JP2568384B2 - 偽狂犬病ウイルスワクチン用ポリペプチド、その製法、およびそれを含有するワクチン - Google Patents
偽狂犬病ウイルスワクチン用ポリペプチド、その製法、およびそれを含有するワクチンInfo
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は偽狂犬病ウイルス糖蛋白
質およびそれに関連するポリペプチド、該ポリペプチド
よりなるワクチン、かかるワクチンを投与することより
なる動物を感染から保護する方法、および該ポリペプチ
ドの産生法、および動物がPRVに感染しているかどう
かを識別する方法、およびかかる方法のためのキットに
関する。
質およびそれに関連するポリペプチド、該ポリペプチド
よりなるワクチン、かかるワクチンを投与することより
なる動物を感染から保護する方法、および該ポリペプチ
ドの産生法、および動物がPRVに感染しているかどう
かを識別する方法、およびかかる方法のためのキットに
関する。
【0002】
【従来の技術】偽狂犬病ウイルス(PRV)は世界的に多
くの種の動物に感染する病気である。PRVは種々に呼
ばれる感染性延髄麻痺、アウジエスキー病、および仮性
恐水病である。感染はブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツ
ジ、ラットおよびミンクの如き重要な家畜において知ら
れている。宿主の範囲は非常に広く、ほとんどの哺乳動
物および、実験的には少なくとも多種類の鳥類を包含す
る[宿主の詳細なリストについては、ディ・ピイ・グス
タフソン(D.P.Gustafson)、「シウドラビエス(Pseudorab
ies)」、デイジージズ・オブ・スワイン(Diseases of Sw
ine)、第5版、エイ・ディ・レマンら(A.D.Leman et a
l.)編(1981)参照)。感染したほとんどの動物につい
て該病気は致命的なものである。しかし、成熟したブタ
および恐らくラットは該病気によって殺されることはな
く、従ってキャリアである。
くの種の動物に感染する病気である。PRVは種々に呼
ばれる感染性延髄麻痺、アウジエスキー病、および仮性
恐水病である。感染はブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツ
ジ、ラットおよびミンクの如き重要な家畜において知ら
れている。宿主の範囲は非常に広く、ほとんどの哺乳動
物および、実験的には少なくとも多種類の鳥類を包含す
る[宿主の詳細なリストについては、ディ・ピイ・グス
タフソン(D.P.Gustafson)、「シウドラビエス(Pseudorab
ies)」、デイジージズ・オブ・スワイン(Diseases of Sw
ine)、第5版、エイ・ディ・レマンら(A.D.Leman et a
l.)編(1981)参照)。感染したほとんどの動物につい
て該病気は致命的なものである。しかし、成熟したブタ
および恐らくラットは該病気によって殺されることはな
く、従ってキャリアである。
【0003】ブタの集団は特にPRVに罹り易い。成熟
したブタはまれにしか徴候を示さずまたは該病気により
死なないが、子ブタは感染すると急性の病気により、そ
の結果、特異的な臨床的様相なくして24ないし48時
間のうちに通常死んでしまう(ティ・シイ・ジョーンズ
およびアール・ディ・ハント(T.C.Jones and R.D.Hun
t)、ベテリナリ・パソロジー(Veterinary Pathology)、
第5版、リー・アンド・フェビガー(Lea & Febiger)
(1983))。
したブタはまれにしか徴候を示さずまたは該病気により
死なないが、子ブタは感染すると急性の病気により、そ
の結果、特異的な臨床的様相なくして24ないし48時
間のうちに通常死んでしまう(ティ・シイ・ジョーンズ
およびアール・ディ・ハント(T.C.Jones and R.D.Hun
t)、ベテリナリ・パソロジー(Veterinary Pathology)、
第5版、リー・アンド・フェビガー(Lea & Febiger)
(1983))。
【0004】PRVワクチンが多種類の技術によって生
産されてきたし、ヨーロッパの流行地においてはワクチ
ン接種が15年以上の間、行われてきた。ワクチン接種
によって損失は減少されてきたが、ワクチン接種は環境
中に該ウイルスを維持しつづけてきた。感染を防止する
ワクチンは生産されたことがない。ビルレントウイルス
に暴露された、ワクチン接種した動物は感染しても生き
残り、次いでより多くのビルレントウイルスを放出す
る。従ってワクチン接種した動物は再び突発する可能性
がある潜伏感染を有しうる(ディ・ビイ・グスタフソン
(D.P.Gustafson)、前掲参照)。
産されてきたし、ヨーロッパの流行地においてはワクチ
ン接種が15年以上の間、行われてきた。ワクチン接種
によって損失は減少されてきたが、ワクチン接種は環境
中に該ウイルスを維持しつづけてきた。感染を防止する
ワクチンは生産されたことがない。ビルレントウイルス
に暴露された、ワクチン接種した動物は感染しても生き
残り、次いでより多くのビルレントウイルスを放出す
る。従ってワクチン接種した動物は再び突発する可能性
がある潜伏感染を有しうる(ディ・ビイ・グスタフソン
(D.P.Gustafson)、前掲参照)。
【0005】PRV用の生弱毒化ワクチンおよび不活性
化ワクチンは米国で商業的に入手可能であり、USDA
により認可されてきた(シイ・イー・アロンソン(C.E.Ar
onson)編、ベテリナリ・ファルマシューティカルズ・ア
ンド・バイオロジカルズ(Veterinary Pharmaceuticals
& Biologicals)、(1983)参照)。
化ワクチンは米国で商業的に入手可能であり、USDA
により認可されてきた(シイ・イー・アロンソン(C.E.Ar
onson)編、ベテリナリ・ファルマシューティカルズ・ア
ンド・バイオロジカルズ(Veterinary Pharmaceuticals
& Biologicals)、(1983)参照)。
【0006】成熟したブタはPRVのキャリアであるの
で、多くの州は感染した動物を検知するスクリーニング
プログラムを制定してきた。本明細書に記載するDNA
配列を利用し、DNA/DNA交雑を用いて能動的に感
染した動物を診断できる。本発明のPRV糖蛋白質のい
くつかは、また、PRV感染についての特殊症状をつく
りだすのに有用であり、また、PRVに対するワクチン
を産生するのに有用である。
で、多くの州は感染した動物を検知するスクリーニング
プログラムを制定してきた。本明細書に記載するDNA
配列を利用し、DNA/DNA交雑を用いて能動的に感
染した動物を診断できる。本発明のPRV糖蛋白質のい
くつかは、また、PRV感染についての特殊症状をつく
りだすのに有用であり、また、PRVに対するワクチン
を産生するのに有用である。
【0007】PRVはヘルペスウイルスである。ヘルペ
スウイルスは一般に最も複雑な動物ウイルスの1つであ
る。そのゲノムは少なくとも50個のウイルスの特異的
蛋白質をコード付けし、150000個までのヌクレオ
チドを含有する。最も免疫学的に反応性であるヘルペス
ウイルス蛋白質のなかには、他の場所のうちでもとりわ
けウイルス粒子膜および感染した細胞の膜中で見い出さ
れた糖蛋白質がある。PRV糖蛋白質に関する文献は少
なくとも4つのウイルス糖蛋白質に言及している(ティ
・ベン−ポラートおよびエイ・エス・カプラン(T.Ben-P
orat and A.S.Kaplan)、バイロロジー(Virology)、4
1、265〜73頁、(1970);エイ・エス・カプラ
ンおよびテイ・ベン−ポラート(A.S.Kaplan and T.Ben-
Porat)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ(Proc. Natl.Acad.Sci.)
USA、66、799〜806頁(1970))。
スウイルスは一般に最も複雑な動物ウイルスの1つであ
る。そのゲノムは少なくとも50個のウイルスの特異的
蛋白質をコード付けし、150000個までのヌクレオ
チドを含有する。最も免疫学的に反応性であるヘルペス
ウイルス蛋白質のなかには、他の場所のうちでもとりわ
けウイルス粒子膜および感染した細胞の膜中で見い出さ
れた糖蛋白質がある。PRV糖蛋白質に関する文献は少
なくとも4つのウイルス糖蛋白質に言及している(ティ
・ベン−ポラートおよびエイ・エス・カプラン(T.Ben-P
orat and A.S.Kaplan)、バイロロジー(Virology)、4
1、265〜73頁、(1970);エイ・エス・カプラ
ンおよびテイ・ベン−ポラート(A.S.Kaplan and T.Ben-
Porat)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ(Proc. Natl.Acad.Sci.)
USA、66、799〜806頁(1970))。
【0008】エム・ダブリュー・ウエイセンおよびエル
・ケイ・ウエイセン(M.W.Wathen and L.K.Wathen)、ジ
ャーナル・オブ・バイロロジー(J. Virol.)、51、5
7〜62頁(1984)はウイルス糖蛋白質(gp50)中に
突然変異を含有するPRVおよびgp50に対して定方向
化された単クローン抗体を中和することを利用して該突
然変異体を選択する方法に言及している。ウエイセンお
よびウエイセン(Wathenand Wathen)は、また、gp50に
対して定方向化された単クローン抗体は補体の助けをか
りてまたはそれなしで強力なPRVの中和剤であるこ
と、および多価免疫血清はgp50に対して大いに反応性
であることを示し、従ってgp50は重要なPRV免疫原
の1つであり得ると結論している。他方、98000M
Wエンベロープ糖蛋白質と反応する単クローン抗体はP
RV伝染性を中和するが、他の膜糖蛋白質のいくつかに
対して定方向化された単クローン抗体は中和活性をほと
んど持たないことが報告されている(エイチ・ハンプル
ら(H.Hampl et al.)、ジャーナル・オブ・バイロロジー
(J.Virol.)、52、583〜90頁(1984);および
ティ・ベン−ポラートおよびエイ・エス・カプラン(T.B
en-Porat and A.S.Kaplan)、「偽狂犬病ウイルスの分子
生物学」、ビイ・ロイツマン(B.Roizman)編、ザ・ヘルペ
スバイアラシズ(The Herpesviruses)、3、105〜7
3頁(1984))。
・ケイ・ウエイセン(M.W.Wathen and L.K.Wathen)、ジ
ャーナル・オブ・バイロロジー(J. Virol.)、51、5
7〜62頁(1984)はウイルス糖蛋白質(gp50)中に
突然変異を含有するPRVおよびgp50に対して定方向
化された単クローン抗体を中和することを利用して該突
然変異体を選択する方法に言及している。ウエイセンお
よびウエイセン(Wathenand Wathen)は、また、gp50に
対して定方向化された単クローン抗体は補体の助けをか
りてまたはそれなしで強力なPRVの中和剤であるこ
と、および多価免疫血清はgp50に対して大いに反応性
であることを示し、従ってgp50は重要なPRV免疫原
の1つであり得ると結論している。他方、98000M
Wエンベロープ糖蛋白質と反応する単クローン抗体はP
RV伝染性を中和するが、他の膜糖蛋白質のいくつかに
対して定方向化された単クローン抗体は中和活性をほと
んど持たないことが報告されている(エイチ・ハンプル
ら(H.Hampl et al.)、ジャーナル・オブ・バイロロジー
(J.Virol.)、52、583〜90頁(1984);および
ティ・ベン−ポラートおよびエイ・エス・カプラン(T.B
en-Porat and A.S.Kaplan)、「偽狂犬病ウイルスの分子
生物学」、ビイ・ロイツマン(B.Roizman)編、ザ・ヘルペ
スバイアラシズ(The Herpesviruses)、3、105〜7
3頁(1984))。
【0009】エル・エム・ケイ・ウエイセンら(L.M.K.W
athen et al.)、バイアラス・リサーチ(Virus Resea
rch)、4、19〜29頁(1985)はgp50およびgp8
3と同定されたPRV糖蛋白質に対して定方向化された
単クローン抗体の産生および特徴づけならびにマウスを
PRV感染に対して受動的に免疫とするその使用につい
て言及している。
athen et al.)、バイアラス・リサーチ(Virus Resea
rch)、4、19〜29頁(1985)はgp50およびgp8
3と同定されたPRV糖蛋白質に対して定方向化された
単クローン抗体の産生および特徴づけならびにマウスを
PRV感染に対して受動的に免疫とするその使用につい
て言及している。
【0010】エイ・ケイ・ロビンズら(A.K.Robbins et
al.)、「イー・コリ(E.coli)発現プラスミドライブラリ
ーを用いる偽狂犬病ウイルス糖蛋白質の位置決め」ヘル
ペスバイアラス(Herpesvirus)、551〜61頁(198
4)はPRV DNAを含有するイー・コリ(E.coli)プ
ラスミドのライブラリーの組立てについて言及してい
る。彼等は74000および92000MWの糖蛋白質
をコード付けするPRV遺伝子の同定についても言及し
ている。彼等は本発明の糖蛋白質については言及してい
ない。
al.)、「イー・コリ(E.coli)発現プラスミドライブラリ
ーを用いる偽狂犬病ウイルス糖蛋白質の位置決め」ヘル
ペスバイアラス(Herpesvirus)、551〜61頁(198
4)はPRV DNAを含有するイー・コリ(E.coli)プ
ラスミドのライブラリーの組立てについて言及してい
る。彼等は74000および92000MWの糖蛋白質
をコード付けするPRV遺伝子の同定についても言及し
ている。彼等は本発明の糖蛋白質については言及してい
ない。
【0011】エイ・ケイ・ロビンズら(A.K.Robbins et
al.)、ヨーロッパ特許出願85400704.4号(公開
番号0163738)はgIIおよびgIIIとして同定
されるPRV糖蛋白質の単離、クローニングおよび発現
について言及している。彼等は本発明のPRV糖蛋白質
については言及していない。
al.)、ヨーロッパ特許出願85400704.4号(公開
番号0163738)はgIIおよびgIIIとして同定
されるPRV糖蛋白質の単離、クローニングおよび発現
について言及している。彼等は本発明のPRV糖蛋白質
については言及していない。
【0012】テイ・シイ・メテンライターら(T.C.Mette
nleiter et al.)、「偽狂犬病ウイルス糖蛋白質Aの構造
遺伝子のマッピングおよび2種の非グルコシル化前駆体
ポリペプチドの同定」、ジャーナル・オブ・バイロロジ
ー(J.Virol.)、53、52〜57頁(1985)はPRV
DNAのBamHI7 フラグメントに対する糖蛋白質
gA(これはgIに一致する)のコーディング領域のマッピ
ングについて言及している。彼等は、また、BamHI7
フラグメントが少なくとも3種の他の65K、60
K、および40KMWのウイルス蛋白質をコード付けす
ることを述べている。彼等は本発明の糖蛋白質をコード
付けするDNA配列または組換体DNA法によりかかる
ポリペプチドの産生を開示もしくは示唆していない。
nleiter et al.)、「偽狂犬病ウイルス糖蛋白質Aの構造
遺伝子のマッピングおよび2種の非グルコシル化前駆体
ポリペプチドの同定」、ジャーナル・オブ・バイロロジ
ー(J.Virol.)、53、52〜57頁(1985)はPRV
DNAのBamHI7 フラグメントに対する糖蛋白質
gA(これはgIに一致する)のコーディング領域のマッピ
ングについて言及している。彼等は、また、BamHI7
フラグメントが少なくとも3種の他の65K、60
K、および40KMWのウイルス蛋白質をコード付けす
ることを述べている。彼等は本発明の糖蛋白質をコード
付けするDNA配列または組換体DNA法によりかかる
ポリペプチドの産生を開示もしくは示唆していない。
【0013】ビイ・ロムニクツイら(B.Lomniczi、et a
l.)、「偽狂犬病ウイルスワクチン株のゲノムにおける欠
失および該ゲノムの4種異性体の存在」、ジャーナル・
オブ・バイロロジー(J.Virol.)、49、970〜79頁
(1984)は0.855および0.882図単位間のユニ
ークな短配列中に欠失を有するPRVワクチン株につい
て言及している。これはgI遺伝子の近傍においてであ
る。ティ・シイ・メテンライターら(T.C.Mettenleiter
et al.)、「偽狂犬病ウイルスのアビルレント株は主要糖
蛋白質を発現しない」、ジャーナル・オブ・バイロロジ
ー(J.Virol.)、56、307〜11頁(1985)は、3
種の市販PRVワクチン株が糖蛋白質gIを欠くことを
証明した。発明者らは、また、バルサ(Bartha)ワクチ
ン株はgp63遺伝子のほとんどについて欠失を含有する
ことを最近見い出した。
l.)、「偽狂犬病ウイルスワクチン株のゲノムにおける欠
失および該ゲノムの4種異性体の存在」、ジャーナル・
オブ・バイロロジー(J.Virol.)、49、970〜79頁
(1984)は0.855および0.882図単位間のユニ
ークな短配列中に欠失を有するPRVワクチン株につい
て言及している。これはgI遺伝子の近傍においてであ
る。ティ・シイ・メテンライターら(T.C.Mettenleiter
et al.)、「偽狂犬病ウイルスのアビルレント株は主要糖
蛋白質を発現しない」、ジャーナル・オブ・バイロロジ
ー(J.Virol.)、56、307〜11頁(1985)は、3
種の市販PRVワクチン株が糖蛋白質gIを欠くことを
証明した。発明者らは、また、バルサ(Bartha)ワクチ
ン株はgp63遺伝子のほとんどについて欠失を含有する
ことを最近見い出した。
【0014】ティ・ジェイ・リーら(T.J.Rea et al.)、
ジャーナル・オブ・バイロロジー(J.Virol.)、54、2
1〜29頁(1985)は感染した細胞の培地中に蓄積す
るPRV糖蛋白質についての遺伝子(gx)のマッピングお
よび配列について言及している。そこに示されているg
X遺伝子のフランキング配列のなかには、第6図の塩基
1682で特異的に開始するgp50配列が少しの割合で
包含される。しかし、この配列はgp50配列として同定
されていない。さらに、リーら(Rea et al.)によって公
開された配列中に誤りがある。塩基1586および16
03は欠失されているべきである。塩基1708および
1709、塩基1737および1738、塩基1743
および1744ならびに塩基1753および1754間
に塩基が挿入されているべきである。公開されたgp50
についての部分配列におけるこれらの誤りの結果、フレ
ームシフトとなる。AUG開始部位に始まるオープンリ
ーディングフレームの翻訳はgp50糖蛋白質について誤
ったアミノ酸配列を与えるであろう。
ジャーナル・オブ・バイロロジー(J.Virol.)、54、2
1〜29頁(1985)は感染した細胞の培地中に蓄積す
るPRV糖蛋白質についての遺伝子(gx)のマッピングお
よび配列について言及している。そこに示されているg
X遺伝子のフランキング配列のなかには、第6図の塩基
1682で特異的に開始するgp50配列が少しの割合で
包含される。しかし、この配列はgp50配列として同定
されていない。さらに、リーら(Rea et al.)によって公
開された配列中に誤りがある。塩基1586および16
03は欠失されているべきである。塩基1708および
1709、塩基1737および1738、塩基1743
および1744ならびに塩基1753および1754間
に塩基が挿入されているべきである。公開されたgp50
についての部分配列におけるこれらの誤りの結果、フレ
ームシフトとなる。AUG開始部位に始まるオープンリ
ーディングフレームの翻訳はgp50糖蛋白質について誤
ったアミノ酸配列を与えるであろう。
【0015】ヨーロッパ公開特許出願0133200号
はPRVのキャリアおよび非キャリアを識別するのにあ
る種のレクチン−結合PRV糖蛋白質のサブユニットワ
クチンと一緒に用いる診断抗原ファクターについて言及
している。
はPRVのキャリアおよび非キャリアを識別するのにあ
る種のレクチン−結合PRV糖蛋白質のサブユニットワ
クチンと一緒に用いる診断抗原ファクターについて言及
している。
【0016】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、偽狂
犬病ウイルス用ワクチンのためのポリペプチドの産生法
を提供することにある。
犬病ウイルス用ワクチンのためのポリペプチドの産生法
を提供することにある。
【0017】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、PRV糖
蛋白質抗原性を示す糖蛋白質をコード付けするDNA配
列よりなる組換体DNA分子を作製することに成功する
ことにより、本発明を完成した。 すなわち、(a)組換体DNA分子を調製し、ここに、該
分子はPRV gp50、gp63またはgI抗原性を示す
ポリペプチドについてコード付けするDNA配列よりな
り、該糖蛋白質は、各々、配列表(配列番号1、2およ
び3)に示されるアミノ酸配列を有し、該DNAは発現
制御配列に作動可能に連結し; (b)適当な宿主細胞を該組換体DNA分子で形質転換
し; (c)該宿主細胞を培養し; (d)次いで該ポリペプチドを収集することを特徴とする
PRV gp50、gp63またはgI抗原性を示すポリペ
プチドの産生法を提供するものである。また、本発明
は、該DNA配列が、各々、配列表(配列番号1、2お
よび3)に示される配列よりなる該ポリペプチドの産生
法を提供するものである。さらに、本発明は、該宿主細
胞が細菌、菌類、植物細胞および動物細胞よりなる群か
ら選択される該ポリペプチドの産生法を提供するもので
ある。さらに、本発明は、該宿主細胞がイー・コリ(E.
coli)である該ポリペプチドの産生法を提供するもので
ある。さらに、本発明は、該宿主細胞が酵母である該ポ
リペプチドの産生法を提供するものである。さらに、本
発明は、該宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(C
HO)細胞である該ポリペプチドの産生法を提供するも
のである。また、本明細書中には、ヒトを除く罹患動物
を糖蛋白質gIまたはgp63を欠くPRVでワクチン接
種し、次いで該動物を殺すことなくかかるワクチン接種
した動物とPRVに感染した動物とを血清学的に識別す
ることを特徴とするPRVに対してワクチン接種したヒ
トを除く動物とPRVに感染したヒトを除く動物とを識
別する方法を記載する。さらに、本明細書中には、1の
容器がその中にPRV糖蛋白質gIまたはgp63抗原
性を示すポリペプチドを有する多数の容器よりなること
を特徴とする、ヒトを除く罹患動物を糖蛋白質gIまた
はgp63を欠くPRVでワクチン接種し、次いで該動物
を殺すことなくかかるワクチン接種した動物とPRVに
感染した動物とを血清学的に識別することを特徴とする
PRVに対してワクチン接種したヒトを除く動物とPR
Vに感染したヒトを除く動物とを識別する方法を実施す
るのに有用な商業用キットを記載する。
蛋白質抗原性を示す糖蛋白質をコード付けするDNA配
列よりなる組換体DNA分子を作製することに成功する
ことにより、本発明を完成した。 すなわち、(a)組換体DNA分子を調製し、ここに、該
分子はPRV gp50、gp63またはgI抗原性を示す
ポリペプチドについてコード付けするDNA配列よりな
り、該糖蛋白質は、各々、配列表(配列番号1、2およ
び3)に示されるアミノ酸配列を有し、該DNAは発現
制御配列に作動可能に連結し; (b)適当な宿主細胞を該組換体DNA分子で形質転換
し; (c)該宿主細胞を培養し; (d)次いで該ポリペプチドを収集することを特徴とする
PRV gp50、gp63またはgI抗原性を示すポリペ
プチドの産生法を提供するものである。また、本発明
は、該DNA配列が、各々、配列表(配列番号1、2お
よび3)に示される配列よりなる該ポリペプチドの産生
法を提供するものである。さらに、本発明は、該宿主細
胞が細菌、菌類、植物細胞および動物細胞よりなる群か
ら選択される該ポリペプチドの産生法を提供するもので
ある。さらに、本発明は、該宿主細胞がイー・コリ(E.
coli)である該ポリペプチドの産生法を提供するもので
ある。さらに、本発明は、該宿主細胞が酵母である該ポ
リペプチドの産生法を提供するものである。さらに、本
発明は、該宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣(C
HO)細胞である該ポリペプチドの産生法を提供するも
のである。また、本明細書中には、ヒトを除く罹患動物
を糖蛋白質gIまたはgp63を欠くPRVでワクチン接
種し、次いで該動物を殺すことなくかかるワクチン接種
した動物とPRVに感染した動物とを血清学的に識別す
ることを特徴とするPRVに対してワクチン接種したヒ
トを除く動物とPRVに感染したヒトを除く動物とを識
別する方法を記載する。さらに、本明細書中には、1の
容器がその中にPRV糖蛋白質gIまたはgp63抗原
性を示すポリペプチドを有する多数の容器よりなること
を特徴とする、ヒトを除く罹患動物を糖蛋白質gIまた
はgp63を欠くPRVでワクチン接種し、次いで該動物
を殺すことなくかかるワクチン接種した動物とPRVに
感染した動物とを血清学的に識別することを特徴とする
PRVに対してワクチン接種したヒトを除く動物とPR
Vに感染したヒトを除く動物とを識別する方法を実施す
るのに有用な商業用キットを記載する。
【0018】PRVの糖蛋白質gpをコード付けする遺伝
子の存在および位置決定はエム・ダブリュー・ウエイセ
ンおよびエル・エム・ウエイセン(M.W.Wathen an
dL.M.Wathen)、前掲によって示された。
子の存在および位置決定はエム・ダブリュー・ウエイセ
ンおよびエル・エム・ウエイセン(M.W.Wathen an
dL.M.Wathen)、前掲によって示された。
【0019】該遺伝子によってコード付けされる糖蛋白
質は特定の単クローン抗体と反応する糖蛋白質と定義さ
れた。この糖蛋白質は以前に知られたPRV糖蛋白質の
いずれにも対応しなかった。ウエイセンおよびウエイセ
ン(Wathen and Wathen)は単クローン抗体に対して耐性
の突然変異をマップしたが、それは単純疱疹ウイルスに
おける慣行に基づいて(例えば、テイ・シイ・ホランド
ら(T.C.Holland et al.).ジャーナル・オブ・バイロロ
ジー(J.Virol.)、52、566〜74頁(1984))。g
p50についての構造遺伝子の位置をマップするもので
ある。ウエイセンおよびウエイセン(Wathen and Wathe
n)はPRVのBamHI7フラグメント内からのより小さ
いSalI/BamHIフラグメントに対するgp50遺伝子
をマップした。リーら(Rea et al.)、前掲は同一領域に
対するPRV糖蛋白質gX遺伝子をマップした。
質は特定の単クローン抗体と反応する糖蛋白質と定義さ
れた。この糖蛋白質は以前に知られたPRV糖蛋白質の
いずれにも対応しなかった。ウエイセンおよびウエイセ
ン(Wathen and Wathen)は単クローン抗体に対して耐性
の突然変異をマップしたが、それは単純疱疹ウイルスに
おける慣行に基づいて(例えば、テイ・シイ・ホランド
ら(T.C.Holland et al.).ジャーナル・オブ・バイロロ
ジー(J.Virol.)、52、566〜74頁(1984))。g
p50についての構造遺伝子の位置をマップするもので
ある。ウエイセンおよびウエイセン(Wathen and Wathe
n)はPRVのBamHI7フラグメント内からのより小さ
いSalI/BamHIフラグメントに対するgp50遺伝子
をマップした。リーら(Rea et al.)、前掲は同一領域に
対するPRV糖蛋白質gX遺伝子をマップした。
【0020】PRVgp63およびgI遺伝子はバクテリ
オファージ発現ベクターλgt11中で組立てられたPR
V DNAライブラリーをスクリーニングすることによ
って単離された(ジェイ・ジイ・テイミンズら(J.G.Timm
ins et al.)、「ファージλgtIIライブラリーからの効
果的な遺伝子単離法:変性した、アセトン沈澱蛋白質に
対する抗血清の使用」、ジーン(Gene)、39、89〜9
3頁(1985);アール・エイ・ヤングおよびアール・
ダブリュー・デイビス(R.A.Young and R.W.Davis)、プ
ロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ(Proc.Natl.Acad.Sci)USA、8
0、1194〜98頁(1983); アール・エイ・ヤ
ングおよびアール・ダブリュー・デイビス(R.A.Young a
nd R.W.Davis)、サイエンス(Science)、222、778
〜82頁(1983))。
オファージ発現ベクターλgt11中で組立てられたPR
V DNAライブラリーをスクリーニングすることによ
って単離された(ジェイ・ジイ・テイミンズら(J.G.Timm
ins et al.)、「ファージλgtIIライブラリーからの効
果的な遺伝子単離法:変性した、アセトン沈澱蛋白質に
対する抗血清の使用」、ジーン(Gene)、39、89〜9
3頁(1985);アール・エイ・ヤングおよびアール・
ダブリュー・デイビス(R.A.Young and R.W.Davis)、プ
ロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ(Proc.Natl.Acad.Sci)USA、8
0、1194〜98頁(1983); アール・エイ・ヤ
ングおよびアール・ダブリュー・デイビス(R.A.Young a
nd R.W.Davis)、サイエンス(Science)、222、778
〜82頁(1983))。
【0021】最初パードウ(Purdue)大学のデイ・ピイ・
グスタフソン(D.P.Gustafson)から入手したPRVライ
ス(Rice)株由来のPRVゲノムDNAをPRV感染ベ
ロ(Vero)細胞(ATCC CCL 81)の細胞質から単
離した。ゲノムDNAを超音波処理によってフラグメン
ト化し、次いでλgt11にクローンしてλ/PRV組換
体(λPRV)DNAライブラリーを得た。
グスタフソン(D.P.Gustafson)から入手したPRVライ
ス(Rice)株由来のPRVゲノムDNAをPRV感染ベ
ロ(Vero)細胞(ATCC CCL 81)の細胞質から単
離した。ゲノムDNAを超音波処理によってフラグメン
ト化し、次いでλgt11にクローンしてλ/PRV組換
体(λPRV)DNAライブラリーを得た。
【0022】λPRVライブラリーをスクリーニングす
るための抗血清はSDSゲル上でサイズにより分離した
PRVで感染した細胞(感染した細胞蛋白質またはIC
P)から単離した蛋白質でマウスを接種し、次いで抗体
を単離することによって得た。スクリーニングされるべ
きλPRVファージはlacZ遺伝子の3'末端におけるユ
ニークなクローニング部位を含有するイー・コリ(E.col
i)λgt11のリンネル布上で平板培養した。このユニー
ク部位に適当な配位で挿入された外来性DNAおよび解
読フレームは、発現に際し、β−ガラクトシダーゼに融
合したポリペプチドを産生する。PRV DNA の発
現を促進するlacZ転写の誘発物質を含有するニトロセ
ルロースフィルターを該リンネル布の頂部上に置いた。
λPRVによって発現された融合ポリペプチドにニトロ
セルロースフィルターと結合するのに十分な時間を与え
た後、該フィルターをリンネル布から取り除き、マウス
抗血清でプローブした。マウス抗血清に結合した抗原を
産生するプラークをマウス抗血清についてのラベル抗体
でプロープすることによって同定した。
るための抗血清はSDSゲル上でサイズにより分離した
PRVで感染した細胞(感染した細胞蛋白質またはIC
P)から単離した蛋白質でマウスを接種し、次いで抗体
を単離することによって得た。スクリーニングされるべ
きλPRVファージはlacZ遺伝子の3'末端におけるユ
ニークなクローニング部位を含有するイー・コリ(E.col
i)λgt11のリンネル布上で平板培養した。このユニー
ク部位に適当な配位で挿入された外来性DNAおよび解
読フレームは、発現に際し、β−ガラクトシダーゼに融
合したポリペプチドを産生する。PRV DNA の発
現を促進するlacZ転写の誘発物質を含有するニトロセ
ルロースフィルターを該リンネル布の頂部上に置いた。
λPRVによって発現された融合ポリペプチドにニトロ
セルロースフィルターと結合するのに十分な時間を与え
た後、該フィルターをリンネル布から取り除き、マウス
抗血清でプローブした。マウス抗血清に結合した抗原を
産生するプラークをマウス抗血清についてのラベル抗体
でプロープすることによって同定した。
【0023】陽性信号を与えるプラークを用いてイー・
コリ(E.coli)宿主を形質転換した(Y1090、ATC
C、ロックビル(Rockville)、メリーランド州2085
2より入手可能)。次いで、培養物を一晩インキュベー
トしてλPRVファージ株を得た。これらのファージ株
を用いてイー・コリ(E.coli)K95を感染した(デイ
・フリードマン(D.Friedman)、ザ・バクテリオファージ
・ランブダ(The Bacteriophage Lambda)、733〜38
頁、エイ・デイ・ハーシェイ(A.D.Hershey)編、(197
1)。形質転換されたイー・コリ(E.coli)K95によっ
て産生されたポリペプチドを予備ゲル電気泳動によって
精製した。(lacZ遺伝子の転写の誘導のため)過剰産生
された、116000ダルトン以上の分子量を有し、ま
たλgt11対照培養物中に存在しないポリペプチドはβ
−ガラクトシダーゼ−PRV融合蛋白質であった。次い
で、各個々の融合蛋白質を異なるマウスに注射して抗血
清を得た。
コリ(E.coli)宿主を形質転換した(Y1090、ATC
C、ロックビル(Rockville)、メリーランド州2085
2より入手可能)。次いで、培養物を一晩インキュベー
トしてλPRVファージ株を得た。これらのファージ株
を用いてイー・コリ(E.coli)K95を感染した(デイ
・フリードマン(D.Friedman)、ザ・バクテリオファージ
・ランブダ(The Bacteriophage Lambda)、733〜38
頁、エイ・デイ・ハーシェイ(A.D.Hershey)編、(197
1)。形質転換されたイー・コリ(E.coli)K95によっ
て産生されたポリペプチドを予備ゲル電気泳動によって
精製した。(lacZ遺伝子の転写の誘導のため)過剰産生
された、116000ダルトン以上の分子量を有し、ま
たλgt11対照培養物中に存在しないポリペプチドはβ
−ガラクトシダーゼ−PRV融合蛋白質であった。次い
で、各個々の融合蛋白質を異なるマウスに注射して抗血
清を得た。
【0024】例えば14C−グルコサミンを含有する培地
中で増殖するベロ(Vero)細胞を感染することによって標
識PRV ICPを得た(ティ・ジェイ・リーら(T.J.Re
a etal.)、前掲)。前記からの融合蛋白質抗血清を用い
てこれらの標識ICPを免疫沈降した。かく沈降したポ
リペプチドをゲル電気泳動によって分析した。それらの
うちの1つは110kd MW糖蛋白質(gI)およびもう
1つは63Kd MW糖蛋白質(gp63)であった。かく
して抗−gIおよび抗−gp63血清を生ぜしめるハイブ
リッド蛋白質を産生するファージ中でクローンされた遺
伝子はgIおよびgp63であることが示された。gp50
配列がそうである如く(図1参照)、これらの遺伝子はP
RVゲノムのBamHI7フラグメント内部にマップされ
ることが判明した(ティ・ジェイ・リーら(T.J.Rea et a
l.、前掲)。gIの位置は、一般に、メテンライターら(M
ettenleiter et al.)、前掲がgI遺伝子をマップした領
域に一致している。しかし、メテンライターらMettenle
iter et al.)は、実際はそうではないがgI遺伝子がBa
mHI12フラグメント中まで伸びることを示した。
中で増殖するベロ(Vero)細胞を感染することによって標
識PRV ICPを得た(ティ・ジェイ・リーら(T.J.Re
a etal.)、前掲)。前記からの融合蛋白質抗血清を用い
てこれらの標識ICPを免疫沈降した。かく沈降したポ
リペプチドをゲル電気泳動によって分析した。それらの
うちの1つは110kd MW糖蛋白質(gI)およびもう
1つは63Kd MW糖蛋白質(gp63)であった。かく
して抗−gIおよび抗−gp63血清を生ぜしめるハイブ
リッド蛋白質を産生するファージ中でクローンされた遺
伝子はgIおよびgp63であることが示された。gp50
配列がそうである如く(図1参照)、これらの遺伝子はP
RVゲノムのBamHI7フラグメント内部にマップされ
ることが判明した(ティ・ジェイ・リーら(T.J.Rea et a
l.、前掲)。gIの位置は、一般に、メテンライターら(M
ettenleiter et al.)、前掲がgI遺伝子をマップした領
域に一致している。しかし、メテンライターらMettenle
iter et al.)は、実際はそうではないがgI遺伝子がBa
mHI12フラグメント中まで伸びることを示した。
【0025】DNA交雑および選択されたmRNAのin
vitro 翻訳に比してこのλPRV遺伝子単離法は迅速
でかつ効果的である。精製された糖蛋白質が入手不可能
であったので、発明者らはアミノ酸配列データからオリ
ゴヌクレオチドプローブを急速に組立てることができ
ず、また高度に特異的な多クローン抗血清を精製させる
こともできなかった。従って、発明者らは前記の方法を
用いた。
vitro 翻訳に比してこのλPRV遺伝子単離法は迅速
でかつ効果的である。精製された糖蛋白質が入手不可能
であったので、発明者らはアミノ酸配列データからオリ
ゴヌクレオチドプローブを急速に組立てることができ
ず、また高度に特異的な多クローン抗血清を精製させる
こともできなかった。従って、発明者らは前記の方法を
用いた。
【0026】前記した如く、gp50、gp63およびgI
をコード付けする遺伝子をPRVDNA のBamHI7
フラグメントに対してマップした。PRVからのBamH
I7フラグメントは(PUC1129としても公知の)プ
ラスミドpPRXh1から得ることができ、DNA配列分
析に便利なフラグメントは標準的な継代クローニング法
によって得ることができる。プラスミドpUC1129
はイー・コリ(E.coli)HB101、NRRL B−15
772から入手可能である。この培養物はノーザン・リ
ージョナル・リサーチ・センター・ファーメンテイショ
ン・ラボラトリー(NRRL)、米国農務省、ペオリア(P
eoria)、イリノイ州、米国の永久寄託から入手可能であ
る。
をコード付けする遺伝子をPRVDNA のBamHI7
フラグメントに対してマップした。PRVからのBamH
I7フラグメントは(PUC1129としても公知の)プ
ラスミドpPRXh1から得ることができ、DNA配列分
析に便利なフラグメントは標準的な継代クローニング法
によって得ることができる。プラスミドpUC1129
はイー・コリ(E.coli)HB101、NRRL B−15
772から入手可能である。この培養物はノーザン・リ
ージョナル・リサーチ・センター・ファーメンテイショ
ン・ラボラトリー(NRRL)、米国農務省、ペオリア(P
eoria)、イリノイ州、米国の永久寄託から入手可能であ
る。
【0027】pUC1129を含有するイー・コリ(E.co
li)HB101はよく知られた方法によってL−ブロス
中で増殖させることができる。典型的には、培養物は
0.6の光学密度まで増殖させ、その後クロラムフェニ
コールを添加し、培養物を一晩振盪する。次いで、例え
ば高濃度塩SDSを用いて培養物を溶解し、上澄みを塩
化セシウム/臭化エチジウム平衡密度勾配遠心分離に付
してプラスミドを得る。
li)HB101はよく知られた方法によってL−ブロス
中で増殖させることができる。典型的には、培養物は
0.6の光学密度まで増殖させ、その後クロラムフェニ
コールを添加し、培養物を一晩振盪する。次いで、例え
ば高濃度塩SDSを用いて培養物を溶解し、上澄みを塩
化セシウム/臭化エチジウム平衡密度勾配遠心分離に付
してプラスミドを得る。
【0028】これらの遺伝子配列の利用により該遺伝子
および遺伝子配列の直接操作が可能となり、それにより
該遺伝子またはそのフラグメントによってコード付けさ
れる蛋白質の発現の調節および/または該蛋白質の構造
の修飾が可能となる。これらの遺伝子配列の知見によ
り、交雑プローブとして公知の配列を用いてPRVのい
ずれの株からの対応する遺伝子またはそのフラグメント
をもクローンすること、ならびに一般に当該分野におい
て公知の組換体技術によって完全な蛋白質またはそのフ
ラグメントを発現することが可能となる。
および遺伝子配列の直接操作が可能となり、それにより
該遺伝子またはそのフラグメントによってコード付けさ
れる蛋白質の発現の調節および/または該蛋白質の構造
の修飾が可能となる。これらの遺伝子配列の知見によ
り、交雑プローブとして公知の配列を用いてPRVのい
ずれの株からの対応する遺伝子またはそのフラグメント
をもクローンすること、ならびに一般に当該分野におい
て公知の組換体技術によって完全な蛋白質またはそのフ
ラグメントを発現することが可能となる。
【0029】これらの遺伝子配列の知見により、発明者
らは、対応するポリペプチドのアミノ酸配列を推断する
ことができた(配列表:配列番号1〜3)。その結果、P
RV免疫原性を有するこれらのポリペプチドのフラグメ
ントは蛋白質合成の標準法または組換体DNA法によっ
て産生できる。ここで用いる如く、免疫原性および抗原
性は適応免疫応答のいずれのタイプも刺激する能力につ
いて言及するのに相互交換的に用いることができる。す
なわち、抗原および抗原性は抗体の産生を刺激する物質
を意味することに限定されない。
らは、対応するポリペプチドのアミノ酸配列を推断する
ことができた(配列表:配列番号1〜3)。その結果、P
RV免疫原性を有するこれらのポリペプチドのフラグメ
ントは蛋白質合成の標準法または組換体DNA法によっ
て産生できる。ここで用いる如く、免疫原性および抗原
性は適応免疫応答のいずれのタイプも刺激する能力につ
いて言及するのに相互交換的に用いることができる。す
なわち、抗原および抗原性は抗体の産生を刺激する物質
を意味することに限定されない。
【0030】gp50、gp63およびgIについてコード
付けする遺伝子の一次構造(配列)も配列表(配列番号1
〜3)に記載する。
付けする遺伝子の一次構造(配列)も配列表(配列番号1
〜3)に記載する。
【0031】遺伝子またはそのフラグメントはNRRL
B−15772の培養物からのプラスミドDNAを適
当なエンドヌクレアーゼ制限酵素で消化することによっ
てpUC1129から抽出できる。例えば、BamHI
7フラグメントはBamHIでのpUC1129の調製物
の消化、およびゲル電気泳動による単離によって単離で
きる。
B−15772の培養物からのプラスミドDNAを適
当なエンドヌクレアーゼ制限酵素で消化することによっ
てpUC1129から抽出できる。例えば、BamHI
7フラグメントはBamHIでのpUC1129の調製物
の消化、およびゲル電気泳動による単離によって単離で
きる。
【0032】本明細書中で言及するすべての制限エンド
ヌクレアーゼは商業的に入手可能であり、それらの使用
は当該分野においてよく知られている。使用のための指
図書は、一般に、制限酵素の販売業者によって提供され
る。
ヌクレアーゼは商業的に入手可能であり、それらの使用
は当該分野においてよく知られている。使用のための指
図書は、一般に、制限酵素の販売業者によって提供され
る。
【0033】切り取られた遺伝子またはそのフラグメン
トは宿主細胞を形質転換するのに用いる各種クローニン
グビヒクルまたはベクターに結べる。好ましくは、該ベ
クターはPRV糖蛋白質遺伝子の転写および翻訳(これ
らは一緒に発現よりなる)を開始し、制限しおよび停止
するDNA配列を含有し、従ってそれに作動可能に連結
している。これらの「発現制御配列」は、好ましくは形質
転換されるべき宿主細胞に適合する。宿主細胞が高等動
物細胞、例えば哺乳動物細胞である場合、糖蛋白質遺伝
子の天然に生じる発現制御配列を単独で、または異種発
現制御配列と共に使用できる。異種配列は、また、単独
で用いることができる。該ベクターは、さらに好ましく
は、標識遺伝子(例えば、抗生物質耐性)を含有して形質
転換宿主細胞の選択についての表現型特徴を提供する。
さらに、複製ベクターはレプリコンを含有する。
トは宿主細胞を形質転換するのに用いる各種クローニン
グビヒクルまたはベクターに結べる。好ましくは、該ベ
クターはPRV糖蛋白質遺伝子の転写および翻訳(これ
らは一緒に発現よりなる)を開始し、制限しおよび停止
するDNA配列を含有し、従ってそれに作動可能に連結
している。これらの「発現制御配列」は、好ましくは形質
転換されるべき宿主細胞に適合する。宿主細胞が高等動
物細胞、例えば哺乳動物細胞である場合、糖蛋白質遺伝
子の天然に生じる発現制御配列を単独で、または異種発
現制御配列と共に使用できる。異種配列は、また、単独
で用いることができる。該ベクターは、さらに好ましく
は、標識遺伝子(例えば、抗生物質耐性)を含有して形質
転換宿主細胞の選択についての表現型特徴を提供する。
さらに、複製ベクターはレプリコンを含有する。
【0034】典型的なベクターは動物細胞を感染するプ
ラスミド、ファージおよびウイルスである。基本的に
は、宿主細胞を形質転換することができるいずれのDN
A配列も用いることができる。
ラスミド、ファージおよびウイルスである。基本的に
は、宿主細胞を形質転換することができるいずれのDN
A配列も用いることができる。
【0035】本明細書中で用いる宿主細胞なる語はPR
V糖蛋白質抗原性を示すポリペプチドについてコード付
けするDNA配列で形質転換され得る細胞を意味する。
好ましくは、宿主細胞はPRVポリペプチドまたはその
フラグメントを発現することができる。宿主細胞は原核
または真核であり得る。原核細胞の例としてはイー・コ
リ(E. coli)、ビイ・スブチリス(B. subtilis)、シュー
ドモナス(Pseudomonas)およびビイ・ステアロセルモフ
ィラス(B.stearothermophilus)の如き細菌がある。真
核細胞の例としては酵母または昆虫の細胞の如き高等動
物細胞、植物源もしくは哺乳動物源がある。哺乳動物細
胞懸濁液も用いることができるが、哺乳動物細胞システ
ムはしばしば細胞の単層の形態である。哺乳動物細胞系
は、例えばベロ(VERO)およびヒーラ細胞、チャイニ
ーズハムスター卵巣(CHO)細胞系、WI38、BH
K、COS−7またはMDCK 細胞系を包含する。昆
虫細胞系はスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera fr
ugiperda)(ATCC CRL1711)を包含する。い
くつかの入手可能な真核プラスミド、宿主細胞ならびに
PRV糖蛋白質をクローンするおよび発現するために使
用する方法の要約はケイ・エセルら(K.Esser et a
l.)、プラスミズ・オブ・エーカリオテス(Plasmids of
Eukaryotes)(ファンダメンタルズ・アンド・アプリケイ
ションズ(Fundamentals and Applications))、シュプリ
ンゲル−フェアラーク(Springer-Verlag)(1986)中
に見い出すことができ、参照のためにここに挙げる。
V糖蛋白質抗原性を示すポリペプチドについてコード付
けするDNA配列で形質転換され得る細胞を意味する。
好ましくは、宿主細胞はPRVポリペプチドまたはその
フラグメントを発現することができる。宿主細胞は原核
または真核であり得る。原核細胞の例としてはイー・コ
リ(E. coli)、ビイ・スブチリス(B. subtilis)、シュー
ドモナス(Pseudomonas)およびビイ・ステアロセルモフ
ィラス(B.stearothermophilus)の如き細菌がある。真
核細胞の例としては酵母または昆虫の細胞の如き高等動
物細胞、植物源もしくは哺乳動物源がある。哺乳動物細
胞懸濁液も用いることができるが、哺乳動物細胞システ
ムはしばしば細胞の単層の形態である。哺乳動物細胞系
は、例えばベロ(VERO)およびヒーラ細胞、チャイニ
ーズハムスター卵巣(CHO)細胞系、WI38、BH
K、COS−7またはMDCK 細胞系を包含する。昆
虫細胞系はスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera fr
ugiperda)(ATCC CRL1711)を包含する。い
くつかの入手可能な真核プラスミド、宿主細胞ならびに
PRV糖蛋白質をクローンするおよび発現するために使
用する方法の要約はケイ・エセルら(K.Esser et a
l.)、プラスミズ・オブ・エーカリオテス(Plasmids of
Eukaryotes)(ファンダメンタルズ・アンド・アプリケイ
ションズ(Fundamentals and Applications))、シュプリ
ンゲル−フェアラーク(Springer-Verlag)(1986)中
に見い出すことができ、参照のためにここに挙げる。
【0036】前記した如く、ベクター、例えば宿主細胞
を形質転換するのに用いられるプラスミドは、好ましく
は、PRV糖蛋白質遺伝子またはそのフラグメントの発
現のための受容可能な発現制御配列を含有する。従っ
て、発現制御配列は遺伝子またはフラグメントに作動可
能に連結する。宿主細胞が細菌である場合、有用な発現
制御配列の例はtrpプロモータおよびオペレータ(ゲデル
ら(Goeddel et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ(Nucl.Acids Res.)、8、4057(1980));lac
プロモータおよびオペレータ(チャンら(Chang et a
l.)、ネイチャー(Nature)、275、615(197
8));外部膜蛋白質プロモータ(ユアローピーアン・モレ
キュラー・バイオロジー・オーガナイゼイション・ジャ
ーナル(EMBOJ.)、1、771〜775(198
2));バクテリオファージλプロモータおよびオペレー
タ(ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids R
es.)、11、4677〜4688(1983));α−アミ
ラーゼ(ビイ・スブチリス(B.subtilis))プロモータお
よびオペレータ、停止配列および他の発現エンハンスメ
ントならびに選択された宿主細胞に適合する制御配列を
包含する。宿主細胞が酵母である場合、有用な発現制御
配列の例は、例えばα−交配因子を包含する。昆虫細胞
については、バクロウイルスのポリヘドリンプロモータ
を用いることができる(モレキュラー・アンド・セリュ
ラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.)、3、215
6〜65頁(1983))。宿主細胞が昆虫または哺乳動
物由来である場合、有用な発現制御配列の例は、例えば
SV−40プロモータ(サイエンス(Science)、222、
524〜527(1983))または例えばメタロチオネ
インプロモータ(ネイチャー(Nature)、296、39〜
42(1982))または熱ショックプロモータ(ボエルミ
イら(Voellmy et al.)、プロシーディングズ・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc.Nat
l.Acad.Sci.)USA、82、4949〜53頁(19
85))を包含する。前記した如く、宿主細胞が哺乳動物
細胞である場合、PRV糖蛋白質遺伝子についての発現
制御配列を、好ましくは異種発現制御配列と組合せて用
いることができる。
を形質転換するのに用いられるプラスミドは、好ましく
は、PRV糖蛋白質遺伝子またはそのフラグメントの発
現のための受容可能な発現制御配列を含有する。従っ
て、発現制御配列は遺伝子またはフラグメントに作動可
能に連結する。宿主細胞が細菌である場合、有用な発現
制御配列の例はtrpプロモータおよびオペレータ(ゲデル
ら(Goeddel et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ(Nucl.Acids Res.)、8、4057(1980));lac
プロモータおよびオペレータ(チャンら(Chang et a
l.)、ネイチャー(Nature)、275、615(197
8));外部膜蛋白質プロモータ(ユアローピーアン・モレ
キュラー・バイオロジー・オーガナイゼイション・ジャ
ーナル(EMBOJ.)、1、771〜775(198
2));バクテリオファージλプロモータおよびオペレー
タ(ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids R
es.)、11、4677〜4688(1983));α−アミ
ラーゼ(ビイ・スブチリス(B.subtilis))プロモータお
よびオペレータ、停止配列および他の発現エンハンスメ
ントならびに選択された宿主細胞に適合する制御配列を
包含する。宿主細胞が酵母である場合、有用な発現制御
配列の例は、例えばα−交配因子を包含する。昆虫細胞
については、バクロウイルスのポリヘドリンプロモータ
を用いることができる(モレキュラー・アンド・セリュ
ラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.)、3、215
6〜65頁(1983))。宿主細胞が昆虫または哺乳動
物由来である場合、有用な発現制御配列の例は、例えば
SV−40プロモータ(サイエンス(Science)、222、
524〜527(1983))または例えばメタロチオネ
インプロモータ(ネイチャー(Nature)、296、39〜
42(1982))または熱ショックプロモータ(ボエルミ
イら(Voellmy et al.)、プロシーディングズ・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc.Nat
l.Acad.Sci.)USA、82、4949〜53頁(19
85))を包含する。前記した如く、宿主細胞が哺乳動物
細胞である場合、PRV糖蛋白質遺伝子についての発現
制御配列を、好ましくは異種発現制御配列と組合せて用
いることができる。
【0037】発現制御配列を含有するプラスミドまたは
複製もしくは取込みDNA物質は制限酵素を用いて切断
され、要すればまたは所望によりサイズを調製し、次い
で当該分野でよく知られた方法によってPRV糖蛋白質
遺伝子またはそのフラグメントで結ぶ。酵母または高等
動物宿主細胞を使用する場合、公知の酵母もしくは哺乳
動物遺伝子からのポリアデニレーションもしくはターミ
ネーター配列をベクター中に一体化することができる。
例えば、ヨーロッパ特許公開番号0093619中に記
載されている如くウシ成長ホルモンポリアデニレーショ
ン配列を用いることができ、ここに参照のために挙げ
る。さらに、宿主細胞の複製を制御するための遺伝子配
列をベクター中に一体化することができる。
複製もしくは取込みDNA物質は制限酵素を用いて切断
され、要すればまたは所望によりサイズを調製し、次い
で当該分野でよく知られた方法によってPRV糖蛋白質
遺伝子またはそのフラグメントで結ぶ。酵母または高等
動物宿主細胞を使用する場合、公知の酵母もしくは哺乳
動物遺伝子からのポリアデニレーションもしくはターミ
ネーター配列をベクター中に一体化することができる。
例えば、ヨーロッパ特許公開番号0093619中に記
載されている如くウシ成長ホルモンポリアデニレーショ
ン配列を用いることができ、ここに参照のために挙げ
る。さらに、宿主細胞の複製を制御するための遺伝子配
列をベクター中に一体化することができる。
【0038】宿主細胞は形質転換について受容可能であ
る、あるいは各種方法によって受容可能とされる。細菌
細胞が宿主細胞である場合、コーヘン(Cohen)、ピイ・
エヌ・エイ・エス(PNAS)、69、2110(197
2)によって一般的に記載されている如く、塩、典型的
にはカルシウム塩での処理によってそれを受容可能とで
きる。一般に、酵母宿主細胞はその細胞壁の除去または
イオン処理の如き他の方法によって受容可能とされる
(ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J.Bacterio
l.)、153、163〜168(1983))。例えばリン
酸カルシウム沈降、DNAを含有する細菌プロトプラス
トでの受容体細胞の融合、DNAを含有するリポソーム
での受容体細胞の処理、およびDNAの細胞中への直接
マイクロインジェクションを包含するいくつかのよく知
られたDNAの動物細胞中への導入法がある。
る、あるいは各種方法によって受容可能とされる。細菌
細胞が宿主細胞である場合、コーヘン(Cohen)、ピイ・
エヌ・エイ・エス(PNAS)、69、2110(197
2)によって一般的に記載されている如く、塩、典型的
にはカルシウム塩での処理によってそれを受容可能とで
きる。一般に、酵母宿主細胞はその細胞壁の除去または
イオン処理の如き他の方法によって受容可能とされる
(ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J.Bacterio
l.)、153、163〜168(1983))。例えばリン
酸カルシウム沈降、DNAを含有する細菌プロトプラス
トでの受容体細胞の融合、DNAを含有するリポソーム
での受容体細胞の処理、およびDNAの細胞中への直接
マイクロインジェクションを包含するいくつかのよく知
られたDNAの動物細胞中への導入法がある。
【0039】形質転換細胞は当該分野でよく知られた方
法によって増殖し(モレキュラー・クローニング(Molecu
lar Cloning)、マニアティス・ティら(Maniatis T.et
al.)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
(Cold Spring Harbor Laboratory)、(1982);バイオ
ケミカル・メソッズ・イン・セル・カルチャー・アンド
・バイロロジー(Biochemical Methods In Cell Culture
and Virology)、クチラー・アール・ジェイ(Kuchler
R.J.)、ドウデン(Dowden)、ヒッチンソン・アンド・ロ
ス・インコーポレイティッド(Hutchinson and Ross、In
c.)、(1977);メソッズ・イン・イースト・ジェネテ
ィックス(Methods In Yeast Genetics)、シェルマン・
エフら(Sherman、F.et al.)、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laborato
ry)、(1982))、発現されたPRV糖蛋白質またはそ
のフラグメントは、例えば当該分野でよく知られた機械
的もしくは酵素的方法によって宿主細胞系を破壊した
後、宿主細胞または細胞懸濁液から蛋白質が排出される
系において細胞培養物から収穫される。
法によって増殖し(モレキュラー・クローニング(Molecu
lar Cloning)、マニアティス・ティら(Maniatis T.et
al.)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
(Cold Spring Harbor Laboratory)、(1982);バイオ
ケミカル・メソッズ・イン・セル・カルチャー・アンド
・バイロロジー(Biochemical Methods In Cell Culture
and Virology)、クチラー・アール・ジェイ(Kuchler
R.J.)、ドウデン(Dowden)、ヒッチンソン・アンド・ロ
ス・インコーポレイティッド(Hutchinson and Ross、In
c.)、(1977);メソッズ・イン・イースト・ジェネテ
ィックス(Methods In Yeast Genetics)、シェルマン・
エフら(Sherman、F.et al.)、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laborato
ry)、(1982))、発現されたPRV糖蛋白質またはそ
のフラグメントは、例えば当該分野でよく知られた機械
的もしくは酵素的方法によって宿主細胞系を破壊した
後、宿主細胞または細胞懸濁液から蛋白質が排出される
系において細胞培養物から収穫される。
【0040】前記した如く、遺伝子構造から推断したP
RV糖蛋白質のアミノ酸配列は配列表(配列番号1〜
3)に記載する。PRV糖蛋白質抗原性を示すポリペプ
チドは配列表(配列番号1〜3)に記載した配列ならび
にポリペプチド配列およびまた該ポリペプチドの免疫原
的機能同族体を注射された動物、例えば哺乳動物におい
て免疫応答を引き出すことができるポリペプチド配列の
いずれの部分も包含する。
RV糖蛋白質のアミノ酸配列は配列表(配列番号1〜
3)に記載する。PRV糖蛋白質抗原性を示すポリペプ
チドは配列表(配列番号1〜3)に記載した配列ならび
にポリペプチド配列およびまた該ポリペプチドの免疫原
的機能同族体を注射された動物、例えば哺乳動物におい
て免疫応答を引き出すことができるポリペプチド配列の
いずれの部分も包含する。
【0041】前記で示した如く、PRV糖蛋白質につい
てコード付けする完全な遺伝子をベクターを組立てるの
におよび宿主細胞を形質転換するのに用いてPRV糖蛋
白質を発現することができ、あるいはPRV糖蛋白質を
コード付けする遺伝子のフラグメントを用いることがで
き、それにより得られた宿主細胞はPRV抗原性を示す
ポリペプチドを発現する。PRV糖蛋白質遺伝子のいず
れのフラグメントも用いることができ、その結果PRV
糖蛋白質の免疫原フラグメントまたはその同族体である
ポリペプチドを発現する。当該分野においてよく知られ
ている如く、遺伝コードの縮退はPRV糖蛋白質抗原性
を示すポリペプチドをコード付けする機能的に均等な遺
伝子またはそのフラグメントを産生するための塩基対の
容易な置換を可能とする。これらの機能的均等物も本発
明の範囲内に包含される。
てコード付けする完全な遺伝子をベクターを組立てるの
におよび宿主細胞を形質転換するのに用いてPRV糖蛋
白質を発現することができ、あるいはPRV糖蛋白質を
コード付けする遺伝子のフラグメントを用いることがで
き、それにより得られた宿主細胞はPRV抗原性を示す
ポリペプチドを発現する。PRV糖蛋白質遺伝子のいず
れのフラグメントも用いることができ、その結果PRV
糖蛋白質の免疫原フラグメントまたはその同族体である
ポリペプチドを発現する。当該分野においてよく知られ
ている如く、遺伝コードの縮退はPRV糖蛋白質抗原性
を示すポリペプチドをコード付けする機能的に均等な遺
伝子またはそのフラグメントを産生するための塩基対の
容易な置換を可能とする。これらの機能的均等物も本発
明の範囲内に包含される。
【0042】図1〜図58は実施例の組立てを示すため
に掲げる。プラスミドおよびDNAフラグメントを示す
のに以下の如くある約束事を用いる: (1)単一線の図は環状および直線状の二本鎖DNAを共
に表わす。 (2)星印(*)は表わされた分子が環状であることを示
す。星印が無いのは分子が直線状であることを示す。 (3)注目するエンドヌクレアーゼ制限部位は直線の上方
に示す。 (4)遺伝子は直線の下方に示す。 (5)遺伝子および制限部位間の距離はスケール通りでは
ない。特に断りのない限り、図は相対的な位置のみを示
す。
に掲げる。プラスミドおよびDNAフラグメントを示す
のに以下の如くある約束事を用いる: (1)単一線の図は環状および直線状の二本鎖DNAを共
に表わす。 (2)星印(*)は表わされた分子が環状であることを示
す。星印が無いのは分子が直線状であることを示す。 (3)注目するエンドヌクレアーゼ制限部位は直線の上方
に示す。 (4)遺伝子は直線の下方に示す。 (5)遺伝子および制限部位間の距離はスケール通りでは
ない。特に断りのない限り、図は相対的な位置のみを示
す。
【0043】本発明を実施するのに用いる組換体DNA
法のほとんどは当業者によく知られた標準的な方法であ
り、例えばモレキュラー・クローニング(Molecular Clo
ning)、ティ・マニアティスら(T.Maniatis et al.)、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold
Spring Harbor Laboratory)、(1982)およびビイ・
パーバル(B.Perbal)、ア・プラクティカル・ガイド・
トゥ・モレキュラー・クロウニング(A Practical Guide
to Molecular Cloning)、ジョン・ウイリイ・アンド・
サンズ(John Wiley & Sons)、(1984)中に詳しく記
載されており、参照のためにここに挙げる。
法のほとんどは当業者によく知られた標準的な方法であ
り、例えばモレキュラー・クローニング(Molecular Clo
ning)、ティ・マニアティスら(T.Maniatis et al.)、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold
Spring Harbor Laboratory)、(1982)およびビイ・
パーバル(B.Perbal)、ア・プラクティカル・ガイド・
トゥ・モレキュラー・クロウニング(A Practical Guide
to Molecular Cloning)、ジョン・ウイリイ・アンド・
サンズ(John Wiley & Sons)、(1984)中に詳しく記
載されており、参照のためにここに挙げる。
【0044】
実施例1 本実施例においてはPRV糖蛋白質gp50の配列決定、
クローニングおよび発現を記載する。 1.gp50遺伝子の配列決定 gp50遺伝子をコード付けするPRVライス(Rice)株D
NAのBamHI7フラグメント(図1)をpPRXh1[N
RRL B−15772]、前掲、から単離し、継代ク
ローンしてプラスミドpBR322のBamHI部位に入
れる(マニアティスら(Maniatis et al.)、前掲)。
クローニングおよび発現を記載する。 1.gp50遺伝子の配列決定 gp50遺伝子をコード付けするPRVライス(Rice)株D
NAのBamHI7フラグメント(図1)をpPRXh1[N
RRL B−15772]、前掲、から単離し、継代ク
ローンしてプラスミドpBR322のBamHI部位に入
れる(マニアティスら(Maniatis et al.)、前掲)。
【0045】以下、図2〜5を参照して、PvuIIでB
amHIを消化し、2つのBamHI/PvuIIフラグメン
ト(1.5および4.9kb)を単離し次いでpBR322の
BamHIおよびPvuII部位間でそれらを継代クローン
することによる標準法を用いて該フラグメントをさらに
継代クローンして各々1.5および4.9kbフラグメント
を一体化するプラスミドpPR28−4およびpPR28
−1を得る(リーら(Rea et al.)、前掲、も参照)。これ
らの継代クローンはDNA配列決定実験のためのDNA
源として用いる。
amHIを消化し、2つのBamHI/PvuIIフラグメン
ト(1.5および4.9kb)を単離し次いでpBR322の
BamHIおよびPvuII部位間でそれらを継代クローン
することによる標準法を用いて該フラグメントをさらに
継代クローンして各々1.5および4.9kbフラグメント
を一体化するプラスミドpPR28−4およびpPR28
−1を得る(リーら(Rea et al.)、前掲、も参照)。これ
らの継代クローンはDNA配列決定実験のためのDNA
源として用いる。
【0046】図6はgp50遺伝子中に位置する各種制限
酵素切断部位およびフランキング領域を示す。前記で継
代クローンした1.5および4.9kbフラグメントをこれ
らの制限酵素で消化する。制限酵素によって生じた各末
端をポリヌクレオチドキナーゼを用いてγ−32P−AT
Pでラベルし、マキサムおよびギルバート(Maxam andG
ilbert)、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods
Enzymol.)、65、499〜560(1980)の方法に
より配列する。完全な遺伝子を両鎖上に少なくとも2回
配列する。gp50についてのDNA配列を配列表(配列
番号)に掲げる。このDNAはPRVに能動的に感染し
た動物を検知するのに用いることができる。例えば、鼻
もしくはのどを綿棒で拭いて試料採取し、次いで標準法
によりDNA/DNA交雑を行ってPRVの存在を検知
する。
酵素切断部位およびフランキング領域を示す。前記で継
代クローンした1.5および4.9kbフラグメントをこれ
らの制限酵素で消化する。制限酵素によって生じた各末
端をポリヌクレオチドキナーゼを用いてγ−32P−AT
Pでラベルし、マキサムおよびギルバート(Maxam andG
ilbert)、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods
Enzymol.)、65、499〜560(1980)の方法に
より配列する。完全な遺伝子を両鎖上に少なくとも2回
配列する。gp50についてのDNA配列を配列表(配列
番号)に掲げる。このDNAはPRVに能動的に感染し
た動物を検知するのに用いることができる。例えば、鼻
もしくはのどを綿棒で拭いて試料採取し、次いで標準法
によりDNA/DNA交雑を行ってPRVの存在を検知
する。
【0047】2.gp50の発現 以下、図7〜9を参照して、NarI切断部位はgp50遺
伝子翻訳開始コードンから塩基対35個だけ上流に位置
する。発現における第一工程はNarI切断部位の地点に
おける便利なBamHI切断部位の挿入である。前記から
のプラスミドpPR28−4を制限エンドヌクレアーゼ
NarIで消化してgp50遺伝子の端部をコード付けする
N末端およびgX遺伝子の一部よりなるDNAフラグメ
ント3を得る。BamHIリンカーをフラグメント3に加
え、該フラグメントをBamHIで消化してgX配列を欠
失し、かくしてフラグメント4を得る。次いでBamHI
末端を結んでプラスミドpPR28−4 Nar2を得
る。
伝子翻訳開始コードンから塩基対35個だけ上流に位置
する。発現における第一工程はNarI切断部位の地点に
おける便利なBamHI切断部位の挿入である。前記から
のプラスミドpPR28−4を制限エンドヌクレアーゼ
NarIで消化してgp50遺伝子の端部をコード付けする
N末端およびgX遺伝子の一部よりなるDNAフラグメ
ント3を得る。BamHIリンカーをフラグメント3に加
え、該フラグメントをBamHIで消化してgX配列を欠
失し、かくしてフラグメント4を得る。次いでBamHI
末端を結んでプラスミドpPR28−4 Nar2を得
る。
【0048】以下、図10〜12を参照して、完全なgp
50遺伝子の組立てが示される。pPR28−4 Nar
2をBamHIおよびPvuIIで消化してgp50遺伝子の
N−末端コード付け部分よりなるフラグメント5(16
0bp)を得る。また、前記からのプラスミドpPR28−
1をPvuIIおよびBamHIで消化してgp50遺伝子の
C末端コード付け部分よりなる4.9kbフラグメントを
得る(フラグメント6)。(米国特許出願SN76013
0号に記載されている如く組立てた)プラスミドpPGX
1、または別法としてプラスミドpBR322をBamH
Iで消化し、細菌アルカリホスファターゼ(BAP)で処
理し、次いでフラグメント5および6で結んで完全なgp
50遺伝子よりなるプラスミドpBGP50−23を得
る。
50遺伝子の組立てが示される。pPR28−4 Nar
2をBamHIおよびPvuIIで消化してgp50遺伝子の
N−末端コード付け部分よりなるフラグメント5(16
0bp)を得る。また、前記からのプラスミドpPR28−
1をPvuIIおよびBamHIで消化してgp50遺伝子の
C末端コード付け部分よりなる4.9kbフラグメントを
得る(フラグメント6)。(米国特許出願SN76013
0号に記載されている如く組立てた)プラスミドpPGX
1、または別法としてプラスミドpBR322をBamH
Iで消化し、細菌アルカリホスファターゼ(BAP)で処
理し、次いでフラグメント5および6で結んで完全なgp
50遺伝子よりなるプラスミドpBGP50−23を得
る。
【0049】以下、図13〜15を参照して、プラスミ
ドpD50の産生が示される。プラスミドpBG50−2
3を制限酵素MaeIIIで切断して(ケイ・シュミット
ら(K.Schmid et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ(Nucl.Acids Res.)、12、2619頁(198
4))フラグメントの混合物を得る。MaeIII末端をT
4 DNAポリメラーゼで平滑末端とし、EcoRIリン
カーを該平滑末端に加え、続いてEcoRI消化を行う。
得られたフラグメントをBamHIで切断し、gp50遺伝
子を含有する1.3kb BamHI/EcoRIフラグメン
ト(フラグメント7)を単離する。(アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(American TypeCulture Co
llection)、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Beth
esda Reseach Laboratories)から得た。またはエス・ス
ブラマニら(S.Subramani et al.)、モレキュラー・ア
ンド・セリュラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.)、
2、854〜64頁(1981)の方法により合成した)
プラスミドpSV2dhfrをBamHIおよびEcoRIで消
化し、より大きい(5.0kb)フラグメントを単離してジ
ヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)標識を含有するフラグメント
8を得る。次いでフラグメント7および8を結んでgp5
0遺伝子およびdhfr標識を含有するプラスミドpD50
を得る。
ドpD50の産生が示される。プラスミドpBG50−2
3を制限酵素MaeIIIで切断して(ケイ・シュミット
ら(K.Schmid et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ(Nucl.Acids Res.)、12、2619頁(198
4))フラグメントの混合物を得る。MaeIII末端をT
4 DNAポリメラーゼで平滑末端とし、EcoRIリン
カーを該平滑末端に加え、続いてEcoRI消化を行う。
得られたフラグメントをBamHIで切断し、gp50遺伝
子を含有する1.3kb BamHI/EcoRIフラグメン
ト(フラグメント7)を単離する。(アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(American TypeCulture Co
llection)、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Beth
esda Reseach Laboratories)から得た。またはエス・ス
ブラマニら(S.Subramani et al.)、モレキュラー・ア
ンド・セリュラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.)、
2、854〜64頁(1981)の方法により合成した)
プラスミドpSV2dhfrをBamHIおよびEcoRIで消
化し、より大きい(5.0kb)フラグメントを単離してジ
ヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)標識を含有するフラグメント
8を得る。次いでフラグメント7および8を結んでgp5
0遺伝子およびdhfr標識を含有するプラスミドpD50
を得る。
【0050】以下、図16〜18を参照して、ヒトサイ
トメガロウイルスタウネ(Towne)株からの即時型プロモ
ータをgp50遺伝子より上流に加える。pD50をBam
HIで消化し、細菌アルカリホスファターゼで処理して
フラグメント9を得る。ヒトサイトメガロウイルス(タ
ウネ(Towne))即時型プロモータを含有する760bpSau
3Aフラグメントを米国特許出願SN758517号に
記載された方法によって単離してフラグメント10を得
る(ディ・アール・トムソンら(D.R.Thomson et a
l.)、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ(Proc.Natl.Acad. Sci.)U
SA、81、659〜63頁(1984)も参照)。次い
で、BamHI/Sau3A融合によってこれらのフラグメ
ントを結んでプラスミドpDIE50を得る。プロモー
タがgp50遺伝子を転写するのに適当な配位であること
を確認するために該プラスミドをSacIおよびPvuII
で消化し、185bpフラグメントを得る。
トメガロウイルスタウネ(Towne)株からの即時型プロモ
ータをgp50遺伝子より上流に加える。pD50をBam
HIで消化し、細菌アルカリホスファターゼで処理して
フラグメント9を得る。ヒトサイトメガロウイルス(タ
ウネ(Towne))即時型プロモータを含有する760bpSau
3Aフラグメントを米国特許出願SN758517号に
記載された方法によって単離してフラグメント10を得
る(ディ・アール・トムソンら(D.R.Thomson et a
l.)、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ(Proc.Natl.Acad. Sci.)U
SA、81、659〜63頁(1984)も参照)。次い
で、BamHI/Sau3A融合によってこれらのフラグメ
ントを結んでプラスミドpDIE50を得る。プロモー
タがgp50遺伝子を転写するのに適当な配位であること
を確認するために該プラスミドをSacIおよびPvuII
で消化し、185bpフラグメントを得る。
【0051】以下、図19〜23を参照して、ウシ成長
ホルモンポリアデニレーション信号を含有する0.6kb
PvuII/EcoRIフラグメントをPvuIIおよびEc
oRIでの消化によってプラスミドpGH2R2から(ア
ール・ピイ・ウォイチックら(R.P.Woychik et al.)、
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Re
s.)、10、7197〜7210頁(1982))から、あ
るいはpSVCOW7(前掲)から単離してフラグメント
11を得る。
ホルモンポリアデニレーション信号を含有する0.6kb
PvuII/EcoRIフラグメントをPvuIIおよびEc
oRIでの消化によってプラスミドpGH2R2から(ア
ール・ピイ・ウォイチックら(R.P.Woychik et al.)、
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl.Acids Re
s.)、10、7197〜7210頁(1982))から、あ
るいはpSVCOW7(前掲)から単離してフラグメント
11を得る。
【0052】フラグメント11を(ファルマシア(Pharm
acia)/PLまたはATCCから入手した)pUC9のEc
oRIおよびSmaI切断部位間にクローンする。pCOW
T1をSalIで切断し、T4 DNAポリメラーゼで平
滑末端とし、EcoRIリンカーを加え、該DNAをEco
RIで切断し、0.6kbフラグメント(フラグメント1
2)を単離する。これは2個のEcoRI末端および1の
末端にポリリンカー配列を有する以外はフラグメント1
1と同一である。
acia)/PLまたはATCCから入手した)pUC9のEc
oRIおよびSmaI切断部位間にクローンする。pCOW
T1をSalIで切断し、T4 DNAポリメラーゼで平
滑末端とし、EcoRIリンカーを加え、該DNAをEco
RIで切断し、0.6kbフラグメント(フラグメント1
2)を単離する。これは2個のEcoRI末端および1の
末端にポリリンカー配列を有する以外はフラグメント1
1と同一である。
【0053】プラスミドpDIE50をEcoRIで切断
し、フラグメント12をそれにクローンしてプラスミド
pDIE50PAを得る。ポリアデニレーション信号が
適当な配位である場合、BamHIおよびPvuIIでの消
化により1.1kbのフラグメントを得る。該プラスミド
はプロモータ前のポリアデニレーション配列におけるク
ローニングによっても組立てることができる。
し、フラグメント12をそれにクローンしてプラスミド
pDIE50PAを得る。ポリアデニレーション信号が
適当な配位である場合、BamHIおよびPvuIIでの消
化により1.1kbのフラグメントを得る。該プラスミド
はプロモータ前のポリアデニレーション配列におけるク
ローニングによっても組立てることができる。
【0054】プラスミドpDIE50PAを用いてサケ
精子キャリアDNAとリン酸カルシウムとの共沈降(エ
フ・エル・グラハムおよびエイ・ジェイ・バン・デル・
エブ(F.L.Graham and A.J.Van Der Eb)、バイロロ
ジー(Virol.)、52、456〜67(1973))により
CHO dhfr- 細胞をトランスフェクトする(DXB−
11、ジイ・ウルラウブおよびエル・エイ・チャシン
(G.Urlaub and L.A.Chasin)、プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(P
roc.Natl.Acad.Sci.)USA、77、4216〜20
(1980))。ジヒドロ葉酸還元酵素陽性(dhfr+)のトラ
ンスフェクトされた細胞をダルベッコの修正イーグル培
地+イーグルの非須アミノ酸+10%胎児子ウシ血清中
で選択する。選択したdhfr+CHO細胞は、抗gp50単
クローン抗体3A−4での免疫蛍光法により、あるいは
14C−グルコサミンでの標識および3A−4での免疫沈
降によって検知されるgp50を産生する。単クローン抗
体3A−4は1985年1月9日出願の同時係属米国特
許出願SN817429号に記載されている如くに産生
される。免疫沈降反応は次に示す以外は前記した(ティ
・ジェイ・リーら(T.J.Rea et al.)、前掲)如くに行
う:まず抽出物を正常なマウス血清・続いて洗浄したス
タフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureu
s)細胞と共にインキュベートし、ベックマン(Beckman)
SW50.1ローター中、40000rpmにて30分間
遠心する。抽出物を単クローンもしくは多クローン抗血
清とエス・アウレウス(S.Aureus)細胞と共にインキュ
ベートした後、10mMトリスHCl、pH7.0、1mA
EDTA、0.1M NaCl、1%NP40および
0.5%デオキシコレート中で細胞を3回洗浄する。蛋
白質の分析は11%SDSポリアクリルアミドゲル上で
行う(エル・モースら(L.Morse et al.)、ジャーナル・
オブ・バイロロジー(J.Virol.)、26、389〜41
0頁(1984))。予備免疫蛍光アッセイにおいて、3
A−4はpDIE50PAでトランスフェクトされたC
HO細胞と反応するがトランスフェクトされていないC
HO細胞とは反応しないことが判明した。トランスフェ
クトされたCHO細胞を14C−グルコサミンでラベルし
た場合、3A−4はpDIE50PAを含有する細胞か
らラベルした蛋白質を免疫沈降させたが、ヒトレニンを
生成する対照細胞からは免疫沈降されなかった。沈降し
た蛋白質はSDS−ポリアクリルアミドゲル上でPRV
感染細胞からの3A−4により沈降した蛋白質と一緒に
移動した。
精子キャリアDNAとリン酸カルシウムとの共沈降(エ
フ・エル・グラハムおよびエイ・ジェイ・バン・デル・
エブ(F.L.Graham and A.J.Van Der Eb)、バイロロ
ジー(Virol.)、52、456〜67(1973))により
CHO dhfr- 細胞をトランスフェクトする(DXB−
11、ジイ・ウルラウブおよびエル・エイ・チャシン
(G.Urlaub and L.A.Chasin)、プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(P
roc.Natl.Acad.Sci.)USA、77、4216〜20
(1980))。ジヒドロ葉酸還元酵素陽性(dhfr+)のトラ
ンスフェクトされた細胞をダルベッコの修正イーグル培
地+イーグルの非須アミノ酸+10%胎児子ウシ血清中
で選択する。選択したdhfr+CHO細胞は、抗gp50単
クローン抗体3A−4での免疫蛍光法により、あるいは
14C−グルコサミンでの標識および3A−4での免疫沈
降によって検知されるgp50を産生する。単クローン抗
体3A−4は1985年1月9日出願の同時係属米国特
許出願SN817429号に記載されている如くに産生
される。免疫沈降反応は次に示す以外は前記した(ティ
・ジェイ・リーら(T.J.Rea et al.)、前掲)如くに行
う:まず抽出物を正常なマウス血清・続いて洗浄したス
タフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureu
s)細胞と共にインキュベートし、ベックマン(Beckman)
SW50.1ローター中、40000rpmにて30分間
遠心する。抽出物を単クローンもしくは多クローン抗血
清とエス・アウレウス(S.Aureus)細胞と共にインキュ
ベートした後、10mMトリスHCl、pH7.0、1mA
EDTA、0.1M NaCl、1%NP40および
0.5%デオキシコレート中で細胞を3回洗浄する。蛋
白質の分析は11%SDSポリアクリルアミドゲル上で
行う(エル・モースら(L.Morse et al.)、ジャーナル・
オブ・バイロロジー(J.Virol.)、26、389〜41
0頁(1984))。予備免疫蛍光アッセイにおいて、3
A−4はpDIE50PAでトランスフェクトされたC
HO細胞と反応するがトランスフェクトされていないC
HO細胞とは反応しないことが判明した。トランスフェ
クトされたCHO細胞を14C−グルコサミンでラベルし
た場合、3A−4はpDIE50PAを含有する細胞か
らラベルした蛋白質を免疫沈降させたが、ヒトレニンを
生成する対照細胞からは免疫沈降されなかった。沈降し
た蛋白質はSDS−ポリアクリルアミドゲル上でPRV
感染細胞からの3A−4により沈降した蛋白質と一緒に
移動した。
【0055】gp50を産生するこれらのトランスフェク
トされたCHO細胞のクローンはローラー・ボトル(rol
ler bottle)中で増殖し、リン酸緩衝食塩水および1mM
EDTA 中で収穫し、ワクチンとして使用するため
に完全フロイントアジュバント混合できる。
トされたCHO細胞のクローンはローラー・ボトル(rol
ler bottle)中で増殖し、リン酸緩衝食塩水および1mM
EDTA 中で収穫し、ワクチンとして使用するため
に完全フロイントアジュバント混合できる。
【0056】また、gp50遺伝子はワクチニアベクター
において発現することができる。この具体例において
は、pBG50−23をMaeIIIで消化し次いでT4
DNAポリメラーゼで平滑末端とした後、該DNAを
BamHIで消化する。gp50遺伝子を含有する1.3Ba
mHI/平滑末端フラグメントを単離する。プラスミドp
GS20(マケットら(Mackett et al.)、ジャーナル・
オブ・バイロロジー(J.Virol.)49、876〜64頁
(1984))をBamHIおよびSmaIで切断し、ゲル電
気泳動によってより大きい6.5kbフラグメントを単離
する。これらの2のフラグメントを一緒に結んでpVV
50を得る。プラスミドpVV50をトランスフェクト
してワクチニアウイルスのWR株(ATCC VR−1
19)で感染したCV−1細胞(ATCC CCL70)
に入れ、マケットら(Mackett et al.).ディ・エヌ・エ
イ・クロウニング(DNA Cloning)、II巻:ア・プ
ラクティカル・アプローチ(A Practical Approach)、デ
ィ・エム・グロウバー(D.M.Glover)編、アイ・アール
・エル・プレス(IRL Press)、オックスフォード
(1985)により記載されている方法により5−ブロモ
デオキシ−ウリジン(BUdR)中で143細胞(ATCC
CRL 8303)上で平板培養することによってチ
ミジンキナーゼ陰性組換体について選択する。14C−グ
ルコサミンでの感染細胞の蛋白質のラベルおよび単クロ
ーン抗体3A−4での免疫沈降によってアッセイを行っ
た如く、得られたウイルス・ワクチニア−gp50は感染
細胞においてgp50を発現した。
において発現することができる。この具体例において
は、pBG50−23をMaeIIIで消化し次いでT4
DNAポリメラーゼで平滑末端とした後、該DNAを
BamHIで消化する。gp50遺伝子を含有する1.3Ba
mHI/平滑末端フラグメントを単離する。プラスミドp
GS20(マケットら(Mackett et al.)、ジャーナル・
オブ・バイロロジー(J.Virol.)49、876〜64頁
(1984))をBamHIおよびSmaIで切断し、ゲル電
気泳動によってより大きい6.5kbフラグメントを単離
する。これらの2のフラグメントを一緒に結んでpVV
50を得る。プラスミドpVV50をトランスフェクト
してワクチニアウイルスのWR株(ATCC VR−1
19)で感染したCV−1細胞(ATCC CCL70)
に入れ、マケットら(Mackett et al.).ディ・エヌ・エ
イ・クロウニング(DNA Cloning)、II巻:ア・プ
ラクティカル・アプローチ(A Practical Approach)、デ
ィ・エム・グロウバー(D.M.Glover)編、アイ・アール
・エル・プレス(IRL Press)、オックスフォード
(1985)により記載されている方法により5−ブロモ
デオキシ−ウリジン(BUdR)中で143細胞(ATCC
CRL 8303)上で平板培養することによってチ
ミジンキナーゼ陰性組換体について選択する。14C−グ
ルコサミンでの感染細胞の蛋白質のラベルおよび単クロ
ーン抗体3A−4での免疫沈降によってアッセイを行っ
た如く、得られたウイルス・ワクチニア−gp50は感染
細胞においてgp50を発現した。
【0057】実施例2 本実施例では、実施例1のgp50を免疫原剤として用い
るマウスおよびブタのPRV攻撃からの保護を記載す
る。後掲の表1〜3では、以下の如くにミクロ中和アッ
セイを行った:3%胎児子ウシ血清および抗生物質を補
足した基礎培地イーグル(BME)を用い、ミクロ滴定プ
レート(コスター(Costar))中で血清試料の系列的な2倍
希釈を行った。PRVの約1000pfu(50μl)を各希
釈物50μlに添加した。マウス血清アッセイについて
は、1:5の希釈におけるウイルスの一部にラビット補
体が包含されていたが、ブタ血清アッセイについては包
含されていなかった。試料を37℃にて1時間(ブタ血
清)または3時間(マウス血清)のいずれかインキュベー
トした。インキュベーション時間の後、イーグルの最小
必須培地中のブタ腎臓−15(PK−15)細胞(300
000細胞/ml)の一部50μlをPRV試料につき各血
清に添加した。ひき続いて、試料を37℃にて2日間イ
ンキュベートした。中和による力価は50%の細胞を細
胞病理効果から保護した最高の希釈の逆数を表わす。
るマウスおよびブタのPRV攻撃からの保護を記載す
る。後掲の表1〜3では、以下の如くにミクロ中和アッ
セイを行った:3%胎児子ウシ血清および抗生物質を補
足した基礎培地イーグル(BME)を用い、ミクロ滴定プ
レート(コスター(Costar))中で血清試料の系列的な2倍
希釈を行った。PRVの約1000pfu(50μl)を各希
釈物50μlに添加した。マウス血清アッセイについて
は、1:5の希釈におけるウイルスの一部にラビット補
体が包含されていたが、ブタ血清アッセイについては包
含されていなかった。試料を37℃にて1時間(ブタ血
清)または3時間(マウス血清)のいずれかインキュベー
トした。インキュベーション時間の後、イーグルの最小
必須培地中のブタ腎臓−15(PK−15)細胞(300
000細胞/ml)の一部50μlをPRV試料につき各血
清に添加した。ひき続いて、試料を37℃にて2日間イ
ンキュベートした。中和による力価は50%の細胞を細
胞病理効果から保護した最高の希釈の逆数を表わす。
【0058】表1はワクチニアウイルスにおいて産生さ
れたgp50での免疫化による、ビルレントPRVによる
攻撃からのマウスの保護を示す。25μlでの尾乱切ま
たは50μlでの肉趾経路によってマウスを免疫化し
た。攻撃の28日前にマウスを免疫化した(攻撃の14
日前に免疫化したPR−Vacを投与したマウスを除
く)。
れたgp50での免疫化による、ビルレントPRVによる
攻撃からのマウスの保護を示す。25μlでの尾乱切ま
たは50μlでの肉趾経路によってマウスを免疫化し
た。攻撃の28日前にマウスを免疫化した(攻撃の14
日前に免疫化したPR−Vacを投与したマウスを除
く)。
【0059】
【表1】 免疫化剤 投与量 経路 中和力価a %生存b (PFU) gp50 3.0×107 尾 1024 93 gp50 6.0×107 肉趾 1024 100 gp50 7.5×106 尾 512 93 ワクチニアc 7.5×106 尾 <8 27 BME d −− 尾 <8 20 PR−Vac e −− 肉趾 5 12 90 a 攻撃日におけるPRVに対する中和力価(+補体)b 腹腔内経路によりPRVライス(Rice)株のLD50
の10回分で攻撃した。c 対照ウイルスd 基礎培地イーグル、陰性対照e ノルデン・ラボラトリーズ(Norden Laboratorie
s)、リンカーン、ネブラスカ州、不活性化PRVワクチ
ン、陽性対照
の10回分で攻撃した。c 対照ウイルスd 基礎培地イーグル、陰性対照e ノルデン・ラボラトリーズ(Norden Laboratorie
s)、リンカーン、ネブラスカ州、不活性化PRVワクチ
ン、陽性対照
【0060】表2はCHO細胞において産生されたgp5
0での免疫化による、ビルレントPRVによる攻撃から
のマウスの保護を示す。攻撃の28日前、18日前およ
び7日前にマウスを免疫化した。第1投与できアジュバ
ントと共に調製物をマウスに皮下投与し、第2および第
3投与では食塩水中の調製物を腹腔内投与した。各マウ
スに106破壊細胞/投与で投与した。
0での免疫化による、ビルレントPRVによる攻撃から
のマウスの保護を示す。攻撃の28日前、18日前およ
び7日前にマウスを免疫化した。第1投与できアジュバ
ントと共に調製物をマウスに皮下投与し、第2および第
3投与では食塩水中の調製物を腹腔内投与した。各マウ
スに106破壊細胞/投与で投与した。
【0061】
【表2】 免疫化剤/アジュバント 中和力価a %生存b gp50/CFA c 512 100(10/10) gp50/CFA(2投与) ND 80( 4/5) gp50/IFA d 1024 100( 9/10) gp50/食塩水 256 100( 3/3) CHO−レニンe/CFA <8 10( 1/10) 非処理 <8 0( 0/10) PR−Vac f 4096 90( 9/10) a 攻撃日におけるPRVに対する中和力価(+補体)b 肉趾経路によりPRVライス(Rice)株のLD50の3
0回分で攻撃した。c 完全フロイントアジュバントd 不完全フロイントアジュバントe レニンを発現する対照細胞f ノルデン・ラボラトリーズ(Norden Laboratories)、
リンカーン、ネブラスカ州、不活性化PRVワクチン、
陽性対照
0回分で攻撃した。c 完全フロイントアジュバントd 不完全フロイントアジュバントe レニンを発現する対照細胞f ノルデン・ラボラトリーズ(Norden Laboratories)、
リンカーン、ネブラスカ州、不活性化PRVワクチン、
陽性対照
【0062】表3はCHO細胞において産生したgp50
での免疫化による、ビルレントPRVによる攻撃からの
ブタの保護を示す。攻撃の21日前および7日前にブタ
を免疫化した。投与当たり2×107個の破壊細胞をブ
タに与えた。最初の投与量は完全にフロイントアジュバ
ントと混合し、一方第2の投与量は食塩水中に懸濁し
た。両投与量は筋肉内投与した。
での免疫化による、ビルレントPRVによる攻撃からの
ブタの保護を示す。攻撃の21日前および7日前にブタ
を免疫化した。投与当たり2×107個の破壊細胞をブ
タに与えた。最初の投与量は完全にフロイントアジュバ
ントと混合し、一方第2の投与量は食塩水中に懸濁し
た。両投与量は筋肉内投与した。
【0063】
【表3】 免疫化剤/アジュバント 幾何平均の力価a %生存b gp50/CFA 25 100 CHO−レニン/CFA <8 0 a 攻撃日におけるPRVに対する中和力価b 鼻腔内経路によってPRVライス(Rice)株1×105
pfu/ブタで攻撃した。
pfu/ブタで攻撃した。
【0064】gp50は抗体の中和をひき起こし、致命的
なPRV攻撃からマウスおよびブタを保護することがで
きることをこれらの3つの表は示す。
なPRV攻撃からマウスおよびブタを保護することがで
きることをこれらの3つの表は示す。
【0065】本発明のもう1つの態様において、発明者
らはgp50のC末端端部についてコード付けするDNA
を除去することによって糖蛋白質gp50の誘導体を得
た。得られたポリペプチドは細胞膜中にgp50を固定す
るのに必要なアミノ酸配列について欠失を有する。哺乳
動物細胞において発現された場合、このgp50誘導体は
培地中に分泌される。サブユニットワクチンとして用い
るためのこのgp50誘導体の培地からの精製は全細胞の
分画よりもかなり簡単である。膜蛋白質を分泌蛋白質に
変換するためのアンカー配列の除去は最初インフルエン
ザ赤血球凝集素遺伝子について示された(エム・ジェイ
・ゲシングおよびジェイ・サンブルック(M.-J.Gethin
g and J.Sambrook)、ネイチャー(Nature)、300、5
98〜603頁(1982))。
らはgp50のC末端端部についてコード付けするDNA
を除去することによって糖蛋白質gp50の誘導体を得
た。得られたポリペプチドは細胞膜中にgp50を固定す
るのに必要なアミノ酸配列について欠失を有する。哺乳
動物細胞において発現された場合、このgp50誘導体は
培地中に分泌される。サブユニットワクチンとして用い
るためのこのgp50誘導体の培地からの精製は全細胞の
分画よりもかなり簡単である。膜蛋白質を分泌蛋白質に
変換するためのアンカー配列の除去は最初インフルエン
ザ赤血球凝集素遺伝子について示された(エム・ジェイ
・ゲシングおよびジェイ・サンブルック(M.-J.Gethin
g and J.Sambrook)、ネイチャー(Nature)、300、5
98〜603頁(1982))。
【0066】以下、図24〜27を参照して、前記から
のプラスミドpDIE50をSalIおよびEcoRIで消
化する。5.0および0.7kbフラグメントを単離する。
gp50の一部をコード付けする0.7kbフラグメントを
Sau3Aで消化し、0.5kbSalI/Sau3A フラグ
メントを単離する。切断されたgp50遺伝子後方の停止
コードンを産生するには、以下のオリゴヌクレオチドを
合成する(配列番号4)。 5' GATCGTCGGCTAGTGAGTAGGTAGG 3' 3' CAGCCGATCACTCATCCATCCTTAA 5’
のプラスミドpDIE50をSalIおよびEcoRIで消
化する。5.0および0.7kbフラグメントを単離する。
gp50の一部をコード付けする0.7kbフラグメントを
Sau3Aで消化し、0.5kbSalI/Sau3A フラグ
メントを単離する。切断されたgp50遺伝子後方の停止
コードンを産生するには、以下のオリゴヌクレオチドを
合成する(配列番号4)。 5' GATCGTCGGCTAGTGAGTAGGTAGG 3' 3' CAGCCGATCACTCATCCATCCTTAA 5’
【0067】5.0kb EcoRI/SalIフラグメン
ト、0.5kb SalI/Sau3Aフラグメントおよびア
ニールしたオリゴヌクレオチドを結んでプラスミドpD
IE50Tを得る。EcoRIおよびSalIでの消化によ
り580bpフラグメントを得る。pDIE50TをEco
RIで切断し、6GH ポリA部位を含有する0.6kb
EcoRIフラグメント(フラグメント12)を中にクロ
ーンしてプラスミドpDIE50TPAを得る。ポリア
デニレーション信号が適当な配位である場合、pDIE
50TPAをBamHIおよびPvuIIで消化して970
bpフラグメントを得る。
ト、0.5kb SalI/Sau3Aフラグメントおよびア
ニールしたオリゴヌクレオチドを結んでプラスミドpD
IE50Tを得る。EcoRIおよびSalIでの消化によ
り580bpフラグメントを得る。pDIE50TをEco
RIで切断し、6GH ポリA部位を含有する0.6kb
EcoRIフラグメント(フラグメント12)を中にクロ
ーンしてプラスミドpDIE50TPAを得る。ポリア
デニレーション信号が適当な配位である場合、pDIE
50TPAをBamHIおよびPvuIIで消化して970
bpフラグメントを得る。
【0068】pDIE50TPAを用いてCHO dhfr-
細胞をトランスフェクトする。35S−メチオニンでの
ラベルおよび免疫沈降によって検知される如く、選択し
たdhfr+ CHO細胞はgp50の切断形を産生し、それ
を培地中へ分泌する。
細胞をトランスフェクトする。35S−メチオニンでの
ラベルおよび免疫沈降によって検知される如く、選択し
たdhfr+ CHO細胞はgp50の切断形を産生し、それ
を培地中へ分泌する。
【0069】実施例3 本実施例において、発明者らはgp63およびgI遺伝子
の単離、クローニングおよび配列決定を記載する。 1.ライブラリーの組立て 前記(ティ・ジェイ・リーら(T.J.Rea et al.)、前掲)
した如く、PRVゲノムDNAを調製した。各回ともに
ブランソン(Branson)200 超音波処理器を2に設定
し、PRVライス(Rice)株のPRVゲノムDNAを4
秒間で2回超音波処理することによって0.5〜3.0kb
のフラグメントを得た。T4DNA ポリメラーゼでフ
ラグメントを平滑末端とした後、該フラグメントをキナ
ーゼ処理したEcoRIリンカーに結んだ(ティ・マニア
ティスら(T.Maniatis et al.)、前掲)。EcoRIでの
過剰消化の後(PRV DNAはEcoRI部位を含有し
ないので、メチル化は不必要であった)。アガロースゲ
ル電気泳動によって過剰のリンカーを除去した。所望の
サイズ範囲にあるPRV DNAフラグメントをガラス
スラリー法によって溶出した(ビイ・ボゲルステインお
よびディ・ギレスピー(b.Vogelstein and D.Gillespi
e)、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ(Proc.Natl.Acad.Sci.)U
SA、76、615〜19頁(1979))。最終的に1
0μlの容量とした50mMトリス(pH7.4)、10mM
MgCl2、10mM ジチオスレイトール、1mMスペル
ミジン、1mM ATP、T4DNAリガーゼ400単
位(ニュー・イングランド・バイオラブズ(New England
Biolabs))中でPRV DNA フラグメント500ng
をEcoRIで消化したλgtII(アール・エイ・ヤング
およびアール・ダブリュー・デイビス(R.A.Young and
R.W.Davis)、前掲)DNAに結ぶことによって610
00λ/PRV組換体(λPRV)のライブラリーを組立
てた。パッカジーン(Packgene)抽出物(プロメガ・バイ
オテク(Promega Biotec)、マジソン、ウイスコンシン
州)を用いて、結んだDNAをバクテリオファージλウ
イルス粒子中に充填した。
の単離、クローニングおよび配列決定を記載する。 1.ライブラリーの組立て 前記(ティ・ジェイ・リーら(T.J.Rea et al.)、前掲)
した如く、PRVゲノムDNAを調製した。各回ともに
ブランソン(Branson)200 超音波処理器を2に設定
し、PRVライス(Rice)株のPRVゲノムDNAを4
秒間で2回超音波処理することによって0.5〜3.0kb
のフラグメントを得た。T4DNA ポリメラーゼでフ
ラグメントを平滑末端とした後、該フラグメントをキナ
ーゼ処理したEcoRIリンカーに結んだ(ティ・マニア
ティスら(T.Maniatis et al.)、前掲)。EcoRIでの
過剰消化の後(PRV DNAはEcoRI部位を含有し
ないので、メチル化は不必要であった)。アガロースゲ
ル電気泳動によって過剰のリンカーを除去した。所望の
サイズ範囲にあるPRV DNAフラグメントをガラス
スラリー法によって溶出した(ビイ・ボゲルステインお
よびディ・ギレスピー(b.Vogelstein and D.Gillespi
e)、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ(Proc.Natl.Acad.Sci.)U
SA、76、615〜19頁(1979))。最終的に1
0μlの容量とした50mMトリス(pH7.4)、10mM
MgCl2、10mM ジチオスレイトール、1mMスペル
ミジン、1mM ATP、T4DNAリガーゼ400単
位(ニュー・イングランド・バイオラブズ(New England
Biolabs))中でPRV DNA フラグメント500ng
をEcoRIで消化したλgtII(アール・エイ・ヤング
およびアール・ダブリュー・デイビス(R.A.Young and
R.W.Davis)、前掲)DNAに結ぶことによって610
00λ/PRV組換体(λPRV)のライブラリーを組立
てた。パッカジーン(Packgene)抽出物(プロメガ・バイ
オテク(Promega Biotec)、マジソン、ウイスコンシン
州)を用いて、結んだDNAをバクテリオファージλウ
イルス粒子中に充填した。
【0070】2.λPRVラリブラリーのスクリーニン
グ 前記(ジェイ・ジイ・ティミンズら(J.G.Timmins et a
l.)、前掲;アール・エイ・ヤングおよびアール・ダブリ
ュー・デイビス(R.A.Young and R.W.Davis)、前掲)
した如く、λPRV ライブラリーをスクリーニングし
た。20000ファージを150mm LB−アンピシリ
ンプレートを介してスクリーニングした。SDS−ポリ
アクリルアミドゲルから溶出したPRV感染細胞蛋白質
(ICP)のサイズにより分画した画分をマウスに注射す
ることによってスクリーニングした抗血清を生成した
(ジェイ・ジイ・ティミンズら(J.G.Timmins et a
l.)、前掲)。抗血清でのスクリーニングに際し陽性信号
を与えるプラークを滅菌したパスツールピペットでアガ
ールから取り、SM緩衝液(ティ・マニアティスら(T.M
aniatis et al.)、前掲)1ml中に再懸濁し、再度スクリ
ーニングした。プラークが陽性に反応することについて
均質になるまでスクリーニングをくり返した。
グ 前記(ジェイ・ジイ・ティミンズら(J.G.Timmins et a
l.)、前掲;アール・エイ・ヤングおよびアール・ダブリ
ュー・デイビス(R.A.Young and R.W.Davis)、前掲)
した如く、λPRV ライブラリーをスクリーニングし
た。20000ファージを150mm LB−アンピシリ
ンプレートを介してスクリーニングした。SDS−ポリ
アクリルアミドゲルから溶出したPRV感染細胞蛋白質
(ICP)のサイズにより分画した画分をマウスに注射す
ることによってスクリーニングした抗血清を生成した
(ジェイ・ジイ・ティミンズら(J.G.Timmins et a
l.)、前掲)。抗血清でのスクリーニングに際し陽性信号
を与えるプラークを滅菌したパスツールピペットでアガ
ールから取り、SM緩衝液(ティ・マニアティスら(T.M
aniatis et al.)、前掲)1ml中に再懸濁し、再度スクリ
ーニングした。プラークが陽性に反応することについて
均質になるまでスクリーニングをくり返した。
【0071】約43000λPRV組換体をマウス抗血
清でPRV感染ベロ(Vero)細胞蛋白質に対してスクリ
ーニングし、SDS−ポリアクリルアミドゲルから単離
した。60の陽性λPRVファージを単離した。
清でPRV感染ベロ(Vero)細胞蛋白質に対してスクリ
ーニングし、SDS−ポリアクリルアミドゲルから単離
した。60の陽性λPRVファージを単離した。
【0072】3.ファージ株の調製 プレート溶解物法(ティ・マニアティスら(T.Maniatis
et al.)、前掲)により高力価ファージ株(1010〜10
11pfu/ml)を調製した。単一の十分単離した陽性信号プ
ラークを選択し、SM1mlに再懸濁した。懸濁液100
μlを37℃で15分間、(アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション(American Type Culture Collectio
n)(ATCC)、ロックビル、メリーランド州から入手可
能な)イー・コリ(E.coli)Y1090 300μlに吸
着させ、LB−頂部のアガロース10mlで希釈し、15
0mmのLB−アンピシリンプレート上に一様に注ぎ、4
2℃にて一晩インキュベートした。頂部アガロースを火
炎処理したガラススライドで穏やかにかき取り、30ml
のコレックス(Corex)試験管に移した。SM8mlおよび
クロロホルム250μlを加え、混合し、37℃にて1
5分間インキュベートした。溶解物をHB−4ローター
中、10000rpmでの30分間の遠心分離によって精
製した。ファージ株を0.3%クロロホルムと共に4℃
にて保存した。
et al.)、前掲)により高力価ファージ株(1010〜10
11pfu/ml)を調製した。単一の十分単離した陽性信号プ
ラークを選択し、SM1mlに再懸濁した。懸濁液100
μlを37℃で15分間、(アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション(American Type Culture Collectio
n)(ATCC)、ロックビル、メリーランド州から入手可
能な)イー・コリ(E.coli)Y1090 300μlに吸
着させ、LB−頂部のアガロース10mlで希釈し、15
0mmのLB−アンピシリンプレート上に一様に注ぎ、4
2℃にて一晩インキュベートした。頂部アガロースを火
炎処理したガラススライドで穏やかにかき取り、30ml
のコレックス(Corex)試験管に移した。SM8mlおよび
クロロホルム250μlを加え、混合し、37℃にて1
5分間インキュベートした。溶解物をHB−4ローター
中、10000rpmでの30分間の遠心分離によって精
製した。ファージ株を0.3%クロロホルムと共に4℃
にて保存した。
【0073】4.融合蛋白質の調製および分析 LB培地(マニアティスら(Maniatis et al.)、前掲)を
イー・コリ(E.coli)K95(sup- 、λ- 、gal- 、s
trγ、nusA- ; ディ・フリードマン(D.Friedman)、
前掲)の新たに一晩培養した培養物で1:50にて接種
し、30℃においてOD550=0.5となるまで増殖し
た。培養物25mlをλPRVファージで5の多重度にて
感染し、42℃の振盪水浴中で25分間インキュベート
し、続いて2〜3時間で37℃まで移した。HB−4ロ
ーター中、5000rpmにて10分間細胞をペレット化
し、100mMトリス(pH7.8)、300mM NaClの
100μlに再懸濁した。等容量の2×SDS−PAG
E 試料緩衝液を加え、試料を10分間沸騰した。エル
・モースら(L.Morse et al.)、ジャーナル・オブ・バ
イロロジー(J.Virol.)、26、389〜410頁(19
78)に記載されている如く、分析用SDS−ポリアク
リルアミドゲル上の電気泳動によって試料各5μlを分
析した。マウスの注射用に、融合ポリペプチドの調製を
10倍にスケールアップした。ゲル片をコーマシーブル
ーで染色した後、β−ガラクトシダーゼ/PRV融合ポ
リペプチドを単離した(エル・モースら(L.Morse et
al.)、前掲;ケイ・ウェーバーおよびエム・オスボル
ン(K.Weber and M.Osborn)、ザ・プロテインズ(The P
roteins)、1、179〜223(1975))。分析用S
DS−PAGEによって融合ポリペプチド量を見積もっ
た。λPRV感染イー・コリ(E.coli)K95培養物か
らの細胞溶解物を9.25%SDS−ポリアクリルアミ
ドゲルで電気泳動に付した。λgtII−感染対照がない
分子量116000ダルトン以上の過剰産生ポリペプチ
ドバンドはβ−ガラクトシダーゼ−PRV融合ポリペプ
チドであった。β−ガラクトシダーゼ−PRV融合ポリ
ペプチドはサイズが129000〜158000ダルト
ンの範囲であった。融合ポリペプチド約50〜75μg
を完全フロイントアジュバント中に再懸濁し、マウスに
つき皮下および腹腔内注射した。後の注射は不完全フロ
イントアジュバント中で腹腔内に行った。
イー・コリ(E.coli)K95(sup- 、λ- 、gal- 、s
trγ、nusA- ; ディ・フリードマン(D.Friedman)、
前掲)の新たに一晩培養した培養物で1:50にて接種
し、30℃においてOD550=0.5となるまで増殖し
た。培養物25mlをλPRVファージで5の多重度にて
感染し、42℃の振盪水浴中で25分間インキュベート
し、続いて2〜3時間で37℃まで移した。HB−4ロ
ーター中、5000rpmにて10分間細胞をペレット化
し、100mMトリス(pH7.8)、300mM NaClの
100μlに再懸濁した。等容量の2×SDS−PAG
E 試料緩衝液を加え、試料を10分間沸騰した。エル
・モースら(L.Morse et al.)、ジャーナル・オブ・バ
イロロジー(J.Virol.)、26、389〜410頁(19
78)に記載されている如く、分析用SDS−ポリアク
リルアミドゲル上の電気泳動によって試料各5μlを分
析した。マウスの注射用に、融合ポリペプチドの調製を
10倍にスケールアップした。ゲル片をコーマシーブル
ーで染色した後、β−ガラクトシダーゼ/PRV融合ポ
リペプチドを単離した(エル・モースら(L.Morse et
al.)、前掲;ケイ・ウェーバーおよびエム・オスボル
ン(K.Weber and M.Osborn)、ザ・プロテインズ(The P
roteins)、1、179〜223(1975))。分析用S
DS−PAGEによって融合ポリペプチド量を見積もっ
た。λPRV感染イー・コリ(E.coli)K95培養物か
らの細胞溶解物を9.25%SDS−ポリアクリルアミ
ドゲルで電気泳動に付した。λgtII−感染対照がない
分子量116000ダルトン以上の過剰産生ポリペプチ
ドバンドはβ−ガラクトシダーゼ−PRV融合ポリペプ
チドであった。β−ガラクトシダーゼ−PRV融合ポリ
ペプチドはサイズが129000〜158000ダルト
ンの範囲であった。融合ポリペプチド約50〜75μg
を完全フロイントアジュバント中に再懸濁し、マウスに
つき皮下および腹腔内注射した。後の注射は不完全フロ
イントアジュバント中で腹腔内に行った。
【0074】5.抗血清分析 前記(ティ・ジェイ・リーら(T.J.Rea et al.)、前掲)
した如く、14C−グルコサミンICP、35S−メチオニ
ンICPおよび14C−グルコサミンgXの免疫沈降を行
った。これらの方法によりgp63およびgIがλgtII
組換体ファージ中に単離されたことが示された。発明者
らはこれらのファージをλ37およびλ36(gp63)お
よびλ23(gI)と命名した。
した如く、14C−グルコサミンICP、35S−メチオニ
ンICPおよび14C−グルコサミンgXの免疫沈降を行
った。これらの方法によりgp63およびgIがλgtII
組換体ファージ中に単離されたことが示された。発明者
らはこれらのファージをλ37およびλ36(gp63)お
よびλ23(gI)と命名した。
【0075】6.λDNAの小規模調製 平板培養溶解物からバクテリオファージを迅速に単離し
た(ティ・ジェイ・シルハビイら(T.J.Silhavy et a
l.)、エクスペリメンツ・ウイズ・ジーン・ヒュージョ
ンズ(Experiments With Gene Fusions)、(1984))。
5%および40%グリセロール段(SM緩衝液中で各3m
l)をSW41試験管中で重ねた。平板培養溶解物(〜6m
l)を重ね、4℃にて35000rpmで60分間遠心分離
した。上澄みを捨て、ファージペレットをSM1mlに再
懸濁した。DNアーゼIおよびRNアーゼAを加えて1
μg/mlおよび10μg/mlの最終濃度とした。37℃で
の30分間のインキュベーションの後、SDSミックス
(0.25M EDTA、0.5Mトリス(pH7.8)、
2.5%SDS)200μlおよびプロティナーゼK(〜
1mg/ml)を加え、68℃にて30分間インキュベート
した。λDNAをフェノールで3回抽出し、クロロホル
ムで抽出し、エタノールで沈澱させた。平均150mmの
平板培養溶解物からλDNA5〜10μgを得る。
た(ティ・ジェイ・シルハビイら(T.J.Silhavy et a
l.)、エクスペリメンツ・ウイズ・ジーン・ヒュージョ
ンズ(Experiments With Gene Fusions)、(1984))。
5%および40%グリセロール段(SM緩衝液中で各3m
l)をSW41試験管中で重ねた。平板培養溶解物(〜6m
l)を重ね、4℃にて35000rpmで60分間遠心分離
した。上澄みを捨て、ファージペレットをSM1mlに再
懸濁した。DNアーゼIおよびRNアーゼAを加えて1
μg/mlおよび10μg/mlの最終濃度とした。37℃で
の30分間のインキュベーションの後、SDSミックス
(0.25M EDTA、0.5Mトリス(pH7.8)、
2.5%SDS)200μlおよびプロティナーゼK(〜
1mg/ml)を加え、68℃にて30分間インキュベート
した。λDNAをフェノールで3回抽出し、クロロホル
ムで抽出し、エタノールで沈澱させた。平均150mmの
平板培養溶解物からλDNA5〜10μgを得る。
【0076】7.λPRV DNA分析 BamHIおよびKpnIでPRV DNAを完全に消化
し、0.8%アガロース中で電気泳動に付し、サザーン
(Southern)の方法によるニトロセルロースに移した(ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mo
l.Biol.)、98、503〜17(1975))。ブロッテ
ィング物を4mm片にスライスし、20〜25℃にて乾燥
状態で保存した。λPRV DNAに対してニックトラ
ンスレーション(アメルスハム(Amersham))を行って約1
08cpm/μgの特異的活性とする。6×SSC、30%
ホルムアミド、1×デンハルト(Denhardt)試薬(フィコ
ール(ficoll)、ポリビニルピロリドンおよびウシ血清ア
ルブミンの各0.02%)、0.1%SDS、50μg/ml
異種DNA中、プレ交雑を70℃にて1時間行った。同
一溶液中、交雑を70℃にて16時間行った。15分間
の洗浄を2×SSC、0.1%SDS中で2回、0.1×
SSCおよび0.1%SDS中で2回、すべて20〜2
0℃にて行った。ブロッティング物を〜70℃にて一晩
増感板上でオートラジオグラフィーに付した。
し、0.8%アガロース中で電気泳動に付し、サザーン
(Southern)の方法によるニトロセルロースに移した(ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mo
l.Biol.)、98、503〜17(1975))。ブロッテ
ィング物を4mm片にスライスし、20〜25℃にて乾燥
状態で保存した。λPRV DNAに対してニックトラ
ンスレーション(アメルスハム(Amersham))を行って約1
08cpm/μgの特異的活性とする。6×SSC、30%
ホルムアミド、1×デンハルト(Denhardt)試薬(フィコ
ール(ficoll)、ポリビニルピロリドンおよびウシ血清ア
ルブミンの各0.02%)、0.1%SDS、50μg/ml
異種DNA中、プレ交雑を70℃にて1時間行った。同
一溶液中、交雑を70℃にて16時間行った。15分間
の洗浄を2×SSC、0.1%SDS中で2回、0.1×
SSCおよび0.1%SDS中で2回、すべて20〜2
0℃にて行った。ブロッティング物を〜70℃にて一晩
増感板上でオートラジオグラフィーに付した。
【0077】サザーンブロッティング法によって、λ2
3、λ36およびλ37中に含有されたPRV糖蛋白質
遺伝子をユニークな小領域中のBamHI7フラグメント
に対してマップした(ティ・ジェイ・リーら(T.J.Rea
et al.)、前掲)。図1に示す如くこのフラグメントのよ
り精密なマッピングはλ23(gI)遺伝子に対して遠位
にマップされ、λ37がBamHI7の内部領域に対して
マップされたことを示した。
3、λ36およびλ37中に含有されたPRV糖蛋白質
遺伝子をユニークな小領域中のBamHI7フラグメント
に対してマップした(ティ・ジェイ・リーら(T.J.Rea
et al.)、前掲)。図1に示す如くこのフラグメントのよ
り精密なマッピングはλ23(gI)遺伝子に対して遠位
にマップされ、λ37がBamHI7の内部領域に対して
マップされたことを示した。
【0078】8.gp63およびgI遺伝子の配列決定 λ36およびλ37中のPRV DNAはStuI切断部
位を含有することが決定された。BamHI7フラグメン
ト中にはただ1つのStuI切断部位が存在する;従っ
て、StuI切断部位を包含したオープンリーディングフ
レームは配列された。図2〜5は各種制限酵素切断部位
がgp63遺伝子およびフランキング領域中に位置するこ
とを示す。BamHI7を継代クローンし、これらの制限
酵素で消化した。マクサムおよびギルバート(Maxam and
Gilbert)、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Method
s Enzymol.)、65、499〜560(1980)の方法
により、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて制限酵素に
よって生じた各末端をγ−32P−ATPでラベルし、配
列した。
位を含有することが決定された。BamHI7フラグメン
ト中にはただ1つのStuI切断部位が存在する;従っ
て、StuI切断部位を包含したオープンリーディングフ
レームは配列された。図2〜5は各種制限酵素切断部位
がgp63遺伝子およびフランキング領域中に位置するこ
とを示す。BamHI7を継代クローンし、これらの制限
酵素で消化した。マクサムおよびギルバート(Maxam and
Gilbert)、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Method
s Enzymol.)、65、499〜560(1980)の方法
により、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて制限酵素に
よって生じた各末端をγ−32P−ATPでラベルし、配
列した。
【0079】pUC1129から単離したBamHI17
フラグメントをクローンしてプラスミドpSV2 gptに
入れることによってプラスミドpPR28を得た(アール
・シイ・ムリガンおよびピイ・ベルグ(R.C.Mulligan
and P.Berg)、プロシーディングズ・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc.Natl.Aca
d.Sci.)USA、78、2072〜76(1981))。
フラグメントをクローンしてプラスミドpSV2 gptに
入れることによってプラスミドpPR28を得た(アール
・シイ・ムリガンおよびピイ・ベルグ(R.C.Mulligan
and P.Berg)、プロシーディングズ・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc.Natl.Aca
d.Sci.)USA、78、2072〜76(1981))。
【0080】PvuIIでpPR28を消化し次いでイー
・コリ(E.coli)複製開始点およびbla遺伝子を含有する
切断片を再環化してgIについてのDNA配列を含有す
る4.9kb PvuII/BamHI7 PRVフラグメン
トよりなるプラスミドを得ることによってプラスミドp
PR28−1を得た。
・コリ(E.coli)複製開始点およびbla遺伝子を含有する
切断片を再環化してgIについてのDNA配列を含有す
る4.9kb PvuII/BamHI7 PRVフラグメン
トよりなるプラスミドを得ることによってプラスミドp
PR28−1を得た。
【0081】図29はgI遺伝子およびフランキング領
域中に位置する各種制限酵素切断部位を示す。前記した
如くBamHI7を継代クローンし、消化し、ラベルし、
配列した。
域中に位置する各種制限酵素切断部位を示す。前記した
如くBamHI7を継代クローンし、消化し、ラベルし、
配列した。
【0082】糖蛋白質gp63およびgIについてのDN
A配列を各々配列表(配列番号2および3)に示す。こ
のDNAを用いてPRVに能動的に感染した動物を検知
することができる。例えば、鼻またはのどを綿棒で拭い
て試料採取し、次いで標準的なDNA/DNA交雑法に
よってPRVの存在を検知できる。
A配列を各々配列表(配列番号2および3)に示す。こ
のDNAを用いてPRVに能動的に感染した動物を検知
することができる。例えば、鼻またはのどを綿棒で拭い
て試料採取し、次いで標準的なDNA/DNA交雑法に
よってPRVの存在を検知できる。
【0083】実施例4 本実施例において、発明者らは哺乳動物におけるgIの
発現を記載する。プラスミドpPR28(前記参照)をBa
mHIで消化し、該フラグメントをアガロースゲル上で
分離し、次いでゲルから該フラグメントを切り取ること
によってgI遺伝子を含有するBamHI7フラグメント
を該プラスミドから単離する。
発現を記載する。プラスミドpPR28(前記参照)をBa
mHIで消化し、該フラグメントをアガロースゲル上で
分離し、次いでゲルから該フラグメントを切り取ること
によってgI遺伝子を含有するBamHI7フラグメント
を該プラスミドから単離する。
【0084】以下、図30〜33を参照して、次いで前
記で単離したBamHI7フラグメントをクローンして
(ファルマシア(Pharmacia)/PLから購入した)プラス
ミドpUC19中に入れてプラスミドAを得る。プラス
ミドAをDraIで消化する。DraIはpUC19配列を
いくつかの箇所で切断するが、gp63およびgI遺伝子
間のBamHI7配列においては一度だけしか切断せずに
(図1)なかんずくフラグメント1を得る。BamHIリン
カーをフラグメント1を包含するフラグメントのDraI
末端上に結び、得られたフラグメント混合物をBamHI
で消化する。アガロースゲル電気泳動によって産生物フ
ラグメントを分離し、gI遺伝子を含有する2.5kbフラ
グメント2を精製する。フラグメント2をクローンして
BamHIで消化したpUC19に入れてプラスミドpUC
D/Bを得る。かく産生した2のプラスミドのうち適当
な配位にあるgI遺伝子を含有するプラスミドをBsmI
およびEcoRIでプラスミドを消化することによって決
定する:該適当な配位にあるプラスミドは特徴的な75
0bpBsmI/EcoRIフラグメントを含有する。
記で単離したBamHI7フラグメントをクローンして
(ファルマシア(Pharmacia)/PLから購入した)プラス
ミドpUC19中に入れてプラスミドAを得る。プラス
ミドAをDraIで消化する。DraIはpUC19配列を
いくつかの箇所で切断するが、gp63およびgI遺伝子
間のBamHI7配列においては一度だけしか切断せずに
(図1)なかんずくフラグメント1を得る。BamHIリン
カーをフラグメント1を包含するフラグメントのDraI
末端上に結び、得られたフラグメント混合物をBamHI
で消化する。アガロースゲル電気泳動によって産生物フ
ラグメントを分離し、gI遺伝子を含有する2.5kbフラ
グメント2を精製する。フラグメント2をクローンして
BamHIで消化したpUC19に入れてプラスミドpUC
D/Bを得る。かく産生した2のプラスミドのうち適当
な配位にあるgI遺伝子を含有するプラスミドをBsmI
およびEcoRIでプラスミドを消化することによって決
定する:該適当な配位にあるプラスミドは特徴的な75
0bpBsmI/EcoRIフラグメントを含有する。
【0085】以下、図34〜39を参照して、プラスミ
ドpUCD/B(図30〜33)をBsmIおよびEcoRI
で消化し、より大きなフラグメント(フラグメント3、
4.4kb)をアガロースゲル電気泳動によって精製する。
以下の2種のオリゴヌクレオチドをよく知られた技術に
より化学的に合成するか、あるいはコマーシャル・カス
タム・シンセシス・サービス(Commercial custom synth
esis service)から購入する(配列番号5)。 5’ CGCCCCGCTTAAATACCGG
GAGAAG 3’ 5’ AATTCTTCTCCCGGTATTTAAG
CGGGGCGGG 3’
ドpUCD/B(図30〜33)をBsmIおよびEcoRI
で消化し、より大きなフラグメント(フラグメント3、
4.4kb)をアガロースゲル電気泳動によって精製する。
以下の2種のオリゴヌクレオチドをよく知られた技術に
より化学的に合成するか、あるいはコマーシャル・カス
タム・シンセシス・サービス(Commercial custom synth
esis service)から購入する(配列番号5)。 5’ CGCCCCGCTTAAATACCGG
GAGAAG 3’ 5’ AATTCTTCTCCCGGTATTTAAG
CGGGGCGGG 3’
【0086】これらのオリゴヌクレオチドをフラグメン
ト3に結んでBsmI切断によって欠失されたgI遺伝
子のC末端についてのコーディング配列を置き換える。
得られたプラスミドpGIはgIコーディング配列から上
流のBamHI切断部位およびgIコーディング配列から
下流のEcoRI切断部位を共に有するgI遺伝子の完全
なコーディング領域を含有する。
ト3に結んでBsmI切断によって欠失されたgI遺伝
子のC末端についてのコーディング配列を置き換える。
得られたプラスミドpGIはgIコーディング配列から上
流のBamHI切断部位およびgIコーディング配列から
下流のEcoRI切断部位を共に有するgI遺伝子の完全
なコーディング領域を含有する。
【0087】プラスミドpGIをEcoRIおよびBamH
Iで消化し、gI遺伝子よりなる1.8kbフラグメント
(フラグメント4)をアガロースゲル上で精製する。
Iで消化し、gI遺伝子よりなる1.8kbフラグメント
(フラグメント4)をアガロースゲル上で精製する。
【0088】プラスミドpSV2dhfr(前掲)をEcoRI
で切断し、次いでBamHIで切断してdhfr標識を含有す
る5.0kbフラグメント5を得、これをアガロースゲル
電気泳動により単離する。次いで、フラグメント4およ
び5を結んでジヒドロ葉酸還元酵素およびアンピシリン
耐性標識、SV40プロモータおよび複製開始点ならび
にgI遺伝子よりなるプラスミドpDGIを得る。
で切断し、次いでBamHIで切断してdhfr標識を含有す
る5.0kbフラグメント5を得、これをアガロースゲル
電気泳動により単離する。次いで、フラグメント4およ
び5を結んでジヒドロ葉酸還元酵素およびアンピシリン
耐性標識、SV40プロモータおよび複製開始点ならび
にgI遺伝子よりなるプラスミドpDGIを得る。
【0089】以下、図40〜49を参照して、ヒトサイ
トメガロウイルスタウネ(Towne)株からの即時型プロモ
ータをgI遺伝子より上流に加える。プラスミドpDGI
をBamHIで消化してフラグメント6を得る。ヒトサイ
トメガロウイルス(タウネ(Towme))即時型プロモータを
単離(前掲)してフラグメント7を得る。次いでフラグメ
ント6および7を結んでプラスミドpDIEGIdhfrを
得る。該プロモータが適当な配位にあることを確認する
ために該プラスミドをSacIおよびBstEII制限酵素
で消化する。約400bpのフラグメントの産生は適当な
配位を示す。
トメガロウイルスタウネ(Towne)株からの即時型プロモ
ータをgI遺伝子より上流に加える。プラスミドpDGI
をBamHIで消化してフラグメント6を得る。ヒトサイ
トメガロウイルス(タウネ(Towme))即時型プロモータを
単離(前掲)してフラグメント7を得る。次いでフラグメ
ント6および7を結んでプラスミドpDIEGIdhfrを
得る。該プロモータが適当な配位にあることを確認する
ために該プラスミドをSacIおよびBstEII制限酵素
で消化する。約400bpのフラグメントの産生は適当な
配位を示す。
【0090】ウシ成長ホルモンポリアデニレーション信
号を含有する0.6kb PvuII/EcoRIフラグメン
トをプラスミドpSVCOW7(前掲)から単離してフラ
グメント8を得る。フラグメント8をpUC9のSmaI
/EcoRI部位(前掲)と交差してクローンしてプラスミ
ドpCOWT1を得る。pCOWT1をSalIで切断し、
T4DNAポリメラーゼで処理し、EcoRIリンカーを
その上に結ぶ。次いで、かく産生したフラグメント混合
物をEcoRIで消化し、0.6kbフラグメントを単離す
る(フラグメント9)。フラグメント9をpUC19のEc
oRI部位にクローンしてプラスミドpCOWT1Eを得
る。pCOWT1EをEcoRIで消化してフラグメント
10(600bp)を得る。
号を含有する0.6kb PvuII/EcoRIフラグメン
トをプラスミドpSVCOW7(前掲)から単離してフラ
グメント8を得る。フラグメント8をpUC9のSmaI
/EcoRI部位(前掲)と交差してクローンしてプラスミ
ドpCOWT1を得る。pCOWT1をSalIで切断し、
T4DNAポリメラーゼで処理し、EcoRIリンカーを
その上に結ぶ。次いで、かく産生したフラグメント混合
物をEcoRIで消化し、0.6kbフラグメントを単離す
る(フラグメント9)。フラグメント9をpUC19のEc
oRI部位にクローンしてプラスミドpCOWT1Eを得
る。pCOWT1EをEcoRIで消化してフラグメント
10(600bp)を得る。
【0091】プラスミドpDIEGIdhfrをEcoRIで
消化し、bGHポリアデニレーション信号を含有するフ
ラグメント10で結んでプラスミドpDIEGIPAを
得る。gI遺伝子を適当な配位で有するプラスミドをBa
mHIおよびBstIIでの消化に際しての1400bpフ
ラグメントの産生によって証明する。
消化し、bGHポリアデニレーション信号を含有するフ
ラグメント10で結んでプラスミドpDIEGIPAを
得る。gI遺伝子を適当な配位で有するプラスミドをBa
mHIおよびBstIIでの消化に際しての1400bpフ
ラグメントの産生によって証明する。
【0092】得られたプラスミドをdhfr-チャイニーズ
ハムスター卵巣細胞にトランスフェクトして、dhfr+細
胞を選択してgIを発現する細胞系を得る(スブラマニら
(Subramani et al.)、モレキュラー・アンド・セリュラ
ー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.)、1、854〜6
4頁(1981))。メトトレキセートの濃度を次第に高
くする増殖で生き残るトランスフェクトした細胞のクロ
ーンを選択することによってgIの発現を増大させる(マ
ッコルミックら(McCormick et al.)、モレキュラー・
アンド・セリュラー・バイオロジー(Mol.Cell.Bio
l.)、4、166〜72頁(1984))。
ハムスター卵巣細胞にトランスフェクトして、dhfr+細
胞を選択してgIを発現する細胞系を得る(スブラマニら
(Subramani et al.)、モレキュラー・アンド・セリュラ
ー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.)、1、854〜6
4頁(1981))。メトトレキセートの濃度を次第に高
くする増殖で生き残るトランスフェクトした細胞のクロ
ーンを選択することによってgIの発現を増大させる(マ
ッコルミックら(McCormick et al.)、モレキュラー・
アンド・セリュラー・バイオロジー(Mol.Cell.Bio
l.)、4、166〜72頁(1984))。
【0093】実施例5 本実施例において、発明者らは哺乳動物細胞におけるgp
63の発現を記載する。PRV DNAのBamHI7フ
ラグメント(前掲)をpPRXh1[NRRL B−157
72]から単離し、gp63遺伝子のより多くのコピーを
配列しかつ産生するのに使用するために実施例1におけ
る如く、プラスミドpBR322のBamHI部位に継代
クローンする。
63の発現を記載する。PRV DNAのBamHI7フ
ラグメント(前掲)をpPRXh1[NRRL B−157
72]から単離し、gp63遺伝子のより多くのコピーを
配列しかつ産生するのに使用するために実施例1におけ
る如く、プラスミドpBR322のBamHI部位に継代
クローンする。
【0094】以下、図50〜55を参照して、BamHI
7をBstEIIで切断し、T4DNAポリメラーゼで末
端を処理し、次いでKpnIで切断することによってBam
HI7の内部から1.9kb BstEII/KpnIフラグ
メント(フラグメント1)を継代クローンする。フラグメ
ント1を単離し、(ファルマシア(Pharmacia)/PL、ピ
スカタウェイ、ニュージャージー州から購入した)pUC
19中のKpnIおよびSmaI部位間にクローンしてプラ
スミドpPR28−1BKを得る。
7をBstEIIで切断し、T4DNAポリメラーゼで末
端を処理し、次いでKpnIで切断することによってBam
HI7の内部から1.9kb BstEII/KpnIフラグ
メント(フラグメント1)を継代クローンする。フラグメ
ント1を単離し、(ファルマシア(Pharmacia)/PL、ピ
スカタウェイ、ニュージャージー州から購入した)pUC
19中のKpnIおよびSmaI部位間にクローンしてプラ
スミドpPR28−1BKを得る。
【0095】プラスミドpPR28−1BKをDraIと
MaeIIIで切断して1.1kbフラグメント2を得る。
DraI切断部位はgp63遺伝子のコーディング領域の外
部かつそのポリアデニレーション信号から下流にある。
MaeIII切断部位はgp63遺伝子のATG翻訳開始コ
ードンから下流の21塩基を切断する。gp63遺伝子か
ら除去したコーディング領域を置き換えるために、以下
の2種のオリゴヌクレオチドを化学的に合成するか、あ
るいはコマーシャル・カスタム・シンセシス・サービス
(commercial custom synthesis service)から購入する
(フラグメント4) (配列番号6): 5' GATCCGCAGTACCGGCGTCGATGATGATGGTGGCGCGCGAC 3' 3' GCGTCATGGCCGCAGCTACTACTACCACCGCGCGCTGCACTG 5'
MaeIIIで切断して1.1kbフラグメント2を得る。
DraI切断部位はgp63遺伝子のコーディング領域の外
部かつそのポリアデニレーション信号から下流にある。
MaeIII切断部位はgp63遺伝子のATG翻訳開始コ
ードンから下流の21塩基を切断する。gp63遺伝子か
ら除去したコーディング領域を置き換えるために、以下
の2種のオリゴヌクレオチドを化学的に合成するか、あ
るいはコマーシャル・カスタム・シンセシス・サービス
(commercial custom synthesis service)から購入する
(フラグメント4) (配列番号6): 5' GATCCGCAGTACCGGCGTCGATGATGATGGTGGCGCGCGAC 3' 3' GCGTCATGGCCGCAGCTACTACTACCACCGCGCGCTGCACTG 5'
【0096】プラスミドPSV2dhfr、前掲、をEcoR
Iで切断し、T4 DNAポリメラーゼで処理し、次い
でBamHIで切断し、より大きい(5.0kb)フラグメン
トを単離してdhfr標識を含有するフラグメント4を得
る。次いでフラグメント2、3および4を結んでプラス
ミドpGP63dhfrを得る。
Iで切断し、T4 DNAポリメラーゼで処理し、次い
でBamHIで切断し、より大きい(5.0kb)フラグメン
トを単離してdhfr標識を含有するフラグメント4を得
る。次いでフラグメント2、3および4を結んでプラス
ミドpGP63dhfrを得る。
【0097】以下、図56〜58を参照して、ヒトサイ
トメガロウイルスタウネ(Towne)株からの即時型プロモ
ータをgp63遺伝子より上流に加える。pGP63dhfr
をBamHIで消化し、細菌アルカリホスファターゼで処
理してフラグメント5を得る。ヒトサイトメガロウイル
ス(タウネ(Towne))即時型プロモータを含有する760
bp Sau3Aフラグメントを単離してフラグメント6を
得る。次いでこれらのフラグメントを結んでプラスミド
pIEGP63dhfrを得る。該プロモータが適当な配位
にあることを確認するために該プラスミドをSacIおよ
びPvuIIで消化し、150bpフラグメントを得る。
トメガロウイルスタウネ(Towne)株からの即時型プロモ
ータをgp63遺伝子より上流に加える。pGP63dhfr
をBamHIで消化し、細菌アルカリホスファターゼで処
理してフラグメント5を得る。ヒトサイトメガロウイル
ス(タウネ(Towne))即時型プロモータを含有する760
bp Sau3Aフラグメントを単離してフラグメント6を
得る。次いでこれらのフラグメントを結んでプラスミド
pIEGP63dhfrを得る。該プロモータが適当な配位
にあることを確認するために該プラスミドをSacIおよ
びPvuIIで消化し、150bpフラグメントを得る。
【0098】得られたプラスミドをdhfr-チャイニーズ
ハムスター卵巣細胞にトランスフェクトし、dhfr+細胞
を選択してgp63を発現する細胞系を得る。この系によ
るgp63の合成レベルは余りにも低くて発明者らが用い
る方法によっては検出できず、発明者らは後記する如く
ワクチニアウイルス中でポリペプチドを産生した。
ハムスター卵巣細胞にトランスフェクトし、dhfr+細胞
を選択してgp63を発現する細胞系を得る。この系によ
るgp63の合成レベルは余りにも低くて発明者らが用い
る方法によっては検出できず、発明者らは後記する如く
ワクチニアウイルス中でポリペプチドを産生した。
【0099】実施例6 本実施例において、発明者らはワクチニアウイルスにお
けるgp63の発現を記載する。用いる方法は前記したも
のの他の合成態様としてここに挙げる。実施例5に従っ
てフラグメント1、2、3および4を得る。
けるgp63の発現を記載する。用いる方法は前記したも
のの他の合成態様としてここに挙げる。実施例5に従っ
てフラグメント1、2、3および4を得る。
【0100】プラスミドpGS20(マケットら(Mackett
et al.)、ジャーナル・オブ・バイロロジー(J.Viro
l.)、49、857〜64頁(1984))をBamHIおよ
びSmaIで切断し、ゲル電気泳動によってより大きい
6.5kbフラグメントを単離する。フラグメント2、オ
リゴヌクレオチド、およびpGS20フラグメントを一
緒に結んでプラスミドpVV63を得る。このプラスミ
ドをワクチニアウイルスのWR株(ATCC VR−1
19)で感染したCV−1細胞(ATCC CCL70)
にトランスフェクトし、マケットら(Mackett et al.)、
ディ・エヌ・エイ・クローニング(DNA Cloning)、
巻II:ア・プラクティカル・アプローチ(A Practical
Approach)、ディ・エム・グローバー(D.M.Glover)
編、アイ・アール・エル・プレス(IRL Press)、オ
ックスフォード(1985)により記載された方法によっ
て、BUdR中の143細胞(ATCC CRL830
3)上でプレート化することによってチミジンキナーゼ
陰性組換体について選択する。14C−グルコサミンで感
染した蛋白質をラベルし、抗−gp63抗血清で免疫沈降
することによってアッセイを行う如く、得られたウイル
ス、ワクチニア−gp63は感染した細胞においてgp50
を発現する。
et al.)、ジャーナル・オブ・バイロロジー(J.Viro
l.)、49、857〜64頁(1984))をBamHIおよ
びSmaIで切断し、ゲル電気泳動によってより大きい
6.5kbフラグメントを単離する。フラグメント2、オ
リゴヌクレオチド、およびpGS20フラグメントを一
緒に結んでプラスミドpVV63を得る。このプラスミ
ドをワクチニアウイルスのWR株(ATCC VR−1
19)で感染したCV−1細胞(ATCC CCL70)
にトランスフェクトし、マケットら(Mackett et al.)、
ディ・エヌ・エイ・クローニング(DNA Cloning)、
巻II:ア・プラクティカル・アプローチ(A Practical
Approach)、ディ・エム・グローバー(D.M.Glover)
編、アイ・アール・エル・プレス(IRL Press)、オ
ックスフォード(1985)により記載された方法によっ
て、BUdR中の143細胞(ATCC CRL830
3)上でプレート化することによってチミジンキナーゼ
陰性組換体について選択する。14C−グルコサミンで感
染した蛋白質をラベルし、抗−gp63抗血清で免疫沈降
することによってアッセイを行う如く、得られたウイル
ス、ワクチニア−gp63は感染した細胞においてgp50
を発現する。
【0101】すべて前記したプラスミドpGIからのBa
mHI/EcoRIフラグメント、プラスミドpPR28−
1BKからのDraI/MaeIIIフラグメント、または
pBGP50−23からのBamHI/MaeIIIフラグ
メントはリーら(Rea et al.)、前掲に記載されている如
く、Ba131で処理し、(同時係属米国特許出願SN6
06307号に記載されている如く産生した)pTRZ4
中に挿入し、イー・コリ(E.coli)を形質転換するのに
用いることもできる。この方法により、gp50、gp63
およびgIはイー・コリ(E.coli)における融合蛋白質と
して得られる。
mHI/EcoRIフラグメント、プラスミドpPR28−
1BKからのDraI/MaeIIIフラグメント、または
pBGP50−23からのBamHI/MaeIIIフラグ
メントはリーら(Rea et al.)、前掲に記載されている如
く、Ba131で処理し、(同時係属米国特許出願SN6
06307号に記載されている如く産生した)pTRZ4
中に挿入し、イー・コリ(E.coli)を形質転換するのに
用いることもできる。この方法により、gp50、gp63
およびgIはイー・コリ(E.coli)における融合蛋白質と
して得られる。
【0102】また、前記実施例におけるpSV2dhfrの
代わりに例えば(アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション(American Type Culture Collection)から入
手可能な)pSV2neoをもいることによって、PRV糖
蛋白質遺伝子よりなる組換体プラスミドを形質転換して
他の宿主細胞に入れることができる。形質転換された細
胞はプラスミドによってコード付けされた抗生物質G4
18に対する耐性によって選択される。
代わりに例えば(アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション(American Type Culture Collection)から入
手可能な)pSV2neoをもいることによって、PRV糖
蛋白質遺伝子よりなる組換体プラスミドを形質転換して
他の宿主細胞に入れることができる。形質転換された細
胞はプラスミドによってコード付けされた抗生物質G4
18に対する耐性によって選択される。
【0103】また、本発明のポリペプチドを以下の如く
に昆虫細胞において発現することもできる:BamHIリ
ンカーをpD50のEcoRI部位上に置き次いでBamH
Iで消化することによって、またはBamHIリンカーを
pGP63dhfrのEcoRI部位上に置き次いでBamHI
で消化することによって、あるいはBamHIでPUCD
/Bを消化することによって、各々gp50、gp63また
はgI遺伝子を含有するBamHIフラグメントを得るこ
とができる。これらのBamHIフラグメントはpAC3
73中のポリヘドリンプロモータから下流のBamHIに
クローンすることができる(モレキュラー・アンド・セ
リュラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.)、5、28
60〜65頁(1985))。かく産生されたプラスミド
はバクロウイルスアウトグラファ・カリフォルニカ(Aut
ographa californica)からのDNAで共トランスフェ
クトしてSf9細胞に入れ、本明細書に記載した方法に
よって組換体ウイルスを単離できる。これらの組換体ウ
イルスはSf9細胞を感染するに際しgp50、gp63ま
たはgIを産生する。
に昆虫細胞において発現することもできる:BamHIリ
ンカーをpD50のEcoRI部位上に置き次いでBamH
Iで消化することによって、またはBamHIリンカーを
pGP63dhfrのEcoRI部位上に置き次いでBamHI
で消化することによって、あるいはBamHIでPUCD
/Bを消化することによって、各々gp50、gp63また
はgI遺伝子を含有するBamHIフラグメントを得るこ
とができる。これらのBamHIフラグメントはpAC3
73中のポリヘドリンプロモータから下流のBamHIに
クローンすることができる(モレキュラー・アンド・セ
リュラー・バイオロジー(Mol.Cell.Biol.)、5、28
60〜65頁(1985))。かく産生されたプラスミド
はバクロウイルスアウトグラファ・カリフォルニカ(Aut
ographa californica)からのDNAで共トランスフェ
クトしてSf9細胞に入れ、本明細書に記載した方法に
よって組換体ウイルスを単離できる。これらの組換体ウ
イルスはSf9細胞を感染するに際しgp50、gp63ま
たはgIを産生する。
【0104】本発明の糖蛋白質またはその免疫原フラグ
メントを利用して調製したワクチンは固定した宿主細
胞、宿主細胞抽出物、あるいは宿主細胞からのまたは化
学合成により生成した部分的にまたは完全に精製したP
RV糖蛋白質調製物から成ることができる。本発明に従
って調製したPRV糖蛋白質免疫原は、好ましくは、P
RVウイルスを含まない。かくして、本発明のワクチン
免疫原はPRV抗原性を示す実質的にすべての所望の免
疫原PRVポリペプチドおよび/または他のポリペプチ
ドよりなる。
メントを利用して調製したワクチンは固定した宿主細
胞、宿主細胞抽出物、あるいは宿主細胞からのまたは化
学合成により生成した部分的にまたは完全に精製したP
RV糖蛋白質調製物から成ることができる。本発明に従
って調製したPRV糖蛋白質免疫原は、好ましくは、P
RVウイルスを含まない。かくして、本発明のワクチン
免疫原はPRV抗原性を示す実質的にすべての所望の免
疫原PRVポリペプチドおよび/または他のポリペプチ
ドよりなる。
【0105】免疫原はよく知られた方法によりワクチン
投与形態に調製できる。該ワクチンは筋肉内、皮下また
は鼻腔内投与できる。筋肉内注射の如き非経口投与に
は、免疫原は適当な担体と組み合すことができ、例えば
水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミ
ニウムカリウム(alum)、硫酸ベリリウム、シリカ、カロ
リン、カーボン、油中水型エマルジョン、水中油型エマ
ルジョン、ムラミルジペプチド、細菌内毒素、脂質X、
コリネバクテリウム・パルバム(Corynebacteriumparvu
m)(プロピオノバクテリウム・アクネス(Propionobacter
ium acnes))、ボルデテラ・ペルトゥスシス(Bordetell
a pertussis)、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナ
トリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンA、サポ
ニン、リポソーム、レバミソール、DEAE−デキスト
ラン、ブロック共重合体もしくは他の合成アジュバント
を包含する各種アジュバントまたは免疫調整剤と共にま
たはそれなしで水、食塩水または緩衝ビヒクルに入れて
投与できる。かかるアジュバントは各種供給源、例えば
メルクアジュバント(Merk Adjuvant)65(メルク・アン
ド・カンパニー・インコーポレイティッド(Merk and Co
mpany、Inc.)、ラーウェイ(Rahway)、ニュージャージー
州)より商業的に入手可能である。もう1つの適当なア
ジュバントはフロイントの不完全アジュバント(ディフ
コ・ラボラトリーズ(Difco Laboratories)、デトロイ
ト、ミシガン州)である。
投与形態に調製できる。該ワクチンは筋肉内、皮下また
は鼻腔内投与できる。筋肉内注射の如き非経口投与に
は、免疫原は適当な担体と組み合すことができ、例えば
水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミ
ニウムカリウム(alum)、硫酸ベリリウム、シリカ、カロ
リン、カーボン、油中水型エマルジョン、水中油型エマ
ルジョン、ムラミルジペプチド、細菌内毒素、脂質X、
コリネバクテリウム・パルバム(Corynebacteriumparvu
m)(プロピオノバクテリウム・アクネス(Propionobacter
ium acnes))、ボルデテラ・ペルトゥスシス(Bordetell
a pertussis)、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナ
トリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンA、サポ
ニン、リポソーム、レバミソール、DEAE−デキスト
ラン、ブロック共重合体もしくは他の合成アジュバント
を包含する各種アジュバントまたは免疫調整剤と共にま
たはそれなしで水、食塩水または緩衝ビヒクルに入れて
投与できる。かかるアジュバントは各種供給源、例えば
メルクアジュバント(Merk Adjuvant)65(メルク・アン
ド・カンパニー・インコーポレイティッド(Merk and Co
mpany、Inc.)、ラーウェイ(Rahway)、ニュージャージー
州)より商業的に入手可能である。もう1つの適当なア
ジュバントはフロイントの不完全アジュバント(ディフ
コ・ラボラトリーズ(Difco Laboratories)、デトロイ
ト、ミシガン州)である。
【0106】免疫原およびアジュバントの割合は双方が
有効量で存在する限り、広範囲にわたって変化させるこ
とができる。例えば、水酸化アルミニウムはワクチン混
合物の約0.5%の量で存在させることができる(Al2
O3ベース)。投与量ベース当たりについては、免疫原の
濃度はブタ当たり約1.0μg〜約100mgの範囲とする
ことができる。好ましい範囲はブタ当たり約100μg
〜約3.0mgである。適当な投与量容量は約1〜10m
l、好ましくは約1.0mlである。従って、筋肉内注射用
の投与量は、例えば0.5%水酸化アルミニウムとの混
合物中に免疫原1.0mgを含有する1mlよりなる。匹敵
する投与形態は幼少のブタに対する非経口投与用にも調
製できるが、免疫原の量は例えば投与量当たり約0.2
5〜約1.0mgとより少なくなる。
有効量で存在する限り、広範囲にわたって変化させるこ
とができる。例えば、水酸化アルミニウムはワクチン混
合物の約0.5%の量で存在させることができる(Al2
O3ベース)。投与量ベース当たりについては、免疫原の
濃度はブタ当たり約1.0μg〜約100mgの範囲とする
ことができる。好ましい範囲はブタ当たり約100μg
〜約3.0mgである。適当な投与量容量は約1〜10m
l、好ましくは約1.0mlである。従って、筋肉内注射用
の投与量は、例えば0.5%水酸化アルミニウムとの混
合物中に免疫原1.0mgを含有する1mlよりなる。匹敵
する投与形態は幼少のブタに対する非経口投与用にも調
製できるが、免疫原の量は例えば投与量当たり約0.2
5〜約1.0mgとより少なくなる。
【0107】雌ブタのワクチン接種については、二投与
量法を用いることができる。第1の投与量は分娩の約数
カ月前から約5〜7週間前に投与することができる。次
いで、ワクチンの第2の投与量は第1の投与の数週間
後、例えば約2〜4週間後に投与すべきであり、次いで
分娩までであって分娩前にワクチンを投与できる。別法
として、ワクチンは単一の2mlの投与量として、例えば
分娩の約5〜7週間前に投与することができる。しかし
ながら、幼少ブタの最も効果的な免疫化には二投与法が
好ましいと考えられる。半年ごとの再ワクチン接種が動
物を飼育するのに対して推薦される。雄ブタはいつ再ワ
クチン接種してもよい。また、雌ブタは飼育前に再ワク
チン接種することもできる。ワクチン接種していない雌
ブタから生まれた子ブタは約3〜10日に、その後再び
4〜6カ月におよび毎年、あるいは好ましくは半年ごと
にワクチン接種できる。
量法を用いることができる。第1の投与量は分娩の約数
カ月前から約5〜7週間前に投与することができる。次
いで、ワクチンの第2の投与量は第1の投与の数週間
後、例えば約2〜4週間後に投与すべきであり、次いで
分娩までであって分娩前にワクチンを投与できる。別法
として、ワクチンは単一の2mlの投与量として、例えば
分娩の約5〜7週間前に投与することができる。しかし
ながら、幼少ブタの最も効果的な免疫化には二投与法が
好ましいと考えられる。半年ごとの再ワクチン接種が動
物を飼育するのに対して推薦される。雄ブタはいつ再ワ
クチン接種してもよい。また、雌ブタは飼育前に再ワク
チン接種することもできる。ワクチン接種していない雌
ブタから生まれた子ブタは約3〜10日に、その後再び
4〜6カ月におよび毎年、あるいは好ましくは半年ごと
にワクチン接種できる。
【0108】また、該ワクチンを他の病気についての他
のワクチンと組合せて多価ワクチンを得ることもでき
る。また、他の薬剤、例えば抗生物質と組合すこともで
きる。ワクチンの医薬的有効量を医薬上許容される担体
または希釈剤と共に用いてブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、
および他の動物の如き動物をワクチン接種できる。
のワクチンと組合せて多価ワクチンを得ることもでき
る。また、他の薬剤、例えば抗生物質と組合すこともで
きる。ワクチンの医薬的有効量を医薬上許容される担体
または希釈剤と共に用いてブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、
および他の動物の如き動物をワクチン接種できる。
【0109】例えばアイ・ティザード(I.Tizard)、ア
ン・イントラダクション・トゥ・ベテリナリ・イミュノ
ロジー(An Introduction to Veterinary Immunology)、
第2版(1982)に記載されている如く、当業者によく
知られた方法により他のワクチンを調製することがで
き、ここに参照のために挙げる。
ン・イントラダクション・トゥ・ベテリナリ・イミュノ
ロジー(An Introduction to Veterinary Immunology)、
第2版(1982)に記載されている如く、当業者によく
知られた方法により他のワクチンを調製することがで
き、ここに参照のために挙げる。
【0110】前記した如く、市販のワクチンPRVはg
Iおよびgp63遺伝子が欠失していることが判明してい
る。従って、本発明の方法により産生したgIおよびgp
63ポリペプチドを診断剤として用いてこれらの市販ワ
クチンを接種した動物とビルレントウイルスに感染した
動物とを識別することができる。
Iおよびgp63遺伝子が欠失していることが判明してい
る。従って、本発明の方法により産生したgIおよびgp
63ポリペプチドを診断剤として用いてこれらの市販ワ
クチンを接種した動物とビルレントウイルスに感染した
動物とを識別することができる。
【0111】感染動物とワクチン接種動物とを区別する
には、例えばエライサアッセイを用いることができる。
例えば組換体DNA法(リーら(Rea et al.)、前掲)によ
りイー・コリ(E.coli)中で産生したgIまたはgp63蛋
白質を適当なプラスチック製プレートのウエルに加え、
十分な時間を与えてプラスチックに吸着させる(例え
ば、一晩、20〜25℃)。プレートを洗浄し、ブロッ
キング剤(例えば、BSA)を加えてプラスチック表面上
のいずれの未反応部位も中和する。続いて洗浄し、次い
でブタ血清をウエルに加える。20〜25℃における1
時間のインキュベーションの後、ウエルを洗浄し、蛋白
質A−セイヨウワサビペルオキシダーゼ配合体を25〜
25℃における約1時間のインキュベーションの間の各
ウエルに加える。さらに洗浄し、酵素基質(O−フェニ
レンジアミン)をウエルに加え、酸で反応を停止する。
492ナノメータにて吸光度を測定して血清中に存在す
るgIもしくはgp63抗体を定量する。gIおよびgp63
を欠くことは動物が感染していないことを示す。他のP
RV抗原についてテストすることによって、与えられた
動物がワクチン接種を受けたか否かを決定することがで
きる。
には、例えばエライサアッセイを用いることができる。
例えば組換体DNA法(リーら(Rea et al.)、前掲)によ
りイー・コリ(E.coli)中で産生したgIまたはgp63蛋
白質を適当なプラスチック製プレートのウエルに加え、
十分な時間を与えてプラスチックに吸着させる(例え
ば、一晩、20〜25℃)。プレートを洗浄し、ブロッ
キング剤(例えば、BSA)を加えてプラスチック表面上
のいずれの未反応部位も中和する。続いて洗浄し、次い
でブタ血清をウエルに加える。20〜25℃における1
時間のインキュベーションの後、ウエルを洗浄し、蛋白
質A−セイヨウワサビペルオキシダーゼ配合体を25〜
25℃における約1時間のインキュベーションの間の各
ウエルに加える。さらに洗浄し、酵素基質(O−フェニ
レンジアミン)をウエルに加え、酸で反応を停止する。
492ナノメータにて吸光度を測定して血清中に存在す
るgIもしくはgp63抗体を定量する。gIおよびgp63
を欠くことは動物が感染していないことを示す。他のP
RV抗原についてテストすることによって、与えられた
動物がワクチン接種を受けたか否かを決定することがで
きる。
【0112】
【発明の効果】本発明により提供されるPRV糖蛋白質
のいくつかはPRV感染についての特殊症状をつくりだ
すのに有用であり、また、PRVに対するワクチンを生
産するのに有用である。
のいくつかはPRV感染についての特殊症状をつくりだ
すのに有用であり、また、PRVに対するワクチンを生
産するのに有用である。
【0113】
【0114】配列番号:1 配列の長さ:1209 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:DNA 配列: ATG CTG CTC GCA GCG CTA TTG GCG GCG CTG GTC GCC CGG ACG ACG CTC 48 Met Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Leu Val Ala Arg Thr Thr Leu 1 5 10 15 GGT GCG GAC GTG GAC GCC GTG CCC GCG CCG ACC TTC CCC CCG CCC GCG 96 Gly Ala Asp Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Thr Phe Pro Pro Pro Ala 20 25 30 TAC CCG TAC ACC GAG TCG TGG CAG CTG ACG CTG ACG ACG GTC CCC TCG 144 Tyr Pro Tyr Thr Glu Ser Trp Gln Leu Thr Leu Thr Thr Val Pro Ser 35 40 45 CCC TTC GTC GGC CCC GCG GAC GTC TAC CAC ACG CGC CCG CTG GAG GAC 192 Pro Phe Val Gly Pro Ala Asp Val Tyr His Thr Arg Pro Leu Glu Asp 50 55 60 CCG TGC GCG GTG GTG GCG CTG ATC TCC GAC CCG CAG GTG GAC CGG CTG 240 Pro Cys Gly Val Val Ala Leu Ile Ser Asp Pro Gln Val Asp Arg Leu 65 70 75 80 CTG AAC GAG GCG GTG GCC CAC CGG CGG CCC ACG TAC CGC GCC CAC GTG 288 Leu Asn Glu Ala Val Ala His Arg Arg Pro Thr Tyr Arg Ala His Val 85 90 95 GCC TGG TAC CGC ATC GCG GAC GGG TGC GCA CAC CTG CTG TAC TTT ATC 336 Ala Trp Tyr Arg Ile Ala Asp Gly Cys Ala His Leu Leu Tyr Phe Ile 100 105 110 GAG TAC GCC GAC TGC GAC CCC AGG CAG GTC TTT GGG CGC TGC CGG CGC 384 Glu Tyr Ala Asp Cys Asp Pro Arg Gln Val Phe Gly Arg Cys Arg Arg 115 120 125 CGC ACC ACG CCG ATG TGG TGG ACC CCG TCC GCG GAC TAC ATG TTC CCC 432 Arg Thr Thr Pro Met Trp Trp Thr Pro Ser Ala Asp Tyr Met Phe Pro 130 135 140 ACG GAG GAC GAG CTG GGG CTG CTC ATG GTG GCC CCG GGG CGG TTC AAC 480 Thr Glu Asp Glu Leu Gly Leu Leu Met Val Ala Pro Gly Arg Phe Asn 145 150 155 160 GAG GGC CAG TAC CGG CGC CTG GTG TCC GTC GAC GGC GTG AAC ATC CTC 528 Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Leu Val Ser Val Asp Gly Val Asn Ile Leu 165 170 175 ACC GAC TTC ATG GTG GCG CTC CCC GAG GGG CAA GAG TGC CCG TTC GCC 576 Thr Asp Phe Met Val Ala Leu Pro Glu Gly Gln Glu Cys Pro Phe Ala 180 185 190 CGC GTG GAC CAG CAC CGC ACG TAC AAG TTC GGC GCG TGC TGG AGC GAC 624 Arg Val Asp Gln His Arg Thr Tyr Lys Phe Gly Ala Cys Trp Ser Asp 195 200 205 GAC AGC TTC AAG CGG GGC GTG GAC GTG ATG CGA TTC CTG ACG CCG TTC 672 Asp Ser Phe Lys Arg Gly Val Asp Val Met Arg Phe Leu Thr Pro Phe 210 215 220 TAC CAG CAG CCC CCG CAC CGG GAG GTG GTG AAC TAC TGG TAG CGC AAG 720 Tyr Gln Gln Pro Pro His Arg Glu Val Val Asn Tyr Trp Tyr Arg Lys 225 230 235 240 AAC GGC CGG ACG CTC CCG CGG GCC CAC GCC GCC GCC ACG CCG TAC GCC 768 Asn Gly Arg Thr Leu Pro Arg Ala His Ala Ala Ala Thr Pro Tyr Ala 245 250 255 ATC GAC CCC GCG CGG CCC TCG GCG GGC TCG CCG AGG CCC CGG CCC CGG 816 Ile Asp Pro Ala Arg Pro Ser Ala Gly Ser Pro Arg Pro Arg Pro Arg 260 265 270 CCC CGG CCC CGG CCC CGG CCG AAG CCC GAG CCC GCC CCG GCG ACG CCC 864 Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Lys Pro Glu Pro Ala Pro Ala Thr Pro 275 280 285 GCG CCC CCC GAC CGC CTG CCC GAG CCG GCG ACG CGG GAC CAC GCC GCC 912 Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Pro Ala Thr Arg Asp His Ala Ala 290 295 300 GGG GGC CGC CCC ACG CCG CGA CCC CCG AGG CCC GAG ACG CCG CAC CGC 960 Gly Gly Arg Pro Thr Pro Arg Pro Pro Arg Pro Glu Thr Pro His Arg 305 310 315 320 CCC TTC GCC CCG CCG GCC GTC GTG CCC AGC GGG TGG CCG CAG CCC GCG 1008 Pro Phe Ala Pro Pro Ala Val Val Pro Ser Gly Trp Pro Gln Pro Ala 325 330 335 GAG CCG TTC CAG CCG CGG ACC CCC GCC GCG CCG GGC GTC TCG CGC CAC 1056 Glu Pro Phe Gln Pro Arg Thr Pro Ala Ala Pro Gly Val Ser Arg His 340 345 350 CGC TCG GTG ATC GTC GGC ACG GGC ACC GCG ATG GGC GCG CTC CTG GTG 1104 Arg Ser Val Ile Val Gly Thr Gly Thr Ala Met Gly Ala Leu Leu Val 355 360 365 GGC GTG TGC GTC TAC ATC TTC TTC CGC CTG AGG GGG GCG AAG GGG TAT 1152 Gly Val Cys Val Tyr Ile Phe Phe Arg Leu Arg Gly Ala Lys Gly Tyr 370 375 380 CGC CTC CTG GGC GGT CCC GCG GAC GCC GAC GAG CTA AAA GCG CAG CCC 1200 Arg Leu Leu Gly Gly Pro Ala Asp Ala Asp Glu Leu Lys Ala Gln Pro 385 390 395 400 GGT CCG TAG Gly Pro
【0115】配列番号:2 配列の長さ:1053 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:DNA 配列: ATG ATG ATG GTG GCG CGC GAC GTG ACC CGG CTC CCC GCG GGG CTC CTC 48 Met Met Met Val Ala Arg Asp Val Thr Arg Leu Pro Ala Gly Leu Leu 1 5 10 15 CTC GCC GCC CTG ACC CTG GCC GCC CTG ACC CCG CGC GTC GGG GGC GTC 96 Leu Ala Ala Leu Thr Leu Ala Ala Leu Thr Pro Arg Val Gly Gly Val 20 25 30 CTC TTC AGG GGC GCC GGC GTC AGC GTG CAC GTC GCC GGG AGC GCC GTC 144 Leu Phe Arg Gly Ala Aly Val Ser Val His Val Ala Gly Ser Ala Val 35 40 45 CTC GTG CCC GGC GAC GCG CCC AAC CTG ACG ATC GAC GGG ACG CTG CTG 192 Leu Val Pro Gly Asp Ala Pro Asn Leu Thr Ile Asp Gly Thr Leu Leu 50 55 60 TTT CTG GAG GGG CCC TCG CCG AGC AAC TAC AGC GGG CGC GTG GAG CTG 240 Phe Leu Glu Gly Pro Ser Pro Ser Asn Tyr Ser Gly Arg Val Glu Leu 65 70 75 80 CTG CGC CTC GAC CCC AAG CGC GCC TGC TAC ACG CGC GAG TAC GCC GCC 288 Leu Arg Leu Asp Pro Lys Arg Ala Cys Tyr Thr Arg Glu Tyr Ala Ala 85 90 95 GAG TAC GAC CTC TGC CCC CGC GTG CAC CAC GAG GCC TTC CGC GGC TGT 336 Glu Tyr Asp Leu Cys Pro Arg Val His His Glu Ala Phe Arg Gly Cys 100 105 110 CTG CGC AAG CGC GAG CCG CTC GCC CGG CGC GCG TCC GCC GCG GTG GAG 384 Leu Arg Lys Arg Glu Pro Leu Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Val Glu 115 120 125 GCG CGC CGG CTG CTG TTC GTC TCG CGC CCG GCC CCG CCG GAC GCG GGG 432 Ala Arg Arg Leu Leu Phe Val Ser Arg Pro Ala Pro Pro Asp Ala Gly 130 135 140 TCG TAC GTG CTG CGG GTC CGC GTG AAC GGG ACC ACG GAC CTC TTT GTG 480 Ser Tyr Val Leu Arg Val Arg Val Asn Gly Thr Thr Asp Leu Phe Val 145 150 155 160 CTG ACG GCC CTG GTG CCG CCC AGG GGG CGC CCC CAC CAC CCC ACG CCG 528 Leu Thr Ala Leu Val Pro Pro Arg Gly Arg Pro His His Pro Thr Pro 165 170 175 TCG TCC GCG GAC GAG TGC CGG CCT GTC GTC GGA TCG TGG CAC GAC AGC 576 Ser Ser Ala Asp Glu Cys Arg Pro Val Val Gly Ser Trp His Asp Ser 180 185 190 CTG CGC GTC GTG GAC CCC GCC GAG GAC GCC GTG TTC ACC ACG CCG CCC 624 Leu Arg Val Val Asp Pro Ala Glu Asp Ala Val Phe Thr Thr Pro Pro 195 200 205 CCG ATC GAG CCA GAG CCG CCG ACG ACC CCC GCG CCC CCC CGG GGG ACC 672 Pro Ile Glu Pro Glu Pro Pro Thr Thr Pro Ala Pro Pro Arg Gly Thr 210 215 220 GGC GCC ACC CCC GAG CCC CGC TCC GAC GAA GAG GAG GAG GAC GAG GAG 720 Gly Ala Thr Pro Glu Pro Arg Ser Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu 225 230 235 240 GGG GCG ACG ACG GCG ATG ACC CCG GTG CCC GGG ACC CTG GAC GCG AAC 768 Gly Ala Thr Thr Ala Met Thr Pro Val Pro Gly Thr Leu Asp Ala Asn 245 250 255 GGC ACG ATG GTG CTG AAC GCC AGC GTC GTG TCG CGC GTC CTG CTC GCC 816 Gly Thr Met Val Leu Asn Ala Ser Val Val Ser Arg Val Leu Leu Ala 260 265 270 GCC GCC AAC GCC ACG GCG GGC GCC CGG GGC CCC GGG AAG ATA GCC ATG 864 Ala Ala Asn Ala Thr Ala Gly Ala Arg Gly Pro Gly Lys Ile Ala Met 275 280 285 GTG CTG GGG CCC ACG ATC GTC GTC CTC CTG ATC TTC TTG GGC GGG GTC 912 Val Leu Gly Pro Thr Ile Val Val Leu Leu Ile Phe Leu Gly Gly Val 290 295 300 GCC TGC GCG GCC CGG CGC TGC GCG CGC GGA ATC GCA TCT ACC GGC CGC 960 Ala Cys Ala Ala Arg Arg Cys Ala Arg Gly Ile Ala Ser Thr Gly Arg 305 310 315 320 GAC CCG GGC GCG GCC CGG CGG TCC ACG CGC CGC CCC CGC GGC GCC CGC 1008 Asp Pro Gly Ala Ala Arg Arg Ser Thr Arg Arg Pro Arg Gly Ala Arg 325 330 335 CCC CCA ACC CCG TCG CCG GGG CGC CCG TCC CCC AGC CCA AGA TGA Pro Pro Thr Pro Ser Pro Gly Arg Pro Ser Pro Ser Pro Arg 340 345 350
【0116】配列番号:3 配列の長さ:1734 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:DNA 配列: ATG CGG CCC TTT CTG CTG CGC GCC GCG CAG CTC CTG GCG CTG CTG GCC 48 Met Arg Pro Phe Leu Leu Arg Ala Ala Gln Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 CTG GCG CTC TCC ACC GAG GCC CCG AGC CTC TCC GCC GAG ACG ACC CCG 96 Leu Ala Leu Ser Thr Glu Ala Pro Ser Leu Ser Ala Glu Thr Thr Pro 20 25 30 GGC CCC GTC ACC GAG GTC CCG AGT CCC TCG GCC GAG GTC TGG GAC CTC 144 Gly Pro Val Thr Glu Val Pro Ser Pro Ser Ala Glu Val Trp Asp Leu 35 40 45 TCC ACC GAG GCC GGC GAC GAT GAC CTC GAC GGC GAC CTC AAC GGC GAC 192 Ser Thr Glu Ala Gly Asp Asp Asp Leu Asp Gly Asp Leu Asn Gly Asp 50 55 60 GAC CGC CGC GCG GGC TTC GGC TCG GCC CTC GCC TCC CTG AGG GAG GCA 240 Asp Arg Arg Ala Gly Phe Gly Ser Ala Leu Ala Ser Leu Arg Glu Ala 65 70 75 80 CCC CCG GCC CAT CTG GTG AAC GTG TCC GAG GGC GCC AAC TTC ACC CTC 288 Pro Pro Ala His Leu Val Asn Val Ser Glu Gly Ala Asn Phe Thr Leu 85 90 95 GAC GCG CGC GGC GAC GGC GCC GTG GTG GCC GGG ATC TGG ACG TTC CTG 336 Asp Ala Arg Gly Asp Gly Ala Val Val Ala Gly Ile Trp Thr Phe Leu 100 105 110 CCC GTC CGC GGC TGC GAC GCC GTG GCG GTG ACC ATG GTG TGC TTC GAG 384 Pro Val Arg Gly Cys Asp Ala Val Ala Val Thr Met Val Cys Phe Glu 115 120 125 ACC GCC TGC CAC CCG GAC CTG GTG CTG GGC CGC GCC TGC GTC CCC GAG 432 Thr Ala Cys His Pro Asp Leu Val Leu Gly Arg Ala Cys Val Pro Glu 130 135 140 GCC CCG GAG CGG GGC ATC GGC GAC TAC CTG CCG CCC GAG GTG CCG CGG 480 Ala Pro Glu Arg Gly Ile Gly Asp Tyr Leu Pro Pro Glu Val Pro Arg 145 150 155 160 CTC CAG CGC GAG CCG CCC ATC GTC ACC CCG GAG CGG TGG TCG CCG CAC 528 Leu Gln Arg Glu Pro Pro Ile Val Thr Pro Glu Arg Trp Ser Pro His 165 170 175 CTG ACC GTC CGG CGG GCC ACG CCC AAC GAC ACG GGC CTC TAC ACG CTG 576 Leu Thr Val Arg Arg Ala Thr Pro Asn Asp Thr Gly Leu Tyr Thr Leu 180 185 190 CAC GAC GCC TCG GCG CCG CGG GCC GTG TTC TTT GTG GCG GTG GGC GAC 624 His Asp Ala Ser Gly Pro Arg Ala Val Phe Phe Val Ala Val Gly Asp 195 200 205 CGG CCG CCC GCG CCG CTG GCC CCG GTG GGC CCC GCG CGC CAC GAG CCC 672 Arg Pro Pro Ala Pro Leu Ala Pro Val Gly Pro Ala Arg His Glu Pro 210 215 220 CGC TTC CAC GCG CTC GGC TTC CAC TCG CAG CTC TTC TCG CCC GGG GAC 720 Arg Phe His Ala Leu Gly Phe His Ser Gln Leu Phe Ser Pro Gly Asp 225 230 235 240 ACG TTC GAC CTG ATG CCG CGC GTG GTC TCG GAC ATG GGC GAC TCG CGC 768 Thr Phe Asp Leu Met Pro Arg Val Val Ser Asp Met Gly Asp Ser Arg 245 250 255 GAG AAC TTC ACC GCC ACG CTG GAC TGG TAC TAC GCG CGC GCG CCC CCG 816 Glu Asn Phe Thr Ala Thr Leu Asp Trp Tyr Tyr Ala Arg Ala Pro Pro 260 265 270 CGG TGC CTG CTG TAC TAC GTG TAC GAG CCC TGC ATC TAC CAC CCG CGC 864 Arg Cys Leu Leu Tyr Tyr Val Tyr Glu Pro Cys Ile Tyr His Pro Arg 275 280 285 GCG CCC GAG TGC CTG CGC CCG GTG GAC CCG GCG TCC AGC TTC ACC TCG 912 Ala Pro Glu Cys Leu Arg Pro Val Asp Pro Ala Cys Ser Phe Thr Ser 290 295 300 CCG GCG CGC GCG GCG CTG GTG GCG CGC CGC GCG TAC GCC TCG TGC AGC 960 Pro Ala Arg Ala Ala Leu Val Ala Arg Arg Ala Tyr Ala Ser Cys Ser 305 310 315 320 CCG CTG CTC GGG GAC CGG TGG CTG ACC GCC TGC CCC TTC GAC GCC TTC 1008 Pro Leu Leu Gly Asp Arg Trp Leu Thr Ala Cys Pro Phe Asp Ala Phe 325 330 335 GGC GAG GAG GTG CAC ACG AAC GCC ACC GCG GAC GAG TCG GGG CTG TAC 1056 Gly Glu Glu Val His Thr Asn Ala Thr Ala Asp Glu Ser Gly Leu Tyr 340 345 350 GTG CTC GTG ATG ACC CAC AAC GGC CAC GTC GCC ACC TGG GAC TAC ACG 1104 Val Leu Val Met Thr His Asn Gly His Val Ala Thr Trp Asp Tyr Thr 355 360 365 CTC GTC GCC ACC GCG GCC GAG TAC GTC ACG GTC ATC AAG GAG CTG ACG 1152 Leu Val Ala Thr Ala Ala Glu Tyr Val Thr Val Ile Lys Glu Leu Thr 370 375 380 GCC CCG GCC CGG GCC CCG GGC ACC CCG TGG GGC CCC GGC GGC GGC GAC 1200 Ala Pro Ala Arg Ala Pro Gly Thr Pro Trp Gly Pro Gly Gly Gly Asp 385 390 395 400 GAC GCG ATC TAC GTG GAC GGC GTC ACG ACG CCG GCG CCG CCC GCG CGC 1248 Asp Ala Ile Tyr Val Asp Gly Val Thr Thr Pro Ala Pro Pro Ala Arg 405 410 415 CCG TGG AAC CCG TAC GGC CGG ACG ACG CCC GGG CGG CTG TTT GTG CTG 1296 Pro Trp Asn Pro Tyr Gly Arg Thr Thr Pro Gly Arg Leu Phe Val Leu 420 425 430 GCG CTG GGC TCC TTC GTG ATG ACG TGC GTC GTC GGG GGG GCC GTC TGG 1344 Ala Leu Gly Ser Phe Val Met Thr Cys Val Val Gly Gly Ala Val Trp 435 440 445 CTC TGC GTG CTG TGC TCC CGC CGC CGG GCG GCC TCG CGG CCG TTC CGG 1392 Leu Cys Val Leu Cys Ser Arg Arg Arg Ala Ala Ser Arg Pro Phe Arg 450 455 460 GTG CCG ACG CGG GCG GGG ACG CGC ATG CTC TCG CCG GTG TAC ACC AGC 1440 Val Pro Thr Arg Ala Gly Thr Arg Met Leu Ser Pro Val Tyr Thr Ser 465 470 475 480 CTG CCC ACG CAC GAG GAC TAC TAC GAC GGC GAC GAC GAC GAC GAG GAG 1488 Leu Pro Thr His Glu Asp Tyr Tyr Asp Gly Asp Asp Asp Asp Glu Glu 485 490 495 GCG GGC GAC GCC CGC CGG CGG CCC TCC TCC CCC GGC GGG GAC AGC GGC 1536 Ala Gly Asp Ala Arg Arg Arg Pro Ser Ser Pro Gly Gly Asp Ser Gly 500 505 510 TAC GAG GGG CCG TAC GTG AGC CTG GAC GCC GAG GAC GAG TTC AGC AGC 1584 Tyr Glu Gly Pro Tyr Val Ser Leu Asp Ala Glu Asp Glu Phe Ser Ser 515 520 525 GAC GAG GAC GAC GGG CTG TAC GTG CGC CCC GAG GAG GCG CCC CGC TCC 1632 Asp Glu Asp Asp Gly Leu Tyr Val Arg Pro Glu Glu Ala Pro Arg Ser 530 535 540 GGC TTC GAC GTC TGG TTC CGC GAT CCG GAG AAA CCG GAA GTG ACG AAT 1680 Gly Phe Asp Val Trp Phe Arg Asp Pro Glu Lys Pro Glu Val Thr Asn 545 550 555 560 GGG CCC AAC TAT GGC GTG ACC GCC AGC CGC CTG TTG AAT GCC CGC CCC 1728 Gly Pro Asn Tyr Gly Val Thr Ala Ser Arg Leu Leu Asn Ala Arg Pro 565 570 575 GCT TAA Ala
【0117】配列番号:4 配列の長さ:25 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:DNA 配列: 5' GATCGTCGGCTAGTGAGTAGGTAGG 3' 3' CAGCCGATCACTCATCCATCCTTAA 5'
【0118】配列番号:5 配列の長さ:41 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:DNA 配列: 5' GATCCGCAGTACCGGCGTCGATGATGATGGTGGCGCGCGAC 3' 3' GCGTCATGGCCGCAGCTACTACTACCACCGCGCGCTGCACTG 5'
【図1】 PRVのBamHI7フラグメントの制限地図
である。
である。
【図2】 BamHI7をBamHIおよびPvuIIで消化
して得られるフラグメント1(1.5kb)の制限地図であ
る。
して得られるフラグメント1(1.5kb)の制限地図であ
る。
【図3】 BamHI7をBamHIおよびPvuIIで消化
して得られるフラグメント2(4.9kb)の制限地図であ
る。
して得られるフラグメント2(4.9kb)の制限地図であ
る。
【図4】 フラグメント1をpBR322のBamHIお
よびPvuII部位間に挿入して得られるプラスミドpP
R28−4の制限地図である。
よびPvuII部位間に挿入して得られるプラスミドpP
R28−4の制限地図である。
【図5】 フラグメント2をpBR322のBamHIお
よびPvuII部位間に挿入して得られるプラスミドpP
R28−1の制限地図である。
よびPvuII部位間に挿入して得られるプラスミドpP
R28−1の制限地図である。
【図6】 gp50遺伝子に位置する各種制限酵素切断
部位およびフランキング配列を示す地図である。
部位およびフランキング配列を示す地図である。
【図7】 プラスミドpPR28−4をNarIで消化し
て得られるフラグメント3の制限地図である。
て得られるフラグメント3の制限地図である。
【図8】 BamHIリンカーをフラグメント3に加え、
次いでそれをBamHIで処理して得られるフラグメント
4の制限地図である。
次いでそれをBamHIで処理して得られるフラグメント
4の制限地図である。
【図9】 フラグメント4をDNAリガーゼで環化して
得られるプラスミドpPR28−4Nar2の制限地図で
ある。
得られるプラスミドpPR28−4Nar2の制限地図で
ある。
【図10】 プラスミドpPR28−4 Nar2をBam
HIおよびPvuIIで消化して得られるフラグメント5
(160bp)の制限地図である。
HIおよびPvuIIで消化して得られるフラグメント5
(160bp)の制限地図である。
【図11】 プラスミドpPR28−1をBamHIおよ
びPvuIIで消化して得られるフラグメント6(4.9k
b)の制限地図である。
びPvuIIで消化して得られるフラグメント6(4.9k
b)の制限地図である。
【図12】 プラスミドpPGX1をBamHIで消化
し、BAPで処理し、次いでフラグメント5および6で
結んで得られる、完全なgp50遺伝子よりなるプラス
ミドpBGP50−23の制限地図である。
し、BAPで処理し、次いでフラグメント5および6で
結んで得られる、完全なgp50遺伝子よりなるプラス
ミドpBGP50−23の制限地図である。
【図13】 pBGP50−23をMaeIIIで切断
し、T4DNAポリメラーゼで平滑末端とし、EcoRI
リンカーを加え、EcoRIで消化し、次いでBamHIで
切断して得られるフラグメント7(1.3kb)の制限地図
である。
し、T4DNAポリメラーゼで平滑末端とし、EcoRI
リンカーを加え、EcoRIで消化し、次いでBamHIで
切断して得られるフラグメント7(1.3kb)の制限地図
である。
【図14】 プラスミドpSV2dhfrをBamHIおよび
EcoRIで切断して得られるフラグメント8(5.0kb)
の制限地図である。
EcoRIで切断して得られるフラグメント8(5.0kb)
の制限地図である。
【図15】 フラグメント7および8を結ぶことによっ
てプラスミドpD50の制限地図である。
てプラスミドpD50の制限地図である。
【図16】 pD50をBamHIで消化し、BAPで処
理して得られるフラグメント9の制限地図である。
理して得られるフラグメント9の制限地図である。
【図17】 単離されたヒトサイトメガロウイルス(タ
ウネ(Towne))即時型プロモータを含有するフラグメン
ト10(760bp)の制限地図である。
ウネ(Towne))即時型プロモータを含有するフラグメン
ト10(760bp)の制限地図である。
【図18】 フラグメント9および10を結んで得られ
るプラスミドpDIE50の制限地図である。
るプラスミドpDIE50の制限地図である。
【図19】 プラスミドpSVCOW7の制限地図であ
る。
る。
【図20】 プラスミドpSVCOW7をPvuIIおよ
びEcoRIで切断して得られるフラグメント11の制限
地図である。
びEcoRIで切断して得られるフラグメント11の制限
地図である。
【図21】 フラグメント11をpUC9にクローンし
て得られるプラスミドpCOWT1の制限地図である。
て得られるプラスミドpCOWT1の制限地図である。
【図22】 プラスミドpCOWT1をSalIで切断
し、T4DNA ポリメラーゼで平滑末端とし、EcoR
Iリンカーを加え、続いてEcoRIで消化して得られる
フラグメント12(0.6kb)の制限地図である。
し、T4DNA ポリメラーゼで平滑末端とし、EcoR
Iリンカーを加え、続いてEcoRIで消化して得られる
フラグメント12(0.6kb)の制限地図である。
【図23】 プラスミドpDIE50をEcoRIで切断
し、フラグメント12をその中にクローンして得られた
プラスミドpDIE50PAの制限地図である。
し、フラグメント12をその中にクローンして得られた
プラスミドpDIE50PAの制限地図である。
【図24】 プラスミドpDIE50をSalIおよびEc
oRIで消化して得られる5.0kbフラグメントの制限地
図である。
oRIで消化して得られる5.0kbフラグメントの制限地
図である。
【図25】 プラスミドpDIE50をSalIおよびEc
oRIで消化して得られる0.7kbフラグメントの制限地
図である。
oRIで消化して得られる0.7kbフラグメントの制限地
図である。
【図26】 0.7kbフラグメントをSau3AIで消化
して得られる0.5kbのSalI/Sau3AI フラグメ
ントの制限地図である。
して得られる0.5kbのSalI/Sau3AI フラグメ
ントの制限地図である。
【図27】 5.0kbのEcoRI/SalI フラグメン
ト、0.5kbのSalI/Sau3AIフラグメントおよび
アニールしたオリゴヌクレオチドを結んで得られるプラ
スミドpDIE50Tの制限地図である。
ト、0.5kbのSalI/Sau3AIフラグメントおよび
アニールしたオリゴヌクレオチドを結んで得られるプラ
スミドpDIE50Tの制限地図である。
【図28】 gp63 配列決定に用いる制限酵素切断部
位を示す地図である。
位を示す地図である。
【図29】 gI配列決定に用いる制限酵素切断部位を
示す地図である。
示す地図である。
【図30】 BamHI7フラグメントをプラスミドpU
C19にクローンして得られるプラスミドAの制限地図
である。
C19にクローンして得られるプラスミドAの制限地図
である。
【図31】 プラスミドAをDraIで消化して得られる
フラグメント1の制限地図である。
フラグメント1の制限地図である。
【図32】 BamHIリンカーをフラグメント1に加
え、続いてBamHIで消化して得られるフラグメント2
(2.5kb)の制限地図である。
え、続いてBamHIで消化して得られるフラグメント2
(2.5kb)の制限地図である。
【図33】 フラグメント2をBamHIで消化したpU
C19に入れて得られるプラスミドpUCD/Bの制限
地図である。
C19に入れて得られるプラスミドpUCD/Bの制限
地図である。
【図34】 プラスミドpUCD/BをBsmIおよびEc
oRIで消化して得られるフラグメント3(4.4kb)の制
限地図である。
oRIで消化して得られるフラグメント3(4.4kb)の制
限地図である。
【図35】 2種の合成ヌクレオチドの塩基配列を示す
配列図である。
配列図である。
【図36】 図35に示す合成オリゴヌクレオチドおよ
びフラグメント3を結んで得られるプラスミドpGIの
制限地図である。
びフラグメント3を結んで得られるプラスミドpGIの
制限地図である。
【図37】 プラスミドpGIをEcoRIおよびBamH
Iで消化して得られるフラグメント4(1.8kb)の制限
地図である。
Iで消化して得られるフラグメント4(1.8kb)の制限
地図である。
【図38】 プラスミドpSV2dhfrをEcoRIで切断
し、次いでBamHIで切断して得られるフラグメント5
(5.0kb)の制限地図である。
し、次いでBamHIで切断して得られるフラグメント5
(5.0kb)の制限地図である。
【図39】 フラグメント4および5を結んで得られる
プラスミドpDGIの制限地図である。
プラスミドpDGIの制限地図である。
【図40】 プラスミドpDGIをBamHIで切断して
得られるフラグメント6の制限地図である。
得られるフラグメント6の制限地図である。
【図41】 単離したヒトサイトメガロウイルス(タウ
ネ(Towne))即時型プロモータを含有するフラグメント
7(760bp)の制限地図である。
ネ(Towne))即時型プロモータを含有するフラグメント
7(760bp)の制限地図である。
【図42】 フラグメント6および7を結んで得られる
プラスミドpDIEGIdhfrの制限地図である。
プラスミドpDIEGIdhfrの制限地図である。
【図43】 プラスミドpSVCOW7の制限地図であ
る。
る。
【図44】 プラスミドpSVCOW7をPvuIIおよ
びEcoRIで切断して得られるフラグメント8の制限地
図である。
びEcoRIで切断して得られるフラグメント8の制限地
図である。
【図45】 フラグメント8をpUC9にクローンして
得られるプラスミドpCOWT1の制限地図である。
得られるプラスミドpCOWT1の制限地図である。
【図46】 プラスミドpCOWT1をSalIで切断
し、T4 DNA ポリメラーゼで処理し、EcoRIリ
ンカーを上に結び、続いてEcoRIで消化して得られる
フラグメント9(0.6kb)の制限地図である。
し、T4 DNA ポリメラーゼで処理し、EcoRIリ
ンカーを上に結び、続いてEcoRIで消化して得られる
フラグメント9(0.6kb)の制限地図である。
【図47】 フラグメント9をpUC19のEcoRI部
位にクローンして得られるプラスミドpCOWT1Eの
制限地図である。
位にクローンして得られるプラスミドpCOWT1Eの
制限地図である。
【図48】 pCOWT1EをEcoRIで消化して得ら
れるフラグメント10(600bp)の制限地図である。
れるフラグメント10(600bp)の制限地図である。
【図49】 プラスミドpDIEGIdhfrをEcoRIで
消化し、bGH ポリアデニレーション信号を含有する
フラグメント10で結んで得られるプラスミドpDIE
GIPAの制限地図である。
消化し、bGH ポリアデニレーション信号を含有する
フラグメント10で結んで得られるプラスミドpDIE
GIPAの制限地図である。
【図50】 BamHI7をBstEIIで消化し、T4D
NAポリメラーゼで処理し、次いでKpnIで切断して得
られるフラグメント1(1.9kb)の制限地図である。
NAポリメラーゼで処理し、次いでKpnIで切断して得
られるフラグメント1(1.9kb)の制限地図である。
【図51】 次いでフラグメント1をプラスミドpUC
19のKpnIおよびSmaI部位間でクローンして得られ
るプラスミドpPR28−1BKの制限地図である。
19のKpnIおよびSmaI部位間でクローンして得られ
るプラスミドpPR28−1BKの制限地図である。
【図52】 プラスミドpPR28−1BKをDraIお
よびMaeIIIで切断して得られるフラグメント2(1.
1kb)の制限地図である。
よびMaeIIIで切断して得られるフラグメント2(1.
1kb)の制限地図である。
【図53】 プラスミドpSV2dhfrをEcoRIで切断
し、T4DNAポリメラーゼで処理し、次いでBamHI
で切断して得られるフラグメント3(5.0kb)の制限地
図である。
し、T4DNAポリメラーゼで処理し、次いでBamHI
で切断して得られるフラグメント3(5.0kb)の制限地
図である。
【図54】 2種のオリゴヌクレオチドを合成して得ら
れるフラグメント4のフクレオチド配列を示す地図であ
る。
れるフラグメント4のフクレオチド配列を示す地図であ
る。
【図55】 フラグメント2、3および4を結んで得ら
れるプラスミドpGP63dhfrの制限地図である。
れるプラスミドpGP63dhfrの制限地図である。
【図56】 プラスミドpGP63dhfrをBamHIで消
化し、BAPで処理して得られるフラグメント5の制限
地図である。
化し、BAPで処理して得られるフラグメント5の制限
地図である。
【図57】 単離したヒトサイトメガロウイルス(タウ
ネ(Towne))即時型プロモータを含有するフラグメント
6(760bp)の制限地図である。
ネ(Towne))即時型プロモータを含有するフラグメント
6(760bp)の制限地図である。
【図58】 フラグメント5および6を結んで得られる
プラスミド pIEGP63dhfrの制限地図である。
プラスミド pIEGP63dhfrの制限地図である。
図1中、X=糖蛋白質X(gX)、 50=糖蛋白質50(gp50)、 63=糖蛋白質63(gp63)、 I=糖蛋白質I(gI)、 図15中、dhfr=ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、 SV40 Ori=SV40プロモータおよび複製開始
点、 AmpR=アンピシリン耐性遺伝子、 図23中、A=ウシ成長ホルモンポリアデニレーション
信号、 B=ゲノムウシ成長ホルモン、 C=ヒトサイトメガロウイルス(タウネ(Towne))即時型
プロモータ、 図27中、T=停止コードン、 図33中、7=BamHI フラグメント、 図39中、dhfr=ジヒドロ葉酸還元酵素、 SV40 Ori=SV40プロモータおよび複製開始
点、 AmpR=アンピシリン耐性、 図49中、A=ウシ成長ホルモンポリアデニレーション
信号、 G=ゲノムウシ成長ホルモン、 P=ヒトサイトメガロウイルス(タウネ(Towne))即時型
プロモータ、 図55中、dhfr=ジヒドロ葉酸還元酵素、 SV40 Ori=SV40プロモータおよび複製開始
点、 AmpR=アンピシリン耐性
点、 AmpR=アンピシリン耐性遺伝子、 図23中、A=ウシ成長ホルモンポリアデニレーション
信号、 B=ゲノムウシ成長ホルモン、 C=ヒトサイトメガロウイルス(タウネ(Towne))即時型
プロモータ、 図27中、T=停止コードン、 図33中、7=BamHI フラグメント、 図39中、dhfr=ジヒドロ葉酸還元酵素、 SV40 Ori=SV40プロモータおよび複製開始
点、 AmpR=アンピシリン耐性、 図49中、A=ウシ成長ホルモンポリアデニレーション
信号、 G=ゲノムウシ成長ホルモン、 P=ヒトサイトメガロウイルス(タウネ(Towne))即時型
プロモータ、 図55中、dhfr=ジヒドロ葉酸還元酵素、 SV40 Ori=SV40プロモータおよび複製開始
点、 AmpR=アンピシリン耐性
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/53 9162−4B C12N 15/00 ZNAA 33/569 9281−4B 5/00 B (C12N 15/09 ZNA C12R 1:92) (C12P 21/02 C12R 1:91) (72)発明者 ジェイムス・ジイ・チミンス アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02139、ケンブリッジ、メモライル・ド ライブ ナンバー18エフ550番
Claims (6)
- 【請求項1】 (a)組換体DNA分子を調製し、ここ
に、該分子はPRV gp50、gp63またはgI抗原性
を示すポリペプチドについてコード付けするDNA配列
よりなり、該糖蛋白質は、各々、以下に示されるアミノ
酸配列を有し、該DNAは発現制御配列に作動可能に連
結し; (b)適当な宿主細胞を該組換体DNA分子で形質転換し; (c)該宿主細胞を培養し; (d)次いで該ポリペプチドを収集することを特徴とする
PRV gp50、gp63またはgI抗原性を示すポリペ
プチドの産生法。 gp50のアミノ酸配列: Met Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Leu Val Ala Arg Thr Thr Leu Gly Ala Asp Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Thr Phe Pro Pro Pro Ala Tyr Pro Tyr Thr Glu Ser Trp Gln Leu Thr Leu Thr Thr Val Pro Ser Pro Phe Val Gly Pro Ala Asp Val Tyr His Thr Arg Pro Leu Glu Asp Pro Cys Gly Val Val Ala Leu Ile Ser Asp Pro Gln Val Asp Arg Leu Leu Asn Glu Ala Val Ala His Arg Arg Pro Thr Tyr Arg Ala His Val Ala Trp Tyr Arg Ile Ala Asp Gly Cys Ala His Leu Leu Tyr Phe Ile Glu Tyr Ala Asp Cys Asp Pro Arg Gln Val Phe Gly Arg Cys Arg Arg Arg Thr Thr Pro Met Trp Trp Thr Pro Ser Ala Asp Tyr Met Phe Pro Thr Glu Asp Glu Leu Gly Leu Leu Met Val Ala Pro Gly Arg Phe Asn Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Leu Val Ser Val Asp Gly Val Asn Ile Leu Thr Asp Phe Met Val Ala Leu Pro Glu Gly Gln Glu Cys Pro Phe Ala Arg Val Asp Gln His Arg Thr Tyr Lys Phe Gly Ala Cys Trp Ser Asp Asp Ser Phe Lys Arg Gly Val Asp Val Met Arg Phe Leu Thr Pro Phe Tyr Gln Gln Pro Pro His Arg Glu Val Val Asn Tyr Trp Tyr Arg Lys Asn Gly Arg Thr Leu Pro Arg Ala His Ala Ala Ala Thr Pro Tyr Ala Ile Asp Pro Ala Arg Pro Ser Ala Gly Ser Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Lys Pro Glu Pro Ala Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Pro Ala Thr Arg Asp His Ala Ala Gly Gly Arg Pro Thr Pro Arg Pro Pro Arg Pro Glu Thr Pro His Arg Pro Phe Ala Pro Pro Ala Val Val Pro Ser Gly Trp Pro Gln Pro Ala Glu Pro Phe Gln Pro Arg Thr Pro Ala Ala Pro Gly Val Ser Arg His Arg Ser Val Ile Val Gly Thr Gly Thr Ala Met Gly Ala Leu Leu Val Gly Val Cys Val Tyr Ile Phe Phe Arg Leu Arg Gly Ala Lys Gly Tyr Arg Leu Leu Gly Gly Pro Ala Asp Ala Asp Glu Leu Lys Ala Gln Pro Gly Pro gp63のアミノ酸配列: Met Met Met Val Ala Arg Asp Val Thr Arg Leu Pro Ala Gly Leu Leu Leu Ala Ala Leu Thr Leu Ala Ala Leu Thr Pro Arg Val Gly Gly Val Leu Phe Arg Gly Ala Aly Val Ser Val His Val Ala Gly Ser Ala Val Leu Val Pro Gly Asp Ala Pro Asn Leu Thr Ile Asp Gly Thr Leu Leu Phe Leu Glu Gly Pro Ser Pro Ser Asn Tyr Ser Gly Arg Val Glu Leu Leu Arg Leu Asp Pro Lys Arg Ala Cys Tyr Thr Arg Glu Tyr Ala Ala Glu Tyr Asp Leu Cys Pro Arg Val His His Glu Ala Phe Arg Gly Cys Leu Arg Lys Arg Glu Pro Leu Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Val Glu Ala Arg Arg Leu Leu Phe Val Ser Arg Pro Ala Pro Pro Asp Ala Gly Ser Tyr Val Leu Arg Val Arg Val Asn Gly Thr Thr Asp Leu Phe Val Leu Thr Ala Leu Val Pro Pro Arg Gly Arg Pro His His Pro Thr Pro Ser Ser Ala Asp Glu Cys Arg Pro Val Val Gly Ser Trp His Asp Ser Leu Arg Val Val Asp Pro Ala Glu Asp Ala Val Phe Thr Thr Pro Pro Pro Ile Glu Pro Glu Pro Pro Thr Thr Pro Ala Pro Pro Arg Gly Thr Gly Ala Thr Pro Glu Pro Arg Ser Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Gly Ala Thr Thr Ala Met Thr Pro Val Pro Gly Thr Leu Asp Ala Asn Gly Thr Met Val Leu Asn Ala Ser Val Val Ser Arg Val Leu Leu Ala Ala Ala Asn Ala Thr Ala Gly Ala Arg Gly Pro Gly Lys Ile Ala Met Val Leu Gly Pro Thr Ile Val Val Leu Leu Ile Phe Leu Gly Gly Val Ala Cys Ala Ala Arg Arg Cys Ala Arg Gly Ile Ala Ser Thr Gly Arg Asp Pro Gly Ala Ala Arg Arg Ser Thr Arg Arg Pro Arg Gly Ala Arg Pro Pro Thr Pro Ser Pro Gly Arg Pro Ser Pro Ser Pro Arg gIのアミノ酸配列: Met Arg Pro Phe Leu Leu Arg Ala Ala Gln Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ser Thr Glu Ala Pro Ser Leu Ser Ala Glu Thr Thr Pro Gly Pro Val Thr Glu Val Pro Ser Pro Ser Ala Glu Val Trp Asp Leu Ser Thr Glu Ala Gly Asp Asp Asp Leu Asp Gly Asp Leu Asn Gly Asp Asp Arg Arg Ala Gly Phe Gly Ser Ala Leu Ala Ser Leu Arg Glu Ala Pro Pro Ala His Leu Val Asn Val Ser Glu Gly Ala Asn Phe Thr Leu Asp Ala Arg Gly Asp Gly Ala Val Val Ala Gly Ile Trp Thr Phe Leu Pro Val Arg Gly Cys Asp Ala Val Ala Val Thr Met Val Cys Phe Glu Thr Ala Cys His Pro Asp Leu Val Leu Gly Arg Ala Cys Val Pro Glu Ala Pro Glu Arg Gly Ile Gly Asp Tyr Leu Pro Pro Glu Val Pro Arg Leu Gln Arg Glu Pro Pro Ile Val Thr Pro Glu Arg Trp Ser Pro His Leu Thr Val Arg Arg Ala Thr Pro Asn Asp Thr Gly Leu Tyr Thr Leu His Asp Ala Ser Gly Pro Arg Ala Val Phe Phe Val Ala Val Gly Asp Arg Pro Pro Ala Pro Leu Ala Pro Val Gly Pro Ala Arg His Glu Pro Arg Phe His Ala Leu Gly Phe His Ser Gln Leu Phe Ser Pro Gly Asp Thr Phe Asp Leu Met Pro Arg Val Val Ser Asp Met Gly Asp Ser Arg Glu Asn Phe Thr Ala Thr Leu Asp Trp Tyr Tyr Ala Arg Ala Pro Pro Arg Cys Leu Leu Tyr Tyr Val Tyr Glu Pro Cys Ile Tyr His Pro Arg Ala Pro Glu Cys Leu Arg Pro Val Asp Pro Ala Cys Ser Phe Thr Ser Pro Ala Arg Ala Ala Leu Val Ala Arg Arg Ala Tyr Ala Ser Cys Ser Pro Leu Leu Gly Asp Arg Trp Leu Thr Ala Cys Pro Phe Asp Ala Phe Gly Glu Glu Val His Thr Asn Ala Thr Ala Asp Glu Ser Gly Leu Tyr Val Leu Val Met Thr His Asn Gly His Val Ala Thr Trp Asp Tyr Thr Leu Val Ala Thr Ala Ala Glu Tyr Val Thr Val Ile Lys Glu Leu Thr Ala Pro Ala Arg Ala Pro Gly Thr Pro Trp Gly Pro Gly Gly Gly Asp Asp Ala Ile Tyr Val Asp Gly Val Thr Thr Pro Ala Pro Pro Ala Arg Pro Trp Asn Pro Tyr Gly Arg Thr Thr Pro Gly Arg Leu Phe Val Leu Ala Leu Gly Ser Phe Val Met Thr Cys Val Val Gly Gly Ala Val Trp Leu Cys Val Leu Cys Ser Arg Arg Arg Ala Ala Ser Arg Pro Phe Arg Val Pro Thr Arg Ala Gly Thr Arg Met Leu Ser Pro Val Tyr Thr Ser Leu Pro Thr His Glu Asp Tyr Tyr Asp Gly Asp Asp Asp Asp Glu Glu Ala Gly Asp Ala Arg Arg Arg Pro Ser Ser Pro Gly Gly Asp Ser Gly Tyr Glu Gly Pro Tyr Val Ser Leu Asp Ala Glu Asp Glu Phe Ser Ser Asp Glu Asp Asp Gly Leu Tyr Val Arg Pro Glu Glu Ala Pro Arg Ser Gly Phe Asp Val Trp Phe Arg Asp Pro Glu Lys Pro Glu Val Thr Asn Gly Pro Asn Tyr Gly Val Thr Ala Ser Arg Leu Leu Asn Ala Arg Pro Ala - 【請求項2】 該DNA配列が ATG CTG CTC GCA GCG CTA TTG GCG GCG CTG GTC GCC CGG ACG ACG CTC GGT GCG GAC GTG GAC GCC GTG CCC GCG CCG ACC TTC CCC CCG CCC GCG TAC CCG TAC ACC GAG TCG TGG CAG CTG ACG CTG ACG ACG GTC CCC TCG CCC TTC GTC GGC CCC GCG GAC GTC TAC CAC ACG CGC CCG CTG GAG GAC CCG TGC GCG GTG GTG GCG CTG ATC TCC GAC CCG CAG GTG GAC CGG CTG CTG AAC GAG GCG GTG GCC CAC CGG CGG CCC ACG TAC CGC GCC CAC GTG GCC TGG TAC CGC ATC GCG GAC GGG TGC GCA CAC CTG CTG TAC TTT ATC GAG TAC GCC GAC TGC GAC CCC AGG CAG GTC TTT GGG CGC TGC CGG CGC CGC ACC ACG CCG ATG TGG TGG ACC CCG TCC GCG GAC TAC ATG TTC CCC ACG GAG GAC GAG CTG GGG CTG CTC ATG GTG GCC CCG GGG CGG TTC AAC GAG GGC CAG TAC CGG CGC CTG GTG TCC GTC GAC GGC GTG AAC ATC CTC ACC GAC TTC ATG GTG GCG CTC CCC GAG GGG CAA GAG TGC CCG TTC GCC CGC GTG GAC CAG CAC CGC ACG TAC AAG TTC GGC GCG TGC TGG AGC GAC GAC AGC TTC AAG CGG GGC GTG GAC GTG ATG CGA TTC CTG ACG CCG TTC TAC CAG CAG CCC CCG CAC CGG GAG GTG GTG AAC TAC TGG TAC CGC AAG AAC GGC CGG ACG CTC CCG CGG GCC CAC GCC GCC GCC ACG CCG TAC GCC ATC GAC CCC GCG CGG CCC TCG GCG GGC TCG CCG AGG CCC CGG CCC CGG CCC CGG CCC CGG CCC CGG CCG AAG CCC GAG CCC GCC CCG GCG ACG CCC GCG CCC CCC GAC CGC CTG CCC GAG CCG GCG ACG CGG GAC CAC GCC GCC GGG GGC CGC CCC ACG CCG CGA CCC CCG AGG CCC GAG ACG CCG CAC CGC CCC TTC GCC CCG CCG GCC GTC GTG CCC AGC GGG TGG CCG CAG CCC GCG GAG CCG TTC CAG CCG CGG ACC CCC GCC GCG CCG GGC GTC TCG CGC CAC CGC TCG GTG ATC GTC GGC ACG GGC ACC GCG ATG GGC GCG CTC CTG GTG GGC GTG TGC GTC TAC ATC TTC TTC CGC CTG AGG GGG GCG AAG GGG TAT CGC CTC CTG GGC GGT CCC GCG GAC GCC GAC GAG CTA AAA GCG CAG CCC GGT CCG TAG,であるgp50配列、 ATG ATG ATG GTG GCG CGC GAC GTG ACC CGG CTC CCC GCG GGG CTC CTC CTC GCC GCC CTG ACC CTG GCC GCC CTG ACC CCG CGC GTC GGG GGC GTC CTC TTC AGG GGC GCC GGC GTC AGC GTG CAC GTC GCC GGG AGC GCC GTC CTC GTG CCC GGC GAC GCG CCC AAC CTG ACG ATC GAC GGG ACG CTG CTG TTT CTG GAG GGG CCC TCG CCG AGC AAC TAC AGC GGG CGC GTG GAG CTG CTG CGC CTC GAC CCC AAG CGC GCC TGC TAC ACG CGC GAG TAC GCC GCC GAG TAC GAC CTC TGC CCC CGC GTG CAC CAC GAG GCC TTC CGC GGC TGT CTG CGC AAG CGC GAG CCG CTC GCC CGG CGC GCG TCC GCC GCG GTG GAG GCG CGC CGG CTG CTG TTC GTC TCG CGC CCG GCC CCG CCG GAC GCG GGG TCG TAC GTG CTG CGG GTC CGC GTG AAC GGG ACC ACG GAC CTC TTT GTG CTG ACG GCC CTG GTG CCG CCC AGG GGG CGC CCC CAC CAC CCC ACG CCG TCG TCC GCG GAC GAG TGC CGG CCT GTC GTC GGA TCG TGG CAC GAC AGC CTG CGC GTC GTG GAC CCC GCC GAG GAC GCC GTG TTC ACC ACG CCG CCC CCG ATC GAG CCA GAG CCG CCG ACG ACC CCC GCG CCC CCC CGG GGG ACC GGC GCC ACC CCC GAG CCC CGC TCC GAC GAA GAG GAG GAG GAC GAG GAG GGG GCG ACG ACG GCG ATG ACC CCG GTG CCC GGG ACC CTG GAC GCG AAC GGC ACG ATG GTG CTG AAC GCC AGC GTC GTG TCG CGC GTC CTG CTC GCC GCC GCC AAC GCC ACG GCG GGC GCC CGG GGC CCC GGG AAG ATA GCC ATG GTG CTG GGG CCC ACG ATC GTC GTC CTC CTG ATC TTC TTG GGC GGG GTC GCC TGC GCG GCC CGG CGC TGC GCG CGC GGA ATC GCA TCT ACC GGC CGC GAC CCG GGC GCG GCC CGG CGG TCC ACG CGC CGC CCC CGC GGC GCC CGC CCC CCA ACC CCG TCG CCG GGG CGC CCG TCC CCC AGC CCA AGA TGA,であるgp63配列、および ATG CGG CCC TTT CTG CTG CGC GCC GCG CAG CTC CTG GCG CTG CTG GCC CTG GCG CTC TCC ACC GAG GCC CCG AGC CTC TCC GCC GAG ACG ACC CCG GGC CCC GTC ACC GAG GTC CCG AGT CCC TCG GCC GAG GTC TGG GAC CTC TCC ACC GAG GCC GGC GAC GAT GAC CTC GAC GGC GAC CTC AAC GGC GAC GAC CGC CGC GCG GGC TTC GGC TCG GCC CTC GCC TCC CTG AGG GAG GCA CCC CCG GCC CAT CTG GTG AAC GTG TCC GAG GGC GCC AAC TTC ACC CTC GAC GCG CGC GGC GAC GGC GCC GTG GTG GCC GGG ATC TGG ACG TTC CTG CCC GTC CGC GGC TGC GAC GCC GTG GCG GTG ACC ATG GTG TGC TTC GAG ACC GCC TGC CAC CCG GAC CTG GTG CTG GGC CGC GCC TGC GTC CCC GAG GCC CCG GAG CGG GGC ATC GGC GAC TAC CTG CCG CCC GAG GTG CCG CGG CTC CAG CGC GAG CCG CCC ATC GTC ACC CCG GAG CGG TGG TCG CCG CAC CTG ACC GTC CGG CGG GCC ACG CCC AAC GAC ACG GGC CTC TAC ACG CTG CAC GAC GCC TCG GCG CCG CGG GCC GTG TTC TTT GTG GCG GTG GGC GAC CGG CCG CCC GCG CCG CTG GCC CCG GTG GGC CCC GCG CGC CAC GAG CCC CGC TTC CAC GCG CTC GGC TTC CAC TCG CAG CTC TTC TCG CCC GGG GAC ACG TTC GAC CTG ATG CCG CGC GTG GTC TCG GAC ATG GGC GAC TCG CGC GAG AAC TTC ACC GCC ACG CTG GAC TGG TAC TAC GCG CGC GCG CCC CCG CGG TGC CTG CTG TAC TAC GTG TAC GAG CCC TGC ATC TAC CAC CCG CGC GCG CCC GAG TGC CTG CGC CCG GTG GAC CCG GCG TCC AGC TTC ACC TCG CCG GCG CGC GCG GCG CTG GTG GCG CGC CGC GCG TAC GCC TCG TGC AGC CCG CTG CTC GGG GAC CGG TGG CTG ACC GCC TGC CCC TTC GAC GCC TTC GGC GAG GAG GTG CAC ACG AAC GCC ACC GCG GAC GAG TCG GGG CTG TAC GTG CTC GTG ATG ACC CAC AAC GGC CAC GTC GCC ACC TGG GAC TAC ACG CTC GTC GCC ACC GCG GCC GAG TAC GTC ACG GTC ATC AAG GAG CTG ACG GCC CCG GCC CGG GCC CCG GGC 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- 【請求項3】 該宿主細胞が細菌、菌類、植物細胞およ
び動物細胞よりなる群から選択される請求項1記載の方
法。 - 【請求項4】 該宿主細胞がイー・コリ(E.Coli)で
ある請求項1記載の方法。 - 【請求項5】 該宿主細胞が酵母である請求項1記載の
方法。 - 【請求項6】 該宿主細胞がチャイニーズハムスター卵
巣(CHO)細胞である請求項1記載の方法。
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