
有しうる（デイ・ピイ・グスタフソン（D.P.Gustafso
n）、前掲参照）。 PRV用の生弱毒化ワクチンおよび不活性化ワクチンは
米国で商業的に入手可能であり、USDAにより認可されて
きた（シイ・イー・アロンソン（C.E.Aronson）編、ベ
テリナリ・フアルマシユーテイカルズ・アンド・バイオ
ロジカルズ（Veterinary Pharmaceuticals ＆ Biologi
cals）、（1983）参照）。 成熟したブタはPRVのキヤリアであるので、多くの州
は感染した動物を検知するスクリーニングプログラムを
制定してきた。本発明のDNA配列を利用し、DNA/DNA交雑
を用いて能動的に感染した動物を診断できる。本発明の
PRV糖蛋白質のいくつかは、また、PRV感染についての特
殊症状をつくりだすのに有用であり、また、PRVに対す
るワクチンを産生するのに有用である。 PRVはヘルペスウイルスである。ヘルペスウイルスは
一般に最も複雑な動物ウイルスの１つである。そのゲノ
ムは少くとも50個のウイルスの特異的蛋白質をコード付
けし、150000個までのヌクレオチドを含有する。最も免
疫学的に反応生であるヘルペスウイルス蛋白質のなかに
は、他の場所のうちでもとりわけウイルス粒子膜および
感染した細胞の膜中で見い出された糖蛋白質がある。PR
V糖蛋白質に関する文献は少くとも４つのウイルス糖蛋
白質に言及している（テイ・ベン−ポラートおよびエイ
・エス・カプラン（T.Ben−Porat and A.S.Kaplan）、
バイロロジー（Virology）、41、265〜73頁、（197
0）；エイ・エス・カプランおよびテイ・ベン−ポラー
ト（A.S.Kaplan and T.Ben−Porat）、プロシーデイン
グス・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、66、799〜806頁（19
70））。 情報の開示 エム・ダブリユー・ウエイセンおよびエル・ケイ・ウ
エイセン（M.W.Wathen and L.K.Wathen）、ジヤーナル
・オブ・バイロロジー（J.Virol.）、51、57〜62頁（19
84）はウイルス糖蛋白質（gp50）中に突然変異を含有す
るPRVおよびgp50に対して定方向化された単クローン抗
体を中和することを利用して該突然変異体を選択する方
法に言及している。ウエイセンおよびウエイセン（Wath
en and Wathen）は、また、gp50に対して定方向化され
た単クローン抗体は補体の助けをかりてまたはそれない
で強力なPRVの中和剤であること、および多価免疫血清
はgp50に対して大いに反応性であることを示し、従つて
gp50は重要なPRV免疫原の１つであり得ると結論してい
る。他方、98000MWエンベロープ糖蛋白質と反応する単
クローン抗体はPRV伝染性を中和するが、他の膜糖蛋白
質のいくつかに対して定方向化された単クローン抗体は
中和活性をほとんど持たないことが報告されている（エ
イチ・ハンプルら（H.Hampl et al.）、ジヤーナル・オ
ブ・バイロロジー（J.Virol.）、52、583〜90頁（198
4）；およびテイ・ベン−ポラートおよびエイ・エス・
カプラン（T.Ben−Porat and A.S.Kaplan）、「偽狂犬
病ウイルスの分子生物学」、ビイ・ロイツマン（B.Roiz
man）編、ザ・ヘルペスバイアラシズ（The Herpesvirus
es）、３、105〜73頁（1984））。 エル・エム・ケイ・ウエイセンら（L.M.K.Wathen et
al.）、バイアラス・リサーチ（Virus Research）、
４、19〜29頁（1985）はgp50およびgp83と同定されたPR
V糖蛋白質に対して定方向化された単クローン抗体の産
生および特徴づけならびにマウスをPRV感染に対して受
動的に免疫とするその使用について言及している。 エイ・ケイ・ロビンズら（A.K.Robbins et al.）、
「イー・コリ（E.coli）発現プラスミドライブラリーを
用いる偽狂犬病ウイルス糖蛋白質の位置決め」ヘルペス
バイアラス（Herpesvirus）、551〜61頁（1984）はPRV
DNAを含有するイー・コリ（E.coli）プラスミドのラ
イブラリーの組立てについて言及している。彼等は7400
0および92000MWの糖蛋白質をコード付けするPRV遺伝子
の同定についても言及している。彼等は本明細書中に記
載する糖蛋白質については言及していない。 エン・ケイ・ロビンズら（A.K.Robbins et al.）、ヨ
ーロツパ特許出願85400704.4号（公開番号0163738）はg
IIおよびg IIIとして同定されるPRV糖蛋白質の単離、
クローニングおよび発現について言及している。彼等は
本明細書中に記載するPRV糖蛋白質については言及して
いない。 テイ・シイ・メテンライターら（T.C.Mettenleiter e
t al.）、「偽狂犬病ウイルス糖蛋白質Ａの構造遺伝子
のマツピングおよび２種の非グルコシル化前駆体ポリペ
プチドの同定」、ジヤーナル・オブ・バイロロジー（J.
Virol.）、53、52〜57頁（1985）はPRV DNAのBamH I7
フラグメントに対する糖蛋白質gA（これはg Iに一致す
る）のコーデイング領域のマツピングについて言及して
いる。彼等は、また、BamH I7フラグメンオが少くとも
３種の他の65K、60K、および40KMWのウイルス蛋白質を
コード付けすることを述べている。彼等は本発明の糖蛋
白質をコード付けするDNA配列または組換体DNA法による
かかるポリペプチドの産生を開示もしくは示唆していな
い。 ビイ・ロムニクツイら（B.Lomniczi、et al.）、「偽
狂犬病ウイルスワクチン株のゲノムにおける欠失および
該ゲノムの４種異性体の存在」、ジヤーナル・オブ・バ
イロロジー（J.Virol.）,49,970〜79頁（1984）は0.855
および0.882図単位間のユニークな短配列中に欠失を有
するPRVワクチン株について言及している。これはg I遺
伝子の近傍においてである。テイ・シイ・メテンライタ
ーら（T.C.Mettenleiter et al.）、「偽狂犬病ウイル
スのアビルレント株は主要糖蛋白質を発現しない」、ジ
ヤーナル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）、56、307
〜11頁（1985）は、３種の市販PRVワクチン株が糖蛋白
質g Iを欠くことを証明した。発明者らは、また、バル
サ（Bartha）ワクチン株はgp63遺伝子のほとんどについ
て欠失を含有することを最近見い出した。 テイ・ジエイ・リーら（T.J.Rea et al.）、ジヤーナ
ル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）54、21〜29頁（19
85）は感染した細胞の培地中に蓄積するPRV糖蛋白質に
ついての遺伝子（gx）のマツピングおよび配列について
言及している。そこに示されているgX遺伝子のフランキ
ング配列のなかには、第６図の塩基1682で特異的に開始
するgp50配列が少しの割合で包含される。しかし、この
配列はgp50配列として同定されていない。さらに、リー
ら（Rea et al.）によつて公開された配列中には誤りが
ある。塩基1586および1603は欠失されているべきであ
る。塩基1708および1709、塩基1737および1738、塩基17
43および1744ならびに塩基1753および1754間に塩基が挿
入されているべきである。公開されたgp50についての部
分配列におけるこれらの誤りの結果、フレームシフトと
なる。AUG開始部位に始まるオープンリーデイングフレ
ームの翻訳はgp50糖蛋白質について誤つたアミノ酸配列
を与えるであろう。 ヨーロツパ公開特許出願0133200号はPRVのキヤリアお
よび非キヤリアを識別するのにある種のレクチン−結合
PRV糖蛋白質サブユニツトワクチンと一緒に用いる診断
抗原フアクターについて言及している。 発明の要約 本発明はPRV糖蛋白質抗原性を示す糖蛋白質をコード
付けするDNA配列よりなる組換体DNA分子を提供するもの
である。 また、本明細書中に、チヤートＡ、Ｂ、およびＣに記
載されたDNA配列ならびにそのフラグメントよりなる本
発明の組換体DNA分子で形質転換した宿主細胞を記載す
る。 また、本明細書中に、チヤートＡ、Ｂ、およびＣに記
載された式のDNA配列よりなる組換体DNA分子、および免
疫学的機能均等物ならびにポリペプチドの免疫原フラグ
メントおよび誘導体で形質転換した宿主によつて発現さ
れるポリペプチドを記載する。 また、本明細書中には、チヤートＡ、Ｂ、およびＣに
記載された式を有するポリペプチド、その免疫原フラグ
メントおよびその免疫学的機能均等物を記載する。 また、本発明は偽狂犬病ウイルス糖蛋白質gp50、gp6
3、g Iまたは発現制御配列に作動可能に連結したその免
疫原フラグメントをコード付けするDNA配列よりなる組
換体DNA分子を提供するものである。 また、本明細書中は、gp50およびgp63よりなるワクチ
ンならびにこれらのポリペプチドで動物をワクチン接種
することによる動物をPRV感染から保護する方法を記載
する。 発明の詳説 PRVの糖蛋白質gpをコード付けする遺伝子の存在およ
び位置決定はエム・ダブリユー・ウエイセンおよびエル
・エム・ウエイセン（M.W.Wathen and L.M.Wathen）、
前掲によつて示された。 該遺伝子によつてコード付けされる糖蛋白質は特定の
単クローン抗体と反応する糖蛋白質と定義された。この
糖蛋白質は以前に知られたPRV糖蛋白質のいずれにも対
応しなかつた。ウエイセンおよびウエイセン（Wathen a
nd Wathen）は単クローン抗体に対して耐性の突然変異
をマツプしたが、それは単純疱疹ウイルスにおける慣行
に基づいて（例えば、テイ・シイ・ホランドら（T.C.Ho
lland et al.）、ジヤーナル・オブ・バイロロジー（J.
Virol.）、52、566〜74頁（1984））、gp50についての
構造遺伝子の位置をマツプするものである。ウエイセン
およびウエイセン（Wathen and Wathen）はPRVのBamH I
7フラグメント内からのより小さいSa1 I/BamH Iフラグ
メントに対するgp50遺伝子をマツプした。リーら（Rea
et al.）、前掲は同一領域に対するPRV糖蛋白質gX遺伝
子をマツプした。 PRVgp63およびg I遺伝子はバクテリオフアージ発現ベ
クターλgt11中で組立てられたPRV DNAライブラリーを
スクリーニングすることによつて単離された（ジエイ・
ジイ・テイミンズら（J.G.Timmins et al.）、「フアー
ジλgt IIライブラリーからの効果的な遺伝子単離法：
変性した、アセトン沈殿蛋白質に対する抗血清の使
用」、ジーン（Gene）、39、89〜93頁（1985）；アール
・エイ・ヤングおよびアール・ダブリユー・デイビス
（R.A.Young and R.W.Davis）、プロシーデイングズ・
オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、80、1194〜98頁（198
3）；アール・エイ・ヤングおよびアール・ダブリユー
・デイビス（R.A.Young and R.W.Davis），サイエンス
（Science）、222、778〜82頁（1983））。 最初パードウ（Purdue）大学のデイ・ピイ・グスタフ
ソン（D.P.Gustafson）から入手したPRVライス（Rice）
株由来のPRVゲノムDNAをPRV感染ベロ（Vero）細胞（ATC
C CCL 81）の細胞質から単離した。ゲノムDNAを超音
波処理によつてフラグメント化し、次いでクローンして
λgt11に入れてλ/PRV組換体（λPRV）DNAライブラリー
を得た。 λPRVライブラリーをスクリーニングするための抗血
清はSDSゲル上でサイズにより分離したPRVで感染した細
胞（感染した細胞蛋白質またはICP）から単離した蛋白
質でマウスを接種し、次いで抗体を単離することによつ
て得た。スクリーニングされるべきλPRV フアージはl
acZ遺伝子の３′末端におけるユニークなクローニング
部位を含有するイー・コリ（E.coli.）λgt11のリンネ
ル布上で平板培養した。このユニーク部位に適当な配位
で挿入された外来性DNAおよび解読フレームは、発現に
際し、β−ガラクトシダーゼに融合したポリペプチドを
産生する。PRV DNAの発現を促進するlacZ転写の誘発物
質を含有するニトロセルロースフイルターを該リンネル
布の頂部上に置いた。λPRVによつて発現された融合ポ
リペプチドにニトロセルロースフイルターと結合するの
に十分な時間を与えた後、該フイルターをリンネル布か
ら取り除き、マウス抗血清でプローブした。マウス抗血
清に結合した抗原を産生するプラークをマウス抗血清に
ついてのラベル抗体でプローブすることによつて同定し
た。 陽性信号を与えるプラークを用いてイー・コリ（E.co
li）宿主を形質転換した（Y1090、ATCC、ロツクビル（R
ockville）、メリーランド州20852より入手可能）。次
いで、培養物を一晩インキユベートしてλPRV フアー
ジ株を得た。これらのフアージ株を用いてイー・コリ
（E.coli）K95を感染した（デイ・フリードマン（D.Fri
edman）、ザ・バクテリオフアージ・ランブダ（The Bac
teriophage Lambda）、733〜38頁、エイ・デイ・ハーシ
エイ（A.D.Hershey）編、（1971）。形質転換されたイ
ー・コリ（E.coli）K95によつて産生されたポリペプチ
ドを予備ゲル電気泳動によつて精製した。（lacZ遺伝子
の転写の誘導のため）過剰産生された、116000ダルトン
以上の分子量を有し、またλgt11対照培養物中に存在し
ないポリペプチドはβ−ガラクトシダーゼ−PRV融合蛋
白質であつた。次いで、各個々の融合蛋白質を異なるマ
ウスに注射して抗血清を得た。 例えば14C−グルコサミンを含有する培地中で増殖す
るベロ（Vero）細胞を感染することによつて標識PRV I
CPを得た（テイ・ジエイ・リーら（T.J.Rea et al.）、
前掲）。前記からの融合蛋白質抗血清を用いてこれらの
標識ICPを免疫沈降した。かく沈降したポリペプドをゲ
ル電気泳動によつて分析した。それらのうちの１つは11
0kd MW糖蛋白質（g I）およびもう１つは63Kd MW糖蛋白
質（gp63）であつた。かくして抗−g Iおよび抗−gp63
血清を生ぜしめるハイブリツド蛋白質を産生するフアー
ジ中でクローンされた遺伝子はg Iおよびgp63であるこ
とが示された。gp50配列がそうである如く（チヤートＤ
参照）、これらの遺伝子はPRVゲノムのBamH I7フラグメ
ント内部にマツプされることが判明した（テイ・ジエイ
・リーら（T.J.Rea et al.、前掲）。g Iの位置は、一
般に、メテンライターら（Mettenleiter et al.）、前
掲がg I遺伝子をマツプした領域に一致している。しか
し、メテンライターらMettenleiter et al.）は、実際
はそうではないがg I遺伝子がBamH I12フラグメント中
まで伸びることを示した。 DNA交雑および選択されたmRNAのin vitro翻訳に比し
てこのλPRV遺伝子単離法は迅速でありかつ効果的であ
る。精製された糖蛋白質が入手不可能であつたので、発
明者らはアミノ酸配列データからオリゴヌクレオチドプ
ローブを急速に組立てることができず、また高度に特異
的な多クローン抗血清を生成させることもできなかつ
た。従つて、発明者らは前記の方法を用いた。 前記した如く、gp50、gp63およびg Iをコード付けす
る遺伝子をPRV DNAのBamH I7フラグメントに対してマ
ツプした。PRVからのBamH I7ラグメントは（PUC1129と
しても公知の）プラスミドpPRXh1から得ることができ、
DNA配列分析に便利なフラグメントは標準的な継代クロ
ーニング法によつて得ることができる。プラスミドpUC1
129はイー・コリ（E.coli）HB101、NRR1 Ｂ−15772か
ら入手可能である。この培養物はノーザン・リージヨナ
ル・リサーチ・センター・フアーメンテイシヨン・ラボ
ラトリー（NRRL）、米国農務省、ペオリア（Peoria）、
イリノイ州、米国の永久寄託から入手可能である。 pUC1129を含有するイー・コリ（E.coli）HB101はよく
知られた方法によつてＬ−ブロス中で増殖させることが
できる。典型的には、培養物は0.6の光学密度まで増殖
させ、その後クロラムフエニコールを添加し、培養物を
一晩振盪する。次いで、例えば高濃度塩SDSを用いて培
養物を溶解し、上澄みを塩化セシウム／臭化エチジウム
平衡密度勾配遠心分離に付してプラスミドを得る。 これらの遺伝子配列の利用により該遺伝子および遺伝
子配列の直接操作が可能となり、それにより該遺伝子ま
たはそのフラグメントによつてコード付けされる蛋白質
の発現の調節および／または該蛋白質の構造の修飾が可
能となる。これらの遺伝子配列の知見により、交雑プロ
ーブとして公知の配列を用いてPRVのいずれの株からの
対応する遺伝子またはそのフラグメントをもクローンす
ること、ならびに一般に当該分野において公知の組換体
技術によつて完全な蛋白質またはそのフラグメントを発
現することが可能となる。 これらの遺伝子配列の知見により、発明者らは、対応
するポリペプチドのアミノ酸配列を推断することがてき
た（チヤートＡ〜Ｃ）。その結果、PRV免疫原性を有す
るこれらのポリペプチドのフラグメントは蛋白質合成の
標準法または組換体DNA法によつて産生できる。ここで
用いる如く、免疫原性および抗原性は適応免疫応答のい
ずれのタイプも刺激する能力について言及するのに相互
交換的に用いることができる。すなわち、抗原および抗
原性は抗体の産生を刺激する物質を意味することに限定
されない。 gp50、gp63およびg Iについてコード付けする遺伝子
の一次構造（配列）もチヤートＡ〜Ｃに記載する。 遺伝子またはそのフラグメントはNRRL Ｂ−15772の
培養物からのプラスミドDNAを適当なエンドヌクレアー
ゼ制限酵素で消化することによつてpUC1129から抽出で
きる。例えば、BamH I7フラグメントはBamH IでのpUC11
29の調製物の消化、およびゲル電気泳動による単離によ
つて単離できる。 本明細書中で言及するすべての制限エンドヌクレアー
ゼは商業的に入手可能であり、それらの使用は当該分野
においてよく知られている。使用のための指図書は、一
般に、制限酵素の販売業者によつて提供される。 切り取られた遺伝子またはそのフラグメントは宿主細
胞を形質転換するのに用いる各種クローニングビヒクル
またはベクターに結べる。好ましくは、該ベクターはPR
V糖蛋白質遺伝子の転写および翻訳（これらは一緒に発
現よりなる）を開始し、制御しおよび停止するDNA配列
を含有し、従つてそれに作動可能に連結している。これ
らの「発現制御配列」は、好ましくは形質転換されるべ
き宿主細胞に適合する。宿主細胞が高等動物細胞、例え
ば哺乳動物細胞である場合、糖蛋白質遺伝子の天然に生
じる発現制御配列を単独で、または異種発現制御配列と
共に使用できる。異種配列は、また、単独で用いること
ができる。該ベクターは、さらに好ましくは、標識遺伝
子（例えば、抗生物質耐性）を含有して形質転換宿主細
胞の選択についての表現型特徴を提供する。さらに、複
製ベクターはレプリコンを含有する。 典型的なベクターは動物細胞を感染するプラスミド、
フアージおよびウイルスである。基本的には、宿主細胞
を形質転換することができるいずれのDNA配列も用いる
ことができる。 本明細書中で用いる宿主細胞なる語はPRV糖蛋白質抗
原性を示すポリペプチドについてコード付けするDNA配
列で形質転換され得る細胞を意味する。好ましくは、宿
主細胞はRPVポリペプチドまたはそのフラグメントを発
現することができる。宿主細胞は原核または真核であり
得る。原核細胞の例としてはイー・コリ（E.coli）、ビ
イ・スブチリス（B.subtilis）、シユードモナス（Pseu
domonas）およびビイ・ステアロセルモフイラス（B.ste
arothermophilus）の如き細菌がある。真核細胞の例と
しては酵母または昆虫の細胞の如き高等動物細胞、植物
源もしくは哺乳動物源がある。哺乳動物細胞懸濁液も用
いることができるが、哺乳動物細胞システムはしばしば
細胞の単層の形態である。哺乳動物細胞系は、例えばベ
ロ（VERO）およびヒーラ細胞、チヤイニーズハムスター
卵巣（CHO）細胞系、WI38、BHK、COS−７またはMDCK細
胞系を包含する。昆虫細胞系はスポドプテラ・フルギペ
ルダ（Spodoptera frugiperda）（ATCC CRL1711）を包
含する。いくつかの入手可能な真核プラスミド、宿主細
胞ならびにPRV糖蛋白質をクローンするおよび発現する
ために使用する方法の要約はケイ・エセルら（K.Esser
et al.）、プラスミズ・オブ・エーカリオテス（Plasmi
ds of Eukaryotes）（フアンダメンタルズ・アンド・ア
プリケイシヨンズ（Fundamentals and Application
s））、シユプリンゲル−フエアラーク（Springer−Ver
lag）（1986）中に見い出すことができ、参照のために
ここに挙げる。 前記した如く、ベクター、例えば宿主細胞を形質転換
するのに用いられるプラスミドは、好ましくは、PRV糖
蛋白質遺伝子またはそのフラグメントの発現のための受
容可能な発現制御配列を含有する。従つて、発現制御配
列は遺伝子またはフラグメントに作動可能に連結する。
宿主細胞が細菌である場合、有用な発現制御配列の例は
trpプロモータおよびオペレータ（ゲデルら（Goeddel e
t al.）、ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Nucl.Ac
ids Res.）、８、4057（1980））;lacプロモータおよび
オペレータ（チヤンら（Cahng et al.）、ネイチヤー
（Nature）、275、615（1978））；外部膜蛋白質プロモ
ータ（ユアローピーアン・モレキユラー・バイオロジー
・オーガナイゼイシヨン・ジヤーナル（EMBO J.）、
１、771〜775（1982））；バクテリオフアージλプロモ
ータおよびオペレータ（ヌクレイツク・アシツズ・リサ
ーチ（Nucl.Acids Res.）、11、4677〜4688（198
3））；α−アミラーゼ（ビイ・スブチリス（B.subtili
s））プロモータおよびオペレータ、停止配列および他
の発現エンハンスメントならびに選択された宿主細胞に
適合する制御配列を包含する。宿主細胞が酵母である場
合、有用な発現制御配列の例は、例えばα−交配因子を
包含する。昆虫細胞については、バクロウイルスのポリ
ヘドリンプロモータを用いることができる（モレキユラ
ー・アンド・セリユラー・バイオロジー（Mol.Cell.Bio
l.）、３、2156〜65頁（1983））。宿主細胞が昆虫また
は哺乳動物由来である場合、有用な発現制御配列の例
は、例えばSV−40プロモータ（サイエス（Science）、2
22、524〜527（1983））または例えばメタロチオネイン
プロモータ（ネイチヤー（Nature）、296、39〜42（198
2））または熱シヨツクプロモータ（ボエルミイら（Voe
llmy et al.）、プロシーデイングズ・オブ・ナシヨナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Aca
d.Sci.）USA、82、4949〜53頁（1985））を包含する。
前記した如く、宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、PR
V糖蛋白質遺伝子についての発現制御配列を、好ましく
は異種発現制御配列と組合せて用いることができる。 発現制御配列を含有するプラスミドまたは複製もしく
は取込みDNA物質は制限酵素を用いて切断され、要すれ
ばまたは所望によりサイズを調製し、次いで当該分野で
よく知られた方法によつてPRV糖蛋白質遺伝子またはそ
のフラグメントで結ぶ。酵母または高等動物宿主細胞を
使用する場合、公知の酵母もしくは哺乳動物遺伝子から
のポリアデニレーシヨンもしくはターミネーター配列を
ベクター中に一体化することができる。例えば、ヨーロ
ツパ特許公開番号0093619中に記載されている如くウシ
成長ホルモンポリアデニレーシヨン配列を用いることが
でき、ここに参照のために挙げる。さらに、宿主細胞の
複製を制御するための遺伝子配列をベクター中に一体化
することができる。 宿主細胞は形質転換について受容可能である、あるい
は各種方法によつて受容可能とされる。細菌細胞が宿主
細胞である場合、コーヘン（Cohen）、ピイ・エヌ・エ
イ・エス（PNAS）、69、2110（1972）によつて一般的に
記載されている如く、塩、典型的にはカルシウム塩での
処理によつてそれを受容可能とできる。一般に、酵母宿
主細胞はその細胞壁の除去またはイオン処理の如き他の
方法によつて受容可能とされる（ジヤーナル・オブ・バ
クテリオロジー（J.Bacteriol.）、153、163〜168（198
3））。例えばリン酸カルシウム沈降、DNAを含有する細
菌プロトプラストでの受容体細胞の融合、DNAを含有す
るリポソームでの受容体細胞の処理、およびDNAの細胞
中への直接マイクロインジエクシヨンを包含するいくつ
かのよく知られたDNAの動物細胞中への導入法がある。 形質転換細胞は当該分野でよく知られた方法によつて
増殖し（モレキユラー・クローニング（Molecular Clon
ing）、マニアテイス・テイら（Maniatis T.et al.）、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold
Spring Harbor Laboratory）、（1982）；バイオケミ
カル・メソツズ・イン・セル・カルチヤー・アンド・バ
イロロジー（Biochemical Methods In Cell Culture an
d Virology）、クチラー・アール・ジエイ（Kuchler R.
J.）、ドウデン（Dowden）、ヒツチンソン・アンド・ロ
ス・インコーポレイテイツド（Hutchinson and Ross、I
nc.）、（1977）；メソツズ・イン・イースト・ジエネ
テイツクス（Methods In Yeast Genetics）、シエルマ
ン・エフら（Sherman、F.et al.）、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor L
aboratory）、（1982））、発現されたPRV糖蛋白質また
はそのフラグメントは、例えば当該分野でよく知られた
機械的もしくは酵素的方法によつて宿主細胞系を破壊し
た後、宿主細胞または細胞懸濁液から蛋白質が排出され
る系において細胞培養物から収穫される。 前記した如く、遺伝子構造から推断したPRV糖蛋白質
のアミノ酸配列はチヤートＡ〜Ｃに記載する。PRV糖蛋
白質抗原性を示すポリペプチドはチヤートＡ〜Ｃに記載
した配列ならびにポリペプチド配列およびまた該ポリペ
プチドの免疫原的機能同族体を注射された動物、例えば
哺乳動物において免疫応答を引き出すことができるポリ
ペプチド配列のいずれの部分も包含する。 前記で示した如く、PRV糖蛋白質についてコード付け
する完全な遺伝子をベクターを組立てるのにおよび宿主
細胞を形質転換するのに用いてPRV糖蛋白質を発現する
ことができ、あるいはPRV糖蛋白質をコード付けする遺
伝子のフラグメントを用いることができ、それにより得
られた宿主細胞はPRV抗原性を示すポリペプチドを発現
する。PRV糖蛋白質遺伝子のいずれのフラグメントも用
いることができ、その結果PRV糖蛋白質の免疫原フラグ
メントまたはその同族体であるポリペプチドを発現す
る。当該分野においてよく知られている如く、遺伝コー
ドの縮退はPRV糖蛋白質抗原性を示すポリペプチドをコ
ード付けする機能的に均等な遺伝子またはそのフラグメ
ントを産生するための塩基対の容易な置換を可能とす
る。これらの機能的均等物も本発明の範囲内に包含され
る。 チヤートＤ−Ｓは実施例の組立てを示すために掲げ
る。プラスミドおよびDNAフラグメントを示すのに以下
の如くある約束事を用いる： （１）単一線の図は環状および直線状の日本鎖DNAを共
に表わす。 （２）星印（＊）は表わされた分子が環状であることを
示す。星印が無いのは分子が直線状であることを示す。 （３）注目するエンドヌクレアーゼ制限部位は直線の上
方に示す。 （４）遺伝子は直線の下方に示す。 （５）遺伝子および制限部位間の距離はスケール通りで
はない。特に断りのない限り、図は相対的な位置のみを
示す。 本発明を実施するのに用いる組換体DNA法のほとんど
は当業者によく知られた標準的な方法であり、例えばモ
レキユラー・クローニング（Molecular Cloning）、テ
イ・マニアテイスら（T.Maniatis et al.）、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring
Harbor Laboratory）、（1982）およびビイ・パーバル
（B.Perbal）、ア・プラクテイカル・ガイド・トウ・モ
レキユラー・クロウニング（A Practical Guide to Mol
ecular Cloning）、ジヨン・ウイリイ・アンド・サンズ
（John Wiley ＆ Sons）、（1984）中に詳しく記載され
ており、参照のためにここに挙げる。 実施例１ 本実施例においてはPRV糖蛋白質gp50の配列決定、ク
ローニングおよび発現を記載する。 1.gp50遺伝子の配列決定 gp50遺伝子をコード付けするPRVライス（Rice）株DNA
のBamH I7フラグメント（チヤートＤ）をpRPXh1〔NRRL
B−15772〕、前掲、から単離し、継代クローンしてプラ
スミドpBR322のBamH I部位に入れる（マニアテイスら
（Maniatis et al.）、前掲）。 以下、チヤートＥを参照して、Pvu IIでBamH Iを消化
し、２つのBamH I/Pvu IIフラグメント（1.5および4.9k
b）を単離し次いでpBR322のBamH IおよびPvu II部位間
でそれらを継代クローンすることによる標準法を用いて
該フラグメントをさらに継代クローンして各々1.5およ
び4.9kbフラグメントを一体化するプラスミドpPR28−４
およびpPR28−１を得る（リーら（Rea et al.）、前
掲、も参照）。これらの継代クローンはDNA配列決定実
験のためのDNA源として用いる。 チヤートＦはgp50遺伝子中に位置する各種制限酵素切
断部位およびフランキング領域を示す。前記で継代クロ
ーンした1.5および4.9kbフラグメントをこれらの制限酵
素で消化する。制限酵素によつて生じた各末端をポリヌ
クレオチドキナーゼを用いてγ−32P−ATPでラベルし、
マキサムおよびギルバード（Maxam and Gilbert）、メ
ソツズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymo
l.）、65、499〜560（1980）の方法により配列する。完
全な遺伝子を両鎖上に少くとも２回配列する。gp50につ
いてのDNA配列をチヤートＡに掲げる。このDNAはPRVに
能動的に感染した動物を検知するのに用いることができ
る。例えば、鼻もしくはのどを綿紡で拭いて試料採取
し、次いで標準法によりDNA/DNA交雑を行つてPRVの存在
を検知する。 2.gp50の発現 以下、チヤートＧを参照して、Nra I切断部位はgp50
遺伝子翻訳開始コードンから塩基対35個だけ上流に位置
する。発現における第一工程はNar I切断部位の地点に
おける便利なBamH I切断部位の挿入である。前記からの
プラスミドpPR28−４を制限エンドヌクレアーゼNar Iで
消化してgp50遺伝子の端部をコード付けするＮ末端およ
びg X遺伝子の一部よりなるDNAフラグメント３を得る。
BamH Iリンカーをフラグメント３に加え、該フラグメン
トをBamH Iで消化してg X配列を欠失し、かくしてフラ
グメント４を得る。次いでBamH I末端を結んでプラスミ
ドpPR28−4Nar2を得る。 以下、チヤートＨを参照して、完全なgp50遺伝子の組
立てが示される。pPR28−4Nar2をBamH IおよびPvu IIで
消化してgp50遺伝子のＮ−末端コード付け部分よりなる
フラグメント５（160bp）を得る。また、前記からのプ
ラスミドpPR28−１をPvu IIおよびBamH Iで消化してgp5
0遺伝子のＣ末端モード付け部分よりなる4.9kbフラグメ
ントを得る（フラグメント６）。（米国特許出願SN7601
30号に記載されている如く組立てた）プラスミドpPGX
1、または別法としてプラスミドpBR322をBamH Iで消化
し、細菌アルカリホスフアターゼ（BAP）で処理し、次
いでフラグメント５および６で結んで完全なgp50遺伝子
よりなるプラスミドpGBP50−23を得る。 以下、チヤートＩを参照して、プラスミドpD50の産生
が示される。プラスミドpBG50−23を制限酵素Mae IIIで
切断して（ケイ・シユミツトら（K.Schmid et al.）、
ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Nucl.Acids Re
s.）、12、2619頁（1984））フラグメントの混合物を得
る。Mae III末端をT4DNAポリメラーゼで平滑末端とし、
EcoR Iリンカーを該平滑末端に加え、続いてEcoR I消化
を行う。得られたフラグメントをBamH Iで切断し、gp50
遺伝子を含有する1.3kb BamH I/EcoR Iフラグメント
（フラグメント７）を単離する。（アメリカン・タイプ
・カルチヤー・コレクシヨン（American Type Culture
Collection）、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ
（Bethesda Research Laboratories）から得た、または
エス・スブラマニら（S.Subramani et al.）、モレキユ
ラー・アンド・セリユラー・バイオロジー（Mol.Cell.B
iol.）、２、854〜64頁（1981）の方法により合成し
た）プラスミドpSV2dhfrをBamH IおよびEcoR Iで消化
し、より大きい（5.0kb）フラグメントを単離してジヒ
ドロ葉酸還元酵素（dhfr）標識を含有するフラグメント
８を得る。次いでフラグメント７および８を結んでgp50
遺伝子およびdhfr標識を含有するプラスミドpD50を得
る。 以下、チヤートＪを参照して、ヒトサイトメガロウイ
ルスタウネ（Towne）株からの即時型プロモータをgp50
遺伝子より上流に加える。pD50をBamH Iで消化し、細菌
アルカリホスフアターゼで処理してフラグメント９を得
る。ヒトサイトメガロウイルス（タウネ（Towne））即
時型プロモータを含有する760bpSau3Aフラグメントを米
国特許出願SN758517号に記載された方法によつて単離し
てフラグメント10を得る（デイ・アール・トムソンら
（D.R.Thomson et al.）、プロシーデイングズ・オブ・
ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Nat
l・Acad.Sci.）USA、81、659〜63頁（1984）も参照）。
次いで、BamH I/Sau3A融合によつてこれらのフラグメン
トを結んでプラスミドpDIE50を得る。プロモータがgp50
遺伝子を転写するのに適当な配位であることを確認する
ために該プラスミドをSac IおよびPvu IIで消化し、185
bpフラグメントを得る。 以下、チヤートＫを参照して、ウシ成長ホルモンポリ
アデニレーシヨン信号を含有する0.6kb Pvu II/EcoR I
フラグメントをPvu IIおよびEcoR Iでの消化によつてプ
ラスミドpGH2R2から（アール・ピイ・ウオイチツクら
（R.P.Woychik et al.）、ヌクレイツク・アシツズ・リ
サーチ（Nucl.Acids Res.）、10、7197〜7210頁（198
2））から、あるいはpSVCOW7（前掲）から単離してフラ
グメント11を得る。 フラグメント11を（フアルマシア（Pharmacia）/PLま
たはATCCから入手した）pUC9のEcoR IおよびSma I切断
部位間にクローンする。pCOWT1をSal Iで切断し、T4DNA
ポリメラーゼで平滑末端とし、EcoR Iリンカーを加え、
該DNAをEcoR Iで切断し、0.6kbフラグメント（フラグメ
ント12）を単離する。これは２個のEcoR I末端および１
の末端にポリリンカー配列を有する以外はフラグメント
11と同一である。 プラスミドpDIE50をEcoR Iで切断し、フラグメント12
をクローンしてそれに入れてプラスミドpDIE50PAを得
る。ポリアデニレーシヨン信号が適当な配位である場
合、BamH IおよびPvu IIでの消化により1.1kbのフラグ
メントを得る。該プラスミドはプロモータ前のポリアデ
ニレーシヨン配列におけるクローニングによつても組立
てることができる。 プラスミドpDIE50PAを用いてサケ精子キヤリアDNAと
リン酸カルシウムとの共沈降（エフ・エル・グラハムお
よびエイ・ジエン・バン・デル・エブ（F.L.Graham and
A.J.Van Der Eb）、バイロロジー（Virol.）、52、456
〜67（1973））によりCHO dhfr-細胞をトランスフエク
トする（DXB−11、ジイ・ウルラウブおよびエル・エイ
・チヤシン（G.Urlaub and L.A.Chasin）、プロシーデ
イングズ・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ（Proc.Natl・Acad.Sci.）USA、77、4216〜20
（1980））。ジヒドロ葉酸還元酵素陽性（dhfr+）のト
ランスフエクトされた細胞をダルベツコの修正イーグル
培地＋イーグルの非須アミノ酸＋10％胎児子ウシ血清中
で選択する。選択したdhfr+CHO細胞は、抗gp50単クロー
ン抗体3A−４での免疫螢光法により、あるいは14C−グ
ルコサミンでの標識および3A−４での免疫沈降によつて
検知されるgp50を産生する。単クローン抗体3A−４は19
85年１月９日出願の同時係属米国特許出願SN817429号に
記載されている如くに産生される。免疫沈降反応は次に
示す以外は前記した（テイ・ジエイ・リーら（T.J.Rea
et al.）、前掲）、如くに行う：まず抽出物を正常なマ
ウス血清、続いて洗浄したスタフイロコツカス・アウレ
ウス（Staphylococcus aureus）細胞と共にインギユベ
ートし、ベツクマン（Beckman）SW50.1ローター中、400
00rpmにて30分間遠心する。抽出物を単クローンもしく
は多クローン抗血清とエス・アウレウス（S.Aureus）細
胞と共にインキユベートした後、10mMトリスHCl、pH7.
0、1mA EDTA、0.1M NaCl、１％NP40および0.5％デオキ
シコレート中で細胞を３回洗浄する。蛋白質の分析は11
％SDSポリアクリルアミドゲル上で行う（エル・モース
ら（L.Morse et al.）、ジヤーナル・オブ・バイロロジ
ー（J.Virol.）、26、389〜410頁（1984））。予備免疫
螢光アツセイにおいて、3A−４はpDIE50PAでトランフエ
クトされたCHO細胞と反応するがトランスフエクトされ
ていないCHO細胞とは反応しないことが判明した。トラ
ンスフエクトされたCHO細胞を14C−グルコサミンでラベ
ルした場合、3A−４はpDIE50PAを含有する細胞からラベ
ルした蛋白質を免疫沈降させたが、ヒトレニンを生成す
る対照細胞からは免疫沈降されなかつた。沈降した蛋白
質はSDS−ポリアクリルアミドゲル上でPRV感染細胞から
の3A−４により沈降した蛋白質と一緒に移動した。 gp50を産生するこれらのトランスフエクトされたCHO
細胞のクローンはローラー・ボトル（roller bottle）
中で増殖し、リン酸緩衝食塩水および1mM EDTA中で収穫
し、ワクチンとして使用するために完全フロイントアジ
ユバント混合できる。 また、gp50遺伝子はワクチニアベクターにおいて発現
することができる。この具体例においては、pBG50−23
をMae IIIで消化し次いでT4DNAポリメラーゼで平滑末端
とした後、該DNAをBamH Iで消化する。gp50遺伝子を含
有する1.3BamH I/平滑末端フラグメントを単離する。プ
ラスミドpGS20（マケツトら（Mackett et al.）、ジヤ
ーナル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）49、876〜64
頁（1984））をBamH IおよびSma Iで切断し、ゲル電気
泳動によつてより大きい6.5kbフラグメントを単離す
る。これらの２のフラグメントを一緒に結んでpVV50を
得る。プラスミドpVV50をトランスフエクトしてワクチ
ニアウイルスのWR株（ATCC VR−119）で感染したCV−１
細胞（ATCC CCL70）に入れ、マケツトら（Mackett et a
l.）、デイ・エヌ・エイ・クロウニング（DNA Clonin
g）、II巻：ア・プラクテイカル・アプローチ（A Pract
ical Approach）、デイ・エム・グロウバー（D.M.Glove
r）編、アイ・アール・エル・プレス（IRL Press）、オ
ツクスフオード（1985）により記載されている方法によ
り５−プロモデオキシ−ウリジン（BUdR）中で143細胞
（ATCC CRL 8303）上で平板培養することによつてチミ
ジンキナーゼ陰性組換体について選択する。14C−グル
コミサミンでの感染細胞の蛋白質のラベルおよび単クロ
ーン抗体3A−４での免疫沈降によつてアツセイを行つた
如く、得られたウイルス、ワクチニア−gp50は感染細胞
においてgp50を発現した。 実施例２ 本実施例では、実施例１のgp50を免疫原剤として用い
るマウスおよびブタのPRV攻撃からの保護を記載する。 後掲の第１〜３表では、以下の如くにミクロ中和アツ
セイを行つた:3％胎児子ウシ血清および抗生物質を補足
した基礎培地イーグル（BME）を用い、ミクロ滴定プレ
ート（コスター（Costar））中で血清試料の系列的な２
倍希釈を行つた。PRVの約1000pfu（50μ）を各希釈物
50μに添加した。マウス血清アツセイについては、1:
5の希釈におけるウイルスの一部にいラビツト補体が包
含されていたが、ブタ血清アツセイについては包含され
ていなかつた。試料を37℃にて１時間（ブタ血清）また
は３時間（マウス血清）のいずれかインキユベートし
た。インキユベーシヨン時間の後、イーグルの最小必須
培地中のブタ腎臓−15（PK−15）細胞（300000細胞/m
l）の一部50μをPRV試料につき各血清に添加した。ひ
き続いて、試料を37℃にて２日間インキユベートした。
中和による力価は50％の細胞を細胞病理効果から保護し
た最高の希釈の逆数を表わす。 第１表はワクチニアウイルスにおいて産生されたgp50
での免疫化による、ビルレトンPRVによる攻撃からのマ
ウスの保護を示す。25μでの尾乱切または50μでの
肉趾経路によつてマウスを免疫化した。攻撃の28日前に
マウスを免疫化した（攻撃の14日前に免疫化したPR−Va
cを投与したマウスを除く）。 第２表はCHO細胞において産生されたgp50での免疫化
による、ビルレントPRVによる攻撃からのマウスの保護
を示す。攻撃の28日前、18日前および７日前にマウスを
免疫化した。第１投与ではアジユバントと共に調製物を
マウスに皮下投与し、第２および第３投与では食塩水中
の調製物を腹腔内投与した。各マウスに106破壊細胞／
投与で投与した。 第３表はCHO細胞において産生したgp50での免疫化に
よる、ビルレントPRVによる攻撃からのブタの保護を示
す。攻撃の21日前および７日前にブタを免疫化した。投
与当たり２×107個の破壊細胞をブタに与えた。最初の
投与量は完全フロイントアジユバントと混合し、一方第
２の投与量は食塩水中に懸濁した。両投与量は筋肉内投
与した。 gp50は抗体の中和をひき起こし、致命的なPRV攻撃か
らマウスおよびブタを保護することができることをこれ
らの３つの表は示す。 本発明のもう１つの態様において、発明者らはgp50の
Ｃ末端端部についてコード付けするDNAを除去すること
によつて糖蛋白質gp50の誘導体を得た。得られたポリペ
プチドは細胞膜中にgp50を固定するのに必要なアミノ酸
配列について欠失を有する。哺乳動物細胞において発現
された場合、このgp50誘導体は培地中に分泌される。サ
ブユニツトワクチンとして用いるためのこのgp50誘導体
の培地からの精製は全細胞の分画よりもかなり簡単であ
る。膜蛋白質を分泌蛋白質に変換するためのアンカー配
列の除去は最初インフルエンザ赤血球凝集素遺伝子につ
いて示された（エム−ジエイ・ゲシングおよびジエイ・
サンブルツク（M.−J.Gething and J.Sambrook）、ネイ
チヤー（Nature）、300、598〜603頁（1982））。 以下、チヤートＬを参照して、前記からのプラスミド
pDIE50をSa1 IおよびEcoR Iで消化する。5.0および0.7k
bフラグメントを単離する。gp50の一部をコード付けす
る0.7kbフラグメントをSau3Aで消化し、0.5kb Sa1 I/Sa
u3Aフラグメントを単離する。切断されたgp50遺伝子後
方の停止コードンを産生するには、以下のオリゴヌクレ
オチドを合成する。 5.0kb EcoR I/Sa1 Iフラグメント、0.5kb Sa1 I/Sau3
Aフラグメントおよびアニールしたオルゴヌクレオチド
を結んでプラスミドpDIE50Tを得る。EcoR IおよびSa1 I
での消化により580bpフラグメントを得る。pDIE50TをEc
oR Iで切断し、6GHポリAb部位を含有する0.6kb EcoR I
フラグメント（フラグメント12）を中にクローンしてプ
ラスミドpDIE50TPAを得る。ポリアデニレーシヨン信号
が適当な配位である場合、pDIE50TPAをBamH IおよびPvu
IIで消化して970bpフラグメントを得る。 pDIE50TPAを用いてCHO dhfr-細胞をトランスフエクト
する。35S−メチオニンでのラベルおよび免疫沈降によ
つて検知される如く、選択したdhfr+CHO細胞はgp50の切
断形を産生し、それを培地中へ分泌する。 実施例３ 本実施例において、発明者らはgp63およびg I遺伝子
の単離、クローニングおよび配列決定を記載する。 1.ライブラリーの組立て 前記（テイ・ジエイ・リーら（T.J.Rea et al.）、前
掲）した如く、RPVゲノムDNAを調製した。各回ともにブ
ランソン（Branson）200超音波処理器を２に設定し、PR
Vライス（Rice）株のPRVゲノムDNAを４秒間で２回超音
波処理することによつて0.5〜3.0kbのフラグメントを得
た。T4DNAポリメラーゼでフラグメントを平滑末端とし
た後、該フラグメントをキナーゼ処理したEcoR Iリンカ
ーに結んだ（テイ・マニアテイスら（T.Maniatis et a
l.）、前掲）。EcoR Iでの過剰消化の後（PRV DNAはEco
R I部位を含有しないので、メチル化は不必要であつ
た）、アガロースゲル電気泳動によつて過剰のリンカー
を除去した。所望のサイズ範囲にあるPRV DNAフラグメ
ントをガラススラリー法によつて溶出した（ビイ・ボゲ
ルステインおよびデイ・ギレスピー（B.Vogelstein and
D.Gileispie）、プロシーデイングズ・オブ・ナシヨナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Aca
d.Sci.）USA、76、615〜19頁（1979））。最終的に10μ
の容量とした50mMトリス（pH7.4）、10mM MgCl2、10m
Mジチオスレイトール、1mMスペルミジン、1mM ATP、T4D
NAリガーゼ400単位（ニユー・イングランド・バイオラ
ブズ（New England Biolabs））中でPRV DNAフラグメン
ト500ngをEcoR Iで消化したλgt II（アール・エイ・ヤ
ングおよびアール・ダブリユー・デイビス（R.A.Yaung
and R.W.Davis）、前掲）DNAに結ぶことによつて61000
λ/PRV組換体（λPRV）のライブラリーを組立てた。パ
ツカジーン（Packgene）抽出物（プロメガ・バイオテク
（Promega Biotec）、マジソン、ウイスコンシン州）を
用いて、結んだDNAをバクテリオフアージλウイルス粒
子中に充填した。 2.λPRVライブラリーのスクリーニング 前記（ジエイ・ジイ・テイミンズら（J.G.Timmins et
al.）、前掲；アール・エイ・ヤングおよびアール・ダ
ブリユー・デイビス（R.A.Young and R.W.Davis）、前
掲）した如く、λRPVライブラリーをスクリーニングし
た。20000フアージを150mmLB−アンピシリンプレートを
介してスクリーニングした。SDS−ポリアクリルアミド
ゲルから溶出したPRV感染細胞蛋白質（ICP）のサイズに
より分画した画分をマウスに注射することによつてスク
リーニングした抗血清を生成した（ジエイ・ジイ・テイ
ミンズら（J.G.Timmins et al.）、前掲）。抗血清での
スクリーニングに際し陽性信号を与えるプラークを滅菌
したパスツールピペツトでアガールから取り、SM緩衝液
（テイ・マニアテイスら（T.Maniatis et al.）、前
掲）1ml中に再懸濁し、再度スクリーニングした。プラ
ークが陽性に反応することについて均質になるまでスク
リーニングをくり返した。 約43000λPRV組換体をマウク抗血清でPRV感染ベロ（V
ero）細胞蛋白質に対してスクリーニングし、SDS−ポリ
アクリルアミドゲルから単離した。60の陽性λPRVフア
ージを単離した。 3.フアージ株の調製 プレート溶解物法（テイ・マニアテイスら（T.Maniat
is et al.）、前掲）により高力価フアージ株（1010〜1
011pfu/ml）を調製した。単一の十分単離した陽性信号
プラークを選択し、SM1mlに再懸濁した。懸濁液100μ
を37℃で15分間、（アメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨン（American Type Culture Collection）
（ATCC）、ロツクビル、メリーランド州から入手可能
な）イー・コリ（E.coli）Y1090 300μに吸着させ、L
B−頂部のアガロース10mlで希釈し、150mmのLB−アンピ
シリンプレート上に一様に注ぎ、42℃にて一晩インキユ
ベートした。頂部アガロースを火炎処理したガラススラ
イドで穏かにかき取り、30mlのコレツクス（Corex）試
験管に移した。SM8mlおよびクロロホルム250μを加
え、混合し、37℃にて15分間インキユベートした。溶解
物をHB−４ローター中、10000rpmでの30分間の遠心分離
によつて精製した。フアージ株を0.3％クロロホルムと
共に４℃にて保存した。 ４・融合蛋白質の調製および分析 LB培地（マニアテイスら（Maniatis et al.）、前
掲）をイー・コリ（E.coli）K95（sup-、λ−、ga-、st
rγ、nusA-;デイ・フリードマン（D.Friedman）、前
掲）の新たに一晩培養した培養物で1:50にて接種し、30
℃においてOD550＝0.5となるまで増殖した。培養物25ml
をλPRVフアージで５の多重度にて感染し、42℃の振盪
水浴中で25分間インキユベートし、続いて２〜３時間で
37℃まで移した。HB−４ローター中、5000rpmにて10分
間細胞をペレツト化し、100mMトリス（pH7.8）、300mM
NaClの100μに再懸濁した。等容量の２×SDS−PAGE試
料緩衝液を加え、試料を10分間沸騰した。エル・モース
ら（L.Morse et al.）、ジヤーナル・オブ・バイロロジ
ー（J.Virol.）、26、389〜410頁（1978）に記載されて
いる如く、分析用SDS−ポリアクリルアミドゲル上の電
気泳動によつて試料各５μを分析した。マウスの注射
用に、融合ポリペプチドの調製を10倍にスケールアツプ
した。ゲル片をコーマシーブルーで染色した後、β−ガ
ラクトシダーゼ/PRV融合ポリペプチドを単離した（エル
・モースら（L.Morse et al.）、前掲：ケイ・ウエーバ
ーおよびエム・オスボルン（K.Weber and M.Osborn）、
ザ・プロテインズ（The Proteins）、１、179〜223（19
75））。分析用SDS−PAGEによつて融合ポリペプチド量
を見積つた。λPRV感染イー・コリ（E.coli）K95培養物
からの細胞溶解物を9.25％SDS−ポリアクリルアミドゲ
ルで電気泳動に付した。λgt II−感染対照がない分子
量116000ダルトン以上の過剰産生ポリペプチドバンドは
β−ガラクトシダーゼ−PRV融合ポリペプチドであつ
た。β−ガラクトシダーゼ−PRV融合ポリペプチドはサ
イズが129000〜158000ダルトンの範囲であつた。融合ポ
リペプチド約50〜75μｇを完全フロイントアジユバント
中に再懸濁し、マウスにつき皮下および腹腔内注射し
た。後の注射は不完全フロイントアジユバント中で腹腔
内に行つた。 5.抗血清分析 前記（テイ・ジエイ・リーら（T.J.Rea et al.）、前
掲）した如く、14C−グルコミサンIPC、35S−メチオニ
ンICPおよび14−グルコミサンg Xの免疫沈降を行つた。
これらの方法によりgp63およびg Iがλgt II組換体フア
ージ中に単離されたことが示された。発明者らはこれら
のフアージをλ37およびλ36（gp63）およびλ23（g
I）と命名した。 6.λDNAの小規模調製 平板培養溶解物からバクテリオフアージを迅速に単離
した（テイ・ジエイ・シルハビイら（T.J.Silhavy et a
l.）、エクスペリメンツ・ウイズ・ジーン・ヒユージヨ
ンズ（Experiments With Gene Fusions）、1984））。
５％および40％グリセロール段（SM緩衝液中で各3ml）
をSW41試験管中で重ねた。平板培養溶解物（〜6ml）を
重ね、４℃にて35000rpmで60分間遠心分離した。上澄み
を捨て、フアージペレツトをSM1mlに再懸濁した。DNア
ーゼＩおよびRNアーゼＡを加えて１μg/mlおよび10μg/
mlの最終濃度とした。37℃での30分間のインキユベーシ
ヨンの後、SDSミックス（0.25M EDTE、0.5Mトリス（pH
7.8）、2.5％SDS）200μおよびプロテイナーゼＫ（〜
1mg/ml）を加え、68℃にて30分間インキユベートした。
λDNAをフエノールで３回抽出し、クロロホルムで抽出
し、エタノールで沈殿させた。平均150mmの平板培養溶
解物からλDNA5〜10μｇを得る。 7.λPRV DNA分析 BamH IおよびKpn IでPRV DNAを完全に消化し、0.8％
アガロース中で電気泳動に対し、サザーン（Southern）
の方法によるニトロセルロースに移した（ジヤーナル・
オブ・モレキユラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、9
8、507〜17（1975））。ブロツテイング物を4mm片にス
ライスし、20〜25℃にて乾燥状態にて保存した。λPRV
DNAに対してニツクトランスレーシヨン（アメルスハ
ム（Amersham））を行つて約108cpm/μｇの特異的活性
とする。６×SSC、30％ホルムアミド、１×デンハルト
（Denhardt）試薬（フイコール（ficoll）、ポリビリル
ピロリドンおよびウシ血清アルブミンの各0.02％）、0.
1％SDS、50μg/ml異種DNA中、プレ交雑を70℃にて１時
間行つた。同一溶液中、交雑を70℃にて16時間行つた。
15分間の洗浄を２×SSC、0.1％SDS中で２回、0.1×SSC
および0.1％SDS中で２回、すべて20〜20℃にて行つた。
ブロツテイング物を〜70℃にて一晩増感板上でオートラ
ジオグラフイーに付した。 サザーンブロツテイング法によつて、λ23、λ36およ
びλ37中に含有されたPRV糖蛋白質遺伝子をユニークな
小領域中のBamH I7フラグメントに対してマツプした
（テイ・ジエイ・リーら（T.J.Rea et al.）、前掲）。
チヤートＤに示す如くこのフラグメントのより精密なマ
ツピングはλ23（g I）遺伝子に対して遠位にマツプさ
れ、λ37がBamH I7の内部領域に対してマツプされたこ
とを示した。 8.gp63およびg I遺伝子の配列決定 λ36およびλ37中のRPV DNAはStu I切断部位を含有
することが決定された。BamH I7フラグメント中にはた
だ１つのStu I切断部位が存在する；従つて、Stu I切断
部位を包含したオープンリーデイングフレームは配列さ
れた。チヤートＥは各種制限酵素切断部位がgp63遺伝子
およびフランキング領域中に位置することを示す。BamH
I7を継代クローンし、これらの制限酵素で消化した。
マクサムおよびギルバート（Maxam and Gilbert）、メ
ソツズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymo
l.）、65、499〜560（1980）の方法により、ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いて制限酵素によつて生じた各末端
をγ−32P−ATPでラベルし、配列した。 pUC1129から単離したBamH I7フラグメントをクローン
してプラスミドpSV2gptに入れることによつてプラスミ
ドpPR28を得た（アール・シイ・ムリガンおよびピイ・
ベルグ（R.C.Mulligan and P.Berg）、プロシーデイン
グズ・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、78、2072〜76（198
1））。 Pvu IIでpPR28を消化し次いでイー・コリ（E.coli）
複製開始点およびbla遺伝子を含有する切断片を再環化
してg IについてのDNA配列を含有する4.9kbPvu II/BamH
I7PRVフラグメントよりなるプラスミドを得ることによ
つてプラスミドpPR28−１を得た。 チヤートＮはg I遺伝子およびフランキング領域中に
位置する各種制限酵素切断部位を示す。前記した如くBa
mH I7を継代クローンし、消化し、ラベルし、配列し
た。 糖蛋白質gp63およびg IについてのDNA配列を各々チヤ
ートＢおよびＣに示す。このDNAを用いてPRVに能動的に
感染した動物を検知することができる。例えば、鼻また
はのどを綿紡で拭いて試料採取し、次いで標準的なDNA/
DNA交雑法によつてPRVの存在を検知できる。 実施例４ 本実施例において、発明者らは哺乳動物におけるg I
の発現を記載する。 プラスミドpPR28（前記参照）をBamH Iで消化し、該
フラグメントをアガロースゲル上で分離し、次いでゲル
から該フラグメントを切り取ることによつてg I遺伝子
を含有するBamH I7フラグメントを該プラスミドから単
離する。 以下、チヤートＯを参照して、次いで前記で単離した
BamH I7フラグメントをクローンして（フアルマシア（P
harmacia）/PLから購入した）プラスミドpUC19中に入れ
てプラスミドＡを得る。プラスミドＡをDra Iで消化す
る。Dra IはpUC19配列をいくつかの個所で切断するが、
gp63およびg I遺伝子間のBamH I7配列においては一度だ
けしか切断せずに（チヤートＤ）なかんずくフラグメン
ト１を得る。BamH Iリンカーをフラグメント１を包含す
るフラグメントのDra I末端上に結び、得られたフラグ
メント混合物をBamH Iで消化する。アガロースゲル電気
泳動によつて産生物フラグメントを分離し、g I遺伝子
を含有する2.5kbフラグメント２を精製する。フラグメ
ント２をクローンしてBamH Iで消化したpUC19に入れて
プラスミドpUCD/Bを得る。かく産生した２のプラスミド
のうち適当な配位にあるg I遺伝子を含有するプラスミ
ドをBsm IおよびEcoR Iでプラスミドを消化することに
よつて決定する：該適当な配位にあるプラスミドは特徴
的な750bpBsm I/EcoR Iフラグメントを含有する。 以下、チヤートＰを参照して、プラスミドpUCD/B（チ
ヤートＯ）をBsm IおよびEcoR Iで消化し、より大きな
フラグメント（フラグメント３、4.4kb）をアガロース
ゲル電気泳動によつて精製する。以下の２種のオリゴヌ
クレオチドをよく知られた技術により化学的に合成する
か、あるいはコマーシヤル・カスタム・シンセシス・サ
ービス（commercial custom synthesis service）から
購入する。 これらのオリゴヌクレオチドをフラグメント３に結ん
でBsm I切断によつて失欠されたg I遺伝子のＣ末端につ
いてのコーデイング配列を置き換える。得られたプラス
ミドpG Iはg Iコーデイング配列から上流のBamH I切断
部位およびg Iコーデイング配列から下流のEcoR I切断
部位を共に有するg I遺伝子の完全なコーデイング領域
を含有する。 プラスミドpG IをEcoR IおよびBamH Iで消化し、g I
遺伝子よりなる1.8kbフラグメント（フラグメント４）
をアガロースゲル上で精製する。 プラスミドpSV2dhfr（前掲）をEcoR Iで切断し、次い
でBamH Iで切断してdhfr標識を含有する5.0kbフラグメ
ント５を得、これをアガロースゲル電気泳動により単離
する。次いで、フラグメント４および５を結んでジヒド
ロ葉酸還元酵素およびアンピシリン耐性標識、SV40プロ
モータおよび複製開始点ならびにg I遺伝子よりなるプ
ラスミドpDG Iを得る。 以下、チヤートＱを参照して、ヒトサイトメガロウイ
ルスタウネ（Towne）株からの即時型プロモータをg I遺
伝子より上流に加える。プラスミドpDG IをBamH Iで消
化してフラグメント６を得る。ヒトサイトメガロウイル
ス（タウネ（Towne））即時型プロモータを単離（前
掲）してフラグメント７を得る。次いでフラグメント６
および７を結んでプラスミドpDIEGI dhfrを得る。該プ
ロモータが適当な配位にあることを確認するために該プ
ラスミドをSac IおよびBstE II制限酵素で消化する。約
400bpのフラグメントの産生は適当な配位を示す。 ウシ成長ホルモンポリアデニレーシヨン信号を含有す
る0.6kbPvu II/EcoR IフラグメントをプラスミドpSVCOW
7（前掲）から単離してフラグメント８を得る。フラグ
メント８をpUC9のSma I/EcoR I部位（前掲）と交差して
クローンしてプラスミドpCOWT1を得る。pCOWT1をSa1 I
で切断し、T4DNAポリメラーゼで処理し、EcoR Iリンカ
ーをその上に結ぶ。次いで、かく産生したフラグメント
混合物をEcoR Iで消化し、0.6kbフラグメントを単離す
る（フラグメント９）。フラグメント９をクローンして
pUC19のEcoR I部位に入れてプラスミドpCOWT1Eを得る。
pCOWT1EをEcoR Iで消化してプラグメント10（600bp）を
得る。 プラスミドpDIEGI dhfrをEcoR Iで消化し、bGHポリア
デニレーシヨン信号を含有するフラグメント10で結んで
プラスミドpDIEGIPAを得る。g I遺伝子を適当な配位で
有するプラスミドをBamH IおよびBst IIでの消化に際し
ての1400bpフラグメントの産生によつて証明する。 得られたプラスミドをトランスフエクトしてdhfr-チ
ヤイニーズハムスター卵巣細胞に入れ、dhfr+細胞を選
択してg Iを発現する細胞系を得る（スブラマニら（Sub
ramani et al.）、モレキユラー・アンド・セリユラー
・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）、１、854〜64頁（1
981））、メトトレキセートの濃度を次第に高くする増
殖で生き残るトランスフエクトした細胞のクローンを選
択することによつてg Iの発現を増大させる（マツコル
ミツクら（Mc Cormick et al.）、モレキユラー・アン
ド・セリユラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）、
４、166〜72頁（1984））。 実施例５ 本実施例において、発明者らは哺乳動物細胞における
gp63の発現を記載する。 PRV DNAのBamH I7フラグメント（前掲）をpPRXh1〔N
RRL B−15772〕から単離し、gp63遺伝子のより多くのコ
ピーを配列しかつ産生するのに使用するために実施例１
における如く、継代クローンしてプラスミドpBR322のBa
mH I部位に入れる。 以下、チヤートＲを参照して、BamH I7をBstE IIで切
断し、T4DNAポリメラーゼで末端を処理し、次いでKpn I
で切断することによつてBamH I7の内部から1.9kbBstE I
I/Kpn Iフラグメント（フラグメント１）を継代クロー
ンする。フラグメント１を単離し、（フアルマシア（Ph
armacia）/PL、ピスカタウエイ、ニユージヤージー州か
ら購入した）pUC19中のKpn IおよびSma I部位間にクロ
ーンしてプラスミドpPR28−1BKを得る。 プラスミドpPR28−1BKをDra IとMae IIIで切断して1.
1kbフラグメント２を得る。Dra I切断部位はgp63遺伝子
のコーデイング領域の外部かつそのポリアデニレーシヨ
ン信号から下流にある。Mae III切断部位はgp63遺伝子
のATG翻訳開始コードンから下流の21塩基を切断する。g
p63遺伝子から除去したコーデイング領域を置き換える
ために、以下の２種のオリゴヌクレオチドを化学的に合
成するか、あるいはコマーシヤル・カスタム・シンセシ
ス・サービス（commercial customn synthesis sevvic
e）から購入する（フラグメント４）： プラスミドpSV2dhfr、前掲、をEcoR Iで切断し、T4DN
Aポリメラーゼで処理し、次いでBamH Iで切断し、より
大きい（5.0kb）フラグメントを単離してdhfr標識を含
有するフラグメント４を得る。次いでフラグメント２、
３および４を結んでプラスミドpGP63hdfrを得る。 以下、チヤートＳを参照して、ヒトサイトメガロウイ
ルスタウネ（Towne）株からの即時型プロモータをgp63
遺伝子より上流に加える。pGP63dhrfをBamH Iで消化
し、細菌アルカリホスフアターゼで処理してフラグメン
ト５を得る。ヒトサイトメガロウイルス（タウネ（Town
e））即時型プロモータを含有する760bp Sau3Aフラグメ
ントを単離してフラグメント６を得る。次いでこれらの
フラグメントを結んでプラスミドpIEGP63dhfrを得る。
該プロモータが適当な配位にあることを確認するために
該プラスミドをSca IおよびPvu IIで消化し、150bpフラ
グメントを得る。 得られたプラスミドをトランスフエクトしてdhfr-チ
ヤイニーズハムスター卵巣細胞に入れ、dhft+細胞を選
択してgp63を発現する細胞系を得る。この系によるgp63
の合成レベルは余りにも低くて発明者らが用いる方法に
よつては検出できず、発明者らは後記する如くワクチニ
アウイルス中でポリペプチドを産生した。 実施例６ 本実施例において、発明者らはワクチニアウイルスに
おけるgp63の発現を記載する。用いる方法は前記したも
のの他の合成態様としてここに挙げる。 実施例５に従つてフラグメント１、２、３および４を
得る。 プラスミドgGS20（マケツトら（Mackett et al.）、
ジヤーナル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）、49、85
7〜64頁（1984））をBamH IおよびSma Iで切断し、ゲル
電気泳動によつてより大きい6.5kbフラグメントを単離
する。フラグメント２、オリゴヌクレオチド、およびpG
S20フラグメントを一緒に結んでプラスミドpVV63を得
る。このプラスミドをトランスフエクトしてワクチニア
ウイルスのWR株（ATCC VR−119）で感染したCV−１細
胞（ATCC CCL70）に入れ、マケツトら（Mackett et a
l.）、デイ・エヌ・エイ・クローニング（DNA Clonin
g）、巻II:ア・プラクテイカル・アプローチ（A Practi
cal Approach）、デイ・エム・グローバー（D.M.Glove
r）編、アイ・アール・エル・プレス（IRL Press）、オ
ツクスフオード（1985）により記載された方法によつ
て、BUdR中の143細胞（ATCC CRL8303）上でプレート化
することによつてチミジンキナーゼ陰性組換体について
選択する。14C−グルコサミンで感染した蛋白質をラベ
ルし、抗−gp63抗血清で免疫沈降することによつてアツ
セイを行う如く、得られたウイルス、ワクチニア−gp6
3、は感染した細胞においてgp50を発現する。 すべて前記したプラスミドpG IからのBamH I/EcoR I
フラグメント、プラスミドpPR28−1BKからのDra I/Mae
IIIフラグメント、またはpBGP50−23からのBamH I/Mae
IIIフラグメントはリーら（Rea et al.）、前掲に記載
されている如く、Ba131で処理し、（同時係属米国特許
出顔SN606307号に記載されている如く産生した）pTRZ4
中に挿入し、イー・コリ（E.coli）を形質転換するのに
用いることもできる。この方法により、gp50、gp63およ
びg Iはイー・コリ（E.coli）における融合蛋白質とし
て得られる。 また、前記実施例におけるpSV2dhfrの代りに例えば
（アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン（Am
erican Type Culture Collection）から入手可能な）pS
V2neoを用いることによつて、RPV糖蛋白質遺伝子よりな
る組換体プラスミドを形質転換して他の宿主細胞に入れ
ることができる。形質転換された細胞はプラスミドによ
つてコード付けされた抗生物質G418に対する耐性によつ
て選択される。 また、本発明のポリペプチドを以下の如くに昆虫細胞
において発現することもできる:BamH IリンカーをpD50
のEcoR I部位上に置き次いでBamH Iで消化することによ
つて、またはBamH IリンカーをpGP63dhfrのEcoR I部位
上に置き次いでBamH Iで消化することによつて、あるい
はBamH IでpUCD/Bを消化することによつて、各々gp50、
gp63またはg I遺伝子を含有するBamH Iフラグメントを
得ることができる。これらのBamH Iフラグメントはクロ
ーンしてpAC373中のポリヘドリンプロモータから下流の
BamH Iに入れることができる（モレキユラー・アンド・
セリユラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）、５、28
60〜65頁（1985））。かく産生されたプラスミドはバク
ロウイルスアウトグラフア・カリフオルニカ（Autograh
pa californica）からのDNAで共トランスフエクトしてS
f9細胞に入れ、本明細書に記載した方法によつて組換体
ウイルスを単離できる。これらの組換体ウイルスはSf9
細胞を感染するに際しgp50、gp63またはg Iを産生す
る。 本発明の糖蛋白質またはその免疫原フラグメントを利
用して調製したワクチンは固定した宿主細胞、宿主細胞
抽出物、あるいは宿主細胞からのまたは化合合成により
精製した部分的にまたは完全に精製したPRV糖蛋白質調
製物から成ることができる。本発明に従つて調製したPR
V糖蛋白質免疫原は、好ましくは、PRVウイルスを含まな
い。かくして、本発明のワクチン免疫原はPRV抗原性を
示す実質的にすべての所望の免疫原PRVポリペプチドお
よび／または他のポリペプチドよりなる。 免疫原はよく知られた方法によりワクチン投与形態に
調製できる。該ワクチンは筋肉内、皮下または鼻腔内投
与できる。筋肉内注射の如き非経口投与には、免疫原は
適当な担体と組み合すことができ、例えば水酸化アルミ
ニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウ
ム（alum）、硫酸ベリリウム、シリカ、カロリン、カー
ボン、油中水型エマルジヨン、水中油型エマルジヨン、
ムラミルジペプチド、細菌内毒素、脂質Ｘ、コリネバク
テリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）（プロ
ピオノバクテリウム・アクネス（Propionobacterium ac
nes））、ボルデテラ・ペルトウスシス（Bordetella pe
rtussis）、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリ
ウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、サポニ
ン、リポソーム、レバミソール、DEAE−デキストラン、
ブロツク共重合体もしくは他の合成アジユバントを包含
する各種アジユバントまたは免疫調整剤と共にまたはそ
れなしで水、食塩水または緩衝ビヒクルに入れて投与で
きる。かかるアジユバントは各種供給源、例えばメルク
アジュバント（Merk Adjuvant）65（メルク・アンド・
カンパニー・インコーポレイテイツド（Merk and Compa
ny、Inc.）、ラーウエイ（Rahway）、ニユージヤージー
州）より商業的に入手可能である。もう１つの適当なア
ジユバントはフロイントの不完全アジユバント（デイフ
コ・ラボラトリーズ（Difco Laboratories）、デトロイ
ト、ミシガン州）である。 免疫原およびアジユバントの割合は双方が有効量で存
在する限り、広範囲にわたつて変化させることができ
る。例えば、水酸化アルミニウムはワクチン混合物の約
0.5％の量で存在させることができる（Al2O3ベース）。
投与量ベース当たりについては、免疫原の濃度はブタ当
たり約1.0μｇ〜約100mgの範囲とすることができる。好
ましい範囲はブタ当たり約100μｇ〜約3.0mgである。適
当な投与量容量は約１〜10ml、好ましく約1.0mlであ
る。従つて、筋肉内注射用の投与量は、例えば0.5％水
酸化アルミニウムとの混合物中に免疫原1.0mgを含有す
る1mlよりなる。匹敵する投与形態は幼少のブタに対す
る非経口投与用でも調製できるが、免疫原の量は例えば
投与量当たり約0.25〜約1.0mgとより少なくなる。 雌ブタのワクチン接種については、二投与量法を用い
ることができる。第１の投与量は分娩の約数カ月前から
約５〜７週間前に投与することができる。次いで、ワク
チンの第２の投与量は第１の投与の数週間後、例えば約
２〜４週間後に投与すべきであり、次いで分娩までであ
つて分娩前にワクチンを投与できる。別法として、ワク
チンは単一の2mlの投与量として、例えば分娩の約５〜
７週間前に投与することができる。しかしながら、幼少
ブタの最も効果的な免疫化には二投与法が好ましいと考
えられる。半年ごとの再ワクチン接種が動物を飼育する
のに対して推薦される。雄ブタはいつ再ワクチン接種し
てもよい。また、雌ブタは飼育前に再ワクチン接種する
こともできる。ワクチン接種していない雌ブタから生ま
れた子ブタは約３〜10日に、その後再び４〜６カ月にお
よび毎年、あるいは好ましくは半年ごとにワクチン接種
できる。 また、該ワクチンを他の病気についての他のワクチン
と組合せて多価ワクチンを得ることもできる。また、他
の薬剤、例えば抗生物質と組合すこともできる。ワクチ
ンの医学的有効量を医薬上許容される担体または希釈剤
と共に用いてブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、および他の動
物の如き動物をワクチン接種できる。 例えばアイ・テイザード（I.Tizard）、アン・イント
ラダクシヨン・トウ・ベテリナリ・イミユノロジー（An
Introduction to Veterinary Immunology）、第２版
（1982）に記載されている如く、当業者によく知られた
方法により他のワクチンを調製することができ、ここに
参照のために挙げる。 前記した如く、市販のワクチンPRVはg Iおよびgp63遺
伝子が欠失していることが判明している。従つて、本発
明の方法により産生したg Iおよびgp63ポリペプチドを
診断剤として用いてこれらの市販ワクチンを接種した動
物とビルレントウイルスに感染した動物とを識別するこ
とができる。 感染動物とワチン接種動物とを区別するには、例えば
エライサアツセイを用いることができる。例えば組換体
DNA法（リーら（Rea et al.）、前掲）によりイー・コ
リ（E.coli）中で産生したg Iまたはgp63蛋白質を適当
なプラスチツク製プレートのウエルに加え、十分な時間
を与えてプラスチツクに吸着させる（例えば、一晩、20
〜25℃）。プレートを洗浄し、ブロツキング剤（例え
ば、BSA）を加えてプラスチツク表面上のいずれの未反
応部位も中和する。続いて洗浄し、次いでブタ血清をウ
エルに加える。20〜25℃における１時間のインキユベー
シヨンの後、ウエルを洗浄し、蛋白質Ａ−セイヨウワサ
ビペルオキシダーゼ配合体を25〜25℃における約１時間
のインキユベーシヨンの間に各ウエルに加える。さらに
洗浄し、酵素基質（Ｏ−フエニレンジアミン）をウエル
に加え、酸で反応を停止する。492ナノメータにて吸光
度を測定して血清中に存在するg Iもしくはgp63抗体を
定量する。g Iおよびgp63を欠くことは動物が感染して
いないことを示す。他のPRV抗原についてテストするこ
とによつて、与えられた動物がワクチン接種を受けたか
否かを決定することができる。 チヤートD. PRVのBamH I7フラグメント チヤートE. pPR28−４およびpPR28−１の組立て （ａ）BamH I7をBamH IおよびPvu IIで消化してフラグ
メント１（1.5kb）および２（4.9kb）を得る。 （ｂ）フラグメント１および２をpBR322のBamH Iおよび
Pvu II部位間に別々に挿入してを得る。 チヤートF. gp50配列決定に用いる制限酵素切断部位 チヤートG. pPR28−4Nar2の組立て （ａ）pRP28−４をNar Iで消化してフラグメント３を得
る。 （ｂ）BamH Iリンカーをフラグメントに加え、次いでそ
れをBamH Iで処理してフラグメント４を得る。 （ｃ）フラグメント４をDNAリガーゼで環化してpPR28−
4Nar2を得る。 チヤートH. 完全なgp50遺伝子の組立て （ａ）pRP28−4Nar2をBamH IおよびPvu IIで消化してフ
ラグメント５（160bp）を得る。 （ｂ）pPR28−１をBamH IおよびPvu IIで消化してフラ
グメント６（4.9kb）を得る。 （ｃ）pPGX1をBamH Iで消化し、BAPで処理し、次いでフ
ラグメント５および６で結んでpBGP50−23を得る。 チヤートＩ プラスミドpD50の産生 （ａ）pBGP50−23をMae IIIで切断し、T4DNAポリメラー
ゼで平滑末端とし、EcoR Iリンカーを加え、EcoR Iで消
化し、次いでBamH Iで切断してフラグメント７（1.3k
b）を得る。 （ｂ）プラスミドpSV2dhfrをBamH IおよびEcoR Iで切断
してフラグメント８（5.0kb）を得る。 （ｃ）フラグメント７および８を結ぶことによつてプラ
スミドpD50を得る。 チヤートJ. プラスミドpDIE50の産生 （ａ）pD50をBamH Iで消化し、BAPで処理してフラグメ
ント９を得る。 （ｂ）ヒトサイトメガロウイルス（タウネ（Towne））
即時型プロモータを含有するフラグメント10（760bp）
を単離する。 （ｃ）フラグメント９および10を結んでプラスミドpDIE
50を得る。チヤートK. プラスミドpDIE50PAの産生 （ａ）プラスミドpSVCOW7をPvu IIおよびEcoR Iで切断
してフラグメント11を得る。 （ｂ）フラグメント11をクローンしてpUC9に入れてプラ
スミドpCOWT1を得る。 （ｃ）pCOWT1をSa1 Iで切断し、T4DNAポリメラーゼで平
滑末端とし、EcoR Iリンカーを加え、続いてEcoR Iで消
化してフラグメント12（0.6kb）を得る。 チヤートＫ（続き） （ｄ）プラスミドpDIE50をEcoR Iで切断し、フラグメン
ト12をその中にクローンしてプラスミドpDIE50PAを得
る。即時型プロモータ チヤートL. プラスミドpDIE50Tの産生 （ａ）プラスミドpDIE50をSal IおよびEcoR Iで消化し
て5.0kbフラグメント、 および0.7kbフラグメント を得る。 （ｂ）該0.7kbフラグメントをSau3A Iで消化し、0.5kbS
a1 I/Sau3A Iフラグメントを単離する。 （ｃ）該5.0kbEcoR I/Sa1 Iフラグメント、該0.5kbSa1
I/Sau3A Iフラグメントおよびアニールしたオリゴヌク
レオチド（明細書本文参照）を結んでプラスミドpDIE50
Tを得る。 チヤートＬ（続き） チヤートM. gp63配列決定に用いる制限酵素切断部位 チヤートN. g I配位決定に用いる制限酵素切断部位 チヤートO. プラスミドpUCD/Bの組立て （ａ）BamH I7フラグメントをクローンしてプラスミドp
UC19に入れてプラスミドＡを得る。 （ｂ）プラズミドＡをDra Iで消化してフラグメント１
を得る。 （ｃ）BamH Iリンカーをフラグメント１に加え、続いて
BamH Iで消化してフラグメント２（2.5kb）を得る。 （ｄ）フラグメント２をBamH Iで消化したpUC19に入れ
てプラスミドpUCD/Bを得る。 チヤートＯ（続き） チヤートP. プラスミドpDG Iの組立て （ａ）プラスミドpUCD/BをBsm IおよびEcoR Iで消化し
てフラグメント３（4.4kb）を得る。 （ｂ）以下の２種の合成オリゴヌクレオチドを得る： （ｃ）該合成オリゴヌクレオチドおよびフラグメント３
を結んでプラスミドpG Iを得る。（ｄ）プラスミドpGIをEcoR IおよびBamH Iで消化して
フラグメント４（1.8kb）を得る。 チヤートＰ（続き） （ｅ）プラスミドpSV2dhfrをEcoR Iで切断し、次いでBa
mH Iで切断してフラグメント５（5.0kb）を得る。 （ｆ）次いでフラグメント４および５を結んでプラスミ
ドpDG Iを得る。 チヤートQ. プラスミドpDIEGIPAの組立 （ａ）プラスミドpDG IをBamH Iで切断してフラグメン
ト６を得る。 （ｂ）ヒトサイトメガロウイルス（タウネ（Towne））
即時型プロモータを含有するフラグメント７（760bp）
を単離する。 （ｃ）フラグメント６および７を結んでプラスミドpDIE
GIdhfrを得る。（ｄ）プラスミドpSVCOW7をPvu IIおよびEcoR Iで切断
してフラグメント８を得る。 （ｅ）フラグメント８をpUC9においてクローンしてプラ
スミドpCOWT1を得る。 （ｆ）pCOWT1をSa1 Iで切断し、T4DNAポリメラーゼで処
理し、EcoR Iリンカーを上に結び、続いてEcoR Iで消化
してフラグメント９（0.6kb）を得る。 チヤートQ.（続き） （ｇ）フラグメント９をクローンしてpUC19のEcoR I部
位に入れてプラスミドpCOWT1Eを得る。 （ｈ）pCOWT1EをEcoR Iで消化してフラグメント10（600
bp）を得る。 （ｉ）プラスミドpDIEGIdhfrをEcoR Iで消化し、bGHポ
リアデニレーシヨン信号を含有するフラグメント10で結
んでプラスミドpDIEGIPAを得る。即時型プロモータ チヤートR. pGP63dhfrの組立て （ａ）BamH I7をBstE IIで消化し、T4DNAポリメラーゼ
で処理し、次いでKpn Iで切断してフラグメント１（1.9
kb）を得る。 （ｂ）次いでフラグメント１をプラスミドpUC19のKpn I
およびSma I部位間でクローンしてプラスミドpPR28−1B
Kを得る。 （ｃ）プラスミドpPR28−1BKをDra IおよびMae IIIで切
断してフラグメント２（1.1kb）を得る。 （ｄ）プラスミドpSV2dhfrをEcoR Iで切断し、T4DNAポ
リメラーゼで処理し、次いでBamH Iで切断してフラグメ
ント３（5.0kb）を得る。 （ｅ）２種のオリゴヌクレオチドを合成してフラグメン
ト４を得る。 （ｆ）次いでフラグメント２、３および４を結んでプラ
スミドpGP63dhfrを得る。チヤートS. （ａ）pGP63dhfrをBamH Iで消化し、BAPで処理してフラ
グメント５を得る。 （ｂ）ヒトサイトメガロウイルス（タウネ（Towne））
即時型プロモータを含有するフラグメント（760bp）を
単離する。 （ｃ）フラグメント５および６を結んでプラスミドpIEG
P63dhfrを得る。
するポリペプチドをコード付けするDNA配列に関する。
これらのDNA配列は動物がPRVに感染しているかどうかを
決定する動物のスクリーニング、およびそれによつてコ
ード付けされた糖蛋白質の発現にも有用である。 発明の背景 偽狂犬病ウイルス（PRV）は世界的に多くの種の動物
に感染する病気である。PRVは種々に呼ばれる感染性延
髄麻痺、アウジエスキー病、および仮性恐水病である。
感染はブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ラツトおよび
ミンクの如き重要な家畜において知られている。宿主の
範囲は非常に広く、ほとんどの哺乳動物および、実験的
には少くとも多種類の鳥類を包含する〔宿主の詳細なリ
ストについては、デイ・ピイ・グスタフソン（D.P.Gust
afson）、「シウドラビエス（Pseudorabies）」、デイ
ジージズ・オブ・スワイン（Diseases of Swine）、第
５版、エイ・デイ・レマンら（A.D.Leman et al.）編
（1981）参照）。感染したほとんどの動物について該病
気は致命的なものである。しかし、成熟したブタおよび
恐らくラツトは該病気によつて殺されることはなく、従
つてキヤリアである。 ブタの集団は特にPRVに罹り易い。成熟したブタはま
れにしか徴候を示さずまたは該病気により死なないが、
子ブタは感染すると急性の病気になり、その結果、特異
的な臨床的様相なくして24ないし48時間のうちに通常死
んでしまう（テイ・シイ・ジヨーンズおよびアール・デ
イ・ハント（T.C.Jones and R.D.Hunt）、ベテリナリ・
パソロジー（Veterinary Pathology）、第５版、リー
・アンド・フエビガー（Lea ＆ Febiger）（1983））。 PRVワクチンが多種類の技術によつて生産されてきた
し、ヨーロツパの流行地においてはワクチン接種が15年
以上の間、行われてきた。ワクチン接種によつて損失は
減少されてきたが、ワクチン接種は環境中に該ウイルス
を維持しつづけてきた。感染を防止するワクチンは生産
されたことがない。ビルレントウイルスに暴露された、
ワクチン接種した動物は感染しても生き残り、次いでよ
り多くのビルレントウイルスを放出する。従つてワクチ
ン接種した動物は再び突発する可能性がある潜伏感染を
有しうる（デイ・ピイ・グスタフソン（D.P.Gustafso
n）、前掲参照）。 PRV用の生弱毒化ワクチンおよび不活性化ワクチンは
米国で商業的に入手可能であり、USDAにより認可されて
きた（シイ・イー・アロンソン（C.E.Aronson）編、ベ
テリナリ・フアルマシユーテイカルズ・アンド・バイオ
ロジカルズ（Veterinary Pharmaceuticals ＆ Biologi
cals）、（1983）参照）。 成熟したブタはPRVのキヤリアであるので、多くの州
は感染した動物を検知するスクリーニングプログラムを
制定してきた。本発明のDNA配列を利用し、DNA/DNA交雑
を用いて能動的に感染した動物を診断できる。本発明の
PRV糖蛋白質のいくつかは、また、PRV感染についての特
殊症状をつくりだすのに有用であり、また、PRVに対す
るワクチンを産生するのに有用である。 PRVはヘルペスウイルスである。ヘルペスウイルスは
一般に最も複雑な動物ウイルスの１つである。そのゲノ
ムは少くとも50個のウイルスの特異的蛋白質をコード付
けし、150000個までのヌクレオチドを含有する。最も免
疫学的に反応生であるヘルペスウイルス蛋白質のなかに
は、他の場所のうちでもとりわけウイルス粒子膜および
感染した細胞の膜中で見い出された糖蛋白質がある。PR
V糖蛋白質に関する文献は少くとも４つのウイルス糖蛋
白質に言及している（テイ・ベン−ポラートおよびエイ
・エス・カプラン（T.Ben−Porat and A.S.Kaplan）、
バイロロジー（Virology）、41、265〜73頁、（197
0）；エイ・エス・カプランおよびテイ・ベン−ポラー
ト（A.S.Kaplan and T.Ben−Porat）、プロシーデイン
グス・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、66、799〜806頁（19
70））。 情報の開示 エム・ダブリユー・ウエイセンおよびエル・ケイ・ウ
エイセン（M.W.Wathen and L.K.Wathen）、ジヤーナル
・オブ・バイロロジー（J.Virol.）、51、57〜62頁（19
84）はウイルス糖蛋白質（gp50）中に突然変異を含有す
るPRVおよびgp50に対して定方向化された単クローン抗
体を中和することを利用して該突然変異体を選択する方
法に言及している。ウエイセンおよびウエイセン（Wath
en and Wathen）は、また、gp50に対して定方向化され
た単クローン抗体は補体の助けをかりてまたはそれない
で強力なPRVの中和剤であること、および多価免疫血清
はgp50に対して大いに反応性であることを示し、従つて
gp50は重要なPRV免疫原の１つであり得ると結論してい
る。他方、98000MWエンベロープ糖蛋白質と反応する単
クローン抗体はPRV伝染性を中和するが、他の膜糖蛋白
質のいくつかに対して定方向化された単クローン抗体は
中和活性をほとんど持たないことが報告されている（エ
イチ・ハンプルら（H.Hampl et al.）、ジヤーナル・オ
ブ・バイロロジー（J.Virol.）、52、583〜90頁（198
4）；およびテイ・ベン−ポラートおよびエイ・エス・
カプラン（T.Ben−Porat and A.S.Kaplan）、「偽狂犬
病ウイルスの分子生物学」、ビイ・ロイツマン（B.Roiz
man）編、ザ・ヘルペスバイアラシズ（The Herpesvirus
es）、３、105〜73頁（1984））。 エル・エム・ケイ・ウエイセンら（L.M.K.Wathen et
al.）、バイアラス・リサーチ（Virus Research）、
４、19〜29頁（1985）はgp50およびgp83と同定されたPR
V糖蛋白質に対して定方向化された単クローン抗体の産
生および特徴づけならびにマウスをPRV感染に対して受
動的に免疫とするその使用について言及している。 エイ・ケイ・ロビンズら（A.K.Robbins et al.）、
「イー・コリ（E.coli）発現プラスミドライブラリーを
用いる偽狂犬病ウイルス糖蛋白質の位置決め」ヘルペス
バイアラス（Herpesvirus）、551〜61頁（1984）はPRV
DNAを含有するイー・コリ（E.coli）プラスミドのラ
イブラリーの組立てについて言及している。彼等は7400
0および92000MWの糖蛋白質をコード付けするPRV遺伝子
の同定についても言及している。彼等は本明細書中に記
載する糖蛋白質については言及していない。 エン・ケイ・ロビンズら（A.K.Robbins et al.）、ヨ
ーロツパ特許出願85400704.4号（公開番号0163738）はg
IIおよびg IIIとして同定されるPRV糖蛋白質の単離、
クローニングおよび発現について言及している。彼等は
本明細書中に記載するPRV糖蛋白質については言及して
いない。 テイ・シイ・メテンライターら（T.C.Mettenleiter e
t al.）、「偽狂犬病ウイルス糖蛋白質Ａの構造遺伝子
のマツピングおよび２種の非グルコシル化前駆体ポリペ
プチドの同定」、ジヤーナル・オブ・バイロロジー（J.
Virol.）、53、52〜57頁（1985）はPRV DNAのBamH I7
フラグメントに対する糖蛋白質gA（これはg Iに一致す
る）のコーデイング領域のマツピングについて言及して
いる。彼等は、また、BamH I7フラグメンオが少くとも
３種の他の65K、60K、および40KMWのウイルス蛋白質を
コード付けすることを述べている。彼等は本発明の糖蛋
白質をコード付けするDNA配列または組換体DNA法による
かかるポリペプチドの産生を開示もしくは示唆していな
い。 ビイ・ロムニクツイら（B.Lomniczi、et al.）、「偽
狂犬病ウイルスワクチン株のゲノムにおける欠失および
該ゲノムの４種異性体の存在」、ジヤーナル・オブ・バ
イロロジー（J.Virol.）,49,970〜79頁（1984）は0.855
および0.882図単位間のユニークな短配列中に欠失を有
するPRVワクチン株について言及している。これはg I遺
伝子の近傍においてである。テイ・シイ・メテンライタ
ーら（T.C.Mettenleiter et al.）、「偽狂犬病ウイル
スのアビルレント株は主要糖蛋白質を発現しない」、ジ
ヤーナル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）、56、307
〜11頁（1985）は、３種の市販PRVワクチン株が糖蛋白
質g Iを欠くことを証明した。発明者らは、また、バル
サ（Bartha）ワクチン株はgp63遺伝子のほとんどについ
て欠失を含有することを最近見い出した。 テイ・ジエイ・リーら（T.J.Rea et al.）、ジヤーナ
ル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）54、21〜29頁（19
85）は感染した細胞の培地中に蓄積するPRV糖蛋白質に
ついての遺伝子（gx）のマツピングおよび配列について
言及している。そこに示されているgX遺伝子のフランキ
ング配列のなかには、第６図の塩基1682で特異的に開始
するgp50配列が少しの割合で包含される。しかし、この
配列はgp50配列として同定されていない。さらに、リー
ら（Rea et al.）によつて公開された配列中には誤りが
ある。塩基1586および1603は欠失されているべきであ
る。塩基1708および1709、塩基1737および1738、塩基17
43および1744ならびに塩基1753および1754間に塩基が挿
入されているべきである。公開されたgp50についての部
分配列におけるこれらの誤りの結果、フレームシフトと
なる。AUG開始部位に始まるオープンリーデイングフレ
ームの翻訳はgp50糖蛋白質について誤つたアミノ酸配列
を与えるであろう。 ヨーロツパ公開特許出願0133200号はPRVのキヤリアお
よび非キヤリアを識別するのにある種のレクチン−結合
PRV糖蛋白質サブユニツトワクチンと一緒に用いる診断
抗原フアクターについて言及している。 発明の要約 本発明はPRV糖蛋白質抗原性を示す糖蛋白質をコード
付けするDNA配列よりなる組換体DNA分子を提供するもの
である。 また、本明細書中に、チヤートＡ、Ｂ、およびＣに記
載されたDNA配列ならびにそのフラグメントよりなる本
発明の組換体DNA分子で形質転換した宿主細胞を記載す
る。 また、本明細書中に、チヤートＡ、Ｂ、およびＣに記
載された式のDNA配列よりなる組換体DNA分子、および免
疫学的機能均等物ならびにポリペプチドの免疫原フラグ
メントおよび誘導体で形質転換した宿主によつて発現さ
れるポリペプチドを記載する。 また、本明細書中には、チヤートＡ、Ｂ、およびＣに
記載された式を有するポリペプチド、その免疫原フラグ
メントおよびその免疫学的機能均等物を記載する。 また、本発明は偽狂犬病ウイルス糖蛋白質gp50、gp6
3、g Iまたは発現制御配列に作動可能に連結したその免
疫原フラグメントをコード付けするDNA配列よりなる組
換体DNA分子を提供するものである。 また、本明細書中は、gp50およびgp63よりなるワクチ
ンならびにこれらのポリペプチドで動物をワクチン接種
することによる動物をPRV感染から保護する方法を記載
する。 発明の詳説 PRVの糖蛋白質gpをコード付けする遺伝子の存在およ
び位置決定はエム・ダブリユー・ウエイセンおよびエル
・エム・ウエイセン（M.W.Wathen and L.M.Wathen）、
前掲によつて示された。 該遺伝子によつてコード付けされる糖蛋白質は特定の
単クローン抗体と反応する糖蛋白質と定義された。この
糖蛋白質は以前に知られたPRV糖蛋白質のいずれにも対
応しなかつた。ウエイセンおよびウエイセン（Wathen a
nd Wathen）は単クローン抗体に対して耐性の突然変異
をマツプしたが、それは単純疱疹ウイルスにおける慣行
に基づいて（例えば、テイ・シイ・ホランドら（T.C.Ho
lland et al.）、ジヤーナル・オブ・バイロロジー（J.
Virol.）、52、566〜74頁（1984））、gp50についての
構造遺伝子の位置をマツプするものである。ウエイセン
およびウエイセン（Wathen and Wathen）はPRVのBamH I
7フラグメント内からのより小さいSa1 I/BamH Iフラグ
メントに対するgp50遺伝子をマツプした。リーら（Rea
et al.）、前掲は同一領域に対するPRV糖蛋白質gX遺伝
子をマツプした。 PRVgp63およびg I遺伝子はバクテリオフアージ発現ベ
クターλgt11中で組立てられたPRV DNAライブラリーを
スクリーニングすることによつて単離された（ジエイ・
ジイ・テイミンズら（J.G.Timmins et al.）、「フアー
ジλgt IIライブラリーからの効果的な遺伝子単離法：
変性した、アセトン沈殿蛋白質に対する抗血清の使
用」、ジーン（Gene）、39、89〜93頁（1985）；アール
・エイ・ヤングおよびアール・ダブリユー・デイビス
（R.A.Young and R.W.Davis）、プロシーデイングズ・
オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ
（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、80、1194〜98頁（198
3）；アール・エイ・ヤングおよびアール・ダブリユー
・デイビス（R.A.Young and R.W.Davis），サイエンス
（Science）、222、778〜82頁（1983））。 最初パードウ（Purdue）大学のデイ・ピイ・グスタフ
ソン（D.P.Gustafson）から入手したPRVライス（Rice）
株由来のPRVゲノムDNAをPRV感染ベロ（Vero）細胞（ATC
C CCL 81）の細胞質から単離した。ゲノムDNAを超音
波処理によつてフラグメント化し、次いでクローンして
λgt11に入れてλ/PRV組換体（λPRV）DNAライブラリー
を得た。 λPRVライブラリーをスクリーニングするための抗血
清はSDSゲル上でサイズにより分離したPRVで感染した細
胞（感染した細胞蛋白質またはICP）から単離した蛋白
質でマウスを接種し、次いで抗体を単離することによつ
て得た。スクリーニングされるべきλPRV フアージはl
acZ遺伝子の３′末端におけるユニークなクローニング
部位を含有するイー・コリ（E.coli.）λgt11のリンネ
ル布上で平板培養した。このユニーク部位に適当な配位
で挿入された外来性DNAおよび解読フレームは、発現に
際し、β−ガラクトシダーゼに融合したポリペプチドを
産生する。PRV DNAの発現を促進するlacZ転写の誘発物
質を含有するニトロセルロースフイルターを該リンネル
布の頂部上に置いた。λPRVによつて発現された融合ポ
リペプチドにニトロセルロースフイルターと結合するの
に十分な時間を与えた後、該フイルターをリンネル布か
ら取り除き、マウス抗血清でプローブした。マウス抗血
清に結合した抗原を産生するプラークをマウス抗血清に
ついてのラベル抗体でプローブすることによつて同定し
た。 陽性信号を与えるプラークを用いてイー・コリ（E.co
li）宿主を形質転換した（Y1090、ATCC、ロツクビル（R
ockville）、メリーランド州20852より入手可能）。次
いで、培養物を一晩インキユベートしてλPRV フアー
ジ株を得た。これらのフアージ株を用いてイー・コリ
（E.coli）K95を感染した（デイ・フリードマン（D.Fri
edman）、ザ・バクテリオフアージ・ランブダ（The Bac
teriophage Lambda）、733〜38頁、エイ・デイ・ハーシ
エイ（A.D.Hershey）編、（1971）。形質転換されたイ
ー・コリ（E.coli）K95によつて産生されたポリペプチ
ドを予備ゲル電気泳動によつて精製した。（lacZ遺伝子
の転写の誘導のため）過剰産生された、116000ダルトン
以上の分子量を有し、またλgt11対照培養物中に存在し
ないポリペプチドはβ−ガラクトシダーゼ−PRV融合蛋
白質であつた。次いで、各個々の融合蛋白質を異なるマ
ウスに注射して抗血清を得た。 例えば14C−グルコサミンを含有する培地中で増殖す
るベロ（Vero）細胞を感染することによつて標識PRV I
CPを得た（テイ・ジエイ・リーら（T.J.Rea et al.）、
前掲）。前記からの融合蛋白質抗血清を用いてこれらの
標識ICPを免疫沈降した。かく沈降したポリペプドをゲ
ル電気泳動によつて分析した。それらのうちの１つは11
0kd MW糖蛋白質（g I）およびもう１つは63Kd MW糖蛋白
質（gp63）であつた。かくして抗−g Iおよび抗−gp63
血清を生ぜしめるハイブリツド蛋白質を産生するフアー
ジ中でクローンされた遺伝子はg Iおよびgp63であるこ
とが示された。gp50配列がそうである如く（チヤートＤ
参照）、これらの遺伝子はPRVゲノムのBamH I7フラグメ
ント内部にマツプされることが判明した（テイ・ジエイ
・リーら（T.J.Rea et al.、前掲）。g Iの位置は、一
般に、メテンライターら（Mettenleiter et al.）、前
掲がg I遺伝子をマツプした領域に一致している。しか
し、メテンライターらMettenleiter et al.）は、実際
はそうではないがg I遺伝子がBamH I12フラグメント中
まで伸びることを示した。 DNA交雑および選択されたmRNAのin vitro翻訳に比し
てこのλPRV遺伝子単離法は迅速でありかつ効果的であ
る。精製された糖蛋白質が入手不可能であつたので、発
明者らはアミノ酸配列データからオリゴヌクレオチドプ
ローブを急速に組立てることができず、また高度に特異
的な多クローン抗血清を生成させることもできなかつ
た。従つて、発明者らは前記の方法を用いた。 前記した如く、gp50、gp63およびg Iをコード付けす
る遺伝子をPRV DNAのBamH I7フラグメントに対してマ
ツプした。PRVからのBamH I7ラグメントは（PUC1129と
しても公知の）プラスミドpPRXh1から得ることができ、
DNA配列分析に便利なフラグメントは標準的な継代クロ
ーニング法によつて得ることができる。プラスミドpUC1
129はイー・コリ（E.coli）HB101、NRR1 Ｂ−15772か
ら入手可能である。この培養物はノーザン・リージヨナ
ル・リサーチ・センター・フアーメンテイシヨン・ラボ
ラトリー（NRRL）、米国農務省、ペオリア（Peoria）、
イリノイ州、米国の永久寄託から入手可能である。 pUC1129を含有するイー・コリ（E.coli）HB101はよく
知られた方法によつてＬ−ブロス中で増殖させることが
できる。典型的には、培養物は0.6の光学密度まで増殖
させ、その後クロラムフエニコールを添加し、培養物を
一晩振盪する。次いで、例えば高濃度塩SDSを用いて培
養物を溶解し、上澄みを塩化セシウム／臭化エチジウム
平衡密度勾配遠心分離に付してプラスミドを得る。 これらの遺伝子配列の利用により該遺伝子および遺伝
子配列の直接操作が可能となり、それにより該遺伝子ま
たはそのフラグメントによつてコード付けされる蛋白質
の発現の調節および／または該蛋白質の構造の修飾が可
能となる。これらの遺伝子配列の知見により、交雑プロ
ーブとして公知の配列を用いてPRVのいずれの株からの
対応する遺伝子またはそのフラグメントをもクローンす
ること、ならびに一般に当該分野において公知の組換体
技術によつて完全な蛋白質またはそのフラグメントを発
現することが可能となる。 これらの遺伝子配列の知見により、発明者らは、対応
するポリペプチドのアミノ酸配列を推断することがてき
た（チヤートＡ〜Ｃ）。その結果、PRV免疫原性を有す
るこれらのポリペプチドのフラグメントは蛋白質合成の
標準法または組換体DNA法によつて産生できる。ここで
用いる如く、免疫原性および抗原性は適応免疫応答のい
ずれのタイプも刺激する能力について言及するのに相互
交換的に用いることができる。すなわち、抗原および抗
原性は抗体の産生を刺激する物質を意味することに限定
されない。 gp50、gp63およびg Iについてコード付けする遺伝子
の一次構造（配列）もチヤートＡ〜Ｃに記載する。 遺伝子またはそのフラグメントはNRRL Ｂ−15772の
培養物からのプラスミドDNAを適当なエンドヌクレアー
ゼ制限酵素で消化することによつてpUC1129から抽出で
きる。例えば、BamH I7フラグメントはBamH IでのpUC11
29の調製物の消化、およびゲル電気泳動による単離によ
つて単離できる。 本明細書中で言及するすべての制限エンドヌクレアー
ゼは商業的に入手可能であり、それらの使用は当該分野
においてよく知られている。使用のための指図書は、一
般に、制限酵素の販売業者によつて提供される。 切り取られた遺伝子またはそのフラグメントは宿主細
胞を形質転換するのに用いる各種クローニングビヒクル
またはベクターに結べる。好ましくは、該ベクターはPR
V糖蛋白質遺伝子の転写および翻訳（これらは一緒に発
現よりなる）を開始し、制御しおよび停止するDNA配列
を含有し、従つてそれに作動可能に連結している。これ
らの「発現制御配列」は、好ましくは形質転換されるべ
き宿主細胞に適合する。宿主細胞が高等動物細胞、例え
ば哺乳動物細胞である場合、糖蛋白質遺伝子の天然に生
じる発現制御配列を単独で、または異種発現制御配列と
共に使用できる。異種配列は、また、単独で用いること
ができる。該ベクターは、さらに好ましくは、標識遺伝
子（例えば、抗生物質耐性）を含有して形質転換宿主細
胞の選択についての表現型特徴を提供する。さらに、複
製ベクターはレプリコンを含有する。 典型的なベクターは動物細胞を感染するプラスミド、
フアージおよびウイルスである。基本的には、宿主細胞
を形質転換することができるいずれのDNA配列も用いる
ことができる。 本明細書中で用いる宿主細胞なる語はPRV糖蛋白質抗
原性を示すポリペプチドについてコード付けするDNA配
列で形質転換され得る細胞を意味する。好ましくは、宿
主細胞はRPVポリペプチドまたはそのフラグメントを発
現することができる。宿主細胞は原核または真核であり
得る。原核細胞の例としてはイー・コリ（E.coli）、ビ
イ・スブチリス（B.subtilis）、シユードモナス（Pseu
domonas）およびビイ・ステアロセルモフイラス（B.ste
arothermophilus）の如き細菌がある。真核細胞の例と
しては酵母または昆虫の細胞の如き高等動物細胞、植物
源もしくは哺乳動物源がある。哺乳動物細胞懸濁液も用
いることができるが、哺乳動物細胞システムはしばしば
細胞の単層の形態である。哺乳動物細胞系は、例えばベ
ロ（VERO）およびヒーラ細胞、チヤイニーズハムスター
卵巣（CHO）細胞系、WI38、BHK、COS−７またはMDCK細
胞系を包含する。昆虫細胞系はスポドプテラ・フルギペ
ルダ（Spodoptera frugiperda）（ATCC CRL1711）を包
含する。いくつかの入手可能な真核プラスミド、宿主細
胞ならびにPRV糖蛋白質をクローンするおよび発現する
ために使用する方法の要約はケイ・エセルら（K.Esser
et al.）、プラスミズ・オブ・エーカリオテス（Plasmi
ds of Eukaryotes）（フアンダメンタルズ・アンド・ア
プリケイシヨンズ（Fundamentals and Application
s））、シユプリンゲル−フエアラーク（Springer−Ver
lag）（1986）中に見い出すことができ、参照のために
ここに挙げる。 前記した如く、ベクター、例えば宿主細胞を形質転換
するのに用いられるプラスミドは、好ましくは、PRV糖
蛋白質遺伝子またはそのフラグメントの発現のための受
容可能な発現制御配列を含有する。従つて、発現制御配
列は遺伝子またはフラグメントに作動可能に連結する。
宿主細胞が細菌である場合、有用な発現制御配列の例は
trpプロモータおよびオペレータ（ゲデルら（Goeddel e
t al.）、ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Nucl.Ac
ids Res.）、８、4057（1980））;lacプロモータおよび
オペレータ（チヤンら（Cahng et al.）、ネイチヤー
（Nature）、275、615（1978））；外部膜蛋白質プロモ
ータ（ユアローピーアン・モレキユラー・バイオロジー
・オーガナイゼイシヨン・ジヤーナル（EMBO J.）、
１、771〜775（1982））；バクテリオフアージλプロモ
ータおよびオペレータ（ヌクレイツク・アシツズ・リサ
ーチ（Nucl.Acids Res.）、11、4677〜4688（198
3））；α−アミラーゼ（ビイ・スブチリス（B.subtili
s））プロモータおよびオペレータ、停止配列および他
の発現エンハンスメントならびに選択された宿主細胞に
適合する制御配列を包含する。宿主細胞が酵母である場
合、有用な発現制御配列の例は、例えばα−交配因子を
包含する。昆虫細胞については、バクロウイルスのポリ
ヘドリンプロモータを用いることができる（モレキユラ
ー・アンド・セリユラー・バイオロジー（Mol.Cell.Bio
l.）、３、2156〜65頁（1983））。宿主細胞が昆虫また
は哺乳動物由来である場合、有用な発現制御配列の例
は、例えばSV−40プロモータ（サイエス（Science）、2
22、524〜527（1983））または例えばメタロチオネイン
プロモータ（ネイチヤー（Nature）、296、39〜42（198
2））または熱シヨツクプロモータ（ボエルミイら（Voe
llmy et al.）、プロシーデイングズ・オブ・ナシヨナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Aca
d.Sci.）USA、82、4949〜53頁（1985））を包含する。
前記した如く、宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、PR
V糖蛋白質遺伝子についての発現制御配列を、好ましく
は異種発現制御配列と組合せて用いることができる。 発現制御配列を含有するプラスミドまたは複製もしく
は取込みDNA物質は制限酵素を用いて切断され、要すれ
ばまたは所望によりサイズを調製し、次いで当該分野で
よく知られた方法によつてPRV糖蛋白質遺伝子またはそ
のフラグメントで結ぶ。酵母または高等動物宿主細胞を
使用する場合、公知の酵母もしくは哺乳動物遺伝子から
のポリアデニレーシヨンもしくはターミネーター配列を
ベクター中に一体化することができる。例えば、ヨーロ
ツパ特許公開番号0093619中に記載されている如くウシ
成長ホルモンポリアデニレーシヨン配列を用いることが
でき、ここに参照のために挙げる。さらに、宿主細胞の
複製を制御するための遺伝子配列をベクター中に一体化
することができる。 宿主細胞は形質転換について受容可能である、あるい
は各種方法によつて受容可能とされる。細菌細胞が宿主
細胞である場合、コーヘン（Cohen）、ピイ・エヌ・エ
イ・エス（PNAS）、69、2110（1972）によつて一般的に
記載されている如く、塩、典型的にはカルシウム塩での
処理によつてそれを受容可能とできる。一般に、酵母宿
主細胞はその細胞壁の除去またはイオン処理の如き他の
方法によつて受容可能とされる（ジヤーナル・オブ・バ
クテリオロジー（J.Bacteriol.）、153、163〜168（198
3））。例えばリン酸カルシウム沈降、DNAを含有する細
菌プロトプラストでの受容体細胞の融合、DNAを含有す
るリポソームでの受容体細胞の処理、およびDNAの細胞
中への直接マイクロインジエクシヨンを包含するいくつ
かのよく知られたDNAの動物細胞中への導入法がある。 形質転換細胞は当該分野でよく知られた方法によつて
増殖し（モレキユラー・クローニング（Molecular Clon
ing）、マニアテイス・テイら（Maniatis T.et al.）、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold
Spring Harbor Laboratory）、（1982）；バイオケミ
カル・メソツズ・イン・セル・カルチヤー・アンド・バ
イロロジー（Biochemical Methods In Cell Culture an
d Virology）、クチラー・アール・ジエイ（Kuchler R.
J.）、ドウデン（Dowden）、ヒツチンソン・アンド・ロ
ス・インコーポレイテイツド（Hutchinson and Ross、I
nc.）、（1977）；メソツズ・イン・イースト・ジエネ
テイツクス（Methods In Yeast Genetics）、シエルマ
ン・エフら（Sherman、F.et al.）、コールド・スプリ
ング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor L
aboratory）、（1982））、発現されたPRV糖蛋白質また
はそのフラグメントは、例えば当該分野でよく知られた
機械的もしくは酵素的方法によつて宿主細胞系を破壊し
た後、宿主細胞または細胞懸濁液から蛋白質が排出され
る系において細胞培養物から収穫される。 前記した如く、遺伝子構造から推断したPRV糖蛋白質
のアミノ酸配列はチヤートＡ〜Ｃに記載する。PRV糖蛋
白質抗原性を示すポリペプチドはチヤートＡ〜Ｃに記載
した配列ならびにポリペプチド配列およびまた該ポリペ
プチドの免疫原的機能同族体を注射された動物、例えば
哺乳動物において免疫応答を引き出すことができるポリ
ペプチド配列のいずれの部分も包含する。 前記で示した如く、PRV糖蛋白質についてコード付け
する完全な遺伝子をベクターを組立てるのにおよび宿主
細胞を形質転換するのに用いてPRV糖蛋白質を発現する
ことができ、あるいはPRV糖蛋白質をコード付けする遺
伝子のフラグメントを用いることができ、それにより得
られた宿主細胞はPRV抗原性を示すポリペプチドを発現
する。PRV糖蛋白質遺伝子のいずれのフラグメントも用
いることができ、その結果PRV糖蛋白質の免疫原フラグ
メントまたはその同族体であるポリペプチドを発現す
る。当該分野においてよく知られている如く、遺伝コー
ドの縮退はPRV糖蛋白質抗原性を示すポリペプチドをコ
ード付けする機能的に均等な遺伝子またはそのフラグメ
ントを産生するための塩基対の容易な置換を可能とす
る。これらの機能的均等物も本発明の範囲内に包含され
る。 チヤートＤ−Ｓは実施例の組立てを示すために掲げ
る。プラスミドおよびDNAフラグメントを示すのに以下
の如くある約束事を用いる： （１）単一線の図は環状および直線状の日本鎖DNAを共
に表わす。 （２）星印（＊）は表わされた分子が環状であることを
示す。星印が無いのは分子が直線状であることを示す。 （３）注目するエンドヌクレアーゼ制限部位は直線の上
方に示す。 （４）遺伝子は直線の下方に示す。 （５）遺伝子および制限部位間の距離はスケール通りで
はない。特に断りのない限り、図は相対的な位置のみを
示す。 本発明を実施するのに用いる組換体DNA法のほとんど
は当業者によく知られた標準的な方法であり、例えばモ
レキユラー・クローニング（Molecular Cloning）、テ
イ・マニアテイスら（T.Maniatis et al.）、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring
Harbor Laboratory）、（1982）およびビイ・パーバル
（B.Perbal）、ア・プラクテイカル・ガイド・トウ・モ
レキユラー・クロウニング（A Practical Guide to Mol
ecular Cloning）、ジヨン・ウイリイ・アンド・サンズ
（John Wiley ＆ Sons）、（1984）中に詳しく記載され
ており、参照のためにここに挙げる。 実施例１ 本実施例においてはPRV糖蛋白質gp50の配列決定、ク
ローニングおよび発現を記載する。 1.gp50遺伝子の配列決定 gp50遺伝子をコード付けするPRVライス（Rice）株DNA
のBamH I7フラグメント（チヤートＤ）をpRPXh1〔NRRL
B−15772〕、前掲、から単離し、継代クローンしてプラ
スミドpBR322のBamH I部位に入れる（マニアテイスら
（Maniatis et al.）、前掲）。 以下、チヤートＥを参照して、Pvu IIでBamH Iを消化
し、２つのBamH I/Pvu IIフラグメント（1.5および4.9k
b）を単離し次いでpBR322のBamH IおよびPvu II部位間
でそれらを継代クローンすることによる標準法を用いて
該フラグメントをさらに継代クローンして各々1.5およ
び4.9kbフラグメントを一体化するプラスミドpPR28−４
およびpPR28−１を得る（リーら（Rea et al.）、前
掲、も参照）。これらの継代クローンはDNA配列決定実
験のためのDNA源として用いる。 チヤートＦはgp50遺伝子中に位置する各種制限酵素切
断部位およびフランキング領域を示す。前記で継代クロ
ーンした1.5および4.9kbフラグメントをこれらの制限酵
素で消化する。制限酵素によつて生じた各末端をポリヌ
クレオチドキナーゼを用いてγ−32P−ATPでラベルし、
マキサムおよびギルバード（Maxam and Gilbert）、メ
ソツズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymo
l.）、65、499〜560（1980）の方法により配列する。完
全な遺伝子を両鎖上に少くとも２回配列する。gp50につ
いてのDNA配列をチヤートＡに掲げる。このDNAはPRVに
能動的に感染した動物を検知するのに用いることができ
る。例えば、鼻もしくはのどを綿紡で拭いて試料採取
し、次いで標準法によりDNA/DNA交雑を行つてPRVの存在
を検知する。 2.gp50の発現 以下、チヤートＧを参照して、Nra I切断部位はgp50
遺伝子翻訳開始コードンから塩基対35個だけ上流に位置
する。発現における第一工程はNar I切断部位の地点に
おける便利なBamH I切断部位の挿入である。前記からの
プラスミドpPR28−４を制限エンドヌクレアーゼNar Iで
消化してgp50遺伝子の端部をコード付けするＮ末端およ
びg X遺伝子の一部よりなるDNAフラグメント３を得る。
BamH Iリンカーをフラグメント３に加え、該フラグメン
トをBamH Iで消化してg X配列を欠失し、かくしてフラ
グメント４を得る。次いでBamH I末端を結んでプラスミ
ドpPR28−4Nar2を得る。 以下、チヤートＨを参照して、完全なgp50遺伝子の組
立てが示される。pPR28−4Nar2をBamH IおよびPvu IIで
消化してgp50遺伝子のＮ−末端コード付け部分よりなる
フラグメント５（160bp）を得る。また、前記からのプ
ラスミドpPR28−１をPvu IIおよびBamH Iで消化してgp5
0遺伝子のＣ末端モード付け部分よりなる4.9kbフラグメ
ントを得る（フラグメント６）。（米国特許出願SN7601
30号に記載されている如く組立てた）プラスミドpPGX
1、または別法としてプラスミドpBR322をBamH Iで消化
し、細菌アルカリホスフアターゼ（BAP）で処理し、次
いでフラグメント５および６で結んで完全なgp50遺伝子
よりなるプラスミドpGBP50−23を得る。 以下、チヤートＩを参照して、プラスミドpD50の産生
が示される。プラスミドpBG50−23を制限酵素Mae IIIで
切断して（ケイ・シユミツトら（K.Schmid et al.）、
ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Nucl.Acids Re
s.）、12、2619頁（1984））フラグメントの混合物を得
る。Mae III末端をT4DNAポリメラーゼで平滑末端とし、
EcoR Iリンカーを該平滑末端に加え、続いてEcoR I消化
を行う。得られたフラグメントをBamH Iで切断し、gp50
遺伝子を含有する1.3kb BamH I/EcoR Iフラグメント
（フラグメント７）を単離する。（アメリカン・タイプ
・カルチヤー・コレクシヨン（American Type Culture
Collection）、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ
（Bethesda Research Laboratories）から得た、または
エス・スブラマニら（S.Subramani et al.）、モレキユ
ラー・アンド・セリユラー・バイオロジー（Mol.Cell.B
iol.）、２、854〜64頁（1981）の方法により合成し
た）プラスミドpSV2dhfrをBamH IおよびEcoR Iで消化
し、より大きい（5.0kb）フラグメントを単離してジヒ
ドロ葉酸還元酵素（dhfr）標識を含有するフラグメント
８を得る。次いでフラグメント７および８を結んでgp50
遺伝子およびdhfr標識を含有するプラスミドpD50を得
る。 以下、チヤートＪを参照して、ヒトサイトメガロウイ
ルスタウネ（Towne）株からの即時型プロモータをgp50
遺伝子より上流に加える。pD50をBamH Iで消化し、細菌
アルカリホスフアターゼで処理してフラグメント９を得
る。ヒトサイトメガロウイルス（タウネ（Towne））即
時型プロモータを含有する760bpSau3Aフラグメントを米
国特許出願SN758517号に記載された方法によつて単離し
てフラグメント10を得る（デイ・アール・トムソンら
（D.R.Thomson et al.）、プロシーデイングズ・オブ・
ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Nat
l・Acad.Sci.）USA、81、659〜63頁（1984）も参照）。
次いで、BamH I/Sau3A融合によつてこれらのフラグメン
トを結んでプラスミドpDIE50を得る。プロモータがgp50
遺伝子を転写するのに適当な配位であることを確認する
ために該プラスミドをSac IおよびPvu IIで消化し、185
bpフラグメントを得る。 以下、チヤートＫを参照して、ウシ成長ホルモンポリ
アデニレーシヨン信号を含有する0.6kb Pvu II/EcoR I
フラグメントをPvu IIおよびEcoR Iでの消化によつてプ
ラスミドpGH2R2から（アール・ピイ・ウオイチツクら
（R.P.Woychik et al.）、ヌクレイツク・アシツズ・リ
サーチ（Nucl.Acids Res.）、10、7197〜7210頁（198
2））から、あるいはpSVCOW7（前掲）から単離してフラ
グメント11を得る。 フラグメント11を（フアルマシア（Pharmacia）/PLま
たはATCCから入手した）pUC9のEcoR IおよびSma I切断
部位間にクローンする。pCOWT1をSal Iで切断し、T4DNA
ポリメラーゼで平滑末端とし、EcoR Iリンカーを加え、
該DNAをEcoR Iで切断し、0.6kbフラグメント（フラグメ
ント12）を単離する。これは２個のEcoR I末端および１
の末端にポリリンカー配列を有する以外はフラグメント
11と同一である。 プラスミドpDIE50をEcoR Iで切断し、フラグメント12
をクローンしてそれに入れてプラスミドpDIE50PAを得
る。ポリアデニレーシヨン信号が適当な配位である場
合、BamH IおよびPvu IIでの消化により1.1kbのフラグ
メントを得る。該プラスミドはプロモータ前のポリアデ
ニレーシヨン配列におけるクローニングによつても組立
てることができる。 プラスミドpDIE50PAを用いてサケ精子キヤリアDNAと
リン酸カルシウムとの共沈降（エフ・エル・グラハムお
よびエイ・ジエン・バン・デル・エブ（F.L.Graham and
A.J.Van Der Eb）、バイロロジー（Virol.）、52、456
〜67（1973））によりCHO dhfr-細胞をトランスフエク
トする（DXB−11、ジイ・ウルラウブおよびエル・エイ
・チヤシン（G.Urlaub and L.A.Chasin）、プロシーデ
イングズ・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ（Proc.Natl・Acad.Sci.）USA、77、4216〜20
（1980））。ジヒドロ葉酸還元酵素陽性（dhfr+）のト
ランスフエクトされた細胞をダルベツコの修正イーグル
培地＋イーグルの非須アミノ酸＋10％胎児子ウシ血清中
で選択する。選択したdhfr+CHO細胞は、抗gp50単クロー
ン抗体3A−４での免疫螢光法により、あるいは14C−グ
ルコサミンでの標識および3A−４での免疫沈降によつて
検知されるgp50を産生する。単クローン抗体3A−４は19
85年１月９日出願の同時係属米国特許出願SN817429号に
記載されている如くに産生される。免疫沈降反応は次に
示す以外は前記した（テイ・ジエイ・リーら（T.J.Rea
et al.）、前掲）、如くに行う：まず抽出物を正常なマ
ウス血清、続いて洗浄したスタフイロコツカス・アウレ
ウス（Staphylococcus aureus）細胞と共にインギユベ
ートし、ベツクマン（Beckman）SW50.1ローター中、400
00rpmにて30分間遠心する。抽出物を単クローンもしく
は多クローン抗血清とエス・アウレウス（S.Aureus）細
胞と共にインキユベートした後、10mMトリスHCl、pH7.
0、1mA EDTA、0.1M NaCl、１％NP40および0.5％デオキ
シコレート中で細胞を３回洗浄する。蛋白質の分析は11
％SDSポリアクリルアミドゲル上で行う（エル・モース
ら（L.Morse et al.）、ジヤーナル・オブ・バイロロジ
ー（J.Virol.）、26、389〜410頁（1984））。予備免疫
螢光アツセイにおいて、3A−４はpDIE50PAでトランフエ
クトされたCHO細胞と反応するがトランスフエクトされ
ていないCHO細胞とは反応しないことが判明した。トラ
ンスフエクトされたCHO細胞を14C−グルコサミンでラベ
ルした場合、3A−４はpDIE50PAを含有する細胞からラベ
ルした蛋白質を免疫沈降させたが、ヒトレニンを生成す
る対照細胞からは免疫沈降されなかつた。沈降した蛋白
質はSDS−ポリアクリルアミドゲル上でPRV感染細胞から
の3A−４により沈降した蛋白質と一緒に移動した。 gp50を産生するこれらのトランスフエクトされたCHO
細胞のクローンはローラー・ボトル（roller bottle）
中で増殖し、リン酸緩衝食塩水および1mM EDTA中で収穫
し、ワクチンとして使用するために完全フロイントアジ
ユバント混合できる。 また、gp50遺伝子はワクチニアベクターにおいて発現
することができる。この具体例においては、pBG50−23
をMae IIIで消化し次いでT4DNAポリメラーゼで平滑末端
とした後、該DNAをBamH Iで消化する。gp50遺伝子を含
有する1.3BamH I/平滑末端フラグメントを単離する。プ
ラスミドpGS20（マケツトら（Mackett et al.）、ジヤ
ーナル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）49、876〜64
頁（1984））をBamH IおよびSma Iで切断し、ゲル電気
泳動によつてより大きい6.5kbフラグメントを単離す
る。これらの２のフラグメントを一緒に結んでpVV50を
得る。プラスミドpVV50をトランスフエクトしてワクチ
ニアウイルスのWR株（ATCC VR−119）で感染したCV−１
細胞（ATCC CCL70）に入れ、マケツトら（Mackett et a
l.）、デイ・エヌ・エイ・クロウニング（DNA Clonin
g）、II巻：ア・プラクテイカル・アプローチ（A Pract
ical Approach）、デイ・エム・グロウバー（D.M.Glove
r）編、アイ・アール・エル・プレス（IRL Press）、オ
ツクスフオード（1985）により記載されている方法によ
り５−プロモデオキシ−ウリジン（BUdR）中で143細胞
（ATCC CRL 8303）上で平板培養することによつてチミ
ジンキナーゼ陰性組換体について選択する。14C−グル
コミサミンでの感染細胞の蛋白質のラベルおよび単クロ
ーン抗体3A−４での免疫沈降によつてアツセイを行つた
如く、得られたウイルス、ワクチニア−gp50は感染細胞
においてgp50を発現した。 実施例２ 本実施例では、実施例１のgp50を免疫原剤として用い
るマウスおよびブタのPRV攻撃からの保護を記載する。 後掲の第１〜３表では、以下の如くにミクロ中和アツ
セイを行つた:3％胎児子ウシ血清および抗生物質を補足
した基礎培地イーグル（BME）を用い、ミクロ滴定プレ
ート（コスター（Costar））中で血清試料の系列的な２
倍希釈を行つた。PRVの約1000pfu（50μ）を各希釈物
50μに添加した。マウス血清アツセイについては、1:
5の希釈におけるウイルスの一部にいラビツト補体が包
含されていたが、ブタ血清アツセイについては包含され
ていなかつた。試料を37℃にて１時間（ブタ血清）また
は３時間（マウス血清）のいずれかインキユベートし
た。インキユベーシヨン時間の後、イーグルの最小必須
培地中のブタ腎臓−15（PK−15）細胞（300000細胞/m
l）の一部50μをPRV試料につき各血清に添加した。ひ
き続いて、試料を37℃にて２日間インキユベートした。
中和による力価は50％の細胞を細胞病理効果から保護し
た最高の希釈の逆数を表わす。 第１表はワクチニアウイルスにおいて産生されたgp50
での免疫化による、ビルレトンPRVによる攻撃からのマ
ウスの保護を示す。25μでの尾乱切または50μでの
肉趾経路によつてマウスを免疫化した。攻撃の28日前に
マウスを免疫化した（攻撃の14日前に免疫化したPR−Va
cを投与したマウスを除く）。 第２表はCHO細胞において産生されたgp50での免疫化
による、ビルレントPRVによる攻撃からのマウスの保護
を示す。攻撃の28日前、18日前および７日前にマウスを
免疫化した。第１投与ではアジユバントと共に調製物を
マウスに皮下投与し、第２および第３投与では食塩水中
の調製物を腹腔内投与した。各マウスに106破壊細胞／
投与で投与した。 第３表はCHO細胞において産生したgp50での免疫化に
よる、ビルレントPRVによる攻撃からのブタの保護を示
す。攻撃の21日前および７日前にブタを免疫化した。投
与当たり２×107個の破壊細胞をブタに与えた。最初の
投与量は完全フロイントアジユバントと混合し、一方第
２の投与量は食塩水中に懸濁した。両投与量は筋肉内投
与した。 gp50は抗体の中和をひき起こし、致命的なPRV攻撃か
らマウスおよびブタを保護することができることをこれ
らの３つの表は示す。 本発明のもう１つの態様において、発明者らはgp50の
Ｃ末端端部についてコード付けするDNAを除去すること
によつて糖蛋白質gp50の誘導体を得た。得られたポリペ
プチドは細胞膜中にgp50を固定するのに必要なアミノ酸
配列について欠失を有する。哺乳動物細胞において発現
された場合、このgp50誘導体は培地中に分泌される。サ
ブユニツトワクチンとして用いるためのこのgp50誘導体
の培地からの精製は全細胞の分画よりもかなり簡単であ
る。膜蛋白質を分泌蛋白質に変換するためのアンカー配
列の除去は最初インフルエンザ赤血球凝集素遺伝子につ
いて示された（エム−ジエイ・ゲシングおよびジエイ・
サンブルツク（M.−J.Gething and J.Sambrook）、ネイ
チヤー（Nature）、300、598〜603頁（1982））。 以下、チヤートＬを参照して、前記からのプラスミド
pDIE50をSa1 IおよびEcoR Iで消化する。5.0および0.7k
bフラグメントを単離する。gp50の一部をコード付けす
る0.7kbフラグメントをSau3Aで消化し、0.5kb Sa1 I/Sa
u3Aフラグメントを単離する。切断されたgp50遺伝子後
方の停止コードンを産生するには、以下のオリゴヌクレ
オチドを合成する。 5.0kb EcoR I/Sa1 Iフラグメント、0.5kb Sa1 I/Sau3
Aフラグメントおよびアニールしたオルゴヌクレオチド
を結んでプラスミドpDIE50Tを得る。EcoR IおよびSa1 I
での消化により580bpフラグメントを得る。pDIE50TをEc
oR Iで切断し、6GHポリAb部位を含有する0.6kb EcoR I
フラグメント（フラグメント12）を中にクローンしてプ
ラスミドpDIE50TPAを得る。ポリアデニレーシヨン信号
が適当な配位である場合、pDIE50TPAをBamH IおよびPvu
IIで消化して970bpフラグメントを得る。 pDIE50TPAを用いてCHO dhfr-細胞をトランスフエクト
する。35S−メチオニンでのラベルおよび免疫沈降によ
つて検知される如く、選択したdhfr+CHO細胞はgp50の切
断形を産生し、それを培地中へ分泌する。 実施例３ 本実施例において、発明者らはgp63およびg I遺伝子
の単離、クローニングおよび配列決定を記載する。 1.ライブラリーの組立て 前記（テイ・ジエイ・リーら（T.J.Rea et al.）、前
掲）した如く、RPVゲノムDNAを調製した。各回ともにブ
ランソン（Branson）200超音波処理器を２に設定し、PR
Vライス（Rice）株のPRVゲノムDNAを４秒間で２回超音
波処理することによつて0.5〜3.0kbのフラグメントを得
た。T4DNAポリメラーゼでフラグメントを平滑末端とし
た後、該フラグメントをキナーゼ処理したEcoR Iリンカ
ーに結んだ（テイ・マニアテイスら（T.Maniatis et a
l.）、前掲）。EcoR Iでの過剰消化の後（PRV DNAはEco
R I部位を含有しないので、メチル化は不必要であつ
た）、アガロースゲル電気泳動によつて過剰のリンカー
を除去した。所望のサイズ範囲にあるPRV DNAフラグメ
ントをガラススラリー法によつて溶出した（ビイ・ボゲ
ルステインおよびデイ・ギレスピー（B.Vogelstein and
D.Gileispie）、プロシーデイングズ・オブ・ナシヨナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Aca
d.Sci.）USA、76、615〜19頁（1979））。最終的に10μ
の容量とした50mMトリス（pH7.4）、10mM MgCl2、10m
Mジチオスレイトール、1mMスペルミジン、1mM ATP、T4D
NAリガーゼ400単位（ニユー・イングランド・バイオラ
ブズ（New England Biolabs））中でPRV DNAフラグメン
ト500ngをEcoR Iで消化したλgt II（アール・エイ・ヤ
ングおよびアール・ダブリユー・デイビス（R.A.Yaung
and R.W.Davis）、前掲）DNAに結ぶことによつて61000
λ/PRV組換体（λPRV）のライブラリーを組立てた。パ
ツカジーン（Packgene）抽出物（プロメガ・バイオテク
（Promega Biotec）、マジソン、ウイスコンシン州）を
用いて、結んだDNAをバクテリオフアージλウイルス粒
子中に充填した。 2.λPRVライブラリーのスクリーニング 前記（ジエイ・ジイ・テイミンズら（J.G.Timmins et
al.）、前掲；アール・エイ・ヤングおよびアール・ダ
ブリユー・デイビス（R.A.Young and R.W.Davis）、前
掲）した如く、λRPVライブラリーをスクリーニングし
た。20000フアージを150mmLB−アンピシリンプレートを
介してスクリーニングした。SDS−ポリアクリルアミド
ゲルから溶出したPRV感染細胞蛋白質（ICP）のサイズに
より分画した画分をマウスに注射することによつてスク
リーニングした抗血清を生成した（ジエイ・ジイ・テイ
ミンズら（J.G.Timmins et al.）、前掲）。抗血清での
スクリーニングに際し陽性信号を与えるプラークを滅菌
したパスツールピペツトでアガールから取り、SM緩衝液
（テイ・マニアテイスら（T.Maniatis et al.）、前
掲）1ml中に再懸濁し、再度スクリーニングした。プラ
ークが陽性に反応することについて均質になるまでスク
リーニングをくり返した。 約43000λPRV組換体をマウク抗血清でPRV感染ベロ（V
ero）細胞蛋白質に対してスクリーニングし、SDS−ポリ
アクリルアミドゲルから単離した。60の陽性λPRVフア
ージを単離した。 3.フアージ株の調製 プレート溶解物法（テイ・マニアテイスら（T.Maniat
is et al.）、前掲）により高力価フアージ株（1010〜1
011pfu/ml）を調製した。単一の十分単離した陽性信号
プラークを選択し、SM1mlに再懸濁した。懸濁液100μ
を37℃で15分間、（アメリカン・タイプ・カルチヤー・
コレクシヨン（American Type Culture Collection）
（ATCC）、ロツクビル、メリーランド州から入手可能
な）イー・コリ（E.coli）Y1090 300μに吸着させ、L
B−頂部のアガロース10mlで希釈し、150mmのLB−アンピ
シリンプレート上に一様に注ぎ、42℃にて一晩インキユ
ベートした。頂部アガロースを火炎処理したガラススラ
イドで穏かにかき取り、30mlのコレツクス（Corex）試
験管に移した。SM8mlおよびクロロホルム250μを加
え、混合し、37℃にて15分間インキユベートした。溶解
物をHB−４ローター中、10000rpmでの30分間の遠心分離
によつて精製した。フアージ株を0.3％クロロホルムと
共に４℃にて保存した。 ４・融合蛋白質の調製および分析 LB培地（マニアテイスら（Maniatis et al.）、前
掲）をイー・コリ（E.coli）K95（sup-、λ−、ga-、st
rγ、nusA-;デイ・フリードマン（D.Friedman）、前
掲）の新たに一晩培養した培養物で1:50にて接種し、30
℃においてOD550＝0.5となるまで増殖した。培養物25ml
をλPRVフアージで５の多重度にて感染し、42℃の振盪
水浴中で25分間インキユベートし、続いて２〜３時間で
37℃まで移した。HB−４ローター中、5000rpmにて10分
間細胞をペレツト化し、100mMトリス（pH7.8）、300mM
NaClの100μに再懸濁した。等容量の２×SDS−PAGE試
料緩衝液を加え、試料を10分間沸騰した。エル・モース
ら（L.Morse et al.）、ジヤーナル・オブ・バイロロジ
ー（J.Virol.）、26、389〜410頁（1978）に記載されて
いる如く、分析用SDS−ポリアクリルアミドゲル上の電
気泳動によつて試料各５μを分析した。マウスの注射
用に、融合ポリペプチドの調製を10倍にスケールアツプ
した。ゲル片をコーマシーブルーで染色した後、β−ガ
ラクトシダーゼ/PRV融合ポリペプチドを単離した（エル
・モースら（L.Morse et al.）、前掲：ケイ・ウエーバ
ーおよびエム・オスボルン（K.Weber and M.Osborn）、
ザ・プロテインズ（The Proteins）、１、179〜223（19
75））。分析用SDS−PAGEによつて融合ポリペプチド量
を見積つた。λPRV感染イー・コリ（E.coli）K95培養物
からの細胞溶解物を9.25％SDS−ポリアクリルアミドゲ
ルで電気泳動に付した。λgt II−感染対照がない分子
量116000ダルトン以上の過剰産生ポリペプチドバンドは
β−ガラクトシダーゼ−PRV融合ポリペプチドであつ
た。β−ガラクトシダーゼ−PRV融合ポリペプチドはサ
イズが129000〜158000ダルトンの範囲であつた。融合ポ
リペプチド約50〜75μｇを完全フロイントアジユバント
中に再懸濁し、マウスにつき皮下および腹腔内注射し
た。後の注射は不完全フロイントアジユバント中で腹腔
内に行つた。 5.抗血清分析 前記（テイ・ジエイ・リーら（T.J.Rea et al.）、前
掲）した如く、14C−グルコミサンIPC、35S−メチオニ
ンICPおよび14−グルコミサンg Xの免疫沈降を行つた。
これらの方法によりgp63およびg Iがλgt II組換体フア
ージ中に単離されたことが示された。発明者らはこれら
のフアージをλ37およびλ36（gp63）およびλ23（g
I）と命名した。 6.λDNAの小規模調製 平板培養溶解物からバクテリオフアージを迅速に単離
した（テイ・ジエイ・シルハビイら（T.J.Silhavy et a
l.）、エクスペリメンツ・ウイズ・ジーン・ヒユージヨ
ンズ（Experiments With Gene Fusions）、1984））。
５％および40％グリセロール段（SM緩衝液中で各3ml）
をSW41試験管中で重ねた。平板培養溶解物（〜6ml）を
重ね、４℃にて35000rpmで60分間遠心分離した。上澄み
を捨て、フアージペレツトをSM1mlに再懸濁した。DNア
ーゼＩおよびRNアーゼＡを加えて１μg/mlおよび10μg/
mlの最終濃度とした。37℃での30分間のインキユベーシ
ヨンの後、SDSミックス（0.25M EDTE、0.5Mトリス（pH
7.8）、2.5％SDS）200μおよびプロテイナーゼＫ（〜
1mg/ml）を加え、68℃にて30分間インキユベートした。
λDNAをフエノールで３回抽出し、クロロホルムで抽出
し、エタノールで沈殿させた。平均150mmの平板培養溶
解物からλDNA5〜10μｇを得る。 7.λPRV DNA分析 BamH IおよびKpn IでPRV DNAを完全に消化し、0.8％
アガロース中で電気泳動に対し、サザーン（Southern）
の方法によるニトロセルロースに移した（ジヤーナル・
オブ・モレキユラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、9
8、507〜17（1975））。ブロツテイング物を4mm片にス
ライスし、20〜25℃にて乾燥状態にて保存した。λPRV
DNAに対してニツクトランスレーシヨン（アメルスハ
ム（Amersham））を行つて約108cpm/μｇの特異的活性
とする。６×SSC、30％ホルムアミド、１×デンハルト
（Denhardt）試薬（フイコール（ficoll）、ポリビリル
ピロリドンおよびウシ血清アルブミンの各0.02％）、0.
1％SDS、50μg/ml異種DNA中、プレ交雑を70℃にて１時
間行つた。同一溶液中、交雑を70℃にて16時間行つた。
15分間の洗浄を２×SSC、0.1％SDS中で２回、0.1×SSC
および0.1％SDS中で２回、すべて20〜20℃にて行つた。
ブロツテイング物を〜70℃にて一晩増感板上でオートラ
ジオグラフイーに付した。 サザーンブロツテイング法によつて、λ23、λ36およ
びλ37中に含有されたPRV糖蛋白質遺伝子をユニークな
小領域中のBamH I7フラグメントに対してマツプした
（テイ・ジエイ・リーら（T.J.Rea et al.）、前掲）。
チヤートＤに示す如くこのフラグメントのより精密なマ
ツピングはλ23（g I）遺伝子に対して遠位にマツプさ
れ、λ37がBamH I7の内部領域に対してマツプされたこ
とを示した。 8.gp63およびg I遺伝子の配列決定 λ36およびλ37中のRPV DNAはStu I切断部位を含有
することが決定された。BamH I7フラグメント中にはた
だ１つのStu I切断部位が存在する；従つて、Stu I切断
部位を包含したオープンリーデイングフレームは配列さ
れた。チヤートＥは各種制限酵素切断部位がgp63遺伝子
およびフランキング領域中に位置することを示す。BamH
I7を継代クローンし、これらの制限酵素で消化した。
マクサムおよびギルバート（Maxam and Gilbert）、メ
ソツズ・イン・エンザイモロジー（Methods Enzymo
l.）、65、499〜560（1980）の方法により、ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いて制限酵素によつて生じた各末端
をγ−32P−ATPでラベルし、配列した。 pUC1129から単離したBamH I7フラグメントをクローン
してプラスミドpSV2gptに入れることによつてプラスミ
ドpPR28を得た（アール・シイ・ムリガンおよびピイ・
ベルグ（R.C.Mulligan and P.Berg）、プロシーデイン
グズ・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエン
シズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、78、2072〜76（198
1））。 Pvu IIでpPR28を消化し次いでイー・コリ（E.coli）
複製開始点およびbla遺伝子を含有する切断片を再環化
してg IについてのDNA配列を含有する4.9kbPvu II/BamH
I7PRVフラグメントよりなるプラスミドを得ることによ
つてプラスミドpPR28−１を得た。 チヤートＮはg I遺伝子およびフランキング領域中に
位置する各種制限酵素切断部位を示す。前記した如くBa
mH I7を継代クローンし、消化し、ラベルし、配列し
た。 糖蛋白質gp63およびg IについてのDNA配列を各々チヤ
ートＢおよびＣに示す。このDNAを用いてPRVに能動的に
感染した動物を検知することができる。例えば、鼻また
はのどを綿紡で拭いて試料採取し、次いで標準的なDNA/
DNA交雑法によつてPRVの存在を検知できる。 実施例４ 本実施例において、発明者らは哺乳動物におけるg I
の発現を記載する。 プラスミドpPR28（前記参照）をBamH Iで消化し、該
フラグメントをアガロースゲル上で分離し、次いでゲル
から該フラグメントを切り取ることによつてg I遺伝子
を含有するBamH I7フラグメントを該プラスミドから単
離する。 以下、チヤートＯを参照して、次いで前記で単離した
BamH I7フラグメントをクローンして（フアルマシア（P
harmacia）/PLから購入した）プラスミドpUC19中に入れ
てプラスミドＡを得る。プラスミドＡをDra Iで消化す
る。Dra IはpUC19配列をいくつかの個所で切断するが、
gp63およびg I遺伝子間のBamH I7配列においては一度だ
けしか切断せずに（チヤートＤ）なかんずくフラグメン
ト１を得る。BamH Iリンカーをフラグメント１を包含す
るフラグメントのDra I末端上に結び、得られたフラグ
メント混合物をBamH Iで消化する。アガロースゲル電気
泳動によつて産生物フラグメントを分離し、g I遺伝子
を含有する2.5kbフラグメント２を精製する。フラグメ
ント２をクローンしてBamH Iで消化したpUC19に入れて
プラスミドpUCD/Bを得る。かく産生した２のプラスミド
のうち適当な配位にあるg I遺伝子を含有するプラスミ
ドをBsm IおよびEcoR Iでプラスミドを消化することに
よつて決定する：該適当な配位にあるプラスミドは特徴
的な750bpBsm I/EcoR Iフラグメントを含有する。 以下、チヤートＰを参照して、プラスミドpUCD/B（チ
ヤートＯ）をBsm IおよびEcoR Iで消化し、より大きな
フラグメント（フラグメント３、4.4kb）をアガロース
ゲル電気泳動によつて精製する。以下の２種のオリゴヌ
クレオチドをよく知られた技術により化学的に合成する
か、あるいはコマーシヤル・カスタム・シンセシス・サ
ービス（commercial custom synthesis service）から
購入する。 これらのオリゴヌクレオチドをフラグメント３に結ん
でBsm I切断によつて失欠されたg I遺伝子のＣ末端につ
いてのコーデイング配列を置き換える。得られたプラス
ミドpG Iはg Iコーデイング配列から上流のBamH I切断
部位およびg Iコーデイング配列から下流のEcoR I切断
部位を共に有するg I遺伝子の完全なコーデイング領域
を含有する。 プラスミドpG IをEcoR IおよびBamH Iで消化し、g I
遺伝子よりなる1.8kbフラグメント（フラグメント４）
をアガロースゲル上で精製する。 プラスミドpSV2dhfr（前掲）をEcoR Iで切断し、次い
でBamH Iで切断してdhfr標識を含有する5.0kbフラグメ
ント５を得、これをアガロースゲル電気泳動により単離
する。次いで、フラグメント４および５を結んでジヒド
ロ葉酸還元酵素およびアンピシリン耐性標識、SV40プロ
モータおよび複製開始点ならびにg I遺伝子よりなるプ
ラスミドpDG Iを得る。 以下、チヤートＱを参照して、ヒトサイトメガロウイ
ルスタウネ（Towne）株からの即時型プロモータをg I遺
伝子より上流に加える。プラスミドpDG IをBamH Iで消
化してフラグメント６を得る。ヒトサイトメガロウイル
ス（タウネ（Towne））即時型プロモータを単離（前
掲）してフラグメント７を得る。次いでフラグメント６
および７を結んでプラスミドpDIEGI dhfrを得る。該プ
ロモータが適当な配位にあることを確認するために該プ
ラスミドをSac IおよびBstE II制限酵素で消化する。約
400bpのフラグメントの産生は適当な配位を示す。 ウシ成長ホルモンポリアデニレーシヨン信号を含有す
る0.6kbPvu II/EcoR IフラグメントをプラスミドpSVCOW
7（前掲）から単離してフラグメント８を得る。フラグ
メント８をpUC9のSma I/EcoR I部位（前掲）と交差して
クローンしてプラスミドpCOWT1を得る。pCOWT1をSa1 I
で切断し、T4DNAポリメラーゼで処理し、EcoR Iリンカ
ーをその上に結ぶ。次いで、かく産生したフラグメント
混合物をEcoR Iで消化し、0.6kbフラグメントを単離す
る（フラグメント９）。フラグメント９をクローンして
pUC19のEcoR I部位に入れてプラスミドpCOWT1Eを得る。
pCOWT1EをEcoR Iで消化してプラグメント10（600bp）を
得る。 プラスミドpDIEGI dhfrをEcoR Iで消化し、bGHポリア
デニレーシヨン信号を含有するフラグメント10で結んで
プラスミドpDIEGIPAを得る。g I遺伝子を適当な配位で
有するプラスミドをBamH IおよびBst IIでの消化に際し
ての1400bpフラグメントの産生によつて証明する。 得られたプラスミドをトランスフエクトしてdhfr-チ
ヤイニーズハムスター卵巣細胞に入れ、dhfr+細胞を選
択してg Iを発現する細胞系を得る（スブラマニら（Sub
ramani et al.）、モレキユラー・アンド・セリユラー
・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）、１、854〜64頁（1
981））、メトトレキセートの濃度を次第に高くする増
殖で生き残るトランスフエクトした細胞のクローンを選
択することによつてg Iの発現を増大させる（マツコル
ミツクら（Mc Cormick et al.）、モレキユラー・アン
ド・セリユラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）、
４、166〜72頁（1984））。 実施例５ 本実施例において、発明者らは哺乳動物細胞における
gp63の発現を記載する。 PRV DNAのBamH I7フラグメント（前掲）をpPRXh1〔N
RRL B−15772〕から単離し、gp63遺伝子のより多くのコ
ピーを配列しかつ産生するのに使用するために実施例１
における如く、継代クローンしてプラスミドpBR322のBa
mH I部位に入れる。 以下、チヤートＲを参照して、BamH I7をBstE IIで切
断し、T4DNAポリメラーゼで末端を処理し、次いでKpn I
で切断することによつてBamH I7の内部から1.9kbBstE I
I/Kpn Iフラグメント（フラグメント１）を継代クロー
ンする。フラグメント１を単離し、（フアルマシア（Ph
armacia）/PL、ピスカタウエイ、ニユージヤージー州か
ら購入した）pUC19中のKpn IおよびSma I部位間にクロ
ーンしてプラスミドpPR28−1BKを得る。 プラスミドpPR28−1BKをDra IとMae IIIで切断して1.
1kbフラグメント２を得る。Dra I切断部位はgp63遺伝子
のコーデイング領域の外部かつそのポリアデニレーシヨ
ン信号から下流にある。Mae III切断部位はgp63遺伝子
のATG翻訳開始コードンから下流の21塩基を切断する。g
p63遺伝子から除去したコーデイング領域を置き換える
ために、以下の２種のオリゴヌクレオチドを化学的に合
成するか、あるいはコマーシヤル・カスタム・シンセシ
ス・サービス（commercial customn synthesis sevvic
e）から購入する（フラグメント４）： プラスミドpSV2dhfr、前掲、をEcoR Iで切断し、T4DN
Aポリメラーゼで処理し、次いでBamH Iで切断し、より
大きい（5.0kb）フラグメントを単離してdhfr標識を含
有するフラグメント４を得る。次いでフラグメント２、
３および４を結んでプラスミドpGP63hdfrを得る。 以下、チヤートＳを参照して、ヒトサイトメガロウイ
ルスタウネ（Towne）株からの即時型プロモータをgp63
遺伝子より上流に加える。pGP63dhrfをBamH Iで消化
し、細菌アルカリホスフアターゼで処理してフラグメン
ト５を得る。ヒトサイトメガロウイルス（タウネ（Town
e））即時型プロモータを含有する760bp Sau3Aフラグメ
ントを単離してフラグメント６を得る。次いでこれらの
フラグメントを結んでプラスミドpIEGP63dhfrを得る。
該プロモータが適当な配位にあることを確認するために
該プラスミドをSca IおよびPvu IIで消化し、150bpフラ
グメントを得る。 得られたプラスミドをトランスフエクトしてdhfr-チ
ヤイニーズハムスター卵巣細胞に入れ、dhft+細胞を選
択してgp63を発現する細胞系を得る。この系によるgp63
の合成レベルは余りにも低くて発明者らが用いる方法に
よつては検出できず、発明者らは後記する如くワクチニ
アウイルス中でポリペプチドを産生した。 実施例６ 本実施例において、発明者らはワクチニアウイルスに
おけるgp63の発現を記載する。用いる方法は前記したも
のの他の合成態様としてここに挙げる。 実施例５に従つてフラグメント１、２、３および４を
得る。 プラスミドgGS20（マケツトら（Mackett et al.）、
ジヤーナル・オブ・バイロロジー（J.Virol.）、49、85
7〜64頁（1984））をBamH IおよびSma Iで切断し、ゲル
電気泳動によつてより大きい6.5kbフラグメントを単離
する。フラグメント２、オリゴヌクレオチド、およびpG
S20フラグメントを一緒に結んでプラスミドpVV63を得
る。このプラスミドをトランスフエクトしてワクチニア
ウイルスのWR株（ATCC VR−119）で感染したCV−１細
胞（ATCC CCL70）に入れ、マケツトら（Mackett et a
l.）、デイ・エヌ・エイ・クローニング（DNA Clonin
g）、巻II:ア・プラクテイカル・アプローチ（A Practi
cal Approach）、デイ・エム・グローバー（D.M.Glove
r）編、アイ・アール・エル・プレス（IRL Press）、オ
ツクスフオード（1985）により記載された方法によつ
て、BUdR中の143細胞（ATCC CRL8303）上でプレート化
することによつてチミジンキナーゼ陰性組換体について
選択する。14C−グルコサミンで感染した蛋白質をラベ
ルし、抗−gp63抗血清で免疫沈降することによつてアツ
セイを行う如く、得られたウイルス、ワクチニア−gp6
3、は感染した細胞においてgp50を発現する。 すべて前記したプラスミドpG IからのBamH I/EcoR I
フラグメント、プラスミドpPR28−1BKからのDra I/Mae
IIIフラグメント、またはpBGP50−23からのBamH I/Mae
IIIフラグメントはリーら（Rea et al.）、前掲に記載
されている如く、Ba131で処理し、（同時係属米国特許
出顔SN606307号に記載されている如く産生した）pTRZ4
中に挿入し、イー・コリ（E.coli）を形質転換するのに
用いることもできる。この方法により、gp50、gp63およ
びg Iはイー・コリ（E.coli）における融合蛋白質とし
て得られる。 また、前記実施例におけるpSV2dhfrの代りに例えば
（アメリカン・タイプ・カルチヤー・コレクシヨン（Am
erican Type Culture Collection）から入手可能な）pS
V2neoを用いることによつて、RPV糖蛋白質遺伝子よりな
る組換体プラスミドを形質転換して他の宿主細胞に入れ
ることができる。形質転換された細胞はプラスミドによ
つてコード付けされた抗生物質G418に対する耐性によつ
て選択される。 また、本発明のポリペプチドを以下の如くに昆虫細胞
において発現することもできる:BamH IリンカーをpD50
のEcoR I部位上に置き次いでBamH Iで消化することによ
つて、またはBamH IリンカーをpGP63dhfrのEcoR I部位
上に置き次いでBamH Iで消化することによつて、あるい
はBamH IでpUCD/Bを消化することによつて、各々gp50、
gp63またはg I遺伝子を含有するBamH Iフラグメントを
得ることができる。これらのBamH Iフラグメントはクロ
ーンしてpAC373中のポリヘドリンプロモータから下流の
BamH Iに入れることができる（モレキユラー・アンド・
セリユラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）、５、28
60〜65頁（1985））。かく産生されたプラスミドはバク
ロウイルスアウトグラフア・カリフオルニカ（Autograh
pa californica）からのDNAで共トランスフエクトしてS
f9細胞に入れ、本明細書に記載した方法によつて組換体
ウイルスを単離できる。これらの組換体ウイルスはSf9
細胞を感染するに際しgp50、gp63またはg Iを産生す
る。 本発明の糖蛋白質またはその免疫原フラグメントを利
用して調製したワクチンは固定した宿主細胞、宿主細胞
抽出物、あるいは宿主細胞からのまたは化合合成により
精製した部分的にまたは完全に精製したPRV糖蛋白質調
製物から成ることができる。本発明に従つて調製したPR
V糖蛋白質免疫原は、好ましくは、PRVウイルスを含まな
い。かくして、本発明のワクチン免疫原はPRV抗原性を
示す実質的にすべての所望の免疫原PRVポリペプチドお
よび／または他のポリペプチドよりなる。 免疫原はよく知られた方法によりワクチン投与形態に
調製できる。該ワクチンは筋肉内、皮下または鼻腔内投
与できる。筋肉内注射の如き非経口投与には、免疫原は
適当な担体と組み合すことができ、例えば水酸化アルミ
ニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウ
ム（alum）、硫酸ベリリウム、シリカ、カロリン、カー
ボン、油中水型エマルジヨン、水中油型エマルジヨン、
ムラミルジペプチド、細菌内毒素、脂質Ｘ、コリネバク
テリウム・パルバム（Corynebacterium parvum）（プロ
ピオノバクテリウム・アクネス（Propionobacterium ac
nes））、ボルデテラ・ペルトウスシス（Bordetella pe
rtussis）、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナトリ
ウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、サポニ
ン、リポソーム、レバミソール、DEAE−デキストラン、
ブロツク共重合体もしくは他の合成アジユバントを包含
する各種アジユバントまたは免疫調整剤と共にまたはそ
れなしで水、食塩水または緩衝ビヒクルに入れて投与で
きる。かかるアジユバントは各種供給源、例えばメルク
アジュバント（Merk Adjuvant）65（メルク・アンド・
カンパニー・インコーポレイテイツド（Merk and Compa
ny、Inc.）、ラーウエイ（Rahway）、ニユージヤージー
州）より商業的に入手可能である。もう１つの適当なア
ジユバントはフロイントの不完全アジユバント（デイフ
コ・ラボラトリーズ（Difco Laboratories）、デトロイ
ト、ミシガン州）である。 免疫原およびアジユバントの割合は双方が有効量で存
在する限り、広範囲にわたつて変化させることができ
る。例えば、水酸化アルミニウムはワクチン混合物の約
0.5％の量で存在させることができる（Al2O3ベース）。
投与量ベース当たりについては、免疫原の濃度はブタ当
たり約1.0μｇ〜約100mgの範囲とすることができる。好
ましい範囲はブタ当たり約100μｇ〜約3.0mgである。適
当な投与量容量は約１〜10ml、好ましく約1.0mlであ
る。従つて、筋肉内注射用の投与量は、例えば0.5％水
酸化アルミニウムとの混合物中に免疫原1.0mgを含有す
る1mlよりなる。匹敵する投与形態は幼少のブタに対す
る非経口投与用でも調製できるが、免疫原の量は例えば
投与量当たり約0.25〜約1.0mgとより少なくなる。 雌ブタのワクチン接種については、二投与量法を用い
ることができる。第１の投与量は分娩の約数カ月前から
約５〜７週間前に投与することができる。次いで、ワク
チンの第２の投与量は第１の投与の数週間後、例えば約
２〜４週間後に投与すべきであり、次いで分娩までであ
つて分娩前にワクチンを投与できる。別法として、ワク
チンは単一の2mlの投与量として、例えば分娩の約５〜
７週間前に投与することができる。しかしながら、幼少
ブタの最も効果的な免疫化には二投与法が好ましいと考
えられる。半年ごとの再ワクチン接種が動物を飼育する
のに対して推薦される。雄ブタはいつ再ワクチン接種し
てもよい。また、雌ブタは飼育前に再ワクチン接種する
こともできる。ワクチン接種していない雌ブタから生ま
れた子ブタは約３〜10日に、その後再び４〜６カ月にお
よび毎年、あるいは好ましくは半年ごとにワクチン接種
できる。 また、該ワクチンを他の病気についての他のワクチン
と組合せて多価ワクチンを得ることもできる。また、他
の薬剤、例えば抗生物質と組合すこともできる。ワクチ
ンの医学的有効量を医薬上許容される担体または希釈剤
と共に用いてブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、および他の動
物の如き動物をワクチン接種できる。 例えばアイ・テイザード（I.Tizard）、アン・イント
ラダクシヨン・トウ・ベテリナリ・イミユノロジー（An
Introduction to Veterinary Immunology）、第２版
（1982）に記載されている如く、当業者によく知られた
方法により他のワクチンを調製することができ、ここに
参照のために挙げる。 前記した如く、市販のワクチンPRVはg Iおよびgp63遺
伝子が欠失していることが判明している。従つて、本発
明の方法により産生したg Iおよびgp63ポリペプチドを
診断剤として用いてこれらの市販ワクチンを接種した動
物とビルレントウイルスに感染した動物とを識別するこ
とができる。 感染動物とワチン接種動物とを区別するには、例えば
エライサアツセイを用いることができる。例えば組換体
DNA法（リーら（Rea et al.）、前掲）によりイー・コ
リ（E.coli）中で産生したg Iまたはgp63蛋白質を適当
なプラスチツク製プレートのウエルに加え、十分な時間
を与えてプラスチツクに吸着させる（例えば、一晩、20
〜25℃）。プレートを洗浄し、ブロツキング剤（例え
ば、BSA）を加えてプラスチツク表面上のいずれの未反
応部位も中和する。続いて洗浄し、次いでブタ血清をウ
エルに加える。20〜25℃における１時間のインキユベー
シヨンの後、ウエルを洗浄し、蛋白質Ａ−セイヨウワサ
ビペルオキシダーゼ配合体を25〜25℃における約１時間
のインキユベーシヨンの間に各ウエルに加える。さらに
洗浄し、酵素基質（Ｏ−フエニレンジアミン）をウエル
に加え、酸で反応を停止する。492ナノメータにて吸光
度を測定して血清中に存在するg Iもしくはgp63抗体を
定量する。g Iおよびgp63を欠くことは動物が感染して
いないことを示す。他のPRV抗原についてテストするこ
とによつて、与えられた動物がワクチン接種を受けたか
否かを決定することができる。 チヤートD. PRVのBamH I7フラグメント チヤートE. pPR28−４およびpPR28−１の組立て （ａ）BamH I7をBamH IおよびPvu IIで消化してフラグ
メント１（1.5kb）および２（4.9kb）を得る。 （ｂ）フラグメント１および２をpBR322のBamH Iおよび
Pvu II部位間に別々に挿入してを得る。 チヤートF. gp50配列決定に用いる制限酵素切断部位 チヤートG. pPR28−4Nar2の組立て （ａ）pRP28−４をNar Iで消化してフラグメント３を得
る。 （ｂ）BamH Iリンカーをフラグメントに加え、次いでそ
れをBamH Iで処理してフラグメント４を得る。 （ｃ）フラグメント４をDNAリガーゼで環化してpPR28−
4Nar2を得る。 チヤートH. 完全なgp50遺伝子の組立て （ａ）pRP28−4Nar2をBamH IおよびPvu IIで消化してフ
ラグメント５（160bp）を得る。 （ｂ）pPR28−１をBamH IおよびPvu IIで消化してフラ
グメント６（4.9kb）を得る。 （ｃ）pPGX1をBamH Iで消化し、BAPで処理し、次いでフ
ラグメント５および６で結んでpBGP50−23を得る。 チヤートＩ プラスミドpD50の産生 （ａ）pBGP50−23をMae IIIで切断し、T4DNAポリメラー
ゼで平滑末端とし、EcoR Iリンカーを加え、EcoR Iで消
化し、次いでBamH Iで切断してフラグメント７（1.3k
b）を得る。 （ｂ）プラスミドpSV2dhfrをBamH IおよびEcoR Iで切断
してフラグメント８（5.0kb）を得る。 （ｃ）フラグメント７および８を結ぶことによつてプラ
スミドpD50を得る。 チヤートJ. プラスミドpDIE50の産生 （ａ）pD50をBamH Iで消化し、BAPで処理してフラグメ
ント９を得る。 （ｂ）ヒトサイトメガロウイルス（タウネ（Towne））
即時型プロモータを含有するフラグメント10（760bp）
を単離する。 （ｃ）フラグメント９および10を結んでプラスミドpDIE
50を得る。チヤートK. プラスミドpDIE50PAの産生 （ａ）プラスミドpSVCOW7をPvu IIおよびEcoR Iで切断
してフラグメント11を得る。 （ｂ）フラグメント11をクローンしてpUC9に入れてプラ
スミドpCOWT1を得る。 （ｃ）pCOWT1をSa1 Iで切断し、T4DNAポリメラーゼで平
滑末端とし、EcoR Iリンカーを加え、続いてEcoR Iで消
化してフラグメント12（0.6kb）を得る。 チヤートＫ（続き） （ｄ）プラスミドpDIE50をEcoR Iで切断し、フラグメン
ト12をその中にクローンしてプラスミドpDIE50PAを得
る。即時型プロモータ チヤートL. プラスミドpDIE50Tの産生 （ａ）プラスミドpDIE50をSal IおよびEcoR Iで消化し
て5.0kbフラグメント、 および0.7kbフラグメント を得る。 （ｂ）該0.7kbフラグメントをSau3A Iで消化し、0.5kbS
a1 I/Sau3A Iフラグメントを単離する。 （ｃ）該5.0kbEcoR I/Sa1 Iフラグメント、該0.5kbSa1
I/Sau3A Iフラグメントおよびアニールしたオリゴヌク
レオチド（明細書本文参照）を結んでプラスミドpDIE50
Tを得る。 チヤートＬ（続き） チヤートM. gp63配列決定に用いる制限酵素切断部位 チヤートN. g I配位決定に用いる制限酵素切断部位 チヤートO. プラスミドpUCD/Bの組立て （ａ）BamH I7フラグメントをクローンしてプラスミドp
UC19に入れてプラスミドＡを得る。 （ｂ）プラズミドＡをDra Iで消化してフラグメント１
を得る。 （ｃ）BamH Iリンカーをフラグメント１に加え、続いて
BamH Iで消化してフラグメント２（2.5kb）を得る。 （ｄ）フラグメント２をBamH Iで消化したpUC19に入れ
てプラスミドpUCD/Bを得る。 チヤートＯ（続き） チヤートP. プラスミドpDG Iの組立て （ａ）プラスミドpUCD/BをBsm IおよびEcoR Iで消化し
てフラグメント３（4.4kb）を得る。 （ｂ）以下の２種の合成オリゴヌクレオチドを得る： （ｃ）該合成オリゴヌクレオチドおよびフラグメント３
を結んでプラスミドpG Iを得る。（ｄ）プラスミドpGIをEcoR IおよびBamH Iで消化して
フラグメント４（1.8kb）を得る。 チヤートＰ（続き） （ｅ）プラスミドpSV2dhfrをEcoR Iで切断し、次いでBa
mH Iで切断してフラグメント５（5.0kb）を得る。 （ｆ）次いでフラグメント４および５を結んでプラスミ
ドpDG Iを得る。 チヤートQ. プラスミドpDIEGIPAの組立 （ａ）プラスミドpDG IをBamH Iで切断してフラグメン
ト６を得る。 （ｂ）ヒトサイトメガロウイルス（タウネ（Towne））
即時型プロモータを含有するフラグメント７（760bp）
を単離する。 （ｃ）フラグメント６および７を結んでプラスミドpDIE
GIdhfrを得る。（ｄ）プラスミドpSVCOW7をPvu IIおよびEcoR Iで切断
してフラグメント８を得る。 （ｅ）フラグメント８をpUC9においてクローンしてプラ
スミドpCOWT1を得る。 （ｆ）pCOWT1をSa1 Iで切断し、T4DNAポリメラーゼで処
理し、EcoR Iリンカーを上に結び、続いてEcoR Iで消化
してフラグメント９（0.6kb）を得る。 チヤートQ.（続き） （ｇ）フラグメント９をクローンしてpUC19のEcoR I部
位に入れてプラスミドpCOWT1Eを得る。 （ｈ）pCOWT1EをEcoR Iで消化してフラグメント10（600
bp）を得る。 （ｉ）プラスミドpDIEGIdhfrをEcoR Iで消化し、bGHポ
リアデニレーシヨン信号を含有するフラグメント10で結
んでプラスミドpDIEGIPAを得る。即時型プロモータ チヤートR. pGP63dhfrの組立て （ａ）BamH I7をBstE IIで消化し、T4DNAポリメラーゼ
で処理し、次いでKpn Iで切断してフラグメント１（1.9
kb）を得る。 （ｂ）次いでフラグメント１をプラスミドpUC19のKpn I
およびSma I部位間でクローンしてプラスミドpPR28−1B
Kを得る。 （ｃ）プラスミドpPR28−1BKをDra IおよびMae IIIで切
断してフラグメント２（1.1kb）を得る。 （ｄ）プラスミドpSV2dhfrをEcoR Iで切断し、T4DNAポ
リメラーゼで処理し、次いでBamH Iで切断してフラグメ
ント３（5.0kb）を得る。 （ｅ）２種のオリゴヌクレオチドを合成してフラグメン
ト４を得る。 （ｆ）次いでフラグメント２、３および４を結んでプラ
スミドpGP63dhfrを得る。チヤートS. （ａ）pGP63dhfrをBamH Iで消化し、BAPで処理してフラ
グメント５を得る。 （ｂ）ヒトサイトメガロウイルス（タウネ（Towne））
即時型プロモータを含有するフラグメント（760bp）を
単離する。 （ｃ）フラグメント５および６を結んでプラスミドpIEG
P63dhfrを得る。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(31)優先権主張番号 ８４４１１３
(32)優先日 1986年３月26日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ８８６２６０
(32)優先日 1986年７月16日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
微生物の受託番号 ＮＲＲＬ Ｂ−１５７７２
(72)発明者 ポスト，レオナルド・イー
アメリカ合衆国ミシガン州49007、カラ
マズ−、オールド・ロッグ・トライル
6129番
(72)発明者 チミンス，ジェイムス・ジイ
アメリカ合衆国マサチューセッツ州
02139、ケンブリッジ、メモライル・ド
ライブ ナンバー18エフ550番
(56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ，Ｖｏｌ．53，Ｎｏ．１ （Ｊａ
ｎ．1985） Ｐ．52−57
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．発現制御配列に作動可能に連結したDNA配列よりな
る組換体DNA分子であって、該DNA配列が偽狂犬病ウイル
ス糖蛋白質gp50、gp63またはg I免疫原性を示すポリペ
プチドについてコード付けし、該糖蛋白質が、各々、以
下のアミノ酸配列： gp50のアミノ酸配列； gp63のアミノ酸配列；g Iのアミノ酸配列； を有する該組換体DNA分子。 ２．該ポリペプチドについてコード付けする該DNA配列
が、 であるg I配列で示されるヌクレオチド配列である＿請
求の範囲第１記載の組換体DNA分子。 ３．発現制御配列に作動可能に連結したDNA配列よりな
る組換体DNA分子であって、該DNA配列が偽狂犬病ウイル
ス糖蛋白質gp50、gp63またはg I免疫原性を示すポリペ
プチドについてコード付けし、該蛋白質が、各々、以下
のアミノ酸配列： gp50のアミノ酸配列； gp63のアミノ酸配列； g Iのアミノ酸配列； を有する該組換体DNA分子で形質転換した宿主細胞。 ４．細菌、菌類、植物または動物由来である請求の範囲
第３項記載の宿主細胞。 ５．コー・コリ（E.coli）である請求の範囲第４項記載
の宿主細胞。 ６．酵母細胞である請求の範囲第４項記載の宿主細胞。 ７．チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞である請
求の範囲第４項記載の宿主細胞。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US78478785A | 1985-10-04 | 1985-10-04 | |
| US801799 | 1986-07-16 | ||
| US784787 | 1986-07-16 | ||
| US886260 | 1986-07-16 | ||
| US844113 | 2001-04-25 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6151983A Division JP2568384B2 (ja) | 1985-10-04 | 1994-07-04 | 偽狂犬病ウイルスワクチン用ポリペプチド、その製法、およびそれを含有するワクチン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63501611A JPS63501611A (ja) | 1988-06-23 |
| JP2810364B2 true JP2810364B2 (ja) | 1998-10-15 |
Family
ID=25133540
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61504958A Expired - Lifetime JP2810364B2 (ja) | 1985-10-04 | 1986-08-28 | 偽狂犬病ウイルス蛋白質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2810364B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5069901A (en) * | 1988-02-03 | 1991-12-03 | Jones Elaine V | Preparation of a recombinant subunit vaccine against pseudorabies infection |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2480780B1 (fr) * | 1980-04-22 | 1985-12-06 | Pasteur Institut | Procede de transformation de cellules, notamment eucaryotes, par un adn circulaire tel que celui du virus de l'hepatite b et preparations contenant les produits d'expression desdits adn |
| GR76274B (ja) * | 1981-08-04 | 1984-08-04 | Univ California | |
| GB8324800D0 (en) * | 1983-09-15 | 1983-10-19 | Pasteur Institut | Antigens |
-
1986
- 1986-08-28 JP JP61504958A patent/JP2810364B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．１ （Ｊａｎ．１９８５） Ｐ．５２−５７ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63501611A (ja) | 1988-06-23 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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