JP2568384B2

JP2568384B2 - 偽狂犬病ウイルスワクチン用ポリペプチド、その製法、およびそれを含有するワクチン

Info

Publication number: JP2568384B2
Application number: JP6151983A
Authority: JP
Inventors: エリック・エイ・ペトロブスキス; レオナルド・イー・ポスト; ジェイムス・ジイ・チミンス
Original assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1985-10-04
Filing date: 1994-07-04
Publication date: 1997-01-08
Anticipated expiration: 2012-01-08
Also published as: AU6375186A; EP0223382A1; DE3689144T2; DE3689144D1; EP0223382B1; EP0238618A1; AU601378B2; DK288887D0; EP0223382B2; DK288887A; GR3034271T3; CA1340848C; JP2638588B2; JPH07107982A; KR880700074A; WO1987002058A1; ES2059305T3; DK175072B1; DE3689144T3; DK35794A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は偽狂犬病ウイルス糖蛋白
質およびそれに関連するポリペプチド、該ポリペプチド
よりなるワクチン、かかるワクチンを投与することより
なる動物を感染から保護する方法、および該ポリペプチ
ドの産生法、および動物がＰＲＶに感染しているかどう
かを識別する方法、およびかかる方法のためのキットに
関する。

【０００２】

【従来の技術】偽狂犬病ウイルス(ＰＲＶ)は世界的に多
くの種の動物に感染する病気である。ＰＲＶは種々に呼
ばれる感染性延髄麻痺、アウジエスキー病、および仮性
恐水病である。感染はブタ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツ
ジ、ラットおよびミンクの如き重要な家畜において知ら
れている。宿主の範囲は非常に広く、ほとんどの哺乳動
物および、実験的には少なくとも多種類の鳥類を包含す
る[宿主の詳細なリストについては、ディ・ピイ・グス
タフソン(D.P.Gustafson)、「シウドラビエス(Pseudorab
ies)」、デイジージズ・オブ・スワイン(Diseases of Sw
ine)、第５版、エイ・ディ・レマンら(A.D.Leman et a
l.)編(１９８１)参照)。感染したほとんどの動物につい
て該病気は致命的なものである。しかし、成熟したブタ
および恐らくラットは該病気によって殺されることはな
く、従ってキャリアである。

【０００３】ブタの集団は特にＰＲＶに罹り易い。成熟
したブタはまれにしか徴候を示さずまたは該病気により
死なないが、子ブタは感染すると急性の病気により、そ
の結果、特異的な臨床的様相なくして２４ないし４８時
間のうちに通常死んでしまう(ティ・シイ・ジョーンズ
およびアール・ディ・ハント(T.C.Ｊones and R.D.Hun
t)、ベテリナリ・パソロジー(Veterinary Pathology)、
第５版、リー・アンド・フェビガー(Lea ＆ Febiger)
(１９８３))。

【０００４】ＰＲＶワクチンが多種類の技術によって生
産されてきたし、ヨーロッパの流行地においてはワクチ
ン接種が１５年以上の間、行われてきた。ワクチン接種
によって損失は減少されてきたが、ワクチン接種は環境
中に該ウイルスを維持しつづけてきた。感染を防止する
ワクチンは生産されたことがない。ビルレントウイルス
に暴露された、ワクチン接種した動物は感染しても生き
残り、次いでより多くのビルレントウイルスを放出す
る。従ってワクチン接種した動物は再び突発する可能性
がある潜伏感染を有しうる(ディ・ビイ・グスタフソン
(D.P.Gustafson)、前掲参照)。

【０００５】ＰＲＶ用の生弱毒化ワクチンおよび不活性
化ワクチンは米国で商業的に入手可能であり、ＵＳＤＡ
により認可されてきた(シイ・イー・アロンソン(C.E.Ar
onson)編、ベテリナリ・ファルマシューティカルズ・ア
ンド・バイオロジカルズ(Veterinary Pharmaceuticals
＆ Biologicals)、(１９８３)参照)。

【０００６】成熟したブタはＰＲＶのキャリアであるの
で、多くの州は感染した動物を検知するスクリーニング
プログラムを制定してきた。本明細書に記載するＤＮＡ
配列を利用し、ＤＮＡ／ＤＮＡ交雑を用いて能動的に感
染した動物を診断できる。本発明のＰＲＶ糖蛋白質のい
くつかは、また、ＰＲＶ感染についての特殊症状をつく
りだすのに有用であり、また、ＰＲＶに対するワクチン
を産生するのに有用である。

【０００７】ＰＲＶはヘルペスウイルスである。ヘルペ
スウイルスは一般に最も複雑な動物ウイルスの１つであ
る。そのゲノムは少なくとも５０個のウイルスの特異的
蛋白質をコード付けし、１５００００個までのヌクレオ
チドを含有する。最も免疫学的に反応性であるヘルペス
ウイルス蛋白質のなかには、他の場所のうちでもとりわ
けウイルス粒子膜および感染した細胞の膜中で見い出さ
れた糖蛋白質がある。ＰＲＶ糖蛋白質に関する文献は少
なくとも４つのウイルス糖蛋白質に言及している(ティ
・ベン−ポラートおよびエイ・エス・カプラン(T.Ben-P
orat and A.S.Kaplan)、バイロロジー(Virology)、４
１、２６５〜７３頁、(１９７０);エイ・エス・カプラ
ンおよびテイ・ベン−ポラート(A.S.Kaplan and T.Ben-
Porat)、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ(Proc. Natl．Acad.Sci.)
ＵＳＡ、６６、７９９〜８０６頁(１９７０))。

【０００８】エム・ダブリュー・ウエイセンおよびエル
・ケイ・ウエイセン(M.W.Wathen and L.K.Wathen)、ジ
ャーナル・オブ・バイロロジー(J. Virol.)、５１、５
７〜６２頁(１９８４)はウイルス糖蛋白質(gp５０)中に
突然変異を含有するＰＲＶおよびgp５０に対して定方向
化された単クローン抗体を中和することを利用して該突
然変異体を選択する方法に言及している。ウエイセンお
よびウエイセン(Wathenand Wathen)は、また、gp５０に
対して定方向化された単クローン抗体は補体の助けをか
りてまたはそれなしで強力なＰＲＶの中和剤であるこ
と、および多価免疫血清はgp５０に対して大いに反応性
であることを示し、従ってgp５０は重要なＰＲＶ免疫原
の１つであり得ると結論している。他方、９８０００Ｍ
Ｗエンベロープ糖蛋白質と反応する単クローン抗体はＰ
ＲＶ伝染性を中和するが、他の膜糖蛋白質のいくつかに
対して定方向化された単クローン抗体は中和活性をほと
んど持たないことが報告されている(エイチ・ハンプル
ら(H.Hampl et al.)、ジャーナル・オブ・バイロロジー
(J.Virol.)、５２、５８３〜９０頁(１９８４);および
ティ・ベン−ポラートおよびエイ・エス・カプラン(T.B
en-Porat and A.S.Kaplan)、「偽狂犬病ウイルスの分子
生物学」、ビイ・ロイツマン(B.Roizman)編、ザ・ヘルペ
スバイアラシズ(The Herpesviruses)、３、１０５〜７
３頁(１９８４))。

【０００９】エル・エム・ケイ・ウエイセンら(L.M.K.W
athen et al.)、バイアラス・リサーチ(Ｖirus Ｒesea
rch)、４、１９〜２９頁(１９８５)はgp５０およびgp８
３と同定されたＰＲＶ糖蛋白質に対して定方向化された
単クローン抗体の産生および特徴づけならびにマウスを
ＰＲＶ感染に対して受動的に免疫とするその使用につい
て言及している。

【００１０】エイ・ケイ・ロビンズら(A.K.Robbins et
al.)、「イー・コリ(E.coli)発現プラスミドライブラリ
ーを用いる偽狂犬病ウイルス糖蛋白質の位置決め」ヘル
ペスバイアラス(Herpesvirus)、５５１〜６１頁(１９８
４)はＰＲＶＤＮＡを含有するイー・コリ(E.coli)プ
ラスミドのライブラリーの組立てについて言及してい
る。彼等は７４０００および９２０００ＭＷの糖蛋白質
をコード付けするＰＲＶ遺伝子の同定についても言及し
ている。彼等は本発明の糖蛋白質については言及してい
ない。

【００１１】エイ・ケイ・ロビンズら(A.K.Robbins et
al.)、ヨーロッパ特許出願８５４００７０４.４号(公開
番号０１６３７３８)はgＩＩおよびgＩＩＩとして同定
されるＰＲＶ糖蛋白質の単離、クローニングおよび発現
について言及している。彼等は本発明のＰＲＶ糖蛋白質
については言及していない。

【００１２】テイ・シイ・メテンライターら(T.C.Mette
nleiter et al.)、「偽狂犬病ウイルス糖蛋白質Ａの構造
遺伝子のマッピングおよび２種の非グルコシル化前駆体
ポリペプチドの同定」、ジャーナル・オブ・バイロロジ
ー(J.Virol.)、５３、５２〜５７頁(１９８５)はＰＲＶ
ＤＮＡのＢamＨＩ７フラグメントに対する糖蛋白質
gＡ(これはgＩに一致する)のコーディング領域のマッピ
ングについて言及している。彼等は、また、ＢamＨＩ７
フラグメントが少なくとも３種の他の６５Ｋ、６０
Ｋ、および４０ＫＭＷのウイルス蛋白質をコード付けす
ることを述べている。彼等は本発明の糖蛋白質をコード
付けするＤＮＡ配列または組換体ＤＮＡ法によりかかる
ポリペプチドの産生を開示もしくは示唆していない。

【００１３】ビイ・ロムニクツイら(B.Lomniczi、et a
l.)、「偽狂犬病ウイルスワクチン株のゲノムにおける欠
失および該ゲノムの４種異性体の存在」、ジャーナル・
オブ・バイロロジー(J.Virol.)、４９、９７０〜７９頁
(１９８４)は０.８５５および０.８８２図単位間のユニ
ークな短配列中に欠失を有するＰＲＶワクチン株につい
て言及している。これはgＩ遺伝子の近傍においてであ
る。ティ・シイ・メテンライターら(T.C.Mettenleiter
et al.)、「偽狂犬病ウイルスのアビルレント株は主要糖
蛋白質を発現しない」、ジャーナル・オブ・バイロロジ
ー(J.Virol.)、５６、３０７〜１１頁(１９８５)は、３
種の市販ＰＲＶワクチン株が糖蛋白質gＩを欠くことを
証明した。発明者らは、また、バルサ(Ｂartha)ワクチ
ン株はgp６３遺伝子のほとんどについて欠失を含有する
ことを最近見い出した。

【００１４】ティ・ジェイ・リーら(T.J.Rea et al.)、
ジャーナル・オブ・バイロロジー(J.Virol.)、５４、２
１〜２９頁(１９８５)は感染した細胞の培地中に蓄積す
るＰＲＶ糖蛋白質についての遺伝子(gx)のマッピングお
よび配列について言及している。そこに示されているg
Ｘ遺伝子のフランキング配列のなかには、第６図の塩基
１６８２で特異的に開始するgp５０配列が少しの割合で
包含される。しかし、この配列はgp５０配列として同定
されていない。さらに、リーら(Rea et al.)によって公
開された配列中に誤りがある。塩基１５８６および１６
０３は欠失されているべきである。塩基１７０８および
１７０９、塩基１７３７および１７３８、塩基１７４３
および１７４４ならびに塩基１７５３および１７５４間
に塩基が挿入されているべきである。公開されたgp５０
についての部分配列におけるこれらの誤りの結果、フレ
ームシフトとなる。ＡＵＧ開始部位に始まるオープンリ
ーディングフレームの翻訳はgp５０糖蛋白質について誤
ったアミノ酸配列を与えるであろう。

【００１５】ヨーロッパ公開特許出願０１３３２００号
はＰＲＶのキャリアおよび非キャリアを識別するのにあ
る種のレクチン−結合ＰＲＶ糖蛋白質のサブユニットワ
クチンと一緒に用いる診断抗原ファクターについて言及
している。

【００１６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、偽狂
犬病ウイルス用ワクチンのためのポリペプチドの産生法
を提供することにある。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＰＲＶ糖
蛋白質抗原性を示す糖蛋白質をコード付けするＤＮＡ配
列よりなる組換体ＤＮＡ分子を作製することに成功する
ことにより、本発明を完成した。すなわち、(a)組換体ＤＮＡ分子を調製し、ここに、該
分子はＰＲＶ gp５０、gp６３またはｇＩ抗原性を示す
ポリペプチドについてコード付けするＤＮＡ配列よりな
り、該糖蛋白質は、各々、配列表（配列番号１、２およ
び３）に示されるアミノ酸配列を有し、該ＤＮＡは発現
制御配列に作動可能に連結し； (b)適当な宿主細胞を該組換体ＤＮＡ分子で形質転換
し； (c)該宿主細胞を培養し； (d)次いで該ポリペプチドを収集することを特徴とする
ＰＲＶ gp５０、gp６３またはｇＩ抗原性を示すポリペ
プチドの産生法を提供するものである。また、本発明
は、該ＤＮＡ配列が、各々、配列表（配列番号１、２お
よび３）に示される配列よりなる該ポリペプチドの産生
法を提供するものである。さらに、本発明は、該宿主細
胞が細菌、菌類、植物細胞および動物細胞よりなる群か
ら選択される該ポリペプチドの産生法を提供するもので
ある。さらに、本発明は、該宿主細胞がイー・コリ(Ｅ.
coli)である該ポリペプチドの産生法を提供するもので
ある。さらに、本発明は、該宿主細胞が酵母である該ポ
リペプチドの産生法を提供するものである。さらに、本
発明は、該宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（Ｃ
ＨＯ）細胞である該ポリペプチドの産生法を提供するも
のである。また、本明細書中には、ヒトを除く罹患動物
を糖蛋白質gＩまたはgp６３を欠くＰＲＶでワクチン接
種し、次いで該動物を殺すことなくかかるワクチン接種
した動物とＰＲＶに感染した動物とを血清学的に識別す
ることを特徴とするＰＲＶに対してワクチン接種したヒ
トを除く動物とＰＲＶに感染したヒトを除く動物とを識
別する方法を記載する。さらに、本明細書中には、１の
容器がその中にＰＲＶ糖蛋白質ｇＩまたはｇｐ６３抗原
性を示すポリペプチドを有する多数の容器よりなること
を特徴とする、ヒトを除く罹患動物を糖蛋白質gＩまた
はgp６３を欠くＰＲＶでワクチン接種し、次いで該動物
を殺すことなくかかるワクチン接種した動物とＰＲＶに
感染した動物とを血清学的に識別することを特徴とする
ＰＲＶに対してワクチン接種したヒトを除く動物とＰＲ
Ｖに感染したヒトを除く動物とを識別する方法を実施す
るのに有用な商業用キットを記載する。

【００１８】ＰＲＶの糖蛋白質gpをコード付けする遺伝
子の存在および位置決定はエム・ダブリュー・ウエイセ
ンおよびエル・エム・ウエイセン(Ｍ．Ｗ．Ｗathen an
dＬ．Ｍ．Ｗathen)、前掲によって示された。

【００１９】該遺伝子によってコード付けされる糖蛋白
質は特定の単クローン抗体と反応する糖蛋白質と定義さ
れた。この糖蛋白質は以前に知られたＰＲＶ糖蛋白質の
いずれにも対応しなかった。ウエイセンおよびウエイセ
ン(Wathen and Ｗathen)は単クローン抗体に対して耐性
の突然変異をマップしたが、それは単純疱疹ウイルスに
おける慣行に基づいて(例えば、テイ・シイ・ホランド
ら(T.C.Holland et al.)．ジャーナル・オブ・バイロロ
ジー(J.Virol.)、５２、５６６〜７４頁(１９８４))。g
p５０についての構造遺伝子の位置をマップするもので
ある。ウエイセンおよびウエイセン(Wathen and Wathe
n)はＰＲＶのＢamＨＩ７フラグメント内からのより小さ
いＳalＩ／ＢamＨＩフラグメントに対するgp５０遺伝子
をマップした。リーら(Rea et al.)、前掲は同一領域に
対するＰＲＶ糖蛋白質gＸ遺伝子をマップした。

【００２０】ＰＲＶgp６３およびgＩ遺伝子はバクテリ
オファージ発現ベクターλgt１１中で組立てられたＰＲ
ＶＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによ
って単離された(ジェイ・ジイ・テイミンズら(J.G.Timm
ins et al.)、「ファージλgtＩＩライブラリーからの効
果的な遺伝子単離法:変性した、アセトン沈澱蛋白質に
対する抗血清の使用」、ジーン(Gene)、３９、８９〜９
３頁(１９８５);アール・エイ・ヤングおよびアール・
ダブリュー・デイビス(R.A.Young and R.W.Davis)、プ
ロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ(Proc．Natl．Acad．Sci)ＵＳＡ、８
０、１１９４〜９８頁(１９８３); アール・エイ・ヤ
ングおよびアール・ダブリュー・デイビス(R.A.Young a
nd R.W.Davis)、サイエンス(Science)、２２２、７７８
〜８２頁(１９８３))。

【００２１】最初パードウ(Purdue)大学のデイ・ピイ・
グスタフソン(D.P.Gustafson)から入手したＰＲＶライ
ス(Ｒice)株由来のＰＲＶゲノムＤＮＡをＰＲＶ感染ベ
ロ(Vero)細胞(ＡＴＣＣＣＣＬ８１)の細胞質から単
離した。ゲノムＤＮＡを超音波処理によってフラグメン
ト化し、次いでλgt１１にクローンしてλ／ＰＲＶ組換
体(λＰＲＶ)ＤＮＡライブラリーを得た。

【００２２】λＰＲＶライブラリーをスクリーニングす
るための抗血清はＳＤＳゲル上でサイズにより分離した
ＰＲＶで感染した細胞(感染した細胞蛋白質またはＩＣ
Ｐ)から単離した蛋白質でマウスを接種し、次いで抗体
を単離することによって得た。スクリーニングされるべ
きλＰＲＶファージはlacＺ遺伝子の３'末端におけるユ
ニークなクローニング部位を含有するイー・コリ(E.col
i)λgt１１のリンネル布上で平板培養した。このユニー
ク部位に適当な配位で挿入された外来性ＤＮＡおよび解
読フレームは、発現に際し、β−ガラクトシダーゼに融
合したポリペプチドを産生する。ＰＲＶＤＮＡの発
現を促進するlacＺ転写の誘発物質を含有するニトロセ
ルロースフィルターを該リンネル布の頂部上に置いた。
λＰＲＶによって発現された融合ポリペプチドにニトロ
セルロースフィルターと結合するのに十分な時間を与え
た後、該フィルターをリンネル布から取り除き、マウス
抗血清でプローブした。マウス抗血清に結合した抗原を
産生するプラークをマウス抗血清についてのラベル抗体
でプロープすることによって同定した。

【００２３】陽性信号を与えるプラークを用いてイー・
コリ(E.coli)宿主を形質転換した(Ｙ１０９０、ＡＴＣ
Ｃ、ロックビル(Rockville)、メリーランド州２０８５
２より入手可能)。次いで、培養物を一晩インキュベー
トしてλＰＲＶファージ株を得た。これらのファージ株
を用いてイー・コリ(Ｅ．coli)Ｋ９５を感染した(デイ
・フリードマン(D.Friedman)、ザ・バクテリオファージ
・ランブダ(The Bacteriophage Lambda)、７３３〜３８
頁、エイ・デイ・ハーシェイ(A.D.Hershey)編、(１９７
１)。形質転換されたイー・コリ(E.coli)Ｋ９５によっ
て産生されたポリペプチドを予備ゲル電気泳動によって
精製した。(lacＺ遺伝子の転写の誘導のため)過剰産生
された、１１６０００ダルトン以上の分子量を有し、ま
たλgt１１対照培養物中に存在しないポリペプチドはβ
−ガラクトシダーゼ−ＰＲＶ融合蛋白質であった。次い
で、各個々の融合蛋白質を異なるマウスに注射して抗血
清を得た。

【００２４】例えば¹⁴Ｃ−グルコサミンを含有する培地
中で増殖するベロ(Vero)細胞を感染することによって標
識ＰＲＶＩＣＰを得た(ティ・ジェイ・リーら(T.J.Re
a etal.)、前掲)。前記からの融合蛋白質抗血清を用い
てこれらの標識ＩＣＰを免疫沈降した。かく沈降したポ
リペプチドをゲル電気泳動によって分析した。それらの
うちの１つは１１０kd ＭＷ糖蛋白質(gＩ)およびもう
１つは６３Ｋd ＭＷ糖蛋白質(gp６３)であった。かく
して抗−gＩおよび抗−gp６３血清を生ぜしめるハイブ
リッド蛋白質を産生するファージ中でクローンされた遺
伝子はgＩおよびgp６３であることが示された。gp５０
配列がそうである如く(図１参照)、これらの遺伝子はＰ
ＲＶゲノムのＢamＨＩ７フラグメント内部にマップされ
ることが判明した(ティ・ジェイ・リーら(T.J.Rea et a
l.、前掲)。gＩの位置は、一般に、メテンライターら(M
ettenleiter et al.)、前掲がgＩ遺伝子をマップした領
域に一致している。しかし、メテンライターらMettenle
iter et al.)は、実際はそうではないがgＩ遺伝子がＢa
mＨＩ１２フラグメント中まで伸びることを示した。

【００２５】ＤＮＡ交雑および選択されたmＲＮＡのin
vitro 翻訳に比してこのλＰＲＶ遺伝子単離法は迅速
でかつ効果的である。精製された糖蛋白質が入手不可能
であったので、発明者らはアミノ酸配列データからオリ
ゴヌクレオチドプローブを急速に組立てることができ
ず、また高度に特異的な多クローン抗血清を精製させる
こともできなかった。従って、発明者らは前記の方法を
用いた。

【００２６】前記した如く、gp５０、gp６３およびgＩ
をコード付けする遺伝子をＰＲＶＤＮＡのＢamＨＩ７
フラグメントに対してマップした。ＰＲＶからのＢamＨ
Ｉ７フラグメントは(ＰＵＣ１１２９としても公知の)プ
ラスミドpＰＲＸh１から得ることができ、ＤＮＡ配列分
析に便利なフラグメントは標準的な継代クローニング法
によって得ることができる。プラスミドpＵＣ１１２９
はイー・コリ(E.coli)ＨＢ１０１、ＮＲＲＬＢ−１５
７７２から入手可能である。この培養物はノーザン・リ
ージョナル・リサーチ・センター・ファーメンテイショ
ン・ラボラトリー(ＮＲＲＬ)、米国農務省、ペオリア(P
eoria)、イリノイ州、米国の永久寄託から入手可能であ
る。

【００２７】pＵＣ１１２９を含有するイー・コリ(E.co
li)ＨＢ１０１はよく知られた方法によってＬ−ブロス
中で増殖させることができる。典型的には、培養物は
０．６の光学密度まで増殖させ、その後クロラムフェニ
コールを添加し、培養物を一晩振盪する。次いで、例え
ば高濃度塩ＳＤＳを用いて培養物を溶解し、上澄みを塩
化セシウム／臭化エチジウム平衡密度勾配遠心分離に付
してプラスミドを得る。

【００２８】これらの遺伝子配列の利用により該遺伝子
および遺伝子配列の直接操作が可能となり、それにより
該遺伝子またはそのフラグメントによってコード付けさ
れる蛋白質の発現の調節および／または該蛋白質の構造
の修飾が可能となる。これらの遺伝子配列の知見によ
り、交雑プローブとして公知の配列を用いてＰＲＶのい
ずれの株からの対応する遺伝子またはそのフラグメント
をもクローンすること、ならびに一般に当該分野におい
て公知の組換体技術によって完全な蛋白質またはそのフ
ラグメントを発現することが可能となる。

【００２９】これらの遺伝子配列の知見により、発明者
らは、対応するポリペプチドのアミノ酸配列を推断する
ことができた(配列表：配列番号１〜３)。その結果、Ｐ
ＲＶ免疫原性を有するこれらのポリペプチドのフラグメ
ントは蛋白質合成の標準法または組換体ＤＮＡ法によっ
て産生できる。ここで用いる如く、免疫原性および抗原
性は適応免疫応答のいずれのタイプも刺激する能力につ
いて言及するのに相互交換的に用いることができる。す
なわち、抗原および抗原性は抗体の産生を刺激する物質
を意味することに限定されない。

【００３０】gp５０、gp６３およびgＩについてコード
付けする遺伝子の一次構造(配列)も配列表（配列番号１
〜３）に記載する。

【００３１】遺伝子またはそのフラグメントはＮＲＲＬ
Ｂ−１５７７２の培養物からのプラスミドＤＮＡを適
当なエンドヌクレアーゼ制限酵素で消化することによっ
てpＵＣ１１２９から抽出できる。例えば、ＢamＨＩ
７フラグメントはＢamＨＩでのpＵＣ１１２９の調製物
の消化、およびゲル電気泳動による単離によって単離で
きる。

【００３２】本明細書中で言及するすべての制限エンド
ヌクレアーゼは商業的に入手可能であり、それらの使用
は当該分野においてよく知られている。使用のための指
図書は、一般に、制限酵素の販売業者によって提供され
る。

【００３３】切り取られた遺伝子またはそのフラグメン
トは宿主細胞を形質転換するのに用いる各種クローニン
グビヒクルまたはベクターに結べる。好ましくは、該ベ
クターはＰＲＶ糖蛋白質遺伝子の転写および翻訳(これ
らは一緒に発現よりなる)を開始し、制限しおよび停止
するＤＮＡ配列を含有し、従ってそれに作動可能に連結
している。これらの「発現制御配列」は、好ましくは形質
転換されるべき宿主細胞に適合する。宿主細胞が高等動
物細胞、例えば哺乳動物細胞である場合、糖蛋白質遺伝
子の天然に生じる発現制御配列を単独で、または異種発
現制御配列と共に使用できる。異種配列は、また、単独
で用いることができる。該ベクターは、さらに好ましく
は、標識遺伝子(例えば、抗生物質耐性)を含有して形質
転換宿主細胞の選択についての表現型特徴を提供する。
さらに、複製ベクターはレプリコンを含有する。

【００３４】典型的なベクターは動物細胞を感染するプ
ラスミド、ファージおよびウイルスである。基本的に
は、宿主細胞を形質転換することができるいずれのＤＮ
Ａ配列も用いることができる。

【００３５】本明細書中で用いる宿主細胞なる語はＰＲ
Ｖ糖蛋白質抗原性を示すポリペプチドについてコード付
けするＤＮＡ配列で形質転換され得る細胞を意味する。
好ましくは、宿主細胞はＰＲＶポリペプチドまたはその
フラグメントを発現することができる。宿主細胞は原核
または真核であり得る。原核細胞の例としてはイー・コ
リ(E. coli)、ビイ・スブチリス(B. subtilis)、シュー
ドモナス(Pseudomonas)およびビイ・ステアロセルモフ
ィラス(B．stearothermophilus)の如き細菌がある。真
核細胞の例としては酵母または昆虫の細胞の如き高等動
物細胞、植物源もしくは哺乳動物源がある。哺乳動物細
胞懸濁液も用いることができるが、哺乳動物細胞システ
ムはしばしば細胞の単層の形態である。哺乳動物細胞系
は、例えばベロ(ＶＥＲＯ)およびヒーラ細胞、チャイニ
ーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞系、ＷＩ３８、ＢＨ
Ｋ、ＣＯＳ−７またはＭＤＣＫ細胞系を包含する。昆
虫細胞系はスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera fr
ugiperda)(ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１)を包含する。い
くつかの入手可能な真核プラスミド、宿主細胞ならびに
ＰＲＶ糖蛋白質をクローンするおよび発現するために使
用する方法の要約はケイ・エセルら(K．Esser et a
l.)、プラスミズ・オブ・エーカリオテス(Plasmids of
Eukaryotes)(ファンダメンタルズ・アンド・アプリケイ
ションズ(Fundamentals and Applications))、シュプリ
ンゲル−フェアラーク(Springer-Verlag)(１９８６)中
に見い出すことができ、参照のためにここに挙げる。

【００３６】前記した如く、ベクター、例えば宿主細胞
を形質転換するのに用いられるプラスミドは、好ましく
は、ＰＲＶ糖蛋白質遺伝子またはそのフラグメントの発
現のための受容可能な発現制御配列を含有する。従っ
て、発現制御配列は遺伝子またはフラグメントに作動可
能に連結する。宿主細胞が細菌である場合、有用な発現
制御配列の例はtrpプロモータおよびオペレータ(ゲデル
ら(Goeddel et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ(Nucl．Acids Ｒes.)、８、４０５７(１９８０));lac
プロモータおよびオペレータ(チャンら(Chang et a
l.)、ネイチャー(Nature)、２７５、６１５(１９７
８));外部膜蛋白質プロモータ(ユアローピーアン・モレ
キュラー・バイオロジー・オーガナイゼイション・ジャ
ーナル(ＥＭＢＯＪ．)、１、７７１〜７７５(１９８
２));バクテリオファージλプロモータおよびオペレー
タ(ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl．Acids R
es.)、１１、４６７７〜４６８８(１９８３));α−アミ
ラーゼ(ビイ・スブチリス(Ｂ．subtilis))プロモータお
よびオペレータ、停止配列および他の発現エンハンスメ
ントならびに選択された宿主細胞に適合する制御配列を
包含する。宿主細胞が酵母である場合、有用な発現制御
配列の例は、例えばα−交配因子を包含する。昆虫細胞
については、バクロウイルスのポリヘドリンプロモータ
を用いることができる(モレキュラー・アンド・セリュ
ラー・バイオロジー(Mol．Cell．Biol．)、３、２１５
６〜６５頁(１９８３))。宿主細胞が昆虫または哺乳動
物由来である場合、有用な発現制御配列の例は、例えば
ＳＶ−４０プロモータ(サイエンス(Science)、２２２、
５２４〜５２７(１９８３))または例えばメタロチオネ
インプロモータ(ネイチャー(Nature)、２９６、３９〜
４２(１９８２))または熱ショックプロモータ(ボエルミ
イら(Voellmy et al.)、プロシーディングズ・オブ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc．Nat
l．Acad．Sci.)ＵＳＡ、８２、４９４９〜５３頁(１９
８５))を包含する。前記した如く、宿主細胞が哺乳動物
細胞である場合、ＰＲＶ糖蛋白質遺伝子についての発現
制御配列を、好ましくは異種発現制御配列と組合せて用
いることができる。

【００３７】発現制御配列を含有するプラスミドまたは
複製もしくは取込みＤＮＡ物質は制限酵素を用いて切断
され、要すればまたは所望によりサイズを調製し、次い
で当該分野でよく知られた方法によってＰＲＶ糖蛋白質
遺伝子またはそのフラグメントで結ぶ。酵母または高等
動物宿主細胞を使用する場合、公知の酵母もしくは哺乳
動物遺伝子からのポリアデニレーションもしくはターミ
ネーター配列をベクター中に一体化することができる。
例えば、ヨーロッパ特許公開番号００９３６１９中に記
載されている如くウシ成長ホルモンポリアデニレーショ
ン配列を用いることができ、ここに参照のために挙げ
る。さらに、宿主細胞の複製を制御するための遺伝子配
列をベクター中に一体化することができる。

【００３８】宿主細胞は形質転換について受容可能であ
る、あるいは各種方法によって受容可能とされる。細菌
細胞が宿主細胞である場合、コーヘン(Cohen)、ピイ・
エヌ・エイ・エス(ＰＮＡＳ)、６９、２１１０(１９７
２)によって一般的に記載されている如く、塩、典型的
にはカルシウム塩での処理によってそれを受容可能とで
きる。一般に、酵母宿主細胞はその細胞壁の除去または
イオン処理の如き他の方法によって受容可能とされる
(ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J.Bacterio
l.)、１５３、１６３〜１６８(１９８３))。例えばリン
酸カルシウム沈降、ＤＮＡを含有する細菌プロトプラス
トでの受容体細胞の融合、ＤＮＡを含有するリポソーム
での受容体細胞の処理、およびＤＮＡの細胞中への直接
マイクロインジェクションを包含するいくつかのよく知
られたＤＮＡの動物細胞中への導入法がある。

【００３９】形質転換細胞は当該分野でよく知られた方
法によって増殖し(モレキュラー・クローニング(Molecu
lar Cloning)、マニアティス・ティら(Maniatis T．et
al.)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
(Cold Spring Harbor Laboratory)、(１９８２);バイオ
ケミカル・メソッズ・イン・セル・カルチャー・アンド
・バイロロジー(Biochemical Methods In Cell Culture
and Virology)、クチラー・アール・ジェイ(Kuchler
R．J.)、ドウデン(Dowden)、ヒッチンソン・アンド・ロ
ス・インコーポレイティッド(Hutchinson and Ross、In
c.)、(１９７７);メソッズ・イン・イースト・ジェネテ
ィックス(Methods In Yeast Genetics)、シェルマン・
エフら(Sherman、F．et al.)、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laborato
ry)、(１９８２))、発現されたＰＲＶ糖蛋白質またはそ
のフラグメントは、例えば当該分野でよく知られた機械
的もしくは酵素的方法によって宿主細胞系を破壊した
後、宿主細胞または細胞懸濁液から蛋白質が排出される
系において細胞培養物から収穫される。

【００４０】前記した如く、遺伝子構造から推断したＰ
ＲＶ糖蛋白質のアミノ酸配列は配列表（配列番号１〜
３）に記載する。ＰＲＶ糖蛋白質抗原性を示すポリペプ
チドは配列表（配列番号１〜３）に記載した配列ならび
にポリペプチド配列およびまた該ポリペプチドの免疫原
的機能同族体を注射された動物、例えば哺乳動物におい
て免疫応答を引き出すことができるポリペプチド配列の
いずれの部分も包含する。

【００４１】前記で示した如く、ＰＲＶ糖蛋白質につい
てコード付けする完全な遺伝子をベクターを組立てるの
におよび宿主細胞を形質転換するのに用いてＰＲＶ糖蛋
白質を発現することができ、あるいはＰＲＶ糖蛋白質を
コード付けする遺伝子のフラグメントを用いることがで
き、それにより得られた宿主細胞はＰＲＶ抗原性を示す
ポリペプチドを発現する。ＰＲＶ糖蛋白質遺伝子のいず
れのフラグメントも用いることができ、その結果ＰＲＶ
糖蛋白質の免疫原フラグメントまたはその同族体である
ポリペプチドを発現する。当該分野においてよく知られ
ている如く、遺伝コードの縮退はＰＲＶ糖蛋白質抗原性
を示すポリペプチドをコード付けする機能的に均等な遺
伝子またはそのフラグメントを産生するための塩基対の
容易な置換を可能とする。これらの機能的均等物も本発
明の範囲内に包含される。

【００４２】図１〜図５８は実施例の組立てを示すため
に掲げる。プラスミドおよびＤＮＡフラグメントを示す
のに以下の如くある約束事を用いる: (１)単一線の図は環状および直線状の二本鎖ＤＮＡを共
に表わす。 (２)星印(＊)は表わされた分子が環状であることを示
す。星印が無いのは分子が直線状であることを示す。 (３)注目するエンドヌクレアーゼ制限部位は直線の上方
に示す。 (４)遺伝子は直線の下方に示す。 (５)遺伝子および制限部位間の距離はスケール通りでは
ない。特に断りのない限り、図は相対的な位置のみを示
す。

【００４３】本発明を実施するのに用いる組換体ＤＮＡ
法のほとんどは当業者によく知られた標準的な方法であ
り、例えばモレキュラー・クローニング(Molecular Clo
ning)、ティ・マニアティスら(T．Maniatis et al.)、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold
Spring Harbor Laboratory)、(１９８２)およびビイ・
パーバル(B．Perbal)、ア・プラクティカル・ガイド・
トゥ・モレキュラー・クロウニング(A Practical Guide
to Molecular Cloning)、ジョン・ウイリイ・アンド・
サンズ(John Wiley ＆ Sons)、(１９８４)中に詳しく記
載されており、参照のためにここに挙げる。

【００４４】

【実施例】

実施例１本実施例においてはＰＲＶ糖蛋白質gp５０の配列決定、
クローニングおよび発現を記載する。１．gp５０遺伝子の配列決定 gp５０遺伝子をコード付けするＰＲＶライス(Rice)株Ｄ
ＮＡのＢamＨＩ７フラグメント(図１)をpＰＲＸh１[Ｎ
ＲＲＬＢ−１５７７２]、前掲、から単離し、継代ク
ローンしてプラスミドpＢＲ３２２のＢamＨＩ部位に入
れる(マニアティスら(Maniatis et al.)、前掲)。

【００４５】以下、図２〜５を参照して、ＰvuＩＩでＢ
amＨＩを消化し、２つのＢamＨＩ／ＰvuＩＩフラグメン
ト(１.５および４.９kb)を単離し次いでpＢＲ３２２の
ＢamＨＩおよびＰvuＩＩ部位間でそれらを継代クローン
することによる標準法を用いて該フラグメントをさらに
継代クローンして各々１.５および４.９kbフラグメント
を一体化するプラスミドpＰＲ２８−４およびpＰＲ２８
−１を得る(リーら(Rea et al.)、前掲、も参照)。これ
らの継代クローンはＤＮＡ配列決定実験のためのＤＮＡ
源として用いる。

【００４６】図６はgp５０遺伝子中に位置する各種制限
酵素切断部位およびフランキング領域を示す。前記で継
代クローンした１.５および４.９kbフラグメントをこれ
らの制限酵素で消化する。制限酵素によって生じた各末
端をポリヌクレオチドキナーゼを用いてγ−³²Ｐ−ＡＴ
Ｐでラベルし、マキサムおよびギルバート(Maxam andＧ
ilbert)、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methods
Enzymol.)、６５、４９９〜５６０(１９８０)の方法に
より配列する。完全な遺伝子を両鎖上に少なくとも２回
配列する。gp５０についてのＤＮＡ配列を配列表（配列
番号）に掲げる。このＤＮＡはＰＲＶに能動的に感染し
た動物を検知するのに用いることができる。例えば、鼻
もしくはのどを綿棒で拭いて試料採取し、次いで標準法
によりＤＮＡ／ＤＮＡ交雑を行ってＰＲＶの存在を検知
する。

【００４７】２．gp５０の発現以下、図７〜９を参照して、ＮarＩ切断部位はgp５０遺
伝子翻訳開始コードンから塩基対３５個だけ上流に位置
する。発現における第一工程はＮarＩ切断部位の地点に
おける便利なＢamＨＩ切断部位の挿入である。前記から
のプラスミドpＰＲ２８−４を制限エンドヌクレアーゼ
ＮarＩで消化してgp５０遺伝子の端部をコード付けする
Ｎ末端およびgＸ遺伝子の一部よりなるＤＮＡフラグメ
ント３を得る。ＢamＨＩリンカーをフラグメント３に加
え、該フラグメントをＢamＨＩで消化してgＸ配列を欠
失し、かくしてフラグメント４を得る。次いでＢamＨＩ
末端を結んでプラスミドpＰＲ２８−４Ｎar２を得
る。

【００４８】以下、図１０〜１２を参照して、完全なgp
５０遺伝子の組立てが示される。pＰＲ２８−４Ｎar
２をＢamＨＩおよびＰvuＩＩで消化してgp５０遺伝子の
Ｎ−末端コード付け部分よりなるフラグメント５(１６
０bp)を得る。また、前記からのプラスミドpＰＲ２８−
１をＰvuＩＩおよびＢamＨＩで消化してgp５０遺伝子の
Ｃ末端コード付け部分よりなる４.９kbフラグメントを
得る(フラグメント６)。(米国特許出願ＳＮ７６０１３
０号に記載されている如く組立てた)プラスミドpＰＧＸ
１、または別法としてプラスミドpＢＲ３２２をＢamＨ
Ｉで消化し、細菌アルカリホスファターゼ(ＢＡＰ)で処
理し、次いでフラグメント５および６で結んで完全なgp
５０遺伝子よりなるプラスミドpＢＧＰ５０−２３を得
る。

【００４９】以下、図１３〜１５を参照して、プラスミ
ドpＤ５０の産生が示される。プラスミドpＢＧ５０−２
３を制限酵素ＭaeＩＩＩで切断して(ケイ・シュミット
ら(K．Schmid et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ(Nucl．Acids Res.)、１２、２６１９頁(１９８
４))フラグメントの混合物を得る。ＭaeＩＩＩ末端をＴ
４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＥcoＲＩリン
カーを該平滑末端に加え、続いてＥcoＲＩ消化を行う。
得られたフラグメントをＢamＨＩで切断し、gp５０遺伝
子を含有する１.３kb ＢamＨＩ／ＥcoＲＩフラグメン
ト(フラグメント７)を単離する。(アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(American TypeCulture Co
llection)、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ(Beth
esda Reseach Laboratories)から得た。またはエス・ス
ブラマニら(S．Subramani et al.)、モレキュラー・ア
ンド・セリュラー・バイオロジー(Mol．Cell．Biol.)、
２、８５４〜６４頁(１９８１)の方法により合成した)
プラスミドpＳＶ２dhfrをＢamＨＩおよびＥcoＲＩで消
化し、より大きい(５.０kb)フラグメントを単離してジ
ヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)標識を含有するフラグメント
８を得る。次いでフラグメント７および８を結んでgp５
０遺伝子およびdhfr標識を含有するプラスミドpＤ５０
を得る。

【００５０】以下、図１６〜１８を参照して、ヒトサイ
トメガロウイルスタウネ(Towne)株からの即時型プロモ
ータをgp５０遺伝子より上流に加える。pＤ５０をＢam
ＨＩで消化し、細菌アルカリホスファターゼで処理して
フラグメント９を得る。ヒトサイトメガロウイルス(タ
ウネ(Towne))即時型プロモータを含有する７６０bpＳau
３Ａフラグメントを米国特許出願ＳＮ７５８５１７号に
記載された方法によって単離してフラグメント１０を得
る(ディ・アール・トムソンら(D．R．Thomson et a
l.)、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ(Proc．Natl．Acad. Sci.)Ｕ
ＳＡ、８１、６５９〜６３頁(１９８４)も参照)。次い
で、ＢamＨＩ／Ｓau３Ａ融合によってこれらのフラグメ
ントを結んでプラスミドpＤＩＥ５０を得る。プロモー
タがgp５０遺伝子を転写するのに適当な配位であること
を確認するために該プラスミドをＳacＩおよびＰvuＩＩ
で消化し、１８５bpフラグメントを得る。

【００５１】以下、図１９〜２３を参照して、ウシ成長
ホルモンポリアデニレーション信号を含有する０.６kb
ＰvuＩＩ／ＥcoＲＩフラグメントをＰvuＩＩおよびＥc
oＲＩでの消化によってプラスミドpＧＨ２Ｒ２から(ア
ール・ピイ・ウォイチックら(R．P．Woychik et al.)、
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucl．Acids Re
s.)、１０、７１９７〜７２１０頁(１９８２))から、あ
るいはpＳＶＣＯＷ７(前掲)から単離してフラグメント
１１を得る。

【００５２】フラグメント１１を(ファルマシア(Ｐharm
acia)／ＰＬまたはＡＴＣＣから入手した)pＵＣ９のＥc
oＲＩおよびＳmaＩ切断部位間にクローンする。pＣＯＷ
Ｔ１をＳalＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平
滑末端とし、ＥcoＲＩリンカーを加え、該ＤＮＡをＥco
ＲＩで切断し、０.６kbフラグメント(フラグメント１
２)を単離する。これは２個のＥcoＲＩ末端および１の
末端にポリリンカー配列を有する以外はフラグメント１
１と同一である。

【００５３】プラスミドpＤＩＥ５０をＥcoＲＩで切断
し、フラグメント１２をそれにクローンしてプラスミド
pＤＩＥ５０ＰＡを得る。ポリアデニレーション信号が
適当な配位である場合、ＢamＨＩおよびＰvuＩＩでの消
化により１.１kbのフラグメントを得る。該プラスミド
はプロモータ前のポリアデニレーション配列におけるク
ローニングによっても組立てることができる。

【００５４】プラスミドpＤＩＥ５０ＰＡを用いてサケ
精子キャリアＤＮＡとリン酸カルシウムとの共沈降(エ
フ・エル・グラハムおよびエイ・ジェイ・バン・デル・
エブ(F．L．Graham and A．J．Van Der Eb)、バイロロ
ジー(Virol.)、５２、４５６〜６７(１９７３))により
ＣＨＯ dhfr^- 細胞をトランスフェクトする(ＤＸＢ−
１１、ジイ・ウルラウブおよびエル・エイ・チャシン
(G．Urlaub and L．A．Chasin)、プロシーディングズ・
オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ(P
roc．Natl．Acad．Sci.)ＵＳＡ、７７、４２１６〜２０
(１９８０))。ジヒドロ葉酸還元酵素陽性(dhfr⁺)のトラ
ンスフェクトされた細胞をダルベッコの修正イーグル培
地＋イーグルの非須アミノ酸＋１０％胎児子ウシ血清中
で選択する。選択したdhfr⁺ＣＨＯ細胞は、抗gp５０単
クローン抗体３Ａ−４での免疫蛍光法により、あるいは
¹⁴Ｃ−グルコサミンでの標識および３Ａ−４での免疫沈
降によって検知されるgp５０を産生する。単クローン抗
体３Ａ−４は１９８５年１月９日出願の同時係属米国特
許出願ＳＮ８１７４２９号に記載されている如くに産生
される。免疫沈降反応は次に示す以外は前記した(ティ
・ジェイ・リーら(T．J．Rea et al.)、前掲)如くに行
う:まず抽出物を正常なマウス血清・続いて洗浄したス
タフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureu
s)細胞と共にインキュベートし、ベックマン(Beckman)
ＳＷ５０．１ローター中、４００００rpmにて３０分間
遠心する。抽出物を単クローンもしくは多クローン抗血
清とエス・アウレウス(S．Aureus)細胞と共にインキュ
ベートした後、１０mＭトリスＨＣl、pＨ７．０、１mＡ
ＥＤＴＡ、０.１ＭＮaＣl、１％ＮＰ４０および
０．５％デオキシコレート中で細胞を３回洗浄する。蛋
白質の分析は１１％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で
行う(エル・モースら(L．Morse et al.)、ジャーナル・
オブ・バイロロジー(J．Virol.)、２６、３８９〜４１
０頁(１９８４))。予備免疫蛍光アッセイにおいて、３
Ａ−４はpＤＩＥ５０ＰＡでトランスフェクトされたＣ
ＨＯ細胞と反応するがトランスフェクトされていないＣ
ＨＯ細胞とは反応しないことが判明した。トランスフェ
クトされたＣＨＯ細胞を¹⁴Ｃ−グルコサミンでラベルし
た場合、３Ａ−４はpＤＩＥ５０ＰＡを含有する細胞か
らラベルした蛋白質を免疫沈降させたが、ヒトレニンを
生成する対照細胞からは免疫沈降されなかった。沈降し
た蛋白質はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上でＰＲＶ
感染細胞からの３Ａ−４により沈降した蛋白質と一緒に
移動した。

【００５５】gp５０を産生するこれらのトランスフェク
トされたＣＨＯ細胞のクローンはローラー・ボトル(rol
ler bottle)中で増殖し、リン酸緩衝食塩水および１mＭ
ＥＤＴＡ中で収穫し、ワクチンとして使用するため
に完全フロイントアジュバント混合できる。

【００５６】また、gp５０遺伝子はワクチニアベクター
において発現することができる。この具体例において
は、pＢＧ５０−２３をＭaeＩＩＩで消化し次いでＴ４
ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした後、該ＤＮＡを
ＢamＨＩで消化する。gp５０遺伝子を含有する１.３Ｂa
mＨＩ／平滑末端フラグメントを単離する。プラスミドp
ＧＳ２０(マケットら(Mackett et al.)、ジャーナル・
オブ・バイロロジー(J．Virol.)４９、８７６〜６４頁
(１９８４))をＢamＨＩおよびＳmaＩで切断し、ゲル電
気泳動によってより大きい６．５kbフラグメントを単離
する。これらの２のフラグメントを一緒に結んでpＶＶ
５０を得る。プラスミドpＶＶ５０をトランスフェクト
してワクチニアウイルスのＷＲ株(ＡＴＣＣＶＲ−１
１９)で感染したＣＶ−１細胞(ＡＴＣＣＣＣＬ７０)
に入れ、マケットら(Mackett et al.)．ディ・エヌ・エ
イ・クロウニング(ＤＮＡＣloning)、ＩＩ巻:ア・プ
ラクティカル・アプローチ(A Practical Approach)、デ
ィ・エム・グロウバー(D．M．Glover)編、アイ・アール
・エル・プレス(ＩＲＬＰress)、オックスフォード
(１９８５)により記載されている方法により５−ブロモ
デオキシ−ウリジン(ＢＵdＲ)中で１４３細胞(ＡＴＣＣ
ＣＲＬ８３０３)上で平板培養することによってチ
ミジンキナーゼ陰性組換体について選択する。¹⁴Ｃ−グ
ルコサミンでの感染細胞の蛋白質のラベルおよび単クロ
ーン抗体３Ａ−４での免疫沈降によってアッセイを行っ
た如く、得られたウイルス・ワクチニア−gp５０は感染
細胞においてgp５０を発現した。

【００５７】実施例２本実施例では、実施例１のgp５０を免疫原剤として用い
るマウスおよびブタのＰＲＶ攻撃からの保護を記載す
る。後掲の表１〜３では、以下の如くにミクロ中和アッ
セイを行った:３％胎児子ウシ血清および抗生物質を補
足した基礎培地イーグル(ＢＭＥ)を用い、ミクロ滴定プ
レート(コスター(Costar))中で血清試料の系列的な２倍
希釈を行った。ＰＲＶの約１０００pfu(５０μl)を各希
釈物５０μlに添加した。マウス血清アッセイについて
は、１:５の希釈におけるウイルスの一部にラビット補
体が包含されていたが、ブタ血清アッセイについては包
含されていなかった。試料を３７℃にて１時間(ブタ血
清)または３時間(マウス血清)のいずれかインキュベー
トした。インキュベーション時間の後、イーグルの最小
必須培地中のブタ腎臓−１５(ＰＫ−１５)細胞(３００
０００細胞／ml)の一部５０μlをＰＲＶ試料につき各血
清に添加した。ひき続いて、試料を３７℃にて２日間イ
ンキュベートした。中和による力価は５０％の細胞を細
胞病理効果から保護した最高の希釈の逆数を表わす。

【００５８】表１はワクチニアウイルスにおいて産生さ
れたgp５０での免疫化による、ビルレントＰＲＶによる
攻撃からのマウスの保護を示す。２５μlでの尾乱切ま
たは５０μlでの肉趾経路によってマウスを免疫化し
た。攻撃の２８日前にマウスを免疫化した(攻撃の１４
日前に免疫化したＰＲ−Ｖacを投与したマウスを除
く)。

【００５９】

【表１】免疫化剤投与量経路中和力価^a ％生存^b (ＰＦＵ) gp５０３.０×１０⁷ 尾１０２４９３ gp５０６.０×１０⁷ 肉趾１０２４１００ gp５０７.５×１０⁶ 尾５１２９３ワクチニア^c ７.５×１０⁶ 尾＜８２７ＢＭＥ ^d −− 尾＜８２０ＰＲ−Ｖac ^e −− 肉趾５１２９０ ^a 攻撃日におけるＰＲＶに対する中和力価(＋補体)^b 腹腔内経路によりＰＲＶライス(Ｒice)株のＬＤ５０
の１０回分で攻撃した。^c 対照ウイルス^d 基礎培地イーグル、陰性対照^e ノルデン・ラボラトリーズ(Ｎorden Ｌaboratorie
s)、リンカーン、ネブラスカ州、不活性化ＰＲＶワクチ
ン、陽性対照

【００６０】表２はＣＨＯ細胞において産生されたgp５
０での免疫化による、ビルレントＰＲＶによる攻撃から
のマウスの保護を示す。攻撃の２８日前、１８日前およ
び７日前にマウスを免疫化した。第１投与できアジュバ
ントと共に調製物をマウスに皮下投与し、第２および第
３投与では食塩水中の調製物を腹腔内投与した。各マウ
スに１０⁶破壊細胞／投与で投与した。

【００６１】

【表２】免疫化剤／アジュバント中和力価^a ％生存^b gp５０／ＣＦＡ ^c ５１２１００(１０／１０) gp５０／ＣＦＡ(２投与) ＮＤ８０( ４／５) gp５０／ＩＦＡ ^d １０２４１００( ９／１０) gp５０／食塩水２５６１００( ３／３) ＣＨＯ−レニン^e／ＣＦＡ＜８１０( １／１０) 非処理＜８０( ０／１０) ＰＲ−Ｖac ^f ４０９６９０( ９／１０) ^a 攻撃日におけるＰＲＶに対する中和力価(＋補体)^b 肉趾経路によりＰＲＶライス(Rice)株のＬＤ５０の３
０回分で攻撃した。^c 完全フロイントアジュバント^d 不完全フロイントアジュバント^e レニンを発現する対照細胞^f ノルデン・ラボラトリーズ(Norden Laboratories)、
リンカーン、ネブラスカ州、不活性化ＰＲＶワクチン、
陽性対照

【００６２】表３はＣＨＯ細胞において産生したgp５０
での免疫化による、ビルレントＰＲＶによる攻撃からの
ブタの保護を示す。攻撃の２１日前および７日前にブタ
を免疫化した。投与当たり２×１０⁷個の破壊細胞をブ
タに与えた。最初の投与量は完全にフロイントアジュバ
ントと混合し、一方第２の投与量は食塩水中に懸濁し
た。両投与量は筋肉内投与した。

【００６３】

【表３】免疫化剤／アジュバント幾何平均の力価a ％生存b gp５０／ＣＦＡ２５１００ＣＨＯ−レニン／ＣＦＡ＜８０ ^a 攻撃日におけるＰＲＶに対する中和力価^b 鼻腔内経路によってＰＲＶライス(Ｒice)株１×１０⁵
pfu／ブタで攻撃した。

【００６４】gp５０は抗体の中和をひき起こし、致命的
なＰＲＶ攻撃からマウスおよびブタを保護することがで
きることをこれらの３つの表は示す。

【００６５】本発明のもう１つの態様において、発明者
らはgp５０のＣ末端端部についてコード付けするＤＮＡ
を除去することによって糖蛋白質gp５０の誘導体を得
た。得られたポリペプチドは細胞膜中にgp５０を固定す
るのに必要なアミノ酸配列について欠失を有する。哺乳
動物細胞において発現された場合、このgp５０誘導体は
培地中に分泌される。サブユニットワクチンとして用い
るためのこのgp５０誘導体の培地からの精製は全細胞の
分画よりもかなり簡単である。膜蛋白質を分泌蛋白質に
変換するためのアンカー配列の除去は最初インフルエン
ザ赤血球凝集素遺伝子について示された(エム・ジェイ
・ゲシングおよびジェイ・サンブルック(M．-J．Gethin
g and J．Sambrook)、ネイチャー(Nature)、３００、５
９８〜６０３頁(１９８２))。

【００６６】以下、図２４〜２７を参照して、前記から
のプラスミドpＤＩＥ５０をＳalＩおよびＥcoＲＩで消
化する。５.０および０.７kbフラグメントを単離する。
gp５０の一部をコード付けする０.７kbフラグメントを
Ｓau３Ａで消化し、０.５kbＳalＩ／Ｓau３Ａフラグ
メントを単離する。切断されたgp５０遺伝子後方の停止
コードンを産生するには、以下のオリゴヌクレオチドを
合成する（配列番号４）。 5' GATCGTCGGCTAGTGAGTAGGTAGG 3' 3' CAGCCGATCACTCATCCATCCTTAA ５’

【００６７】５．０kb ＥcoＲＩ／ＳalＩフラグメン
ト、０.５kb ＳalＩ／Ｓau３Ａフラグメントおよびア
ニールしたオリゴヌクレオチドを結んでプラスミドpＤ
ＩＥ５０Ｔを得る。ＥcoＲＩおよびＳalＩでの消化によ
り５８０bpフラグメントを得る。pＤＩＥ５０ＴをＥco
ＲＩで切断し、６ＧＨポリＡ部位を含有する０.６kb
ＥcoＲＩフラグメント(フラグメント１２)を中にクロ
ーンしてプラスミドpＤＩＥ５０ＴＰＡを得る。ポリア
デニレーション信号が適当な配位である場合、pＤＩＥ
５０ＴＰＡをＢamＨＩおよびＰvuＩＩで消化して９７０
bpフラグメントを得る。

【００６８】pＤＩＥ５０ＴＰＡを用いてＣＨＯ dhfr^-
細胞をトランスフェクトする。³⁵Ｓ−メチオニンでの
ラベルおよび免疫沈降によって検知される如く、選択し
たdhfr⁺ ＣＨＯ細胞はgp５０の切断形を産生し、それ
を培地中へ分泌する。

【００６９】実施例３本実施例において、発明者らはgp６３およびgＩ遺伝子
の単離、クローニングおよび配列決定を記載する。１．ライブラリーの組立て前記(ティ・ジェイ・リーら(T．J．Rea et al.)、前掲)
した如く、ＰＲＶゲノムＤＮＡを調製した。各回ともに
ブランソン(Ｂranson)２００超音波処理器を２に設定
し、ＰＲＶライス(Ｒice)株のＰＲＶゲノムＤＮＡを４
秒間で２回超音波処理することによって０.５〜３.０kb
のフラグメントを得た。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼでフ
ラグメントを平滑末端とした後、該フラグメントをキナ
ーゼ処理したＥcoＲＩリンカーに結んだ(ティ・マニア
ティスら(T．Maniatis et al.)、前掲)。ＥcoＲＩでの
過剰消化の後(ＰＲＶＤＮＡはＥcoＲＩ部位を含有し
ないので、メチル化は不必要であった)。アガロースゲ
ル電気泳動によって過剰のリンカーを除去した。所望の
サイズ範囲にあるＰＲＶＤＮＡフラグメントをガラス
スラリー法によって溶出した(ビイ・ボゲルステインお
よびディ・ギレスピー(b．Vogelstein and D．Gillespi
e)、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ(Proc．Natl．Acad．Sci．)Ｕ
ＳＡ、７６、６１５〜１９頁(１９７９))。最終的に１
０μlの容量とした５０mＭトリス(pＨ７.４)、１０mＭ
ＭgＣl₂、１０mＭジチオスレイトール、１mＭスペル
ミジン、１mＭＡＴＰ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ４００単
位(ニュー・イングランド・バイオラブズ(New England
Biolabs))中でＰＲＶＤＮＡフラグメント５００ng
をＥcoＲＩで消化したλgtＩＩ(アール・エイ・ヤング
およびアール・ダブリュー・デイビス(R．A．Young and
R．W．Davis)、前掲)ＤＮＡに結ぶことによって６１０
００λ／ＰＲＶ組換体(λＰＲＶ)のライブラリーを組立
てた。パッカジーン(Packgene)抽出物(プロメガ・バイ
オテク(Promega Biotec)、マジソン、ウイスコンシン
州)を用いて、結んだＤＮＡをバクテリオファージλウ
イルス粒子中に充填した。

【００７０】２．λＰＲＶラリブラリーのスクリーニン
グ前記(ジェイ・ジイ・ティミンズら(J．G．Timmins et a
l.)、前掲;アール・エイ・ヤングおよびアール・ダブリ
ュー・デイビス(R．A．Young and R．W．Davis)、前掲)
した如く、λＰＲＶライブラリーをスクリーニングし
た。２００００ファージを１５０mm ＬＢ−アンピシリ
ンプレートを介してスクリーニングした。ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲルから溶出したＰＲＶ感染細胞蛋白質
(ＩＣＰ)のサイズにより分画した画分をマウスに注射す
ることによってスクリーニングした抗血清を生成した
(ジェイ・ジイ・ティミンズら(J．G．Timmins et a
l.)、前掲)。抗血清でのスクリーニングに際し陽性信号
を与えるプラークを滅菌したパスツールピペットでアガ
ールから取り、ＳＭ緩衝液(ティ・マニアティスら(T．M
aniatis et al.)、前掲)１ml中に再懸濁し、再度スクリ
ーニングした。プラークが陽性に反応することについて
均質になるまでスクリーニングをくり返した。

【００７１】約４３０００λＰＲＶ組換体をマウス抗血
清でＰＲＶ感染ベロ(Ｖero)細胞蛋白質に対してスクリ
ーニングし、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから単離
した。６０の陽性λＰＲＶファージを単離した。

【００７２】３．ファージ株の調製プレート溶解物法(ティ・マニアティスら(T．Maniatis
et al.)、前掲)により高力価ファージ株(１０¹⁰〜１０
¹¹pfu／ml)を調製した。単一の十分単離した陽性信号プ
ラークを選択し、ＳＭ１mlに再懸濁した。懸濁液１００
μlを３７℃で１５分間、(アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション(American Type Culture Collectio
n)(ＡＴＣＣ)、ロックビル、メリーランド州から入手可
能な)イー・コリ(E．coli)Ｙ１０９０３００μlに吸
着させ、ＬＢ−頂部のアガロース１０mlで希釈し、１５
０mmのＬＢ−アンピシリンプレート上に一様に注ぎ、４
２℃にて一晩インキュベートした。頂部アガロースを火
炎処理したガラススライドで穏やかにかき取り、３０ml
のコレックス(Corex)試験管に移した。ＳＭ８mlおよび
クロロホルム２５０μlを加え、混合し、３７℃にて１
５分間インキュベートした。溶解物をＨＢ−４ローター
中、１００００rpmでの３０分間の遠心分離によって精
製した。ファージ株を０．３％クロロホルムと共に４℃
にて保存した。

【００７３】４．融合蛋白質の調製および分析ＬＢ培地(マニアティスら(Maniatis et al.)、前掲)を
イー・コリ(E．coli)Ｋ９５(sup^- 、λ^- 、gal^- 、s
tr^γ、nusＡ^- ; ディ・フリードマン(D．Friedman)、
前掲)の新たに一晩培養した培養物で１:５０にて接種
し、３０℃においてＯＤ₅₅₀＝０.５となるまで増殖し
た。培養物２５mlをλＰＲＶファージで５の多重度にて
感染し、４２℃の振盪水浴中で２５分間インキュベート
し、続いて２〜３時間で３７℃まで移した。ＨＢ−４ロ
ーター中、５０００rpmにて１０分間細胞をペレット化
し、１００mＭトリス(pＨ７.８)、３００mＭＮaＣlの
１００μlに再懸濁した。等容量の２×ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ試料緩衝液を加え、試料を１０分間沸騰した。エル
・モースら(L．Morse et al.)、ジャーナル・オブ・バ
イロロジー(J．Virol.)、２６、３８９〜４１０頁(１９
７８)に記載されている如く、分析用ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル上の電気泳動によって試料各５μlを分
析した。マウスの注射用に、融合ポリペプチドの調製を
１０倍にスケールアップした。ゲル片をコーマシーブル
ーで染色した後、β−ガラクトシダーゼ／ＰＲＶ融合ポ
リペプチドを単離した(エル・モースら(Ｌ．Ｍorse et
al．)、前掲;ケイ・ウェーバーおよびエム・オスボル
ン(K．Weber and M．Osborn)、ザ・プロテインズ(The P
roteins)、１、１７９〜２２３(１９７５))。分析用Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによって融合ポリペプチド量を見積もっ
た。λＰＲＶ感染イー・コリ(E．coli)Ｋ９５培養物か
らの細胞溶解物を９.２５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲルで電気泳動に付した。λgtＩＩ−感染対照がない
分子量１１６０００ダルトン以上の過剰産生ポリペプチ
ドバンドはβ−ガラクトシダーゼ−ＰＲＶ融合ポリペプ
チドであった。β−ガラクトシダーゼ−ＰＲＶ融合ポリ
ペプチドはサイズが１２９０００〜１５８０００ダルト
ンの範囲であった。融合ポリペプチド約５０〜７５μg
を完全フロイントアジュバント中に再懸濁し、マウスに
つき皮下および腹腔内注射した。後の注射は不完全フロ
イントアジュバント中で腹腔内に行った。

【００７４】５．抗血清分析前記(ティ・ジェイ・リーら(T．J．Rea et al.)、前掲)
した如く、¹⁴Ｃ−グルコサミンＩＣＰ、³⁵Ｓ−メチオニ
ンＩＣＰおよび¹⁴Ｃ−グルコサミンgＸの免疫沈降を行
った。これらの方法によりgp６３およびgＩがλgtＩＩ
組換体ファージ中に単離されたことが示された。発明者
らはこれらのファージをλ３７およびλ３６(gp６３)お
よびλ２３(gＩ)と命名した。

【００７５】６．λＤＮＡの小規模調製平板培養溶解物からバクテリオファージを迅速に単離し
た(ティ・ジェイ・シルハビイら(T．J．Silhavy et a
l.)、エクスペリメンツ・ウイズ・ジーン・ヒュージョ
ンズ(Experiments With Gene Fusions)、(１９８４))。
５％および４０％グリセロール段(ＳＭ緩衝液中で各３m
l)をＳＷ４１試験管中で重ねた。平板培養溶解物(〜６m
l)を重ね、４℃にて３５０００rpmで６０分間遠心分離
した。上澄みを捨て、ファージペレットをＳＭ１mlに再
懸濁した。ＤＮアーゼＩおよびＲＮアーゼＡを加えて１
μg／mlおよび１０μg／mlの最終濃度とした。３７℃で
の３０分間のインキュベーションの後、ＳＤＳミックス
(０.２５ＭＥＤＴＡ、０．５Ｍトリス(pＨ７.８)、
２．５％ＳＤＳ)２００μlおよびプロティナーゼＫ(〜
１mg／ml)を加え、６８℃にて３０分間インキュベート
した。λＤＮＡをフェノールで３回抽出し、クロロホル
ムで抽出し、エタノールで沈澱させた。平均１５０mmの
平板培養溶解物からλＤＮＡ５〜１０μgを得る。

【００７６】７．λＰＲＶＤＮＡ分析ＢamＨＩおよびＫpnＩでＰＲＶＤＮＡを完全に消化
し、０.８％アガロース中で電気泳動に付し、サザーン
(Southern)の方法によるニトロセルロースに移した(ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J．Mo
l．Biol.)、９８、５０３〜１７(１９７５))。ブロッテ
ィング物を４mm片にスライスし、２０〜２５℃にて乾燥
状態で保存した。λＰＲＶＤＮＡに対してニックトラ
ンスレーション(アメルスハム(Amersham))を行って約１
０⁸cpm／μgの特異的活性とする。６×ＳＳＣ、３０％
ホルムアミド、１×デンハルト(Denhardt)試薬(フィコ
ール(ficoll)、ポリビニルピロリドンおよびウシ血清ア
ルブミンの各０.０２％)、０.１％ＳＤＳ、５０μg／ml
異種ＤＮＡ中、プレ交雑を７０℃にて１時間行った。同
一溶液中、交雑を７０℃にて１６時間行った。１５分間
の洗浄を２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で２回、０.１×
ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳ中で２回、すべて２０〜２
０℃にて行った。ブロッティング物を〜７０℃にて一晩
増感板上でオートラジオグラフィーに付した。

【００７７】サザーンブロッティング法によって、λ２
３、λ３６およびλ３７中に含有されたＰＲＶ糖蛋白質
遺伝子をユニークな小領域中のＢamＨＩ７フラグメント
に対してマップした(ティ・ジェイ・リーら(T．J．Rea
et al.)、前掲)。図１に示す如くこのフラグメントのよ
り精密なマッピングはλ２３(gＩ)遺伝子に対して遠位
にマップされ、λ３７がＢamＨＩ７の内部領域に対して
マップされたことを示した。

【００７８】８．gp６３およびgＩ遺伝子の配列決定 λ３６およびλ３７中のＰＲＶＤＮＡはＳtuＩ切断部
位を含有することが決定された。ＢamＨＩ７フラグメン
ト中にはただ１つのＳtuＩ切断部位が存在する;従っ
て、ＳtuＩ切断部位を包含したオープンリーディングフ
レームは配列された。図２〜５は各種制限酵素切断部位
がgp６３遺伝子およびフランキング領域中に位置するこ
とを示す。ＢamＨＩ７を継代クローンし、これらの制限
酵素で消化した。マクサムおよびギルバート(Maxam and
Gilbert)、メソッズ・イン・エンザイモロジー(Method
s Enzymol.)、６５、４９９〜５６０(１９８０)の方法
により、ポリヌクレオチドキナーゼを用いて制限酵素に
よって生じた各末端をγ−³²Ｐ−ＡＴＰでラベルし、配
列した。

【００７９】pＵＣ１１２９から単離したＢamＨＩ１７
フラグメントをクローンしてプラスミドpＳＶ２ gptに
入れることによってプラスミドpＰＲ２８を得た(アール
・シイ・ムリガンおよびピイ・ベルグ(R．C．Mulligan
and P．Berg)、プロシーディングズ・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Proc．Natl．Aca
d．Sci.)ＵＳＡ、７８、２０７２〜７６(１９８１))。

【００８０】ＰvuＩＩでpＰＲ２８を消化し次いでイー
・コリ(E．coli)複製開始点およびbla遺伝子を含有する
切断片を再環化してgＩについてのＤＮＡ配列を含有す
る４．９kb ＰvuＩＩ／ＢamＨＩ７ＰＲＶフラグメン
トよりなるプラスミドを得ることによってプラスミドp
ＰＲ２８−１を得た。

【００８１】図２９はgＩ遺伝子およびフランキング領
域中に位置する各種制限酵素切断部位を示す。前記した
如くＢamＨＩ７を継代クローンし、消化し、ラベルし、
配列した。

【００８２】糖蛋白質gp６３およびgＩについてのＤＮ
Ａ配列を各々配列表（配列番号２および３）に示す。こ
のＤＮＡを用いてＰＲＶに能動的に感染した動物を検知
することができる。例えば、鼻またはのどを綿棒で拭い
て試料採取し、次いで標準的なＤＮＡ／ＤＮＡ交雑法に
よってＰＲＶの存在を検知できる。

【００８３】実施例４本実施例において、発明者らは哺乳動物におけるgＩの
発現を記載する。プラスミドpＰＲ２８(前記参照)をＢa
mＨＩで消化し、該フラグメントをアガロースゲル上で
分離し、次いでゲルから該フラグメントを切り取ること
によってgＩ遺伝子を含有するＢamＨＩ７フラグメント
を該プラスミドから単離する。

【００８４】以下、図３０〜３３を参照して、次いで前
記で単離したＢamＨＩ７フラグメントをクローンして
(ファルマシア(Pharmacia)／ＰＬから購入した)プラス
ミドpＵＣ１９中に入れてプラスミドＡを得る。プラス
ミドＡをＤraＩで消化する。ＤraＩはpＵＣ１９配列を
いくつかの箇所で切断するが、gp６３およびgＩ遺伝子
間のＢamＨＩ７配列においては一度だけしか切断せずに
(図１)なかんずくフラグメント１を得る。ＢamＨＩリン
カーをフラグメント１を包含するフラグメントのＤraＩ
末端上に結び、得られたフラグメント混合物をＢamＨＩ
で消化する。アガロースゲル電気泳動によって産生物フ
ラグメントを分離し、gＩ遺伝子を含有する２.５kbフラ
グメント２を精製する。フラグメント２をクローンして
ＢamＨＩで消化したpＵＣ１９に入れてプラスミドpＵＣ
Ｄ／Ｂを得る。かく産生した２のプラスミドのうち適当
な配位にあるgＩ遺伝子を含有するプラスミドをＢsmＩ
およびＥcoＲＩでプラスミドを消化することによって決
定する:該適当な配位にあるプラスミドは特徴的な７５
０bpＢsmＩ／ＥcoＲＩフラグメントを含有する。

【００８５】以下、図３４〜３９を参照して、プラスミ
ドpＵＣＤ／Ｂ(図３０〜３３)をＢsmＩおよびＥcoＲＩ
で消化し、より大きなフラグメント(フラグメント３、
４.４kb)をアガロースゲル電気泳動によって精製する。
以下の２種のオリゴヌクレオチドをよく知られた技術に
より化学的に合成するか、あるいはコマーシャル・カス
タム・シンセシス・サービス(Commercial custom synth
esis service)から購入する（配列番号５）。５’ ＣＧＣＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＴＡＣＣＧＧ
ＧＡＧＡＡＧ３’ ５’ ＡＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＣＧＧＴＡＴＴＴＡＡＧ
ＣＧＧＧＧＣＧＧＧ３’

【００８６】これらのオリゴヌクレオチドをフラグメン
ト３に結んでＢｓｍＩ切断によって欠失されたgＩ遺伝
子のＣ末端についてのコーディング配列を置き換える。
得られたプラスミドpＧＩはgＩコーディング配列から上
流のＢamＨＩ切断部位およびgＩコーディング配列から
下流のＥcoＲＩ切断部位を共に有するgＩ遺伝子の完全
なコーディング領域を含有する。

【００８７】プラスミドpＧＩをＥcoＲＩおよびＢamＨ
Ｉで消化し、gＩ遺伝子よりなる１.８kbフラグメント
(フラグメント４)をアガロースゲル上で精製する。

【００８８】プラスミドpＳＶ２dhfr(前掲)をＥcoＲＩ
で切断し、次いでＢamＨＩで切断してdhfr標識を含有す
る５.０kbフラグメント５を得、これをアガロースゲル
電気泳動により単離する。次いで、フラグメント４およ
び５を結んでジヒドロ葉酸還元酵素およびアンピシリン
耐性標識、ＳＶ４０プロモータおよび複製開始点ならび
にgＩ遺伝子よりなるプラスミドpＤＧＩを得る。

【００８９】以下、図４０〜４９を参照して、ヒトサイ
トメガロウイルスタウネ(Ｔowne)株からの即時型プロモ
ータをgＩ遺伝子より上流に加える。プラスミドpＤＧＩ
をＢamＨＩで消化してフラグメント６を得る。ヒトサイ
トメガロウイルス(タウネ(Towme))即時型プロモータを
単離(前掲)してフラグメント７を得る。次いでフラグメ
ント６および７を結んでプラスミドpＤＩＥＧＩdhfrを
得る。該プロモータが適当な配位にあることを確認する
ために該プラスミドをＳacＩおよびＢstＥＩＩ制限酵素
で消化する。約４００bpのフラグメントの産生は適当な
配位を示す。

【００９０】ウシ成長ホルモンポリアデニレーション信
号を含有する０.６kb ＰvuＩＩ／ＥcoＲＩフラグメン
トをプラスミドpＳＶＣＯＷ７(前掲)から単離してフラ
グメント８を得る。フラグメント８をpＵＣ９のＳmaＩ
／ＥcoＲＩ部位(前掲)と交差してクローンしてプラスミ
ドpＣＯＷＴ１を得る。pＣＯＷＴ１をＳalＩで切断し、
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＥcoＲＩリンカーを
その上に結ぶ。次いで、かく産生したフラグメント混合
物をＥcoＲＩで消化し、０.６kbフラグメントを単離す
る(フラグメント９)。フラグメント９をpＵＣ１９のＥc
oＲＩ部位にクローンしてプラスミドpＣＯＷＴ１Ｅを得
る。pＣＯＷＴ１ＥをＥcoＲＩで消化してフラグメント
１０(６００bp)を得る。

【００９１】プラスミドpＤＩＥＧＩdhfrをＥcoＲＩで
消化し、bＧＨポリアデニレーション信号を含有するフ
ラグメント１０で結んでプラスミドpＤＩＥＧＩＰＡを
得る。gＩ遺伝子を適当な配位で有するプラスミドをＢa
mＨＩおよびＢstＩＩでの消化に際しての１４００bpフ
ラグメントの産生によって証明する。

【００９２】得られたプラスミドをdhfr^-チャイニーズ
ハムスター卵巣細胞にトランスフェクトして、dhfr＋細
胞を選択してgＩを発現する細胞系を得る(スブラマニら
(Subramani et al.)、モレキュラー・アンド・セリュラ
ー・バイオロジー(Mol．Cell．Biol.)、１、８５４〜６
４頁(１９８１))。メトトレキセートの濃度を次第に高
くする増殖で生き残るトランスフェクトした細胞のクロ
ーンを選択することによってgＩの発現を増大させる(マ
ッコルミックら(McＣormick et al.)、モレキュラー・
アンド・セリュラー・バイオロジー(Mol．Cell．Bio
l.)、４、１６６〜７２頁(１９８４))。

【００９３】実施例５本実施例において、発明者らは哺乳動物細胞におけるgp
６３の発現を記載する。ＰＲＶＤＮＡのＢamＨＩ７フ
ラグメント(前掲)をpＰＲＸh１[ＮＲＲＬＢ−１５７
７２]から単離し、gp６３遺伝子のより多くのコピーを
配列しかつ産生するのに使用するために実施例１におけ
る如く、プラスミドpＢＲ３２２のＢamＨＩ部位に継代
クローンする。

【００９４】以下、図５０〜５５を参照して、ＢamＨＩ
７をＢstＥＩＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで末
端を処理し、次いでＫpnＩで切断することによってＢam
ＨＩ７の内部から１.９kb ＢstＥＩＩ／ＫpnＩフラグ
メント(フラグメント１)を継代クローンする。フラグメ
ント１を単離し、(ファルマシア(Pharmacia)／ＰＬ、ピ
スカタウェイ、ニュージャージー州から購入した)pＵＣ
１９中のＫpnＩおよびＳmaＩ部位間にクローンしてプラ
スミドpＰＲ２８−１ＢＫを得る。

【００９５】プラスミドpＰＲ２８−１ＢＫをＤraＩと
ＭaeＩＩＩで切断して１.１kbフラグメント２を得る。
ＤraＩ切断部位はgp６３遺伝子のコーディング領域の外
部かつそのポリアデニレーション信号から下流にある。
ＭaeＩＩＩ切断部位はgp６３遺伝子のＡＴＧ翻訳開始コ
ードンから下流の２１塩基を切断する。gp６３遺伝子か
ら除去したコーディング領域を置き換えるために、以下
の２種のオリゴヌクレオチドを化学的に合成するか、あ
るいはコマーシャル・カスタム・シンセシス・サービス
(commercial custom synthesis service)から購入する
(フラグメント４) （配列番号６）: 5' GATCCGCAGTACCGGCGTCGATGATGATGGTGGCGCGCGAC 3' 3' GCGTCATGGCCGCAGCTACTACTACCACCGCGCGCTGCACTG 5'

【００９６】プラスミドＰＳＶ２dhfr、前掲、をＥcoＲ
Ｉで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、次い
でＢamＨＩで切断し、より大きい(５.０kb)フラグメン
トを単離してdhfr標識を含有するフラグメント４を得
る。次いでフラグメント２、３および４を結んでプラス
ミドpＧＰ６３dhfrを得る。

【００９７】以下、図５６〜５８を参照して、ヒトサイ
トメガロウイルスタウネ(Ｔowne)株からの即時型プロモ
ータをgp６３遺伝子より上流に加える。pＧＰ６３dhfr
をＢamＨＩで消化し、細菌アルカリホスファターゼで処
理してフラグメント５を得る。ヒトサイトメガロウイル
ス(タウネ(Ｔowne))即時型プロモータを含有する７６０
bp Ｓau３Ａフラグメントを単離してフラグメント６を
得る。次いでこれらのフラグメントを結んでプラスミド
pＩＥＧＰ６３dhfrを得る。該プロモータが適当な配位
にあることを確認するために該プラスミドをＳacＩおよ
びＰvuＩＩで消化し、１５０bpフラグメントを得る。

【００９８】得られたプラスミドをdhfr^-チャイニーズ
ハムスター卵巣細胞にトランスフェクトし、dhfr⁺細胞
を選択してgp６３を発現する細胞系を得る。この系によ
るgp６３の合成レベルは余りにも低くて発明者らが用い
る方法によっては検出できず、発明者らは後記する如く
ワクチニアウイルス中でポリペプチドを産生した。

【００９９】実施例６本実施例において、発明者らはワクチニアウイルスにお
けるgp６３の発現を記載する。用いる方法は前記したも
のの他の合成態様としてここに挙げる。実施例５に従っ
てフラグメント１、２、３および４を得る。

【０１００】プラスミドpＧＳ２０(マケットら(Mackett
et al.)、ジャーナル・オブ・バイロロジー(J．Viro
l.)、４９、８５７〜６４頁(１９８４))をＢamＨＩおよ
びＳmaＩで切断し、ゲル電気泳動によってより大きい
６.５kbフラグメントを単離する。フラグメント２、オ
リゴヌクレオチド、およびpＧＳ２０フラグメントを一
緒に結んでプラスミドpＶＶ６３を得る。このプラスミ
ドをワクチニアウイルスのＷＲ株(ＡＴＣＣＶＲ−１
１９)で感染したＣＶ−１細胞(ＡＴＣＣＣＣＬ７０)
にトランスフェクトし、マケットら(Mackett et al.)、
ディ・エヌ・エイ・クローニング(ＤＮＡ Cloning)、
巻ＩＩ:ア・プラクティカル・アプローチ(A Practical
Approach)、ディ・エム・グローバー(D．M．Glover)
編、アイ・アール・エル・プレス(ＩＲＬＰress)、オ
ックスフォード(１９８５)により記載された方法によっ
て、ＢＵdＲ中の１４３細胞(ＡＴＣＣＣＲＬ８３０
３)上でプレート化することによってチミジンキナーゼ
陰性組換体について選択する。¹⁴Ｃ−グルコサミンで感
染した蛋白質をラベルし、抗−gp６３抗血清で免疫沈降
することによってアッセイを行う如く、得られたウイル
ス、ワクチニア−gp６３は感染した細胞においてgp５０
を発現する。

【０１０１】すべて前記したプラスミドpＧＩからのＢa
mＨＩ／ＥcoＲＩフラグメント、プラスミドpＰＲ２８−
１ＢＫからのＤraＩ／ＭaeＩＩＩフラグメント、または
pＢＧＰ５０−２３からのＢamＨＩ／ＭaeＩＩＩフラグ
メントはリーら(Rea et al.)、前掲に記載されている如
く、Ｂa１３１で処理し、(同時係属米国特許出願ＳＮ６
０６３０７号に記載されている如く産生した)pＴＲＺ４
中に挿入し、イー・コリ(E．coli)を形質転換するのに
用いることもできる。この方法により、gp５０、gp６３
およびgＩはイー・コリ(E．coli)における融合蛋白質と
して得られる。

【０１０２】また、前記実施例におけるpＳＶ２dhfrの
代わりに例えば(アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション(American Type Culture Collection)から入
手可能な)pＳＶ２neoをもいることによって、ＰＲＶ糖
蛋白質遺伝子よりなる組換体プラスミドを形質転換して
他の宿主細胞に入れることができる。形質転換された細
胞はプラスミドによってコード付けされた抗生物質Ｇ４
１８に対する耐性によって選択される。

【０１０３】また、本発明のポリペプチドを以下の如く
に昆虫細胞において発現することもできる:ＢamＨＩリ
ンカーをpＤ５０のＥcoＲＩ部位上に置き次いでＢamＨ
Ｉで消化することによって、またはＢamＨＩリンカーを
pＧＰ６３dhfrのＥcoＲＩ部位上に置き次いでＢamＨＩ
で消化することによって、あるいはＢamＨＩでＰＵＣＤ
／Ｂを消化することによって、各々gp５０、gp６３また
はgＩ遺伝子を含有するＢamＨＩフラグメントを得るこ
とができる。これらのＢamＨＩフラグメントはpＡＣ３
７３中のポリヘドリンプロモータから下流のＢamＨＩに
クローンすることができる(モレキュラー・アンド・セ
リュラー・バイオロジー(Mol．Cell．Biol.)、５、２８
６０〜６５頁(１９８５))。かく産生されたプラスミド
はバクロウイルスアウトグラファ・カリフォルニカ(Aut
ographa californica)からのＤＮＡで共トランスフェ
クトしてＳf９細胞に入れ、本明細書に記載した方法に
よって組換体ウイルスを単離できる。これらの組換体ウ
イルスはＳf９細胞を感染するに際しgp５０、gp６３ま
たはgＩを産生する。

【０１０４】本発明の糖蛋白質またはその免疫原フラグ
メントを利用して調製したワクチンは固定した宿主細
胞、宿主細胞抽出物、あるいは宿主細胞からのまたは化
学合成により生成した部分的にまたは完全に精製したＰ
ＲＶ糖蛋白質調製物から成ることができる。本発明に従
って調製したＰＲＶ糖蛋白質免疫原は、好ましくは、Ｐ
ＲＶウイルスを含まない。かくして、本発明のワクチン
免疫原はＰＲＶ抗原性を示す実質的にすべての所望の免
疫原ＰＲＶポリペプチドおよび／または他のポリペプチ
ドよりなる。

【０１０５】免疫原はよく知られた方法によりワクチン
投与形態に調製できる。該ワクチンは筋肉内、皮下また
は鼻腔内投与できる。筋肉内注射の如き非経口投与に
は、免疫原は適当な担体と組み合すことができ、例えば
水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミ
ニウムカリウム(alum)、硫酸ベリリウム、シリカ、カロ
リン、カーボン、油中水型エマルジョン、水中油型エマ
ルジョン、ムラミルジペプチド、細菌内毒素、脂質Ｘ、
コリネバクテリウム・パルバム(Corynebacteriumparvu
m)(プロピオノバクテリウム・アクネス(Propionobacter
ium acnes))、ボルデテラ・ペルトゥスシス(Bordetell
a pertussis)、ポリリボヌクレオチド、アルギン酸ナ
トリウム、ラノリン、リゾレシチン、ビタミンＡ、サポ
ニン、リポソーム、レバミソール、ＤＥＡＥ−デキスト
ラン、ブロック共重合体もしくは他の合成アジュバント
を包含する各種アジュバントまたは免疫調整剤と共にま
たはそれなしで水、食塩水または緩衝ビヒクルに入れて
投与できる。かかるアジュバントは各種供給源、例えば
メルクアジュバント(Merk Adjuvant)６５(メルク・アン
ド・カンパニー・インコーポレイティッド(Merk and Co
mpany、Inc.)、ラーウェイ(Rahway)、ニュージャージー
州)より商業的に入手可能である。もう１つの適当なア
ジュバントはフロイントの不完全アジュバント(ディフ
コ・ラボラトリーズ(Difco Laboratories)、デトロイ
ト、ミシガン州)である。

【０１０６】免疫原およびアジュバントの割合は双方が
有効量で存在する限り、広範囲にわたって変化させるこ
とができる。例えば、水酸化アルミニウムはワクチン混
合物の約０．５％の量で存在させることができる(Ａl₂
Ｏ₃ベース)。投与量ベース当たりについては、免疫原の
濃度はブタ当たり約１.０μg〜約１００mgの範囲とする
ことができる。好ましい範囲はブタ当たり約１００μg
〜約３．０mgである。適当な投与量容量は約１〜１０m
l、好ましくは約１.０mlである。従って、筋肉内注射用
の投与量は、例えば０.５％水酸化アルミニウムとの混
合物中に免疫原１.０mgを含有する１mlよりなる。匹敵
する投与形態は幼少のブタに対する非経口投与用にも調
製できるが、免疫原の量は例えば投与量当たり約０.２
５〜約１.０mgとより少なくなる。

【０１０７】雌ブタのワクチン接種については、二投与
量法を用いることができる。第１の投与量は分娩の約数
カ月前から約５〜７週間前に投与することができる。次
いで、ワクチンの第２の投与量は第１の投与の数週間
後、例えば約２〜４週間後に投与すべきであり、次いで
分娩までであって分娩前にワクチンを投与できる。別法
として、ワクチンは単一の２mlの投与量として、例えば
分娩の約５〜７週間前に投与することができる。しかし
ながら、幼少ブタの最も効果的な免疫化には二投与法が
好ましいと考えられる。半年ごとの再ワクチン接種が動
物を飼育するのに対して推薦される。雄ブタはいつ再ワ
クチン接種してもよい。また、雌ブタは飼育前に再ワク
チン接種することもできる。ワクチン接種していない雌
ブタから生まれた子ブタは約３〜１０日に、その後再び
４〜６カ月におよび毎年、あるいは好ましくは半年ごと
にワクチン接種できる。

【０１０８】また、該ワクチンを他の病気についての他
のワクチンと組合せて多価ワクチンを得ることもでき
る。また、他の薬剤、例えば抗生物質と組合すこともで
きる。ワクチンの医薬的有効量を医薬上許容される担体
または希釈剤と共に用いてブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、
および他の動物の如き動物をワクチン接種できる。

【０１０９】例えばアイ・ティザード(I．Tizard)、ア
ン・イントラダクション・トゥ・ベテリナリ・イミュノ
ロジー(An Introduction to Veterinary Immunology)、
第２版(１９８２)に記載されている如く、当業者によく
知られた方法により他のワクチンを調製することがで
き、ここに参照のために挙げる。

【０１１０】前記した如く、市販のワクチンＰＲＶはg
Ｉおよびgp６３遺伝子が欠失していることが判明してい
る。従って、本発明の方法により産生したgＩおよびgp
６３ポリペプチドを診断剤として用いてこれらの市販ワ
クチンを接種した動物とビルレントウイルスに感染した
動物とを識別することができる。

【０１１１】感染動物とワクチン接種動物とを区別する
には、例えばエライサアッセイを用いることができる。
例えば組換体ＤＮＡ法(リーら(Rea et al.)、前掲)によ
りイー・コリ(E．coli)中で産生したgＩまたはgp６３蛋
白質を適当なプラスチック製プレートのウエルに加え、
十分な時間を与えてプラスチックに吸着させる(例え
ば、一晩、２０〜２５℃)。プレートを洗浄し、ブロッ
キング剤(例えば、ＢＳＡ)を加えてプラスチック表面上
のいずれの未反応部位も中和する。続いて洗浄し、次い
でブタ血清をウエルに加える。２０〜２５℃における１
時間のインキュベーションの後、ウエルを洗浄し、蛋白
質Ａ−セイヨウワサビペルオキシダーゼ配合体を２５〜
２５℃における約１時間のインキュベーションの間の各
ウエルに加える。さらに洗浄し、酵素基質(Ｏ−フェニ
レンジアミン)をウエルに加え、酸で反応を停止する。
４９２ナノメータにて吸光度を測定して血清中に存在す
るgＩもしくはgp６３抗体を定量する。gＩおよびgp６３
を欠くことは動物が感染していないことを示す。他のＰ
ＲＶ抗原についてテストすることによって、与えられた
動物がワクチン接種を受けたか否かを決定することがで
きる。

【０１１２】

【発明の効果】本発明により提供されるＰＲＶ糖蛋白質
のいくつかはＰＲＶ感染についての特殊症状をつくりだ
すのに有用であり、また、ＰＲＶに対するワクチンを生
産するのに有用である。

【０１１３】

【配列表】

【０１１４】配列番号：１配列の長さ：１２０９配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列： ATG CTG CTC GCA GCG CTA TTG GCG GCG CTG GTC GCC CGG ACG ACG CTC 48 Met Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Leu Val Ala Arg Thr Thr Leu 1 5 10 15 GGT GCG GAC GTG GAC GCC GTG CCC GCG CCG ACC TTC CCC CCG CCC GCG 96 Gly Ala Asp Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Thr Phe Pro Pro Pro Ala 20 25 30 TAC CCG TAC ACC GAG TCG TGG CAG CTG ACG CTG ACG ACG GTC CCC TCG 144 Tyr Pro Tyr Thr Glu Ser Trp Gln Leu Thr Leu Thr Thr Val Pro Ser 35 40 45 CCC TTC GTC GGC CCC GCG GAC GTC TAC CAC ACG CGC CCG CTG GAG GAC 192 Pro Phe Val Gly Pro Ala Asp Val Tyr His Thr Arg Pro Leu Glu Asp 50 55 60 CCG TGC GCG GTG GTG GCG CTG ATC TCC GAC CCG CAG GTG GAC CGG CTG 240 Pro Cys Gly Val Val Ala Leu Ile Ser Asp Pro Gln Val Asp Arg Leu 65 70 75 80 CTG AAC GAG GCG GTG GCC CAC CGG CGG CCC ACG TAC CGC GCC CAC GTG 288 Leu Asn Glu Ala Val Ala His Arg Arg Pro Thr Tyr Arg Ala His Val 85 90 95 GCC TGG TAC CGC ATC GCG GAC GGG TGC GCA CAC CTG CTG TAC TTT ATC 336 Ala Trp Tyr Arg Ile Ala Asp Gly Cys Ala His Leu Leu Tyr Phe Ile 100 105 110 GAG TAC GCC GAC TGC GAC CCC AGG CAG GTC TTT GGG CGC TGC CGG CGC 384 Glu Tyr Ala Asp Cys Asp Pro Arg Gln Val Phe Gly Arg Cys Arg Arg 115 120 125 CGC ACC ACG CCG ATG TGG TGG ACC CCG TCC GCG GAC TAC ATG TTC CCC 432 Arg Thr Thr Pro Met Trp Trp Thr Pro Ser Ala Asp Tyr Met Phe Pro 130 135 140 ACG GAG GAC GAG CTG GGG CTG CTC ATG GTG GCC CCG GGG CGG TTC AAC 480 Thr Glu Asp Glu Leu Gly Leu Leu Met Val Ala Pro Gly Arg Phe Asn 145 150 155 160 GAG GGC CAG TAC CGG CGC CTG GTG TCC GTC GAC GGC GTG AAC ATC CTC 528 Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Leu Val Ser Val Asp Gly Val Asn Ile Leu 165 170 175 ACC GAC TTC ATG GTG GCG CTC CCC GAG GGG CAA GAG TGC CCG TTC GCC 576 Thr Asp Phe Met Val Ala Leu Pro Glu Gly Gln Glu Cys Pro Phe Ala 180 185 190 CGC GTG GAC CAG CAC CGC ACG TAC AAG TTC GGC GCG TGC TGG AGC GAC 624 Arg Val Asp Gln His Arg Thr Tyr Lys Phe Gly Ala Cys Trp Ser Asp 195 200 205 GAC AGC TTC AAG CGG GGC GTG GAC GTG ATG CGA TTC CTG ACG CCG TTC 672 Asp Ser Phe Lys Arg Gly Val Asp Val Met Arg Phe Leu Thr Pro Phe 210 215 220 TAC CAG CAG CCC CCG CAC CGG GAG GTG GTG AAC TAC TGG TAG CGC AAG 720 Tyr Gln Gln Pro Pro His Arg Glu Val Val Asn Tyr Trp Tyr Arg Lys 225 230 235 240 AAC GGC CGG ACG CTC CCG CGG GCC CAC GCC GCC GCC ACG CCG TAC GCC 768 Asn Gly Arg Thr Leu Pro Arg Ala His Ala Ala Ala Thr Pro Tyr Ala 245 250 255 ATC GAC CCC GCG CGG CCC TCG GCG GGC TCG CCG AGG CCC CGG CCC CGG 816 Ile Asp Pro Ala Arg Pro Ser Ala Gly Ser Pro Arg Pro Arg Pro Arg 260 265 270 CCC CGG CCC CGG CCC CGG CCG AAG CCC GAG CCC GCC CCG GCG ACG CCC 864 Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Lys Pro Glu Pro Ala Pro Ala Thr Pro 275 280 285 GCG CCC CCC GAC CGC CTG CCC GAG CCG GCG ACG CGG GAC CAC GCC GCC 912 Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Pro Ala Thr Arg Asp His Ala Ala 290 295 300 GGG GGC CGC CCC ACG CCG CGA CCC CCG AGG CCC GAG ACG CCG CAC CGC 960 Gly Gly Arg Pro Thr Pro Arg Pro Pro Arg Pro Glu Thr Pro His Arg 305 310 315 320 CCC TTC GCC CCG CCG GCC GTC GTG CCC AGC GGG TGG CCG CAG CCC GCG 1008 Pro Phe Ala Pro Pro Ala Val Val Pro Ser Gly Trp Pro Gln Pro Ala 325 330 335 GAG CCG TTC CAG CCG CGG ACC CCC GCC GCG CCG GGC GTC TCG CGC CAC 1056 Glu Pro Phe Gln Pro Arg Thr Pro Ala Ala Pro Gly Val Ser Arg His 340 345 350 CGC TCG GTG ATC GTC GGC ACG GGC ACC GCG ATG GGC GCG CTC CTG GTG 1104 Arg Ser Val Ile Val Gly Thr Gly Thr Ala Met Gly Ala Leu Leu Val 355 360 365 GGC GTG TGC GTC TAC ATC TTC TTC CGC CTG AGG GGG GCG AAG GGG TAT 1152 Gly Val Cys Val Tyr Ile Phe Phe Arg Leu Arg Gly Ala Lys Gly Tyr 370 375 380 CGC CTC CTG GGC GGT CCC GCG GAC GCC GAC GAG CTA AAA GCG CAG CCC 1200 Arg Leu Leu Gly Gly Pro Ala Asp Ala Asp Glu Leu Lys Ala Gln Pro 385 390 395 400 GGT CCG TAG Gly Pro

【０１１５】配列番号：２配列の長さ：１０５３配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列： ATG ATG ATG GTG GCG CGC GAC GTG ACC CGG CTC CCC GCG GGG CTC CTC 48 Met Met Met Val Ala Arg Asp Val Thr Arg Leu Pro Ala Gly Leu Leu 1 5 10 15 CTC GCC GCC CTG ACC CTG GCC GCC CTG ACC CCG CGC GTC GGG GGC GTC 96 Leu Ala Ala Leu Thr Leu Ala Ala Leu Thr Pro Arg Val Gly Gly Val 20 25 30 CTC TTC AGG GGC GCC GGC GTC AGC GTG CAC GTC GCC GGG AGC GCC GTC 144 Leu Phe Arg Gly Ala Aly Val Ser Val His Val Ala Gly Ser Ala Val 35 40 45 CTC GTG CCC GGC GAC GCG CCC AAC CTG ACG ATC GAC GGG ACG CTG CTG 192 Leu Val Pro Gly Asp Ala Pro Asn Leu Thr Ile Asp Gly Thr Leu Leu 50 55 60 TTT CTG GAG GGG CCC TCG CCG AGC AAC TAC AGC GGG CGC GTG GAG CTG 240 Phe Leu Glu Gly Pro Ser Pro Ser Asn Tyr Ser Gly Arg Val Glu Leu 65 70 75 80 CTG CGC CTC GAC CCC AAG CGC GCC TGC TAC ACG CGC GAG TAC GCC GCC 288 Leu Arg Leu Asp Pro Lys Arg Ala Cys Tyr Thr Arg Glu Tyr Ala Ala 85 90 95 GAG TAC GAC CTC TGC CCC CGC GTG CAC CAC GAG GCC TTC CGC GGC TGT 336 Glu Tyr Asp Leu Cys Pro Arg Val His His Glu Ala Phe Arg Gly Cys 100 105 110 CTG CGC AAG CGC GAG CCG CTC GCC CGG CGC GCG TCC GCC GCG GTG GAG 384 Leu Arg Lys Arg Glu Pro Leu Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Val Glu 115 120 125 GCG CGC CGG CTG CTG TTC GTC TCG CGC CCG GCC CCG CCG GAC GCG GGG 432 Ala Arg Arg Leu Leu Phe Val Ser Arg Pro Ala Pro Pro Asp Ala Gly 130 135 140 TCG TAC GTG CTG CGG GTC CGC GTG AAC GGG ACC ACG GAC CTC TTT GTG 480 Ser Tyr Val Leu Arg Val Arg Val Asn Gly Thr Thr Asp Leu Phe Val 145 150 155 160 CTG ACG GCC CTG GTG CCG CCC AGG GGG CGC CCC CAC CAC CCC ACG CCG 528 Leu Thr Ala Leu Val Pro Pro Arg Gly Arg Pro His His Pro Thr Pro 165 170 175 TCG TCC GCG GAC GAG TGC CGG CCT GTC GTC GGA TCG TGG CAC GAC AGC 576 Ser Ser Ala Asp Glu Cys Arg Pro Val Val Gly Ser Trp His Asp Ser 180 185 190 CTG CGC GTC GTG GAC CCC GCC GAG GAC GCC GTG TTC ACC ACG CCG CCC 624 Leu Arg Val Val Asp Pro Ala Glu Asp Ala Val Phe Thr Thr Pro Pro 195 200 205 CCG ATC GAG CCA GAG CCG CCG ACG ACC CCC GCG CCC CCC CGG GGG ACC 672 Pro Ile Glu Pro Glu Pro Pro Thr Thr Pro Ala Pro Pro Arg Gly Thr 210 215 220 GGC GCC ACC CCC GAG CCC CGC TCC GAC GAA GAG GAG GAG GAC GAG GAG 720 Gly Ala Thr Pro Glu Pro Arg Ser Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu 225 230 235 240 GGG GCG ACG ACG GCG ATG ACC CCG GTG CCC GGG ACC CTG GAC GCG AAC 768 Gly Ala Thr Thr Ala Met Thr Pro Val Pro Gly Thr Leu Asp Ala Asn 245 250 255 GGC ACG ATG GTG CTG AAC GCC AGC GTC GTG TCG CGC GTC CTG CTC GCC 816 Gly Thr Met Val Leu Asn Ala Ser Val Val Ser Arg Val Leu Leu Ala 260 265 270 GCC GCC AAC GCC ACG GCG GGC GCC CGG GGC CCC GGG AAG ATA GCC ATG 864 Ala Ala Asn Ala Thr Ala Gly Ala Arg Gly Pro Gly Lys Ile Ala Met 275 280 285 GTG CTG GGG CCC ACG ATC GTC GTC CTC CTG ATC TTC TTG GGC GGG GTC 912 Val Leu Gly Pro Thr Ile Val Val Leu Leu Ile Phe Leu Gly Gly Val 290 295 300 GCC TGC GCG GCC CGG CGC TGC GCG CGC GGA ATC GCA TCT ACC GGC CGC 960 Ala Cys Ala Ala Arg Arg Cys Ala Arg Gly Ile Ala Ser Thr Gly Arg 305 310 315 320 GAC CCG GGC GCG GCC CGG CGG TCC ACG CGC CGC CCC CGC GGC GCC CGC 1008 Asp Pro Gly Ala Ala Arg Arg Ser Thr Arg Arg Pro Arg Gly Ala Arg 325 330 335 CCC CCA ACC CCG TCG CCG GGG CGC CCG TCC CCC AGC CCA AGA TGA Pro Pro Thr Pro Ser Pro Gly Arg Pro Ser Pro Ser Pro Arg 340 345 350

【０１１６】配列番号：３配列の長さ：１７３４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列： ATG CGG CCC TTT CTG CTG CGC GCC GCG CAG CTC CTG GCG CTG CTG GCC 48 Met Arg Pro Phe Leu Leu Arg Ala Ala Gln Leu Leu Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15 CTG GCG CTC TCC ACC GAG GCC CCG AGC CTC TCC GCC GAG ACG ACC CCG 96 Leu Ala Leu Ser Thr Glu Ala Pro Ser Leu Ser Ala Glu Thr Thr Pro 20 25 30 GGC CCC GTC ACC GAG GTC CCG AGT CCC TCG GCC GAG GTC TGG GAC CTC 144 Gly Pro Val Thr Glu Val Pro Ser Pro Ser Ala Glu Val Trp Asp Leu 35 40 45 TCC ACC GAG GCC GGC GAC GAT GAC CTC GAC GGC GAC CTC AAC GGC GAC 192 Ser Thr Glu Ala Gly Asp Asp Asp Leu Asp Gly Asp Leu Asn Gly Asp 50 55 60 GAC CGC CGC GCG GGC TTC GGC TCG GCC CTC GCC TCC CTG AGG GAG GCA 240 Asp Arg Arg Ala Gly Phe Gly Ser Ala Leu Ala Ser Leu Arg Glu Ala 65 70 75 80 CCC CCG GCC CAT CTG GTG AAC GTG TCC GAG GGC GCC AAC TTC ACC CTC 288 Pro Pro Ala His Leu Val Asn Val Ser Glu Gly Ala Asn Phe Thr Leu 85 90 95 GAC GCG CGC GGC GAC GGC GCC GTG GTG GCC GGG ATC TGG ACG TTC CTG 336 Asp Ala Arg Gly Asp Gly Ala Val Val Ala Gly Ile Trp Thr Phe Leu 100 105 110 CCC GTC CGC GGC TGC GAC GCC GTG GCG GTG ACC ATG GTG TGC TTC GAG 384 Pro Val Arg Gly Cys Asp Ala Val Ala Val Thr Met Val Cys Phe Glu 115 120 125 ACC GCC TGC CAC CCG GAC CTG GTG CTG GGC CGC GCC TGC GTC CCC GAG 432 Thr Ala Cys His Pro Asp Leu Val Leu Gly Arg Ala Cys Val Pro Glu 130 135 140 GCC CCG GAG CGG GGC ATC GGC GAC TAC CTG CCG CCC GAG GTG CCG CGG 480 Ala Pro Glu Arg Gly Ile Gly Asp Tyr Leu Pro Pro Glu Val Pro Arg 145 150 155 160 CTC CAG CGC GAG CCG CCC ATC GTC ACC CCG GAG CGG TGG TCG CCG CAC 528 Leu Gln Arg Glu Pro Pro Ile Val Thr Pro Glu Arg Trp Ser Pro His 165 170 175 CTG ACC GTC CGG CGG GCC ACG CCC AAC GAC ACG GGC CTC TAC ACG CTG 576 Leu Thr Val Arg Arg Ala Thr Pro Asn Asp Thr Gly Leu Tyr Thr Leu 180 185 190 CAC GAC GCC TCG GCG CCG CGG GCC GTG TTC TTT GTG GCG GTG GGC GAC 624 His Asp Ala Ser Gly Pro Arg Ala Val Phe Phe Val Ala Val Gly Asp 195 200 205 CGG CCG CCC GCG CCG CTG GCC CCG GTG GGC CCC GCG CGC CAC GAG CCC 672 Arg Pro Pro Ala Pro Leu Ala Pro Val Gly Pro Ala Arg His Glu Pro 210 215 220 CGC TTC CAC GCG CTC GGC TTC CAC TCG CAG CTC TTC TCG CCC GGG GAC 720 Arg Phe His Ala Leu Gly Phe His Ser Gln Leu Phe Ser Pro Gly Asp 225 230 235 240 ACG TTC GAC CTG ATG CCG CGC GTG GTC TCG GAC ATG GGC GAC TCG CGC 768 Thr Phe Asp Leu Met Pro Arg Val Val Ser Asp Met Gly Asp Ser Arg 245 250 255 GAG AAC TTC ACC GCC ACG CTG GAC TGG TAC TAC GCG CGC GCG CCC CCG 816 Glu Asn Phe Thr Ala Thr Leu Asp Trp Tyr Tyr Ala Arg Ala Pro Pro 260 265 270 CGG TGC CTG CTG TAC TAC GTG TAC GAG CCC TGC ATC TAC CAC CCG CGC 864 Arg Cys Leu Leu Tyr Tyr Val Tyr Glu Pro Cys Ile Tyr His Pro Arg 275 280 285 GCG CCC GAG TGC CTG CGC CCG GTG GAC CCG GCG TCC AGC TTC ACC TCG 912 Ala Pro Glu Cys Leu Arg Pro Val Asp Pro Ala Cys Ser Phe Thr Ser 290 295 300 CCG GCG CGC GCG GCG CTG GTG GCG CGC CGC GCG TAC GCC TCG TGC AGC 960 Pro Ala Arg Ala Ala Leu Val Ala Arg Arg Ala Tyr Ala Ser Cys Ser 305 310 315 320 CCG CTG CTC GGG GAC CGG TGG CTG ACC GCC TGC CCC TTC GAC GCC TTC 1008 Pro Leu Leu Gly Asp Arg Trp Leu Thr Ala Cys Pro Phe Asp Ala Phe 325 330 335 GGC GAG GAG GTG CAC ACG AAC GCC ACC GCG GAC GAG TCG GGG CTG TAC 1056 Gly Glu Glu Val His Thr Asn Ala Thr Ala Asp Glu Ser Gly Leu Tyr 340 345 350 GTG CTC GTG ATG ACC CAC AAC GGC CAC GTC GCC ACC TGG GAC TAC ACG 1104 Val Leu Val Met Thr His Asn Gly His Val Ala Thr Trp Asp Tyr Thr 355 360 365 CTC GTC GCC ACC GCG GCC GAG TAC GTC ACG GTC ATC AAG GAG CTG ACG 1152 Leu Val Ala Thr Ala Ala Glu Tyr Val Thr Val Ile Lys Glu Leu Thr 370 375 380 GCC CCG GCC CGG GCC CCG GGC ACC CCG TGG GGC CCC GGC GGC GGC GAC 1200 Ala Pro Ala Arg Ala Pro Gly Thr Pro Trp Gly Pro Gly Gly Gly Asp 385 390 395 400 GAC GCG ATC TAC GTG GAC GGC GTC ACG ACG CCG GCG CCG CCC GCG CGC 1248 Asp Ala Ile Tyr Val Asp Gly Val Thr Thr Pro Ala Pro Pro Ala Arg 405 410 415 CCG TGG AAC CCG TAC GGC CGG ACG ACG CCC GGG CGG CTG TTT GTG CTG 1296 Pro Trp Asn Pro Tyr Gly Arg Thr Thr Pro Gly Arg Leu Phe Val Leu 420 425 430 GCG CTG GGC TCC TTC GTG ATG ACG TGC GTC GTC GGG GGG GCC GTC TGG 1344 Ala Leu Gly Ser Phe Val Met Thr Cys Val Val Gly Gly Ala Val Trp 435 440 445 CTC TGC GTG CTG TGC TCC CGC CGC CGG GCG GCC TCG CGG CCG TTC CGG 1392 Leu Cys Val Leu Cys Ser Arg Arg Arg Ala Ala Ser Arg Pro Phe Arg 450 455 460 GTG CCG ACG CGG GCG GGG ACG CGC ATG CTC TCG CCG GTG TAC ACC AGC 1440 Val Pro Thr Arg Ala Gly Thr Arg Met Leu Ser Pro Val Tyr Thr Ser 465 470 475 480 CTG CCC ACG CAC GAG GAC TAC TAC GAC GGC GAC GAC GAC GAC GAG GAG 1488 Leu Pro Thr His Glu Asp Tyr Tyr Asp Gly Asp Asp Asp Asp Glu Glu 485 490 495 GCG GGC GAC GCC CGC CGG CGG CCC TCC TCC CCC GGC GGG GAC AGC GGC 1536 Ala Gly Asp Ala Arg Arg Arg Pro Ser Ser Pro Gly Gly Asp Ser Gly 500 505 510 TAC GAG GGG CCG TAC GTG AGC CTG GAC GCC GAG GAC GAG TTC AGC AGC 1584 Tyr Glu Gly Pro Tyr Val Ser Leu Asp Ala Glu Asp Glu Phe Ser Ser 515 520 525 GAC GAG GAC GAC GGG CTG TAC GTG CGC CCC GAG GAG GCG CCC CGC TCC 1632 Asp Glu Asp Asp Gly Leu Tyr Val Arg Pro Glu Glu Ala Pro Arg Ser 530 535 540 GGC TTC GAC GTC TGG TTC CGC GAT CCG GAG AAA CCG GAA GTG ACG AAT 1680 Gly Phe Asp Val Trp Phe Arg Asp Pro Glu Lys Pro Glu Val Thr Asn 545 550 555 560 GGG CCC AAC TAT GGC GTG ACC GCC AGC CGC CTG TTG AAT GCC CGC CCC 1728 Gly Pro Asn Tyr Gly Val Thr Ala Ser Arg Leu Leu Asn Ala Arg Pro 565 570 575 GCT TAA Ala

【０１１７】配列番号：４配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列： 5' GATCGTCGGCTAGTGAGTAGGTAGG 3' 3' CAGCCGATCACTCATCCATCCTTAA 5'

【０１１８】配列番号：５配列の長さ：４１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列： 5' GATCCGCAGTACCGGCGTCGATGATGATGGTGGCGCGCGAC 3' 3' GCGTCATGGCCGCAGCTACTACTACCACCGCGCGCTGCACTG 5'

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＲＶのＢamＨＩ７フラグメントの制限地図
である。

【図２】ＢamＨＩ７をＢamＨＩおよびＰvuＩＩで消化
して得られるフラグメント１(１.５kb)の制限地図であ
る。

【図３】ＢamＨＩ７をＢamＨＩおよびＰvuＩＩで消化
して得られるフラグメント２(４.９kb)の制限地図であ
る。

【図４】フラグメント１をpＢＲ３２２のＢamＨＩお
よびＰvuＩＩ部位間に挿入して得られるプラスミドｐＰ
Ｒ２８−４の制限地図である。

【図５】フラグメント２をpＢＲ３２２のＢamＨＩお
よびＰvuＩＩ部位間に挿入して得られるプラスミドｐＰ
Ｒ２８−１の制限地図である。

【図６】ｇｐ５０遺伝子に位置する各種制限酵素切断
部位およびフランキング配列を示す地図である。

【図７】プラスミドpＰＲ２８−４をＮarＩで消化し
て得られるフラグメント３の制限地図である。

【図８】ＢamＨＩリンカーをフラグメント３に加え、
次いでそれをＢamＨＩで処理して得られるフラグメント
４の制限地図である。

【図９】フラグメント４をＤＮＡリガーゼで環化して
得られるプラスミドpＰＲ２８−４Ｎar２の制限地図で
ある。

【図１０】プラスミドpＰＲ２８−４Ｎar２をＢam
ＨＩおよびＰvuＩＩで消化して得られるフラグメント５
(１６０bp)の制限地図である。

【図１１】プラスミドpＰＲ２８−１をＢamＨＩおよ
びＰvuＩＩで消化して得られるフラグメント６(４.９k
b)の制限地図である。

【図１２】プラスミドpＰＧＸ１をＢamＨＩで消化
し、ＢＡＰで処理し、次いでフラグメント５および６で
結んで得られる、完全なｇｐ５０遺伝子よりなるプラス
ミドpＢＧＰ５０−２３の制限地図である。

【図１３】 pＢＧＰ５０−２３をＭaeＩＩＩで切断
し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＥcoＲＩ
リンカーを加え、ＥcoＲＩで消化し、次いでＢamＨＩで
切断して得られるフラグメント７(１.３kb)の制限地図
である。

【図１４】プラスミドpＳＶ２dhfrをＢamＨＩおよび
ＥcoＲＩで切断して得られるフラグメント８(５.０kb)
の制限地図である。

【図１５】フラグメント７および８を結ぶことによっ
てプラスミドpＤ５０の制限地図である。

【図１６】 pＤ５０をＢamＨＩで消化し、ＢＡＰで処
理して得られるフラグメント９の制限地図である。

【図１７】単離されたヒトサイトメガロウイルス(タ
ウネ(Ｔowne))即時型プロモータを含有するフラグメン
ト１０(７６０bp)の制限地図である。

【図１８】フラグメント９および１０を結んで得られ
るプラスミドpＤＩＥ５０の制限地図である。

【図１９】プラスミドpＳＶＣＯＷ７の制限地図であ
る。

【図２０】プラスミドpＳＶＣＯＷ７をＰvuＩＩおよ
びＥcoＲＩで切断して得られるフラグメント１１の制限
地図である。

【図２１】フラグメント１１をpＵＣ９にクローンし
て得られるプラスミドpＣＯＷＴ１の制限地図である。

【図２２】プラスミドpＣＯＷＴ１をＳalＩで切断
し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＥcoＲ
Ｉリンカーを加え、続いてＥcoＲＩで消化して得られる
フラグメント１２(０.６kb)の制限地図である。

【図２３】プラスミドpＤＩＥ５０をＥcoＲＩで切断
し、フラグメント１２をその中にクローンして得られた
プラスミドpＤＩＥ５０ＰＡの制限地図である。

【図２４】プラスミドpＤＩＥ５０をＳalＩおよびＥc
oＲＩで消化して得られる５.０kbフラグメントの制限地
図である。

【図２５】プラスミドpＤＩＥ５０をＳalＩおよびＥc
oＲＩで消化して得られる０.７kbフラグメントの制限地
図である。

【図２６】０.７kbフラグメントをＳau３ＡＩで消化
して得られる０.５kbのＳalＩ／Ｓau３ＡＩフラグメ
ントの制限地図である。

【図２７】５.０kbのＥcoＲＩ／ＳalＩフラグメン
ト、０.５kbのＳalＩ／Ｓau３ＡＩフラグメントおよび
アニールしたオリゴヌクレオチドを結んで得られるプラ
スミドpＤＩＥ５０Ｔの制限地図である。

【図２８】 gp６３配列決定に用いる制限酵素切断部
位を示す地図である。

【図２９】 gＩ配列決定に用いる制限酵素切断部位を
示す地図である。

【図３０】ＢamＨＩ７フラグメントをプラスミドpＵ
Ｃ１９にクローンして得られるプラスミドＡの制限地図
である。

【図３１】プラスミドＡをＤraＩで消化して得られる
フラグメント１の制限地図である。

【図３２】ＢamＨＩリンカーをフラグメント１に加
え、続いてＢamＨＩで消化して得られるフラグメント２
(２.５kb)の制限地図である。

【図３３】フラグメント２をＢamＨＩで消化したpＵ
Ｃ１９に入れて得られるプラスミドpＵＣＤ／Ｂの制限
地図である。

【図３４】プラスミドpＵＣＤ／ＢをＢsmＩおよびＥc
oＲＩで消化して得られるフラグメント３(４.４kb)の制
限地図である。

【図３５】２種の合成ヌクレオチドの塩基配列を示す
配列図である。

【図３６】図３５に示す合成オリゴヌクレオチドおよ
びフラグメント３を結んで得られるプラスミドpＧＩの
制限地図である。

【図３７】プラスミドpＧＩをＥcoＲＩおよびＢamＨ
Ｉで消化して得られるフラグメント４(１.８kb)の制限
地図である。

【図３８】プラスミドpＳＶ２dhfrをＥcoＲＩで切断
し、次いでＢamＨＩで切断して得られるフラグメント５
(５.０kb)の制限地図である。

【図３９】フラグメント４および５を結んで得られる
プラスミドpＤＧＩの制限地図である。

【図４０】プラスミドpＤＧＩをＢamＨＩで切断して
得られるフラグメント６の制限地図である。

【図４１】単離したヒトサイトメガロウイルス(タウ
ネ(Ｔowne))即時型プロモータを含有するフラグメント
７(７６０bp)の制限地図である。

【図４２】フラグメント６および７を結んで得られる
プラスミドpＤＩＥＧＩdhfrの制限地図である。

【図４３】プラスミドpＳＶＣＯＷ７の制限地図であ
る。

【図４４】プラスミドpＳＶＣＯＷ７をＰvuＩＩおよ
びＥcoＲＩで切断して得られるフラグメント８の制限地
図である。

【図４５】フラグメント８をpＵＣ９にクローンして
得られるプラスミドpＣＯＷＴ１の制限地図である。

【図４６】プラスミドpＣＯＷＴ１をＳalＩで切断
し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＥcoＲＩリ
ンカーを上に結び、続いてＥcoＲＩで消化して得られる
フラグメント９(０.６kb)の制限地図である。

【図４７】フラグメント９をpＵＣ１９のＥcoＲＩ部
位にクローンして得られるプラスミドpＣＯＷＴ１Ｅの
制限地図である。

【図４８】 pＣＯＷＴ１ＥをＥcoＲＩで消化して得ら
れるフラグメント１０(６００bp)の制限地図である。

【図４９】プラスミドpＤＩＥＧＩdhfrをＥcoＲＩで
消化し、bＧＨポリアデニレーション信号を含有する
フラグメント１０で結んで得られるプラスミドpＤＩＥ
ＧＩＰＡの制限地図である。

【図５０】ＢamＨＩ７をＢstＥＩＩで消化し、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼで処理し、次いでＫpnＩで切断して得
られるフラグメント１(１.９kb)の制限地図である。

【図５１】次いでフラグメント１をプラスミドpＵＣ
１９のＫpnＩおよびＳmaＩ部位間でクローンして得られ
るプラスミドpＰＲ２８−１ＢＫの制限地図である。

【図５２】プラスミドpＰＲ２８−１ＢＫをＤraＩお
よびＭaeＩＩＩで切断して得られるフラグメント２(１.
１kb)の制限地図である。

【図５３】プラスミドpＳＶ２dhfrをＥcoＲＩで切断
し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、次いでＢamＨＩ
で切断して得られるフラグメント３(５.０kb)の制限地
図である。

【図５４】２種のオリゴヌクレオチドを合成して得ら
れるフラグメント４のフクレオチド配列を示す地図であ
る。

【図５５】フラグメント２、３および４を結んで得ら
れるプラスミドpＧＰ６３dhfrの制限地図である。

【図５６】プラスミドpＧＰ６３dhfrをＢamＨＩで消
化し、ＢＡＰで処理して得られるフラグメント５の制限
地図である。

【図５７】単離したヒトサイトメガロウイルス(タウ
ネ(Ｔowne))即時型プロモータを含有するフラグメント
６(７６０bp)の制限地図である。

【図５８】フラグメント５および６を結んで得られる
プラスミド pＩＥＧＰ６３dhfrの制限地図である。

【符号の説明】

図１中、Ｘ＝糖蛋白質Ｘ(gＸ)、５０＝糖蛋白質５０(gp５０)、６３＝糖蛋白質６３(gp６３)、Ｉ＝糖蛋白質Ｉ(gＩ)、図１５中、dhfr＝ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ＳＶ４０Ｏri＝ＳＶ４０プロモータおよび複製開始
点、ＡmpＲ＝アンピシリン耐性遺伝子、図２３中、Ａ＝ウシ成長ホルモンポリアデニレーション
信号、Ｂ＝ゲノムウシ成長ホルモン、Ｃ＝ヒトサイトメガロウイルス(タウネ(Ｔowne))即時型
プロモータ、図２７中、Ｔ＝停止コードン、図３３中、７＝ＢａｍＨＩフラグメント、図３９中、dhfr＝ジヒドロ葉酸還元酵素、ＳＶ４０Ｏri＝ＳＶ４０プロモータおよび複製開始
点、ＡmpＲ＝アンピシリン耐性、図４９中、Ａ＝ウシ成長ホルモンポリアデニレーション
信号、Ｇ＝ゲノムウシ成長ホルモン、Ｐ＝ヒトサイトメガロウイルス(タウネ(Ｔowne))即時型
プロモータ、図５５中、dhfr＝ジヒドロ葉酸還元酵素、ＳＶ４０Ｏri＝ＳＶ４０プロモータおよび複製開始
点、ＡmpＲ＝アンピシリン耐性

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/53 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/569 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ジェイムス・ジイ・チミンスアメリカ合衆国マサチューセッツ州 02139、ケンブリッジ、メモライル・ドライブナンバー18エフ550番

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】 (a)組換体ＤＮＡ分子を調製し、ここ
に、該分子はＰＲＶ gp５０、gp６３またはｇＩ抗原性
を示すポリペプチドについてコード付けするＤＮＡ配列
よりなり、該糖蛋白質は、各々、以下に示されるアミノ
酸配列を有し、該ＤＮＡは発現制御配列に作動可能に連
結し; (b)適当な宿主細胞を該組換体ＤＮＡ分子で形質転換し; (c)該宿主細胞を培養し; (d)次いで該ポリペプチドを収集することを特徴とする
ＰＲＶ gp５０、gp６３またはｇＩ抗原性を示すポリペ
プチドの産生法。ｇｐ５０のアミノ酸配列： Met Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Leu Val Ala Arg Thr Thr Leu Gly Ala Asp Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Thr Phe Pro Pro Pro Ala Tyr Pro Tyr Thr Glu Ser Trp Gln Leu Thr Leu Thr Thr Val Pro Ser Pro Phe Val Gly Pro Ala Asp Val Tyr His Thr Arg Pro Leu Glu Asp Pro Cys Gly Val Val Ala Leu Ile Ser Asp Pro Gln Val Asp Arg Leu Leu Asn Glu Ala Val Ala His Arg Arg Pro Thr Tyr Arg Ala His Val Ala Trp Tyr Arg Ile Ala Asp Gly Cys Ala His Leu Leu Tyr Phe Ile Glu Tyr Ala Asp Cys Asp Pro Arg Gln Val Phe Gly Arg Cys Arg Arg Arg Thr Thr Pro Met Trp Trp Thr Pro Ser Ala Asp Tyr Met Phe Pro Thr Glu Asp Glu Leu Gly Leu Leu Met Val Ala Pro Gly Arg Phe Asn Glu Gly Gln Tyr Arg Arg Leu Val Ser Val Asp Gly Val Asn Ile Leu Thr Asp Phe Met Val Ala Leu Pro Glu Gly Gln Glu Cys Pro Phe Ala Arg Val Asp Gln His Arg Thr Tyr Lys Phe Gly Ala Cys Trp Ser Asp Asp Ser Phe Lys Arg Gly Val Asp Val Met Arg Phe Leu Thr Pro Phe Tyr Gln Gln Pro Pro His Arg Glu Val Val Asn Tyr Trp Tyr Arg Lys Asn Gly Arg Thr Leu Pro Arg Ala His Ala Ala Ala Thr Pro Tyr Ala Ile Asp Pro Ala Arg Pro Ser Ala Gly Ser Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Arg Pro Lys Pro Glu Pro Ala Pro Ala Thr Pro Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Pro Ala Thr Arg Asp His Ala Ala Gly Gly Arg Pro Thr Pro Arg Pro Pro Arg Pro Glu Thr Pro His Arg Pro Phe Ala Pro Pro Ala Val Val Pro Ser Gly Trp Pro Gln Pro Ala Glu Pro Phe Gln Pro Arg Thr Pro Ala Ala Pro Gly Val Ser Arg His Arg Ser Val Ile Val Gly Thr Gly Thr Ala Met Gly Ala Leu Leu Val Gly Val Cys Val Tyr Ile Phe Phe Arg Leu Arg Gly Ala Lys Gly Tyr Arg Leu Leu Gly Gly Pro Ala Asp Ala Asp Glu Leu Lys Ala Gln Pro Gly Pro ｇｐ６３のアミノ酸配列： Met Met Met Val Ala Arg Asp Val Thr Arg Leu Pro Ala Gly Leu Leu Leu Ala Ala Leu Thr Leu Ala Ala Leu Thr Pro Arg Val Gly Gly Val Leu Phe Arg Gly Ala Aly Val Ser Val His Val Ala Gly Ser Ala Val Leu Val Pro Gly Asp Ala Pro Asn Leu Thr Ile Asp Gly Thr Leu Leu Phe Leu Glu Gly Pro Ser Pro Ser Asn Tyr Ser Gly Arg Val Glu Leu Leu Arg Leu Asp Pro Lys Arg Ala Cys Tyr Thr Arg Glu Tyr Ala Ala Glu Tyr Asp Leu Cys Pro Arg Val His His Glu Ala Phe Arg Gly Cys Leu Arg Lys Arg Glu Pro Leu Ala Arg Arg Ala Ser Ala Ala Val Glu Ala Arg Arg Leu Leu Phe Val Ser Arg Pro Ala Pro Pro Asp Ala Gly Ser Tyr Val Leu Arg Val Arg Val Asn Gly Thr Thr Asp Leu Phe Val Leu Thr Ala Leu Val Pro Pro Arg Gly Arg Pro His His Pro Thr Pro Ser Ser Ala Asp Glu Cys Arg Pro Val Val Gly Ser Trp His Asp Ser Leu Arg Val Val Asp Pro Ala Glu Asp Ala Val Phe Thr Thr Pro Pro Pro Ile Glu Pro Glu Pro Pro Thr Thr Pro Ala Pro Pro Arg Gly Thr Gly Ala Thr Pro Glu Pro Arg Ser Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Gly Ala Thr Thr Ala Met Thr Pro Val Pro Gly Thr Leu Asp Ala Asn Gly Thr Met Val Leu Asn Ala Ser Val Val Ser Arg Val Leu Leu Ala Ala Ala Asn Ala Thr Ala Gly Ala Arg Gly Pro Gly Lys Ile Ala Met Val Leu Gly Pro Thr Ile Val Val Leu Leu Ile Phe Leu Gly Gly Val Ala Cys Ala Ala Arg Arg Cys Ala Arg Gly Ile Ala Ser Thr Gly Arg Asp Pro Gly Ala Ala Arg Arg Ser Thr Arg Arg Pro Arg Gly Ala Arg Pro Pro Thr Pro Ser Pro Gly Arg Pro Ser Pro Ser Pro Arg ｇＩのアミノ酸配列： Met Arg Pro Phe Leu Leu Arg Ala Ala Gln Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ser Thr Glu Ala Pro Ser Leu Ser Ala Glu Thr Thr Pro Gly Pro Val Thr Glu Val Pro Ser Pro Ser Ala Glu Val Trp Asp Leu Ser Thr Glu Ala Gly Asp Asp Asp Leu Asp Gly Asp Leu Asn Gly Asp Asp Arg Arg Ala Gly Phe Gly Ser Ala Leu Ala Ser Leu Arg Glu Ala Pro Pro Ala His Leu Val Asn Val Ser Glu Gly Ala Asn Phe Thr Leu Asp Ala Arg Gly Asp Gly Ala Val Val Ala Gly Ile Trp Thr Phe Leu Pro Val Arg Gly Cys Asp Ala Val Ala Val Thr Met Val Cys Phe Glu Thr Ala Cys His Pro Asp Leu Val Leu Gly Arg Ala Cys Val Pro Glu Ala Pro Glu Arg Gly Ile Gly Asp Tyr Leu Pro Pro Glu Val Pro Arg Leu Gln Arg Glu Pro Pro Ile Val Thr Pro Glu Arg Trp Ser Pro His Leu Thr Val Arg Arg Ala Thr Pro Asn Asp Thr Gly Leu Tyr Thr Leu His Asp Ala Ser Gly Pro Arg Ala Val Phe Phe Val Ala Val Gly Asp Arg Pro Pro Ala Pro Leu Ala Pro Val Gly Pro Ala Arg His Glu Pro Arg Phe His Ala Leu Gly Phe His Ser Gln Leu Phe Ser Pro Gly Asp Thr Phe Asp Leu Met Pro Arg Val Val Ser Asp Met Gly Asp Ser Arg Glu Asn Phe Thr Ala Thr Leu Asp Trp Tyr Tyr Ala Arg Ala Pro Pro Arg Cys Leu Leu Tyr Tyr Val Tyr Glu Pro Cys Ile Tyr His Pro Arg Ala Pro Glu Cys Leu Arg Pro Val Asp Pro Ala Cys Ser Phe Thr Ser Pro Ala Arg Ala Ala Leu Val Ala Arg Arg Ala Tyr Ala Ser Cys Ser Pro Leu Leu Gly Asp Arg Trp Leu Thr Ala Cys Pro Phe Asp Ala Phe Gly Glu Glu Val His Thr Asn Ala Thr Ala Asp Glu Ser Gly Leu Tyr Val Leu Val Met Thr His Asn Gly His Val Ala Thr Trp Asp Tyr Thr Leu Val Ala Thr Ala Ala Glu Tyr Val Thr Val Ile Lys Glu Leu Thr Ala Pro Ala Arg Ala Pro Gly Thr Pro Trp Gly Pro Gly Gly Gly Asp Asp Ala Ile Tyr Val Asp Gly Val Thr Thr Pro Ala Pro Pro Ala Arg Pro Trp Asn Pro Tyr Gly Arg Thr Thr Pro Gly Arg Leu Phe Val Leu Ala Leu Gly Ser Phe Val Met Thr Cys Val Val Gly Gly Ala Val Trp Leu Cys Val Leu Cys Ser Arg Arg Arg Ala Ala Ser Arg Pro Phe Arg Val Pro Thr Arg Ala Gly Thr Arg Met Leu Ser Pro Val Tyr Thr Ser Leu Pro Thr His Glu Asp Tyr Tyr Asp Gly Asp Asp Asp Asp Glu Glu Ala Gly Asp Ala Arg Arg Arg Pro Ser Ser Pro Gly Gly Asp Ser Gly Tyr Glu Gly Pro Tyr Val Ser Leu Asp Ala Glu Asp Glu Phe Ser Ser Asp Glu Asp Asp Gly Leu Tyr Val Arg Pro Glu Glu Ala Pro Arg Ser Gly Phe Asp Val Trp Phe Arg Asp Pro Glu Lys Pro Glu Val Thr Asn Gly Pro Asn Tyr Gly Val Thr Ala Ser Arg Leu Leu Asn Ala Arg Pro Ala
【請求項２】該ＤＮＡ配列が ATG CTG CTC GCA GCG CTA TTG GCG GCG CTG GTC GCC CGG ACG ACG CTC GGT GCG GAC GTG GAC GCC GTG CCC GCG CCG ACC TTC CCC CCG CCC GCG TAC CCG TAC ACC GAG TCG TGG CAG CTG ACG CTG ACG ACG GTC CCC TCG CCC TTC GTC GGC CCC GCG GAC GTC TAC CAC ACG CGC CCG CTG GAG GAC CCG TGC GCG GTG GTG GCG CTG ATC TCC GAC CCG CAG GTG GAC CGG CTG CTG AAC GAG GCG GTG GCC CAC CGG CGG CCC ACG TAC CGC GCC CAC GTG GCC TGG TAC CGC ATC GCG GAC GGG TGC GCA CAC CTG CTG TAC TTT ATC GAG TAC GCC GAC TGC GAC CCC AGG CAG GTC TTT GGG CGC TGC CGG CGC CGC ACC ACG CCG ATG TGG TGG ACC CCG TCC GCG GAC TAC ATG TTC CCC ACG GAG GAC GAG CTG GGG CTG CTC ATG GTG GCC CCG GGG CGG TTC AAC GAG GGC CAG TAC CGG CGC CTG GTG TCC GTC GAC GGC GTG AAC ATC CTC ACC GAC TTC ATG GTG GCG CTC CCC GAG GGG CAA GAG TGC CCG TTC GCC CGC GTG GAC CAG CAC CGC ACG TAC AAG TTC GGC GCG TGC TGG AGC GAC GAC AGC TTC AAG CGG GGC GTG GAC GTG ATG CGA TTC CTG ACG CCG TTC TAC CAG CAG CCC CCG CAC CGG GAG GTG GTG AAC TAC TGG TAC CGC AAG AAC GGC CGG ACG CTC CCG CGG GCC CAC GCC GCC GCC ACG CCG TAC GCC ATC GAC CCC GCG CGG CCC TCG GCG GGC TCG CCG AGG CCC CGG CCC CGG CCC CGG CCC CGG CCC CGG CCG AAG CCC GAG CCC GCC CCG GCG ACG CCC GCG CCC CCC GAC CGC CTG CCC GAG CCG GCG ACG CGG GAC CAC GCC GCC GGG GGC CGC CCC ACG CCG CGA CCC CCG AGG CCC GAG ACG CCG CAC CGC CCC TTC GCC CCG CCG GCC GTC GTG CCC AGC GGG TGG CCG CAG CCC GCG GAG CCG TTC CAG CCG CGG ACC CCC GCC GCG CCG GGC GTC TCG CGC CAC CGC TCG GTG ATC GTC GGC ACG GGC ACC GCG ATG GGC GCG CTC CTG GTG GGC GTG TGC GTC TAC ATC TTC TTC CGC CTG AGG GGG GCG AAG GGG TAT CGC CTC CTG GGC GGT CCC GCG GAC GCC GAC GAG CTA AAA GCG CAG CCC GGT CCG TAG,であるgp５０配列、 ATG ATG ATG GTG GCG CGC GAC GTG ACC CGG CTC CCC GCG GGG CTC CTC CTC GCC GCC CTG ACC CTG GCC GCC CTG ACC CCG CGC GTC GGG GGC GTC CTC TTC AGG GGC GCC GGC GTC AGC GTG CAC GTC GCC GGG AGC GCC GTC CTC GTG CCC GGC GAC GCG CCC AAC CTG ACG ATC GAC GGG ACG CTG CTG TTT CTG GAG GGG CCC TCG CCG AGC AAC TAC AGC GGG CGC GTG GAG CTG CTG CGC CTC GAC CCC AAG CGC GCC TGC TAC ACG CGC GAG TAC GCC GCC GAG TAC GAC CTC TGC CCC CGC GTG CAC CAC GAG GCC TTC CGC GGC TGT CTG CGC AAG CGC GAG CCG CTC GCC CGG CGC GCG TCC GCC GCG GTG GAG GCG CGC CGG CTG CTG TTC GTC TCG CGC CCG GCC CCG CCG GAC GCG GGG TCG TAC GTG CTG CGG GTC CGC GTG AAC GGG ACC ACG GAC CTC TTT GTG CTG ACG GCC CTG GTG CCG CCC AGG GGG CGC CCC CAC CAC CCC ACG CCG TCG TCC GCG GAC GAG TGC CGG CCT GTC GTC GGA TCG TGG CAC GAC AGC CTG CGC GTC GTG GAC CCC GCC GAG GAC GCC GTG TTC ACC ACG CCG CCC CCG ATC GAG CCA GAG CCG CCG ACG ACC CCC GCG CCC CCC CGG GGG ACC GGC GCC ACC CCC GAG CCC CGC TCC GAC GAA GAG GAG GAG GAC GAG GAG GGG GCG ACG ACG GCG ATG ACC CCG GTG CCC GGG ACC CTG GAC GCG AAC GGC ACG ATG GTG CTG AAC GCC AGC GTC GTG TCG CGC GTC CTG CTC GCC GCC GCC AAC GCC ACG GCG GGC GCC CGG GGC CCC GGG AAG ATA GCC ATG GTG CTG GGG CCC ACG ATC GTC GTC CTC CTG ATC TTC TTG GGC GGG GTC GCC TGC GCG GCC CGG CGC TGC GCG CGC GGA ATC GCA TCT ACC GGC CGC GAC CCG GGC GCG GCC CGG CGG TCC ACG CGC CGC CCC CGC GGC GCC CGC CCC CCA ACC CCG TCG CCG GGG CGC CCG TCC CCC AGC CCA AGA TGA,であるgp６３配列、および ATG CGG CCC TTT CTG CTG CGC GCC GCG CAG CTC CTG GCG CTG CTG GCC CTG GCG CTC TCC ACC GAG GCC CCG AGC CTC TCC GCC GAG ACG ACC CCG GGC CCC GTC ACC GAG GTC CCG AGT CCC TCG GCC GAG GTC TGG GAC CTC TCC ACC GAG GCC GGC GAC GAT GAC CTC GAC GGC GAC CTC AAC GGC GAC GAC CGC CGC GCG GGC TTC GGC TCG GCC CTC GCC TCC CTG AGG GAG GCA CCC CCG GCC CAT CTG GTG AAC GTG TCC GAG GGC GCC AAC TTC ACC CTC GAC GCG CGC GGC GAC GGC GCC GTG GTG GCC GGG ATC TGG ACG TTC CTG CCC GTC CGC GGC TGC GAC GCC GTG GCG GTG ACC ATG GTG TGC TTC GAG ACC GCC TGC CAC CCG GAC CTG GTG CTG GGC CGC GCC TGC GTC CCC GAG GCC CCG GAG CGG GGC ATC GGC GAC TAC CTG CCG CCC GAG GTG CCG CGG CTC CAG CGC GAG CCG CCC ATC GTC ACC CCG GAG CGG TGG TCG CCG CAC CTG ACC GTC CGG CGG GCC ACG CCC AAC GAC ACG GGC CTC TAC ACG CTG CAC GAC GCC TCG GCG CCG CGG GCC GTG TTC TTT GTG GCG GTG GGC GAC CGG CCG CCC GCG CCG CTG GCC CCG GTG GGC CCC GCG CGC CAC GAG CCC CGC TTC CAC GCG CTC GGC TTC CAC TCG CAG CTC TTC TCG CCC GGG GAC ACG TTC GAC CTG ATG CCG CGC GTG GTC TCG GAC ATG GGC GAC TCG CGC GAG AAC TTC ACC GCC ACG CTG GAC TGG TAC TAC GCG CGC GCG CCC CCG CGG TGC CTG CTG TAC TAC GTG TAC GAG CCC TGC ATC TAC CAC CCG CGC GCG CCC GAG TGC CTG CGC CCG GTG GAC CCG GCG TCC AGC TTC ACC TCG CCG GCG CGC GCG GCG CTG GTG GCG CGC CGC GCG TAC GCC TCG TGC AGC CCG CTG CTC GGG GAC CGG TGG CTG ACC GCC TGC CCC TTC GAC GCC TTC GGC GAG GAG GTG CAC ACG AAC GCC ACC GCG GAC GAG TCG GGG CTG TAC GTG CTC GTG ATG ACC CAC AAC GGC CAC GTC GCC ACC TGG GAC TAC ACG CTC GTC GCC ACC GCG GCC GAG TAC GTC ACG GTC ATC AAG GAG CTG ACG GCC CCG GCC CGG GCC CCG GGC ACC CCG TGG GGC CCC GGC GGC GGC GAC GAC GCG ATC TAC GTG GAC GGC GTC ACG ACG CCG GCG CCG CCC GCG CGC CCG TGG AAC CCG TAC GGC CGG ACG ACG CCC GGG CGG CTG TTT GTG CTG GCG CTG GGC TCC TTC GTG ATG ACG TGC GTC GTC GGG GGG GCC GTC TGG CTC TGC GTG CTG TGC TCC CGC CGC CGG GCG GCC TCG CGG CCG TTC CGG GTG CCG ACG CGG GCG GGG ACG CGC ATG CTC TCG CCG GTG TAC ACC AGC CTG CCC ACG CAC GAG GAC TAC TAC GAC GGC GAC GAC GAC GAC GAG GAG GCG GGC GAC GCC CGC CGG CGG CCC TCC TCC CCC GGC GGG GAC AGC GGC TAC GAG GGG CCG TAC GTG AGC CTG GAC GCC GAG GAC GAG TTC AGC AGC GAC GAG GAC GAC GGG CTG TAC GTG CGC CCC GAG GAG GCG CCC CGC TCC GGC TTC GAC GTC TGG TTC CGC GAT CCG GAG AAA CCG GAA GTG ACG AAT GGG CCC AAC TAT GGC GTG ACC GCC AGC CGC CTG TTG AAT GCC CGC CCC GCT TAAであるgＩ配列よりなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】該宿主細胞が細菌、菌類、植物細胞およ
び動物細胞よりなる群から選択される請求項１記載の方
法。
【請求項４】該宿主細胞がイー・コリ(Ｅ．Ｃoli)で
ある請求項１記載の方法。
【請求項５】該宿主細胞が酵母である請求項１記載の
方法。
【請求項６】該宿主細胞がチャイニーズハムスター卵
巣（ＣＨＯ）細胞である請求項１記載の方法。