DK175072B1 - Rekombinant DNA-molekyle, værtscelle transformeret dermed, fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid ved anvendelse af det rekombinante DNA-molekyle, og diagnostisk sæt omfattende et sådant polypeptid - Google Patents

Description

i DK 175072 B1

Den foreliggende opfindelse angår et rekombinant DNA-molekyle, en værtscelle transformeret dermed, en fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid ved anvendelse af det rekombinante DNA-molekyle, og diagnostisk sæt omfat-5 tende et sådant polypeptid. Polypeptidet og det diagnostiske sæt er anvendelige til screening af dyr til bestemmelse af, om de er inficeret med PRV, og det rekombinante DNA-molekyle er egnet til eksprimering af PRV-glycoproteinerne, som kodes deraf.

10 Pseudorabies-virus (PRV) er en sygdom, som an griber mange dyrearter over hele verden. PRV-infektioner betegnes afvekslende paralysis bulbaris infectiosa,

Aujeszky's sygdom og "mad itch". Infektioner kendes hos vigtige husdyr, såsom svin, kvæg, hunde, katte, får, 15 rotter og mink. Værtsdyr-området er meget bredt og omfatter de fleste pattedyr og, i det mindste eksperimentelt, mange fuglearter (vedrørende en detaljeret liste over værtsdyr, se D.P. Gustafson, "Pseudorabies", in Diseases of Swine, 5. udg., A.D. Leman et al.,eds., (1981)). For 20 de fleste inficerede dyr er sygdomme dødelig. Voksne svin og muligvis rotter dør imidlertid ikke af sygdommen og er derfor bærere.

Svinebesætninger er særlig udsatte for PRV. Selv om de voksne svin sjældent udviser symptomer eller dør af 25 sygdommen, bliver smågrise akut ;syge, når de smittes, og de dør sædvanligvis i løbet af 24-48 timer-, ofte uden specifikke kliniske tegn (T.C. Jones og R.D. Hunt, Veterinary Pathology, 5. udg., Lea & Febiger (1983)).

PRV-vacciner er blevet fremstillet ved forskellige 30 metoder, og vaccination i endemiske områder af Europa er blevet praktiseret i mere end 15 år. Tabene er blevet nedsat ved vaccinationen, men vaccinationen har bibeholdt virusset i miljøet. Der er ikke blevet fremstillet nogen vaccine, som vil forhindre infektion. Vaccinerede dyr, 35 som udsættes for virulent virus, overlever infektionen og udskiller derefter mere virulent virus. Vaccinerede dyr kan derfor huse en latent infektion, som kan blusse op igen (se D.P. Gustafson, ovenfor).

DK 175072 B1 2

Levende svækkede og inaktiverede vacciner mod PRV er tilgængelige i handelen i USA og er blevet godkendt af USDA (Se C.E. Aronson, ed., Veterinary Pharmaceuticals & Biologicals, (1983)).

5 Fordi voksne svin er bærere af PRV, har mange stater startet screening-programmer til påvisning af smit-tede dyr. DNA/DNA-hybridis!ering kan anvendes til diagnos- * ticering af aktivt inficerede dyr under anvendelse af et rekombinant DNA-molekyle ifølge den foreliggende opfin-10 delse. Nogle af PRV-glycoproteinerne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse er også anvendelige til fremstilling af diagnostika for PRV-infektioner og også til fremstilling af vacciner mod PRV.

PRV er et herpesvirus. Herpesvira er generelt 15 blandt de mest komplekse af dyre-vira. Deres genomer koder mindst 50 virus-specifikke proteiner og indeholder over 150.000 nucleotider. Blandt de mest immunologisk reaktive proteiner af herpesvira findes glycoproteinerne blandt andet i virion-membraner og membranerne af infi-20 cerede celler. Litteraturen vedrørende PRV-glycoproteiner refererer til mindstfire virale glycoproteiner (T. Ben--Porat og A.S. Kaplan, Virology £1, 265-73 (1970) ; A.S. Kaplan og T. Ben-Porat, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 66, 799-806 (1970)) .

25 M.W. Wathen og L.K. Wathen, J. Virol. 51, 57-62 (1984) refererer til et PRV, der indeholder en mutation i ét viralt glycoprotein (gp50), og en fremgangsmåde til selektering af mutanten under anvendelse af neutraliserende monoclonalt antistof rettet mod 30 gp50. Wathen og Wathen anfører også, at et monoclonalt antistof rettet mod gp50 er en stærk neutraliserende faktor for PRV, med eller uden hjælp af komplement, og at polyvalent immunserum er særdeles reaktivt mod gp50, og konkluderer derfor, at gp50 kan være et af de vigtige 35 DK 175072 B1 3 PRV-immunogener. På den anden side er det blevet rapporteret, at monoclonale antistoffer, som reagerer med kappe-glycoproteinet med en molekylvægt på 98.000, neu- ____ . ____ . .traliserer PRV-infektionsevnen, men at monoclonale an- 5 tistoffer rettet mod nogle af de andre membran-glycopro-teiner har meget lille neutraliserende aktivitet (H. Hampi et al., J. Virol. 52, 583-90 (1984); og T. Ben-Porat og A.S. Kaplan, "Molecular Biology of Pseudorabies Virus", i B. Roizman ed., The Herpesviruses, 10 3, s. 105-73 (1984)).

L.M.K. Wathen et al., Virus Research 4, 19-29 (1985 beskriver fremstilling og karakterisering af mono-clonale antistoffer rettet mod PRV-glycoproteiner identificeret som gp50 og gp83 og deres anvendelse til pas-15 siv immunisering af mus mod PRV-infektion.

A.K. Robbins et al., "Localization of a Pseudorabies Virus Glycoprotein Gene Using an E. coli Expression Plasmid Library", i Herpesvirus, s. 551-61 (1984) beskriver konstruktion af et bibliotek af 20 E. coli-plasmider indeholdende PRV-DNA. De beskriver også identifikation af et PRV-gen som koder glycoproteiner med en molekylvægt på 74.000 og 92.000. De beskriver ikke glycoproteinerne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse.

25 A.K. Robbins et al., EP-patentansøgning nr.

85400704.4 (publikation nr. 162.738) beskriver isolering, cloning og eksprimering af PRV-glycoproteiner, der identificeres som gll og gill. De beskriver ikke PRV-glyco-proteinerne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse.

30 T.C. Mettenleiter et al., "Mapping of the Struc tural Gene of Pseudorabies Virus Glycoprotein A and Identification of Two Non-Glycosylated Precursor Polypeptides", J. Virol. 53, 52-57 (1985), beskriver kortlægning af det kodende område af glycoprotein gA 35 (som de ligestiller med gi) til BamHI-7-fragmentet af 4 DK 175072 B1 PRV-DNA. De anfører også, at BamHI-7-fragmentet koder for mindst tre andre virale proteiner med en molekylvægt på 65.000, 60.000 og 40.000. De beskriver eller antyder ikke DNA-sekvensen, som koder for glycoproteinerne fremstillet 5 ifølge den foreliggende opfindelse, eller fremstilingen af sådanne polypeptider ved rekombinante DNA-metoder.

B. Lomniczi et al., "Deletions in the Genomes of Pseudorabies Virus Vaccine Strains and Existence of Four Isomers of the Genomes", J. Virol. £9, 970-79 io (1984) beskriver PRV-vaccine-stammer, som har udeladelser i den særlige korte sekvens mellem 0,855 og 0,882 kort--enheder. Dette er i nærheden af gi-genet. T.C. Metten-leiter et al., "Pseudorabies Virus Avirulent Strains Fail to Express a Major Glycoprotein", J. Virol. 56, 15 307-11 (1985), har demonstreret, at tre kommercielle PRV- -vaccine-stammer mangler glycoprotein gi. Det har også for nylig vist sig, at Bartha-vaccine-stammen indeholder en udeladelse af det meste af gp63-genet.

T.J. Rea et al., J. Virol. 54, 21-29 (1935), 20 beskriver kortlægning og sekvensbestemmelse af genet for PRV-glycoproteinet, som akkumuleres i mediet af inficerede celler (gX). Blandt de flankerende sekvenser af gX-genet, som er vist deri, er en lille del af gp50-se-kvensen, der specifikt begynder ved base: nummer 1682 25 i fig. 6 deri. Denne sekvens blev imidlertid ikke identificeret som gp50-sekvensen. Endvidere er der fejl i sekvensen publiseret af Rea et al. Baserne 1586 og 1603 skal udelades. Baserne skal indføres mellem baserne 1708 og 1709, baserne 1737 og 1738, baserne 1743 og 30 1744 og baserne 1753 og 1754. Konsekvensen af disse fejl i den publiserede delvise sekvens af gp50 er en læserammeforskydning. Translation af den åbne læseramme, der begynder ved AUG-startstedet, vil give en ukorrekt aminosyresekvens for gp50-glycoproteinet.

35 DK 175072 B1 5 EP-patentpublikation nr. 133.200 beskriver en diagnostisk antigen faktor, der skal anvendes sammen med visse lectin-bundne PRV-glycoprotein-underenheds-vacciner til at skelne mellem bærere af PRV og ikke-bærere af PRV.

5 Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes et rekombinant DNA-molekyle indeholdende en DNA-sekvens kodende for et polypeptid, der udviser pseudorabies-virus-(PRV)-glycoprotein-gl-immunogenitet, hvor den nævnte DNA-sekvens er operativt forbundet med en ekspressionskon-10 trolsekvens, hvorved DNA-sekvensen, der koder for polypep-tidet, er valgt blandt sekvensen, der koder for gi, og som er

AIG OGG CCC TIT CTG CTG CGC GCC GCG CAG CTC CIG GCG CTG CTG GCC CTG GCG CTC TCC ACC GAG GCC CCG AGC CTC TCC GCC GAG AGG ACC CCG GGC CCC CTC ACC 1S GAG GIC CCG AGT GCC TCG GCC GAG CTC TOG GAG CTC ICC ACC GAG GCC GGC GAC GAT GAC CTC GAC GGC GAC CFC MC GGC GAC GA.C OGC CGC GCG GGC TTC GGC TCG GCC CTC GCC TCC CTG AGG GAG GCA CCC CGG GCC CAT CTG CTG AAC CTG ICC GAG GGC GCC AAC TTC ACC CTC GAC GCG CGC GGC GAC GGC CCC CTG GTG GCC GGG ATC TGG ACG TTC CTG OCC CTC CGC GGC TGC GAC GCC GIG GCG CIG ACC AIG GTG TGC 20 TTC GAG ACC GCC TGC CAC CCG GAC CTG CTG CIG GGC CGC GCC TGC GTC CCC GAG GCC CCG GAG CGG GGC ATC GGC GAC TAC CTG CCG CCC GAG GTG CCG GGG CTC CAG CGC GAG CCG CCC ATC CTC ACC COG GAG CGG TGG TCG CCG CAC CTG ACC GTC OGG CGG GCC ACG CCC AAC GAC ACG GGC CTC TAC AGG CTG CAC GAC GCC TCG GCG CCG CGG GCC GTG TTC TIT GTG GCG GIG GGC GAC CGG COG CCC GCG CCG CTG GCC CGG 25 GTG GGC CCC GOG OGC CAC GAG CCC CGC TTC CAC GCG CIC GGC TTC CAC TCG CAG CTC TTC TCG CCC GGG GAC ACG TTC GAC CIG AIG CCG CGC GIG GTC TCG GAC AIG GGC GAC TCG CGC GAG AAC TTC ACC GCC ACG CTG GAC TGG TAC TAC GCG CGC GCG GCC CCG CGG TGC CTG CTG TAC TAC GTG TAC GAG CCC TGC ATC TAC CAC CCG CGC

GCG CCC GAG TGC CTG CGC CCG GIG GAC CCG GCG TCC AGC TTC ACC TCG COG GCG

30

CGC GCG GOG CTG GTG GCG OGC CGC GCG TAC GCC TOG TGC AGC COG CTG CTC GGG GAC CGG TGG CIG ACC GCC TGC OCC TTC GAC GCC TTC GGC GAG GAG CIG CA.C ACG AAC GCC ACC GCG GAC GAG TCG GGG CTG TAC GIG CTC GIG AIG ACC CAC AAC GGC CAC CTC CCC ACC TGG GAC TAC ACG CTC GIC GCC ACC GCG GCC GAC TAC CTC ACG

_ GTC ATC AAG GAG CTG ACG GCC CCG GCC CGG GCC CCG GGC ACC GOG TGG GGC CCC

35

GGC GGC GGC GAC GAC GCG ATC TAC GIG GAC GGC CTC ACG ACG CCG GCG CCG CCC GCG OGC CCG TGG AAC CCG TAC GGC OGG ACG ACG CCC GGG CGG CIG ΠΤ CTG CTG

DK 175072 B1 6

GCG CIG CGC ICC TTC GTG ATG ACG TGC CTC CTC OGC GCC GCC GTC TGC CTC TGC CrCCTGTGCTCCGGCOGCOOGGGGGCCIOGOQCOOCrrCCGCCTGCCGACCOGG GCG GGG ACG OGC ATG CTC TOG GGG GTG TAC ACC ACC CTC CCC ACG CAC GAG GAC

TAC TAC GAC OGC GAC GAC GAC GAC GAG GAG GCG GCC GAC GCC OGC CGG OGG CCC

5 TCC TCC CCC OGC 03G GAC AGC OGC TAC GAC CGG CCG IAC GTG AGC CTC GAC GCC

GAG GAC GAG TTC AGC AGC GAC GAG GAC GAC OGG CTG TAC GTG CGC CCC GAG GAG

GCG OCC OGC TCC OGC TTC GAC GTC TGG.TTC OGC GAT CCG GAG AAA CCG GAA GTG

ACG AAT OGG CCC AAC TAT OGC GTG ACC OCC AGC CGC CTC TTC AAT OCC OGC CCC

GCT TAA

10 og fragmenter deraf, som koder for polypeptider, der udviser PRV-glycoprotein-antigenitet.

Desuden tilvejebringes der ifølge den foreliggende opfindelse en værtscelle transformeret med et rekombinant DNA-molekyle ifølge ofindelsen.

15 Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid, der udviser PRV-gl-antigenitet, omfattende: (a) fremstilling af et rekombinant DNA-molekyle, hvor molekylet indeholder en DNA-sekvens, der koder for et i 20 polypeptid, som udviser PRV-gl-antigenitet, hvor den nævnte DNA-sekvens er operativt forbundet med en ekspressionskontrolsekvens, (b) transformering af en passende værtscelle med det nævnte rekombinante DNA-molekyle, 25 (c) dyrkning af den nævnte værtscelle, og

(d) opsamling af polypeptidet, hvorved DNA-sekvensen er valgt blandt gi-sekvensen, som er ATG CGG CCC TTT CTG CTG OGC GCC GCG CAG CTC CTG CCG CTG CFG GCC CTC GCG

CTC TGC ACC GAG OCC CCG AGC CTC TCC GCC GAG ACC ACC OCC OGC CCC GTC ACC

30 GAG GTC CCC AGT CCC TCC OCC GAG CTC TGG GAC CTC TCC ACC GAG GCC OGC GAC -

GAT GAC CTC GAC OGC GAC CTC AAC GGC GAC GAC OGC CGC GCG GGC TTC OGC TOG

GCC CTC GCC TCC CTG AGG GAG GCA CCC CCG GCC CAT CTG GTG AAC GTG TCC GAG

GGC GCC AAC TTC ACC CTC GAC GCG CGC GGC GAC GGC GCC GTG GTG GCC OGG AXC

TGG ACG TTC CTG CCC GTC OGC OGC TGC GAC OCC GTG GCG GTG ACC ATG GTG TGC

35 TTC GAG ACC GCC TGC CAC CCG GAC CTG GTG CTG GGC CGC GCC TGC CTC CCC GAG

DK 175072 B1 7

GCC CCG GAG OGG OGC ATC GGC GAC TAC CTG CCG CCC GAC CTG CCG CGG CTC CAG OGC GAG GOG OCC AXC GTC ACC CCG GAG OGG TGC TCG GCC CAC CTG ACC GTC OGG CGG GCC ACG CCC AAC GAC ACG GGC CTC TAC ACG CTG CAC GAC GGC TCG GCG CCG CGG GCC GIG TTC TIT GTG GCG GTG GGC GAC CGG CCG CCC GCG CCG CIG GCC CCG 5 CIG GCC CCC GOG CGC CAC GAG CCC CGC TTC CAC GCG CTC GCC TTC CAC TCG CAG CTC TTC TCG CCC GGG GAC ACG TIC GAC CTG AIG OGG GGC GTG GTC TCG GAC AIG GGC GAC TCG OGC GAG AAC TTC ACC GCC ACG CIG GAC TGG TAC TAC GCG OGC GCG CCC GCG OGG 7GC CIG CIG TAG TAC GTG TAC GAG CCC TGC ATC TAC CAC GCG OGC GCG CCC GAG 7GC CTG OGC CGG GTG GAC COG GCG ICC AGC TTC ACC TCG CCG GCG 10 CGC GCG GCG CIG GIG GCG OGC CGC GCG TAC GCC TCG TGC AGC CCG CIG CTC GGG GAC OGG TGG CTG ACC GCC TGC CCC TTC GAC GCC TTC GGC GAG GAG GTG CAC ACG AAC GCC ACC GCG GAC GAG TCG GGG CTG TAC GIG CTC GTG ATG ACC CAC AAC GGC CAC GTC GCC ACC TGG GAC TAC ACG CTC GTC GCC ACC GCG GCC GAG TAC GTC ACG GTC ATC AAG GAG CTG ACG GCC CCG GCC OGG GCC OCG GGC ACC OOG TGG GGC CCC 15 GGC GGC GGC GAC GAC GCG ATC TAC GTG GAC GGC GTC ACG ACG CCG GCG CCG CCC GCG CGC CCG TGG AAC CCG TAC GGC CGG ACG ACG CCC GGG CGG CTG TIT GTG CIG GCG CIG GGC 7CC TTC GTG AIG ACG TGC GTC GTC GGG GGG GCC GTC TGG CTC TGC GIG CIG TGC TCC CGC CGC GGG GCG GCC TCG CGG CCG TTC OGG GTG CGG ACG CGG GCG GGG ACG OGC ATG CTC TCG CCG GTG TAC ACC AGC CTG CCC ACG CAC GAG CAC 20 TAC TAC GAC GGC GAC GAC GAC GAC GAG GAG GCG GGC GAC GCC OGC OGG CGG. CCC TCC TCC CCC GGC GGG GAC AGC GGC TAC GAG GGG CCG TAC GTG ACC CIG GAC GCC GAG GAC GAG TIC AGC AGC GAC GAG GAC GAC GGG CIG TAC GIG CGC OCC GAG GAG GCG CCC CGC TCC GGC TTC GAC CTC TGG TIC CGC GAT COG GAG AAA CCG GAA GIG

ACG AAT GGG OCC AAC TAT GGC CTG ACC GCC AGC OGC CTG TIG AAT CCC OGC OCC

25 GCT TAA

og fragmenter deraf, som koder polypeptider, der udviser pseudorabiesvirus-antigenitet.

Endelig tilvejebringes der ifølge den foreliggende opfindelse også et diagnostisk sæt til anvendelse til at 30 skelne mellem dyr, der er vaccineret mod PRV, og dyr, der er inficeret med PRV, hvilket sæt er ejendommeligt ved, at at det omfatter flere beholdere, og en af beholderne indeholder et polypeptid, der udviser PRV-glycoprotein-gl-antigenitet og er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge 3 5 krav 8.

8

Ulv Ί /5Ό/Ζ Dl

Med det omhandlede rekombinante DNA-molekyle, den omhandlede værtscelle og den omhandlede fremgangsmåde muliggøres for første gang fremstilling af et diagnostisk sæt af den omhandlede art, hvilket udgør et oplagt og væsentligt 5 teknisk fremskridt.

Glycoproteinet, som kodes af genet, er defineret som et glycoprotein, der reagerer med et bestemt mono-clonalt antistof. Dette glycoprotein svarer ikke til nogen af de hidtil kendte PRV-glycoproteiner. Wathen og Wathen 10 har kortlagt en mutation, som er resistent mod det mono-clonale antistof, som på basis af fortilfælde i herpes simplex-virus (f.eks. T.C. Holland et al., J. Virol 52, 566-74 (1984)), kortlægger placeringen af det strukturelle gen for gp50. Wathen og Wathen har kortlagt gp50-15 -genet til det mindre Sall/BamHI-fragment inden i

BamHI-7-fragmentet af PRV. Rea et al., se ovenfor, har kortlagt PRV-glycoprotein-gX-genet til det samme område.

PRV-gl-genet er isoleret ved screening af PRV-DNA-biblioteker konstrueret i bakteriofag-20 -ekspressionsvektoren Agtll (J.G. Timmins et al., "A method for Efficient Gene Isolation from Phage Jjgtll Libraries: Use of Antisera to Denatured, Acetone--Precipitated Proteins", Gene 39, 89-93 (1985); R.A.

Young og R.W. Davis, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 80, 25 1194-98 (1983); R.A. Young og R.W. Davis, Science 222, 773-82 (1983)).

PRV-genomisk DNA afledt af PRV-Rice-stammen, der oprindelig blev tilvejebragtfra D.P. Gustafson ved Purdue University, blev isoleret fra cytoplasmaet af 30 PRV-inficerede Vero-celler (ATCC CCL 81). Det genomiske DNA blev fragmenteret ved lydbehandling og derefter clo-net i ^gt'll til dannelse af et ,λ/PRV rekombinant ( λPRV) DNA-bibliotek.

Antisera til screening af ^PRV-biblioteket frem-35 stilles ved at pode mus med proteiner isoleret fra celler inficeret med PRV (inficeret-celle-proteiner eller DK 175072 B1 9 ICP'er), som er blevet adskilt efter størrelse på SDS-geler, og derefter isolere antistofferne.

X PRV-fagerne, der skal screenes, udplades på et lag E. coli. ^gtll indeholder et enestående cloningssted i 5 3'-enderne af lacZ-genet. Fremmede DNA'er, som indføjes i dette enestående sted i den rette orientering og læseramme giver ved ekspression polypeptider bundet til β-galactosidase. Et nitrocellulosefilter indeholdende en inducer for lacZ-transcription til at fremme eks-10 pressionen af PRV-DNA anbringes oven på laget. Efter at fusions-polypeptiderne eksprimeret af /JPRV'er har haft tilstrækkelig tid til at binde til nitrocellulosefilterne, fjernes filterne fra lagene og undersøges med de ovenfor anførte muse-antisera. Pletter, som producerer antigen, 15 der bindes til muse-antiserum, identificeres ved undersøgelse med et mærket antistof for muse-antiserum.

Pletter, som giver et positivt signal, anvendes til at transformere en E. coli-vært (Y1090, tilgængelig fra ATCC, Rockville, MD 20852) . Kulturerne inkuberes 20 derefter natten over til dannelse af ^PRV-fagmaterialer.

Disse fag-materialer anvendes til at inficere E. coli K95 (D. Friedman i The Bacteriophage Lambda, s. 733-38, A.D. Hershey, ed. (1971)). Polypeptider produceret af den transformerede E. coli K95 renses ved præparativ 25 gelelektroforese. Polypeptider, som er overproduceret (på grund af induktionen af transcriptionen af lacZ--genet), der har molekylvægte over 116.000, og som også er fraværende i ^gtll-kontrolkulturer, er β-galacto-sidase-PRV-fusionsproteiner. Hvert enkelt fusionspro-30 tein injiceres derefter særskilt i en mus til dannelse af antisera.

Mærkede PRV-ICP’er dannes ved at inficere Vero-, -celler, der vokser i et medium, som f.eks. indeholder 14 C-glucosamin (T.J. Rea et al., ovenfor). De ovenfor an-35 førte fusionsprotein-antisera anvendes til immunopreci-pitation af disse mærkede ICP'er. De således udfældede polypeptider analyseres ved gelelektroforese. Et af dis- DK 175072 B1 10 se er et glycoprotein (gi) med en molekylvægt på 110.000.

Det demonstreres på denne måde, at genet clonet i fagerne, der danner det hybride protein, som fremkalder anti-gl-gp63-serum, er gi-genet. Dette gen viser sig at være placeret i 5 BamHI-7-fragmentet af PRV-genomet (T.J. Rea et al., ovenfor) (se blad D). gi-placeringen stemmer generelt overens med det område, hvor Mettenleiter et al., ovenfor, har placeret gi-genet. Imidlertid har Mettenleiter et al. antydet, at gi-genet strækker sig ind i BamHI-12-fragmentet, hvilket 10 det ikke gør.

Denne λ-PRV-genisoleringsmetode er hurtig og effektiv i sammenligning med DNA-hybridisering og in vi-t'ro-translation af udvalgte mRNA'er. Da rensede glyco-proteiner ikke stod til rådighed, kunne oligonucleotid-15 -sonder ikke hurtigt konstrueres ud fra aminosyresekvens-data, og der kunne heller ikke dannes højspecifikke po-lyclonale antisera. Derfor blev den ovenfor anførte metode anvendt.

Som ovenfor nævnt placeres genet, der koder gi, i 20 BamHI-7-fragmentet af PRV-DNA. BamHI-7-fragmentet af PRV kan afledes af plasmidet pPRXhl (også kendt som pUC1129), og fragmenter, der er bekvemme til DNA-sekvensanalyse, kan fås ved standard-subcloningsprocedurer. Plasmidet pUC1129 kan fås fra E. coli HB101, NRRL B-15772. Denne kultur er 25 tilgængelig fra den permanente samling hos Northern Regional Research Center Fermentation Laboratory (NRRL), U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, U.S.A.

E. coli HB101 indeholdende pUC1129 kan dyrkes i L-næringsmedium ved velkendte procedurer. Typisk dyrkes 30 kulturer til en optisk tæthed på 0,6, hvorefter der tilsættes chloramphenicol, og kulturen henstilles under om- 35 DK 175072 B1 11 rystning natten over. Kulturen lyseres derefter f.eks. ved anvendelse af SDS med høj saltkoncentration, og den ovenstående væske underkastes en cæsiumchlorid/-ethidiumbromid-ligevægtsdensitetsgradientcentrifuge-5 ring, hvorved plasmiderne fås.

Tilgængeligheden af denne gensekvens muliggør direkte manipulering af genet og gensekvensen, hvilket tillader modifikationer af reguleringen af ekspressionen og/eller strukturen af proteinet kodet af 10 genet eller et fragment deraf. Kendskabet til denne gensekvens gør det også muligt at clone det tilsvarende gen eller fragment deraf fra enhver stamme af PRV under anvendelse af den kendte sekvens som hybridiseringssonde og at eksprimere hele proteinet eller et fragment deraf 15 ved rekombinante metoder, der er almindeligt kendte.

Kendskabet til denne gensekvens har gjort det muligt at udlede aminosyresekvensen af det tilsvarende polypeptid (kort C). Som resultat heraf kan fragmenter af dette polypeptid med PRV-immunogenitet frem-20 stilles ved standardmetoder til proteinsyntese eller rekombinante DNA-metoder. Som anvendt i den foreliggende beskrivelse anvendes udtrykkene immunogenitet og anti-genitet afvekslende om evnen til at stimulere enhver type af adaptiv immunreaktion, dvs. udtrykkene antigen 25 og antigenitet er ikke i betydning begrænset til stoffer, der stimulerer produktionen af antistoffer.

Den primære struktur (sekvens) af genet, der koder for gi er også anført i kort C.

Genet eller fragmenterne deraf kan udvindes 30 fra pUC1129 ved nedbrydning af plasmid-DNA'et fra en kultur af NRRL B-15772 med passende endonuclease-re-striktionsenzymer. F.eks. kan BamHI-7-fragmentet isoleres ved nedbrydning af et præparat af pUC1129 med

BamHI og isoleres ved gelelektroforese.

35 DK 175072 B1 12

Alle restriktions-endonucleaserne, som er omtalt i den foreliggende beskrivelse, er kommercielt tilgængelig, og deres anvendelse er velkendt. Brugsanvisninger gives i almindelighed af de kommercielle leverandører af 5 restriktionsenzymerne.

Det udskårne gen eller fragmenter deraf kan ligeres til forskellige cloningsbærere eller vektorer til anvendelse ved transformering af en værtscelle. Vektorerne indeholder fortrinsvis DNA-sekvenser til at starte, 10 kontrollere og afslutte transcription og translation (som tilsammen udgør ekspression) af PRV-glycoprotein--generne og er derfor operativt forbundet dermed. Disse "ekspressionskontrolsekvenser" er fortrinsvis forenelige med værtscellen, der skal transformeres. Når værtcellen 15 er en celle af et højere dyr, f.eks. en pattedyrcelle, kan de naturligt forekommende ekspressionskontrolsekvenser af glycoprotein-generne anvendes alene eller sammen med heterologe ekspressionskontrolsekvenser. Heterologe sekvenser kan også anvendes alene. Vektorerne indeholder 20 yderligere fortrinsvis et markørgen (f.eks. antibioti kumresistens) , således at der fås et fænotypisk træk til selektion af transformerede værtsceller. Desuden vil en replikerende vektor indeholde et replicon.

Typiske vektorer er plasmider, fager og vira, 25 der inficerer dyreceller. Der kan i det væsentlige anvendes enhver DNA-sekvens, som er i stand til at transformere en· værtscelle.

Ved udtrykket "værtscelle" som anvendt i den foreliggende beskrivelse menes en celle, der er i stand til 30 at blive transformeret med DNA-sekvensen, der koder for et polypeptid, som udviser PRV-glycoprotein-antigenitet. Fortrinsvis er værtscellen i stand til at eksprimere PRV-polypeptidet eller fragmenter deraf. Værtscellen kan være prokaryotisk eller eukaryotisk. Illustrerende pro-35 DK 175072 B1 13 karyotiske celler er bakterier, såsom E. coli, B. subtilis, pseudomonas og B. stearothermofilus. Illustrerende eukaryotiske celler er gærceller eller celler af højere dyr, såsom celler fra insekter, planter eller pat-5 tedyr. Pattedyr-cellesystemer vil ofte foreligge i form af monolag af celler, selv om pattedyrcelle-suspensioner også kan anvendes. Pattedyr-cellelinier omfatter f.eks.

Vero og HeLa-celler, kinesisk hamster-ovarie-cellelinier (CHO-cellelinier), WI38-, BHK-, COS-7- eller MDCK-10 -cellelinier. Insekt-cellelinier omfatter Sf9-linien af Spodoptera frugiperda (ATCC CRL1711). En sammenfatning af nogle tilgængelige eukaryotiske plasmider, værtsceller og metoder til anvendelse af disse til cloning og ekspression af PRV-glycoproteiner kan findes i 15 k. Esser et al., Plasmids of Eukaryotes (Fundamentals and Applications), Springer-Verlag (1986).

Som ovenfor anført indeholder vektoren, f.eks. et plasmid, som anvendes til at transformere værtscellen, fortrinsvis forenelige ekspressionskontrolsekvenser til 20 ekspression af PRV-glycoprotein-genet eller fragmenter der af. Ekspressionskontrolsekvenserne er derfor operativt forbundet med genet eller fragmentet. Når værtscellerne er bakterier, omfatter illustrerende anvendelige ekspressionskontrolsekvenser trp-promotoren og -operatoren 25 (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8_, 4057 (1980)); lac--promotor og -operator (Chang et al., Nature 275, 615 (1978) ) ; ydre membran protein promotor (EMBO J. 1, 771-775 (1982)); bakteriofag* /(-promotorer og -operatorer (Nucl. Acids Res. 11, 4677-4688 (1983)); a-amy-30 lase (B. subtilis) promotor og -operator. Terminerings-sekvenser og andre ekspressionsfremmende og -kontrollerende sekvenser, som er forenelige med den valgte værtscelle. Når værtscellen er gær, omfatter illustrerende anvendelige ekspressionskontrolsekvenser f.eks. a-mating 35 DK 175072 B1 14 faktor. Til insektceller kan polyhedrin-promotoren af baculovira anvendes (Mol. Cell. Biol. 2, s. 2156-65 (1983)). Når værtscellen stammer fra insekter eller pattedyr, omfatter illustrerende anvendelige ekspres-5 sionskontrolsekvenser f.eks. SV-40 promotor (Science 222, 524-527 (1983)) eller f.eks. metallothionein--promotor (Nature 296, 39-42 (1982)) eller en varme-chok-promotor (Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 82^ s. 4949-53 (1985)). Som ovenfor anført kan man, 10 når værtscellen er en pattedyrcelle, anvende ekspressionskontrolsekvenserne for PRV-glycoprotein-genet, men fortrinsvis i kombination med heterologe ekspressionskontrolsekvenser .

Plasmidet eller replikerende eller integrerende 15 DNA-materiale indeholdende ekspressionskontrolsekvenserne spaltes under anvendelse af restriktionsenzymer, størrelses-justeres i nødvendigt eller ønskeligt omfang og ligeres med PRV-glycoprotein-genet eller fragmenter deraf ved velkendte metoder. Når der anvendes gær-værtsceller 20 eller værtsceller af højere dyr, kan polyadenylerings- eller terminatorsekvenser fra kendte gær- eller pattedyrgener inkorporeres i vektoren. Der kan f.eks. anvendes kvæg-væksthormon-polyadenyleringssekvensen som anført i EP-patentpublikation nr. 93.619. Desuden kan gensekven-25 ser til kontrol af replikationen af værtscellen inkorpo reres i vektoren.

Værtscellerne er kompetente . eller gøres kompetente til transformation på forskellig måde. Når bakterieceller er værtsceller, kan de gøres kompetente ved 30 behandling med salte, typisk et calciumsalt, som generelt beskrevet af Cohen, PNAS, 69, 2110 (1972). En gær--værtscelle gøres i almindelighed kompetent ved fjernelse af dens cellevæg eller på anden måde, f.eks. ved ionisk behandling (J. Bacteriol. 153, 163-168 (1983)).

i 35 DK 175072 B1 15

Der findes flere velkendte metoder til indføring af DNA i dyreceller, herunder f.eks. calciumphosphat-præci-pitation, fusion af de modtagende celler med bakterie--protoplaster indeholdende DNA'et, behandling af de 5 modtaqende celler med lioosomer indeholdende DNA'et og mikroinjektion af DNA'et direkte i cellerne.

De transformerede celler opformeres ved velkendte metoder (Molecular Cloning, T. Maniatis et al.,

Cold Spring Harbor Laboratory, (1982); Biochemical 10 * Methods In Cell Culture And Virology, R.J. Kuchler,

Dowden, Hutchinson og Ross, Inc., (1977); Methods In Yeast Genetics, F. Sherman et al., Cold Spring Harbor Laboratory, (1982)) og det eksprimerende PRV-glyco-protein eller fragmentet deraf høstes fra cellemediet 15 i de systemer, hvor proteinet udskilles fra værtscellerne, eller fra cellesuspensionen efter brydning af værtscellesystemet ved f.eks. velkendte mekaniske eller enzymatiske metoder.

Som ovenfor anført er aminosyresekvensen af PRV-20 glycoproteinet som afledt af genstrukturen anført i kort C. Polypeptider, som udviser PRV-glycoprotein-antigenitet, omfatter sekvensen anført i kort C og enhver del af poly-peptidsekvensen, som er i stand til at fremkalde en immunreaktion hos et dyr, f.eks. et pattedyr, som har modtaget 25 en injektion af polypeptidsekvensen.

Som ovenfor anført kan hele genet, der koder for PRV-glycoproteinet, anvendes til at konstruere vektorerne og transformere værtscellerne til ekspression af PRV-glycoproteinet, eller der kan anvendes fragmenter 30 af genet, som koder for PRV-glycoproteinet, hvorved den resulterende værtscelle vil eksprimere polypeptider, der udviser PRV-antigenitet. Ethvert fragment af PRV-glyco-protein-genet kan anvendes, hvilket resulterer i ekspression af et polypeptid, som er et immunogent fragment af 35 PRV-glycoproteinet eller en analog deraf. Som det er velkendt, muliggør degenerationen af den genetiske kode let DK 175072 B1 16 substitution af basepar til dannelse af funktionelt ækvivalente gener eller fragmenter deraf, som koder polypep-tider, der udviser PRV-glycoprotein-antigenitet. Disse funktionelle ækvivalenter er også omfattet af opfindelsen.

5 Kort D og N-Q er anført for at illustrere konstruk tionerne ifølge eksemplerne. Der anvendes bestemte konventioner til illustrering af plasmider og DNA-fragmenter på følgende måde: (1) Figurerne med en enkelt linie viser både cirkulært 10 og lineært dobbeltstrenget DNA.

(2) Stjerner viser, at det viste molekyle er cirkulært.

Hvis der ikke er anført en stjerne, er molekylet lineært.

' (3) Endonuclease-restriktionssteder af interesse er an ført over linien.

15 (4) Gener er anført under linien.

(5) Afstandene mellem gener og restriktionssteder er ikke i korrekt målestok. Figurerne viser kun de relative positioner, medmindre andet er anført.

De fleste af de rekombinante DNA-metoder, der an-20 vendes ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse, er standardprocedurer, der er velkendte af fagmanden og f.eks. beskrevet detaljeret i Molecular Cloning, T.

Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, (1982) og B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, 25 John Wiley & Sons (1984).

Eksempel 1 I dette eksempel beskrives isolering, kloning og 30 sekvensbestemmelse af gi-genet. i 1. Bibliotekskonstruktion.

PRV-genomisk DNA fremstilles som tidligere beskrevet (T.J. Rea et al., ovenfor). Fragmenter på 0,5--3,0 kb fås ved lydbehandling af det PRV-genomiske 35 DNA af PRV-Rice-stammen to gange i 4 sekunder hver gang på indstilling 2 med et Branson 200-lydbehandlingsappa- DK 175072 B1 17 rat. Efter dannelse af stumpe ender hos fragmenterne med T4-DNA-polymerase ligeres fragmenterne til kinase-behandlede EcoRI-linkere (T. Maniatis et al., ovenfor).

Efter over-nedbrydning med EcoRI (da PRV-DNA ikke inde-5 holder et EcoRI-sted, er. methylering unødvendig) , fjernes overskydende linkere ved agarose-gelélektroforese. PRV-DNA-fragroenter i det ønskede størrelseinterval elu-eres ved glasopslæmningsmetoden (B: Vogelstein og D. Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7£, s 615-19 10 (1979)). Et bibliotek på 61.000 ^/PRV-rekombinanter ( PRV’er) konstrueres ved at ligere 500 ng af PRV--DNA-f ragmenter til 7 50 ng af EcoRI-nedbrudt ^gtll (R.A. Young og R.W. Davis, ovenfor) DNA i 50 mM Tris (pH-værdi 7,4), 10 mM magnesiumchlorid, 10 mM dithio-15 treitol, 1 mM spermidin, 1 mM ATP, 400 enheder af T4--DNA-ligase (New England Biolabs), i et slutvolumen på 10^,ul. Det ligerede DNA emballeres i bakteriofag -virioner under anvendelse af "Packagene"-ekstrakt (Promega Biotec, Madison, Wisconsin).

20 2. 2 PRV-bibliotek-screening.

/\ PRV-biblioteket screenes som ovenfor beskrevet (J.G. Timmins et al., ovenfor; R.A. Young og R.W. Davis, ovenfor). 20.000 fager screenés pr. 150 mm LB-ampicil-25 lin-plade. Screening-antisera dannes ved injektion hos mus af størrelsesfraktioner af proteiner af PRV-infi-cerede celler (ICP'er) elueret fra SDS-polyacrylamid-geler (J.G. Timmins et al., ovenfor). Pletter, som giver positive signaler ved screening med antisera, opsamles fra agarpladerne med en steril pasteurpipette, resus-penderes i 1 ml SM-puffer (T. Maniatis et al., ovenfor) og screenes igen. Screeningen gentages, indtil pletterne reagerer ensartet positivt.

Ca. 43.000 ^.PRV-rekombinanter screenes med mu-35 se-antisera over for proteiner fra PRV-inficerede Vero--celler isoleret fra SDS-polyacrylamidgeler. Der isoleres 60 positive ^PRV-fager.

DK 175072 B1 18 3. Fag-forrådsfremstilling. i

Fag-forråd med høj titer (1010-1011 pfu/ml) fremstilles ved plade-lysat-metoden (T. Maniatis et al., ovenfor). En enkelt velisoleret positiv sig-5 nalplet opsamles og resuspenderes i 1 ml SM. 100^,ul af suspensionen adsorberes til 300^ul af E. coli Y1090 (tilgængelig fra American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland) ved 37°C i 15 minutter, fortyndes med 10 ml LB-top-agarose, udhældes 10 jævnt på en 150 mm LB-ampicillin-plade og inkuberes natten over ved 42°C. Top-agarosen skrabes forsigtigt af med et flammebestrøget objektglas og overføres til et 30 ml Corex-rør. Der tilsættes 8 ml SM og 250^ul chloroform, hvorefter der blandes og inkuberes ved 15 37°C i 15 minutter. Lysatet klares ved centrifugering ved 10.000 o/in i 30 minutter på en HB-4-rotor. Fag-forrådet opbevares ved 4°C med 0,3% chloroform.

4. Fusionsprotein-fremstilling og -analyse.

20 LB-medium (Maniatis et al., ovenfor) podes i forholdet 1:50 med en frisk kultur fra natten over af E. coli K95 (sup , pi , gal , strr, nusA ; D. Friedman, ovenfor) og dyrkes til én ORD^Q-værdi på 0,5 ved 30°C.

25 ml af kulturen inficeres med ^PRV-fag ved en multi- ' 25 plicitet på 5 og inkuberes ved 42°C i et omrystnings- -vandbad i 25 minutter, efterfulgt af overføring til 37°C i 2-3 timer. Cellerne pelleteres ved 5.000 o/m i 10 minutter i HB-4-rotoren og resuspenderes i 100^,ul 100 mM Tris (pH-værdi 7,8), 300 mM NaCl. Der tilsættes 30 et lige så stort volumen af 2x SDS-PAGE-prøvepuffer, og prøven koges i 10 minutter. 5^,ul af hver prøve analyseres ved elektroforese på analytiske SDS-polyacryl-amidgeler som beskrevet af L. Morse et al., J. Virol.

26, s. 389-410 (1978). Fusionspolypeptid-præparaterne 35 i i

--J

DK 175072 B1 19 opskaleres 10 gange til injektion i mus. Ø-Galacto-sidase/PRV-fusionspolypeptiderne isoleres efter farvning af en strimmel af gelen med Coomassie blue (L. Morse et al., ovenfor; K. Weber og M. Osborn, i 5 The Proteins 1, s. 179-223 (1975)). Fusionspolypeptid- -mængderne vurderes ved analytisk SDS-PAGE. Oellely-saterne fra ^PRV-inficerede E. coli K95-kulturer underkastes elektroforese i 9,25%'s SDS-polyacrylamid— geler. Overproducerede polypeptidbånd med molekylvægte 10 over 116.000, der ikke findes i ^gtll-inficerede kon troller, er (5-galactosidase-PRV-fusionspolypeptider.

8-Galactosidase-PRV-fusionspolypeptiderne har molekylvægte fra 129.000 til 158.000. Ca. 50-75^,ug fusions-polypeptid resuspenderes i komplet Freund's adjuvans 15 og injiceres subcutant og interperitonealt i hver mus.

Senere injektioner foretages intraperitonealt i ukomplet Freund's adjuvans.

5. Antisera-analyse.

20 Immunopræcipi tat ioner af ^C-glucosamin-ICP'er, 35 14 S-methionin-ICP'er og C-glueosamln-gX gennemføres som tidligere beskrevet (T.J. Rea et al., ovenfor).

Disse metoder viser, at gi er isoleret i en Xgtll rekombinant fag. Denne fag betegnes Λ23 (gi).

25 6. Pi -DNA-minjpræparat ioner.

Bakteriofager isoleres hurtigt fra pladely- sater (T.J. Silhavy et al., Experiments With Gene 30 Fusions, (1984)). 5%'s og 40%'s glyceroltrin (3 ml af hver i SM-buffer) lægges i lag i et SW41-rør. Et pladelysat (ca. 6 ml) lægges i lag og centrifugeres ved 35.000 o/ra i 60 minutter ved 4°C. Den ovenstående væske bortkastes, og den fremkomne fag-pellet resus-35 20 DK 175072 B1 penderes i 1 ml SM. DNAse I og RNAse A tilsættes til slutkoncentrationer på l^ug/ml og lO^ug/ml. Efter in-kubering ved 37°C i 30 minutter tilsættes 200 ml SDS--blanding (0,25 M EDTA, 0,5 N tris (pH-værdi 7,8), 5 2,5% SDS) og proteinase K (til 1 mg/ml), og der in kuberes ved 68°C i 30 minutter. /)DNA ekstraheres 3 gange med phenol, ekstraheres med chloroform og udfældes med ethanol. Et gennemsnitligt lysat fra en 150 mm plade giver 5-10^,ug '^-DNA.

10 7. /)PRV-DNA-analyse.

PRV-DNA nedbrydes fuldstændigt med BamHI og ’ Kpnl, underkastes elektroforese i 0,8% agarose og overføres til nitrocellulose ved metoden ifølge Southern, 15 J. Mol. Biol. 98, s. 503-17 (1975)). De fremkomne blots opskæres i strimler på 4 mm.' og opbevares tørret ved 20-25°C. ^-PRV-DNA'er nick-translateres (Amersham)

O

til specifikke aktiviteter på ca. 10 cpm^ug. Præhy-bridisering gennemføres i 6 x SSC, 30% formamid, 1 x 20 Denhard£s reagens (0,02% ficoll, 0,02% polyvinylpyr- rolidon, 0,02% kvægserumalbumin), 0,1% SDS, 50^ug/ml heterologt DNA ved 70°C i 1 time. Hybridiseringen gennemføres i den samme opløsning ved 70°C i 16 timer.

Der gennemføres 15 minutters vaskninger to gange i 25 2 x SSC, 0,1% SDS og to gange i 0,1 x SSC, og 0,1% SDS, alle ved 20-25°C. De fremkomne blots autoradio-graferes med en intensiverende skærm ved ca. 70°C natten over.

Ved Southern-blotting kortlægges PRV-glycoprotein-30 generne, der er indeholdt i X23, til BamHI-7-fragmentet i det enestående lille område (se T.J. Rea et al., ovenfor). Finere kortlægning af dette fragment viser, at X23 (gi) genet kortlægges distalt til gX-genet, som vist i kort D.

35 DK 175072 B1 21 8. Sekvensbestemmelse af gi-genet.

Plasmidet pPR28-l fremstilles ved at nedbryde pPR28 med PvuII og derefter recirkularisere stykket indeholdende E. coli-replikationsstarten og bla-genet 5 til dannelse af et plasmid indeholdende et 4,9 kb

PvuII/BamHI-7-PRV-fragment indeholdende DNA-sekvensen for gi.

Kort N viser forskellige restriktionsenzym--spaltningssteder placeret i gi-genet og de flankerende 10 områder. BamHI-7 subklones, nedbrydes, mærkes og sekvens-bestemmes som ovenfor anført.

DNA-sekvensen for glycoproteinet gi er anført i kort C. Dette DNA kan anvendes til påvisning af dyr, der er aktivt inficeret med PRV. Man kan f.eks. tage en næse- eller 15 halspodepind og derefter ved standard-DNA/DNA-hybridise-ringsmetoder påvise tilstedeværelsen af PRV.

Eksempel 2 20 I dette eksempel beskrives ekspressionen af gi i pattedyrceller.

Et BamHI-7-fragment indeholdende gi-genet isoleres fra plasmidet pPR28 (se ovenfor) ved nedbrydning af plasmidet med BamHI, adskillelse af fragmenterne 25 på agarosegel og derefter udskæring af fragmentet fra gelen.

Idet der henvises til kort 0, klones det ovenfor isolerede BamHI-7-fragment derefter i plasmidet pUC19 (anskaffet fra Pharmacia/PL) til dannelse af plasmidet A.

30 Plasmidet A nedbrydes med Dral. Dral spalter pUC19--sekvensen på flere steder, men kun en gang i BamHI--7-sekvensen mellem gp63- og gi-generne (kort D) til dannelse af blandt andet fragment 1. BamHI-linkere ligeres til Dral-enderne af fragmenterne, herunder frag-35 ment 1, og den fremkomne fragmentblanding nedbrydes med BamHI. Produkt-fragmenterne adskilles ved agarosegel-elektroforese, og fragment 2 (2,5 kb) indeholdende gi- DK 175072 B1 22 -genet renses. Fragment 2 klones i pUC19 nedbrudt med BamHI til dannelse af plasmidet pUCD/B. Blandt de to således dannede plasmider bestemmes plasmidet indeholdende gi-genet med korrekt orientering ved nedbrydning af plas-5 miderne med Bsml og EcoRI. Plasmidet med korrekt orientering indeholder et karakteristisk 750 bp Bsml/EcoRI--fragment.

Idet der henvises til kort P, nedbrydes plasmidet pUCD/B (kort 0) med Bsml og EcoRI, og det store 10 fragment (fragment 3, 4,4 kb) renses ved agarosegel-elektroforese. De følgende to oligonucleotider syntetiseres kemisk ved velkendte metoder eller anskaffes udefra.

15 5' CGCCCCGCTTAAATACCGGGAGAAG 3' 51 AATTCTTCTCCCGGATTTAAGCGGGGCGGG 3'

Disse oligonucleotider ligeres til fragment 3 2o til erstatning af den kodende sekvens for C-terminusen af gi-genet, der blev fjernet ved BsmI-spaltningen.

Det fremkomne plasmid pGI indeholder en komplet kodende region af gi-genet med et BamHI-spaltningssted ovenfor og et EcoRI-spaltningssted nedenfor de gi-kodende se-25 kvenser.

Plasmidet pGI nedbrydes med EcoRI og BamHI, og et 1,8 kb fragment indeholdende gi-genet (fragment 4) renses på en agarosegel.

Plasmidet pSV2dhfr (ovenfor) spaltes med EcoRI 30 og spaltes derefter med BamHI til dannelse af fragment 5 (5,0 kb) indeholdende dhfr-markøren, som isoleres ved agarosegelelektroforese. Derefter ligeres fragmenterne 4 og 5 til dannelse af plasmidet pDGI, som indeholder dihydrofolat-reduktase- og ampicillinresistens-3 5 -markørerne, SV4O-promotoren og replikationsstarten.· og gi-genet.

DK 175072 B1 23

Idet der henvises til kort tilføjes den umiddelbare tidlige promotor fra humant cytomegalovirus, Towne-stamme, ovenfor gi-genet. Plasmidet pDGI nedbrydes med BamHI til dannelse af fragmentet 6. Den umiddelbare 5 tidlige promotor af humant cytomegalovirus (Towne) isoleres (se ovenfor) til dannelse af fragment 7. Fragmenterne 6 og 7 ligeres derefter til dannelse af plasmidet pDIEGIdhfr. Til bekræftelse af, at promotoren har korrekt orientering nedbrydes plasmidet med Sacl-10 og BstEII-restriktionsenzymer. Dannelse af et fragment på ca. 400 bp viser korrekt orientering.

Et 0,6 kb Pvuil/EcoRI-fragment indeholdende kvæg-væksthormon-polyadenyleringssignalet isoleres fra plasmidet pSVC0W7 (se ovenfor) til dannelse af frag-15 ment 8. Fragment 8 klones over Smal/EcoRI-stederne af pUC9 (se ovenfor) til dannelse af plasmidet pCOWTl. pCOWTl spaltes med Sall, behandles med T4-DNA-poly-merase, og der tilligeres EcoRI-linkere. Den således fremstillede fragmentblanding nedbrydes derefter med 20 EcoRI, og der isoleres et 0,6 kb fragment (fragment 9).

Fragment 9 klones i EcoRI-stedet af pUC19 til dannelse af plasmidet pCOWTIE. pCOWTlE nedbrydes med EcoRI til dannelse af fragmentet 10 (600 bp).

Plasmidet pDIEGIdhfr nedbrydes med EcoRI og 25 ligeres med fragment 10 indeholdende bGH-plyadeny-leringssignalet til dannelse af plasmidet pDIEGIPA.

Plasmidet med gi-genet i korrekt orientering påvises ved produktionen af et 1400 bp fragment ved nedbrydning med BamHI og BstEII.

30 Det fremkomne plasmid transficeres i dhfr-- -ovarieceller af kinesisk hamster, og dhfr+-celler selekteres til opnåelse af cellelinier, der eksprime-rer gi (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1, s.

854-64 (1981)). Ekspressionen af gi forstærkes ved at 35 selektere kloner af transficerede celler, der overlever dyrkning i gradvis højere koncentrationer af methotrexat (McCormick et al., Mol. Cell. Biol. 4, s. 166-72 (1984).

DK 175072 B1 24

BamHI/EcoRI-fragmentet af plasmidet pGI, der er beskrevet ovenfor, kan også behandles med Bal3I og indføjes i pTRZ4 (fremstillet som beskrevet i US-patentansøgning nr.

606.307) som beskrevet af Rea et al. ovenfor, og anvendes 5 til transformering af E. coli. Ved denne metode kan gi produceres som et fusionsprotein i E. coli.

Ved i stedet for pSV2dhfr f.eks, at anvende pSV2neo (tilgængelig fra American Type Culture Collection) i det ovenfor anførte eksempel kan det rekombinante plasmid . 10 indeholdende PRV-glycoprotein-genet transformeres i andre værtsceller. Transformerede celler vil blive selekteret ved resistens mod antibiotikum G418, som kodes af plasmidet.

Polypeptiderne ifølge den foreliggende opfindelse kan også eksprimeres i insektceller på følgende måde: 15 Ved nedbrydning af pUCD/B med BamHI fås BamHI-fragmenter indeholdende gi-gener. Disse BamHI-fragmenter kan dones i et BamHl-sted nedenfor en polyhedrin--promotor i pAC373 (Mol. Cell. Biol. 5, s. 2860-65 (1985)). De således fremstillede plasmider kan 20 sammen med DNA fra baculovirus Autographa californica co-transficeres i Sf9-celler, og rekombinante vira kan isoleres ved metoderne anført i den nævnte artikel.

Disse rekombinante vira producerer gi efter inficering af Sf9-celler.

25 En vaccine fremstillet under anvendelse af et glycoprotein ifølge den foreliggende opfindelse eller et inununogent fragment deraf kan bestå af fikserede værtsceller, en værtcelleekstrakt eller et delvis eller fuldstændig renset PRV-glycoproteinpræpa-30 rat fra værtscellerne eller produceret ved kemisk syntese. PRV-glycoprotein-immunogenet fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse er fortrinsvis frit for PRV-virus. Vaccine-immunogenet ifølge opfindelsen er således i det væsentlige udelukkende sammensat af 35 det ønskede immunogene PRV-polypeptid og/eller andre PRV-polypeptider, som udviser PRV-antigenitet.

DK 175072 B1 25

Immunogenet kan fremstilles i vaccinedosisform ved velkendte procedurer. Vaccinen kan indgives intra-muskulært, subcutant eller intranasalt. Til parenteral indgivelse, såsom intramuskulær injektion, kan 5 immunogenet kombineres med en egnet bærer. Det kan f.eks. indgives i vand, saltvand eller pufrede bærestoffer med eller uden forskellige hjælpestoffer eller immunomodulerende midler, herunder aluminiumhydroxid, aluminiumphosphat, aluminiumkaliumsulfat (alun), 10 berylliumsulfat, siliciumdioxid, kaolin, carbon, vand-i-olie-emulsioner, olie-i-vand-emulsioner, muramyl-dipeptid, bakterielt endotoxin, lipid X, Corynebacterium parvum (Propionobacterium aenes), Bordetella pertussis, polyribonucleotider, natriumalginat, lanolin, lysoleci-15 thin, vitamin A, saponin, liposomer, levamisol, DEAE--dextran, blokerede copolymere eller andre syntetiske hjælpestoffer. Sådanne hjælpestoffer er tilgængelige kommercielt fra forskellige kilder, f.eks.

"Merck Adjuvant 65" (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.).

20 Et andet egnet hjælpestof er Freund's ukomplette adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, Michigan).

Forholdet mellem immunogen og adjuvans kan varieres indenfor et stort område, sålænge begge er til stede i effektive mængder. F.eks. kan aluminium-25 hydroxid være til stede i en mængde på ca. 0,5% af vaccineblandingen (beregnet på aluminiumoxid). På enkelt-dosisbasis kan koncentrationen af immunogenet være fra ca. 1,0 pg til ca. 100 mg pr. svin. Et foretrukket område er fra ca. 100 μ? til ca. 3,0 mg pr. svin. En pas- ' 30 sende dosisstørrelse er ca. 1-10 ml, fortrinsvis ca.

1.0 ml. I overensstemmelse hermed vil en dosis til intramuskulær injektion f.eks. omfatte 1 ml indeholdende 1.0 mg immunogen i blanding med 0,5% aluminiumoxid. Sammenlignelige dosisformer kan også fremstilles til parenteral indgivelse til smågrise, men mængden af immunogen pr. dosis vil være mindre, f.eks. ca. 0,25 DK 175072 B1 26 til ca. 1,0 mg pr. dosis.

Til vaccinering af søer kan der anvendes et system med to døser. Den første dosis kan gives fra flere måneder til ca. 5-7 uger før søerne får grise.

5 Den anden dosis af vaccinen bør derefter indgives nogle uger efter den første dosis, f.eks. ca.

2 til 4 uger senere, og vaccinen kan derefter indgives op til, men før søerne får grise. Alternativt kan vaccinen indgives som f.eks. en enkelt 2 ml's dosis 10 ca. 5 til 7 uger før søerne får grise. Imidlertid anses et system med to doser at være at foretrække til den mest effektive immunisering af smågrisene. Halvårlig revaccinering anbefales til avlsdyr. Orner kan revaccineres på ethvert tidspunkt. Desuden kan søer revaccineres 15 før avl. Smågrise født af ikke-vaccinerede søer kan vaccineres når de er ca. 3-10 dage gamle, igen når de er 4-6 måneder gamle og derefter årligt eller fortrinsvis halvårligt.

Vaccinen kan også kombineres med andre 20 vacciner mod andre sygdomme, således at der fås kombinationsvacciner. Den kan også kombineres med andre lægemidler, f.eks. antibiotika. En farmaceutisk effektiv mængde af vaccinen kan anvendes sammen med et farmaceutisk acceptabelt bærestof eller fortyndingsmiddel til 25 vaccinering af dyr, såsom svin, kvæg, får, geder og andre pattedyr.

Andre vacciner kan fremstilles ifølge metoder, der er velkendte af fagmanden og f.eks. er beskrevet i I. Tizard, An Introduction to Veterinary Immunology, 30 2. ed. (1982).

Som ovenfor anført har det vist sig, at kommercielle vaccine-PRV1 er har gi- og gp63-generne udeladt. Derfor kan gl-polypeptiderne fremstillet ved metoderne ifølge opfindelsen anvendes som 35 diagnostiske midler til at skelne mellem dyr, der er vaccineret med disse kommercielle vacciner, og dyr, der er inficeret med virulent virus.

DK 175072 B1 27

Til at skelne mellem inficerede og vaccinerede dyr kan der f.eks. anvendes en ELISA-bestemmelse. gl-protein, der er fremstillet i f.eks. E. coli ved rekombinante DNA-metoder (Rea et al., ovenfor) sættes 5 til hullerne af egnede plastplader og henstilles tilstrækkelig længe til at absorbere til plastmaterialet (f.eks. natten over ved 20-25°C). Pladerne vaskes, og der tilsættes et blokeringsmiddel (f.eks. BSA) til neutralisering af eventuelle ikke-reagerede steder på 10 plastoverfladen. Der vaskes derefter, og derpå sættes svine-serummet til hullerne. Efter ca. 1 times inkubering ved 20-25°C vaskes hullerne, og der tilsættes et protein A-peberrodsperoxidase-konjugat til hvert hul og inkuberes i ca. 1 time ved 20-25°C. Der vaskes 15 derefter endnu en gang, og enzymsubstratet (o-phenylen-diamin) sættes til hullerne, og reaktionen standses med syre. Absorptionen måles ved 492 nm til bestemmelse af den tilstedeværende mængde af gi-antistof i serummet. Fraværelse af gi viser, at dyret ikke er inficeret. Ved 20 undersøgelse for andre PRV-antigener kan det konstateres, om et givet dyr er vaccineret eller ej.

25 30 35 1/1¾ i vwi ^ v i 28

SKEMA C

27 54 AIG CGG CCC ΤΠ CTG CTG OGC GCC GCG CAG CTC CTG GCG CTG CTG GCC CTG CCG g Met Arg Pro Hie Leu Leu Arg Ala Ala Gin Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ala 81 108 CTC TCC ACC GAG GCC CCG AGC CTC TCC GCC GAG ACG ACC CCG GGC CCC GTC ACC Leu Ser Thr Glu Ala Pro Ser Leu Ser Ala Glu Thr Thr Pro Gly Pro Val Thr 135 162 10 GAG CTC CCG AGT CCC TOG GCC GAG GTC TGG GAC CTC TCC AGC GAG GCC GGC GAC Glu Val Pro Ser Pro Ser Ala Glu Val Trp Asp Leu Ser Thr Glu Ala Gly Asp 189 216 , GAT GAC CTC GAC GGC GAC CTC AAC GGC GAC GAC GGC GGC GCG GGC TTC GGC TOG Asp Asp Leu Asp Gly Asp Leu Asn Gly Asp Asp Arg Arg Ala Gly Hie Gly Ser 15 243 270 GCC CTC GCC TCC CTG AGG GAG GCA CCC CCG GCC CAT CTG GTG AAC GTG TCC GAG Ala Leu Ala Ser Leu Arg Glu Ala Pro Pro Ala His Leu Val Asn Val Ser Glu 297 324

GGC GCC AAC TTC ACC CTC GAC CCG CGC GGC GAC GGC GCC GTG GTG GCC GGG ATC

20 Gly Ala Asn Phe Thr Leu Asp Ala Arg Gly Asp Gly Ala Val Val Ala Gly He 351 378 TGG ACG TTC CTG CCC GTC CGC GGC TGC GAC GCC GTG GCC CTG ACC ATG CTC TGC Trp Thr Hie Leu Pro Val Arg Gly Cys Asp Ala Val Ala Val Ihr Met Val Cys 405 432

25 TTC GAG ACC GCC TGC CAC CCG GAC CTG GTC CTG GGC CCC GCC TCC CTC CCC GAG

Hie Glu Thr Ala Cys His Pro Asp Leu Val Leu Gly Arg Ala Cys Val Pro Glu 459 486 GCC CCG GAG CGG GGC ATC GGC GAC TAC CTG CCG CCC GAG GTG CCG CGG CTC CAG Ala Pro Glu Arg Gly Ile Gly Asp Tyr Leu Pro Pro Glu Val Pro Arg Leu Gin 30 513 540 CGC GAG CCG CCC AIC GTC ACC CCG GAG CGG TGG TCG CCG CAC CTG ACC GTC CGG Arg Glu Pro Pro lie Val Thr Pro Glu Arg Trp Ser Pro His Leu Thr Val Arg 567 594

CGG GCC ACG CCC AAC GAC ACG GGC CTC TAC ACG CTC CAC GAC GCC TGG GCG COG

35

Arg Ala Thr Pro Asn Asp Thr Gly Leu Tyr Thr Leu His Asp Ala Ser Gly Pro 621 648 CGG GCC GTG TTC ΤΓΤ GTG GCG GTG GGC GAC CGG CCG CCC GCG CCG CTG GCC CCG Arg Ala Val Hie Phe Val Ala Val Gly Asp Arg Pro Pro Ala Pro Leu Ala Pro DK 175072 B1 29 * SKEMA C (fortsat) 675 702

GIG GGC CCC GCG CGC CAC GAG CCC CGC TTC CAC GCG CTC GGC TTC CAC TCG CAG

5 Val Gly Pro Ala Arg His Glu Pro Arg Phe His Ala Leu Gly Phe His Ser Gin 729 756

CTC TTC TCG CCC GGG GAC ACG TTC GAC CTG ATG CCG CGC GTG GTC TCG GAC ATG

Leu Rie Ser Pro Gly Asp Thr Phe Asp Leu Met Pro Arg Val Val Ser Asp Met 783 810

10 GGC GAC TCG CGC GAG AAC TTC ACC GCC ACG CTG GAC TGG TAC TAC GCG CGC GCG

Gly Asp Ser Arg Glu Asn Phe Thr Ala Thr Leu Asp Trp Tyr Tyr Ala Arg Ala 837 864

' CCC CCC CCC TGC CTG CTG TAC TAC CTG TAC GAG CCC TCC ATC TAC CAC CCG CGC

Pro Pro Arg Cys Leu Leu Tyr Tyr Val Tyr Glu Pro Cys Ile Tyr His Pro Arg 15 891 918

GCG CCC GAG TGC CTG CGC CCG GIG GAC CCG GCG TCC AGC TTC ACC TCG CCC GCG

Ala Pro Glu Cys Leu Arg Pro Val Asp Pro Ala Cys Ser Rie Thr Ser Pro Ala 945 972

CGC GCG GCG CTG GTG GCG CGC CGC GCG TAC GCC TCG TGC AGC CCG CTG CTC GGG

20 Arg Ala.Ala Leu Val Ala Arg Arg Ala Tyr Ala Ser Cys Ser Pro Leu Leu Gly 999 1026

GAC CGG TGG CTG ACC GCC TGC CCC TTC GAC GCC TTC GGC GAG GAG GTG CAC ACG

Asp Arg Trp Leu Thr Ala Cys Pro Rie Asp Ala Rie Gly Glu Glu Val His Thr 1053 1080

25 AAC GCC ACC GCG GAC GAG TCG GGG CTG TAC GTG CTC GTG ATG ACC CAC AAC GGC

Asn Ala Thr Ala Asp Glu Ser Gly Leu Tyr Val Leu Val Met Thr His Asn Gly 1107 1134

CAC CTC GCC ACC TGG GAC TAC ACG CTC GTC GCC ACC GCG GCC GAG TAC GTC ACG

His Val Ala Thr Trp Asp Tyr Thr Leu Val Ala Thr Ala Ala Glu Tyr Val Thr 30 1161 1188

GTC ATC AAG GAG CTG ACG GCC CCG GCC CGG GCC CCG GGC ACC CCG TGG GGC CCC

Val Ile Lys Glu Leu Thr Ala Pro Ala Arg Ala Pro Gly Thr Pro Trp Gly Pro 1215 1242

„ GGC GGC GGC GAC GAC GCG ATC TAC GTG GAC GGC GTC ACG ACG CCG GCG CCG CCC

35

Gly Gly Gly Asp Asp Ala Ile Tyr Val Asp Gly Val Thr Thr Pro Ala Pro Pro 1269 1296

GCG CGC CCG TGG AAC CCG TAC GGC CGG ACG ACG CCC GGG CGG CTG TIT GTG CTG

Ala Arg Pro Trp Asn Pro Tyr Gly Arg Thr Thr Pro Gly Arg Leu Rie Val Leu 30 DK 175072 B1 SKEMA C (fortsat) 1323 1350

GCG CTG OGC TCC TTC GIG AIG ACG TGC GTC GTC GGG GGG GCC CTC TGG CTC ICC

5 Ala Leu Gly Ser Rie Val Met Thr Cys Val Val Gly Gly Ala Val Trp Leu Cys 1377 1404

CTG CTG TGC TCC GGC OGC CGG GCG GCC TGG GGG CCG TIC GGG GTG CCG ACG GGG

Val Leu Cys Ser Arg Arg Arg Ala Ala Ser Arg Pro Phe Arg Val Pro Thr Arg 1431 1458 10

GCG GGG ACG CGC AIG CTC TCG CCG GTG XAC ACC AGC CTG CCC ACG CAC GAG GAC

Ala Gly Thr Arg Met Leu Ser Pro Val Tyr Thr Ser Leu Pro Thr His Glu Asp 1485 1512 *

XAC TAC GAC GGC GAC GAC GAC GAC GAG GAG GCG GGC GAC GCC OGC CGG CGG CCC

Tyr Tyr Asp Gly Asp Asp Asp Asp Glu Glu Ala Gly Asp Ala Arg Arg Arg Pro 1539 1566

TCC TCC CCC GGC GGG GAC AGC GGC TAC GAG GX CCG TAC GTG AGC CIG GAC GCC

Ser Ser Pro Gly Gly Asp Ser Gly Tyr Glu Gly Pro Tyr Val Ser Leu Asp Ala 1593 1620

2Q GAG GAC GAG TTC AGC AGC GAC GAG GAC GAC GGG CTG TAC GIG CGC CCC GAG GAC

Glu Asp -Glu Rie Ser Ser Asp Glu Asp Asp Gly Leu Tyr Val Arg Pro Glu Glu 1647 1674

GCG CCC CGC TCC GCC TTC GAC CTC TGG TTC CGC GAT CCG GAG AAA CCG GAA GTG

Ala Pro Arg Ser Gly Rie Asp Val Trp Rie Arg Asp Pro Glu Lys Pro Glu Val 25 1701 1728

ACG AAT GGG CCC AAC TAT GGC GTG ACC GCC AGC CGC CTG TIG AAT GCC CGC CCC

Thr Asn Gly Pro Asn Tyr Gly Val Thr Ala Ser Arg Leu Leu Asn Ala Arg Pro 1755 GCT TAA 30 Al® 35 DK 175072 B1 31

SKEMA D BamHI-7-Fragment af PRV BamHI BstEII PvuII Kpnl Sall Kpnl SCu Dral BstEII Sphl Bsml BaniHI

J_1_I_i—I_I_I_I-1_I-1-L

5 XXXXXXXXX 5050505050505050 63636363636363 IIIIIIIIIII1IIIII

X - glycoprotein X (gX) 50 - glycoprotein 50 (gp50) 63 - glycoprotein 63 (gp63) 10 I - glycoprotein I (gi) 15 20 25 30 35 DK 175072 B1 32 SKEMA N. Restriktionsenzym-spaltningssteder anvendt til gl-sekvensbestenunelse.

5

Bal Dr al Saul BstEII Smal Nae I Smal Maelll Sph Nael Karl Maelll Kæl

J_I_I_I_I_!_l I til_L_I

IIIIIIII1IIIIIII1IIII1IIIIIIIIHIIIIIIIIIIIIIIIIIIII1IIIIIII

10 15 20 25 30 35 SKEMA O. Konstruktion af plasmid pUCD/B.

DK 175072 B1 33 (a) Et BamHI 7-fragment klones i plasmid pUC19 til dannelse af plasmid A.

5

BamHI Dral Dr al Dral BamHI Dral * i .i _ i____J_i-:-1—* 77777 777777777777777777777777777777 III _ ΙΠ 10 (b) Plastnid A nedbrydes med Dral til dannelse af fragment 1.

Dral BamHI Dral j-:—_l 15 77777777777777 minium (c) BamHI-linkere tilføjes til fragment 1, hvorefter der nedbrydes med BamHI til dannelse af fragment 2 {2,5 kb).

20

BamHI BamHI

J_i_L

miiiiiiiiiiiiimmiiii 25 (d) Fragment 2 klones i pUCl9 nedbrudt med BamHI til dannelse af plasmidet pUCD/B:

30 EcoRI BamHI Bsal BamHI

* I I_I_I * ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΠ 7 — BamHI-7—fragment 35 I - glycoprotein gi SKEMA P. Konstruktion af plasmid pDGI.

DK 175072 B1 34 (a) Plasmid pUCD/B nedbrydes med Bsml og EcoRI til dannelse af fragment 3 (4»4 kb).

S

Bsml BamHI EcoRI

J_I__1 iiiiiiimmmiin 10 (b) Der fremstilles følgende to syntetiske oligonucleotider: 5' CGCGCOGCTIAAAlACCGGGAGAAG 3' 5' MTrcrrCTCCCOGTATTTAAGCGGGGCGGG 3' 15 (c) De syntetiske oligonucleotider og fragment 3 ligeres til dannelse af plasmidet pGI.

EcoRI Bsml BamHI

♦ I —1_1-*

20 IIIIIIIIIIIIIIIIIII

(d) Plasmid pGI nedbrydes med EcoRI og BamHI til dannelse af fragment 4 {1,8 kb).

25 BamHI EcoRI

J_l iiiiiiiiiiiiiiiimiiiiii (e) Plasmid pSV2dhfr spaltes med EcoRI og spaltes 30 derefter BamHI til dannelse af fragment (5,0 kb).

BamHI Hindlll PvuII EcoRI

J_I_I_L

1 1 L

35 dhfr SV40 Amp*

Ori DK 175072 B1 35 SKEMA P (fortsat) (f) Fragmenterne 4 og 5 ligeres derefter til dannelse af plasmidet pDGI.

5 Hindlll EcoRI BanHI

*__l_I--I - *

I I I

dhfr SV40 Amp* ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΠΙΙΙ Ori 10 dhfr = dihydrofolatreduktase.

SV40-Ori = SV40-promotor og -replikationsstart.

R

Amp = Ampicillinresistens.

15 20 25 30 35 SKEMA Q. Konstruktion af plasmid pDIEGIPA.

36 DK 175072 B1 (a) Plasmidet pDGI spaltes med BamHI til dannelse af fragment 6.

5

BamHI EcoRI' BamHI

J-1_l ΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΠΙΙ 10 (b) Fragment 7 (760bp) indeholdende den umiddelbare tidlige* promotor af humant cytomegalovirus (Towne) isoleres.

Sau3A Sacl Sau3A

J_I-i 15 pppppppppppppppp (c) Fragmenterne 6 og 7 ligeres til dannelse af plasmidet pDIEGIdhfr.

„ EcoRI BstEII Sau3A Sacl Sau3A

20

*, - _I_I_L J_L

I I I

dhfr SV40 Anrp* IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIPPPPPPPPPPPPP

Ori 25 (d) Plasmidet pSVCOW7 spaltes med PvuII og EcoRI til dannelse af fragment 8.

pSVCcw/

EcoRI PvuII PstI BamHI Hindi II PvuII

*-1-!-1_!_!_!_*

30 I I . I

AAAAGGGGGCCGGGGGGGGG dhfr SV40 AmpR

Ori

Fragment 8

35 EcoRI PvuII

j_:_L

AAAAG

DK 175072 B1 37 SKEMA Q. (fortsat) (e) Fragment 8 klones i pUC9 til dannelse af plasmidet pCOWTl.

5 EcoRI PvuII/Sma fusion BamHI Sall *_l_I i I_*

AAAAG

(f) pCOWTl spaltes med Sall, behandles med T4-DNA-polymerase.

10 og der til-ligeres EcoRI-linkere og nedbrydes derefter med EcoRI til dannelse af fragment 9 (0,6 kb).

EeoRI BamHI EcoRI . . _ . , _ Ί T ^ .

(på opfyldtSall-sted)

J_I_L

15 AAAAG

(g) Fragment 9 klones i EcoRI-stedet af pUCl9 til dannelse af plasmidet pCOWTlE.

EcoRI BamHI EcoRI

20 *--1-1_I_*

AAAAG

(h) PCOWTlE nedbrydes med EcoRI til dannelse af fragment 10

(600 bp) . EcoRj BanflI EcoRI

25

J_I-L

GAAAA

(i) Plasmidet pDIEGIdhfr nedbrydes med EcoRI og ligeres med fragment 10 indeholdende bGH-polyadenyleringssignalet 30 til dannelse af plasmidet pDlEGIPA.

EcoRI BamHI EcoRI Bsml BstEII Sau3A Sau3A

* 1_1 I I_I-1-1-* AAAA IIIIIIIIII1IIIIIIIIIIIIPPPPPPPPP dhfr 35 A = Kvæg-væksthormon-polyadenyleringssignal.

G = Genomisk kvæg-væksthormon.

P = Umiddelbar tidlig promotor af humant cylomegalovirus (Towne).

Claims (12)

1- Rekombinant DNA-molekyle indeholdende en DNA-se-kvens kodende for et polypeptid, der udviser pseudorabies-virus-(PRV)-glycoprotein-gl-immunogenitet, hvor den nævnte 5 DNA-sekvens er operativt forbundet med en ekspressionskontrolsekvens, hvorved DNA-sekvensen, der koder for polypep-tidet, er valgt blandt sekvensen, der koder for gi, og som er . ATS GGG CCC ITT CIG CTC CGC GGC GGG GAG CTC CIG GCG CFG CIG CCC CTG GGG 10 CTC TCC ACC GAG GCC CCG AGC CTC TCC GCC GAG ACG ACC CCC GGC CCC CTC ACC GAG CTC CCG AGT CCC TCG GCC CAG CTC ICG GAC CTC TCC ACC GAG GCC GCC GAC GAT GAC CTC GAC GGC CAC CTC AAC GGC GAC GAC CGC OGC GCG GGC TTC GGC TCG GCC CTC GCC TCC CTG AGC GAG GCA CCC COG GCC CAT CTG GIG AAC GIG TCC GAG A- GGC GCC AAC TTC ACC CTC GAC GCG CCC GGC GAC GGC CCC GTG CTG GCC GGG ATC 15 TGG ACG TIC CIG CCC CTC GGC GGC TCC GAC GCC GIG GCG GIG ACC ATG GIG TGC TTC GAG ACC GCC TGC GAC CCG GAC CTG GTG CIG GGC CGC GCC TGC CTC CCC GAG GCC CCG GAG GGG GGC ATC GGC GAC IAC CIG CCG CCC GAG GTG CCG GGG CTC CAG CGC GAG COG CCC ATC GTC ACC GOG GAG GGG TGG TCG GGG GAC CIG ACC GTC OGG GGG GCC ACG CCC AAC GAC ACG CGC CTC TAC ACG CTG CAC GAC GCC TCG GCG CCG 2.n _ OGG GCC GTG TTC ΤΓΓ GTG GCG CIG GGC GAC OGC CCG CCC GCG CCC CTG GCC CCC GTG GGC CCC GCC OGC CAC GAG OGC OGC TTC CAC GCG CTC GGC TTC CAC TCG CAC CTC ITC TCG CCC GGG GAC ACC TTC GAC CTG ATG CCG CGC GTG GTC TCC GAC ATC GGCGACTCGOGCGAGAACTTCACCGCCACCCIGGACIGGTACTACCCGCGCGCC CCC CCG GGG TCC CTG CIG TAC IAC GTG TAC GAG CCC TGC ATC TAC CAC CCG OGC 25 CCG CCC GAG TGC CIG CGC GCG GIG GAG COG OCG TCC AGC TTC ACC TCG CCG CCG CGC GCG GCG CTG GTG GCG OGC OGC GCG TAC GCC TCG TGC AGC CCG CTG CTC OGG GACOGGTGGCIGACCGCCTGCCCCTICGACOCCTTCOGCGAGGAGCTGCACACG AAC GCC ACC CCG GAC GAG TCG CGG CTG IAC GIG CTC CTG ATG ACC CAC AAC OGC CAC GTC GCC ACC TGG GAC TAC ACG CTC GTC GCC ACC GCG GCC GAG TAC GTC ACG 30 GTC ATC AAG GAG CIG ACG GCC COG GCC CGG CCC CGG GGC ACC CCG TGG OGC CCC GGC GGC GGC GAC GAC GCG ATC EtC GIG GAC OGC GTC ACG ACG CCC GCG GOG CCC GCG OGC CCG TGG AAC CCG TAC GGC CGG ACG ACG CCC COG OGC· CTG ΤΓΤ CIG CTG OCG CTC OGC TCC TTC CTC ATG ACG TGC CTC CTC GGG OGG OCC GTC TCG CTC TCC GIG CTG TGC TCC OGC CGC CGG GCG GCC TOG CGG COG TTC OGG GTG CCG ACG CGG CCC OGC ACC CCC ATC CTC TCG CCG CIG TAC ACC AGC CTG CCC ACG CAC GAG GAC DK 175072 B1 TAC TAC GAC GGC GAC GAC GAC GAC GAG GAG CCC GGC GAC GCC CGC COG CQG CCC TCCTCCCCCGGCGGGGACAGCGGCIACGAGGGGCCGTACGTGAGCCTGGACGCC GAG GAC GAG TTC AGC AGC GAC GAG GAC GAC GGG CTG TAC GTG OGC CCC GAG GAG GCG CCC OGC TCC OGC TTC GAC GTC TGG.TTC CGC GAT CCG GAG AAA COG GAA GTG 5 ACG AAT GGG CCC AAC TAT GGC GIG ACC GCC AGC CGC CTG TIG AAT GCC CGC CCC GCT TAA og fragmenter deraf, som koder for polypeptider, der udviser PRV-antigenitet.

2. Værtscelle, transformeret med et rekombinant DNÅ-10 -molekyle ifølge krav l.

3. Værtscelle ifølge krav 2, som hidrører fra bakterier, fungi, planter eller dyr.

4. Værtscelle ifølge krav 3, som er E. coli.

5. Værtscelle ifølge krav 3, som er en gærcelle. 15 6. Værtscelle ifølge krav 3, som er en ovariecelle af kinesisk hamster (CHO-celle).

7. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypeptid, der udviser PRV-gl-antigenitet, omfattende: (a) fremstilling af et rekombinant DNA-molekyle, 20 hvor molekylet indeholder en DNA-sekvéns, der koder for et polypeptid, som udviser PRV-gl-antigenitet, hvor den nævnte DNA-sekvens er operativt forbundet med en ekspressionskontrolsekvens, (b) transformering af en passende værtscelle med det 25 nævnte rekombinante DNA-molekyle, (c) dyrkning af den nævnte værtscelle, og (d) opsamling af polypeptidet, hvorved DNA-sekvensen er valgt blandt gi-sekvensen, som er ATG OGG CCC ΤΠ CTG CTG CGC GCC GCG CAG CTC CTG GCG CTG CTG GCC CTG GCG

30 CTC TCC ACC GAG GCC CCG AGC CTC TCC GCC GAG ACG ACC CCG GGC CCC GTC ACC GAG CTC CCG AGT CCC TCG GCC GAG GTC TCG GAC CTC TCC ACC GAG GCC GGC GAC GAT GAC CTC GAC GGC GAC CTC AAC GGC GAC GAC OGC CGC GCG GGC TTC GGC TCG GCC CTC GCC TCC CTG AGG GAG GCA CCC CCG GCC CAT CTG GTG AAC GTG TCC GAG GGC GCC AAC TTC ACC CTC GAC GCG CGC GGC GAC GGC GCC GIG GTG GCC GGG AIC

35 TGG ACG TTC CTG CCC GTC OGC GGC TCC GAC GCC GTG GCG GTG ACC ATG GTG TGC TTC GAG ACC GCC TGC CAC CCG GAC CTG GIG CTG GGC CGC GCC TGC CTC CCC GAG DK 175072 B1 GCC CCG GAG GGG GGC ATC GGC GAC IAC CTG GOG CCC GAG GTC CCG CGG CIC CAG CGC GAG OCG CCC ATC GTCACCCCCGAGOGGTGCTCGCOG CAC CTG AGC GTC CGG CGG GCC ACG CCC AAC GAC ACG GGC CTC IAC ACG CTG GAC GAC GCC TOG GCG CCG I CGG GCC CTG TIC ΤΓΤ CTG GCG CTG GGC GAC CGG CCG OCC GCG CCG CTG GCC CCG I 5 GTG GGC CCC GCG OGC CAC GAG CCC CGC TTC CAC GCG CTC GGC TTC CAC TCG CAG I CTC TTC TCG CCC GGG GAC ACG TTC GAC CTG ATG CCG CGC GTG GTC TCG GAC ATG I GGC GAC TOG OGC GAG AAC TTC ACC GCC ACG CTG GAC TGG TAC IAC GGG OGC GCG I CCC CCG CGG TGC CTG CTG TAC TAC GTG TAC GAG CCC TGC ATC IAC CAC CCG OGC I CCG CCC GAG TGC CTG CGC COG CTG GAC COG GOG ICC AGC TTC ACC ICC OOG GCG I 1Q OGC GCG GCG CTG GTG GGG CGC CGC GCG TAC GCC TCG TGC AGC OCG CTG CIC GGG I GAC CGG TGG CTG ACC GCC TGC CCC TTC GAC GCC TTC GGC GAG GAG GTG CAC ACG I AAC GCC ACC GCG GAC GAG TCG GGG CTG TAC GTG CTC GTG ATG ACC CAC AAC GGC I CAC GTC GCC ACC TGG GAC TAC ACG CTC GTC GCC ACC GCG GCC GAG TAC GTC ACG I GTC ATC AAG GAG CTG ACG GCC CCG GCC CGG GCC CCG OGC ACC OOG TGG GGC CCC I 15 GGC GGC GGC GAC GAC GCG ATC TAC GIG GAC GGC CTC ACG ACG CCG GCG CCG CCC I GCG CGC CCG TGG AAC CCG TAC CGC CGG ACG ACG CCC GGG CGG CTG TIT GTG CTG I GCG CTG GGC ICC TTC CTG ATG ACG TGC CTC CTC GGG GGG GCC GTC TGG CTC TGC I GIG CTG TGC TCC CGC CGC CGG GCG GCC TCG OGG CCG TTC CGG CTG OOG ACG CGG I GCG GGG ACG CGC ATG CTC TOG CCG GTG TAC ACC ACC CTG CCC ACC CAC GAG GAC I 20 TAC TAC GAC GGC GAC GAC GAC GAC GAG GAG GCG GGC GAC GCC OGC OGG CGG. OCC I TCC TCC CCC GGC GGG GAC AGC OGC TAC GAG GGG CCG TAC GTC AGC CIC GAC GCC I gag GAC GAG TTC AGC AGC GAC GAG GAC GAC GGG CTG TAC GTG OGC CCC GAG GAG I GGG CGC OGC TCC GGC TTC GAC GTC TOG TTC OGC GAT CCG GAG AAA CCG GAA GTG I ACG AAT GGG CCC AAC TAT GGC GTG ACC GCC AGC CGC CTG TTG AAT GCC OCC CCC I 25 GCT TAA I og fragmenter deraf, som koder polypeptider, der udviser I pseudorabiesvirus-antigenitet.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, hvorved værtscellen I er valgt blandt bakterier, fungi, planteceller og dyreceller. I 30 9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, hvorved værtscellen I er E. coli.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 7, hvorved værtscellen I er gær.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 7, hvorved værtscellen I 35 er CHO. DK 175072 B1

12. Diagnostisk sæt til anvendelse til at skelne mellem dyr, der er vaccineret mod PRV, og dyr, der er inficeret med PRV, kendetegnet ved, at det omfatter flere beholdere, og en af beholderne indeholder et polypep-5 tid, der udviser PRV-glycoprotein-gl-antigenitet og er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 8.