CN112048484A - 一株表达传染性法氏囊强毒株vp2蛋白的基因ⅶ型新城疫重组病毒和疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，公开了一株表达传染性法氏囊强毒株VP2蛋白的基因Ⅶ型新城疫重组病毒，所述重组病毒在病毒rDHN3mF的P基因和M基因之间插入VP2蛋白编码基因得到，所述VP2蛋白编码基因如序列表SEQ ID NO：2所述，所述病毒rDHN3‑mF的序列表如SEQ ID NO：1所述。该重组病毒为弱毒型、应用后具有较强烈的保护性免疫反应、是针对流行毒株的NDV/IBDV二联疫苗的具有实用性的潜在毒株，同时本发明还公开了该重组病毒的制备方法和疫苗。

Description

一株表达传染性法氏囊强毒株VP2蛋白的基因Ⅶ型新城疫重 组病毒和疫苗
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，特别涉及表达传染性法氏囊强毒株VP2蛋白的基因Ⅶ型新城疫重组病毒以及制备方法和疫苗。
背景技术
传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectious bursal diseasevirus,IBDV)引起的一种急性、高传染性、免疫抑制性疾病。该病毒有两种血清型即I型和II型血清型，但只有I型血清型对鸡有致病作用。它主要侵害3-6周龄雏鸡的中枢神经系统和法氏囊器官中的B细胞，引起法氏囊充血坏死，免疫抑制，继发其它感染性疾病，是造成全球家禽业重大损失的重要病原之一。
IBDV是一种具有二十面体核衣壳结构的无包膜双链RNA(dsRNA)病毒，属于双链RNA病毒科，双链RNA病毒属[1]。病毒基因组由大片段A和小片段B两段双链RNA组成。IBDV全基因组成如图1所示。
目前，商业鸡中的IBD是通过弱毒和灭活的IBDV疫苗来控制的。弱毒活疫苗存在一定的安全隐患，弱毒的活病毒在环境中的传播可以造成病毒突变和重组形成新的毒株，从而导致病毒变异[7,8]；但灭活疫苗在生产和使用方面更加耗时，耗力，成本更高[5,6]。如果使用病毒载体来表达IBDV则可形成二联苗达到一石击二鸟的效果，既节约成本又能降低安全隐患。研究表明，VP2是IBDV唯一的衣壳蛋白，也是IBDV主要的保护性抗原基因；VP2蛋白在病毒毒力、细胞嗜性、引起细胞调亡等方面起着重要的作用[2,3,4，9]。
新城疫病毒(NDV)是一种高度传染性和致命性疾病的病原体，已经影响全世界的家禽和其他禽类工业。NDV的强毒株能够在未接种疫苗的鸡中引起高死亡率(高达100％)[10]。该病引起的主要临床症状包括呼吸困难、高热、下痢、神经紊乱和黏膜出血等[11]。NDV是副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)禽副黏病毒Ⅰ型(Avian Paramyxovirus typeⅠ，APMV-1)的唯一成员⑴。NDV属于不分节段的单股负链RNA病毒[12]。该基因组包含的3'-前导序列和5'-尾部序列，是病毒转录和复制所必需的[13]。NDV具有六个结构蛋白：即核衣壳蛋白NP(nucleocapsidprotein)、磷酸化蛋白P(phoshopprotein)、基质蛋白M(matrix protein)、融合蛋白F(fusion protein)、血凝素-神经氨酸酶蛋白HN(Hemagglutinin-Neuraminidase)和依赖RNA的RNA大聚合酶蛋白(Large RNA-dependent RNA polymerase protein L)[14]。
随着反向遗传技术的广泛应用，世界各地科学家己经证实了新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)作为控制人类和动物疾病的疫苗载体候选株的潜力。NDV作疫苗载体有以下优点：
①与痘病毒和疱疹病毒载体相比，NDV基因组编码的个结构蛋白数量少，仅6个，这有助于在免疫过程中产生针对目的基因的特异性免疫应答；
②NDV遗传相对比较稳定；
③NDV能够在鸡胚、许多禽类和非禽类的细胞系中高效复制；
④NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本低廉，便于规模化生产；
⑤NDV载体自身能够表达NDV抗原，能产生对全身和粘膜免疫的广泛性保护应答，并且在许多动物模型中被证实是安全的[15]。
参考文献如下：
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现有的新城疫病毒作为疫苗载体候选株大多为强毒株，其毒性高。
本发明所要解决的技术问题是：如何针对传染性法氏囊病、新城疫病毒开发出弱毒型的二联疫苗用的病毒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达传染性法氏囊强毒株VP2蛋白的基因Ⅶ型新城疫重组病毒表达传染性法氏囊强毒株VP2蛋白的基因Ⅶ型新城疫重组病毒，该重组病毒为弱毒型、应用后具有较强烈的保护性免疫反应、是针对流行毒株的NDV/IBDV二联疫苗的具有实用性的潜在毒株，同时本发明还公开了该重组病毒的制备方法和疫苗。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一株表达传染性法氏囊强毒株VP2蛋白的基因Ⅶ型新城疫重组病毒，所述重组病毒在病毒rDHN3mF的P基因和M基因之间插入VP2蛋白编码基因得到，所述VP2蛋白编码基因如序列表SEQ ID NO：2所述，所述病毒rDHN3-mF的序列表如SEQ ID NO：1所述。
在上述的重组病毒中，所述重组病毒由基因片段F1、F2、F3、F4通过同源重组的的方法得到质粒pBR322-DHN3mF-IBDVvp2，并将质粒pBR322-DHN3mF-IBDVvp2通过转染细胞得到；
所述基因片段F1的序列表如SEQ ID NO：3所述；
所述基因片段F2的序列表如SEQ ID NO：4所述；
所述基因片段F3为VP2蛋白编码基因；
所述基因片段F4的序列表如SEQ ID NO：5所述。
同时本发明还公开了一种如上所述的重组病毒的制备方法，包括如下步骤：
将基因片段F1、F2、F3、F4进行同源重组得到重组产物pBR322-DHN3mF-IBDVvp2；
将质粒pBR322-DHN3mF-IBDVvp2通过转染细胞得到重组病毒。
在上述的重组病毒的制备方法中，重组过程中各物质用量为：30ng基因片段F1、97ng基因片段F2、30ng基因片段F3、200ng基因片段F4、4μl5xCEMultiSBuffer、2μlExnaseMultiS，ddH2O添加至20μl；
反应条件为37℃反应30分钟。
在上述的重组病毒的制备方法中，转染过程中，转染的细胞为BHK-21细胞，转染试剂的各组分如下：
A液：Opti-MEM Medium 150μl,Lipofectamine LTX Reagent 15μl；
B液：Opti-MEM DNA 175μl，pBR322-DHN3mF-IBDVvp2 4μg，pXJ40-NP 2.5μg，pXJ40-P1.25μg，pXJ40-L 1.25μg，pXJ40-DE3 3μg，PLUS Reagent 3.5μl；
pXJ40-NP，pXJ40-P、pXJ40-L、pXJ40-DE3的制备可参考CN201910894754.9，一种针对II类VII型流行NDV株DHN3的感染性重组克隆方法中说明书108-153段；
A液和B液各150μl。
在上述的重组病毒的制备方法中，转染的操作如下：
(1)将BHK-21细胞培养于30mm瓶皿，24h之内用Lipofectamine LTX DNATransfection Reagents转染试剂盒进行转染；
(2)转染试剂配制如下：
A液静置5min；B液吹打混匀，静置5min；
取A液B液各150μl混合均匀得到混合液，静置20min；
取250μl混合液转染BHK-21细胞得到转染细胞；
(3)4天后将上述转染细胞置-80℃冻存得到冻存细胞；
(4)将该冻存细胞反复冻融3次，4℃10000/rpm离心5分钟得到含病毒的病毒液。
最后，还公开了一种疫苗，含有如上所述的重组病毒。
本发明的有益效果在于：
本发明将传染性法氏囊病毒IBDVLYZS株的VP2基因通过DNA重组的方法插进新城疫基因VII型DHN3mF弱毒株的M和P基因之间，构建了一株感染性cDNA克隆pBR322-DHN3mF-IBDVvp2。
将该克隆cDNA与pXJ40-NP，pXJ40-，pXJ40-L，pXJ40-DE3共转染BHK-21细胞，成功获得一株稳定的能高效表达IBDVVP2和NDV抗原蛋白的重组病毒rDHNmF-IBDVvp2。
该病毒有望进一步开发成抗IBDV和抗NDV的二联疫苗，为控制鸡传染性法氏囊病和新城疫提供新的防御方法。
附图说明
图1为背景技术中IBDV全基因结构图谱。
图2为本发明的基因片段F1、F2的跑胶图谱；
图3为本发明的基因片段F3的跑胶图谱；
图4为本发明的基因片段F4的跑胶图谱；
图5为本发明的单菌落筛选结果图；
图6为本发明的质粒pBR322-DHN3mF-IBDVvp2的跑胶图谱；
图7为BHK-21细胞感染病毒和未感染病毒的图像；
图8为重组病毒RT-PCR产物跑胶图谱；
图9为重组毒rDHN3mF-IBDVvp2的F1、F5、F10代鸡胚尿囊液中提取RNA并用其进行RT-PCR产物跑胶图谱；
图10为WB验证rDHN3mF-IBDVvp2病毒有高效表达IBDVvp2蛋白的蛋白胶图谱；
图11为WB验证rDHN3mF-IBDVvp2病毒有高效表达IBDVvp2蛋白的蛋白胶图谱；
图12为质粒pBR322-DHN3mF-IBDVvp2的质粒构造图；
图13为质粒pBR322-mFDHN3的质粒构造图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式说明本发明：但是可以理解这些具体的实施方式只是用于说明本发明，而不是对本发明的限制。本领域的技术人员完全可以在本发明的启示下，对本发明的的具体实施方式或者技术特征进行改进，但这些经过改进或替换的技术方案，仍属于本发明的保护范围。
实施例一
一、实验材料
主要仪器设备
电热恒温培养箱HZ-100(一恒科学仪器有限公司，中国上海)；三孔电热恒温水槽DK-8D(一恒科学仪器有限公司,中国上海)；海尔BCD-579WE冰箱(海尔，中国上海)；CO2恒温培养箱Forma371(Thermo公司，美国)；超净工作台SW-CJ-2FD(苏州安泰空气技术有限公司，中国江苏)；生物安全柜1300SERIESA2(Thermo公司，美国)；倒置光学显微镜(Nikon公司，日本)；高速离心机Centrifuge5804R(Eppendorf公司，德国)；移液器Researchplus(Eppendorf公司，德国)；PCR仪C1000Touch(Bio-Rad公司，美国)；电泳仪PowerPacBasic(Bio-Rad公司，美国)；垂直电泳槽MiniProteanTetra(Bio-Rad公司，美国)；凝胶成像系统2500(R)(Tanon公司，中国上海)；超纯水仪Milli-Q(Millipore公司，美国)；超低温冰箱Forma994(Thermo公司，美国)；核酸蛋白分析仪NanoDrop2000(Thermo公司，美国)；生化培养箱LRH-250(一恒科学仪器有限公司，中国上海)；分析天平BSA224S(Sartorius公司，德国)；涡旋振荡器(Thermo公司，美国)；AzureBiosystemsC600多功能分子成像系统(AzureBiosystems公司，美国)。
主要试剂和材料
TIAN prep Mini Plasmid Kit(DP103-03)购自天根生化科技(北京)有限公司；Gel Extraction Kit(D2500-02)购自OMEGA；M-MLVRT(2641A)购自TAKARA；RRI(2313A)购自TAKARA；Agarose(E0301)购自TSINGK；0.25％Trypsin-EDTA(25200-056)，DMEM basic(C11995500BT)购自Gibco；Lipofectamine LTX and Plus Reagent(15338-100)购自Invitrogen；FBS(10099-141C)购自Gibco；Premix-Taq(RR902A)购自TAKARA；Pen Streppenicillin Streptomycin(15140-122)购自Gibco；Prime STAR GXL(R050)购自TAKARA；BtgZ1(R0703S)，高浓度T4 DNA Ligase(M0202M)购自NEB；T4连接酶及其他常用限制性内切酶均购自TAKARA；ClonExpress Multis One Step Cloning Kit(C113)购自南京诺维赞生物制品有限公司；Trizol 15596-026购自Invitrogen；氯仿，异丙醇，无水乙醇等生化试剂购自宁波萃英化学技术有限公司；10xSDS-PAGE电泳液购自碧云天；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)购自碧云天；IRDye 680RD Goat anti-Mouse(926-68070)购自LIC，TBS缓冲液购自博士德生物公司。pBR322-DHN3mF，pXJ40-NP，pXJ40-P，pX J40-L，pXJ40-DE3均为华农(肇庆)生物技术研究院提供。PUC57-VP2购自金唯智(广州)生物科技有限公司；DH5α、SOC培养基购自TAKARA；LB平板固体培养基购自海博生物(产品编号：HB0128)。
二、试验过程
1.构建表达IBDV强毒株VP2基因的新城疫病毒重组质粒pBR322-DHN3mF-IBDVvp2
(1)以质粒pBR322-mFDHN3载体为模板用分别用引物：FDHN3-F1(序列表SEQ IDNO：6)/FDHN3-SmaI-R1(序列表SEQ ID NO：7)、FDHN3-SmaI-F2(序列表SEQ ID NO：8)/FDHN3-R2(序列表SEQ ID NO：9)扩增长度为1463bp的F1片段，长度为4845bp的F2片段。
以PUC57-VP2载体为模板，用引物VP2-F(序列表SEQ ID NO：10)/VP2-R(序列表SEQID NO：11)扩增1个长度为1366bp的F3片段。F3片段即为VP2蛋白编码基因，F3片段；VP2蛋白的氨基酸序列为参考SEQ ID NO：16。
PUC57-VP2是从金唯智生物公司合成的含IBD VLYZS株VP2编码基因的质粒(引物序列和VP2序列见附表，昆虫细胞表达的该IBDV LYZS株VP2具有很强的抗原活性，能针对IBDV BC6/85攻毒产生良好的保护反应(专利号：CN201110442781.6))。
上述PCR反应条件如下：
PCR反应液的配制参考表1：
表1：PCR反应液配方
5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μl
1×dNTP Mixture(2.5mM each) 4μl
Primer 1 10pmol
Primer 2 10pmol
Template 1μl
GXL DNA Polymerase 1μl
ddH<sub>2</sub>O up to 50μl
PCR反应参数如下：
98℃30s、98℃10s、60℃15s、68℃10s/kb、68℃5min；
98℃10s、60℃15s、68℃10s/kb循环35次。
用SmaI酶切pBR322-mFDHN3载体，通过胶纯化13996bpDNA片段F4；
基因片段F1、F2、F3、F4跑电泳后的条带图参考图2-4。
图2中，F1片段回收大小：1463bp，F2片段回收大小：4845bp。
图3中，F3片段为VP2的回收片段大小：1366bp；
图4中，F4是质粒pBR322-mFDHN3经SmaI酶切回收大小：13996bp；
其中，质粒pBR322-mFDHN3载体的制备方法为：
用SmaI酶切质粒pBR322-DHN3(质粒pBR322-DHN3的制备可参考CN201910894754.9，一种针对II类VII型流行NDV株DHN3的感染性重组克隆方法中说明书第182段至208段，3.1.4构建全基因组表达载体pBR322-DHN3),通过0.8％琼脂糖凝胶电泳回收目的片段(13399bp)待用。酶切方法按说明书进行。
用两对引物change-F1-F/change-F1-R和change-F2-F/change-F2-R以pBR322-DHN3为模板扩增目的片段。引物中包含突变的F碱基序列和与SmaI酶切质粒同源的同源序列，两对PCR产物互含有同源臂(详见下面序列表)。第一对引物的PCR产物为3190bp；第二对引物的PCR产物为3106bp；。
表1构建质粒pBR322-mFDHN3的引物序列
Figure BDA0002603058430000091
注：斜体序列为酶切位点，加粗序列为同源序列，当酶切位点同为同源序列时斜体加粗
将PCR产物纯化后与SmaI酶切后的质粒在重组酶的作用下同源重组，获得含mF的质粒pBR322-mFDHN3。
pBR322-mFDHN3质粒构造见下图13。同源重组反应方法按说明书进行。
(2)将上述4个片段共同进行如下同源重组(重组试剂盒购自南京诺维赞ClonExpressMultis One Step Cloning Kit，C113)：
同源重组的试剂如下表2：
表2同源重组的试剂
Figure BDA0002603058430000092
Figure BDA0002603058430000101
在冰上制备好上述体系后在37℃反应30分钟，得到重组产物。
(3)将重组产物转化进DH5α感受态细胞。
(a)在冰上解冻DH5α感受态细胞，取10μl重组产物加入到50μl DH5α感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。
(b)42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。
(c)加入1ml SOC培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。
(d)将AMP+的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。
(e)取100μl的细菌液用无菌涂板棒轻轻涂在含有AMP+抗性的平板固体培养基上。
(f)37℃培养箱中倒置培养12-16h。
(4)菌落PCR进行筛选
用引物VP2-R/FDHN3-Smal-R1；正确产物为2858bp.
总共筛选24个单菌落，16呈阳性，具体可参考图5中单菌落筛选的图。
(5)Btgzl酶切进行质粒鉴定。
分别取上述5个阳性菌落(1，2，4，5，6)进行扩增培养，提取质粒DNA。分别用BtgzI(购自NEB)酶切，反应如下，反应所用试剂参考表3。
表3：质粒鉴定所用试剂
试剂 用量
Buffer 2μl
质粒DNA 400ng
BtgzI 1μl
ddH<sub>2</sub>O upto20μl
正确的质粒用Btgzl酶切后应分别产生1个10517bp，4376bp，3960bp，1816bp和288bp的DNA片段。
酶切结果如下图6，2号质粒产生了正确的5个片段。
将2号质粒进行测序验证，结果证明该质粒含正确的插入序列，命名为pBR322-DHN3mF-IBDVvp2。
2.转染BHK细胞,拯救病毒
(1)将BHK-21细胞培养于30mm瓶皿，24h之内用Lipofectamine LTX DNATransfection Reagents转染试剂盒，并严格按试剂盒指导方法进行转染。
(2)转染试剂配制如下：
A液：Opti-MEM Medium 150μl,Lipofectamine LTX Reagent 15μl,静置5min；
B液：Opti-MEM DNA 175μl，pBR322-DHN3mF-IBDVvp2 4μg，pXJ40-NP 2.5μg，pXJ40-P1.25μg，pXJ40-L1.25μg，pXJ40-DE3 3μg，PLUS Reagent 3.5μl，吹打混匀，静置5min。
pXJ40-NP，pXJ40-P、pXJ40-L、pXJ40-DE3的制备可参考CN 201910894754.9，一种针对II类VII型流行NDV株DHN3的感染性重组克隆方法中说明书108-153段。
取A液B液各150μl混合均匀，静置20min。取250μl混合液用于转染细胞。
(3)4天后将上述转染细胞(包括培养液)置-80℃冻存。
(4)将该冻存细胞反复冻融3次，4℃10000/rpm离心5分钟。
取200μl上清液感染BHK-21细胞,该上清液中含有病毒rDHN3mF-IBDVvp2。
48h后可见大量细胞死亡。如下图7所示：A感染细胞；B未加病毒液的阴性对照细胞。分别从A,B细胞提取总RNA用于下述病毒鉴定试验。
3.鉴定重组病毒
(1)RT-PCR
用上述A和B细胞总RNA进行RT-PCR。
RT:使用Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(Takara 2641A)并严格按照说明书进行。
A.Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液，总量6μl。配方如表4；
表4：RNA/引物混合液配方
试剂名称 使用量
模板RNA 100ng
Random Primers(25μM) 2μl
RNase free H<sub>2</sub>O Up to 20μL
B.70℃10分钟后迅速在冰上冷却2-3min。
C.在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，配方如表5；
表5：反转录反应液配方
Figure BDA0002603058430000121
置37℃，反应1小时。
PCR：分别用引物F-F(SEQ ID NO：14)/F-R(SEQ ID NO：15)和引物VP2-R/FDHN3-SmaI-R1进行。
PCR体系配方如表5；
表5PCR体系配表
Figure BDA0002603058430000122
Figure BDA0002603058430000131
PCR反应条件如下：
95℃3min、95℃30s、56℃30s、72℃1min/kb、72℃5min；
95℃30s、56℃30s、72℃1min/kb循环30次。
分别取10μl PCR产物跑胶，结果如图8所示：图8中1和3为A样的PCR产物，2和4为B样的PCR产物。1和2为第一对引物的PCR产物，正确应为844bp；3和4为第二对引物的PCR产物，正确应为2858bp；结果显示A样品产生了正确大小的PCR产物。
(2)扩增病毒
用上述rDHN3mF-IBDVvp2 P0代病毒200μl接种SPF鸡胚并连续传代10次，收获各代鸡胚尿囊液于-800℃保存。
(3)RT-PCR和测序验证rDHN3mF-IBDVvp2重组病毒的稳定性
分别从重组毒rDHN3mF-IBDVvp2的F1、F5、F10代鸡胚尿囊液中提取RNA并用其进行RT-PCR。方法和前述一致。
PCR：引物为M-F(SEQ ID NO：12)/P-R(SEQ ID NO：13)；正确产物应为1985bp。
结果如下图9所示，3个样本均产生了正确大小的PCR产物。将其分别送去测序，结果证实均为正确的DNA序列，提示该重组病毒是相对稳定的。
4.WB验证rDHN3mF-IBDVvp2病毒有高效表达IBDVvp2蛋白
用正常鸡胚尿囊液(1)，感染IBDV鸡胚尿囊液(2)和感染rDHN3mF-IBDVvp2尿囊液(3)跑12％蛋白胶并进行WB检测。结果参考图10，显示如下：用抗IBDVvp2抗血清能检测到约40kD大小的蛋白，该蛋白在蛋白胶上显示与IBDV感染产物具相同的大小和形态。
用正常鸡胚尿囊液(1)，感染DHN3mF鸡胚尿囊液(2)和感染rDHN3mF-IBDVvp2尿囊液(3)跑12％蛋白胶并进行WB检测。结果参考图11，结果显示如下：用抗DHN3mF抗血清能检测到约55kD大小的蛋白。该蛋白与DHN3mF感染产物相似。
详细方法如下：
测IBDV-VP2：
将BHK-21细胞置6孔培养皿培养至90％，PBS洗两遍，分别加入2ml0.1％trypsin-DMEM孵育液，用2MOI IBDV鸡胚尿囊液，或2MOI rDHN3mF-IBDVvp2鸡胚尿囊液感染BHK-21细胞。阴性对照加200μl SPF鸡胚尿囊液。24h后收集细胞，加入300μl的2×SDS裂解液和30μl的1M DTT，95℃沸水裂解10min后，12000×g离心10min，取上清10μl进行12％SDS-PAGE(Bio-Rad)。后将蛋白电转移到NC膜上(Ameresco)。5％脱脂乳封闭过夜，TBST(0.05％Tween20)洗涤四次，每次5min。加入1﹕1000倍稀释的IBDV-VP2单抗室温孵育1h。TBST洗涤四次，每次5min。加1﹕10000倍TBST稀释的二抗IRDye 680RD Goat anti-Mouse(926-68070)，室温孵育1h。TBST洗涤四次，每次5min。用Azure Biosystems C600多功能分子成像系统成像。
测NDV蛋白
将BHK-21细胞置6孔培养皿培养至90％，PBS洗两遍，分别加入2ml0.1％trypsin-DMEM孵育液，用2MOI DHN3鸡胚尿囊液，或2MOI rDHN3mF-IBDVvp2鸡胚尿囊液感染BHK-21细胞。阴性对照加200μl SPF鸡胚尿囊液。24h后收集细胞，加入300μl的2×SDS裂解液和30μl的1M DTT，95℃沸水裂解10min后，12 000×g离心10min，取上清10μl进行12％SDS-PAGE(Bio-Rad)。后将蛋白电转移到NC膜上。5％脱脂乳封闭过夜，TBST(0.05％Tween20)洗涤四次，每次5min。加入1﹕1000稀释的NDV阳性血清室温孵育1h。TBST洗涤四次，每次5min。加1﹕10000倍TBST稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗鸡Ig G(LIC)室温孵育1h。TBST洗涤四次，每次5min。加入超敏ECL化学发光显色液。用Azure Biosystems C600多功能分子成像系统成像。
四.结论
我们将传染性法氏囊病毒IBDVLYZS株的VP2基因通过DNA重组的方法插进新城疫基因VII型DHN3-mF弱毒株的M和P基因之间，构建了一株感染性cDNA克隆pBR322-DHN3mF-IBDVvp2。将该克隆cDNA与pXJ40-NP，pXJ40-P，pXJ40-L，pXJ40-DE3共转染BHK-21细胞，成功获得一株稳定的能高效表达IBDVVP2和NDV抗原蛋白的重组病毒rDHNmF-IBDVvp2。该病毒有望进一步开发成抗IBDV和抗NDV的二联疫苗，为控制鸡传染性法氏囊病和新城疫提供新的防御方法。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一株表达传染性法氏囊强毒株VP2蛋白的基因Ⅶ型新城疫重组病毒和疫苗
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 15192
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
accaaacaga gaatccgtga ggtacgataa aaggcgaaga agcaatcgag atcgtacggg 60
tagaaggtgt gaaccccgaa cgcgagatcg aagcttgaac ctgagggaac cttctaccga 120
tatgtcgtct gtttttgacg aatacgagca gctccttgct gcccagaccc gccctaacgg 180
agcccatgga gggggagaga aagggagcac cttaaaagtt gaggtcccag tatttaccct 240
aaacagtgat gatccagagg atagatggaa ctttgcggta ttctgtcttc ggattgccgt 300
tagtgaggat gccaacaaac cactcaggca aggtgctctt atatccctct tatgctccca 360
ttctcaggtg atgagaaacc atgttgccct tgcaggaaaa cagaacgagg ccacactagc 420
tgttcttgag atcgatggtt ttgctaataa tgtgccccag ttcaacaata ggagtggagt 480
gtccgaggag agagcacaga gattcatggt aattgcaggg tctctccctc gggcatgcag 540
caacggtact ccgtttgtca cggctggggt tgaagatgat gcaccagaag atatcactga 600
cactctggaa aggatcctat ctgtccaagt ccaagtatgg gtcacggtag caaaggccat 660
gactgcatat gagacagcag atgagtcaga aacaagaaga ataaataagt atatgcagca 720
gggtagagtc cagaagaagt acatccttca tcctgtatgc aggagtgcaa ttcaactcat 780
aatcagacat tctctggcag tccgtatttt cctggttagt gagctcaaga ggggccgtaa 840
tacagcaggt gggagctcta catattacaa tttggtcggg gatgtagact catacatcag 900
aaataccggg cttactgcgt ttttcctaac actcaaatat ggaatcaata ccaagacgtc 960
agctctcgca ctcagcagcc tcacaggtga tatccaaaaa atgaaacagc tcatgcgttt 1020
atatcggatg aaaggtgaaa atgcaccata catgacattg ttaggtgaca gtgaccagat 1080
gagctttgcg ccagccgaat atgcacaact ttattctttt gccatgggca tggcatcagt 1140
cttagataag ggaactggca agtaccaatt tgccagggac tttatgagca catcattctg 1200
gcgacttgga gtagagtatg ctcaggctca gggaagtagt atcaatgaag acatggctgc 1260
tgagttaaaa ctaaccccag cagcaaggag aggcctggca gctgctgccc aacgagtatc 1320
tgaagaaatc ggcagcatgg acattcctac tcaacaagca ggagtcctca ccgggctcag 1380
tgacgaaggc ccccgaactc cacagggtgg atcgaacaag ccgcaagggc aaccagatgc 1440
tggggatggg gagacccaat tcctggattt tatgagaaca gtggcgaaca gcatgcggga 1500
atcgcctaat cctgcacaga gcaccactca tctagagcct cccccgaccc ctggggcatc 1560
ccaagacaac gacactgact gggggtactg atcgactact cccagcctgc ctccatagga 1620
ccacaccaaa cccctccccc aaaacccccc cacacccccc gacccacaac cccgcacgac 1680
ccccccaaca aaagctcccc cccaccctct cccccacccc cagccacacg accccatcca 1740
cccgggacaa cacaggcaca gctcggccag tcaacaatcc tcccagagtc caaggtatta 1800
gaaaaaaata cgggtagaag agagacatcc agagaccagg acgggtcacc aagctctctg 1860
ttctcccttc tacccggtga gttagggtga agatggctac ctttacagat gcggagatag 1920
atgacatact tgagaccagt gggactgtca ttgatagcat aattacggcc cagggcaaat 1980
cagccgagac cgtcggaaga agtgcgatcc cgcagggcaa gaccaaagct ccaagcacag 2040
cacgggagaa gcacgggagt gcccagccac acgccagtca ggacgtcccc gaccaacaag 2100
acagaacaga aaaacagcca tccacacctg agcaggcaac cccacacaac aacccaccga 2160
ccacacccac cgaaccgccc tccacccagg ccgcaagcga gaccagcgac acacagctca 2220
aaaccggagc aagcaactcc cttctgtcca tgctcgacaa attaagcaat aaatcgtcta 2280
atgctaaaaa gggcccatgg tcgggtcccc aagaagggca tcaccaatct ccggcccaac 2340
aacacgggaa ccagtcgagc catggaagca accagggaag accacagcac caggtcaagg 2400
ccgtctctgg aaaccggggc atagacgaga acacagcata tcatggacaa cggaaggagt 2460
cacaaccatc agctggtgca acccctcatg cgccccagtc agggcagagc caagacaata 2520
ttcctgtacc tgtggatcgt gtccagctac ctgccgactt tgcgcaggcg atgatgtcta 2580
tgatggaggc attatctcag aaggtaagta aagttgatca tcagctggat ctggtcttga 2640
aacagacatc ctctattcct atgatacgat ctgaaatcca acagctcaag acatctgttg 2700
cgatcatgga agctaactta ggtatgatga aaattctgga ccctggttgt gccaacattt 2760
catctttaag tgatctccgg gcagtagccc gatcccaccc agtcctagtt tcgggccccg 2820
gagacccatc tccttacgtg acacaagagg gtgaaatgac gctcaataaa ctctcacaac 2880
cagtgcagca cccttctgaa ttgattaagt ctgccaccgc aagcgggcct gacatgggag 2940
tggagaagga cactgtccgc gcattaatca cctcacgccc gatgcatcca agctcctcgg 3000
ctaagctcct gagcaagcta gatgcagcca agtcaattga agagatcagg aagatcaagc 3060
gccttgcgct gaatggttga tggccgtcac aactcatagc aggctcctgt cgcttcagca 3120
tcacacggaa tcccccggga gccccccctt gcgaatccat gcttcaacac cccagacaac 3180
agccctctct caccatcccc aatccctcgc atgatcgcac aactgcaacc aatctagcag 3240
cattagagat taagaaaaaa cacgggtaga atcaaagtgc ctcgattgaa ccaaaatgga 3300
ctcatccagg acaatcgggc tgtactttga ttctgccctt ccttccagta gcctattagc 3360
atttccgatt atcttacaag atacaggaga cgggaagaaa caaatcactc cacaatacag 3420
gatccagcat cttgattcgt ggacagacag taaggaagac tcggtattta tcaccaccta 3480
cgggttcatc tttcaagttg ggaatgaagg agccactgtc ggtgtgatca atgacaatcc 3540
caggcatgag ctactctctt ccgcaatgct ctgcttaggg agtgtcccga acaacggaga 3600
tcttgttgag ctggcgagag cctgcctcac tatggtggta acctgcaaga agagtgcaac 3660
taacactgag agaatagtct tctcagtagt gcaggcacct cgagtgctgc aaaattgtat 3720
ggttgtgtca aatcggtact catcagtgaa tgcagtgaag catgtgaagg cgcccgaaaa 3780
gatccctggg agcggaaccc tagagtataa agtgaatttt gtctccttga ctgtggtgcc 3840
gagaagggat gtctacagga tcccaactac agtattgaaa gtgtctggct cgagcctgta 3900
caatcttgcg ctcaatgtca ctattgatgt ggacgtggat ccgaagagcc cgttagtcaa 3960
atccctttct aagtccgata gcgggtacta tgcgaatctt tttctgcata tcggacttat 4020
gtccactgta gataagagag gaaagaaagt gacatttgac aagatagagg aaaagataag 4080
gagactcaat ctatctgttg ggctcagtga tgtgctcgga ccctctgtgc ttgtgaaggc 4140
gagaggtgca cggactaagc tacttgctcc tttcttctct agcagtggga cagcctgcta 4200
tcctatagca aatgcctctc cccaggttgc caagatactc tggagccaga ccgcgcacct 4260
gcggagcgtg aaagtcatca ttcaagccgg cactcagcgt gctgttgcag tgaccgccga 4320
tcatgaggta acctccacta agatagagaa gaagcatgcc attgctaaat acaatccttt 4380
cagaaaatag gttacatccc taagactgca gttcacctgc tttcccgaat catcatgaca 4440
ccagataatg atccatctcg actgcttgta gttagttcac ctgtccagca aattagaaaa 4500
aacacgggta gaagagtctg gaccccgacc ggcacactca ggacacagca tgggctccaa 4560
accttctacc aggatcccag cacctctaat gctaatcact cgaattatgc tgatattgaa 4620
ctgcatccgt ctgacaagtt ctcttgacgg caggcccctt gcagctgcag gaattgtaat 4680
aacaggagat aaggcagtca atgtatatac ctcgtctcag acagggtcaa tcatagtcaa 4740
gttgctcccg aatatgccca gagataagga ggcatgtgca agagccccat tggaggcata 4800
taacagaaca ctgactactc tgctcactcc tcttggcgac tccattcgca agatccaagg 4860
gtctgtatcc acgtccggag gagggagaca ggggcgcctt ataggtgctg ttattggcag 4920
tgtagctctc ggggttgcaa cagcggcaca gataacagca gctgcggccc taatacaagc 4980
caaacagaat gctgccaaca tcctccggct taaggagagc attgctgcga ccaatgaagc 5040
tgtgcatgaa gtcaccgacg gattatcaca attatcagtg gcagttggga agatgcaaca 5100
gtttgtcaat gaccagttta ataacacggc gcgagaatta gactgcataa aaatcacaca 5160
acaggtcggt gtagaactca acctatacct aactgagcta actacagtat tcgggccaca 5220
gatcacctcc cctgcattaa ctcagctaac catccaggcg ctctataatt tagctggtgg 5280
caatatggac tacttattaa ctaagttagg tataggaaac aatcaactca gctcattaat 5340
tggtagcggc ctgatcactg gttaccctat actgtatgac tcacatactc aactcttggg 5400
catacaagtt aatctgccct cagtcgggaa cttaaataat atgcgtgcca cctatctgga 5460
gaccttatct gtaagtacaa ccaaaggata tgcctcagca ctggtcccga aagtagtgac 5520
acaagtcggt tctgtgatag aagagcttga cacctcatac tgtatagagt ccgatctgga 5580
tttatattgt actagaatag tgacattccc catgtctcca ggtatttatt cctgtttaag 5640
tggcaacaca tcagcctgca tgtattcaaa gactgaaggc gcactcacta cgccgtatat 5700
ggcccttagg ggctcagtta ttgctaattg taagataaca acatgcagat gtacagaccc 5760
tcctggcatc atatcgcaaa attatggaga agctgtatcc ctgatagata gacactcgtg 5820
caatgtctta tcattagacg gcataactct gaggctcagt ggggaatttg atgcaactta 5880
tcaaaagaac atctcaatat tagattctca ggtcatcgtg acaggcaatc ttgatatatc 5940
aactgaactt ggaaacgtca ataattcgat cagcaatgcc ttggacaagt tggcagaaag 6000
caacagcaaa ctagaaaaag tcaacgtcag actaactagc acatccgctc tcattaccta 6060
tattgttcta actgtcattt ccctaatttt cggtgcactt agtctggttt tagcgtgtta 6120
cctgatgtac aagcagaagg cacaacaaaa gaccctgtta tggcttggga acaataccct 6180
cgatcagatg agagccacca tgagagcatg aatgcaaata ggaagtggac ggacacccaa 6240
cggcagcccg tgtgtcaatt ccgataacct gtcaagtagg agacttaaga aaaaattact 6300
gggaacaagc aaccaaagag caatacacgg gtagaacggt cagaggagcc acccttcaat 6360
tgaaaattag gcttcacaac atccgttcta ccacaccacc aacaacaaga gtcaatcatg 6420
gaccgcgtgg ttaacagagt catgctggag aatgaagaaa gagaagcaaa gaacacatgg 6480
cgcttagttt tccggatcgc agtcttattt ttaatggtaa tgattctagc tatctctgcg 6540
gctgccctgg catacagcat ggaggccagt acgccacacg acctcgcagg catatcgact 6600
gtgatctcca agacagaaga taaggttacg tctttactca gttcaagcca agatgtgata 6660
gataagatat acaagcaggt agctcttgaa tccccgctgg cactattaaa caccgaatct 6720
gtaattatga atgcaataac ctctctttct tatcaaatta acggggctga gaacagtagc 6780
ggatgcggtg cgcccgttca tgacccagat tatatcgggg ggataggcaa agaactcata 6840
gtggacgaca ttagtaatgt cgcatcattt tatccttctg catatcaaga acacttgaat 6900
ttcatcccgg cacctactac aggatctggt tgcactcgga taccctcatt tgacatgggc 6960
accacccatt attgttatac tcacaatgtg atactatctg gttgcagaga tcactcacac 7020
tcacatcaat acctagcact tggtgtgctt cggacatctg caacagggag ggtattcttt 7080
tctactctgc gctccatcaa tttagatgac actcaaaatc ggaagtcttg cagtgtgagt 7140
gcaacccctt taggttgtga tatgctgtgc tctaaggtca cagggactga agaggaggat 7200
tacaagtcag ttgcccccac atcaatggtg cacggaaggc taggatttga cggtcaatac 7260
catgagaaag acttagacac cacggtctta tttaaggatt gggtggcaaa ttacccgggg 7320
gtgggaggag ggtcttttat tgacggccgt gtatggttcc cagtttacgg agggctcaaa 7380
cctaattcac ccagtgacat cgcacaagaa gggaaatatg taatatacaa gcgccataat 7440
aacacatgcc ccgataaaca agattaccaa attcggatgg ctaagtcctc atataaacct 7500
gggcgatttg gtggaaagcg cgtacagcaa gctatcctat ctatcaaagt gtcaacatcc 7560
ctgggtaagg acccggtgct gactattcca cctaatacaa tcacactcat gggagccgaa 7620
ggcagaatcc tcacagtagg gacatctcac ttcttgtatc aacgagggtc ttcatatttc 7680
tcccctgcct tattgtatcc catgacagta agtaacaaaa cggctacact ccatagtcct 7740
tacatgttta atgctttcac tcggccaggt agtgtccctt gccaggcatc agcaaggtgc 7800
cccaactcat gcatcactgg ggtctatacc gatccatatc ccttaatctt ctataggaat 7860
catactctac gaggggtctt cgggacgatg cttgatgatg aacaagcgag gcttaacccc 7920
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gacatgattg ttctgagtct cgctcactgt cactttatta agaaaaaaca caagaagcat 8340
tgacatataa gggaaaataa ccaacaagag agaacacggg taggacatgg cgggctccgg 8400
tcctgagagg gcagagcacc agatcatcct accagagtca catttatcct ctccattggt 8460
caagcacaaa ttgttatact actggaaatt aaccgggcta ccgcttcctg atgaatgcga 8520
ctttgatcat ctcattatca gcaggcaatg gaagagaata ctggagtcag ccactcctga 8580
cacagagaga atgataaaac ttgggcgggc ggtgcaccag actctcaacc acaattccaa 8640
gatgactgga gtgctccatc ccaggtgttt agaagaactg gctagtattg aggtccctga 8700
ttcaactaac aaattccgga agattgaaaa gaagatccag attcacaaca caagatatgg 8760
agacctgttc acaaagctgt gcgtgcaagt tgagaagaaa ttgctagggt catctctgtc 8820
taataatgtc ccacgatcag aggaattcaa cagcatccgt acagatccgg cattctggtt 8880
tcactcaaaa tggtccagag ccaagttcgc gtggctccat ataaaacaag tccaaaggca 8940
tctgattgta gcagcaagga caaggtctgc agtcaacaag ttagtaacat taaatcataa 9000
gataggccat gtctttatta ctcctgagct tgtcattgtg acacacacag acgagaacaa 9060
gttcacatgt ctcacccagg aacttgtatt gatgtatgcg gatatgatgg aaggcaggga 9120
catggtcaat ataatatctt ctacagcagc acatctcagg aacctatccg agaaaattga 9180
tgatattctg cggttagtag atgctctggc aaaggactta ggtaatcaag tctatgatgt 9240
tgtagcatta atggagggat ttgcatacgg tgccgttcag ctgcttgagc catcaggtac 9300
atttgcagga gatttctttg catttaacct acaggagctc aaaaacacgt taatcgaact 9360
tctccccaat aatatagcgg aagcagtaac tcacgctatt gccactgtat tctctggatt 9420
agaacagaac caagcagctg agatgttgtg cttgctgcgt ttgtggggtc atccattgct 9480
tgagtctcgt agtgcagcaa gagcagtcag gagccagatg tgcgcaccaa agatggtaga 9540
ctttgatatg atcctccagg tattatcttt ctttaaagga acaatcatca atggatacag 9600
aaaaaagaac tcaggtgtgt ggccacgcgt caaagtagat acaatatatg gaaatatcat 9660
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catgttccta aaagacaagg caatcgcaca tcctagtgat aactggctcg cctcatttag 9840
gcggaaccta ctctctgagg accagaagaa acagataaag gaggcaactt caactaaccg 9900
cctcctgata gagttcttag aatcaaatga ttttgatcca tataaagaaa tggaatacct 9960
gacaaccctc gagtacctaa gagatgacag tgtggcagta tcgtactcac tcaaagagaa 10020
agaggtgaaa gtgaatggac ggatttttgc taaattaaca aagaaactaa ggaattgcca 10080
ggtaatggca gaaggaattc tagctgacca gattgcacct ttcttccagg gaaatggggt 10140
cattcaagat agcatatcct tgacaaagag tatgttagca atgagtcaac tgtcctttaa 10200
cagcaataag aaacgtatcg ctgactgcaa agagagggtt tcctcaaacc gcaatcatga 10260
tcccaagagc aagaatcgta gaagagttgc cacctttatc acgactgacc tacaaaagta 10320
ttgtcttaac tggagatatc agacagtcaa actattcgcc catgccatca atcagctgat 10380
gggcctacct catttctttg agtggattca tcttaggctg atggacacta caatgtttgt 10440
aggggatcct ttcaatcctc caagtgaccc gaccgactgt gatctatcaa gagtcccaaa 10500
tgatgatata tatattgtca gtgctagagg gggcattgag ggactctgtc agaagctatg 10560
gacgatgatc tcaattgctg caatccaact tgccgcagca agatctcatt gtcgagttgc 10620
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ttccccggat atggtattga cgcagttgca tcaggctagt gataatttct tcaaggaatt 10740
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caaaaattca tctaaattgg tgctaatatc aggtgacctt agcgaaaaca ctgtaatgtc 10920
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gattgcactg actaggaggc ccctcggtat caaaagactg atgcggataa tcaattactc 11640
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tgcgaaaata gcccatatgt caccacatgt gaaagcagca ctaagggcat catccgtgtt 12060
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cagagtgtcg ccttacattc acatatccaa tgattctcaa aggctgttca ccgaagaagg 12300
ggtcaaagag ggaaacgtgg tttaccagca aattatgctc ttgggtttat ctctaattga 12360
gtcactcttc ccaatgacaa caaccagaac atacgatgag atcacattac acctccacag 12420
taaatttagc tgctgtatcc gagaagcgcc tgtcgcagtt cctttcgagc tcctcggact 12480
ggtaccggaa ttaaggatgg taacctcaaa taagttcatg tatgatccta gccctatatc 12540
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ccaatctgtg gtttcttatg atgaagatac ttctataaag aatgatgcta taatagtgta 12720
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gtatgatctg ctgtttccat ctgtcttaga tgataacctg aatgagaaga tgcttcaact 13140
aatttcccgg ttatgctgct tgtacacagt gctctttgct acaacaagag aaatcccaaa 13200
aataaggggc ctatcagcag aagagaaatg ctcaatactc actgagtatc tattgtcgga 13260
tgctgtaaaa ccgttgctta ggtccgaaca attgagttct atcatgtctc ccaacataat 13320
cacgttccca gccaatctat actacatgtc taggaagagc cttaatttga tcagagaacg 13380
agaggacaga gatactatct tgtcgttgtt gttccctcag gagtcactgc ttgagcttcg 13440
cccagtacgg gacattggtg ctcgagtgaa agacccgttt acccgacaac ccgcatcttt 13500
catacaagag ctggatctga gtgccccagc aaggtacgac gcgtttacac tgagtaagat 13560
ttgcttcgag cacacactac cgaacccaag ggaagattac ctagtacgat acttgttcag 13620
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tatcacatct gtagtaccct acaggtctgt atcattacta cattgtgaca ttgagattcc 14040
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cttccactta ctcatgaatt tattcactcc atgttccacg aaaggataca tactttccaa 14220
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cattgatgct gcactaattg aagccggggg acagcccgtc cgtccatttt gtgcagaaag 14520
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cacagtcatc cggtccgtga tttacatgga ggctgagggt gacctcgccg acacagtgtt 14640
cttattaact ccttacaatc tatccacaga cggtaaaaag agaacatcac ttaagcagtg 14700
caccaaacag atcttggaag tcacaatatt gggtctcaga gccaaagaca tcaataaaat 14760
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attctacatg aaaactatag gtaatgctgc caagggatat tacagtaata atgactctta 15000
aaggcaatcg tacaccaatc agttatcttc ttaactgatg actccctcat tgacttgatt 15060
ataccagatt agaaaaaagt taaattctga ctctttggaa ctcgtattcg gattcagtta 15120
gttaacttta agcaaaaatg cgcaaagtcg tctctaatca cagctatgtc attcaccaaa 15180
tctctgtttg gt 15192
<210> 2
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atgaccaacc tgcaagacca gacccagcag atcgtccctt tcatccgttc tctgctgatg 60
cctacgactg gtccagcatc tatcccagac gacactctgg agaaacacac gctgcgttct 120
gagactagca cttacaacct gacggtgggt gacactggta gcggtctgat cgtcttcttc 180
ccaggtttcc ctggtagcat cgtgggtgct cattacaccc tgcagagcaa cggtaactac 240
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ctggtatccc gttccctgac tgtacgtagc agcactctgc cgggtggcgt ttacgcactg 360
aatggtacta tcaacgcagt aaccttccag ggtagcctgt ctgagctgac tgacgtgtct 420
tacaacggcc tgatgtctgc aactgcaaac atcaacgaca agatcggtaa cgtgctggtc 480
ggtgagggtg tgaccgtact gtccctgccg acttcttacg acctgggtta cgtgcgtctg 540
ggtgacccga ttccggcaat tggtctggac ccgaagatgg tcgctacctg tgattcttcc 600
gatcgtccgc gtgtttatac tatcactgca gctgacgatt accagttctc ctcccagtac 660
caggccggtg gcgtaaccat taccctgttt tctgctaaca tcgacgctat caccagcctg 720
agcatcggtg gcgaactggt tttccaaacc agcgtgcagg gcctgatcct gggtgctact 780
atctatctga ttggcttcga tggcaccgct gtaatcaccc gtgctgttgc ggctgataat 840
ggtctgacgg cgggcaccga taatctgatg ccgtttaaca tcgtaatccc gacctctgaa 900
attacccagc cgatcacctc catcaaactg gaaattgtga cctccaaatc cggtggtcag 960
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tctgttgtta cggttgccgg cgtttctaac tttgaactga tcccgaaccc ggaactggcg 1140
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attctgtctg aacgcgatcg cctgggcatc aaaaccgttt ggccgacccg tgaatatacc 1260
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gcgttcggct tcaaagacat tattcgcgcg ctgcgctaa 1359
<210> 3
<211> 1471
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ctacccgtat tttttcttaa ggtgttgaag catggattcg caaggggggg ctcccggggg 60
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gtccttctcc actcccatgt caggcccgct tgcggtggca gacttaatca attcagaagg 300
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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gaagttcgat taacgtgttt ttgagctcct gtaggttaaa tgcaaagaaa tctcctgcaa 12060
atgtacctga tggctcaagc agctgaacgg caccgtatgc aaatccctcc attaatgcta 12120
caacatcata gacttgatta cctaagtcct ttgccagagc atctactaac cgcagaatat 12180
catcaatttt ctcggatagg ttcctgagat gtgctgctgt agaagatatt atattgacca 12240
tgtccctgcc ttccatcata tccgcataca tcaatacaag ttcctgggtg agacatgtga 12300
acttgttctc gtctgtgtgt gtcacaatga caagctcagg agtaataaag acatggccta 12360
tcttatgatt taatgttact aacttgttga ctgcagacct tgtccttgct gctacaatca 12420
gatgcctttg gacttgtttt atatggagcc acgcgaactt ggctctggac cattttgagt 12480
gaaaccagaa tgccggatct gtacggatgc tgttgaattc ctctgatcgt gggacattat 12540
tagacagaga tgaccctagc aatttcttct caacttgcac gcacagcttt gtgaacaggt 12600
ctccatatct tgtgttgtga atctggatct tcttttcaat cttccggaat ttgttagttg 12660
aatcagggac ctcaatacta gccagttctt ctaaacacct gggatggagc actccagtca 12720
tcttggaatt gtggttgaga gtctggtgca ccgcccgccc aagttttatc attctctctg 12780
tgtcaggagt ggctgactcc agtattctct tccattgcct gctgataatg agatgatcaa 12840
agtcgcattc atcaggaagc ggtagcccgg ttaatttcca gtagtataac aatttgtgct 12900
tgaccaatgg agaggataaa tgtgactctg gtaggatgat ctggtgctct gccctctcag 12960
gaccggagcc cgccatgtcc tacccgtgtt ctctcttgtt ggttattttc ccttatatgt 13020
caatgcttct tgtgtttttt cttaataaag tgacagtgag cgagactcag aacaatcatg 13080
tcagcattgt cggattgcgg ttgcccaaca acacgggatc ctgatttatg ctaatgttca 13140
gcttgactct aagcattatg ggagatgatt ggcgcaatgt cgtcctccca accatcctat 13200
gattggctca atcggccaag tctagcttct taaactctat catctttgag gatctcaact 13260
agcaagggaa cgatcctaaa ttccccgaat agggtattgg atatttctgc gatactaaga 13320
caataaactt tattagtctt gacaacttta aaacatgtcg atgtcgtgta tgctgccttg 13380
gtgttgcttg aactcaccc 13399
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ctacccgtat tttttcttaa ggtgttgaag catggattcg c 41
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
cagccacacg accccatcca cccgggacaa cacaggcaca gc 42
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
cttggtgttg cttgaactca cccgggtgac acgactgcga gatatgttg 49
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
ccagacaaca gccctctctc 20
<210> 10
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
ttaagaaaaa atacgggtag aagccaccat gacaaacctg caagatc 47
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
gagagagggc tgttgtctgg aattcttacc ttatggcccg gattatg 47
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
caacaagatc tccgttgttc 20
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
caagctagat gcagccaag 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
gtagtccata ttgccaccag 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
gatccatctc gactgcttgt ag 22
<210> 16
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 16
Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg
1 5 10 15
Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr
20 25 30
Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr
35 40 45
Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro
50 55 60
Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr
65 70 75 80
Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr
85 90 95
Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr
100 105 110
Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr
115 120 125
Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu
130 135 140
Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val
145 150 155 160
Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly
165 170 175
Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys
180 185 190
Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile
195 200 205
Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly
210 215 220
Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu
225 230 235 240
Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile
245 250 255
Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile
260 265 270
Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn
275 280 285
Leu Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro
290 295 300
Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln
305 310 315 320
Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr
325 330 335
Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val
340 345 350
Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val
355 360 365
Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val
370 375 380
Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu
385 390 395 400
Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr
405 410 415
Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu
420 425 430
Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile
435 440 445
Arg Ala Leu Arg
450

Claims (7)

1.一株表达传染性法氏囊强毒株VP2蛋白的基因Ⅶ型新城疫重组病毒，其特征在于，所述重组病毒在病毒rDHN3-mF的P基因和M基因之间插入VP2蛋白编码基因得到，所述VP2蛋白编码基因如序列表SEQ ID NO：2所述，所述病毒rDHN3-mF的序列表如SEQ ID NO：1所述。
2.根据权利要求1所述的重组病毒，其特征在于，所述重组病毒由基因片段F1、F2、F3、F4通过同源重组的的方法得到质粒pBR322-DHN3mF-IBDVvp2，并将质粒pBR322-DHN3mF-IBDVvp2通过转染细胞得到；
所述基因片段F1的序列表如SEQ ID NO：3所述；
所述基因片段F2的序列表如SEQ ID NO：4所述；
所述基因片段F3为VP2蛋白编码基因；
所述基因片段F4的序列表如SEQ ID NO：5所述。
3.一种如权利要求2所述的重组病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将基因片段F1、F2、F3、F4进行同源重组得到重组产物pBR322-DHN3mF-IBDVvp2；
将质粒pBR322-DHN3mF-IBDVvp2通过转染细胞得到重组病毒。
4.根据权利要求3所述的重组病毒的制备方法，其特征在于，重组过程中各物质用量为：30ng基因片段F1、97ng基因片段F2、30ng基因片段F3、200ng基因片段F4、4μl5xCEMultiSBuffer、2μlExnaseMultiS，ddH2O添加至20μl；
反应条件为37℃反应30分钟。
5.根据权利要求4所述的重组病毒的制备方法，其特征在于，转染过程中，转染的细胞为BHK-21细胞，转染试剂的各组分如下：
A液：Opti-MEM Medium 150μl,Lipofectamine LTX Reagent 15μl；
B液：Opti-MEM DNA 175μl，pBR322-DHN3mF-IBDVvp2 4μg，pXJ40-NP 2.5μg，pXJ40-P1.25μg，pXJ40-L 1.25μg，pXJ40-DE3 3μg，PLUS Reagent 3.5μl；
A液和B液各150μl。
6.根据权利要求5所述的重组病毒的制备方法，其特征在于，转染的操作如下：
(1)将BHK-21细胞培养于30mm瓶皿，24h之内用Lipofectamine LTX DNA TransfectionReagents转染试剂盒进行转染；
(2)转染试剂配制如下：
A液静置5min；B液吹打混匀，静置5min；
取A液B液各150μl混合均匀得到混合液，静置20min；
取250μl混合液转染BHK-21细胞得到转染细胞；
(3)4天后将上述转染细胞置-80℃冻存得到冻存细胞；
(4)将该冻存细胞反复冻融3次，4℃ 10000/rpm离心5分钟得到含病毒的病毒液。
7.一种疫苗，其特征在于，含有如权利要求1或2所述的重组病毒。
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