JP2022547975A - 鳥病原体の抗原を発現する組換えシチメンチョウヘルペスウイルスベクターおよびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、様々な病原体に対して保護するための安全な免疫付与における使用のための外来遺伝子の挿入および発現のための組換えウイルスベクターに関する。本発明はまた、様々な病原体に対する保護のための1つ以上の組換えライバル(rival)ベクターを含む多価組成物またはワクチンに関する。本発明は、当該組換えウイルスベクターを作製し、使用する方法に関する。【選択図】図21
Description
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、2019年9月11日に出願された米国仮出願第62/898651号に対する米国特許法第119(e)条の利益を主張する。
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、2019年9月11日に出願された米国仮出願第62/898651号に対する米国特許法第119(e)条の利益を主張する。
本発明は、様々な病原体に対して保護するための安全な免疫付与における使用のための外来遺伝子の挿入および発現のための組換えウイルスベクターに関する。本発明はまた、様々な病原体に対する保護のための1つ以上の組換えウイルスベクターを含む多価組成物またはワクチンに関する。本発明は、当該組換えウイルスベクターを作製し、使用する方法に関する。
マレック病は、伝染性の強いリンパ増殖性疾患であり、主に若いニワトリに影響を与える、最も流行している鳥感染症の1つである。マレック病は、マレック病ウイルスによって引き起こされる。マレック病ウイルス(MDV)は、ヘルペスウイルスであり、Mardivirus属のメンバーであり、以下のMDV-1(Gallidヘルペスウイルス2)、MDV-2(Gallidヘルペスウイルス3)およびMDV-3(Meleagridヘルペスウイルス1、シチメンチョウヘルペスウイルス(HVT))の3つの血清型(種)を有する。MDV-1は、この3つの血清型の中で最も毒性が高く、ワクチン接種していない家禽において広範囲にわたる疾患を引き起こす。MDV-1に感染した鳥類は、脚部、翼、および頸部の麻痺、眼の病変および視力障害、体重減少、胸腺、心臓、肺、性腺、筋肉、および羽嚢などの多くの臓器におけるがん性腫瘍などの神経学的、内臓および皮膚の臨床症状を示す。影響を受けた鳥類の罹患率は、10~50%であり、死亡率は、最大100%になり得る。マレック病は、任意の年齢の鳥類に影響を及ぼす可能性があるが、急性マレック病は、4~8週齢の若年齢の多数のワクチン接種していない鳥類において死を引き起こす。マレック病は、感染したニワトリのニワトリ鱗屑に直接的または間接的にさらされることによって蔓延し、ウイルスは、吸入によって取り込まれる。MDV-2およびMDV-3は、無発病性ウイルス株を表し、関連する毒性が高いMDV-1に対するワクチン接種の調製に使用されてきた。
マレック病に加えて、家禽に影響を与え、家禽の畜産に脅威を及ぼすいくつかの病原体が存在する。生産者は、ウイルス、細菌および他の病原体から群れを保護するために、ワクチンによって提供される免疫に依存しなければならない。鳥類のワクチン接種には、生ワクチン、死滅ワクチンおよび組換えワクチンが使用されてきた。生ワクチンは、免疫が強力で長時間持続するという利点があるが、軽度から重度の反応を引き起こしかねないため、注意深く取り扱われなければならない。一方で、死滅ワクチンは、生ワクチンよりも安定であり、かつ安全であるが、生成する免疫応答が弱いため、複数回の投与が必要である。生ワクチンおよび死滅ワクチンは、両方とも安全かつ効果的であることが証明されているが、1回のワクチン接種において1つより多い病原体に対する保護を提供するために、多価ワクチンを開発し、継続的に改善することが依然として必要である。
組換えベクター化されたワクチンは、複数の病原体に同時に免疫を提供するために開発されてきた。これらのワクチンは、非病原性生物の宿主ゲノム内のいくつかの非必須遺伝子切片を除去し、これらを病原性生物に対する免疫応答の生成に関与する抗原をコードする1つ以上の遺伝子で置き換えることによって作製される。次いで、新たに産生されたベクターを使用して宿主に感染させ、宿主は、毒性が高い生物の抗原を複製し、発現して、免疫応答を誘発する。組換えベクター化されたワクチンは、生ワクチンおよび死滅ワクチンの利点を併せ持つ。組換えベクターは、生ワクチンと同様に、より長く続く免疫を提供し、同時に、死滅ワクチンのようにワクチン接種した後に、より軽度の反応を引き起こす。加えて、ベクターおよび挿入された遺伝子は両方とも、鳥類を2つ以上の疾患から保護する免疫を提供することができる。
マレック病ウイルスは、これらのウイルスがたった1回のワクチン接種で生涯にわたる保護を誘導するため、家禽の疾患に対して免疫付与するための多価ワクチンにとって最も有効なベクターの1つである。加えて、これらのウイルスは、鳥宿主に限定されるため、家禽農場で働く他の動物および人々に感染する危険はない。マレック病ウイルスのうち、シチメンチョウヘルペスウイルス(HVT)は、生ワクチンとして、また、より毒性が高いMDV-1に対する組換えワクチンベクターの両方として、より広範に使用されてきた。HVTは、1969~1970年にシチメンチョウから初めて単離され、まもなく、MDVに対して保護性であることが発見され、1971年にワクチンとしてライセンス供与された。シチメンチョウヘルペスウイルス(HVT)は、マレック病ウイルス(MDV-1)と似た抗原特徴を有するが、ニワトリに対して病原性はない。加えて、HVTは、MDVまたはHVTに対する母体由来の抗体に対して感受性ではないため、生HVTワクチンは、インオボで、または孵化前の初期年齢で、MDV-1に対して効果的にワクチン接種するために使用されてきた。加えて、HVTゲノムは、他の鳥病原体の外来DNA配列を保有するためのワクチンベクターとして使用されてきた。
本発明は、様々な病原体に対して鳥を保護するための安全な免疫付与における使用のための外来遺伝子の挿入および発現のための組換えウイルスベクターを提供する。本発明はまた、様々な病原体に対する保護のための1つ以上の組換えHVTウイルスベクターを含む多価組成物またはワクチンを提供する。加えて、本発明は、組換えウイルスベクターを単独で、または他のワクチンもしくは薬学的組成物と組み合わせて作製し、使用する方法を提供する。
一態様において、本発明は、組換えシチメンチョウヘルペスウイルス(HVT)ゲノムであって、HVTゲノムのユニークロング(UL)領域中の遺伝子間遺伝子座UL35/UL36内に挿入された1つ以上の異種抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列を含む、組換えHVTゲノムを提供する。
一態様において、本発明は、組換えシチメンチョウヘルペスウイルス(HVT)ゲノムであって、HVTゲノムのユニークロング領域中の遺伝子間遺伝子座UL35/UL36内に挿入された1つ以上の異種抗原または複数抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列と、HVTゲノムのユニークロング領域(UL)中のUL55/Gene3部位に挿入された1つ以上の異種抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列または複数配列と、を含む、HVTゲノムを提供する。
1つ以上の実施形態において、本発明は、組換えHVTであって、1つ以上の異種抗原または複数抗原が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)、およびトリインフルエンザウイルス(AIV)からなる群から選択される鳥病原体または複数病原体に対して保護性である、組換えHVTを提供する。
1つ以上の実施形態において、本発明は、組換えHVTであって、1つまたは1つ以上の異種抗原が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のVP2、VP3またはVP4タンパク質、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)のVP1またはVP2タンパク質、ニューカッスル病ウイルス(NDV)のF/HNキメラタンパク質、またはF、NP、P、M、HN、もしくはLタンパク質、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)のS1、S2またはMタンパク質、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)のgB、gC、gD、gE、gH、gIまたはgLタンパク質、およびトリインフルエンザウイルス(AIV)のHA、NA、NPまたはMタンパク質のうちのいずれかからなる群から選択される、組換えHVTを提供する。
1つ以上の実施形態において、本発明の組換えHVTは、1つ以上の異種抗原が、IBDVに対して保護性であることを条件とする。一実施形態において、本発明の組換えHVTは、1つ以上の異種抗原が、IBDVのVP2タンパク質であることを条件とする。一実施形態において、本発明の組換えHVTは、VP2タンパク質配列が、配列番号5または配列番号10を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされることを条件とする。一実施形態において、本発明の組換えHVTは、配列番号5または配列番号10のいずれかを含むヌクレオチド配列によってコードされるVP2タンパク質を提供する。
1つ以上の実施形態において、本発明の組換えHVTは、1つ以上の異種抗原または抗原が、ニューカッスル病ウイルス(NDV)に対して保護性であることを条件とする。一実施形態において、本発明の組換えHVTは、1つ以上の異種抗原が、NDVのFタンパク質であることを条件とする。一実施形態において、本発明の組換えHVTは、NDVのFタンパク質が、配列番号3を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされることを条件とする。一実施形態において、本発明の組換えHVT NDVのFタンパク質は、配列番号3を含むヌクレオチド配列によってコードされる。
1つ以上の実施形態において、本発明の組換えHVTは、1つ以上の異種抗原が、NDVおよびIBDVに対して保護性であることを条件とする。1つ以上の実施形態において、本発明の組換えHVTは、少なくとも1つの異種抗原が、NDVのFタンパク質およびIBDVのVP2タンパク質であることを条件とする。
1つ以上の実施形態において、本発明の組換えHVTは、配列番号3を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるNDVのFタンパク質と、配列番号5または配列番号NO.10を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるIBDVのVP2タンパク質とを提供する。
1つ以上の実施形態において、本発明の組換えHVTは、配列番号3を含むヌクレオチド配列によってコードされるNDVのFタンパク質、およびIBDVのVP2タンパク質が、配列番号5または配列番号10を含むヌクレオチド配列によってコードされることを条件とする。
1つ以上の実施形態において、本発明の組換えHVTは、1つ以上の異種抗原または複数抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列または複数配列を含む1つ以上の発現カセットまたは複数カセットを含むゲノムを含む。一実施形態において、組換えHVTは、発現される抗原をコードする1つ以上のヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む組換えHVTゲノムを含む。一実施形態において、発現される抗原は、NDVのFタンパク質を含む。一実施形態において、発現される抗原は、IBDVのVP2タンパク質を含む。一実施形態において、発現される抗原は、NDVのFタンパク質およびIBDVのVP2タンパク質の両方を含む。
一実施形態において、本発明の組換えHVTは、1つ以上のプロモーターが、前初期サイトメガロウイルスヒト(hCMV)プロモーター、モルモット前初期CMVプロモーター、マウス前初期CMVプロモーター、Pecプロモーター、β-ニワトリアクチンプロモーター、SV40プロモーター、糖タンパク質Xプロモーターの仮性狂犬病ウイルスプロモーター、単純ヘルペスウイルス-1アルファ4プロモーター、糖タンパク質gA、gC、gB、gE、またはgIプロモーターのマレック病ウイルスプロモーター、糖タンパク質gB、gE、gI、gDプロモーターの伝染性喉頭気管炎ウイルスプロモーター、およびウシヘルペスウイルス1/1 VP8プロモーターからなる群から選択されることを条件とする。一実施形態において、組換えHVTは、ヒトCMVプロモーターを含む。一実施形態において、組換えHVTは、マウスCMVプロモーターを含む。一実施形態において、組換えHVTは、hCMVプロモーターおよびmCMVプロモーターを含む。
1つ以上の実施形態において、組換えHVTは、ポリアデニル化(ポリA)シグナルをコードするヌクレオチド配列を含む。1つ以上の実施形態において、組換えHVTは、ポリAシグナルをコードするヌクレオチド配列を含み、BGHポリA(配列番号6)またはSV40ポリA配列(配列番号12)から選択される。一実施形態において、ポリAシグナルは、BGHポリAシグナルである。一実施形態において、ポリAシグナルは、SV40ポリAシグナルである。
一態様において、本発明の組換えHVTは、ポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含むIBDVからのVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたCMVプロモーターを含み、VP2発現カセットの全ての部分が、HVTゲノムの非コード領域中に挿入されている。一実施形態において、CMVプロモーターは、hCMVプロモーター(配列番号1)を含む。一実施形態において、IBDVのVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号5または配列番号10から選択される。一実施形態において、VP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号5を含む。一実施形態において、VP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号10を含む。一実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号6を含む。一実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号12を含む。一実施形態において、プロモーター、VP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびポリAシグナルは、発現カセットを含む。一実施形態において、発現カセットは、UL55/gene3部位でHVTゲノムに挿入される。一実施形態において、発現カセットは、ゲノム内のUL35/36部位でHVTゲノムに挿入される。一実施形態において、発現カセットは、順番に、UL55/gene3部位でHVTゲノムに挿入された配列番号1、配列番号5、または配列番号10および配列番号6を含む。
一態様において、本発明の組換えHVTは、ポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含むNDVのFタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたCMVプロモーターを含み、NDV Fカセットの全ての部分が、HVTゲノム内の非コード位置に挿入されている。一実施形態において、CMVプロモーターは、mCMV(配列番号2)プロモーターを含む。一実施形態において、配列番号3を含むNDVのFタンパク質をコードするヌクレオチド配列。一実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号12を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一実施形態において、プロモーター、Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびポリAシグナルは、発現カセットを含む。一実施形態において、発現カセットは、UL55/gene3部位でHVTゲノムに挿入される。一実施形態において、発現カセットは、ゲノム内のUL35/36部位でHVTゲノムに挿入される。一実施形態において、発現カセットは、順番に、UL55/gene3部位でHVTゲノムに挿入された配列番号2、配列番号3および配列番号12を含む。
一態様において、本発明の組換えHVTは、ポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含むIBDVのVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたCMVプロモーターを含み、VP2発現カセットを含む全てが、HVTゲノム内の非コード位置に挿入されている。一実施形態において、本発明の組換えHVTは、VP2カセットと同じ挿入部位に挿入されたNDV F発現カセットの一部としてポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含むNDVのFタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたCMVプロモーターをさらに含む。一実施形態において、本組換えHVTは、VP2カセットと異なる部位に挿入されたNDV F発現カセットの一部としてポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含むNDVのFタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたCMVプロモーターをさらに含む。
一実施形態において、本発明の組換えHVTは、VP2発現カセットであって、順番に、UL35/36非コード領域中のHVTゲノム内に挿入されたhCMVプロモーターをコードするヌクレオチド配列(配列番号1)、IBDV VP2をコードするヌクレオチド配列(配列番号5または配列番号10から選択される)、およびBGHポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列(配列番号6)と、順番に、UL55/gene3非コード領域中のHVTゲノム内に挿入されたmCMVプロモーターをコードするヌクレオチド配列(配列番号2)、NDVからのFタンパク質をコードするヌクレオチド配列(配列番号3)、およびSV40ポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列(配列番号12)と、を含む、VP2発現カセットを提供する。一態様において、本発明の組換えHVTは、ポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、伝染性喉頭気管炎ウイルス抗原をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。一実施形態において、ILT抗原は、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)のgB、gC、gD、gE、gH、gI、gL、またはILT抗原のうちの1つ以上のキメラタンパク質からなる群から選択される1つ以上の抗原を含む。一実施形態において、本発明の組換えHVTは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、およびトリインフルエンザウイルスからなる群から選択される1つ以上の抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。一実施形態において、本発明の組換えHVTは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のVP1、VP2、VP3もしくはVP4抗原、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)のVP1もしくはVP2タンパク質、ニューカッスル病ウイルス(NDV)のF/HNキメラタンパク質、またはF、NP、P、M、HN、もしくはLタンパク質、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)のS1、S2もしくはMタンパク質、およびトリインフルエンザウイルス(AIV)のHA、NA、NPもしくはMタンパク質のうちのいずれかからなる群から選択される抗原をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターをさらに提供する。
一実施形態において、本発明の組換えHVTは、ILT抗原をコードするヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターを含み、ポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、発現カセットの一部として、1つ以上のILT抗原を含む。一実施形態において、本発明の組換えHVTは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のVP1、VP2、VP3もしくはVP4抗原、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)のVP1もしくはVP2タンパク質、ニューカッスル病ウイルス(NDV)のF/HNキメラタンパク質、またはF、NP、P、M、HN、もしくはLタンパク質、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)のS1、S2もしくはMタンパク質、およびトリインフルエンザウイルス(AIV)のHA、NA、NPもしくはMタンパク質のうちのいずれかからなる群から選択される鳥抗原をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターをコードするヌクレオチド配列を各々含み、ポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、第2および第3の発現カセットを含む。
1つ以上の態様において、本発明は、本発明の組換えHVTゲノムをコードする組換えDNAを提供する。
1つ以上の態様において、本発明は、本発明の組換えHVTを含み、薬学的に許容される担体、賦形剤、またはアジュバントをさらに含む、免疫原性組成物を提供する。
1つ以上の態様において、本発明は、本発明の組換えHVTを含み、薬学的に許容される担体、賦形剤、またはアジュバントをさらに含む、ワクチン組成物を提供する。
一実施形態において、本発明のワクチンは、天然弱毒化MDV-1株Rispens(CVI-988)、またはGallidヘルペスウイルス3株SB-1ウイルスからなる群から選択される追加のマレック病ウイルス(MDV)をさらに含む。一実施形態において、本発明のワクチンは、追加のMDVが組換えゲノムを含むことを条件とする。一実施形態において、本発明のワクチンは、追加の組換えMDVゲノムが、1つ以上の鳥病原体に対して保護性である1つ以上の異種抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列を含むことを条件とする。
一実施形態において、本発明のワクチンは、1つ以上の鳥病原体によって引き起こされる1つ以上の疾患に対する鳥へのワクチン接種における使用を提供する。1つ以上の実施形態において、本発明のワクチンは、1つ以上の鳥病原体によって引き起こされる臨床症状に対する鳥の保護における使用を提供する。1つ以上の実施形態において、本発明のワクチンは、マレック病ウイルスによって引き起こされる臨床症状、および1つ以上の鳥病原体によって引き起こされる臨床症状に対する鳥の保護における使用を提供する。1つ以上の実施形態において、本発明のワクチンは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)、およびトリインフルエンザウイルス(AIV)からなる群から選択される1つ以上の鳥病原体を提供する。一実施形態において、本発明のワクチンは、1つ以上の鳥病原体が、ニューカッスル病ウイルスを含むことを条件とする。一実施形態において、本発明のワクチンは、1つ以上の鳥病原体が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)を含むことを条件とする。一実施形態において、本発明のワクチンは、1つ以上の鳥病原体が、ニューカッスル病ウイルスおよび伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスを含むことを条件とする。
1つ以上の実施形態において、本発明のワクチンは、ワクチンが、スプレー投与、インオボ(in ovo)投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、経鼻投与、またはそれらの組み合わせによるワクチンの少なくとも1回以上の投与によって投与される、鳥へのワクチン接種における使用を提供する。一実施形態において、本発明のワクチンは、ワクチンが、インオボ投与によって投与されることを条件とする。一実施形態において、本発明のワクチンは、インオボ投与が、発生から約16~22日の間に発育卵(embryonated egg)で行われることを条件とする。1つ以上の実施形態において、本発明のワクチンは、インオボ投与が、発生から約18日目に発育卵で行われることを条件とする。一実施形態において、本発明のワクチンは、ワクチンの投与が、インオボ投与、その後のスプレー投与を含むことを条件とする。一実施形態において、本発明のワクチンは、ワクチンの投与が、スプレー投与を含むことを条件とする。
一態様において、本発明は、マレック病および1つ以上の鳥病原体によって引き起こされる1つ以上の鳥疾患を治療または予防するために鳥にワクチン接種する方法であって、有効量の本発明のワクチン組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。一実施形態において、本発明の方法は、1つ以上の鳥病原体が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)、およびトリインフルエンザウイルス(AIV)からなる群から選択されることを条件とする。一実施形態において、本発明の方法は、1つ以上の鳥病原体が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)を含むことを条件とする。一実施形態において、本発明の方法は、1つ以上の鳥病原体が、ニューカッスル病ウイルス(NDV)を含むことを条件とする。一実施形態において、本発明の方法は、1つ以上の鳥病原体が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)およびニューカッスル病ウイルス(NDV)を含むことを条件とする。
本発明の一態様は、マレック病ウイルスおよび1つ以上の鳥病原体に対する免疫応答を鳥動物において誘導する方法であって、鳥に有効量の本発明の免疫原性組成物またはワクチン組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。一実施形態において、本発明の方法は、1つ以上の鳥病原体が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)、およびトリインフルエンザウイルス(AIV)からなる群から選択されることを条件とする。一実施形態において、本発明の方法は、1つ以上の鳥病原体が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)を含むことを条件とする。一実施形態において、本発明の方法は、1つ以上の鳥病原体が、ニューカッスル病ウイルス(NDV)を含むことを条件とする。一実施形態において、本発明の方法は、1つ以上の鳥病原体が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)およびニューカッスル病ウイルス(NDV)を含むことを条件とする。1つ以上の実施形態において、本発明の方法は、投与が、スプレー投与、インオボ投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与または経鼻投与によって実施されることを条件とする。一実施形態において、本方法は、インオボ投与を含む。一実施形態において、本方法は、インオボ投与が、発生から約16~22日の間に発育卵で行われることを条件とする。1つ以上の実施形態において、本方法は、インオボ投与が、発生から約18日目に発育卵で行われることを条件とする。1つ以上の実施形態において、本方法は、投与経路が、インオボ投与、その後のスプレー投与を含むことを条件とする。一実施形態において、本方法は、投与経路が、スプレー投与を含むことを条件とする。1つ以上の実施形態において、本方法は、鳥が、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、キジ、ダチョウ、ハトおよびウズラからなる群から選択されることを条件とする。一実施形態において、本方法は、鳥が、ニワトリを含むことを条件とする。
本発明の一態様は、ワクチン組成物であって、弱毒化伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスおよび伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスに特異的に結合する抗体を含む組成物をさらに含む、ニューカッスル病ウイルスからのFタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む本発明の組換えHVTを含む、ワクチン組成物を提供する。1つ以上の実施形態において、IBDVを含む組成物は、弱毒化IBD株2512であり、Bursaplex(商標)ワクチンを含む。1つ以上の実施形態において、IBDVを含む組成物は、弱毒化IBD株V877であり、Magniplex(商標)ワクチンを含む。
以下は、当業者を支援するために提供される詳細な説明である。当業者は、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の実施形態において修正および変形を行ってもよい。
本発明は、その中に当該病原性薬剤または複数の薬剤に対し、ワクチン接種された動物の効果的な保護をもたらす免疫付与を与える条件下で、上述の病原性薬剤の抗原性ポリペプチドをコードし、これを発現する1つ以上のヌクレオチド配列が挿入された、生組換えトリヘルペスウイルス、すなわち、特に、マレック病ウイルス(MDV)、より特定的には、HVTウイルス(シチメンチョウのヘルペスウイルス)に基づく鳥への使用のためのワクチンに関する。マレック病(MD)は、マレック病ウイルス(MDV)によって引き起こされる、ニワトリの一般的なリンパ増殖性疾患であり、家禽業界において著しい損失を引き起こす可能性がある。現在、MDは、関連するシチメンチョウヘルペスウイルス(HVT)である、MDVの血清型3を使用したワクチンを使用して、家禽において制御されている。MDV以外の家禽ウイルスからの遺伝子を、特定の遺伝子位置でHVTゲノムに導入することによって、本願発明者らは、1回のウイルスワクチンの投与によって、MDおよび1つ以上の追加の疾患に対する家禽の同時保護を可能にする新規な組換えウイルスワクチンを開発することができた。
本発明は、様々な病原体に対して鳥を保護するための安全な免疫付与における使用のための外来遺伝子の挿入および発現のための組換えウイルスベクターを提供する。本発明はまた、様々な病原体に対する保護のための1つ以上の組換えHVTウイルスベクターを含む多価組成物またはワクチンを提供する。加えて、本発明は、組換えウイルスベクターを単独で、または他のワクチンもしくは薬学的組成物と組み合わせて作製し、使用する方法を提供する。
一態様において、本発明は、組換えシチメンチョウヘルペスウイルス(HVT)ゲノムであって、HVTゲノムのユニークロング(UL)領域中の遺伝子間遺伝子座UL35/UL36内に挿入された1つ以上の異種抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列を含む、HVTゲノムを提供する。
一態様において、本発明は、組換えシチメンチョウヘルペスウイルス(HVT)ゲノムであって、HVTゲノムのユニークロング領域中の遺伝子間遺伝子座UL35/UL36内に挿入された1つ以上の異種抗原または複数抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列と、HVTゲノムのユニークロング領域(UL)中のUL55/Gene3部位に挿入された1つ以上の異種抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列または複数配列と、を含む、HVTゲノムを提供する。
1つ以上の実施形態において、本発明は、組換えHVTであって、1つ以上の異種抗原または複数抗原が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)、およびトリインフルエンザウイルス(AIV)からなる群から選択される鳥病原体または複数病原体に対して保護性であることを条件とする。
1つ以上の実施形態において、本発明は、組換えHVTであって、1つまたは1つ以上の異種抗原が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のVP2、VP3もしくはVP4タンパク質、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)のVP1もしくはVP2タンパク質、ニューカッスル病ウイルス(NDV)のF/HNキメラタンパク質、またはF、NP、P、M、HN、もしくはLタンパク質、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)のS1、S2もしくはMタンパク質、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)のgB、gC、gD、gE、gH、gIもしくはgLタンパク質、およびトリインフルエンザウイルス(AIV)のHA、NA、NPもしくはMタンパク質のうちのいずれかからなる群から選択される、組換えHVTを提供する。
1つ以上の実施形態において、本発明の組換えHVTは、1つ以上の異種抗原が、IBDVに対して保護性であることを条件とする。一実施形態において、本発明の組換えHVTは、1つ以上の異種抗原が、IBDVのVP2タンパク質であることを条件とする。一実施形態において、本発明の組換えHVTは、VP2タンパク質配列が、配列番号5または配列番号10を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされることを条件とする。一実施形態において、本発明の組換えHVTは、配列番号5または配列番号10のいずれかを含むヌクレオチド配列によってコードされるVP2タンパク質を提供する。
1つ以上の実施形態において、本発明の組換えHVTは、1つ以上の異種抗原または抗原が、ニューカッスル病ウイルス(NDV)に対して保護性であることを条件とする。一実施形態において、本発明の組換えHVTは、1つ以上の異種抗原が、NDVのFタンパク質であることを条件とする。一実施形態において、本発明の組換えHVTは、NDVのFタンパク質が、配列番号3を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされることを条件とする。一実施形態において、本発明の組換えHVT NDVのFタンパク質は、配列番号3を含むヌクレオチド配列によってコードされる。
1つ以上の実施形態において、本発明の組換えHVTは、1つ以上の異種抗原が、NDVおよびIBDVに対して保護性であることを条件とする。1つ以上の実施形態において、本発明の組換えHVTは、少なくとも1つの異種抗原が、NDVのFタンパク質およびIBDVのVP2タンパク質であることを条件とする。
1つ以上の実施形態において、本発明の組換えHVTは、配列番号3を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるNDVのFタンパク質と、配列番号5または配列番号NO.10を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされるIBDVのVP2タンパク質とを提供する。
1つ以上の実施形態において、本発明の組換えHVTは、配列番号3を含むヌクレオチド配列によってコードされるNDVのFタンパク質、およびIBDVのVP2タンパク質が、配列番号5または配列番号10を含むヌクレオチド配列によってコードされることを条件とする。
1つ以上の実施形態において、本発明の組換えHVTは、1つ以上の異種抗原または複数抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列または複数配列を含む1つ以上の発現カセットまたは複数カセットを含むゲノムを含む。一実施形態において、組換えHVTは、発現される抗原をコードする1つ以上のヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターをコードするヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む組換えHVTゲノムを含む。一実施形態において、発現される抗原は、NDVのFタンパク質を含む。一実施形態において、発現される抗原は、IBDVのVP2タンパク質を含む。一実施形態において、発現される抗原は、NDVのFタンパク質およびIBDVのVP2タンパク質の両方を含む。
一実施形態において、本発明の組換えHVTは、1つ以上のプロモーターが、前初期サイトメガロウイルスヒト(hCMV)プロモーター、モルモット前初期CMVプロモーター、マウス前初期CMVプロモーター、Pecプロモーター、β-ニワトリアクチンプロモーター、SV40プロモーター、糖タンパク質Xプロモーターの仮性狂犬病ウイルスプロモーター、単純ヘルペスウイルス-1アルファ4プロモーター、糖タンパク質gA、gC、gB、gE、またはgIプロモーターのマレック病ウイルスプロモーター、糖タンパク質gB、gE、gI、gDプロモーターの伝染性喉頭気管炎ウイルスプロモーター、およびウシヘルペスウイルス1/1 VP8プロモーターからなる群から選択されることを条件とする。一実施形態において、組換えHVTは、ヒトCMVプロモーターを含む。一実施形態において、組換えHVTは、マウスCMVプロモーターを含む。一実施形態において、組換えHVTは、hCMVプロモーターおよびmCMVプロモーターを含む。
1つ以上の実施形態において、組換えHVTは、ポリアデニル化(ポリA)シグナルをコードするヌクレオチド配列を含む。1つ以上の実施形態において、組換えHVTは、ポリAシグナルをコードするヌクレオチド配列を含み、BGHポリA(配列番号6)またはSV40ポリA配列(配列番号12)から選択される。一実施形態において、ポリAシグナルは、BGHポリAシグナルである。一実施形態において、ポリAシグナルは、SV40ポリAシグナルである。
一態様において、本発明の組換えHVTは、ポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含むIBDVからのVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたCMVプロモーターを含み、VP2発現カセットの全ての部分が、HVTゲノムの非コード領域中に挿入されている。一実施形態において、CMVプロモーターは、hCMVプロモーター(配列番号1)を含む。一実施形態において、IBDVのVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号5または配列番号10から選択される。一実施形態において、VP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号5を含む。一実施形態において、VP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号10を含む。一実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号6を含む。一実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号12を含む。一実施形態において、プロモーター、VP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびポリAシグナルは、発現カセットを含む。一実施形態において、発現カセットは、UL55/gene3部位でHVTゲノムに挿入される。一実施形態において、発現カセットは、ゲノム内のUL35/36部位でHVTゲノムに挿入される。一実施形態において、発現カセットは、順番に、UL55/gene3部位でHVTゲノムに挿入された配列番号1、配列番号5、または配列番号10および配列番号6を含む。
一態様において、本発明の組換えHVTは、ポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含むNDVのFタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたCMVプロモーターを含み、NDV Fカセットの全ての部分が、HVTゲノム内の非コード位置に挿入されている。一実施形態において、CMVプロモーターは、mCMV(配列番号2)プロモーターを含む。一実施形態において、配列番号3を含むNDVのFタンパク質をコードするヌクレオチド配列。一実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号12を含むヌクレオチド配列によってコードされる。一実施形態において、プロモーター、Fタンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびポリAシグナルは、発現カセットを含む。一実施形態において、発現カセットは、UL55/gene3部位でHVTゲノムに挿入される。一実施形態において、発現カセットは、ゲノム内のUL35/36部位でHVTゲノムに挿入される。一実施形態において、発現カセットは、順番に、UL55/gene3部位でHVTゲノムに挿入された配列番号2、配列番号3および配列番号12を含む。
一態様において、本発明の組換えHVTは、ポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含むIBDVのVP2タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたCMVプロモーターを含み、VP2発現カセットを含む全てが、HVTゲノム内の非コード位置に挿入されている。一実施形態において、本発明の組換えHVTは、VP2カセットと同じ挿入部位に挿入されたNDV F発現カセットの一部としてポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含むNDVのFタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたCMVプロモーターをさらに含む。一実施形態において、本組換えHVTは、VP2カセットと異なる部位に挿入されたNDV F発現カセットの一部としてポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含むNDVのFタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたCMVプロモーターをさらに含む。
一実施形態において、本発明の組換えHVTは、VP2発現カセットであって、順番に、UL35/36非コード領域中のHVTゲノム内に挿入されたhCMVプロモーターをコードするヌクレオチド配列(配列番号1)、IBDV VP2をコードするヌクレオチド配列(配列番号5または配列番号10から選択される)、およびBGHポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列(配列番号6)と、順番に、UL55/gene3非コード領域中のHVTゲノム内に挿入されたmCMVプロモーターをコードするヌクレオチド配列(配列番号2)、NDVからのFタンパク質をコードするヌクレオチド配列(配列番号3)、およびSV40ポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列(配列番号12)と、を含む、VP2発現カセットを提供する。一実施形態において、本発明の組換えHVTは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、およびトリインフルエンザウイルスからなる群から選択される1つ以上の抗原をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。一実施形態において、本発明の組換えHVTは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のVP1、VP2、VP3もしくはVP4抗原、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)のVP1もしくはVP2タンパク質、ニューカッスル病ウイルス(NDV)のF/HNキメラタンパク質、またはF、NP、P、M、HN、もしくはLタンパク質、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)のS1、S2もしくはMタンパク質、およびトリインフルエンザウイルス(AIV)のHA、NA、NPもしくはMタンパク質のうちのいずれかからなる群から選択される抗原をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターをさらに提供する。
一実施形態において、本発明の組換えHVTは、ILT抗原をコードするヌクレオチドに作動可能に連結されるプロモーターを含み、ポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、発現カセットの一部として、1つ以上のILT抗原を含む。一実施形態において、本発明の組換えHVTは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のVP1、VP2、VP3もしくはVP4抗原、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)のVP1もしくはVP2タンパク質、ニューカッスル病ウイルス(NDV)のF/HNキメラタンパク質、またはF、NP、P、M、HN、もしくはLタンパク質、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)のS1、S2もしくはMタンパク質、およびトリインフルエンザウイルス(AIV)のHA、NA、NPもしくはMタンパク質のうちのいずれかからなる群から選択される鳥抗原をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターをコードするヌクレオチド配列を各々含み、ポリアデニル化シグナルをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、第2および第3の発現カセットを含む。
1つ以上の態様において、本発明は、本発明の組換えHVTゲノムをコードする組換えDNAを提供する。
1つ以上の態様において、本発明は、本発明の組換えHVTを含み、薬学的に許容される担体、賦形剤、またはアジュバントをさらに含む、免疫原性組成物を提供する。
1つ以上の態様において、本発明は、本発明の組換えHVTを含み、薬学的に許容される担体、賦形剤、またはアジュバントをさらに含む、ワクチン組成物を提供する。
一実施形態において、本発明のワクチンは、天然弱毒化MDV-1株Rispens(CVI-988)、またはGallidヘルペスウイルス3株SB-1ウイルスからなる群から選択される追加のマレック病ウイルス(MDV)をさらに含む。一実施形態において、本発明のワクチンは、追加のMDVが組換えゲノムを含むことを条件とする。一実施形態において、本発明のワクチンは、追加の組換えMDVゲノムが、1つ以上の鳥病原体に対して保護性である1つ以上の異種抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列を含むことを条件とする。
一実施形態において、本発明のワクチンは、1つ以上の鳥病原体によって引き起こされる1つ以上の疾患に対する鳥へのワクチン接種における使用を提供する。1つ以上の実施形態において、本発明のワクチンは、1つ以上の鳥病原体によって引き起こされる臨床症状に対する鳥の保護における使用を提供する。1つ以上の実施形態において、本発明のワクチンは、マレック病ウイルスによって引き起こされる臨床症状、および1つ以上の鳥病原体によって引き起こされる臨床症状に対する鳥の保護における使用を提供する。1つ以上の実施形態において、本発明のワクチンは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)、およびトリインフルエンザウイルス(AIV)からなる群から選択される1つ以上の鳥病原体を提供する。一実施形態において、本発明のワクチンは、1つ以上の鳥病原体が、ニューカッスル病ウイルスを含むことを条件とする。一実施形態において、本発明のワクチンは、1つ以上の鳥病原体が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)を含むことを条件とする。一実施形態において、本発明のワクチンは、1つ以上の鳥病原体が、ニューカッスル病ウイルスおよび伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスを含むことを条件とする。
1つ以上の実施形態において、本発明のワクチンは、ワクチンが、スプレー投与、インオボ投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、経鼻投与、またはそれらの組み合わせによるワクチンの少なくとも1回以上の投与によって投与される、鳥へのワクチン接種における使用を提供する。一実施形態において、本発明のワクチンは、ワクチンが、インオボ投与によって投与されることを条件とする。一実施形態において、本発明のワクチンは、インオボ投与が、発生から約16~22日の間に発育卵で行われることを条件とする。1つ以上の実施形態において、本発明のワクチンは、インオボ投与が、発生から約18日目に発育卵で行われることを条件とする。一実施形態において、本発明のワクチンは、ワクチンの投与が、インオボ投与、その後のスプレー投与を含むことを条件とする。一実施形態において、本発明のワクチンは、ワクチンの投与が、スプレー投与を含むことを条件とする。
一態様において、本発明は、マレック病および1つ以上の鳥病原体によって引き起こされる1つ以上の鳥疾患を治療または予防するために鳥にワクチン接種する方法であって、有効量の本発明のワクチン組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。一実施形態において、本発明の方法は、1つ以上の鳥病原体が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)、およびトリインフルエンザウイルス(AIV)からなる群から選択されることを条件とする。一実施形態において、本発明の方法は、1つ以上の鳥病原体が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)を含むことを条件とする。一実施形態において、本発明の方法は、1つ以上の鳥病原体が、ニューカッスル病ウイルス(NDV)を含むことを条件とする。一実施形態において、本発明の方法は、1つ以上の鳥病原体が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)およびニューカッスル病ウイルス(NDV)を含むことを条件とする。
本発明の一態様は、マレック病ウイルスおよび1つ以上の鳥病原体に対する免疫応答を鳥動物において誘導する方法であって、鳥に有効量の本発明の免疫原性組成物またはワクチン組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。一実施形態において、本発明の方法は、1つ以上の鳥病原体が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)、およびトリインフルエンザウイルス(AIV)からなる群から選択されることを条件とする。一実施形態において、本発明の方法は、1つ以上の鳥病原体が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)を含むことを条件とする。一実施形態において、本発明の方法は、1つ以上の鳥病原体が、ニューカッスル病ウイルス(NDV)を含むことを条件とする。一実施形態において、本発明の方法は、1つ以上の鳥病原体が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)およびニューカッスル病ウイルス(NDV)を含むことを条件とする。1つ以上の実施形態において、本発明の方法は、投与が、スプレー投与、インオボ投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与または経鼻投与によって実施されることを条件とする。一実施形態において、本方法は、インオボ投与を含む。一実施形態において、本方法は、インオボ投与が、発生から約16~22日の間に発育卵で行われることを条件とする。1つ以上の実施形態において、本方法は、インオボ投与が、発生から約18日目に発育卵で行われることを条件とする。1つ以上の実施形態において、本方法は、投与経路が、インオボ投与、その後のスプレー投与を含むことを条件とする。一実施形態において、本方法は、投与経路が、スプレー投与を含むことを条件とする。1つ以上の実施形態において、本方法は、鳥が、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、キジ、ダチョウ、ハトおよびウズラからなる群から選択されることを条件とする。一実施形態において、本方法は、鳥が、ニワトリを含むことを条件とする。
一般的な方法論:
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、それ自体が変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、それ自体が変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
別段に定義されない限り、本明細書に記載の本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって別段の必要がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの化学およびハイブリダイゼーションと関連して利用される専門用語およびそれらの技術は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されている。
当業者に周知の組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養およびトランスフェクションのために、標準的な技術を使用する。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様に従って、または当該技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように実施される。前述の技術および手順は、一般的に、当該技術分野で周知である従来の方法に従って、および記載されるように実行されるが、本明細書全体を通して引用され、議論される様々な一般的およびより具体的な参考文献に限定されるものではない。例えば、Sambrook et al.MOLECULAR CLONING:LAB.MANUAL(3rd ed.,Cold Spring Harbor Lab.Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,2001)、およびAusubel et al.Current Protocols in Molecular Biology(New York:Greene Publishing Association JWiley Interscience),Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)、Methods in Molecular Biology,Humana Press、Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press;Animal Cell Culture(R.1.Freshney,ed.1987)、Introduction to Cell and Tissue Culture(1.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press、Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-1998)J.Wiley and Sons、Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)、Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.)、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987)、Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel et al.,eds.,1987)、PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds.,1994)、Current Protocols in Immunology(E.Coligan et al.,eds.,1991)、Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)、Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997)、Antibodies(P.Finch,1997)、Antibodies:a practical approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989)、Monoclonal antibodies:a practical approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000)、Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)、The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)、およびCancer:Principles and Practice of Oncology(Y.T.DeVita et al.,eds.,J.B.Lippincott Company,1993)を参照されたい。
操作例以外で、または別段の指示がある場合には、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表す全ての数字は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。
特定された全ての特許および他の刊行物は、例えば、本発明に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を記載し、開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。
定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明の文脈において使用されるいくつかの用語を定義する。これらの用語に加えて、他の用語は、必要に応じて本明細書の他の場所で定義される。本明細書で明示的に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語は、それらの技術分野で認識される意味を有する。
本発明を詳細に説明する前に、本発明の文脈において使用されるいくつかの用語を定義する。これらの用語に加えて、他の用語は、必要に応じて本明細書の他の場所で定義される。本明細書で明示的に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語は、それらの技術分野で認識される意味を有する。
本開示において、「含む(comprises)」、「含んでいた(comprised)」、「含む(comprising)」、「含有する(contains)」、「含有する(containing)」、「からなる」、「からなっていた」、「から本質的になる」、「含む(includes)」、「含んでいた(included)」などの用語は、標準的な米国特許法および国際的な特許法の慣行に従って定義されることに留意されたい。
「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために用いられるデバイスまたは方法に関する誤差の標準偏差を含むことを示すために本明細書で使用される。特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すことが明示的に示されない限り、または代替物が互いに排他的である場合を除き、「および/または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみを指す定義および「および/または」を指す定義を支持する。特許請求の範囲において非包括的な文言と併せて使用されない場合、または別途特に注記されない場合、「a」および「an」という単語は、「1つ以上」を示す。したがって、「導入遺伝子(a transgene)によって付与される」という用語は、例えば、1つ以上の導入遺伝子を包含する。
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の方法で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされたもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造(すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合したα炭素、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム)を有する化合物を指す。かかる類似体は、修飾されたR基(例えば、ノルロイシン)または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の方法で機能する化学化合物を指す。
アミノ酸は、本明細書において、一般に知られている3文字記号、またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨される1文字記号のいずれかによって言及されてもよい。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般に受け入れられている一文字コードによって言及されてもよい。ポリペプチド構造などの巨大分子構造は、様々なレベルの組織化の観点から説明され得る。「一次構造」は、特定のペプチドのアミノ酸配列を指す。「二次構造」は、ポリペプチド内の局所的に規則正しい三次元構造を指す。これらの構造は、ドメイン、例えば、酵素ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細孔ドメイン、または細胞質尾部ドメインとして一般的に知られている。ドメインは、ポリペプチドのコンパクトな単位を形成するポリペプチドの部分である。例示的なドメインとしては、酵素活性を有するドメインが挙げられる。ドメインは、βシートの伸長部およびαヘリックスなどのより小さな組織化切片で構成され得る。「三次構造」は、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を指す。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有会合によって形成される三次元構造を指す。異方性項はエネルギー項としても知られている。
本明細書で使用される場合、「抗体」は、抗原に特異的に結合し、抗原を認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片からのフレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含み得る。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類され得る。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類されてもよく、これらは、次いで、免疫グロブリンクラスであるIgY、IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgEをそれぞれ定義する。
例示的な免疫グロブリン(抗体)構造単位は、四量体を含んでいてもよく、各四量体は、ポリペプチド鎖の2つの同一の対からなり、各対は、1本の「軽」鎖(約25kD)と、1本の「重」鎖(約50~70kD)とを有する。各鎖のN末端は、抗原認識に主に関与する約100~110個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖および可変重鎖という用語は、これらの軽鎖および重鎖を指す。抗体は、例えば、インタクトな免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼによる消化によって産生されるいくつかの十分に特性決定された断片として存在する。様々な抗体断片は、インタクトな抗体の消化の観点から定義されるが、当業者は、そのような断片が、化学的に、または組換えDNA方法論を用いてデノボ合成され得ることを理解するであろう。したがって、「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、全抗体の修飾によって産生される抗体断片、または組換えDNA方法論を使用してデノボ合成される抗体断片、または当該技術分野で既知の他の方法を使用して特定される抗体断片のいずれかも含む。
抗体、例えば、組換え抗体、モノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の調製のために、当該技術分野で既知の多くの技術が使用され得る。目的の抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を細胞からクローニングし、組換えモノクローナル抗体を産生するために使用することができる。モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーも使用され得る。重鎖および軽鎖遺伝子産物のランダムな組み合わせは、異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールを生成する。一本鎖抗体または組換え抗体を産生する技術は、当該技術分野で見出され、本発明に係るポリペプチドに対する抗体を産生するように適合され得る。ファージディスプレイ技術は、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマー断片を特定するためにも使用され得る。抗体はまた、二重特異性(すなわち、2つの異なる抗原を認識することができる)、またはヘテロコンジュゲート、例えば、2つの共有結合した抗体、または免疫毒素が作製されてもよい。
本明細書で使用される場合、「抗原」は、ウイルスポリペプチドなどのウイルスタンパク質またはポリペプチド、ならびにウイルス粒子を指す。いくつかの実施形態において、本発明に係る抗原はまた、ウイルス核酸であってもよい。抗原は、免疫系によって認識され、宿主生物において免疫応答を誘導することができる分子である。抗原は、生物全体、弱毒化した生物、死滅した生物、または生きている生物、あるいは生物のサブユニットまたは一部を含み得る。また、免疫応答を誘導することができる、DNAの片もしくは断片、ポリペプチド、エピトープ、ハプテン、またはこれらの任意の組み合わせであってもよい。
本明細書で使用される「鳥」という用語は、Galliformes目のメンバーなどの家禽を含む。より具体的には、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、キジ、ダチョウ、ハト、およびウズラなどの経済的および/または農学的関心を有する鳥類のクラスである。
本明細書で使用される場合、「生体試料」または「試料」は、血液および血液の部分を含んでいてもよく、限定されないが、血清、血漿、血小板、または赤血球、痰、総排泄腔スワブ、粘膜、組織、培養した細胞(初代培養物を含む)、外植片、および形質転換された細胞、生体液、糞便、および尿を含む。生体試料はまた、生検試料および検死試料などの組織の切片、ならびに組織学的目的のために採取した凍結切片を含み得る。生体試料は、真核生物、例えば、鳥、限定されないが、Galliformes目からの鳥、例えば、ニワトリ、ウズラ、およびシチメンチョウから得られてもよい。本発明に従って使用するのに適切な任意の組織、例えば、皮膚、脳、脊髄、副腎、胸筋、肺、心臓、肝臓、素嚢、前胃、砂嚢、十二指腸、小腸、大腸、総排泄腔、腎臓、ファブリキウス嚢、脾臓、膵臓、副腎、骨髄、腰仙髄、または血液を使用してもよい。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、所与のアミノ酸残基に対する任意のアミノ酸置換を示し、置換残基は、所与の残基のものと化学的に非常に類似しているため、ポリペプチド機能(例えば、酵素活性)の実質的な低下は生じない。保存的アミノ酸置換は、当該技術分野で一般的に知られており、その例は、例えば、米国特許第6,790,639号、同第6,774,107号、同第6,194,167号、または同第5,350,576号に記載されている。好ましい実施形態において、保存的アミノ酸置換は、以下の6つの群のうちの1つ内で生じる任意のものである。
●1.小さな脂肪族の実質的に非極性の残基:Ala、Gly、Pro、Ser、およびThr、
●2.大きな脂肪族の非極性残基:lie、Leu、およびVal、Met、
●3.極性の負に帯電した残基およびそれらのアミド:AspおよびGlu、
●4.極性の負に帯電した残基のアミド:AsnおよびGin、His、
●5.正に帯電した極性残基:ArgおよびLys、His、ならびに
●6.大きな芳香族残基:TrpおよびTyr、Phe。
●1.小さな脂肪族の実質的に非極性の残基:Ala、Gly、Pro、Ser、およびThr、
●2.大きな脂肪族の非極性残基:lie、Leu、およびVal、Met、
●3.極性の負に帯電した残基およびそれらのアミド:AspおよびGlu、
●4.極性の負に帯電した残基のアミド:AsnおよびGin、His、
●5.正に帯電した極性残基:ArgおよびLys、His、ならびに
●6.大きな芳香族残基:TrpおよびTyr、Phe。
好ましい実施形態において、保存的アミノ酸置換は、天然残基(保存的置換)対として列挙される以下のもののうちのいずれか1つである。Ala(Ser);Arg(Lys);Asn(Gin;His);Asp(Glu);Gin(Asn);Glu(Asp);Gly(Pro);His(Asn;Gln);lie(Leu;Val);Leu(lie;Val);Lys(Arg;Gin;Glu);Met(Leu;lie);Phe(Met;Leu;Tyr);Ser(Thr);Thr(Ser);Trp(Tyr);Tyr(Trp;Phe)、およびVal(lie;Leu)。
本明細書に記載されるようなウイルスの活性を調節する化合物を試験するためのアッセイの文脈における「機能的効果」という語句は、かかるウイルスの影響下、間接的または直接的な、あるパラメータ、例えば、表現型効果または化学的効果の決定を含む。「機能的効果」は、インビトロ、インビボ、およびエクスビボでの活性を含んでいてもよく、タンパク質の分光特徴、形状、クロマトグラフィー、または溶解性の特性の変化、タンパク質の誘導性マーカーまたは転写活性化を測定すること、結合活性または結合アッセイ、例えば抗体への結合を測定すること、リガンドまたは基質結合活性の変化を測定すること、ウイルス複製を測定すること、細胞表面マーカー発現を測定すること、タンパク質レベルの変化の測定、RNA安定性の測定、下流またはレポーター遺伝子発現の同定、例えば、化学発光、蛍光、比色反応、抗体結合、および/または誘導性マーカーを介した同定など、当業者に知られている任意の手段によって測定され得る。
「遺伝子」という用語は、ウイルスDNAもしくはRNA、cDNA、ウイルスイントロンおよびエクソンDNA、人工ウイルスDNAポリヌクレオチド、またはウイルスペプチド、ウイルスポリペプチド、ウイルスタンパク質、もしくはウイルスRNA転写分子をコードする他のDNA、ならびにウイルスゲノム中の天然遺伝子もしくは導入遺伝子として存在し得るプロモーター領域、5’リーダー領域、3’非翻訳領域などの発現の調節に関与するコード配列に隣接し得る遺伝子要素を含む構成要素を指す。遺伝子またはその断片に対し、遺伝子を含むヌクレオチドの順序を決定するポリヌクレオチド配列決定方法を行うことができる。
「シチメンチョウヘルペスウイルス(HVT)」という用語は、家畜のシチメンチョウの非病原性ウイルスとして定義され、抗原的および遺伝的に関連するリンパ好性トリヘルペスウイルスのマレック病ウイルスの群内の第3の血清型として分類される。
「異種」という用語は、核酸の部分を参照しつつ使用される場合、その核酸が、自然界において互いに同じ関係で見出されない2つ以上の配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には、組換え的に産生され、新規の機能的核酸を作製するように配置された無関係の遺伝子からの2つ以上の配列、例えば、1つの供給源からのプロモーターおよび別の供給源からのコード領域を有する。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、自然界において互いに同じ関係で見出されない2つ以上の配列(例えば、融合タンパク質)を含むことを示す。異種とは、ウイルス配列、例えば、遺伝子もしくは導入遺伝子、またはその一部が、典型的に見出されないウイルスゲノムに挿入されていること、または典型的に見出されない生物に導入された遺伝子を指すこともある。
「宿主細胞」という用語は、細胞によって、例えば、遺伝子、DNAまたはRNA配列、タンパク質または酵素の細胞による発現によって物質を産生するために任意の方法で選択、修飾、形質転換、成長、または使用もしくは操作される任意の生物の任意の細胞を意味する。宿主細胞は、ベクターのため、または外因性核酸分子、ポリヌクレオチド、および/またはタンパク質の組み込みのためのレシピエントであり得るか、またはレシピエントであった任意の個々の細胞または細胞培養物を含むことが意図されている。また、単一細胞の子孫も含むことが意図されている。子孫は、天然の変異、偶発的な変異、または意図的な変異に起因して、必ずしも(形態、またはゲノムもしくは全DNA相補体において)元の親細胞と完全に同一ではなくてもよい。細胞は、原核生物であっても真核生物であってもよい。
本明細書で使用される場合、「宿主」、「対象」、「患者」、または「生物」という用語は、動物、特に鳥類、特に家禽を含んでもよい。獣医学的用途では、鳥類は、ニワトリ、ウズラ、およびシチメンチョウなどを含むGalliformes目からのものであってもよい。「生きている宿主」という用語は、上述の宿主または生きている別の生物を指す。この用語はまた、宿主または生物全体を指してもよく、単に生きている宿主から切除された部分(例えば、脳または他の器官)ではない。これらの用語には、胚期および胎児期を含む、発生の全ての段階にある個体も含まれる。
「同一」または「同一性パーセント」という用語は、2つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈で、以下に記載されるデフォルトパラメータを有するBLASTまたはBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを使用して測定される場合、または手動アラインメントおよび目視検査(例えば、ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/などに見出されるNCBIウェブサイトを参照されたい)によって測定される場合、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを特定のパーセンテージ(すなわち、比較ウィンドウもしくは指定領域にわたって最大対応について比較され、アラインメントされた場合、特定の領域にわたって、約60%同一性、好ましくは、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはもっと高い同一性)で含む、2つ以上の配列またはサブ配列を指す。次いで、そのような配列は、「実質的に同一」と称される。この定義はまた、特定の配列の相補性を指すか、またはそれに適用される。この定義はまた、欠失、付加、および/または置換を有する配列を含んでもよい。
配列比較のために、1つの配列は、典型的には、参照配列として機能し、これに対して他の配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、参照配列および比較配列がコンピュータに入力されてもよく、所望な場合、配列アルゴリズムプログラムパラメータが選択される。次いで、選択されたパラメータに基づいて、参照配列に対して、比較配列について配列同一性パーセントを生成する。配列同一性パーセントおよび配列類似性を決定するのに好適であり得るアルゴリズムの一例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、それぞれ、Altschul et al.,(Nuc Acids Res 25:3389-3402,1977)およびAltschul et al.,(J Mol Biol 215:403-410,1990)に記載されている。BLASTおよびBLAST 2.0は、当該技術分野で周知であり、本明細書に記載されるものなどの任意の核酸またはタンパク質の配列同一性パーセントを決定するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「免疫原性組成物」または「薬学的組成物」または「ワクチン」は、対象、例えば、鳥対象への投与に好適な抗原を含む組成物を包含することを意味する。上述の組成物は、一般的に、対象において免疫応答を誘発することを意味する。免疫応答は、T細胞応答、B細胞応答、またはT細胞およびB細胞応答の両方を含むことができる。組成物は、細胞表面にあるMHC分子と会合する抗原の提示によって対象患者を感作する役割を果たし得る。加えて、抗原特異的Tリンパ球または抗体を生成して、免疫付与された宿主の将来の保護を可能にすることができる。「免疫原性組成物」は、細胞媒介性(T細胞)免疫応答もしくは抗体媒介性(B細胞)免疫応答のいずれか、または両方を誘導する、生物全体またはそれに由来する免疫原性部分を含む、生ワクチン、弱毒化ワクチン、または死滅/不活化ワクチンを含有していてもよく、微生物による感染に関連する1つ以上の症状から動物を保護してもよく、または微生物による感染に起因する死亡から動物を保護してもよい。一般的に、「免疫原性組成物」は、無菌であり、好ましくは、対象内に望ましくない応答を誘発し得る汚染物質を含まない(例えば、免疫原性組成物中の化合物(複数可)は、医薬品グレードである)。免疫原性組成物は、インオボ、経口、静脈内、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内、筋肉内、皮下、吸入などを含むいくつかの異なる投与経路を介して、それを必要とする対象への投与のために設計され得る。
本明細書で使用される「免疫原性」タンパク質またはペプチドという用語は、宿主に投与されると、タンパク質に対して指向される体液型および/または細胞型の免疫応答を誘発することができるという意味で、免疫学的に活性であるポリペプチドを含む。好ましくは、タンパク質断片は、全長タンパク質と実質的に同じ免疫学的活性を有するようなものである。したがって、本発明に係るタンパク質断片は、少なくとも1つのエピトープまたは抗原決定基を含むか、または本質的にそれからなるか、またはそれからなる。「免疫原性」タンパク質またはポリペプチドは、本明細書で使用される場合、タンパク質の完全長配列、その類似体、またはその免疫原性断片を含む。「免疫原性断片」とは、1つ以上のエピトープを含み、したがって上述の免疫応答を誘発するタンパク質の断片を意味する。
「免疫原性タンパク質またはペプチド」という用語は、ポリペプチドが本明細書に定義される免疫応答を生成するように機能する限り、配列に対する欠失、付加、および置換をさらに企図する。「保存的変異」という用語は、アミノ酸残基を別の生物学的に類似した残基に置き換えること、またはコードされたアミノ酸残基が変化しないか、または別の生物学的に類似した残基であるように、核酸配列中のヌクレオチドを置き換えることを示す。この観点で、特に好ましい置換は、一般的に、本質的に保存的である、すなわち、アミノ酸のファミリー内で生じる置換である。例えば、アミノ酸は、一般的に、以下の4つのファミリーに分けられる。(1)酸性-アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩、(2)塩基性-リジン、アルギニン、ヒスチジン、(3)非極性-アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、ならびに(4)非帯電極性-グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として分類されることがある。保存的変異の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンなどの1つの疎水性残基を別の疎水性残基へと置換、または1つの極性残基を別の極性残基へと置換、例えば、アルギニンをリジンへと置換、グルタミン酸をアスパラギン酸へと置換、もしくはグルタミンをアスパラギンへと置換など、または生体活性に大きな影響を及ぼさない構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の同様の保存的置き換えが挙げられる。したがって、参照分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、タンパク質の免疫原性に実質的に影響を与えないわずかなアミノ酸置換を有するタンパク質は、参照ポリペプチドの定義内にある。これらの修飾によって産生されるポリペプチドの全てが、本明細書に含まれる。「保存的変異」という用語には、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも含まれるが、ただし、置換ポリペプチドに挙げられる抗体は、非置換ポリペプチドとも免疫反応する。
本明細書で使用される「免疫学的有効量」は、当業者に既知の標準的なアッセイによって測定されるような、細胞性(T細胞)または液性(B細胞もしくは抗体)応答のいずれかの免疫応答を誘発するのに十分な抗原またはワクチンの量を指す。例えば、本発明に関して、「免疫学的有効量」は、最小限の保護用量(力価)である。免疫原としての抗原の有効性は、増殖アッセイによって、その特定の標的細胞を溶解するT細胞の能力を測定するクロム放出アッセイなどの細胞溶解アッセイによって、または血清中の抗原に特異的な循環抗体のレベルを測定することによってB細胞活性のレベルを測定することによって、または当業者に既知であり、かつ使用される他のアッセイのいずれかによって測定することができる。さらに、免疫応答の保護レベルは、注射された抗原によって免疫付与された宿主にチャレンジ試験することによって測定することができる。例えば、免疫応答が所望される抗原が、ウイルスまたは腫瘍細胞である場合、「免疫学的有効量」の抗原によって誘導される保護レベルは、動物のウイルスまたは腫瘍細胞チャレンジ後の生存率または死亡率を検出することによって測定される。
本発明に従うワクチンの免疫学的有効量がいくつであるかの決定は、例えば、ワクチン接種後、またはチャレンジ感染後(例えば、病原体の再単離による)の免疫学的応答を監視することによって、あるいは標的の疾患の臨床徴候、または血清学的パラメータを監視し、これらをモックワクチン接種動物においてみられる応答と比較することによって、当業者の手の届くところにある。本発明に係るワクチンを標的生物に適用するための投薬スキームは、単回用量または複数回用量であってもよく、同時に、または連続して、ワクチンの製剤と適合する方法で、かつ免疫学的に有効であるような量で与えられ得る。
ウイルス核酸およびポリペプチド配列の「阻害剤」、「活性化剤」、および「調節剤」という用語は、ウイルス核酸およびポリペプチド配列のインビトロおよびインビボアッセイを使用して特定された分子を活性化するか、阻害するか、または調節することを指すために使用される。阻害剤は、ウイルスに結合するか、その活性を部分的にまたは完全に遮断するか、ウイルスの活性または発現を低下させるか、防止するか、活性化を遅らせるか、不活化するか、脱感作するか、または下方調節し得る化合物である。活性化剤は、ウイルス活性を増加させるか、開放するか、活性化するか、促進するか、活性化を増強するか、感作するか、拮抗するか、または上方調節する化合物を指す。阻害剤、活性化剤、または調節剤には、本明細書に記載のウイルスの遺伝子修飾態様、例えば、活性が変化した態様、ならびに天然に存在するおよび合成のリガンド、基質、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、ペプチド、環状ペプチド、核酸、アンチセンス分子、リボザイム、小化学分子なども含まれる。阻害剤および活性化剤のアッセイとしては、例えば、本明細書に記載されるように、インビトロ、細胞内、または細胞膜で、本発明のウイルスを発現すること、推定調節化合物を適用すること、および次いで活性に対する機能的効果を決定することが挙げられる。
阻害の程度を決定するために、潜在的な活性化剤、阻害剤、または調節剤で処理される本発明のウイルスを含む試験試料またはアッセイを、阻害剤、活性化剤、または調節剤を欠く対照試料と比較してもよい。試験試料またはアッセイが比較される対照試料には、100%の相対的なタンパク質活性値が割り当てられてもよい。ウイルスの阻害は、対照試料と比較した試験試料の活性値が、約75%、約70%、約65%、約60%、約55%、約50%、約45%、約40%、約35%、約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、約5%、および約0%を含め、約80%より小さい場合に達成される。
遺伝子間遺伝子座は、本明細書に記載される場合、非翻訳領域、5’および3’フランキング領域、イントロンなどを含む、遺伝子間に位置するDNA配列の領域として定義される。遺伝子間領域は、プロモーターおよびエンハンサーなどの遺伝子制御エレメントを含有し得る非コードDNAの一部である。
「単離された」という用語は、それが天然に存在する他の物質から実質的に分離されたか、または他の物質と比較して濃縮された物質を意味する。単離された物質は、通常、少なくとも約80重量%、少なくとも90重量%の純度、少なくとも98重量%の純度、または少なくとも約99重量%の純度である。
「標識」または「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識としては、32P、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素(例えば、ELISAで一般的に使用されるような)、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、ならびに、例えば、放射性標識をペプチドに組み込むことによって検出可能にすることができるか、またはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用することができるタンパク質が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「マレック病ウイルス」または「MDV」は、本明細書に記載されるような、シチメンチョウヘルペスウイルス(HVT)を含む、Mardivirus属の任意のアルファヘルペスウイルスを指す。特定の実施形態において、本発明は、マレック病ウイルス、その遺伝成分、遺伝子、およびそれによって産生されるタンパク質に関する。本明細書で使用される場合、そのようなウイルスは、ウイルスの遺伝成分、すなわち、そのゲノムおよび転写物、ゲノムによってコードされるタンパク質(構造タンパク質および非構造タンパク質を含む)、ならびに機能的または非機能的ウイルス粒子を含み得る。かかるウイルスをコードするポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、当該技術分野において周知であり、当業者によって容易に見出されるであろう。
「変異体」および「変異」という用語は、遺伝物質(例えば、DNA)の任意の検出可能な変化、またはそのような変化の任意のプロセス、機構、もしくは結果を意味する。これには、遺伝子の構造(例えば、DNA配列)が変更される遺伝子変異、任意の変異プロセスから生じる任意の遺伝子またはDNA、および修飾遺伝子またはDNA配列によって発現される任意の発現産物(例えば、タンパク質または酵素)が挙げられる。「バリアント」という用語は、修飾または変更された遺伝子、DNA配列、酵素、細胞など、すなわち、任意の種類の変異体を示すためにも使用され得る。
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、5’末端から3’末端まで読み取られたデオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。「核酸」はまた、任意選択で、ポリメラーゼによる正しい読み過しを可能にし、かつその核酸によってコードされるポリペプチドの発現を低下させない、天然に存在しないか、または変化したヌクレオチド塩基を含有してもよい。「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」という用語は、個々の一本鎖または二本鎖のいずれかとしての核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を指す。「リボ核酸」(RNA)という用語は、RNAi(阻害性RNA)、dsRNA(二本鎖RNA)、siRNA(低分子干渉RNA)、mRNA(メッセンジャーRNA)、miRNA(マイクロRNA)、tRNA(対応するアシル化アミノ酸で帯電されているか、または放電されているかにかかわらず、トランスファーRNA)、およびcRNA(相補性RNA)を含む。「核酸セグメント」、「ヌクレオチド配列セグメント」、またはより一般的には「セグメント」という用語は、ゲノム配列、リボソームRNA配列、トランスファーRNA配列、メッセンジャーRNA配列、オペロン配列、およびタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを発現するか、または発現するように適合され得る、より小さな操作されたヌクレオチド配列を含む機能的用語として、当業者に理解されるであろう。本明細書で使用される命名法は、Title 37 of the United States Code of Federal Regulations §1.822によって要求され、WIPO Standard ST.25(1998),Appendix 2,Tables 1 and 3の表に記載されるものである。
「作動可能に連結された」という用語は、フランキング配列の配置を指すために本明細書で使用され、そのように記載されたフランキング配列は、それらの通常の機能を発揮するように構成されるか、または組み立てられる。したがって、コード配列に作動可能に連結されたフランキング配列は、コード配列の複製、転写および/または翻訳を行うことができる場合がある。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている。フランキング配列は、正しく機能する限り、コード配列と連続している必要はない。したがって、例えば、介在する未翻訳でありながら転写された配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在することができ、プロモーター配列は、依然としてコード配列に「作動可能に連結された」とみなすことができる。
「薬学的に許容される担体」という用語は、対象に投与するのに生理学的に適合する、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、限定されないが、緩衝液、賦形剤、安定剤、アジュバント、防腐剤、希釈剤、水性または非水性ビヒクル、および他の添加剤が挙げられる。加えて、この用語は、一般に連邦政府、州政府の規制機関、または他の規制機関によって承認されているか、または米国薬局方または一般にヒトおよび非ヒト動物の両方で使用するために認められている他の薬局方に列挙されている免疫原性組成物またはワクチンの要素を指す。そのような薬学的担体は、無菌液体、例えば、水および油であってもよく、石油、動物、植物または合成由来のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む。水は、薬学的組成物が静脈内に投与される場合、好ましい担体である。生理食塩水溶液およびデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液も、液体担体として、特に注射用溶液に用いることができる。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望な場合、組成物はまた、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤および担体と共に、坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの医薬品グレードの標準担体を含むことができる。好適な薬学的担体の例は、E.W.Martinによって「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載されている。製剤は、投与様式に適合するものでなければならない。
本明細書で使用される場合、「家禽」は、それらが産生する卵のために飼育されている家畜または商業用の鳥類、ならびにそれらの肉および羽毛を指す。いくつかの実施形態において、家禽は、Galliformes目からの鳥を含んでいてもよく、ニワトリ、ウズラ、およびシチメンチョウをふくみ、ガチョウ、アヒル、ハクチョウ、ホロホロ、ハトなども含み得る。
本明細書に記載のポリヌクレオチドは、プロモーター、イントロン、コード配列、エクソン、5’非翻訳領域、および3’非翻訳領域を含む、ウイルス遺伝子配列の全てまたは一部に相補的であり得る。
特定の核酸配列はまた、「スプライスバリアント」を包含してもよい。同様に、核酸によってコードされる特定のタンパク質は、その核酸のスプライスバリアントによってコードされる任意のタンパク質を暗示的に包含する。スプライスバリアントは、遺伝子の代替的スプライシングの産物である。転写後、初期核酸転写物は、異なる(代替)核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライシングされてもよい。スプライスバリアントを産生する機構は様々であるが、エクソンの代替スプライシングを含む。読み過し転写によって同じ核酸に由来する代替のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物(スプライス産物の組換え形態を含む)は、この定義に含まれる。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において互換的に使用される。この用語は、1つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
「多価ワクチン(polyvalent vaccine)」、「組み合わせまたはコンボワクチン」、および「多価ワクチン(multivalent vaccine)」という用語は、1つより多い抗原を含有するワクチンを指すために互換的に使用される。多価ワクチンは、2つ、3つ、4つ、またはそれより多い抗原を含有してもよい。多価ワクチンは、組換えウイルスベクター、活性ウイルスもしくは弱毒化ウイルスもしくは死滅野生型ウイルス、または活性形態もしくは弱毒化形態もしくは死滅形態での組換えウイルスベクターおよび野生型ウイルスの混合物を含み得る。
「プロモーター」は、本明細書で使用される場合、RNAポリメラーゼによる遺伝子の転写が始まる場所を定義するDNA配列を指す。プロモーターは、典型的には、転写開始部位の上流に位置する。プロモーターはまた、遠位エンハンサーまたはリプレッサー要素を含むことができ、これは、転写開始部位から数千ヌクレオチドも離れた位置に位置し得る。プロモーターは、転写の方向を定義し、どのDNA鎖が転写されるかを示す。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む供給源に由来し得る。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織もしくは器官に関して、または発現が起こる発達段階に関して、または生理学的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して、遺伝子構成要素の発現を構成的にまたは差次的に調節することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージT7プロモーター、バクテリオファージT3プロモーター、SP6プロモーター、lacオペレーター-プロモーター、tacプロモーター、RSV-LTRプロモーター、CMV IEプロモーター、ヒトCMVプロモーター、マウスCMVプロモーター、Pecプロモーター、β-ニワトリアクチンプロモーター、モルモットCMVプロモーター、仮性狂犬病ウイルスプロモーター、糖タンパク質Xプロモーター、単純ヘルペスウイルス-1プロモーター、マレック病ウイルスプロモーター、およびSV40プロモーターが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「予防的に治療する」または「予防的に治療すること」という用語は、疾患またはその症状を完全に、または部分的に予防することを指し、かつ/または、この疾患および/またはこの疾患に起因する有害作用に対する部分的または完全な治癒という点では、治療的であり得る。
「組換え」という用語は、例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターを参照しつつ使用される場合、その細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然の核酸もしくはタンパク質の改変によって修飾されていること、またはその細胞が、そのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、その細胞の天然(非組換え)形態にはみられない遺伝子を発現するか、または他の方法では異常に発現されるか、過小発現されるか、または全く発現されない天然遺伝子を発現する。いくつかの実施形態において、組換え配列はまた、核酸、タンパク質、または組換えゲノム(例えば、ウイルスゲノム)を含み得る。本明細書に記載の組換えウイルスベクターは、導入遺伝子の転写を行うために異種プロモーターに作動可能に連結される導入遺伝子を含有し得る。
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、プローブが、典型的には核酸の複雑な混合物中で、その標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であってもよく、異なる状況では異なるだろう。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により、ストリンジェントな条件を達成し得る。
DNAハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件は、当業者に周知であり、例えば、約45℃で6倍の塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)、その後、50℃で2倍のSSCの洗浄を含み得る。洗浄ステップにおける塩濃度は、約50℃でおよそ2倍のSSCの低ストリンジェンシーから、50℃で0.2倍のSSCの高ストリンジェンシーまでで選択され得る。洗浄ステップにおける温度は、室温、約22℃での低ストリンジェンシー条件から、約65℃での高ストリンジェンシーまで増加させ得る。温度および/または塩条件は、最適な結果のために、適切な場合に変化させ得る。本発明によれば、核酸は、本明細書に記載の1つ以上の核酸分子と少なくとも約80%~約100%の配列同一性、例えば、少なくとも約80%、約85%、約90%、約95%、約98%、約99%、または約100%の配列同一性を示し得る。
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、依然として実質的に同一である。このことは、例えば、核酸のコピーが、遺伝暗号によって許容される最大のコドン変性を使用して作成される場合に生じる。そのような場合には、核酸は、典型的には、適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。
本明細書で使用される「治療有効量」、「有効量」、または「治療有効用量」という用語は、それが投与される効果を生み出す用量を指す。このような用量または量はまた、疾患の症状、すなわち、治療される感染のうちの1つ以上をある程度緩和する、投与される薬剤の実施形態の量、および/または、治療される宿主が発症するか、または発症するリスクがある、疾患(すなわち、感染)の症状のうちの1つ以上をある程度防止する量を指し得る。正確な用量は、治療の目的に応じて異なり、当業者は、当該技術分野で既知の技術を使用して、そのような用量を決定することができるであろう。
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」は、ある生物から別の生物へ導入するための異種コード配列または他の遺伝物質を含有するDNAのセグメントを指す。例えば、特定の実施形態において、本発明に係る導入遺伝子は、ウイルス遺伝子などの抗原コード配列、またはウイルスタンパク質をコードする配列を含み得る。
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療すること」、および「治療する」という用語は、疾患、障害、もしくは状態、および/またはその症状の薬理学的効果および/または生理学的効果を低減または改善するための薬剤を用い、疾患、障害、もしくは状態に作用するものとして定義される。「治療」は、本明細書で使用される場合、対象または宿主(例えば、獣医学的な目的の動物)における疾患の任意の治療を包含し、(a)疾患の素因があると判定されたが、まだその疾患に感染していると診断されていない対象における疾患の発生リスクを低減すること、(b)疾患の発症を妨げること、および(c)疾患を軽減すること、すなわち、疾患の逆行を引き起こすこと、および/または1つ以上の疾患症状を軽減すること、を含む。「治療」はまた、疾患または状態が存在しない場合であっても、薬理学的効果を提供するための阻害剤の送達を包含することを意味する。例えば、「治療」は、対象における増強した効果または望ましい効果(例えば、病原体の負荷の減少、疾患症状の低減など)をもたらす疾患または病原体阻害剤の送達を包含する。
「単位剤形」という用語は、本明細書で使用される場合、動物対象のための単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位が、薬学的に許容される希釈剤、担体、またはビヒクルと関連して所望な効果がもたらされるのに十分な量で計算された所定の量の化合物(例えば、本明細書に記載されるような抗ウイルス化合物)を含有する。単位剤形の仕様は、使用される特定の化合物、投与経路および投与頻度、達成される効果、ならびに宿主中の各化合物に関連する薬力学に依存する。
「ワクチン」または「ワクチン組成物」という用語は、本明細書で互換的に使用され、対象における免疫応答を誘導する本発明の少なくとも1つの免疫原性組成物を含む薬学的組成物を指す。ワクチンまたはワクチン組成物は、疾患または可能性のある死亡から対象を保護することができ、活性構成要素の免疫活性を増強する1つ以上の追加の構成要素を含んでもよく、または含まなくてもよい。保護免疫応答を誘導する本発明の組成物は、遺伝子間領域UL35/36でHVTゲノムに挿入された遺伝子をコードする1つ以上の異種抗原を有する組換えHVTウイルスを含む。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、UL35/36でHVTゲノムに挿入された遺伝子をコードする1つ以上の異種抗原と、UL55でHVTゲノムに挿入された遺伝子をコードする1つ以上の抗原とを有する、組換えHVTウイルスを含む。いくつかの実施形態において、抗原コード遺伝子は、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、トリインフルエンザウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルスおよび/またはニワトリ貧血ウイルスなどの家禽病原体に由来する抗原である。いくつかの実施形態において、組換えHVTを、家禽において保護免疫応答を引き起こす別の組換えマレック病ウイルスワクチンと組み合わせる。本発明のワクチンまたはワクチン組成物は、加えて、例えば、アジュバントまたは免疫調節物質を含む、ワクチンまたはワクチン組成物に典型的なさらなる構成要素を含み得る。ワクチンは、上述の要素のうちの1つを含むか、または1つより多くを同時に含むことができる。
本発明のワクチンは、好適な薬学的担体をさらに含んでもよい。「薬学的に許容される担体」という用語は、任意および全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤を宿主に含むことが意図される。「担体」という用語は、薬学的組成物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。そのような薬学的担体は、無菌液体、例えば、水および油であってもよく、石油、動物、植物または合成由来のもの、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む。水は、薬学的組成物が静脈内に投与される場合、好ましい担体である。生理食塩水溶液およびデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液も、液体担体として、特に注射用溶液に用いることができる。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望な場合、組成物はまた、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤を含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末剤、徐放性製剤などの形態をとることができる。組成物は、投与方法に応じて、トリグリセリドなどの従来の結合剤および担体で製剤化することができる。特定の製剤は、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの医薬品グレードの標準担体を含むことができる。好適な薬学的担体の例は、E.W.Martinによって「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載されている。製剤は、投与様式に適合するものでなければならない。適切な担体は、当業者には明白であり、大部分が投与経路に依存するであろう。本発明において存在し得る追加の成分は、アジュバント、防腐剤、表面活性剤、化学的安定剤、懸濁化剤または分散剤である。典型的には、安定剤、アジュバント、および防腐剤は、標的対象における有効性のための最良の製剤を決定するように最適化される。
「バリアント」ペプチドは、本明細書において、親ペプチド配列中の1つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失、および/または置換によって、「親」ワクチンペプチドアミノ酸配列とはアミノ酸配列が異なり、親ワクチンペプチドの少なくとも1つの所望な活性を保持するペプチドを指す。例えば、バリアントは、本発明のワクチンの一部として使用されるペプチドの1つ以上のアミノ酸配列において、少なくとも1個、例えば、約1~約10個、好ましくは約2~約5個の置換を含み得る。通常、バリアントは、親アミノ酸配列と少なくとも50%のアミノ酸配列同一性、好ましくは、少なくとも65%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、および最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性または相同性は、配列をアラインメントし、必要な場合、ギャップを導入して最大配列同一性パーセントを達成した後、親ペプチド残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書で定義される。ペプチド配列へのN末端、C末端、または内部伸長、欠失、または挿入のいずれも、配列同一性または相同性に影響を及ぼすと解釈されるべきではない。バリアントは、免疫応答を誘発する能力を保持し、好ましくは、親ペプチドの活性よりも優れた所望の活性を有する。
バリアントペプチドは、完全に機能的であってもよく、または1つ以上の活性において機能を欠いていてもよい。完全に機能的なバリアントは、典型的には、保存的変異、または重要ではない残基もしくは重要ではない領域における変異のみを含有する。機能的バリアントはまた、機能を変化させないか、またはわずかに変化させる同様のアミノ酸の置換も含有し得る。あるいは、そのような置換は、ある程度まで正または負の影響を機能に及ぼし得る。非機能的バリアントは、典型的には、1つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、挿入、逆位、もしくは切断、または重要な残基または重要な領域における置換、挿入、逆位、もしくは欠失を含有する。
さらに、ポリペプチドは、多くの場合、20の「天然に存在する」アミノ酸以外のアミノ酸を含有する。さらに、末端アミノ酸を含む多くのアミノ酸は、プロセシングおよび他の翻訳後修飾などの天然プロセスによって、または当該技術分野で周知の化学修飾技術によって修飾され得る。既知の修飾としては、限定されないが、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトール(phosphotidylinositol)の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質に対するアミノ酸のトランスファー-RNA媒介性付加、およびユビキチン化が挙げられる。かかる修飾は、当業者に周知であり、科学文献に詳細に記載されている。いくつかの特に一般的な修飾、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ-カルボキシル化、ヒドロキシル化、およびADPリボシル化は、例えば、最も基本的な文書、例えば、Proteins-Structure and Molecular Properties(2nd ed.,T.E.Creighton,W.H.Freeman&Co.,NY,1993)に記載されている。多くの詳細な総説は、この主題について、例えば、Wold,Posttranslational Covalent Modification of proteins,1-12(Johnson,ed.,Academic Press,NY,1983)、Seifter et al.182 Meth.Enzymol.626-46(1990)、およびRattan et al.663 Ann.NY Acad.Sci.48-62(1992)で入手可能である。
したがって、本発明のペプチドは、置換されたアミノ酸残基が遺伝暗号によってコードされていない誘導体または類似体も包含する。同様に、アミノ酸配列中の付加および置換、ならびにここに記載された変異、および修飾は、抗原および/またはそのエピトープまたはペプチドのアミノ酸配列に等しく適用可能であってもよく、したがって、本発明に包含される。
「バリアント」核酸は、本明細書において、「親」核酸と配列が異なる分子を指す。ポリヌクレオチド配列の逸脱は、1つ以上のヌクレオチドの欠失、置換、または付加などの変異の変化から生じ得る。これらの変化のそれぞれは、単独で、または組み合わせて、所与の配列において1回以上発生し得る。
ポリペプチドが、保存的アミノ酸置換を含有し得るのと同様に、そのポリヌクレオチドは、保存的コドン置換を含有し得る。コドン置換は、発現されるときに、上述のような保存的アミノ酸置換を産生する場合、保存的であるとみなされる。アミノ酸置換を引き起こさない変性コドン置換は、本発明に係るポリヌクレオチドにおいても有用である。したがって、例えば、本発明の一実施形態で有用な選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、それと共に形質転換される発現宿主細胞によって示されるコドン使用頻度に近似させるために、またはそれ以外の方法でその発現を改善するために、変性コドン置換によって変異され得る。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、宿主細胞において目的の1つ以上の遺伝子または配列を送達し、好ましくは発現させることができる構築物を意味する。ベクターの例としては、限定されないが、ウイルスベクター、ネイキッドDNAまたはRNA発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤に関連するDNAまたはRNA発現ベクター、リポソームに封入されたDNAまたはRNA発現ベクター、ならびにプロデューサー細胞などの特定の真核細胞が挙げられる。ベクターは、本明細書に記載されるように、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する発現制御配列を有する。発現制御配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターなどのプロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に「作動可能に連結されている」。核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に配置されるときに、「作動可能に連結される」。例えば、プレ配列または分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのDNAに作動的に連結され、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動的に連結され、またはリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように位置付けられる場合、コード配列に作動可能に連結される。一般的に、「作用可能に連結される」とは、連結されるDNA配列が連続しており、分泌リーダーの場合には、連続しており、かつ読み取り段階にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。かかる部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーは、従来の慣行に従って使用される。
本明細書で使用される場合、「ウイルスタンパク質」または「ウイルスポリペプチド」は、構造タンパク質および非構造タンパク質を含む、本明細書に記載のウイルスによってコードされるタンパク質を指す。かかるタンパク質は、VP2、F、および/またはHN、NP、P、M、またはLタンパク質を含む、MDV、NDV、および/またはIBDV由来の天然に存在するか、または天然に存在しないウイルスタンパク質を含み得る。かかるタンパク質はまた、ILTV由来の天然に存在するウイルスタンパク質または天然に存在しないウイルスタンパク質、例えば、gB、gC、gD、gE、gH、gIもしくはgL、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)由来のS1、S2もしくはMタンパク質、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)のVP1もしくはVP2タンパク質、および/またはトリインフルエンザウイルス(AIV)のHA、NA、NPもしくはMタンパク質のうちのいずれかを含み得る。
本発明によれば、本明細書に記載の組換えウイルスベクターは、ウイルス病原体からの遺伝子を発現する組換えウイルスベクターを提供することによって、家禽を、2つ以上の異なるウイルス病原体から保護することを可能にしてもよい。いくつかの実施形態において、本発明の組換えウイルスベクターは、本明細書に記載の免疫原性組成物において、家禽に提供され得る。本明細書に記載の組換えウイルスベクターと共に使用するのに好適な任意のウイルス病原体からの遺伝子を使用してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターは、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)、トリインフルエンザウイルス(AIV)、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、および伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)などからの遺伝子を発現し得る。
本発明によれば、特定のウイルスまたは複数ウイルスからの保護または耐性を付与する導入遺伝子を、特定の位置でウイルスゲノムに挿入してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の導入遺伝子は、ゲノムのユニークロング領域中のHVT UL35/UL36によって隣接される遺伝子間領域中のウイルスゲノムに挿入され得る。本発明の別の実施形態において、導入遺伝子は、使用される第2の部位に加えて、HVTゲノムのHVT UL35/UL36によって隣接される遺伝子間領域中のウイルスゲノムに挿入された1つ以上の異種遺伝子を含むものとして本明細書に記載され、1つ以上の異種遺伝子は、HVTゲノム内のUL55部位に挿入される。他の実施形態において、1つより多い導入遺伝子を、これらの領域の一方または両方に挿入してもよい。
いくつかの実施形態において、組換えウイルスベクターは、単一のウイルス種由来の複数の遺伝子を発現してもよく、または複数のウイルスに対する耐性を得るために、1つより多いウイルス種由来の遺伝子を発現してもよい。例えば、一実施形態において、本発明は、組換えウイルスベクターであって、HVTゲノムと、異なるウイルス病原体からの少なくとも1つの導入遺伝子と、を含み、したがって、家禽などの鳥において、マレック病、および少なくとも1つの他のウイルス疾患に対する保護を提供する、組換えウイルスベクターを提供する。例えば、一実施形態において、本発明に係る組換えウイルスベクターは、家禽において、MDVおよびNDVに対する保護を提供してもよく、またはMDVおよびIBDVに対する保護を提供してもよく、またはMDV、NDVおよびIBDVに対する保護を提供してもよい。
本発明の組換えウイルスベクターによる家禽における発現のためのウイルス抗原は、本明細書に記載のウイルス遺伝子などのウイルス遺伝子によってコードされ得る。当業者は、この観点で、所望のウイルス耐性を得るために、特定のウイルス遺伝子の全体を組み込む必要がない場合があることを理解するであろう。むしろ、かかる遺伝子の一部を使用してもよい。任意の所与の標的化されたウイルスまたは複数ウイルスに特異的な、所望の遺伝子の特定の部分を選択することが望ましい場合がある。タンパク質の長さに関係なく、所望のウイルスタンパク質またはそのようなタンパク質をコードする配列の最適化は、本発明と共に使用するのに適切な当該技術分野で既知の方法論を使用して容易に行われ得る。当業者は、ウイルス遺伝子もしくは複数遺伝子、またはそれによってコードされるタンパク質に修飾を行って、対象に導入されたときのウイルスタンパク質の活性を増加させ得ることを理解するであろう。ウイルス遺伝子またはタンパク質に対して行われる修飾は、特定のウイルスに対する宿主における応答を増加または減少させ得る。
特定の実施形態において、本発明の組換えマレック病ウイルスまたは組換えウイルスベクターは、IBDVウイルスタンパク質または遺伝子産物、例えばIBDV VP2タンパク質または遺伝子産物をコードする導入遺伝子を有し得る。別の実施形態において、かかる組換えウイルスまたはウイルスベクターは、NDVウイルスタンパク質または遺伝子産物、例えば、NDV FまたはHNタンパク質または遺伝子産物をコードする導入遺伝子を有し得る。別の実施形態において、かかる組換えウイルスまたはウイルスベクターは、トリインフルエンザウイルス(AIV)ウイルスタンパク質または遺伝子産物、例えば、AIV HAまたはNタンパク質または遺伝子産物をコードする導入遺伝子を有し得る。別の実施形態において、かかる組換えウイルスまたはウイルスベクターは、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)ウイルスタンパク質または遺伝子産物、例えば、IBV S1またはS2タンパク質または遺伝子産物をコードする導入遺伝子を有し得る。本発明の導入遺伝子は、NDV F-HN融合タンパク質、キメラ、または遺伝子産物などの遺伝子融合タンパク質または遺伝子産物を含む、1つより多い遺伝子を有し得る。いくつかの実施形態において、そのような遺伝子の完全なコード配列は、完全長または完全に機能するタンパク質またはポリペプチドが産生されるように使用されてもよい。あるいは、ウイルスタンパク質またはポリペプチドの一部または断片は、特定のウイルスまたは複数ウイルスからの保護またはこれらに対する耐性を提供するのに十分であり得る。
特定の実施形態において、本発明の組換えマレック病ウイルスまたは組換えウイルスベクターは、サイトカインタンパク質または遺伝子産物などの免疫調節物質をコードする導入遺伝子を有し得る。本発明によれば、サイトカインは、IL2、IL6、IL7、IL8、IL12、IL18などを含むがこれらに限定されない、インターロイキン(IL)であってもよい。サイトカインをコードするそのような導入遺伝子は、本明細書に記載の一方または両方のゲノム部位に挿入され得る。いくつかの実施形態において、コードする導入遺伝子を、本明細書に記載の1つの部位に挿入し、ウイルスタンパク質をコードする導入遺伝子を、他の部位に挿入してもよい。インターフェロン、ケモカイン、グルカン、顆粒球コロニー刺激因子などの他の免疫調節物質が有用であってもよく、オリゴデオキシヌクレオチドも、本発明に従って使用されてもよい。
ウイルス遺伝子またはタンパク質の単離
本発明の実施形態において、本明細書に記載のウイルス遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での核酸プローブおよび/またはオリゴヌクレオチド、PCRもしくはマイクロアレイ、DNAライブラリーのスクリーニング、または当該技術分野で知られる任意の他の方法を使用して単離され得る。当業者は、本発明に従う使用のためにウイルス遺伝子またはタンパク質を単離する方法を容易に理解するであろう。あるいは、発現ライブラリーを使用して、抗血清または別の種もしくはその一部からのウイルスに対して指向する精製抗体を用い、ホモログを免疫学的に検出することによって、ウイルス、その多型バリアント、オーソログ、または対立遺伝子をクローニングしてもよい。
本発明の実施形態において、本明細書に記載のウイルス遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での核酸プローブおよび/またはオリゴヌクレオチド、PCRもしくはマイクロアレイ、DNAライブラリーのスクリーニング、または当該技術分野で知られる任意の他の方法を使用して単離され得る。当業者は、本発明に従う使用のためにウイルス遺伝子またはタンパク質を単離する方法を容易に理解するであろう。あるいは、発現ライブラリーを使用して、抗血清または別の種もしくはその一部からのウイルスに対して指向する精製抗体を用い、ホモログを免疫学的に検出することによって、ウイルス、その多型バリアント、オーソログ、または対立遺伝子をクローニングしてもよい。
cDNAライブラリーを作製し、スクリーニングする方法は、当該技術分野において周知である。例えば、ゲノムによって発現されるウイルス遺伝子をクローニングするためのcDNAライブラリーを作製するために、mRNAは、逆転写酵素を使用してcDNAに逆転写され得る。次いで、cDNAを、組換えベクターなどのベクターにライゲーションし、繁殖、スクリーニング、およびクローニングのために宿主細胞または生物に導入してもよい。
ゲノムライブラリーの場合、DNAを所望の組織から抽出してもよく、生体酵素を使用して消化してもよく、または機械的に剪断してもよい。その後、得られたDNA断片を望ましくないDNA断片から単離し、適切なベクターに構築してもよく、次いで、そのベクターをインビトロでパッケージングしてもよい。組換えベクターは、当該技術分野で知られている任意の方法によって分析され得る。
ポリメラーゼ連鎖反応(PCRおよびRT-PCR)およびリガーゼ連鎖反応(LCR)などの方法を使用して、mRNAから、cDNAから、ゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーから直接的に核酸配列を増幅させてもよい。変性オリゴヌクレオチドを設計して、本明細書で提供される配列を使用してホモログを増幅させることができる。制限エンドヌクレアーゼ部位をプライマーに組み込んでもよい。ポリメラーゼ連鎖反応または他のインビトロ増幅方法はまた、例えば、発現されるタンパク質をコードする核酸配列をクローニングすること、標的化される疾患(例えば、MDV、NDV、および/またはIBDV)の存在を検出するためのプローブとして使用する核酸を作製すること、核酸配列決定のために、または他の目的のために生体試料中のmRNAをコードすることに有用であり得る。PCRによって増幅された遺伝子は、アガロースから精製され、適切なベクターにクローニングされ得る。
ウイルス遺伝子の発現は、当該技術分野で既知の技術、例えば、mRNAの逆転写および増幅、全RNAまたはポリA RNAの単離、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、インサイツハイブリダイゼーション、RNase保護、高密度ポリヌクレオチドアレイ技術などによっても分析され得る。
ウイルスゲノムまたはタンパク質をコードする核酸を、高密度オリゴヌクレオチドアレイ技術(例えば、GeneChip(商標))を使用して、本発明におけるウイルス遺伝子、オーソログ、対立遺伝子、そのバリアント、および多型バリアントを特定し得る。選択した遺伝子は、複製および/または発現のために原核細胞または真核細胞に形質転換する前に、中間ベクターにクローニングされ得る。これらの中間ベクターは、原核生物ベクター、例えば、プラスミド、またはシャトルベクターであり得る。
核酸の修飾
DNA分子を単離し、操作するために、当業者に周知の任意の数の方法を使用することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を使用して、特定の出発DNA分子を増幅し、および/または出発DNA分子のバリアントを産生し得る。DNA分子またはその断片は、化学的手段によって断片を直接的に合成することを含む、当該技術分野で既知の任意の技術によっても得ることができる。したがって、本明細書に記載の核酸の全てまたは一部を合成してもよい。
DNA分子を単離し、操作するために、当業者に周知の任意の数の方法を使用することができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を使用して、特定の出発DNA分子を増幅し、および/または出発DNA分子のバリアントを産生し得る。DNA分子またはその断片は、化学的手段によって断片を直接的に合成することを含む、当該技術分野で既知の任意の技術によっても得ることができる。したがって、本明細書に記載の核酸の全てまたは一部を合成してもよい。
本明細書で使用される場合、「相補的核酸」という用語は、互いに特異的にハイブリダイズすることができる2つの核酸分子であって、この2つの分子が、平行ではない二本鎖核酸構造を形成することができる2つの核酸分子を指す。この観点で、ある核酸分子は、それらが完全な相補性を示す場合、別の核酸分子の相補体であると言われる。2つの分子は、それらを少なくとも従来の低ストリンジェントな条件で互いにアニーリングされたまま維持することを可能にするのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができる場合、「最小限相補的」であると言われる。同様に、これらの分子は、それらを従来の高低ストリンジェントな条件で互いにアニーリングされたまま維持することを可能にするのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができる場合、相補的であると言われる。従来のストリンジェントな条件は、Sambrook,et al.(1989)、およびHaymes et al.(1985)によって記載されている。
分子が二本鎖構造を形成する能力を保持している限り、完全な相補性からの逸脱は許容される。したがって、核酸分子または核酸分子の断片がプライマーまたはプローブとして機能するために、このような分子または断片は、使用される特定の溶媒および塩濃度で安定な二本鎖構造を形成することができるように、配列において十分に相補的であるだけでよい。
本明細書で使用される場合、「配列同一性」、「配列類似性」、または「相同性」という用語は、2つ以上のヌクレオチド配列間の配列関係を説明するために使用される。2つの配列間の「配列同一性」のパーセンテージは、特定の数のヌクレオチドにわたって2つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウ中の配列の一部は、参照配列と比較して、付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る。全ての位置でヌクレオチドが同じであれば、2つの配列は、同一であると言われる。5’方向から3’方向に観察されるときのヌクレオチド配列は、第1のヌクレオチド配列が、第2の配列または参照配列との完全な相補性を示す場合、3’方向から5’方向に観察される第2のヌクレオチド配列の「相補体」、または3’方向から5’方向に観察される第2のヌクレオチド配列に相補的であると言われる。本明細書で使用される場合、核酸配列分子は、配列リードの5’から3’のうちの1つの全てのヌクレオチドが、3’から5’へ読み取るときに他の配列の全てのヌクレオチドに相補的である場合に、「完全な相補性」を示すと言われる。参照ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列の逆相補体配列と同一の配列を示す。
組換えベクターおよび宿主細胞
組換えDNAベクターは、例えば、直鎖または環状プラスミドであり得る。ベクター系は、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノムに導入される全DNAを共に含有する2つ以上のベクターもしくはプラスミドであってもよい。本明細書に記載の組換えベクターは、例えば、細菌細胞などの宿主細胞における所望のタンパク質の産生を可能にするための発現ベクターであり得る。本明細書に記載の核酸分子、またはその相補体もしくは断片を、1つ以上の微生物宿主において機能し、連結したコード配列または他のDNA配列の発現を駆動する好適なプロモーターの制御下でベクターに挿入してもよい。多くのベクターが、この目的のために当該技術分野で利用可能であり、既知であり、適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸およびベクターで形質転換される宿主細胞のサイズに依存する。各ベクターは、その機能(例えば、DNAの増幅またはDNAの発現)およびそれが適合する特定の宿主細胞に応じて、様々な構成要素を含有し得る。細菌形質転換のためのベクター構成要素には、一般的に、限定されないが、シグナル配列、複製起点、1つ以上の選択可能なマーカー遺伝子、および外因性DNAの発現を可能にする誘導性プロモーターのうちの1つ以上が含まれる。
組換えDNAベクターは、例えば、直鎖または環状プラスミドであり得る。ベクター系は、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノムに導入される全DNAを共に含有する2つ以上のベクターもしくはプラスミドであってもよい。本明細書に記載の組換えベクターは、例えば、細菌細胞などの宿主細胞における所望のタンパク質の産生を可能にするための発現ベクターであり得る。本明細書に記載の核酸分子、またはその相補体もしくは断片を、1つ以上の微生物宿主において機能し、連結したコード配列または他のDNA配列の発現を駆動する好適なプロモーターの制御下でベクターに挿入してもよい。多くのベクターが、この目的のために当該技術分野で利用可能であり、既知であり、適切なベクターの選択は、ベクターに挿入される核酸およびベクターで形質転換される宿主細胞のサイズに依存する。各ベクターは、その機能(例えば、DNAの増幅またはDNAの発現)およびそれが適合する特定の宿主細胞に応じて、様々な構成要素を含有し得る。細菌形質転換のためのベクター構成要素には、一般的に、限定されないが、シグナル配列、複製起点、1つ以上の選択可能なマーカー遺伝子、および外因性DNAの発現を可能にする誘導性プロモーターのうちの1つ以上が含まれる。
本明細書で使用される場合、「組換えマレック病ウイルス」または「組換えHVT」または「組換えウイルス」は、1つ以上の異種核酸配列(すなわち、ウイルス中に天然に存在する遺伝子の核酸配列と同一ではないウイルス遺伝子またはその断片もしくは一部をコードするDNA)のウイルスゲノムへの組み込みによって遺伝子修飾された感染性ウイルスまたはウイルス粒子を示す。組換えマレック病ウイルスによる細胞の感染では、組換えウイルスは、異種ポリペプチドの形態で異種遺伝子を発現する。
本明細書で使用される「組換えウイルスベクター」または「ウイルスベクター」は、宿主細胞に導入するためにウイルスに挿入される組換え構築物を指す。本発明に係るそのようなベクターは、任意のHVT株に由来し得る。適切な場合、ウイルス遺伝子またはタンパク質コード配列を、1つ以上のウイルス疾患からの保護のためにニワトリまたは他の家禽に導入するために、本明細書に記載のかかる組換えウイルスベクターに組み込んでもよい。
本明細書で使用される場合、「挿入部位」は、導入遺伝子または外因性DNAが挿入されるウイルスゲノム中の領域を指す。本発明の挿入部位は、遺伝子間領域であり得る。本発明に係る遺伝子間領域は、ゲノムのユニークロング領域中のHVT UL35およびHVT UL36によって隣接されてもよい。本発明のいくつかの実施形態において、抗原をコードする1つ以上の異種ヌクレオチドはまた、HVTゲノムのUL55遺伝子座によって定義される領域に挿入され得る。いくつかの実施形態において、本発明の挿入部位は、遺伝子間領域のいずれかの側のフランキング遺伝子の全部または一部を含み得る。これらの領域のうちの1つに1つ以上の導入遺伝子を挿入することにより、組換えウイルスベクターの産生を可能にし、次いで、これを1つ以上の疾患に対する保護のためにニワトリまたは他の家禽に導入することができる。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、調節配列およびヌクレオチド配列に関して使用される場合、調節配列が、連結された構造的ヌクレオチド配列の調節された発現を引き起こすことを意味する。「調節配列」、「調節要素」、または「制御要素」という用語は、構造的ヌクレオチド配列の上流(5’配列)、内部、または下流(3’配列)に位置するヌクレオチド配列を指す。そのような配列は、転写のタイミングおよびレベルまたは量、RNAプロセシングもしくは安定性、または関連する構造的ヌクレオチド配列の翻訳に影響を与える。調節配列としては、限定されないが、プロモーター、リーダー配列、イントロン、エンハンサー、ステム-ループ構造、リプレッサー結合配列、およびポリアデニル化認識配列を挙げることができ、限定されないが、ウシ成長ホルモンポリAシグナル、シミアンウイルス40(SV40)ポリAシグナル、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV) 1629 ORFポリ(A)シグナル、ならびに単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ(TK)ポリAシグナルが挙げられる。当業者は、本明細書に記載の導入遺伝子の発現を増加または減少させるために、プロモーターおよび/または調節エレメントの異なる組み合わせが使用され得ることを認識するであろう。
異なる種において機能するプロモーターもまた、当該技術分野において周知である。ポリペプチドの発現に有用なプロモーターとしては、誘導性、ウイルス性、合成性、もしくは構成的であるプロモーター、および/または組織特異的であり、時間的に調節され、空間的に調節され、かつ空間的に時間的に調節されるプロモーターが挙げられる。例えば、本発明に従って有用なプロモーターとしては、限定されないが、前初期(IE)サイトメガロウイルスヒト(CMV)プロモーター、モルモットCMVプロモーター、SV40プロモーター、仮性狂犬病ウイルスプロモーター、例えば、糖タンパク質Xプロモーターの仮性狂犬病ウイルスプロモーター、単純ヘルペスウイルス-1、例えば、アルファ4プロモーター、マレック病ウイルスプロモーター(MDV-1、MDV-2など、MDVの任意の単離物または株を含む)、ならびにHVT、例えば、糖タンパク質の発現を制御するプロモーター、例えば、gC、gB、gE、もしくはgI、伝染性喉頭気管炎ウイルスプロモーター、例えば、糖タンパク質gB、gE、gI、gD遺伝子の伝染性喉頭気管炎ウイルスプロモーター、または任意の他の適切なプロモーターが挙げられ得る。当業者は、本発明に従って有用なプロモーターを特定する方法を認識するであろう。
本発明によれば、本明細書に記載の組換えマレック病ウイルスまたは組換えウイルスベクターは、1つ以上のウイルスタンパク質またはペプチドまたはその断片もしくは一部の発現のために、1つ以上のプロモーターに作動可能に連結された1つ以上の導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態において、単一の導入遺伝子は、単一のプロモーターに作動的に連結されてもよく、または1つより多い導入遺伝子は、単一のプロモーターに作動可能に連結されてもよい。他の実施形態において、1つより多い導入遺伝子が、組換えベクター中に存在していてもよく、第1の導入遺伝子は、第1のプロモーターに作動可能に連結されており、第2の導入遺伝子は、第2のプロモーターに作動可能に連結されている。
ベクターの構築および選択
遺伝子または導入遺伝子、またはその一部を標的部位に挿入するのに有用な、本明細書に記載の1つ以上の構成要素を含有するベクターの構築は、当業者に既知であり、標準的な組換えDNA技術を用いてもよい。組換えDNAベクターまたは構築物は、細胞に選択可能な表現型を付与する選択可能なマーカーを含み得る。また、選択可能なマーカーを使用して、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外因性核酸を含有する細胞を選択してもよい。かかるマーカーは、例えば、殺生物剤耐性、または抗生物質耐性(例えば、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシンなど)をコードし得る。選択可能なマーカーは、当業者に周知であり、本発明に従って使用するのに適した任意のマーカーを含み得る。
遺伝子または導入遺伝子、またはその一部を標的部位に挿入するのに有用な、本明細書に記載の1つ以上の構成要素を含有するベクターの構築は、当業者に既知であり、標準的な組換えDNA技術を用いてもよい。組換えDNAベクターまたは構築物は、細胞に選択可能な表現型を付与する選択可能なマーカーを含み得る。また、選択可能なマーカーを使用して、本明細書に記載のポリペプチドまたはタンパク質をコードする外因性核酸を含有する細胞を選択してもよい。かかるマーカーは、例えば、殺生物剤耐性、または抗生物質耐性(例えば、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、ハイグロマイシンなど)をコードし得る。選択可能なマーカーは、当業者に周知であり、本発明に従って使用するのに適した任意のマーカーを含み得る。
組換えベクターまたは構築物はまた、発現を監視するために使用され得るが、細胞死を引き起こす可能性がない、スクリーニング可能なマーカーを含み得る。好適なスクリーニング可能なマーカーとしては、例えば、β-グルクロニダーゼまたはuidA遺伝子(GUS)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)などの様々な蛍光タンパク質遺伝子の1つ以上、または特徴的な波長で蛍光を発するタンパク質の大きなファミリーのいずれか1つ、様々な発色基質が知られている酵素をコードする遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、発色カテコールを変換するカテコールジオキシゲナーゼをコードするxylE遺伝子、β-アミラーゼ遺伝子、チロシンをDOPAおよびドーパキノンに酸化することができ、その後にメラニンに凝縮する酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子、または発色α-ガラクトース基質を触媒するα-ガラクトシダーゼが挙げられ得る。
宿主細胞におけるタンパク質の発現
本明細書に記載のクローニングされたウイルス遺伝子の高レベルの発現を得るために、転写を指示する強力なプロモーターと、転写/翻訳ターミネーターとを含有する発現ベクターに核酸をサブクローニングしてもよい。コードされたタンパク質の場合、翻訳開始のためのリボソーム結合部位も含まれ得る。発現ベクターにおける使用に好適なプロモーターは、細菌プロモーター、ウイルスプロモーターなど、当該技術分野で周知である。タンパク質を発現するための発現系は、当該技術分野で既知のいくつかの原核生物種および真核生物種において入手可能である。このような発現系のための市販のキットも容易に入手可能である。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞の真核生物発現系は、当該技術分野で周知であり、これらも市販されている。
本明細書に記載のクローニングされたウイルス遺伝子の高レベルの発現を得るために、転写を指示する強力なプロモーターと、転写/翻訳ターミネーターとを含有する発現ベクターに核酸をサブクローニングしてもよい。コードされたタンパク質の場合、翻訳開始のためのリボソーム結合部位も含まれ得る。発現ベクターにおける使用に好適なプロモーターは、細菌プロモーター、ウイルスプロモーターなど、当該技術分野で周知である。タンパク質を発現するための発現系は、当該技術分野で既知のいくつかの原核生物種および真核生物種において入手可能である。このような発現系のための市販のキットも容易に入手可能である。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞の真核生物発現系は、当該技術分野で周知であり、これらも市販されている。
異種核酸の発現を指示するための適切なプロモーターの選択は、特定の用途に応じて変わる。かかるプロモーターは、その天然設定における距離に類似する異種転写開始部位からの距離に位置していてもよいが、当業者は、この距離におけるいくつかの変動が、プロモーター機能を失うことなく許容され得ることを理解するであろう。
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的には、宿主細胞における核酸の発現に必要な全ての要素を含有する転写または発現カセットを含有する。真核細胞または原核細胞における発現のために使用され得る当該技術分野で既知の任意の従来のベクターを使用して、遺伝子情報を細胞内に輸送し得る。したがって、典型的な発現カセットは、選択された核酸をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、ならびに効率的な処理(例えば、リボソーム結合部位、ポリアデニル化、および翻訳終結)に必要な対応するシグナルを含有する。追加の要素としては、エンハンサー、および構造遺伝子としてのゲノムDNAの場合には、機能的スプライスドナーおよびアクセプター部位を有するイントロンが挙げられ得る。
本明細書に記載のプロモーターなどのプロモーター配列に加えて、発現カセットは、転写の効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域も含有してもよい。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子に由来してもよいか、または異なる遺伝子に由来してもよい。蛍光タンパク質、緑色または赤色蛍光タンパク質、β-gal、CATなどのマーカーは、ベクター形質導入のためのマーカーとしてベクターに含まれ得る。エピトープタグまたは配列タグはまた、好都合な単離方法を提供するために、組換えタンパク質に添加してもよい。
真核生物ウイルス由来の調節要素を含有する発現ベクターは、典型的には、真核生物発現ベクター、例えば、SV40ベクター、パピローマウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびエプスタイン・バールウイルスに由来するベクターに使用される。他の例示的な真核生物ベクターとしては、pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、バキュロウイルスpDSVE、およびCMVプロモーター、S V40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳がんウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞中での発現に有効であり得る当該技術分野で既知の他のプロモーターの指令下でのタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
真核生物ベクターからのタンパク質の発現は、誘導性プロモーターを使用して調節することもできる。誘導性プロモーターでは、発現レベルは、これらの薬剤の応答要素をプロモーターに組み込むことによって、テトラサイクリンまたはエクジソンなどの誘導剤の濃度に結び付けられる。高レベルの発現は、誘導剤の存在下で誘導性プロモーターから得られ得る。一部の発現系は、遺伝子増幅を提供するチミジンキナーゼおよびジヒドロ葉酸レダクターゼなどのマーカーを有する。
発現ベクターはまた、E.coli中で機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択のための抗生物質耐性遺伝子、および真核生物配列の挿入を可能にするためのプラスミドの非必須領域における固有の制限部位を含んでもよい。本発明と共に使用するのに適した任意の抗生物質耐性遺伝子を用いてもよい。
当該技術分野で既知の標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母、または昆虫細胞株を産生し得る。次いで、かかる細胞株を、当該技術分野で既知の標準的な技術を使用して精製してもよく、原核細胞および/または真核細胞を、クローニングされたゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための当該技術分野で既知の任意の方法に従って形質転換してもよい。かかる方法としては、限定されないが、プラスミドまたはウイルスベクター、リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、微粒子銃、リポソーム、マイクロインジェクション、または当該技術分野で利用可能な任意の方法が挙げられ得る。
発現ベクターまたは導入遺伝子が宿主細胞に導入された後、細胞を、所望のタンパク質の発現に最適な条件下で培養してもよく、これは、当該技術分野で既知の標準的な技術を使用して回収されてもよい。次いで、本明細書に記載されるものなどのウイルス病原体またはウイルスタンパク質を、診断アッセイに使用するため、抗体および免疫原性組成物を作製するため、および抗ウイルス化合物の特定のために精製してもよい。天然に存在するタンパク質を、本明細書に記載されるようなウイルスに感染した鳥類からの組織試料などの生体試料から精製してもよく、組換えタンパク質を、当該技術分野で既知の任意の好適な方法または発現系を使用して精製してもよい。
組換えタンパク質を精製するためのいくつかの手順は、当該技術分野において入手可能である。例えば、確立された分子接着特性を有するタンパク質を、別のタンパク質と可逆的に融合することができる。加えて、特定のタンパク質を、精製カラムに選択的に吸着させ、次いで、適切なリガンドまたは基質を使用して、比較的純粋な形態でカラムから遊離させてもよい。次いで、融合タンパク質を酵素活性によって除去してもよい。タンパク質を、アフィニティカラムを使用して精製してもよい。組換えタンパク質を、任意の好適な供給源から精製することができる。
組換え細菌からのタンパク質の精製
組換えタンパク質は、例えば、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターを使用して、細菌によって大量に発現され得る。IPTGを用いたプロモーター誘導は、誘導性プロモーター系の一例である。細菌を、当該技術分野で既知の標準的な手順に従って、新鮮な培養物または凍結培養物から成長させてもよい。
組換えタンパク質は、例えば、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターを使用して、細菌によって大量に発現され得る。IPTGを用いたプロモーター誘導は、誘導性プロモーター系の一例である。細菌を、当該技術分野で既知の標準的な手順に従って、新鮮な培養物または凍結培養物から成長させてもよい。
細菌中で発現したタンパク質は、封入体と呼ばれる不溶性凝集体を形成し得る。タンパク質封入体の精製に好適なプロトコルは、当該技術分野で知られている。発現したタンパク質の回収のための細菌の溶解は、化学緩衝液の導入、超音波処理、機械的破壊などを含み得る当該技術分野で既知の任意の方法を使用して実行され得る。封入体も、可溶化してもよく、溶解した細胞懸濁液を遠心分離して不要な細胞破片を除去してもよい。封入体タンパク質は、適切な緩衝液で希釈または透析することによって再生し得る。
組換えタンパク質は、細菌ペリプラズムからも得られ得る。細菌細胞の溶解後、細菌のペリプラズム画分は、当該技術分野で既知の任意の方法によって単離され得る。上清に存在する組換えタンパク質は、当業者に周知の標準的な分離技術によって宿主タンパク質から分離され得る。
タンパク質は、当該技術分野で既知の任意の技術、例えば、異なる孔径の膜を通る濾過を使用して分子量に基づいてタンパク質を単離する、溶解度分画またはサイズ差濾過を使用して分離され得る。カラムクロマトグラフィーは、サイズ、正味の表面電荷、疎水性、またはリガンドもしくは基質に対する親和性に基づいて、タンパク質を他のタンパク質から単離するために使用され得る。加えて、目的のタンパク質に対して挙げられる抗体をカラムにコンジュゲートし、タンパク質を免疫精製してもよい。これらの方法は全て、当該技術分野で周知である。当業者には、クロマトグラフィー技術が、任意のスケールで、任意の適切な商業的装置を用いて実施され得ることが明白であろう。
抗体産生
ウイルスタンパク質、ウイルス粒子、および/または核酸と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法は、当該技術分野で既知である。かかる技術は、ファージまたは他のベクターにおける組換え抗体ライブラリーからの抗体の選択による抗体調製、ならびにウサギまたはマウスの免疫付与によるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製を含み得る。
ウイルスタンパク質、ウイルス粒子、および/または核酸と特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を産生する方法は、当該技術分野で既知である。かかる技術は、ファージまたは他のベクターにおける組換え抗体ライブラリーからの抗体の選択による抗体調製、ならびにウサギまたはマウスの免疫付与によるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製を含み得る。
ウイルスタンパク質またはその一部、ウイルス粒子、および/または核酸を含むいくつかの抗原または抗原領域を使用して、所望のウイルス病原体に特異的に反応する抗体を産生し得る。例えば、組換えウイルスタンパク質またはその抗原断片は、本明細書に記載されるか、または当該技術分野で既知の任意の方法を使用して単離され得る。組換えタンパク質は、原核細胞または真核細胞で発現され、本明細書に記載のように精製され得る。モノクローナル抗体および/またはポリクローナル抗体は、天然に存在する(純粋な形態もしくは不純な形態で)または組換えタンパク質を使用して、当該技術分野で既知の方法を使用して産生され得る。ウイルス配列に由来する合成ペプチドも、抗体を生成するために使用してよく、担体タンパク質にコンジュゲートし、抗体を産生することができる動物(例えば、ウサギ)に注射してもよい。
ポリクローナル抗体の産生方法は、当業者に既知である。例えば、マウスまたはウサギの近交系株は、当該技術分野で既知の標準的な免疫付与プロトコルを使用して、本明細書に記載のアジュバントなどの標準的なアジュバントを使用して、タンパク質により免疫付与され得る。そのタンパク質に対する抗体の適正な高力価が得られた場合、抗血清を調製し、そのタンパク質に対して反応性の抗体を得るための濃縮を行ってもよい。
モノクローナル抗体はまた、当該技術分野で既知の様々な方法によって得られ得る。例えば、所望の抗原で免疫付与された動物由来の脾臓細胞は、一般的に、骨髄腫細胞との融合によって、またはエプスタイン・バールウイルス(EBV)、癌遺伝子もしくはレトロウイルスによる形質転換、または当該技術分野で周知の他の方法によって、不死化され得る。次いで、不死化した細胞を、抗原に対する所望の特異性および親和性の抗体の産生についてスクリーニングしてもよい。かかる細胞によって産生されるモノクローナル抗体の収率は、当該技術分野で既知の様々な技術によって、例えば、脊椎動物宿主の腹腔内への注射によって増強され得る。
モノクローナル抗体およびポリクローナル血清を収集し、イムノアッセイ、例えば、固体支持体上に固定されたタンパク質を用いた固相イムノアッセイで所望の抗原またはタンパク質に対して滴定してもよい。特定のウイルスタンパク質のみに特異的な抗体は、他の交差反応タンパク質を取り去ることによって作製してもよい。このようにして、選択されたタンパク質のみに結合する抗体を得てもよい。
タンパク質、ウイルス、および/または核酸などの所望のウイルス抗原に対する特異的抗体が利用可能になると、所望の抗原は、様々なイムノアッセイ法を使用して検出され得る。抗体は、治療的にも使用され得る。
本明細書に記載のウイルス粒子に関連するか、またはそれとは異なるタンパク質は、いくつかの十分に認識された免疫学的結合アッセイのうちの任意のものを使用して検出および/または定量化され得る。ウイルス粒子は、ウイルス粒子において提示されるウイルスタンパク質によって定義されるエピトープおよび/またはウイルス粒子から分離されるウイルスタンパク質によって定義されるエピトープ(例えば、感染した細胞中に存在してもよい)に基づいて検出されてもよい。免疫学的アッセイは、選択したタンパク質または抗原に特異的に結合する抗体を使用してもよい。抗体は、当業者に周知のいくつかの方法のいずれかによって産生され得る。イムノアッセイはまた、検出目的のために抗体および抗原によって形成される複合体に特異的に結合するために標識剤を使用してもよい。標識剤は、それ自体が、抗体/抗原複合体を含む部分の1つであってもよい。したがって、標識剤は、標識されたウイルスタンパク質核酸または標識された抗ウイルス抗体であり得る。あるいは、標識剤は、抗体/抗原複合体に特異的に結合する二次抗体などの第3の部分であってもよい。二次抗体は、第1の抗体が由来する種の抗体に特異的であり得る。標識剤は、別の分子(例えばストレプトアビジン)が特異的に結合することができるビオチンなどの検出可能な部分で修飾することができる。様々な検出可能な部分は、当業者に周知である。
試料中のウイルスタンパク質、ウイルス、および/または核酸を検出するためのイムノアッセイは、当該技術分野で周知である。そのようなアッセイは、競合性または非競合性のいずれかであってもよく、定量性または非定量性のいずれかであってもよい。非競合性イムノアッセイは、抗原が直接的に検出され得るアッセイであり、いくつかの場合には、抗原の量が直接的に測定される。競合性アッセイにおいて、試料中に存在するウイルス抗原は、試料中に存在するウイルス抗原によって抗ウイルス抗原抗体から置き換えられた既知の添加された(外因性の)ウイルス抗原に関連する検出可能なシグナルによって間接的に検出される。このようにして、そのようなアッセイはまた、試料中に存在するウイルス抗原の量の間接的な測定を提供するように適合させることができる。競合性結合イムノアッセイも、任意の交差反応抗体がプール抗血清から除去され得る交差反応性を決定するために使用され得る。ウエスタンブロットまたはリポソームイムノアッセイを含むが、これらに限定されない追加のアッセイ型も、本発明に従って使用され得る。
当業者であれば、イムノアッセイにおける非特異的結合を最小限に抑えることが望ましい場合が多いことを理解するであろう。特に、アッセイが固体基質上に固定化された抗原または抗体を含む場合、基質への非特異的結合の量を最小限に抑えることが望ましい。そのような非特異的結合を減少させる手段は、当業者に周知である。
本明細書に記載のアッセイは、アッセイに使用される抗体の特異的結合を有意に妨げない標識または検出可能な基を含み得る。検出可能な基は、検出可能な物理的特性または化学的特性を有する任意の材料であり得る。かかる検出可能な標識は、当該技術分野で既知であり、一般的に、かかる方法で有用な任意の標識が本発明に適用され得る。したがって、本明細書で使用される「標識」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段によって検出可能な任意の組成物であり得る。本発明における有用な標識は、磁気ビーズ(例えば、DYNABEADS(商標)、蛍光色素(例えば、フルオレセインイソチオシアネート、Texas red、ローダミンなど)、放射性標識(例えば、3H、1251、35S、14C、または32P)、酵素(例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、および/または当該技術分野で既知であり、ELISAで使用される任意の他のもの)、およびコロイド金または着色ガラスまたはプラスチックビーズ(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)などの比色標識を含み得る。
本発明に係る標識は、当該技術分野で周知の方法に従って、アッセイの所望の構成要素に直接的または間接的にカップリングされ得る。上述のように、感受性、化合物とのコンジュゲーションの容易さ、安定性要件、または利用可能な計装などに応じた標識の選択を伴い、多種多様な標識が使用されてもよい。
非放射性標識は、間接的な手段によって付着され得る。一般的に、リガンド分子(例えばビオチン)は、分子に共有結合している。次いで、リガンドを、別の分子(例えば、ストレプトアビジン)に結合してもよく、これは、固有に検出可能であってもよく、または検出可能な酵素、蛍光化合物、もしくは化学発光化合物などのシグナル系に共有結合してもよい。リガンドおよびそれらの対応する標的は、ウイルス抗原を認識する抗体、または抗ウイルス抗原を認識する二次抗体と任意の好適な組み合わせで使用され得る。分子はまた、例えば、酵素またはフルオロフォアへのコンジュゲーションによって、シグナル生成化合物に直接的にコンジュゲートされてもよい。標識として使用される目的の酵素は、例えば、ホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼなどのヒドロラーゼ、またはペルオキシダーゼなどのオキシドターゼであり得る。蛍光化合物は、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどを含み得る。化学発光化合物としては、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノール、または当該技術分野で既知の他の化合物が挙げられ得る。
標識を検出する手段は、当業者に周知であり、使用する標識の種類に依存する。例えば、放射性標識を検出するためにオートラジオグラフィーを使用してもよく、または蛍光標識を検出するために蛍光色素を使用してもよい。蛍光は、例えば、電荷結合素子(CCD)または光電子増倍管などの電子検出器によって視覚的に検出され得る。同様に、酵素標識は、酵素のための適切な基質を提供し、得られる反応生成物を検出することによって検出され得る。比色標識または化学発光標識は、特定の標識に関連する色を観察することによって検出され得る。いくつかの実施形態において、アッセイ形式は、標識された構成要素の使用を必要としない場合があり、むしろ単純な目視検査によって検出され得る。
薬学的/免疫原性組成物およびそれらの投与
いくつかの態様において、本明細書に記載の1つ以上のウイルスタンパク質またはペプチドまたはその断片を発現する1つ以上の導入遺伝子を含む組換えベクターは、1つ以上のウイルスからの保護を提供するために、ニワトリまたは他の家禽などの対象に投与するための薬学的組成物または免疫原性組成物として使用され得る。例えば、本明細書に記載の免疫原性組成物は、例えば、HVTゲノムのユニークロング(UL)領域中の遺伝子間遺伝子座UL35/UL36によって隣接される遺伝子間領域中のウイルスゲノムに挿入される本明細書に記載の1つ以上の導入遺伝子を有する組換えベクターを含む。一態様において、本発明は、組換えシチメンチョウヘルペスウイルス(HVT)ゲノムであって、HVTゲノムのユニークロング領域中の遺伝子間遺伝子座UL35/UL36内に挿入された1つ以上の異種抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列と、HVTゲノムのユニークロング領域(UL)中のUL55部位に挿入された1つ以上の異種抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列と、を含む、組換えHVTゲノムを提供する。
いくつかの態様において、本明細書に記載の1つ以上のウイルスタンパク質またはペプチドまたはその断片を発現する1つ以上の導入遺伝子を含む組換えベクターは、1つ以上のウイルスからの保護を提供するために、ニワトリまたは他の家禽などの対象に投与するための薬学的組成物または免疫原性組成物として使用され得る。例えば、本明細書に記載の免疫原性組成物は、例えば、HVTゲノムのユニークロング(UL)領域中の遺伝子間遺伝子座UL35/UL36によって隣接される遺伝子間領域中のウイルスゲノムに挿入される本明細書に記載の1つ以上の導入遺伝子を有する組換えベクターを含む。一態様において、本発明は、組換えシチメンチョウヘルペスウイルス(HVT)ゲノムであって、HVTゲノムのユニークロング領域中の遺伝子間遺伝子座UL35/UL36内に挿入された1つ以上の異種抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列と、HVTゲノムのユニークロング領域(UL)中のUL55部位に挿入された1つ以上の異種抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列と、を含む、組換えHVTゲノムを提供する。
他の態様において、タンパク質もしくはペプチド、それらの免疫原性断片、および/またはポリヌクレオチド、ならびに抗ウイルス抗体および/またはT細胞は、薬学的組成物または免疫原性組成物(例えば、ワクチン)に組み込まれ得る。別の実施形態において、本発明に係る免疫原性組成物は、追加のウイルスタンパク質をコードし得る、少なくとも第3の導入遺伝子、第4の導入遺伝子などを含み得る。かかる方法において、任意の所望の数のウイルスからの保護を提供する家禽などの対象に免疫原性組成物を提供することが可能である。構造的または非構造的なウイルスタンパク質またはその免疫原性断片などの全ウイルスワクチン(生ワクチン、および弱毒化ワクチン、または複製能のないワクチン、または死滅ワクチン)またはサブユニットワクチンを使用して、対象において免疫応答を誘発することによってウイルス感染を治療または予防することができる。あるいは、薬学的組成物は、抗原提示細胞がウイルスペプチドを発現するように、ウイルスポリヌクレオチドでトランスフェクトされた抗原提示細胞を含み得る。
本発明に係る免疫原性組成物は、対象において抗体免疫および/または細胞免疫を生成するように設計され得る。かかる組成物は、天然に存在しない薬学的に許容される担体と共に1つ以上のかかる化合物を含み得る。他の実施形態において、本発明に係る免疫原性組成物は、少なくとも1つが天然に存在しないものであるように、1つより多いアジュバントまたは薬学的に許容される担体を含み得る。薬学的に許容される担体またはアジュバントは、アジュバント、リポソーム、生分解性微小球を含むがこれらに限定されない、外因性抗原に対する対象における免疫応答を増強する任意の物質であり得る。薬学的に許容される担体またはアジュバントは、急速な異化から抗原を保護するように設計された物質、例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油、または免疫応答の刺激物質、例えば、Bortadella pertussisまたはMycobacterium tuberculosisに由来するタンパク質を含有してもよい。市販のアジュバントとしては、例えば、フロイントの不完全アジュバントおよび完全アジュバント、Merck Adjuvant 65、水酸化アルミニウムゲル(ミョウバン)またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩、CpGオリゴヌクレオチド、カルシウム、鉄または亜鉛の塩、アシル化チロシンの不溶性懸濁液、アシル化糖、カチオン性またはアニオン性誘導体化多糖、ポリホスファゼン、生分解性微小球、およびモノホスホリル脂質Aが挙げられ得る。当業者であれば、本発明と共に使用するための適切な薬学的に許容される担体を特定することができるであろう。
本発明の範囲内の薬学的組成物または免疫原性組成物および/またはワクチンは、生物学的に活性または不活性であり得る他の化合物も含有し得る。例えば、他の抗原の1つ以上の免疫原性部分が、融合ポリペプチドに組み込まれるか、または別個の化合物として、本発明に係る組成物またはワクチン内に存在し得る。いくつかの実施形態において、本発明に有用なポリペプチドは、他の巨大分子にコンジュゲートし得る。薬学的組成物または免疫原性組成物およびワクチンは、一般的に、予防的および/または治療的な目的のために使用され得る。例えば、本発明によれば、本明細書に記載の組成物は、1つ以上のウイルスによる感染または感染の症状の発症に対する保護を提供するために、ウイルスへの感染またはウイルスへの曝露の前に、鳥などの対象に提供され得る。他の実施形態において、そのような組成物は、対象におけるウイルスの治療を提供するために、例えば、対象における感染を減少させるか、またはなくすことによって、1つ以上のウイルスへの感染または曝露後に、鳥などの対象に提供され得る。
本明細書に記載のウイルスのゲノム、構造タンパク質もしくは非構造タンパク質、またはその断片をコードする核酸ワクチンも、ウイルス感染を治療または予防するための免疫応答を誘発するために使用してよい。多数の遺伝子送達技術は、当該技術分野で周知である。適切な核酸発現系は、対象における発現に必要なDNA配列(好適なプロモーターおよび終結シグナルなど)を含有し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のDNAは、ウイルス発現系(例えば、マレック病ウイルスまたはHVT)を使用して導入されてもよく、これは、非病原性の複製能のあるウイルスの使用を伴う場合がある。
薬学的組成物または免疫原性組成物は、密封アンプルまたはバイアルなどの単回用量または多回用量の容器で提供され得る。かかる容器は、使用まで組成物の無菌性を保つために密封され得る。一般的に、本明細書に記載の組成物は、油性または水性ビヒクル中に懸濁液、溶液、または乳剤として保存され得る。あるいは、かかる組成物は、使用の直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保管されてもよい。
本明細書に記載される場合、免疫原性組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わされ得る。好適な担体の選択は、投与される特定の組成物(例えば、核酸、タンパク質、調節化合物、または形質導入された細胞)、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定され得る。したがって、本発明で使用され得る薬学的組成物または免疫原性組成物の多種多様な好適な製剤が利用可能である。投与は、例えば、注射、経口投与、吸入、経皮適用、または直腸投与によって、任意の簡便な方法であってもよい。本明細書に記載の組換えベクターまたは免疫原性組成物の注射は、単回投与または用量で家禽などの対象に提供されてもよく、または反復投与など、1回より多く投与されてもよい。
例えば、関節内(関節中)、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、インオボ、および皮下経路などの非経口投与に好適な製剤としては、製剤を、意図された対象の血液と等張性にする抗酸化物質、緩衝液、静菌剤、および溶質を含有し得る、水性および非水性の等張性滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および防腐剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。本発明の実施において、組成物は、例えば、静脈内注入、経口、局所、腹腔内、膀胱内、またはくも膜下腔内によって投与されてもよい。
かかる組成物はまた、緩衝液(例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水)、炭水化物(例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン)、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、またはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化物質、静菌剤、EDTAもしくはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム)、製剤を対象の血液と等張性、低張性、または弱高張性にする溶質、懸濁剤、増粘剤、および/または防腐剤を含み得る。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として製剤化し得る。化合物はまた、当該技術分野で既知の方法を使用してリポソーム内に封入され得る。
注射溶液および懸濁液は、本明細書に記載の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。エクスビボ療法のために核酸によって形質導入された細胞は、上述のように静脈内投与または非経口投与されてもよい。本明細書に記載の注射は、本明細書に記載の死滅した、不活化した、弱毒化した、またはその他の方法で非毒性のウイルス培養物、ウイルスタンパク質の精製溶液または非精製溶液、または核酸のうちの1つ以上の懸濁液を含み得る。注射溶液はまた、本明細書に記載される薬学的に許容される担体を含有してもよい。
経口投与に好適な製剤は、(a)液体溶液、例えば、希釈剤、例えば、水、生理食塩水またはPEG400に懸濁された有効量のパッケージングされたウイルスタンパク質もしくは核酸、(b)各々が液体、固体、顆粒もしくはゼラチンとして、所定量の活性成分を含有するカプセルもしくは錠剤、(c)適切な液体中の懸濁液、または(d)適切な乳剤からなっていてもよい。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、香味剤、染料、崩壊剤、ならびに薬学的に適合性の担体のうちの1つ以上を含み得る。ロゼンジ形態は、フレーバー(例えばスクロース)中の活性成分、ならびに活性成分を、活性成分に加えて、当該技術分野で既知の担体を含有する、ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアエマルション、ゲルなどの不活性基剤中に含む芳香錠を含み得る。
選択される化合物は、単独で、または他の好適な構成要素と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤に作製され得る。エアゾール製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される噴射剤中に配置され得る。
本発明の関連において対象に投与される用量は、対象における有益な治療応答に経時的に影響を及ぼすのに十分な用量であるべきである。用量は、使用される特定のベクターの有効性、対象の状態、ならびに治療される患者の体重および/または表面積によって決定される。用量のサイズはまた、特定の患者における特定のベクター、または形質導入された細胞型の投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定され得る。本明細書に記載のベクターを含む組成物について、投与されるベクターの有効量は、ベクターの循環血漿レベル、ベクター毒性、対象の健康、および抗ベクター抗体の産生に部分的に基づいて決定され得る。
投与に関して、本発明の化合物および形質導入された細胞を、対象の体重および全体的な健康状態に適用されるような、阻害剤、ベクター、または形質導入された細胞型のLD-50、ならびに様々な濃度での阻害剤、ベクター、または細胞型の副作用によって決定される速度で投与することができる。投与は、単回、複数回、または分割された用量によって達成され得る。
ポリペプチドおよび核酸の免疫学的検出
イムノアッセイを使用して、ウイルスタンパク質、ウイルス粒子、および/または核酸を検出し得る。かかるアッセイは、本明細書に記載されるものなどの治療用途および/または診断用途に有用であり得る。イムノアッセイは、当該技術分野で周知であり、タンパク質、ウイルス粒子、および/または核酸を定性的または定量的に分析するために使用され得る。
イムノアッセイを使用して、ウイルスタンパク質、ウイルス粒子、および/または核酸を検出し得る。かかるアッセイは、本明細書に記載されるものなどの治療用途および/または診断用途に有用であり得る。イムノアッセイは、当該技術分野で周知であり、タンパク質、ウイルス粒子、および/または核酸を定性的または定量的に分析するために使用され得る。
ウイルスタンパク質およびウイルス抗原に対する抗体のアッセイ
本発明の一実施形態において、試料中の本明細書に記載のウイルス、ウイルス核酸、またはウイルスタンパク質の存在は、イムノアッセイによって決定し得る。ウイルスまたはウイルスタンパク質の検出を達成するために、免疫蛍光アッセイ(IFA)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、捕捉アッセイ、マイクロ凝集試験、および免疫ブロッティングアッセイ(例えば、ウエスタンブロット)などの酵素媒介性イムノアッセイを容易に適合させることができる。ELISA法は、本明細書に記載のウイルスまたはウイルスタンパク質の検出に有効であり得る。かかるELISAは、例えば、(1)抗ウイルス抗体または抗原を基質に結合させるステップと、(2)結合した受容体を、ウイルス、ウイルス抗原、ウイルスタンパク質、またはウイルスに対する抗体を含有する生体試料と接触させるステップと、(3)生体試料を、検出可能な部分(例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファターゼ酵素)に結合した抗体と接触させるステップと、(4)生体試料を、酵素についての基質と接触させるステップと、(5)生体試料を、色試薬などの検出試薬と接触させるステップと、(6)検出可能な結果を観察するステップとを含み得る。いくつかの実施形態において、そのようなELISAでの使用に好適な生体試料は、血液または他の流体であり得る。別の実施形態において、本明細書に記載のELISAは、組織試料中のウイルスまたはウイルスタンパク質を検出し得る。かかる方法は、試料中の抗ウイルス抗体、または特定のウイルスタンパク質、ならびにウイルスの存在を検出するために、当業者によって容易に改変され得る。特定の実施形態において、本発明に係るELISAは、抗ウイルス抗体の存在を検出し得る。
本発明の一実施形態において、試料中の本明細書に記載のウイルス、ウイルス核酸、またはウイルスタンパク質の存在は、イムノアッセイによって決定し得る。ウイルスまたはウイルスタンパク質の検出を達成するために、免疫蛍光アッセイ(IFA)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、捕捉アッセイ、マイクロ凝集試験、および免疫ブロッティングアッセイ(例えば、ウエスタンブロット)などの酵素媒介性イムノアッセイを容易に適合させることができる。ELISA法は、本明細書に記載のウイルスまたはウイルスタンパク質の検出に有効であり得る。かかるELISAは、例えば、(1)抗ウイルス抗体または抗原を基質に結合させるステップと、(2)結合した受容体を、ウイルス、ウイルス抗原、ウイルスタンパク質、またはウイルスに対する抗体を含有する生体試料と接触させるステップと、(3)生体試料を、検出可能な部分(例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファターゼ酵素)に結合した抗体と接触させるステップと、(4)生体試料を、酵素についての基質と接触させるステップと、(5)生体試料を、色試薬などの検出試薬と接触させるステップと、(6)検出可能な結果を観察するステップとを含み得る。いくつかの実施形態において、そのようなELISAでの使用に好適な生体試料は、血液または他の流体であり得る。別の実施形態において、本明細書に記載のELISAは、組織試料中のウイルスまたはウイルスタンパク質を検出し得る。かかる方法は、試料中の抗ウイルス抗体、または特定のウイルスタンパク質、ならびにウイルスの存在を検出するために、当業者によって容易に改変され得る。特定の実施形態において、本発明に係るELISAは、抗ウイルス抗体の存在を検出し得る。
本明細書に記載のELISAアッセイは、本明細書に記載のウイルスタンパク質を含浸させたニトロセルロースストリップを含み得る。ニトロセルロースストリップは、抗ウイルス核タンパク質抗体を含有する試験試料と接触したときに、視覚的な結果を生じ得る。かかる試験は、ウイルスタンパク質に対する抗体を既に有する対象を特定し得るため、対象はウイルスに対する免疫を有し得る。本明細書に記載のウイルス感染を予防するための免疫原性組成物の投与は、そのような対象において不要な場合もあり、したがって、既に免疫原性抗体を有する対象の特定は、そのような対象への免疫原性化合物の不必要な投与を防止し得る。この観点で、本発明の一実施形態は、ELISAアッセイなどの本明細書に記載のアッセイを使用して、抗ウイルス抗体を欠く対象を特定することと、次いで、ウイルス感染を防止するために、本明細書に記載の免疫原性組成物をその対象に提供することと、を含み得る。別の実施形態において、本発明に係るELISAで使用するためのニトロセルロースストリップは、抗ウイルス抗体などの抗体と共に含浸されてもよく、ウイルスタンパク質を含有する試験試料と接触したときに、視覚的結果を生じてもよい。このような試験は、本明細書に記載のウイルスに感染した対象を特定し得る。
ウイルスの検出に有用であり得る別の免疫学的技術は、競合性阻害アッセイである。かかるアッセイは、特異的ウイルスと反応するモノクローナル抗体(MAB)を利用する。対象由来の生体液(例えば、血液)を、基質に結合した第1の抗体と接触させてもよく、標識されたモノクローナル抗体を、第1の抗体-ウイルス複合体と接触させてもよい。モノクローナル抗体結合の阻害量は、対照に対して測定される。
当業者には容易に理解されるであろうように、上のアッセイで使用するための生体試料は、対象から直接的に採取されてもよく、または部分的に精製された形態であってもよい。特定のウイルスに特異的な抗体は、一次反応としてウイルスに結合することによって反応する。その後、一次反応の検出を増強するために、検出可能な部分に結合または標識された抗体との二次反応も加えてよい。一般的に、二次反応において、ウイルスの異なる結合部位(エピトープ)と特異的または非特異的に反応性である抗体または他のリガンドは、抗体およびウイルスの複合体上の複数の部位と反応する能力について選択される。したがって、例えば、二次反応における抗体のいくつかの分子は、一次反応によって形成される各複合体と反応することができ、一次反応をより検出可能にする。
検出可能な部分は、沈殿物または色変化の目視検出、顕微鏡検査による目視検出、または分光測定、放射線測定などによる自動検出を可能にすることができる。検出可能な部分の例としては、フルオレセインおよびローダミン(蛍光顕微鏡検査のため)、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(光学顕微鏡検査または電子顕微鏡検査および生化学的検出のため)、ビオチン-ストレプトアビジン(光学顕微鏡検査または電子顕微鏡検査のため)およびアルカリホスファターゼ(色変化による生化学的検出のため)が挙げられる。使用される検出方法および部分は、例えば、本明細書に開示されるか、または当該技術分野で入手可能な任意のものから選択することができる。
ウイルス核酸の存在を検出すること
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のウイルス感染は、生体試料中の特定のRNAまたはDNAのレベルに基づいて検出され得る。特定のウイルスまたはウイルス病原体からのプライマーは、ウイルスの検出、診断、および存在の決定のために使用され得る。任意の好適なプライマーは、当該技術分野で既知の任意の適切な方法を使用して、ゲノムDNAまたはその中の任意の配列、オープンリーディングフレームもしくは遺伝子、または選択されるタンパク質を検出するために使用され得る。生体試料中に存在し得るように、好適な核酸配列を、それらから生成されるウイルスmRNAまたはcDNAの検出のために、一本鎖または二本鎖プローブまたはプライマーとして使用してもよい。本明細書に記載のウイルスポリヌクレオチドを、アンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するために、または三本鎖形成オリゴヌクレオチドとして、ポリヌクレオチドの追加のコピーを生成するために使用してもよい。例えば、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを、PCRベースのアッセイにおいて使用して、生体試料に由来するウイルスcDNAの一部を増幅してもよく、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも1つは、ウイルスポリヌクレオチドに特異的である(すなわち、それにハイブリダイゼーションする)。かかるプライマーは、少なくともまたは約10ヌクレオチド、11ヌクレオチド、12ヌクレオチド、13ヌクレオチド、14ヌクレオチド、15ヌクレオチド、16ヌクレオチド、17ヌクレオチド、18ヌクレオチド、19ヌクレオチド、20ヌクレオチド、21ヌクレオチド、22ヌクレオチド、23ヌクレオチド、24ヌクレオチド、25ヌクレオチド、26ヌクレオチド、27ヌクレオチド、28ヌクレオチド、29ヌクレオチド、30ヌクレオチド、35ヌクレオチド、40ヌクレオチド、45ヌクレオチド、もしくは50ヌクレオチド、または約12~約50ヌクレオチドの長さ、15~30ヌクレオチドの長さ、15~25ヌクレオチドの長さ、もしくは20~30ヌクレオチドの長さを含め、本明細書に記載のウイルス核酸にハイブリダイズし、増幅を可能にするのに十分な任意の長さであってもよい。本発明と共に使用するのに好適なDNAプライマーは、本明細書に記載される任意のプライマー、例えば配列番号40~157に記載されるものであってよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のウイルス感染は、生体試料中の特定のRNAまたはDNAのレベルに基づいて検出され得る。特定のウイルスまたはウイルス病原体からのプライマーは、ウイルスの検出、診断、および存在の決定のために使用され得る。任意の好適なプライマーは、当該技術分野で既知の任意の適切な方法を使用して、ゲノムDNAまたはその中の任意の配列、オープンリーディングフレームもしくは遺伝子、または選択されるタンパク質を検出するために使用され得る。生体試料中に存在し得るように、好適な核酸配列を、それらから生成されるウイルスmRNAまたはcDNAの検出のために、一本鎖または二本鎖プローブまたはプライマーとして使用してもよい。本明細書に記載のウイルスポリヌクレオチドを、アンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するために、または三本鎖形成オリゴヌクレオチドとして、ポリヌクレオチドの追加のコピーを生成するために使用してもよい。例えば、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを、PCRベースのアッセイにおいて使用して、生体試料に由来するウイルスcDNAの一部を増幅してもよく、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも1つは、ウイルスポリヌクレオチドに特異的である(すなわち、それにハイブリダイゼーションする)。かかるプライマーは、少なくともまたは約10ヌクレオチド、11ヌクレオチド、12ヌクレオチド、13ヌクレオチド、14ヌクレオチド、15ヌクレオチド、16ヌクレオチド、17ヌクレオチド、18ヌクレオチド、19ヌクレオチド、20ヌクレオチド、21ヌクレオチド、22ヌクレオチド、23ヌクレオチド、24ヌクレオチド、25ヌクレオチド、26ヌクレオチド、27ヌクレオチド、28ヌクレオチド、29ヌクレオチド、30ヌクレオチド、35ヌクレオチド、40ヌクレオチド、45ヌクレオチド、もしくは50ヌクレオチド、または約12~約50ヌクレオチドの長さ、15~30ヌクレオチドの長さ、15~25ヌクレオチドの長さ、もしくは20~30ヌクレオチドの長さを含め、本明細書に記載のウイルス核酸にハイブリダイズし、増幅を可能にするのに十分な任意の長さであってもよい。本発明と共に使用するのに好適なDNAプライマーは、本明細書に記載される任意のプライマー、例えば配列番号40~157に記載されるものであってよい。
次に、ゲル電気泳動などの当該技術分野で周知の技術を使用して、増幅ヌクレオチド、例えば、cDNAを分離して検出してもよい。同様に、ウイルスポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーションアッセイで使用して、生体試料中のウイルスポリヌクレオチドの存在を検出してもよい。
本明細書に記載のウイルスに特異的な核酸プローブまたはプライマーは、本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列を使用して生成され得る。プローブは、好ましくは、少なくとも約12、15、16、18、20、22、24、もしくは25ヌクレオチド断片、またはウイルス核酸もしくはポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチド配列である。核酸プローブは、約200bp、150bp、100bp、75bp、50bp、60bp、40bp、30bp、25bp、2kb、1.5kb、1kb、0.5kb、0.25kb、0.1kb、または0.05kb未満の長さであり得る。プローブは、例えば、化学合成、PCR増幅、制限酵素を使用したより長いポリヌクレオチドからの生成、または当該技術分野で周知の他の方法によって生成することができる。本明細書に記載のポリヌクレオチドはまた、アレイなどの固体基質の使用を伴う方法またはアッセイにおいて使用してもよい。そのようなアレイは、当該技術分野で既知の方法を使用してアレイ上に固定され得る1つ以上の異なるポリヌクレオチドを有し得る。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、検出可能に標識され得る。検出可能な標識としては、限定されないが、放射性標識、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、Texas Red、フィコエリスリン、アロフィコシアニン、6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)、2’,7’-ジメトキシ-4’,5’-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、6-カルボキシ-2’,4’,7’,4,7-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、5-カルボキシフルオレセイン(5-FAM)、またはN,N,N’,N’-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)を含む、蛍光色素、32P、35S、および3Hなどの放射性標識)などが挙げられる。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、複数のステップを伴ってもよい(例えば、ビオチンアビジン、ハプテン-抗ハプテン抗体など)。
本発明によれば、特定のウイルス核酸(例えば、RNAまたはDNA)を検出するための当該技術分野で既知の任意の好適な定性的方法または定量的方法を使用してもよい。本明細書に記載のウイルス核酸は、例えば、組織切片におけるインサイツハイブリダイゼーションによって、ハイブリダイゼーションする核酸間の単一塩基対の差を検出する方法を使用して、逆転写酵素PCRによって、またはポリA mRNAを含有するノーザンブロットにおいて、または当該技術分野で周知の他の方法によって検出され得る。血液または血液由来試料中のウイルスポリヌクレオチドの検出のために、単一塩基対のミスマッチの検出を可能にする方法が用いられ得る。
ウイルス核酸配列は、感染した個体から得られた生体試料において、比較的低レベルで存在し得るため、当該技術分野で知られている増幅技術(例えば、PCR)を使用して、ハイブリダイゼーションアッセイを実施する前に配列を増幅させてもよい。
核酸プローブは、本明細書に記載のウイルスゲノムを使用して調製され得る。かかるプローブは、少なくとも約8ヌクレオチド以上を含んでいてもよく、合成的に、または組換えポリヌクレオチドからの切除によって調製され得る。本明細書に記載されるプローブは、ウイルス核酸とハイブリダイゼーションされてもよく、したがって、そのようなプローブは、生体試料中の特定のウイルスの検出に有用であり得る。本明細書に記載のプローブはまた、感染した対象の同定ならびにウイルスゲノムのさらなる特性決定に有用であり得る。ウイルスポリヌクレオチド(天然または由来する)を検出するためのプローブは、特定の長さであってもよく、またはハイブリダイゼーションによる固有のウイルス配列の検出を可能にする配列を有していてもよい。約6~8個のヌクレオチドが有用であり得るが、例えば、約10~12個のヌクレオチド、または約20個以上のヌクレオチドの配列など、より長い配列が好ましい場合がある。当業者は、本明細書に記載のプローブを作製し、使用する方法を認識するであろう。
核酸プローブは、自動オリゴヌクレオチド合成方法を含むがこれらに限定されない通常の方法を使用して調製され得る。かかるプローブの調製に有用な配列は、ウイルスゲノムの任意の固有の部分、例えば、特定のウイルスを試料中に存在し得る他のウイルスから区別することを可能にするウイルスゲノムの一部に対する相補体を含み得る。本明細書に記載のプローブは、目的の標的配列に対して完全な相補性を有してもよく、または1つ以上のミスマッチを有してもよい。多くのミスマッチのうちの1つを有する本発明に従って有用なプローブは、依然として目的の標的配列にハイブリダイゼーションする。そのようなプローブを診断薬として使用するために、分析される生体試料を、所望の場合、分析の前に処理して、その中に含まれる核酸を抽出してもよい。得られた試料由来の核酸をゲル電気泳動または他のサイズ分離技術に供してもよい。プローブは、本明細書に記載の検出可能な標識で標識され得る。好適な標識、およびプローブを標識するための方法は、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載される任意の標識、または本発明に有用な他の標識を含み得る。
プローブは、ウイルスゲノムまたはその一部(例えば、本明細書に記載のウイルスタンパク質をコードする配列の全部または一部)に対して完全に相補的であり得る。偽陽性結果を防ぐか、または少なくとも最小限に抑えるために、高ストリンジェンシー条件が望ましい場合がある。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、時間の長さ、および試薬の濃度を含む、ハイブリダイゼーションおよび洗浄中のいくつかの因子によって決定され得る。試料からのプローブまたは核酸は、そのようなアッセイのために溶液で提供されてもよく、または支持体(例えば、固体または半固体支持体)に付着されてもよい。使用され得る支持体の例としては、限定されないが、ニトロセルロース(例えば、膜またはマイクロタイターウェル形態)、ポリ塩化ビニル(例えば、シートまたはマイクロタイターウェル)、ポリスチレンラテックス(例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート、ポリフッ化ビニリジン(polyvinylidine fluoride)、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性化ビーズ、およびタンパク質Aビーズ)が挙げられる。
一実施形態において、プローブまたは試料核酸は、検出のためにアレイ上に提供されてもよい。アレイは、例えば、二次元マトリックスまたはアレイ中の基質(例えば、ガラス、ニトロセルロースなど)上にポリヌクレオチドプローブをスポットすることによって作製され得る。プローブを、共有結合または疎水性相互作用などの非特異的相互作用のいずれかによって基質に結合させてもよい。ポリヌクレオチドの試料を検出可能に標識し(例えば、放射性標識または蛍光標識を使用して)、次いでプローブにハイブリダイゼーションすることができる。プローブポリヌクレオチドに結合した標識試料ポリヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチドは、試料の非結合部分が除去されると検出され得る。アレイを構築するための技術およびこれらのアレイを使用する方法は、当該技術分野で既知である。アレイは、2つ以上の核酸標的領域の存在について分析される単一の試料について使用され得る。このような場合、標的領域ごとのプローブ、ならびに対照(陽性および陰性の両方)は、単一のアレイ上に提供され得る。したがって、アレイは、迅速かつ利便性の高い分析を容易にする。
診断検査およびキット
本発明は、例えば、ELISAおよび「サンドイッチ」型イムノアッセイなどのイムノアッセイ、ならびに核酸アッセイ(例えば、PCRアッセイ)を含む、様々な診断アッセイに使用するための1つ以上のそのような試薬を含む診断試薬およびキットをさらに提供する。関連する実施形態において、アッセイは、フロースルーまたはストリップ試験形式で実行されてもよく、結合剤は、ニトロセルロースなどの膜上に固定される。かかるキットは、好ましくは、少なくとも第1のペプチド、または本発明の第1の抗体もしくは抗原結合断片、その機能的断片、またはそのカクテル、または第1のオリゴヌクレオチド対、ならびにシグナル生成手段を含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載の組換えウイルスなどの免疫原性組成物を含み得る。試薬および薬学的に許容される担体などの他の化合物が、キットに含まれ得る。かかるキットで提供される場合、免疫原性組成物は、予め測定された用量もしくは量などの溶液であってもよく、または、再水和もしくは再懸濁に好適な乾燥もしくは凍結乾燥形態などの乾燥組成物であってもよい。キットの構成要素は、固体支持体に予め付着していてもよく、またはキットが使用されるときに固体支持体の表面に適用されてもよい。シグナル生成手段は、本発明の抗体または核酸と予め関連付けられてもよく、または使用前に1つ以上の構成要素、例えば、緩衝液、核酸、抗体-酵素複合体、酵素基質などとの組み合わせを必要とし得る。
本発明は、例えば、ELISAおよび「サンドイッチ」型イムノアッセイなどのイムノアッセイ、ならびに核酸アッセイ(例えば、PCRアッセイ)を含む、様々な診断アッセイに使用するための1つ以上のそのような試薬を含む診断試薬およびキットをさらに提供する。関連する実施形態において、アッセイは、フロースルーまたはストリップ試験形式で実行されてもよく、結合剤は、ニトロセルロースなどの膜上に固定される。かかるキットは、好ましくは、少なくとも第1のペプチド、または本発明の第1の抗体もしくは抗原結合断片、その機能的断片、またはそのカクテル、または第1のオリゴヌクレオチド対、ならびにシグナル生成手段を含み得る。いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載の組換えウイルスなどの免疫原性組成物を含み得る。試薬および薬学的に許容される担体などの他の化合物が、キットに含まれ得る。かかるキットで提供される場合、免疫原性組成物は、予め測定された用量もしくは量などの溶液であってもよく、または、再水和もしくは再懸濁に好適な乾燥もしくは凍結乾燥形態などの乾燥組成物であってもよい。キットの構成要素は、固体支持体に予め付着していてもよく、またはキットが使用されるときに固体支持体の表面に適用されてもよい。シグナル生成手段は、本発明の抗体または核酸と予め関連付けられてもよく、または使用前に1つ以上の構成要素、例えば、緩衝液、核酸、抗体-酵素複合体、酵素基質などとの組み合わせを必要とし得る。
キットは、追加の試薬、例えば、固相表面への非特異的結合を低減するための遮断試薬、洗浄試薬、酵素基質、酵素なども含み得る。固相表面は、核酸、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを固定するのに好適なマイクロタイタープレート、微小球、または他の材料の形態であり得る。化学発光または発色生成物の形成または化学発光または発色基質の還元を触媒する酵素は、シグナル生成手段のかかる構成要素の1つである。そのような酵素は、当該技術分野で周知である。放射性標識、発色性標識、蛍光発色性、または他の種類の検出可能な標識もしくは検出手段がキット内に含まれる場合、標識剤は、診断用組成物または治療用組成物自体と同じ容器内に提供され得るか、またはあるいは、この第2の組成物が配置され、適切に等分され得る第2の別個の容器内に配置され得る。あるいは、検出試薬および標識は、単一の容器手段で調製され得る。
特定された全ての特許および他の刊行物は、例えば、本発明に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を記載し、開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。
本発明は、以下の実施例によってさらに例示され、裏付けられる。しかしながら、これらの実施例は、本発明の範囲をさらに制限するために決して考慮されるべきではない。それどころか、当業者は、本発明の精神および/または付属の特許請求の範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態、修正、および同等物が存在することを容易に理解するであろう。
実施例1
HVT-gfpプラスミドの構築
HVT-緑色蛍光タンパク質(gfp)-Bトランスファープラスミド構築
HVT-gfp-Bトランスファープラスミド(配列番号18)を、GeneArt、ThermoFisher)によって化学的に合成した。2.5ugの上述のプラスミドを、6ウェルプレート中のLTXトランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して、二次CEF細胞にトランスフェクトした。約4~6時間後、トランスフェクトされた細胞を、0.006moi(1.5x104pfu/2.5x106細胞)でHVTに感染させた。3日後、この細胞を、新鮮なCEFを含むT75(1x107細胞/T75)に対して1:15で継代させた。次いで、この細胞を、3日後に24ウェルプレート上で1:50にプレーティングした。緑色蛍光フォーカスを含有するウェルからの細胞を、96ウェルプレート上で、新鮮な細胞(6x10^4細胞/ウェル)を用いて、1:200、1:500、および1:1000希釈でプレーティングした。1個の緑色フォーカスを含有するウェルを、96ウェルプレートを使用して、限界希釈法によって3ラウンド精製した。精製したウイルスを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-gfp-B」と命名した。
HVT-gfpプラスミドの構築
HVT-緑色蛍光タンパク質(gfp)-Bトランスファープラスミド構築
HVT-gfp-Bトランスファープラスミド(配列番号18)を、GeneArt、ThermoFisher)によって化学的に合成した。2.5ugの上述のプラスミドを、6ウェルプレート中のLTXトランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して、二次CEF細胞にトランスフェクトした。約4~6時間後、トランスフェクトされた細胞を、0.006moi(1.5x104pfu/2.5x106細胞)でHVTに感染させた。3日後、この細胞を、新鮮なCEFを含むT75(1x107細胞/T75)に対して1:15で継代させた。次いで、この細胞を、3日後に24ウェルプレート上で1:50にプレーティングした。緑色蛍光フォーカスを含有するウェルからの細胞を、96ウェルプレート上で、新鮮な細胞(6x10^4細胞/ウェル)を用いて、1:200、1:500、および1:1000希釈でプレーティングした。1個の緑色フォーカスを含有するウェルを、96ウェルプレートを使用して、限界希釈法によって3ラウンド精製した。精製したウイルスを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-gfp-B」と命名した。
UL55-Gene3の組み込み部位のすぐ外側のプライマー(上部プライマー:配列番号49、下部プライマー:5’-配列番号50)を使用した、3つの精製されたクローンのPCR分析は、予想通り、1.893kbのバンドを与えた。HVTは、予想通り、0.15kbのバンドを与えた。図1を参照されたい。
HVT-gfp-A修飾トランスファープラスミド構築
修飾トランスファープラスミドHVT-gfp-A(配列番号16)を、プライマーの2つの対(gfp遺伝子の上流のSbfIを生成するための上部プライマー対:配列番号40および配列番号41、gfp遺伝子の下流のSbfIを生成するための下部プライマー:-配列番号42、およびGeneArt、ThermoFisherによって化学的に合成された元のトランスファープラスミドHVT-gfp-A(配列番号17)のための配列番号43)を使用して部位特異的変異誘発を適用することによって、作成した。0.01ugの修飾トランスファープラスミドHVT-gfp-Aを、6ウェルプレート上の二次CEF細胞に対して、7.5uLのPEI(ポリエチレンイミン)を使用して、2.5ugのHVT DNAと共トランスフェクトした。緑色蛍光フォーカスは、第1継代で明らかになった。限界希釈法による3ラウンド精製の後、HVT-gfp-Aの1クローンをさらに拡張させ、凍結ストックを作製した。
修飾トランスファープラスミドHVT-gfp-A(配列番号16)を、プライマーの2つの対(gfp遺伝子の上流のSbfIを生成するための上部プライマー対:配列番号40および配列番号41、gfp遺伝子の下流のSbfIを生成するための下部プライマー:-配列番号42、およびGeneArt、ThermoFisherによって化学的に合成された元のトランスファープラスミドHVT-gfp-A(配列番号17)のための配列番号43)を使用して部位特異的変異誘発を適用することによって、作成した。0.01ugの修飾トランスファープラスミドHVT-gfp-Aを、6ウェルプレート上の二次CEF細胞に対して、7.5uLのPEI(ポリエチレンイミン)を使用して、2.5ugのHVT DNAと共トランスフェクトした。緑色蛍光フォーカスは、第1継代で明らかになった。限界希釈法による3ラウンド精製の後、HVT-gfp-Aの1クローンをさらに拡張させ、凍結ストックを作製した。
UL35-UL36の組み込み部位のすぐ外側のプライマー(上部プライマー:配列番号44、下部プライマー:配列番号45)を使用した、精製されたクローンのPCR分析(左レーン)は、予想通り、1.922kbのバンドを与えた(図4)。修飾トランスファープラスミドHVT-gfp-AのDNAを対照として使用した(右レーン)。図2を参照されたい。
実施例2
HVT-IBD構築
HVT-IBD #1の構築
HVT-IBD #1トランスファープラスミド(配列番号20)を、GeneArt、ThermoFisher)によって化学的に合成した。2.5ugの上述のプラスミドを、6ウェルプレート中のLTXトランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して、二次CEF細胞にトランスフェクトした。およそ4~6時間後、トランスフェクトされた細胞を、0.055moiでHVTに感染させた。3日後、この細胞を、新鮮なCEFを含むT75(1x107細胞/T75)に対して1:7.5で継代させた。次いで、この細胞を96ウェルプレートのうちの10にプレーティングし、複製物プレートを3日後に作製した。1セットのプレートを固定し、抗IBDVニワトリ血清で染色した。IBDについて陽性染色されたフォーカスを含有する2つのウェルを特定した。陽性染色フォーカスを含有する対応するウェルを、96ウェルプレートを使用して、限界希釈法によって3ラウンド精製した。精製したウイルスを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-IBD #1」と命名した。
HVT-IBD構築
HVT-IBD #1の構築
HVT-IBD #1トランスファープラスミド(配列番号20)を、GeneArt、ThermoFisher)によって化学的に合成した。2.5ugの上述のプラスミドを、6ウェルプレート中のLTXトランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して、二次CEF細胞にトランスフェクトした。およそ4~6時間後、トランスフェクトされた細胞を、0.055moiでHVTに感染させた。3日後、この細胞を、新鮮なCEFを含むT75(1x107細胞/T75)に対して1:7.5で継代させた。次いで、この細胞を96ウェルプレートのうちの10にプレーティングし、複製物プレートを3日後に作製した。1セットのプレートを固定し、抗IBDVニワトリ血清で染色した。IBDについて陽性染色されたフォーカスを含有する2つのウェルを特定した。陽性染色フォーカスを含有する対応するウェルを、96ウェルプレートを使用して、限界希釈法によって3ラウンド精製した。精製したウイルスを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-IBD #1」と命名した。
UL55-Gene3の組み込み部位のすぐ外側のプライマー(上部プライマー:配列番号46、下部プライマー:配列番号47、パネルA)を使用した異なるクローンのPCR分析は、2.414kbのバンドを与え、一方、元のベクターのPCRバンドは、1.922kbである。正しい組み込みは、挿入部の下流の接合部の周囲にあるプライマー(IBDV VP2コード領域内に局在化した上部プライマー配列番号48、トランスファープラスミドの下流に局在化した下部プライマー配列番号49、パネルB)を使用することによって、さらに確認された。予想通り、1.118kbのPCRバンドが得られた。挿入部の上流の接合部の周囲にあるプライマー(トランスファープラスミドの上流に局在化した上部プライマー配列番号50、IBDV VP2コード領域内の下部プライマー配列番号51、パネルC)を使用して、上流の組み込み部位の正しい組み込みを行った。予想通り、1.428kbのPCRバンドが得られた。図3A、BおよびCを参照されたい。
HVT-IBD #5の構築
HVT-IBD #5トランスファープラスミド(配列番号21)を、GeneArt、ThermoFisher)によって化学的に合成した。6ウェルプレート中のJBJ-1細胞(ニワトリ線維芽細胞株)を、LTXトランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して、2.5ugの上述のプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、トランスフェクションからおよそ5時間後に、0.05moiでHVTに感染させた。トランスフェクト/感染した細胞を、連続継代(1:4~1:10)によって増幅させ、その後、一部を限界希釈で96ウェルプレートに播種した。IBDV VP2抗原発現を、生細胞の単層を固定せずに抗体で染色することによって評価した。図4Aおよび4Bを参照されたい。染色されたフォーカスを、陽性フォーカスの周囲に配置されたクローニングシリンダを用いた細胞のトリプシン化によって採取した。この「生細胞染色」、その後のクローニングシリンダによる継代を4回繰り返し、純粋なVP2陽性培養物を得た。この培養物を、JBJ-1細胞上の連続継代によって増幅させた後、ローラーボトル中の初代CEF細胞上の最終増幅を行った。採取したCEF細胞を使用して、凍結細胞ストックを作製し、これを「HVT-IBD #5」と命名した。
HVT-IBD #5トランスファープラスミド(配列番号21)を、GeneArt、ThermoFisher)によって化学的に合成した。6ウェルプレート中のJBJ-1細胞(ニワトリ線維芽細胞株)を、LTXトランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して、2.5ugの上述のプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、トランスフェクションからおよそ5時間後に、0.05moiでHVTに感染させた。トランスフェクト/感染した細胞を、連続継代(1:4~1:10)によって増幅させ、その後、一部を限界希釈で96ウェルプレートに播種した。IBDV VP2抗原発現を、生細胞の単層を固定せずに抗体で染色することによって評価した。図4Aおよび4Bを参照されたい。染色されたフォーカスを、陽性フォーカスの周囲に配置されたクローニングシリンダを用いた細胞のトリプシン化によって採取した。この「生細胞染色」、その後のクローニングシリンダによる継代を4回繰り返し、純粋なVP2陽性培養物を得た。この培養物を、JBJ-1細胞上の連続継代によって増幅させた後、ローラーボトル中の初代CEF細胞上の最終増幅を行った。採取したCEF細胞を使用して、凍結細胞ストックを作製し、これを「HVT-IBD #5」と命名した。
両挿入部位にわたるインサートの組み込みを確認するための、2セットのプライマーを使用したクローン#7のPCR分析。PCR Aにおいて、上部プライマー(配列番号52)は、IBDV VP2コード領域に結合し、一方、下部プライマー(配列番号53)は、UL35-UL36の組み込み部位の下流に結合する。このプライマーのセットから、予想通り、1.244kbのPCRバンドを得た。PCR Bにおいて、上部プライマー(配列番号54)は、UL35-UL36挿入部位の上流に結合し、一方、下部プライマー(配列番号55)は、インサートのヒトCMVプロモーター内に結合し、予想通り、0.926kbのPCRバンドを得た。図5を参照されたい。
HVT-IBD #6aの構築
HVT-IBD #6aトランスファープラスミド(配列番号22)を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。0.1ugおよび0.01ugの線状トランスファープラスミド(EcoR1およびHindIIIを用いた消化による)を、6ウェルプレート中、PEI(ポリエチレンイミン)トランスフェクション試薬を使用して、Sbf1により二次CEF細胞内で消化された2.5ugのHVT-gfp-Aと共トランスフェクトした。トランスフェクションから4日後、0.01ugのトランスファープラスミドトランスフェクションでは、4個の非緑色フォーカスがみられ、0.1ugのトランスファープラスミドトランスフェクションでは、3個の非緑色フォーカスがみられ、一方、Sbf1単独で消化されたHVT-gfp-Aを用いると、フォーカスはみられなかった。2個の非緑色フォーカスを、96ウェルプレートを使用して、限界希釈法によって3回精製した。精製したウイルスを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-IBD #6a」と命名した。
HVT-IBD #6aトランスファープラスミド(配列番号22)を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。0.1ugおよび0.01ugの線状トランスファープラスミド(EcoR1およびHindIIIを用いた消化による)を、6ウェルプレート中、PEI(ポリエチレンイミン)トランスフェクション試薬を使用して、Sbf1により二次CEF細胞内で消化された2.5ugのHVT-gfp-Aと共トランスフェクトした。トランスフェクションから4日後、0.01ugのトランスファープラスミドトランスフェクションでは、4個の非緑色フォーカスがみられ、0.1ugのトランスファープラスミドトランスフェクションでは、3個の非緑色フォーカスがみられ、一方、Sbf1単独で消化されたHVT-gfp-Aを用いると、フォーカスはみられなかった。2個の非緑色フォーカスを、96ウェルプレートを使用して、限界希釈法によって3回精製した。精製したウイルスを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-IBD #6a」と命名した。
感染した細胞溶解物を調製し、IBDV R63に対するモノクローナル抗体を使用して、ウエスタンブロット分析を行った。HVT-gfp-Aベクターの溶解物を含有するレーンを除き、全てのレーンで、約50KDのタンパク質バンドがみられた。図6を参照されたい。
正しい組み込みを確認するための、2セットのプライマーを使用したクローンのPCR分析。上流の組み込み部位を標的とする第1のプライマーセット:UL35-UL36組み込み部位の上流に局在化した上部プライマー5’-配列番号56、Pecプロモーター内に局在化した下部プライマー配列番号57。このプライマーのセットから、予想通り、0.911kbのPCRバンドを得た。下流の組み込み部位を標的とする第2のプライマーセット:IBDV VP2コード領域内に局在化した上部プライマー5’-配列番号58、UL35-UL36挿入部位の下流に局在化した下部プライマー5’-配列番号59。予想通り、1.244kbのPCRバンドが得られた。図7Aおよび7Bを参照されたい。
HVT-IBD #9の構築
HVT-IBD #9トランスファープラスミド(配列番号23)を、GeneArt、ThermoFisher)によって化学的に合成した。2.5ugの上述のプラスミドを、6ウェルプレート中のLTXトランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して、二次CEF細胞にトランスフェクトした。約4~6時間後、トランスフェクトされた細胞を、0.075moiでHVT-gfp-Bに感染させた。3日後、この細胞を、新鮮なCEFを含むT75(1x10^7細胞/T75)に対して1:10で3回継代させた。次いで、この細胞を96ウェルプレートのうちの10にプレーティングし、90個の非緑色フォーカスが得られた。それらのうちの3個を、抗IBDVニワトリ血清で陽性染色した。2つのクローンを、96ウェルプレートを使用して、限界希釈法によって3ラウンド精製した。精製したウイルスを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-IBD #9」と命名した。
HVT-IBD #9トランスファープラスミド(配列番号23)を、GeneArt、ThermoFisher)によって化学的に合成した。2.5ugの上述のプラスミドを、6ウェルプレート中のLTXトランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して、二次CEF細胞にトランスフェクトした。約4~6時間後、トランスフェクトされた細胞を、0.075moiでHVT-gfp-Bに感染させた。3日後、この細胞を、新鮮なCEFを含むT75(1x10^7細胞/T75)に対して1:10で3回継代させた。次いで、この細胞を96ウェルプレートのうちの10にプレーティングし、90個の非緑色フォーカスが得られた。それらのうちの3個を、抗IBDVニワトリ血清で陽性染色した。2つのクローンを、96ウェルプレートを使用して、限界希釈法によって3ラウンド精製した。精製したウイルスを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-IBD #9」と命名した。
UL55-Gene3の組み込み部位のすぐ外側のプライマー(上部プライマー:配列番号60、下部プライマー:配列番号61、パネルA)を使用した異なるクローンのPCR分析は、2.536kbのバンドを与え、一方、元のベクターHVT-gfp-BのPCRバンドは、1.922kbである。正しい組み込みは、挿入部の上流の接合部の周囲にあるプライマー(UL55-Gene3挿入部位の上流に局在化した上部プライマー配列番号62、IBDV VP2コード領域内に局在化した下部プライマー配列番号63)を使用して、さらに確認された。予想通り、1.482kbのPCRバンドが得られた。下流部位についての正しい組み込みは、挿入部の下流の接合部の周囲にあるプライマー(IBDV VP2配列内に局在化した上部プライマー配列番号64、UL55-Gene3挿入部位の下流に局在化した下部プライマー配列番号65)を使用して行われた。予想通り、1.166kbのPCRバンドが得られた。図8AおよびBを参照されたい。
HVT-IBD #30の構築
HVT-IBD #30トランスファープラスミド(配列番号24)を、GeneArt、ThermoFisherによって化学的に合成した。二次CEF細胞を、6ウェルプレート中、PEI(ポリエチレンイミン)トランスフェクション試薬を使用して、0.1ugの上述のプラスミドおよび2.5ugのHVTと共トランスフェクトした。3日後、この細胞を、新鮮なCEF細胞上で1:12で継代させた。固定されていない培養物を、IBDVに対するニワトリポリクローナル血清で染色することによって、IBD VP2を発現するフォーカスを視覚化し、これらのフォーカスを、蛍光顕微鏡を用いてマーキングした。合計16個の陽性フォーカスを、クローニングシリンダを用いたトリプシン化によって、新鮮なCEF細胞上で継代し、フォーカスを、VP2を発現しないフォーカスから分離した。これらの培養物のうちの4個を、同じ手順に従って3回クローニングした後、ローラーボトル中の初代CEF細胞上で増幅させた。凍結細胞ストックを置き、これを「HVT-IBD #30」と命名した。
HVT-IBD #30トランスファープラスミド(配列番号24)を、GeneArt、ThermoFisherによって化学的に合成した。二次CEF細胞を、6ウェルプレート中、PEI(ポリエチレンイミン)トランスフェクション試薬を使用して、0.1ugの上述のプラスミドおよび2.5ugのHVTと共トランスフェクトした。3日後、この細胞を、新鮮なCEF細胞上で1:12で継代させた。固定されていない培養物を、IBDVに対するニワトリポリクローナル血清で染色することによって、IBD VP2を発現するフォーカスを視覚化し、これらのフォーカスを、蛍光顕微鏡を用いてマーキングした。合計16個の陽性フォーカスを、クローニングシリンダを用いたトリプシン化によって、新鮮なCEF細胞上で継代し、フォーカスを、VP2を発現しないフォーカスから分離した。これらの培養物のうちの4個を、同じ手順に従って3回クローニングした後、ローラーボトル中の初代CEF細胞上で増幅させた。凍結細胞ストックを置き、これを「HVT-IBD #30」と命名した。
UL55-Gene3の組み込み部位の上流領域のためのプライマー(上部プライマー:配列番号66、下部プライマー:配列番号67、パネルA)を使用した、4個の異なるクローンのPCR分析から、1.673kbのバンドを得た。正しい組み込みは、挿入部の3’接合部の周囲にあるプライマー(IBDV VP2コード領域内に局在化した上部プライマー配列番号68、UL55-Gene3挿入部位の下流に局在化した下部プライマー配列番号69、パネルB)を使用することによって、さらに確認された。予想通り、1.082kbのPCRバンドが得られた。下流部位についての正しい組み込みは、発現カセットの外側のプライマー(上部プライマー配列番号70、下部プライマー配列番号71(パネルC)を使用することによって、さらに確認された。予想通り、2.558kbのPCRバンドが得られた。図9A~Cを参照されたい。
HVT-IBD #31の構築
HVT-IBD #31トランスファープラスミド(配列番号25)を、GeneArt、ThermoFisherによって化学的に合成した。0.01ugの線状トランスファープラスミド(EcoR1およびHindIIIを用いた消化による)を、6ウェルプレート中、PEI(ポリエチレンイミン)トランスフェクション試薬を使用して、Sbf1により二次CEF細胞内で消化された2.5ugのHVT-gfp-Aと共トランスフェクトした。トランスフェクションから4日後、1個の非緑色フォーカスがみられ、一方、Sbf1単独で消化されたHVT-gfp-Aを用いると、フォーカスはみられなかった。継代後、2個の非緑色フォーカスを、96ウェルプレートを使用して、限界希釈法によって3回精製した。精製したウイルスを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-IBD #31」と命名した。
HVT-IBD #31トランスファープラスミド(配列番号25)を、GeneArt、ThermoFisherによって化学的に合成した。0.01ugの線状トランスファープラスミド(EcoR1およびHindIIIを用いた消化による)を、6ウェルプレート中、PEI(ポリエチレンイミン)トランスフェクション試薬を使用して、Sbf1により二次CEF細胞内で消化された2.5ugのHVT-gfp-Aと共トランスフェクトした。トランスフェクションから4日後、1個の非緑色フォーカスがみられ、一方、Sbf1単独で消化されたHVT-gfp-Aを用いると、フォーカスはみられなかった。継代後、2個の非緑色フォーカスを、96ウェルプレートを使用して、限界希釈法によって3回精製した。精製したウイルスを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-IBD #31」と命名した。
感染した細胞溶解物を調製し、IBDV R63に対するモノクローナル抗体を使用して、ウエスタンブロット分析を行った。IBDV R63についてのmAbを有さず、唯一のプローブとして抗IBDVニワトリ血清を有する全てのレーンにおいて、約50KDのタンパク質バンドがみられた。図10AおよびBを参照されたい。
正しい組み込みを確認するための、2セットのプライマーを使用したクローンのPCR分析。上流の組み込み部位を標的とする第1のプライマーセット:UL35-UL36組み込み部位の上流に局在化した上部プライマー配列番号72、ニワトリベータ-アクチンプロモーター内に局在化した下部プライマー配列番号73。このプライマーのセットから、予想通り、0.835kbのPCRバンドを得た。下流の組み込み部位を標的とする第2のプライマーセット:IBDV VP2コード領域内に局在化した上部プライマー配列番号76、UL35-UL36挿入部位の下流に局在化した下部プライマー配列番号77。予想通り、1.248kbのPCRバンドが得られた。図11AおよびBを参照されたい。
HVT-IBD #34の構築
HVT-IBD #34トランスファープラスミド(配列番号28)を、GeneArt、ThermoFisherによって化学的に合成した。2.5ugの上述のプラスミドを、6ウェルプレート中のLTXトランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して、二次CEF細胞にトランスフェクトした。約4~6時間後、トランスフェクトされた細胞を、0.05moiでHVT-gfp-Bに感染させた。3日後、この細胞を、新鮮なCEFを含むT75(1x107細胞/T75)に対して1:15で継代させた。感染した細胞を、10×96ウェルプレート上にプレーティングし、3日間成長させ、次いで、複製物96ウェルプレート内で継代した。1つの複製物を固定し、抗IBDVニワトリ血清で染色し、IBDVについて陽性染色したフォーカスを含有する3個のウェルを特定した。生細胞複製物プレートからの対応するウェルを、96ウェルプレートを使用して、3ラウンドの限界希釈クローニングによって精製した。精製したウイルスのうちの1つを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-IBD #34」と命名した。
HVT-IBD #34トランスファープラスミド(配列番号28)を、GeneArt、ThermoFisherによって化学的に合成した。2.5ugの上述のプラスミドを、6ウェルプレート中のLTXトランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して、二次CEF細胞にトランスフェクトした。約4~6時間後、トランスフェクトされた細胞を、0.05moiでHVT-gfp-Bに感染させた。3日後、この細胞を、新鮮なCEFを含むT75(1x107細胞/T75)に対して1:15で継代させた。感染した細胞を、10×96ウェルプレート上にプレーティングし、3日間成長させ、次いで、複製物96ウェルプレート内で継代した。1つの複製物を固定し、抗IBDVニワトリ血清で染色し、IBDVについて陽性染色したフォーカスを含有する3個のウェルを特定した。生細胞複製物プレートからの対応するウェルを、96ウェルプレートを使用して、3ラウンドの限界希釈クローニングによって精製した。精製したウイルスのうちの1つを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-IBD #34」と命名した。
Gene3-UL55の組み込み部位の上流領域のためのプライマー(上部プライマー:配列番号78、下部プライマー:ニワトリベータ-アクチンプロモーター内に局在化した配列番号79、パネルA)を使用した3個の異なるクローンのPCR分析から、予想通り、0.815kbのバンドを得た。正しい組み込みは、挿入部の下流の接合部の周囲にあるプライマー(IBDV VP2コード領域内に局在化した上部プライマー配列番号80、Gene3-UL55挿入部位の下流に局在化した下部プライマー配列番号81、パネルB)を使用することによって、さらに確認された。予想通り、1.296kbのPCRバンドが得られた。正しい構築物は、発現カセットの外側のプライマー(上部プライマー配列番号82、下部プライマー配列番号83(パネルC)を使用することによって、さらに確認された。予想通り、3.001kbのPCRバンドが得られた。図12A~Cを参照されたい。
HVT-ND #38の構築
HVT-IBD #38トランスファープラスミド(配列番号29)を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。HVT-ND #38についてのHindIIIおよびApoI消化されたトランスファープラスミドを、二次CEF細胞を含む6ウェルプレート中、PEI(ポリエチレンイミン、7.5uL)を使用して、Sbf1消化されたHVT-gfp-A DNAと共トランスフェクトした。トランスフェクションから6日後、トランスフェクトされた細胞を96ウェルプレート上でプレーティングし、NDVニワトリ血清で生細胞染色した。陽性染色を有するフォーカスを含有する7個のウェルを、限界希釈によって3回精製した。精製したウイルスのうちの1つを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-ND #38」と命名した。
HVT-IBD #38トランスファープラスミド(配列番号29)を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。HVT-ND #38についてのHindIIIおよびApoI消化されたトランスファープラスミドを、二次CEF細胞を含む6ウェルプレート中、PEI(ポリエチレンイミン、7.5uL)を使用して、Sbf1消化されたHVT-gfp-A DNAと共トランスフェクトした。トランスフェクションから6日後、トランスフェクトされた細胞を96ウェルプレート上でプレーティングし、NDVニワトリ血清で生細胞染色した。陽性染色を有するフォーカスを含有する7個のウェルを、限界希釈によって3回精製した。精製したウイルスのうちの1つを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-ND #38」と命名した。
UL35-UL36の組み込み部位の上流領域のためのプライマー(上部プライマー:配列番号84、下部プライマー:NDV Fコード領域内に局在化した配列番号85、パネルA)を使用した5個の異なるクローンのPCR分析から、2.122kbのバンドを得た。正しい組み込みは、挿入部の3’接合部の周囲にあるプライマー(NDV Fコード領域内に局在化した上部プライマー配列番号86、UL35-UL36挿入部位の下流に局在化した下部プライマー配列番号87、パネルB)を使用することによって、さらに確認された。予想通り、1.127kbのPCRバンドが得られた。正しい構築物は、発現カセットの外側のプライマー(上部プライマー配列番号88、下部プライマー配列番号89(パネルC)を使用することによって、さらに確認された。予想通り、3.657kbのPCRバンドが得られた。図15AおよびBを参照されたい。
HVT-ND #39の構築
HVT-IBD #39トランスファープラスミド配列番号30)を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。二次CEF細胞を、6ウェルプレート中、PEI(ポリエチレンイミン)トランスフェクション試薬を使用して、0.01ugの上述のプラスミドおよび2.5ugのHVTと共トランスフェクトした。6日後、この細胞を、新鮮なCEF細胞上で1:24で継代させた。継代から3日後、固定されていない培養物を、抗NDV特異的ニワトリポリクローナル血清で染色することによって、NDV Fタンパク質を発現するフォーカスを視覚化し、これらのフォーカスを、蛍光顕微鏡を用いてマーキングした。合計4個の陽性フォーカスを、クローニングシリンダを用いたトリプシン化によって、新鮮なCEF細胞上で継代し、フォーカスを、Fタンパク質を発現しないフォーカスから分離した。これらの培養物のうちの4個を、同じ手順に従って3回クローニングした後、ローラーボトル中の初代CEF細胞上で増幅させた。凍結細胞ストック(図中のクローン2)を置き、これを「HVT-ND #39」と命名した。
HVT-IBD #39トランスファープラスミド配列番号30)を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。二次CEF細胞を、6ウェルプレート中、PEI(ポリエチレンイミン)トランスフェクション試薬を使用して、0.01ugの上述のプラスミドおよび2.5ugのHVTと共トランスフェクトした。6日後、この細胞を、新鮮なCEF細胞上で1:24で継代させた。継代から3日後、固定されていない培養物を、抗NDV特異的ニワトリポリクローナル血清で染色することによって、NDV Fタンパク質を発現するフォーカスを視覚化し、これらのフォーカスを、蛍光顕微鏡を用いてマーキングした。合計4個の陽性フォーカスを、クローニングシリンダを用いたトリプシン化によって、新鮮なCEF細胞上で継代し、フォーカスを、Fタンパク質を発現しないフォーカスから分離した。これらの培養物のうちの4個を、同じ手順に従って3回クローニングした後、ローラーボトル中の初代CEF細胞上で増幅させた。凍結細胞ストック(図中のクローン2)を置き、これを「HVT-ND #39」と命名した。
UL35-UL36の組み込み部位の上流領域のためのプライマー(上部プライマー:配列番号90、下部プライマー:ニワトリベータ-アクチンプロモーター内に局在化した配列番号91、パネルA)を使用した3個の異なるクローンのPCR分析から、0.835kbのバンドを得た。正しい組み込みは、挿入部の下流の接合部の周囲にあるプライマー(ポリA領域内に局在化した上部プライマー配列番号92、UL35-UL36挿入部位の下流に局在化した下部プライマー配列番号93、パネルB)を使用することによって、さらに確認された。予想通り、0.856kbのPCRバンドが得られた。正しい構築物は、発現カセットの外側のプライマー(上部プライマー配列番号94、下部プライマー配列番号95(パネルC)を使用することによって、さらに確認された。予想通り、3.449kbのPCRバンドが得られた。図16AおよびBを参照されたい。
HVT-ND #40の構築
HVT-IBD #40トランスファープラスミド(配列番号31)を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。HVT-ND #40についてのHindIII消化されたトランスファープラスミドを、二次CEF細胞を含む6ウェルプレート中、PEI(ポリエチレンイミン、7.5uL)を使用して、Sbf1消化されたHVT-gfp-A DNAと共トランスフェクトした。トランスフェクションから7日後、トランスフェクトされた細胞を24ウェルプレート上でプレーティングし、NDVニワトリ血清で生細胞染色した。陽性染色を有するフォーカスを含有する4個のウェルを、限界希釈によって3回精製した。精製したウイルスのうちの1つを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-ND #40」と命名した。
HVT-IBD #40トランスファープラスミド(配列番号31)を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。HVT-ND #40についてのHindIII消化されたトランスファープラスミドを、二次CEF細胞を含む6ウェルプレート中、PEI(ポリエチレンイミン、7.5uL)を使用して、Sbf1消化されたHVT-gfp-A DNAと共トランスフェクトした。トランスフェクションから7日後、トランスフェクトされた細胞を24ウェルプレート上でプレーティングし、NDVニワトリ血清で生細胞染色した。陽性染色を有するフォーカスを含有する4個のウェルを、限界希釈によって3回精製した。精製したウイルスのうちの1つを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-ND #40」と命名した。
UL35-UL36の組み込み部位の上流領域のためのプライマー(上部プライマー:配列番号96、下部プライマー:ニワトリベータ-アクチンプロモーター内に局在化した配列番号97、パネルA)を使用した4個の異なるクローンのPCR分析から、0.835kbのバンドを得た。正しい組み込みは、挿入部の下流の接合部の周囲にあるプライマー(NDV Fコード領域内に局在化した上部プライマー配列番号98、UL35-UL36挿入部位の下流に局在化した下部プライマー配列番号99、パネルB)を使用することによって、さらに確認された。予想通り、0.856kbのPCRバンドが得られた。正しい構築物は、発現カセットの外側のプライマー(上部プライマー配列番号100、下部プライマー配列番号101(パネルC)を使用することによって、さらに確認された。予想通り、3.449kbのPCRバンドが得られた。図17A~Cを参照されたい。
HVT-ND #42の構築
初期トランスファープラスミドHVT-ND #42(配列番号33)を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。クローニングプラスミドを、DNA2.0によって化学的に合成した。以下のプライマー:上部プライマー、配列番号102、下部プライマー、5’-配列番号103を使用することによる、HVT-ND #42トランスファープラスミドのNDV F遺伝子発現カセットのPCR増幅。増幅したPCR断片を、AscIおよびNheI部位UL55/gene3にクローニングして、最終トランスファープラスミドHVT-ND #42(配列番号35)を作製した。
初期トランスファープラスミドHVT-ND #42(配列番号33)を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。クローニングプラスミドを、DNA2.0によって化学的に合成した。以下のプライマー:上部プライマー、配列番号102、下部プライマー、5’-配列番号103を使用することによる、HVT-ND #42トランスファープラスミドのNDV F遺伝子発現カセットのPCR増幅。増幅したPCR断片を、AscIおよびNheI部位UL55/gene3にクローニングして、最終トランスファープラスミドHVT-ND #42(配列番号35)を作製した。
6ウェルプレート中、Lipofectamine LTXを使用して、HVTに感染したCEF細胞に、トランスファープラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから3日後、トランスフェクト/感染した細胞を、複製物6ウェルプレートにプレーティングし、次いで、NDV抗血清で染色することによってNDを発現するフォーカスをスクリーニングするために、96ウェルプレートにプレーティングした。ND発現フォーカスを含有することに対応するウェルを、限界希釈によって3回精製した。精製したウイルスのうちの1つを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-ND #42」と命名した。
発現カセットの外側のプライマー(プライマーセット1:上部プライマー配列番号104、下部プライマー配列番号105)を使用した1つの最終クローンのPCR分析から、予想通り、3.597kbのバンドを得た。全ての上部プライマーが、発現カセットの上流および外側に位置し、全ての下部プライマーが、ND Fコード領域内に位置する、UL55-Gene3の上流組み込み領域についての4セットのプライマー。プライマーセット2:上部プライマー:配列番号106、下部プライマー:配列番号107、2.243kbのバンドを得た。プライマーセット3:上部プライマー:配列番号108、下部プライマー:配列番号109、2.356kbのPCRバンドを得た。プライマーセット4:上部プライマー:配列番号110、下部プライマー:配列番号111、2.424kbのPCRバンドを得た。プライマーセット5:上部プライマー:配列番号112、下部プライマー:配列番号113、2.170kbのPCRバンドを得た。正しい組み込みは、挿入部の下流の接合部の周囲にあるプライマー(プライマーセット6:NDV F遺伝子コード配列内に局在化した上部プライマー配列番号114、UL55-Gene3挿入部位の下流に局在化した下部プライマー配列番号115、パネルC)を使用することによって、さらに確認された。予想通り、0.971kbのPCRバンドが得られた。図18を参照されたい。
HVT-ND #44の構築
HVT-IBD #44トランスファープラスミド(配列番号36)を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。トランスファープラスミド44番を制限酵素EcoRIおよびHindIIIで消化して、プラスミド配列からインサートを放出させ、得られた消化されたDNA(10ng)を、2.5μgのHVT-gfpB DNAと共に使用し、PEI(ポリエチレンイミン)を使用しつつ、二次細胞を共トランスフェクトした。トランスフェクションから4日後、トランスフェクトされた細胞を、新鮮な二次細胞で1:6で継代させ、ニワトリ抗NDVポリクローナル血清で生細胞染色し、継代から3~4日後に、NDVを発現するフォーカスを特定した。3個の陽性染色フォーカスを、クローニングを使用したトリプシン化によって採取した。採取した細胞を連続希釈し、新鮮な二次CEF細胞上にプレーティングした。このプロセスを、NDV染色が均一性を示すまで、3~4日ごとに繰り返し、次いで、4回のその後のクローニングを行った。次いで、クローニングされた培養物を増幅させ、凍結ストックを調製した。凍結ストックを「HVT-ND #44」と命名した。
HVT-IBD #44トランスファープラスミド(配列番号36)を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。トランスファープラスミド44番を制限酵素EcoRIおよびHindIIIで消化して、プラスミド配列からインサートを放出させ、得られた消化されたDNA(10ng)を、2.5μgのHVT-gfpB DNAと共に使用し、PEI(ポリエチレンイミン)を使用しつつ、二次細胞を共トランスフェクトした。トランスフェクションから4日後、トランスフェクトされた細胞を、新鮮な二次細胞で1:6で継代させ、ニワトリ抗NDVポリクローナル血清で生細胞染色し、継代から3~4日後に、NDVを発現するフォーカスを特定した。3個の陽性染色フォーカスを、クローニングを使用したトリプシン化によって採取した。採取した細胞を連続希釈し、新鮮な二次CEF細胞上にプレーティングした。このプロセスを、NDV染色が均一性を示すまで、3~4日ごとに繰り返し、次いで、4回のその後のクローニングを行った。次いで、クローニングされた培養物を増幅させ、凍結ストックを調製した。凍結ストックを「HVT-ND #44」と命名した。
UL55-Gene3の組み込み部位の上流領域のためのプライマー(上部プライマー:UL55の上流に局在化した配列番号116、下部プライマー:ニワトリベータ-アクチンプロモーター内に局在化した配列番号117、パネルA)を使用した1個の最終クローンのPCR分析から、0.71kbのバンドを得た。同様に局在化したプライマー対:上部プライマー:配列番号118、下部プライマー:配列番号119(パネルB)から、0.965kbのPCRバンドを得た。正しい組み込みは、挿入部の下流の接合部の周囲にあるプライマー(NDV F遺伝子コード配列内に局在化した上部プライマー配列番号120、UL55-Gene3挿入部位の下流に局在化した下部プライマー配列番号121、パネルC)を使用することによって、さらに確認された。予想通り、0.971kbのPCRバンドが得られた。正しい構築物は、発現カセットの外側のプライマー(上部プライマー配列番号122、下部プライマー配列番号123(パネルD)を使用することによって、さらに確認された。予想通り、3.438kbのPCRバンドが得られた。
HVT-ND #45の構築
HVT-IBD #45トランスファープラスミド(配列番号)を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。6ウェルプレート中、Lipofectamine LTXを使用して、HVT-GFP-Bに感染したCEF細胞に、このプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから3日後、GFP陰性フォーカスのスクリーニングのために、トランスフェクト/感染した細胞を96ウェルプレート上でプレーティングした。GFP陰性フォーカスを含有するウェルを、限界希釈によって3回精製した。精製したウイルスをニワトリNDV血清でIFA染色し、NDV F遺伝子発現を確認した。精製したウイルスのうちの1つを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-ND #45」と命名した。
HVT-IBD #45トランスファープラスミド(配列番号)を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。6ウェルプレート中、Lipofectamine LTXを使用して、HVT-GFP-Bに感染したCEF細胞に、このプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションから3日後、GFP陰性フォーカスのスクリーニングのために、トランスフェクト/感染した細胞を96ウェルプレート上でプレーティングした。GFP陰性フォーカスを含有するウェルを、限界希釈によって3回精製した。精製したウイルスをニワトリNDV血清でIFA染色し、NDV F遺伝子発現を確認した。精製したウイルスのうちの1つを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-ND #45」と命名した。
発現カセットの外側のプライマー(プライマーセット1:上部プライマー配列番号124、下部プライマー配列番号125)を使用した1つの最終クローンのPCR分析から、予想通り、2.830kbのバンドを得た。両方の上部プライマーが、発現カセットの上流および外側に位置し、両方の下部プライマーが、ND Fコード領域内に位置する、Gene3-UL55の上流組み込み領域についての2セットのプライマー。プライマーセット2:上部プライマー:配列番号126、下部プライマー:配列番号127、1.635kbのバンドを得た。プライマーセット3:上部プライマー配列番号128、下部プライマー:配列番号129、1.588kbのPCRバンドを得た。正しい組み込みは、挿入部の下流の接合部の周囲にある2セットのプライマー(プライマーセット4:NDV F遺伝子コード配列内に局在化した上部プライマー配列番号130、Gene3-UL55挿入部位の下流に局在化した下部プライマー配列番号131)を使用することによって、さらに確認された。予想通り、0.993kbのPCRバンドが得られた。プライマーセット5:上部プライマー:配列番号132、下部プライマー:配列番号133、予想通り、1.137kbのPCRバンドが得られた。図19を参照されたい。
HVT-ND #46の構築
HVT-ND #46トランスファープラスミド(配列番号38)を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。このプラスミドを、6ウェルプレート中、PEI(ポリエチレンイミン、7.5uL)を使用して、HVT-GFP-BウイルスDNAと共にCEF細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから4日後、GFP陰性フォーカスのスクリーニングのために、トランスフェクトされた細胞を96ウェルプレート上でプレーティングした。GFP陰性フォーカスを含有するウェルを、限界希釈によって3回精製した。精製したウイルスをニワトリNDV血清でIFA染色し、NDV F遺伝子発現を確認した。精製したウイルスのうちの1つを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-ND #46」と命名した。
HVT-ND #46トランスファープラスミド(配列番号38)を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。このプラスミドを、6ウェルプレート中、PEI(ポリエチレンイミン、7.5uL)を使用して、HVT-GFP-BウイルスDNAと共にCEF細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから4日後、GFP陰性フォーカスのスクリーニングのために、トランスフェクトされた細胞を96ウェルプレート上でプレーティングした。GFP陰性フォーカスを含有するウェルを、限界希釈によって3回精製した。精製したウイルスをニワトリNDV血清でIFA染色し、NDV F遺伝子発現を確認した。精製したウイルスのうちの1つを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-ND #46」と命名した。
発現カセットの外側のプライマー(上部プライマー配列番号134、下部プライマー配列番号135)を使用した1つの最終クローンのPCR分析から、予想通り、3.597kbのバンドを得た。上部プライマーが、発現カセットの上流および外側に位置し(配列番号136)、下部プライマーが、マウスCMVプロモーター内に位置し(上部プライマー配列番号137)、予想通り、1.107kbのPCRバンドを得た、Gene3-UL55の上流組み込み領域についての1セットのプライマー。正しい組み込みは、挿入部の下流の接合部の周囲にある4セットのプライマー:P1:NDV F遺伝子コード配列内に局在化した上部プライマー配列番号138、発現カセットの下流および外側に局在化した下部プライマー配列番号139を使用することによって、さらに確認された。予想通り、1.003kbのPCRバンドが得られた。P2:上部プライマー:配列番号140、下部プライマー:配列番号141、予想通り、1.147kbのPCRバンドが得られた。P3:上部プライマー:配列番号142、下部プライマー:配列番号143、予想通り、1.019kbのPCRバンドが得られた。P4:上部プライマー:配列番号144、下部プライマー:配列番号145、予想通り、1.018kbのPCRバンドが得られた。図20A~Cを参照されたい。
HVT-ND #48の構築
HVT-ND #48についての線状トランスファープラスミド(配列番号39)を、二次CEF細胞を含む6ウェルプレート中、PEI(ポリエチレンイミン、7.5uL)を使用して、HVT-gfp-B DNAと共トランスフェクトした。トランスフェクションから4日後、トランスフェクトされた細胞を96ウェルプレート上でプレーティングし、NDVニワトリ血清で生細胞染色した。4個の非緑色フォーカスが発見され、2個がNDVニワトリ血清を使用して陽性であり、陽性染色された。図33AおよびBを参照されたい。2つのクローンを、限界希釈によって3回精製した。精製したウイルスを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-ND #48」と命名した。
HVT-ND #48についての線状トランスファープラスミド(配列番号39)を、二次CEF細胞を含む6ウェルプレート中、PEI(ポリエチレンイミン、7.5uL)を使用して、HVT-gfp-B DNAと共トランスフェクトした。トランスフェクションから4日後、トランスフェクトされた細胞を96ウェルプレート上でプレーティングし、NDVニワトリ血清で生細胞染色した。4個の非緑色フォーカスが発見され、2個がNDVニワトリ血清を使用して陽性であり、陽性染色された。図33AおよびBを参照されたい。2つのクローンを、限界希釈によって3回精製した。精製したウイルスを、CEF細胞を使用して拡張させ、凍結ストックを作製した。これを「HVT-ND #48」と命名した。
HVT-IBD #48トランスファープラスミドを、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。このトランスファープラスミドをEcoRIおよびHindIIIで消化して、プラスミド配列からインサートを放出させ、得られた消化されたDNA(10ng)を、2.5μgのHVT-gfp-B DNAと共に使用し、PEI(ポリエチレンイミン)を使用しつつ、二次細胞を共トランスフェクトした。トランスフェクションから3日後、トランスフェクトされた細胞を、新鮮な二次細胞で1:6で継代させ、NDVニワトリポリクローナル血清で生細胞染色し、継代から4日後に、NDVを発現するフォーカスを特定した。3個の陽性染色フォーカスを、クローニングシリンダを使用したトリプシン化によって採取した。採取した細胞を連続希釈し、新鮮な二次CEF細胞上にプレーティングした。このプロセスを、NDV染色が均一性を示すまで、3~4日ごとに繰り返し、次いで、4回のその後のクローニングを行った。次いで、クローニングされた培養物を6個のウェルプレートから、75cm2フラスコまで、225cm2フラスコまで増幅させた後、初代CEF細胞を使用して、850cm2のローラーボトル中、最終増幅を行った。最終培養物を採取し、「HVT-ND #48」と命名した。
Gene3-UL55の組み込み部位の上流領域のためのプライマー(上部プライマー:配列番号146、下部プライマー:ニワトリベータ-アクチンプロモーター内に局在化した配列番号147、パネルA)を使用した1つの最終クローンのPCR分析から、予想通り、0.815kbのバンドを得た。正しい組み込みは、挿入部の下流の接合部の周囲にあるプライマー(NDV Fコード領域内に局在化した上部プライマー配列番号148、Gene3-UL55挿入部位の下流に局在化した下部プライマー配列番号149、パネルB)を使用することによって、さらに確認された。予想通り、1.003kbのPCRバンドが得られた。別の同様に局在化したプライマー:上部プライマー:配列番号150、下部プライマー:配列番号151(パネルC)、予想通り、1.147kbのPCRバンドを得た。正しい構築物は、発現カセットの外側のプライマー(上部プライマー配列番号152、下部プライマー配列番号153(パネルD)を使用することによって、さらに確認された。予想通り、3.430kbのPCRバンドが得られた。
実施例3
SPF鳥のHVT-IBD#9、#34のインビボIBDV有効性試験
2種類のHVT-IBD組換え体HVT-IBD#9、#34を、SPF鳥において、毒性が高いIBDVチャレンジ(STD株、USDAによって提供される)に対するそれらのインビボ有効性について試験した。この試験において、市販のワクチンVaxxitek(Merial)の陽性対照を使用した。1500pfuの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。各ワクチンウイルスの逆力価も、ワクチン接種後の各組換え体について決定した。HVT-IBD#9の100%がIBDV VP2抗原を発現するが、本願発明者らは、HVT-IBD#34の96%しか、この抗原を発現しないことを発見した。IBDV STDチャレンジを、USDAの指示に従って28日目に実施した。全ての鳥を、チャレンジの5日後に剖検した。本願発明者らは、HVT-IBD#9について100%の保護、およびHVT-IBD#34について90%の保護を観察したが、本願発明者らの陽性対照Vaxxitekは、97%の保護を与えた。
SPF鳥のHVT-IBD#9、#34のインビボIBDV有効性試験
2種類のHVT-IBD組換え体HVT-IBD#9、#34を、SPF鳥において、毒性が高いIBDVチャレンジ(STD株、USDAによって提供される)に対するそれらのインビボ有効性について試験した。この試験において、市販のワクチンVaxxitek(Merial)の陽性対照を使用した。1500pfuの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。各ワクチンウイルスの逆力価も、ワクチン接種後の各組換え体について決定した。HVT-IBD#9の100%がIBDV VP2抗原を発現するが、本願発明者らは、HVT-IBD#34の96%しか、この抗原を発現しないことを発見した。IBDV STDチャレンジを、USDAの指示に従って28日目に実施した。全ての鳥を、チャレンジの5日後に剖検した。本願発明者らは、HVT-IBD#9について100%の保護、およびHVT-IBD#34について90%の保護を観察したが、本願発明者らの陽性対照Vaxxitekは、97%の保護を与えた。
実施例4
SPF鳥のHVT-IBD#1、#5、#6a、#9、#30、#34のインビボIBDV有効性試験
6種類のHVT-IBD組換え体HVT-IBD#1、#5、#6a、#9、#30、#34を、SPF鳥において、毒性が高いIBDVチャレンジ(STD株、USDAによって提供される)に対するそれらのインビボ有効性について試験した。この試験において、市販のワクチンVaxxitek(Merial)の陽性対照を使用した。1500pfuの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。各ワクチンウイルスの逆力価も、ワクチン接種後の各組換え体について決定した。全ての組換え体が、IBDV VP2抗原について100%発現することが見出された。IBDV STDチャレンジを、USDAの指示に従って28日目に実施した。全ての鳥を、チャレンジの5日後に剖検した。本願発明者らは、HVT-IBD#9について100%の保護、およびHVT-IBD#1、#30、#34について96%の保護、ならびにHVT-IBD#6aについて92%の保護を観察したが、本願発明者らの陽性対照Vaxxitekは、92%の保護を与えた。
SPF鳥のHVT-IBD#1、#5、#6a、#9、#30、#34のインビボIBDV有効性試験
6種類のHVT-IBD組換え体HVT-IBD#1、#5、#6a、#9、#30、#34を、SPF鳥において、毒性が高いIBDVチャレンジ(STD株、USDAによって提供される)に対するそれらのインビボ有効性について試験した。この試験において、市販のワクチンVaxxitek(Merial)の陽性対照を使用した。1500pfuの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。各ワクチンウイルスの逆力価も、ワクチン接種後の各組換え体について決定した。全ての組換え体が、IBDV VP2抗原について100%発現することが見出された。IBDV STDチャレンジを、USDAの指示に従って28日目に実施した。全ての鳥を、チャレンジの5日後に剖検した。本願発明者らは、HVT-IBD#9について100%の保護、およびHVT-IBD#1、#30、#34について96%の保護、ならびにHVT-IBD#6aについて92%の保護を観察したが、本願発明者らの陽性対照Vaxxitekは、92%の保護を与えた。
実施例5:
市販ブロイラー鳥のHVT-IBD#1、#5、#9、#15のIBDV血清学的応答
IBDV抗原に対する血清学的応答を、市販のElisaキットProFlok ND plusを使用して測定した。1500pfu(0.2mL)の各組換え体(HVT-IBD#1、#5、#9、#15を、1日齢の雛に対して皮下(SC)注射した。血清試料を、12、19、26、33、39、47、および54日目に単離し、これらは以下の表3で見ることができる。時間経過中の各構築物についての陽性試料の割合を図13に示す。
市販ブロイラー鳥のHVT-IBD#1、#5、#9、#15のIBDV血清学的応答
IBDV抗原に対する血清学的応答を、市販のElisaキットProFlok ND plusを使用して測定した。1500pfu(0.2mL)の各組換え体(HVT-IBD#1、#5、#9、#15を、1日齢の雛に対して皮下(SC)注射した。血清試料を、12、19、26、33、39、47、および54日目に単離し、これらは以下の表3で見ることができる。時間経過中の各構築物についての陽性試料の割合を図13に示す。
実施例6:
市販ブロイラー鳥のHVT-IBD#6a、#30、#31のIBDV血清学的応答
IBDV抗原に対する血清学的応答を、市販のELISAキットProFlok IBD plusを使用して測定した。1500pfu(0.2mL)の各組換え体(HVT-IBD#61、#30、#31)を、1日齢の雛に対して皮下(SC)注射した。血清試料を、12、19、26、33、39、47、および54日目に単離し、これらは以下の表4に示される。時間経過中の各構築物についての陽性試料の割合を図14に示す。
市販ブロイラー鳥のHVT-IBD#6a、#30、#31のIBDV血清学的応答
IBDV抗原に対する血清学的応答を、市販のELISAキットProFlok IBD plusを使用して測定した。1500pfu(0.2mL)の各組換え体(HVT-IBD#61、#30、#31)を、1日齢の雛に対して皮下(SC)注射した。血清試料を、12、19、26、33、39、47、および54日目に単離し、これらは以下の表4に示される。時間経過中の各構築物についての陽性試料の割合を図14に示す。
実施例7:
SPF鳥のHVT-ND#38、#39、#44、#48のインビボ有効性試験
4種類のHVT-ND組換え体HVT-IBD#38、#39、#44、#48を、SPF鳥において、毒性が高いNDVチャレンジ(Texas GB株、USDAによって提供される)に対するそれらのインビボ有効性について試験した。この試験において、市販のワクチンVectormune ND(Ceva)の陽性対照を使用した。1500pfuの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。ワクチンウイルスの逆力価も、ワクチン接種後の各組換え体について決定した。HVT-ND#38および#48の100%がNDV F抗原を発現するが、本願発明者らは、HVT-IBD#39および#44の95~96%しか、この抗原を発現しないことを発見した。NDV Texas GBチャレンジを、USDAの指示に従って28日目に実施した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。本願発明者らは、HVT-ND#38および#48について90%の保護、およびHVT-ND#39について50%の保護、ならびにHVT-ND#44について60%の保護を観察したが、本願発明者らの陽性対照Vectormune NDは、90%の保護を与えた。以下の表5を参照されたい。
SPF鳥のHVT-ND#38、#39、#44、#48のインビボ有効性試験
4種類のHVT-ND組換え体HVT-IBD#38、#39、#44、#48を、SPF鳥において、毒性が高いNDVチャレンジ(Texas GB株、USDAによって提供される)に対するそれらのインビボ有効性について試験した。この試験において、市販のワクチンVectormune ND(Ceva)の陽性対照を使用した。1500pfuの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。ワクチンウイルスの逆力価も、ワクチン接種後の各組換え体について決定した。HVT-ND#38および#48の100%がNDV F抗原を発現するが、本願発明者らは、HVT-IBD#39および#44の95~96%しか、この抗原を発現しないことを発見した。NDV Texas GBチャレンジを、USDAの指示に従って28日目に実施した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。本願発明者らは、HVT-ND#38および#48について90%の保護、およびHVT-ND#39について50%の保護、ならびにHVT-ND#44について60%の保護を観察したが、本願発明者らの陽性対照Vectormune NDは、90%の保護を与えた。以下の表5を参照されたい。
種々のHVT-NDワクチン候補に対する抗体応答を、ProFlok ND plusキット(Zoetis LLC)を使用することによってアッセイした。全ての力価は、このキットによって推奨されるカットオフ値(345)を使用することなく、含まれていた。陽性ND力価を有する鳥のパーセンテージを以下の表6に示す。
実施例8:
SPF鳥のHVT-ND#40、#42、#45、#46のインビボNDV有効性試験
4種類のHVT-ND組換え体HVT-IBD#40、#42、#45、#46を、SPF鳥において、毒性が高いNDVチャレンジ(Texas GB株、USDAによって提供される)に対するそれらのインビボ有効性について試験した。この試験において、市販のワクチンVectormune ND(Ceva)の陽性対照を使用した。1500pfuの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。ワクチンウイルスの逆力価を、ワクチン接種後の各組換え体について決定した。HVT-ND#42、#45、および#46の100%がNDV F抗原を発現するが、本願発明者らは、HVT-IBD#40の94~99%しか、この抗原を発現しないことを発見した。NDV Texas GBチャレンジを、USDAの指示に従って28日目に実施した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。本願発明者らは、HVT-ND#42および#45について95%の保護、およびHVT-ND#46について80%の保護、ならびにHVT-ND#40について55%の保護を観察したが、陽性対照Vectormune NDは、90%の保護を与えた。以下の表7を参照されたい。
SPF鳥のHVT-ND#40、#42、#45、#46のインビボNDV有効性試験
4種類のHVT-ND組換え体HVT-IBD#40、#42、#45、#46を、SPF鳥において、毒性が高いNDVチャレンジ(Texas GB株、USDAによって提供される)に対するそれらのインビボ有効性について試験した。この試験において、市販のワクチンVectormune ND(Ceva)の陽性対照を使用した。1500pfuの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。ワクチンウイルスの逆力価を、ワクチン接種後の各組換え体について決定した。HVT-ND#42、#45、および#46の100%がNDV F抗原を発現するが、本願発明者らは、HVT-IBD#40の94~99%しか、この抗原を発現しないことを発見した。NDV Texas GBチャレンジを、USDAの指示に従って28日目に実施した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。本願発明者らは、HVT-ND#42および#45について95%の保護、およびHVT-ND#46について80%の保護、ならびにHVT-ND#40について55%の保護を観察したが、陽性対照Vectormune NDは、90%の保護を与えた。以下の表7を参照されたい。
種々のHVT-NDワクチン候補に対する抗体応答を、ProFlok ND plusキット(Zoetis LLC)を使用することによってアッセイした。全ての力価は、このキットによって推奨されるカットオフ値(345)を使用することなく、含まれていた。陽性ND力価を有する鳥のパーセンテージを以下の表8に示す。
実施例9
SFP鳥のHVT-ND#38、#42、#45のインビボMDV有効性試験
3種類のHVT-ND組換え体HVT-IBD#38、#42、#45を、SPF鳥において、毒性が高いMDVチャレンジ(GA22)に対するそれらのインビボ有効性について試験した。この試験において、市販のワクチンVectormune ND(Ceva)の陽性対照を使用した。1500pfuの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。ワクチンウイルスの逆力価を、ワクチン接種後の各組換え体について決定した。MDV GA22チャレンジを、USDAの指示に従って5日目に実施した。全ての鳥を、チャレンジの54日後に観察した。本願発明者らは、HVT-ND#42および#45について69%の保護、ならびにHVT-ND#38について46%の保護を観察したが、陽性対照Vectormune NDは、62%の保護を与えた。以下の表9を参照されたい。
SFP鳥のHVT-ND#38、#42、#45のインビボMDV有効性試験
3種類のHVT-ND組換え体HVT-IBD#38、#42、#45を、SPF鳥において、毒性が高いMDVチャレンジ(GA22)に対するそれらのインビボ有効性について試験した。この試験において、市販のワクチンVectormune ND(Ceva)の陽性対照を使用した。1500pfuの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。ワクチンウイルスの逆力価を、ワクチン接種後の各組換え体について決定した。MDV GA22チャレンジを、USDAの指示に従って5日目に実施した。全ての鳥を、チャレンジの54日後に観察した。本願発明者らは、HVT-ND#42および#45について69%の保護、ならびにHVT-ND#38について46%の保護を観察したが、陽性対照Vectormune NDは、62%の保護を与えた。以下の表9を参照されたい。
実施例10
ブロイラー鳥のHVT-ND#38、#42、#45のインビボND有効性試験
3種類のHVT-ND組換え体HVT-IBD#38、#42、#45を、ブロイラー鳥において、毒性が高いNDVチャレンジ(Texas GB株、USDAによって提供される)に対するそれらのインビボ有効性について試験した。この試験において、市販のワクチンVectormune ND(Ceva)の陽性対照を使用した。4000pfuの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。ワクチンウイルスの逆力価を、ワクチン接種後の各組換え体について決定した。NDV Texas GBチャレンジを、USDAの指示に従って28日目に実施した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。本願発明者らは、HVT-ND#42および#45について100%の保護、ならびにHVT-ND#38について37%の保護を観察したが、本願発明者らの陽性対照Vectormune NDは、50%の保護を与えた。Vectormune NDの逆力価は、0であった。
ブロイラー鳥のHVT-ND#38、#42、#45のインビボND有効性試験
3種類のHVT-ND組換え体HVT-IBD#38、#42、#45を、ブロイラー鳥において、毒性が高いNDVチャレンジ(Texas GB株、USDAによって提供される)に対するそれらのインビボ有効性について試験した。この試験において、市販のワクチンVectormune ND(Ceva)の陽性対照を使用した。4000pfuの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。ワクチンウイルスの逆力価を、ワクチン接種後の各組換え体について決定した。NDV Texas GBチャレンジを、USDAの指示に従って28日目に実施した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。本願発明者らは、HVT-ND#42および#45について100%の保護、ならびにHVT-ND#38について37%の保護を観察したが、本願発明者らの陽性対照Vectormune NDは、50%の保護を与えた。Vectormune NDの逆力価は、0であった。
種々のHVT-NDワクチン候補に対する抗体応答を、ProFlok ND plusキット(Zoetis LLC)を使用することによってアッセイした。全ての力価は、このキットによって推奨されるカットオフ値(345)を使用することなく、含まれていた。
実施例11
チャレンジ20日目のSFP鳥のHVT-ND#38、#42、#45のインビボNDV有効性試験
3種類のHVT-ND組換え体HVT-IBD#38、#42、#45を、チャレンジ20日目のSPF鳥において、毒性が高いNDVチャレンジ(Texas GB株、USDAによって提供される)に対するそれらのインビボ有効性について試験した。この試験において、市販のワクチンVectormune ND(Ceva)の陽性対照を使用した。2000pfuの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。ワクチンウイルスの逆力価を、ワクチン接種後の各組換え体について決定した。NDV Texas GBチャレンジを、USDAの指示に従って20日目に実施した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。本願発明者らは、HVT-ND#42について87.5%の保護、およびHVT-ND#45について70%の保護、HVT-ND#38について65%の保護を観察したが、本願発明者らの陽性対照Vectormune NDは、87.5%の保護を与えた。以下の表11を参照されたい。
チャレンジ20日目のSFP鳥のHVT-ND#38、#42、#45のインビボNDV有効性試験
3種類のHVT-ND組換え体HVT-IBD#38、#42、#45を、チャレンジ20日目のSPF鳥において、毒性が高いNDVチャレンジ(Texas GB株、USDAによって提供される)に対するそれらのインビボ有効性について試験した。この試験において、市販のワクチンVectormune ND(Ceva)の陽性対照を使用した。2000pfuの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。ワクチンウイルスの逆力価を、ワクチン接種後の各組換え体について決定した。NDV Texas GBチャレンジを、USDAの指示に従って20日目に実施した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。本願発明者らは、HVT-ND#42について87.5%の保護、およびHVT-ND#45について70%の保護、HVT-ND#38について65%の保護を観察したが、本願発明者らの陽性対照Vectormune NDは、87.5%の保護を与えた。以下の表11を参照されたい。
実施例12
チャレンジ17、18、19日目のSPF鳥のHVT-ND(#42、MSV+5)のインビボNDV有効性試験
3種類のHVT-ND組換え体HVT-ND(#42、MSV+5)を、チャレンジ17、18、19日目のSPF鳥において、毒性が高いNDVチャレンジ(Texas GB株)に対するそのインビボ有効性について試験した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。本願発明者らは、インオボワクチン接種について、チャレンジ17、18、19日目のNDVチャレンジについて、それぞれ、100%(40/40)、88%(35/40)、98%(39/40)の保護が観察されたことを観察した。孵化当日の皮下ワクチン接種について、75%(30/40)、88%(35/40)、93%(37/40)の保護が観察された。以下の表12を参照されたい。
チャレンジ17、18、19日目のSPF鳥のHVT-ND(#42、MSV+5)のインビボNDV有効性試験
3種類のHVT-ND組換え体HVT-ND(#42、MSV+5)を、チャレンジ17、18、19日目のSPF鳥において、毒性が高いNDVチャレンジ(Texas GB株)に対するそのインビボ有効性について試験した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。本願発明者らは、インオボワクチン接種について、チャレンジ17、18、19日目のNDVチャレンジについて、それぞれ、100%(40/40)、88%(35/40)、98%(39/40)の保護が観察されたことを観察した。孵化当日の皮下ワクチン接種について、75%(30/40)、88%(35/40)、93%(37/40)の保護が観察された。以下の表12を参照されたい。
実施例13
チャレンジ16日目および19日目のSPF鳥のHVT-ND(#42、MSV+5)のインビボNDV有効性試験
3種類のHVT-ND組換え体HVT-ND(#42、MSV+5)を、チャレンジ16日目および19日目のSPF鳥において、毒性が高いNDVチャレンジ(Texas GB株)に対するそのインビボ有効性について試験した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。本願発明者らは、インオボワクチン接種について、16日目および19日目のNDVチャレンジについて、85%(37/40)および93%(37/40)の保護が観察されたことを観察した。孵化当日の皮下ワクチン接種について、70%(28/40)および95%(38/40)の保護が観察された。以下の表13を参照されたい。
チャレンジ16日目および19日目のSPF鳥のHVT-ND(#42、MSV+5)のインビボNDV有効性試験
3種類のHVT-ND組換え体HVT-ND(#42、MSV+5)を、チャレンジ16日目および19日目のSPF鳥において、毒性が高いNDVチャレンジ(Texas GB株)に対するそのインビボ有効性について試験した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。本願発明者らは、インオボワクチン接種について、16日目および19日目のNDVチャレンジについて、85%(37/40)および93%(37/40)の保護が観察されたことを観察した。孵化当日の皮下ワクチン接種について、70%(28/40)および95%(38/40)の保護が観察された。以下の表13を参照されたい。
実施例14
チャレンジ63日目までのSPF鳥のHVT-ND(#42、MSV+5)の免疫持続時間試験
3種類のHVT-ND組換え体HVT-ND(#42、MSV+5)を、チャレンジ63日目のSPF鳥において、毒性が高いNDVチャレンジ(Texas GB株)に対する免疫持続時間について試験した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。本願発明者らは、孵化当日のインオボワクチン接種または皮下ワクチン接種の両方について、100%(30/30)の保護を観察した。以下の表14を参照されたい。
チャレンジ63日目までのSPF鳥のHVT-ND(#42、MSV+5)の免疫持続時間試験
3種類のHVT-ND組換え体HVT-ND(#42、MSV+5)を、チャレンジ63日目のSPF鳥において、毒性が高いNDVチャレンジ(Texas GB株)に対する免疫持続時間について試験した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。本願発明者らは、孵化当日のインオボワクチン接種または皮下ワクチン接種の両方について、100%(30/30)の保護を観察した。以下の表14を参照されたい。
実施例15
SPF鳥のHVT-ND(#42、MSV+5)のND免疫原性試験
3種類のHVT-ND組換え体HVT-ND(#42、MSV+5)を、SPF鳥において28日目に、毒性が高いNDVチャレンジ(Texas GB株、USDAによって提供される)に対する免疫原性について試験した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。本願発明者らは、孵化当日のインオボワクチン接種または皮下ワクチン接種の両方について、100%(30/30)の保護を観察した。以下の表15を参照されたい。
SPF鳥のHVT-ND(#42、MSV+5)のND免疫原性試験
3種類のHVT-ND組換え体HVT-ND(#42、MSV+5)を、SPF鳥において28日目に、毒性が高いNDVチャレンジ(Texas GB株、USDAによって提供される)に対する免疫原性について試験した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。本願発明者らは、孵化当日のインオボワクチン接種または皮下ワクチン接種の両方について、100%(30/30)の保護を観察した。以下の表15を参照されたい。
実施例16
SPF鳥のHVT-ND(#42、MSV+5)のMD免疫原性試験
3種類のHVT-ND組換え体HVT-ND(#42、MSV+5)を、SPF鳥において5日目に、毒性が高いMDVチャレンジ(GA22株)に対する免疫原性について試験した。全ての鳥を、チャレンジの54日後に観察した。本願発明者らは、孵化当日のインオボワクチン接種または皮下ワクチン接種の両方について、100%(30/30)の保護を観察した。以下の表16を参照されたい。
SPF鳥のHVT-ND(#42、MSV+5)のMD免疫原性試験
3種類のHVT-ND組換え体HVT-ND(#42、MSV+5)を、SPF鳥において5日目に、毒性が高いMDVチャレンジ(GA22株)に対する免疫原性について試験した。全ての鳥を、チャレンジの54日後に観察した。本願発明者らは、孵化当日のインオボワクチン接種または皮下ワクチン接種の両方について、100%(30/30)の保護を観察した。以下の表16を参照されたい。
実施例17
インビトロ成長実験
インビトロ成長実験を、HVT-ND#38、#42、#45について実行した。490cm2のローラーボトルに、5×108個の初代CEF細胞を播種した。HVT-ND#38、#42、#45を、以下の3種類の異なるMOIで各ローラーボトルに接種した。0.001、0.003、0.008。感染した細胞を、感染から48時間後に採取し、CEF細胞上で滴定した。HVT-ND#42および#45は両方とも良好に成長し、それぞれ、2.86x106および2.97x106pfu/mLの力価を有する。HVT-ND#38は、1.67x106pfu/mLの力価を有していた。以下の表17を参照されたい。
インビトロ成長実験
インビトロ成長実験を、HVT-ND#38、#42、#45について実行した。490cm2のローラーボトルに、5×108個の初代CEF細胞を播種した。HVT-ND#38、#42、#45を、以下の3種類の異なるMOIで各ローラーボトルに接種した。0.001、0.003、0.008。感染した細胞を、感染から48時間後に採取し、CEF細胞上で滴定した。HVT-ND#42および#45は両方とも良好に成長し、それぞれ、2.86x106および2.97x106pfu/mLの力価を有する。HVT-ND#38は、1.67x106pfu/mLの力価を有していた。以下の表17を参照されたい。
実施例18
HVT-IBD-ND #42-#30LP C2の構築
トランスファープラスミド-#42の生成
初期トランスファープラスミドHVT-ND #42を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。クローニングプラスミドUL55/gene3を、上述のようにDNA2.0によって化学的に合成した。以下のプライマー:上部プライマー配列番号154、下部プライマー配列番号155を使用することによる、HVT-ND #42トランスファープラスミドのNDV F遺伝子発現カセットのPCR増幅。
HVT-IBD-ND #42-#30LP C2の構築
トランスファープラスミド-#42の生成
初期トランスファープラスミドHVT-ND #42を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。クローニングプラスミドUL55/gene3を、上述のようにDNA2.0によって化学的に合成した。以下のプライマー:上部プライマー配列番号154、下部プライマー配列番号155を使用することによる、HVT-ND #42トランスファープラスミドのNDV F遺伝子発現カセットのPCR増幅。
増幅したPCR産物を、UL55/gene3のAscI部位およびNheI部位にクローニングして、最終トランスファープラスミド#42を作製した。このプラスミドを、HVT-ND#42を作製するためのトランスフェクション/感染に使用した。
トランスファープラスミド-#30の生成
初期トランスファープラスミドHVT-IBD #30を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。クローニングプラスミドを、DNA2.0によって化学的に合成した。以下のプライマー:上部プライマー配列番号156、下部プライマーおよび配列番号157を使用することによる、プラスミド #30プラスミドのIBD遺伝子発現カセットのPCR増幅。増幅したPCR産物を、UL35/36のAgeI部位およびNpnI部位にクローニングして、最終トランスファープラスミド#30を作製した。このプラスミドを、HVT-IBD-ND #42-#30 LP C2を作製するためのトランスフェクション/感染に使用した。
初期トランスファープラスミドHVT-IBD #30を、BioBasic Inc.によって化学的に合成した。クローニングプラスミドを、DNA2.0によって化学的に合成した。以下のプライマー:上部プライマー配列番号156、下部プライマーおよび配列番号157を使用することによる、プラスミド #30プラスミドのIBD遺伝子発現カセットのPCR増幅。増幅したPCR産物を、UL35/36のAgeI部位およびNpnI部位にクローニングして、最終トランスファープラスミド#30を作製した。このプラスミドを、HVT-IBD-ND #42-#30 LP C2を作製するためのトランスフェクション/感染に使用した。
HVT-ND #42の構築:
共感染/トランスフェクション:6ウェルプレートにCEF細胞を播種し、次の日に、Lipofectamine(商標)LTX Reagent(ThermoFisher)を使用して、HVTワーキングシード感染(140ul)+プラスミド-#42(SpeI+SbfI消化によって線状化された)トランスフェクションを実施する。トランスフェクトから2日後に、トランスフェクトされた細胞を採取した。6ウェル中のスクリーニングされた陽性フォーカスを、ニワトリ抗NDVポリクローナル抗体(生細胞染色、約1:250希釈)を用いるIFAによってプレーティングし、次いで、限界希釈によって96ウェルプレート中で1回(生存染色によって)さらに精製し、単一クローンを得た。精製したクローンを、6ウェルプレートにて2回、2複製物で継代させ、クローンの純度を、IFAによって確認した(固定および染色)。この6ウェル採取物を、HVT-IBD-ND #42-#30の構築のために使用した。
共感染/トランスフェクション:6ウェルプレートにCEF細胞を播種し、次の日に、Lipofectamine(商標)LTX Reagent(ThermoFisher)を使用して、HVTワーキングシード感染(140ul)+プラスミド-#42(SpeI+SbfI消化によって線状化された)トランスフェクションを実施する。トランスフェクトから2日後に、トランスフェクトされた細胞を採取した。6ウェル中のスクリーニングされた陽性フォーカスを、ニワトリ抗NDVポリクローナル抗体(生細胞染色、約1:250希釈)を用いるIFAによってプレーティングし、次いで、限界希釈によって96ウェルプレート中で1回(生存染色によって)さらに精製し、単一クローンを得た。精製したクローンを、6ウェルプレートにて2回、2複製物で継代させ、クローンの純度を、IFAによって確認した(固定および染色)。この6ウェル採取物を、HVT-IBD-ND #42-#30の構築のために使用した。
HVT-IBD-ND #42-#30の構築
共感染/トランスフェクション:6ウェルプレートにCEF細胞を播種し、次の日に、Lipofectamine(商標)LTX Reagent(ThermoFisher)を使用して、HVT-ND #42感染+プラスミド-#30(SbfI消化によって線状化された)トランスフェクションを実施する。トランスフェクトから3日後に、トランスフェクトされた細胞を採取した。6ウェル中のスクリーニングされた陽性フォーカスを、ニワトリ抗IBDポリクローナル抗体(生細胞染色、約1:250希釈)を用いるIFAによってプレーティングし、次いで、限界希釈によって96ウェルプレート中で1回(生存染色によって)さらに精製し、単一クローンを得た。2つの精製したクローンを取り出し、6ウェルプレートにて2複製物で継代させ、クローンの純度を、IFAによって確認した(固定および染色)。クローンを、T-75フラスコ、T-150フラスコ、T-225フラスコ、850mlローラーボトル中で順次スケールアップした。組換えウイルスを採取し、1mL/バイアルに等分し、-80℃で一晩凍結させ、次いでLNタンクに移した。
共感染/トランスフェクション:6ウェルプレートにCEF細胞を播種し、次の日に、Lipofectamine(商標)LTX Reagent(ThermoFisher)を使用して、HVT-ND #42感染+プラスミド-#30(SbfI消化によって線状化された)トランスフェクションを実施する。トランスフェクトから3日後に、トランスフェクトされた細胞を採取した。6ウェル中のスクリーニングされた陽性フォーカスを、ニワトリ抗IBDポリクローナル抗体(生細胞染色、約1:250希釈)を用いるIFAによってプレーティングし、次いで、限界希釈によって96ウェルプレート中で1回(生存染色によって)さらに精製し、単一クローンを得た。2つの精製したクローンを取り出し、6ウェルプレートにて2複製物で継代させ、クローンの純度を、IFAによって確認した(固定および染色)。クローンを、T-75フラスコ、T-150フラスコ、T-225フラスコ、850mlローラーボトル中で順次スケールアップした。組換えウイルスを採取し、1mL/バイアルに等分し、-80℃で一晩凍結させ、次いでLNタンクに移した。
実施例19:
SPF鳥のHVT-IBD-ND#42-#30、#42-#32、#104のインビボNDV有効性試験
7種類のHVT-IBD-ND組換え体HVT-IBD-ND #42-#30(3クローン)、#42-#32(2クローン)、#104(2クローン)を、SPF鳥において、毒性が高いNDVチャレンジに対するそれらのインビボ有効性について試験した。NDV Texas GBチャレンジを、28日目に実施した。約1500PFUの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。以下の表18を参照されたい。
SPF鳥のHVT-IBD-ND#42-#30、#42-#32、#104のインビボNDV有効性試験
7種類のHVT-IBD-ND組換え体HVT-IBD-ND #42-#30(3クローン)、#42-#32(2クローン)、#104(2クローン)を、SPF鳥において、毒性が高いNDVチャレンジに対するそれらのインビボ有効性について試験した。NDV Texas GBチャレンジを、28日目に実施した。約1500PFUの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。以下の表18を参照されたい。
実施例20:
SPF鳥のHVT-IBD-ND#42-#30、#42-#32、#104のインビボIBD有効性試験
7種類のHVT-IBD-ND組換え体HVT-IBD-ND #42-#30(3クローン)、#42-#32(2クローン)、#104(2クローン)を、14日目および21日目のSPF鳥において、それぞれ、毒性が高いIBDVチャレンジに対するそれらのインビボ有効性について試験した。約2000PFUの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。全ての鳥を、チャレンジの5日後に剖検した。以下の表19を参照されたい。
SPF鳥のHVT-IBD-ND#42-#30、#42-#32、#104のインビボIBD有効性試験
7種類のHVT-IBD-ND組換え体HVT-IBD-ND #42-#30(3クローン)、#42-#32(2クローン)、#104(2クローン)を、14日目および21日目のSPF鳥において、それぞれ、毒性が高いIBDVチャレンジに対するそれらのインビボ有効性について試験した。約2000PFUの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。全ての鳥を、チャレンジの5日後に剖検した。以下の表19を参照されたい。
実施例21
SFP鳥における、HVT-IBD-ND #42-#30(4クローン)のインビボMDV有効性試験
3種類のHVT-IBD-ND組換え体#42-#30(4クローン)を、SPF鳥において、毒性が高いMDVチャレンジ(GA22)に対するそれらのインビボ有効性について試験した。約1500PFUの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。MDV GA22チャレンジを5日目に実施した。全ての鳥を、チャレンジの54日後に観察した。以下の表20を参照されたい。
SFP鳥における、HVT-IBD-ND #42-#30(4クローン)のインビボMDV有効性試験
3種類のHVT-IBD-ND組換え体#42-#30(4クローン)を、SPF鳥において、毒性が高いMDVチャレンジ(GA22)に対するそれらのインビボ有効性について試験した。約1500PFUの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。MDV GA22チャレンジを5日目に実施した。全ての鳥を、チャレンジの54日後に観察した。以下の表20を参照されたい。
実施例22
SPF鳥のHVT-IBD-ND#42-#30、#42-#32、#104のインビボvvIBD有効性試験
3種類のHVT-IBD-ND組換え体#42-#30(2クローン)、#42-#32(2クローン)、#104を、SPF鳥において、非常に毒性が高いIBDVチャレンジに対するそれらのインビボ有効性について試験した。約1500PFUの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。vvIBDVチャレンジを、14日目および21日目に実施した。全ての鳥を、チャレンジの10日後に観察した。試験終了時に、各鳥について、滑液包の組織学的検査を行った。以下の表21を参照されたい。
SPF鳥のHVT-IBD-ND#42-#30、#42-#32、#104のインビボvvIBD有効性試験
3種類のHVT-IBD-ND組換え体#42-#30(2クローン)、#42-#32(2クローン)、#104を、SPF鳥において、非常に毒性が高いIBDVチャレンジに対するそれらのインビボ有効性について試験した。約1500PFUの各組換えウイルスを、E18でインオボ注射した。vvIBDVチャレンジを、14日目および21日目に実施した。全ての鳥を、チャレンジの10日後に観察した。試験終了時に、各鳥について、滑液包の組織学的検査を行った。以下の表21を参照されたい。
実施例23
チャレンジ63日目までのSPF鳥のHVT-IBD-ND(#42-#30、X+5)の免疫IBD持続時間試験
HVT-IBD-ND組換え体#42-#30(MSV+5)を、チャレンジ63日目のSPF鳥において、毒性が高い古典的なIBDVチャレンジに対する免疫持続時間について試験した。全ての鳥を、チャレンジの4日後に観察し、その後、剖検した。表22を参照されたい。
チャレンジ63日目までのSPF鳥のHVT-IBD-ND(#42-#30、X+5)の免疫IBD持続時間試験
HVT-IBD-ND組換え体#42-#30(MSV+5)を、チャレンジ63日目のSPF鳥において、毒性が高い古典的なIBDVチャレンジに対する免疫持続時間について試験した。全ての鳥を、チャレンジの4日後に観察し、その後、剖検した。表22を参照されたい。
実施例24
SPF鳥のHVT-IBD-ND(#42-#30、MSV+5)のND免疫原性試験
HVT-IBD-ND組換え体#42-#30(MSV+5)を、SPF鳥において28日目に、毒性が高いNDVチャレンジ(Texas GB株)に対する免疫原性について試験した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。表23を参照されたい。
SPF鳥のHVT-IBD-ND(#42-#30、MSV+5)のND免疫原性試験
HVT-IBD-ND組換え体#42-#30(MSV+5)を、SPF鳥において28日目に、毒性が高いNDVチャレンジ(Texas GB株)に対する免疫原性について試験した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。表23を参照されたい。
実施例25
SPF鳥のHVT-IBD-ND(#42-#30、MSV+5)のIBD免疫原性試験
HVT-IBD-ND組換え体#42-#30(MSV+5)を、SPF鳥において34日目に、毒性が高いIBDVチャレンジに対する免疫原性について試験した。全ての鳥を、チャレンジの4日後に観察し、その後、嚢胞病変のために剖検した。以下の表24を参照されたい。
SPF鳥のHVT-IBD-ND(#42-#30、MSV+5)のIBD免疫原性試験
HVT-IBD-ND組換え体#42-#30(MSV+5)を、SPF鳥において34日目に、毒性が高いIBDVチャレンジに対する免疫原性について試験した。全ての鳥を、チャレンジの4日後に観察し、その後、嚢胞病変のために剖検した。以下の表24を参照されたい。
実施例26
SPF鳥のHVT-IBD-ND(#42-#30、MSV+5)のMD免疫原性試験
3種類のHVT-IBD-ND組換え体#42-#30(MSV+5)を、SPF鳥において5日目に、毒性が高いMDVチャレンジ(GA22株)に対する免疫原性について試験した。全ての鳥を、チャレンジの54日後に観察した。以下の表25を参照されたい。
SPF鳥のHVT-IBD-ND(#42-#30、MSV+5)のMD免疫原性試験
3種類のHVT-IBD-ND組換え体#42-#30(MSV+5)を、SPF鳥において5日目に、毒性が高いMDVチャレンジ(GA22株)に対する免疫原性について試験した。全ての鳥を、チャレンジの54日後に観察した。以下の表25を参照されたい。
実施例27
EUチャレンジ株に対する、SPF鳥のHVT-IBD-ND(#42-#30、MSV+5)のND免疫原性試験
HVT-IBD-ND組換え体#42-#30(MSV+5)を、SPF鳥において21日目に、毒性が高いNDV Europeチャレンジ(Herts Weybridge 33/56)に対する免疫原性について試験した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。以下の表26を参照されたい。
EUチャレンジ株に対する、SPF鳥のHVT-IBD-ND(#42-#30、MSV+5)のND免疫原性試験
HVT-IBD-ND組換え体#42-#30(MSV+5)を、SPF鳥において21日目に、毒性が高いNDV Europeチャレンジ(Herts Weybridge 33/56)に対する免疫原性について試験した。全ての鳥を、チャレンジの2週間後に観察した。以下の表26を参照されたい。
実施例28
BursaplexとのHVT-NDの適合性
IBDV有効性
BURSAPLEX(商標)(Zoetis、US5871748、参照により本明細書に組み込まれる)は、ウイルスに結合した、生きた弱毒化感染性ファブリキウス嚢病(IBD)株2512と、中和抗体BDAとからなるワクチンコンジュゲートを含む、IBDに対するワクチンである。Bursaplexは、家禽、特に、ニワトリにおいて、IBDに対する能動免疫を生成する。E18卵に、対照または試験ワクチン(1:1の比率でBursaplexを含むHVT-ND)のいずれかをインオボ注射し、注射されなかった卵と共に、Biometricsによって指定されるように割り当てられた孵卵器に移した。孵化当日に、T04鳥に皮下ワクチン接種した。IBDV血清学のために、5日目、12日目、19日目、26日目、および33日目に、血液試料を集めた。34日目に、指定された鳥を、古典的な毒性が高いIBDVでチャレンジし、38日目に、全ての鳥を、嚢胞病変の存在について剖検した。T01陰性群のニワトリは、著しい観察可能な病変を発現せず、T02チャレンジ対照群のニワトリの100%が、著しい観察可能な病変を発現した。T03(HVT-ND+Bursaplex、インオボ)およびT04(HVT-ND+Bursaplex、SC)は、両方とも100%で保護された。Poulvac Procerta HVT-NDおよびPoulvac Bursaplexは、一緒に投与されたときに適合性があり、インオボまたは皮下のいずれかで投与された場合に、IBDVチャレンジに対して依然として有効なままであると結論付けることができる。
BursaplexとのHVT-NDの適合性
IBDV有効性
BURSAPLEX(商標)(Zoetis、US5871748、参照により本明細書に組み込まれる)は、ウイルスに結合した、生きた弱毒化感染性ファブリキウス嚢病(IBD)株2512と、中和抗体BDAとからなるワクチンコンジュゲートを含む、IBDに対するワクチンである。Bursaplexは、家禽、特に、ニワトリにおいて、IBDに対する能動免疫を生成する。E18卵に、対照または試験ワクチン(1:1の比率でBursaplexを含むHVT-ND)のいずれかをインオボ注射し、注射されなかった卵と共に、Biometricsによって指定されるように割り当てられた孵卵器に移した。孵化当日に、T04鳥に皮下ワクチン接種した。IBDV血清学のために、5日目、12日目、19日目、26日目、および33日目に、血液試料を集めた。34日目に、指定された鳥を、古典的な毒性が高いIBDVでチャレンジし、38日目に、全ての鳥を、嚢胞病変の存在について剖検した。T01陰性群のニワトリは、著しい観察可能な病変を発現せず、T02チャレンジ対照群のニワトリの100%が、著しい観察可能な病変を発現した。T03(HVT-ND+Bursaplex、インオボ)およびT04(HVT-ND+Bursaplex、SC)は、両方とも100%で保護された。Poulvac Procerta HVT-NDおよびPoulvac Bursaplexは、一緒に投与されたときに適合性があり、インオボまたは皮下のいずれかで投与された場合に、IBDVチャレンジに対して依然として有効なままであると結論付けることができる。
NDV有効性
E18卵に、対照または試験ワクチン(1:1の比率でBursaplexを含むHVT-ND)のいずれかをインオボ注射し、注射されなかった卵と共に、Biometricsによって指定されるように割り当てられた孵卵器に移した。孵化当日に、T04鳥に皮下ワクチン接種した。NDV血清学のために、6日目、13日目、20日目、および27日目に、血液試料を集めた。28日目に、指定された鳥を、短潜伏期性NDVでチャレンジし、42日目に、生き残っている全ての鳥を死亡させた。T01陰性群のニワトリは、臨床徴候を発現せず、T02チャレンジ対照群のニワトリの100%が、死亡率を含め、ニューカッスル病の臨床徴候を発現した発現した。T03(HVT-ND+Bursaplex、インオボ)およびT04(HVT-ND+Bursaplex、SC)は、それぞれ、92.5%および95%保護された。Poulvac Procerta HVT-NDおよびPoulvac Bursaplexは、一緒に投与されたときに適合性があり、インオボまたは皮下のいずれかで投与された場合に、NDVチャレンジに対して依然として有効なままであると結論付けることができる。
E18卵に、対照または試験ワクチン(1:1の比率でBursaplexを含むHVT-ND)のいずれかをインオボ注射し、注射されなかった卵と共に、Biometricsによって指定されるように割り当てられた孵卵器に移した。孵化当日に、T04鳥に皮下ワクチン接種した。NDV血清学のために、6日目、13日目、20日目、および27日目に、血液試料を集めた。28日目に、指定された鳥を、短潜伏期性NDVでチャレンジし、42日目に、生き残っている全ての鳥を死亡させた。T01陰性群のニワトリは、臨床徴候を発現せず、T02チャレンジ対照群のニワトリの100%が、死亡率を含め、ニューカッスル病の臨床徴候を発現した発現した。T03(HVT-ND+Bursaplex、インオボ)およびT04(HVT-ND+Bursaplex、SC)は、それぞれ、92.5%および95%保護された。Poulvac Procerta HVT-NDおよびPoulvac Bursaplexは、一緒に投与されたときに適合性があり、インオボまたは皮下のいずれかで投与された場合に、NDVチャレンジに対して依然として有効なままであると結論付けることができる。
実施例29
MagniplexとのHVT-NDの適合性
IBD有効性
MAGNIPLEX(商標)(Zoetis)は、ウイルスに結合した、生きた弱毒化感染性ファブリキウス嚢病(IBD)株V877と、中和抗体BDAとからなるワクチンコンジュゲートを含む、IBDに対するワクチンである。Bursaplexは、家禽、特に、ニワトリにおいて、IBDに対する能動免疫を生成する。E18卵に、対照または試験ワクチン(1:1の比率でMagniplexを含むHVT-ND Pre-license serial)のいずれかをインオボ注射し、注射されなかった卵と共に、Biometricsによって指定されるように割り当てられた孵卵器に移した。孵化当日に、T04鳥に皮下ワクチン接種した。IBDV血清学のために、5日目、12日目、19日目、26日目、および33日目に、血液試料を集めた。34日目に、指定された鳥を、古典的な毒性が高いIBDVでチャレンジし、38日目に、全ての鳥を、嚢胞病変の存在について剖検した。T01陰性群のニワトリは、著しい観察可能な病変を発現せず、T02チャレンジ対照群のニワトリの100%が、著しい観察可能な病変を発現した。T03(HVT-ND+Magniplex、インオボ)およびT04(HVT-ND+Magniplex、SC)は、両方とも100%で保護された。Poulvac Procerta HVT-NDおよびPoulvac Magniplexは、一緒に投与されたときに適合性があり、インオボまたは皮下のいずれかで投与された場合に、IBDVチャレンジに対して依然として有効なままであると結論付けることができる。
MagniplexとのHVT-NDの適合性
IBD有効性
MAGNIPLEX(商標)(Zoetis)は、ウイルスに結合した、生きた弱毒化感染性ファブリキウス嚢病(IBD)株V877と、中和抗体BDAとからなるワクチンコンジュゲートを含む、IBDに対するワクチンである。Bursaplexは、家禽、特に、ニワトリにおいて、IBDに対する能動免疫を生成する。E18卵に、対照または試験ワクチン(1:1の比率でMagniplexを含むHVT-ND Pre-license serial)のいずれかをインオボ注射し、注射されなかった卵と共に、Biometricsによって指定されるように割り当てられた孵卵器に移した。孵化当日に、T04鳥に皮下ワクチン接種した。IBDV血清学のために、5日目、12日目、19日目、26日目、および33日目に、血液試料を集めた。34日目に、指定された鳥を、古典的な毒性が高いIBDVでチャレンジし、38日目に、全ての鳥を、嚢胞病変の存在について剖検した。T01陰性群のニワトリは、著しい観察可能な病変を発現せず、T02チャレンジ対照群のニワトリの100%が、著しい観察可能な病変を発現した。T03(HVT-ND+Magniplex、インオボ)およびT04(HVT-ND+Magniplex、SC)は、両方とも100%で保護された。Poulvac Procerta HVT-NDおよびPoulvac Magniplexは、一緒に投与されたときに適合性があり、インオボまたは皮下のいずれかで投与された場合に、IBDVチャレンジに対して依然として有効なままであると結論付けることができる。
ND有効性
E18卵に、対照または試験ワクチン(1:1の比率でMagniplexを含むHVT-ND)のいずれかをインオボ注射し、注射されなかった卵と共に、Biometricsによって指定されるように割り当てられた孵卵器に移した。孵化当日に、T04鳥に皮下ワクチン接種した。NDV血清学のために、6日目、13日目、20日目、および27日目に、血液試料を集めた。28日目に、指定された鳥を、短潜伏期性NDVでチャレンジし、42日目に、生き残っている全ての鳥を死亡させた。T01陰性群のニワトリは、臨床徴候を発現せず、T02チャレンジ対照群のニワトリの100%が、死亡率を含め、ニューカッスル病の臨床徴候を発現した発現した。T03(HVT-ND+Magniplex、インオボ)およびT04(HVT-ND+Magniplex、SC)は、それぞれ、92.5%および95%保護された。Poulvac Procerta HVT-NDおよびPoulvac Magniplexは、一緒に投与されたときに適合性があり、インオボまたは皮下のいずれかで投与された場合に、NDVチャレンジに対して依然として有効なままであると結論付けることができる。
E18卵に、対照または試験ワクチン(1:1の比率でMagniplexを含むHVT-ND)のいずれかをインオボ注射し、注射されなかった卵と共に、Biometricsによって指定されるように割り当てられた孵卵器に移した。孵化当日に、T04鳥に皮下ワクチン接種した。NDV血清学のために、6日目、13日目、20日目、および27日目に、血液試料を集めた。28日目に、指定された鳥を、短潜伏期性NDVでチャレンジし、42日目に、生き残っている全ての鳥を死亡させた。T01陰性群のニワトリは、臨床徴候を発現せず、T02チャレンジ対照群のニワトリの100%が、死亡率を含め、ニューカッスル病の臨床徴候を発現した発現した。T03(HVT-ND+Magniplex、インオボ)およびT04(HVT-ND+Magniplex、SC)は、それぞれ、92.5%および95%保護された。Poulvac Procerta HVT-NDおよびPoulvac Magniplexは、一緒に投与されたときに適合性があり、インオボまたは皮下のいずれかで投与された場合に、NDVチャレンジに対して依然として有効なままであると結論付けることができる。
Claims (59)
- 組換えシチメンチョウヘルペスウイルス(HVT)ゲノムであって、前記HVTゲノムのユニークロング(UL)領域中の遺伝子間遺伝子座UL35/UL36内に挿入された1つ以上の異種抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列を含む、組換えHVTゲノム。
- 組換えシチメンチョウヘルペスウイルス(HVT)ゲノムであって、前記HVTゲノムのユニークロング領域中の遺伝子間遺伝子座UL35/UL36内に挿入された1つ以上の異種抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列と、前記HVTゲノムのユニークロング領域(UL)中のUL55/Gene3部位に挿入された1つ以上の異種抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列と、を含む、組換えHVTゲノム。
- 前記1つ以上の異種抗原が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)、およびトリインフルエンザウイルス(AIV)からなる群から選択される鳥病原体に対して保護性である、請求項1または2に記載の組換えHVT。
- 1つまたは1つ以上の異種抗原が、
a)前記伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のVP2、VP3またはVP4タンパク質、
b)前記ニワトリ貧血ウイルス(CAV)のVP1またはVP2タンパク質、
c)前記ニューカッスル病ウイルス(NDV)のF/HNキメラタンパク質、またはF、NP、P、M、HN、もしくはLタンパク質、
d)伝染性気管支炎ウイルス(IBV)のS1、S2またはMタンパク質、
e)前記伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)のgB、gC、gD、gE、gH、gIまたはgLタンパク質、および
f)前記トリインフルエンザウイルス(AIV)のHA、NA、NPまたはMタンパク質のうちのいずれかからなる群から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の組換えHVT。 - 前記1つ以上の異種抗原が、IBDVに対して保護性である、先行請求項のいずれか一項に記載の組換えHVT。
- 前記1つ以上の異種抗原が、IBDVの前記VP2タンパク質である、請求項5に記載の組換えHVT。
- 前記VP2タンパク質配列が、配列番号5または配列番号10を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされる、請求項6に記載の組換えHVT。
- 前記VP2タンパク質が、配列番号5または配列番号10を含むヌクレオチド配列によってコードされる、請求項6に記載の組換えHVT。
- 前記1つ以上の異種抗原または複数抗原が、ニューカッスル病ウイルス(NDV)に対して保護性である、請求項1~4のいずれか一項に記載の組換えHVT。
- 前記1つ以上の異種抗原が、NDVの前記Fタンパク質を含む、請求項9に記載の組換えHVT。
- NDVの前記Fタンパク質が、配列番号3を含む配列に対して少なくとも80%の配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされる、請求項10に記載の組換えHVT。
- NDVの前記Fタンパク質が、配列番号3を含むヌクレオチド配列によってコードされる、請求項10に記載の組換えHVT。
- 前記1つ以上の異種抗原が、NDVおよびIBDVに対して保護性である、先行請求項のいずれか一項に記載の組換えHVT。
- 前記少なくとも1つの異種抗原が、NDVの前記Fタンパク質およびIBDVの前記VP2タンパク質を含む、請求項13に記載の組換えHVT。
- NDVの前記Fタンパク質が、配列番号3を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされ、IBDVの前記VP2タンパク質が、配列番号5または配列番号10を含むヌクレオチド配列に対して少なくとも80%の配列同一性を含むヌクレオチド配列によってコードされる、請求項14に記載の組換えHVT。
- NDVの前記Fタンパク質が、配列番号3を含むヌクレオチド配列によってコードされ、IBDVの前記VP2タンパク質が、配列番号5または配列番号10を含むヌクレオチド配列によってコードされる、請求項14または15に記載の組換えHVT。
- 1つ以上の異種抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列を含む1つ以上の発現カセットを含むゲノムを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組換えHVT。
- 前記発現カセットが、1つ以上のプロモーターを含む、請求項17に記載の組換えHVTゲノム。
- 前記1つ以上のプロモーターが、前初期サイトメガロウイルスヒト(hCMV)プロモーター、モルモット前初期CMVプロモーター、マウス前初期CMVプロモーター、Pecプロモーター、β-ニワトリアクチンプロモーター、SV40プロモーター、糖タンパク質Xプロモーターの仮性狂犬病ウイルスプロモーター、単純ヘルペスウイルス-1アルファ4プロモーター、糖タンパク質gA、gC、gB、gE、またはgIプロモーターのマレック病ウイルスプロモーター、糖タンパク質gB、gE、gI、gDプロモーターの伝染性喉頭気管炎ウイルスプロモーター、およびウシヘルペスウイルス1/1 VP8プロモーターからなる群から選択される、請求項18に記載の組換えHVT。
- 前記1つ以上のプロモーターが、前記ヒトCMVプロモーターを含む、請求項19に記載の組換えHVT。
- 前記1つ以上のプロモーターが、前記マウスCMVプロモーターを含む、請求項19に記載の組換えHVT。
- 前記1つ以上のプロモーターが、前記hCMVプロモーターおよびmCMVプロモーターを含む、請求項19に記載の組換えHVT。
- 請求項1~22のいずれか一項に記載の組換えHVTゲノムをコードする、単離されたDNA。
- 薬学的に許容される担体、賦形剤、またはアジュバントをさらに含む、請求項1~23のいずれか一項に記載の組換えHVTを含む、免疫原性組成物。
- 薬学的に許容される担体、賦形剤、またはアジュバントをさらに含む、請求項1~23のいずれか一項に記載の組換えHVTを含む、ワクチン組成物。
- 天然弱毒化MDV-1株Rispens(CVI-988)、またはGallidヘルペスウイルス3株SB-1ウイルスからなる群から選択される追加のマレック病ウイルス(MDV)をさらに含む、請求項25に記載のワクチン。
- 前記追加のMDVが、組換えゲノムを含む、請求項26に記載のワクチン。
- 前記組換えMDVゲノムが、1つ以上の鳥病原体に対して保護性である1つ以上の異種抗原をコードする1つ以上のヌクレオチド配列を含む、請求項27に記載のワクチン。
- 1つ以上の鳥病原体によって引き起こされる1つ以上の疾患に対する鳥へのワクチン接種における使用のための、請求項25~28のいずれか一項に記載のワクチン。
- 1つ以上の鳥病原体によって引き起こされる臨床症状に対する鳥の保護における使用のための、請求項25~28のいずれか一項に記載のワクチン。
- マレック病ウイルスによって引き起こされる臨床症状、および1つ以上の鳥病原体によって引き起こされる臨床症状に対する鳥の保護における使用のための、請求項25~28のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記1つ以上の鳥病原体が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)、およびトリインフルエンザウイルス(AIV)からなる群から選択される、請求項29~31のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記1つ以上の鳥病原体が、前記ニューカッスル病ウイルスを含む、請求項32に記載のワクチン。
- 前記1つ以上の鳥病原体が、前記伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)を含む、請求項32に記載のワクチン。
- 前記1つ以上の鳥病原体が、前記ニューカッスル病ウイルスおよび前記伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスを含む、請求項32に記載のワクチン。
- 前記ワクチンが、スプレー投与、インオボ(in ovo)投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、経鼻投与、またはそれらの組み合わせによる前記ワクチンの少なくとも1回以上の投与によって投与される、鳥へのワクチン接種における使用のための請求項25~35のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記ワクチンが、インオボ投与によって投与される、請求項36に記載のワクチン。
- 前記インオボ投与が、発生から約16~22日の間に発育卵(embryonated egg)で行われる、請求項37に記載のワクチン。
- 前記インオボ投与が、発生から約18日目に発育卵で行われる、請求項36~38のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記ワクチンの前記投与が、インオボ投与、その後のスプレー投与を含む、請求項36~39のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記ワクチンの前記投与が、スプレー投与を含む、請求項36に記載のワクチン。
- マレック病および1つ以上の鳥病原体によって引き起こされる1つ以上の鳥疾患を治療または予防するために鳥にワクチン接種する方法であって、有効量の請求項25~35のいずれか一項に記載のワクチン組成物を投与するステップを含む、方法。
- 前記1つ以上の鳥病原体が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)、およびトリインフルエンザウイルス(AIV)からなる群から選択される、請求項42に記載の方法。
- 前記1つ以上の鳥病原体が、前記伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)を含む、請求項43に記載の方法。
- 前記1つ以上の鳥病原体が、前記ニューカッスル病ウイルス(NDV)を含む、請求項43に記載の方法。
- 前記1つ以上の鳥病原体が、前記伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)および前記ニューカッスル病ウイルス(NDV)を含む、請求項43に記載の方法。
- マレック病ウイルスおよび1つ以上の鳥病原体に対する免疫応答を鳥動物において誘導する方法であって、鳥に有効量の請求項24~35のいずれか一項に記載の免疫原性組成物またはワクチン組成物を投与するステップを含む、方法。
- 前記1つ以上の鳥病原体が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、伝染性気管支炎ウイルス(IBV)、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ILTV)、ニワトリ貧血ウイルス(CAV)、およびトリインフルエンザウイルス(AIV)からなる群から選択される、請求項47に記載の方法。
- 前記1つ以上の鳥病原体が、前記伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)を含む、請求項48に記載の方法。
- 前記1つ以上の鳥病原体が、前記ニューカッスル病ウイルス(NDV)を含む、請求項48に記載の方法。
- 前記1つ以上の鳥病原体が、前記伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)および前記ニューカッスル病ウイルス(NDV)を含む、請求項48に記載の方法。
- 前記投与が、スプレー投与、インオボ投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与または経鼻投与によって実施される、請求項42~51のいずれか一項に記載の方法。
- 投与経路が、インオボ投与を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記インオボ投与が、発生から約16~22日の間に発育卵で行われる、請求項53に記載の方法。
- 前記インオボ投与が、発生から約18日目に発育卵で行われる、請求項52~54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与経路が、インオボ投与、その後のスプレー投与を含む、請求項52~55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記投与経路が、スプレー投与を含む、請求項52に記載の方法。
- 前記鳥が、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、キジ、ダチョウ、ハトおよびウズラからなる群から選択される、請求項44~57のいずれか一項に記載の方法。
- 前記鳥が、ニワトリを含む、請求項58に記載の方法。
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