CN112553255A - 一种表达传染性法氏囊病毒vp2抗原的重组病毒及制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒及制备与应用。首先通过RT‑PCR技术获得IBDV的VP2基因片段，然后以pBR322‑mFDHN3载体为模板，用特定引物通过PCR扩增得到F1和F2基因片段，再用SmaI酶切pBR322‑mFDHN3载体得到F4基因片段；将VP2基因片段与F1、F2和F4基因片段进行同源重组，得到重组质粒，最后将重组质粒转染BHK‑21细胞，得到重组病毒。本发明载体选用的是基因VII型NDV致弱病毒，是优质的NDV疫苗候选株，且能够表达IBDVvp2蛋白，可应用于制备NDV/IBD二联活毒疫苗。

Description

一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒及制备与 应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒及制备与应用。

背景技术

传染性法氏囊病(IBD)，是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的一种高度传染性疾病。该病通过口-粪便途径传播，受感染的禽类在感染后约2周内会排泄高水平的病毒。因此该疾病很容易通过食物，水和身体接触从受感染的鸡只传播到健康的鸡群。IBDV主要感染法氏囊发育期的前B淋巴细胞并在其复制，导致B细胞死亡免疫功能抑制。其结果可造成疫苗接种失败，继发多种感染甚至死亡。近年来，在欧洲，拉丁美洲，东南亚，非洲和中东都出现了导致鸡严重死亡的极强毒型IBDV株(vvIBDV)，对全球家禽业已构成巨大威胁。

目前对该病毒的控制主要通过接种下面几种疫苗来进行。1.灭活苗：用得较多的IBD疫苗是油包水乳液灭活苗。灭活的IBD疫苗能够诱导IBDV特异性T细胞和炎症反应。但据报道灭活的IBD疫苗必须具有较高和优化的抗原含量才能诱导种鸡的免疫力和提供后代对IBDV变异株侵染的免疫保护。通常需要用减毒的活IBDV进行初免，然后追加灭活疫苗才能达到最佳的免疫效果。2.亚单位疫苗：IBD病毒的结构蛋白VP2是一种主要的保护性抗原蛋白，携带中和性抗原决定簇。该抗原决定簇是构象依赖性的，是有效的亚单位疫苗候选者。迄今为止，VP2蛋白已在杆状病毒，大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母表达系统中成功表达。由此所制的亚单位疫苗VP2已在一些国家销售。亚单位疫苗与灭活苗联合使用已初步显示出良好的效果，能提供100％受免鸡只对攻毒实验的保护。但灭活苗制作工艺复杂生产成本高。因为IBDV抗原决定簇是构象依赖性的，亚单位蛋白必须维持原病毒蛋白的空间构象才能保证抗原蛋白的免疫保护效力，因此IBDV抗原蛋白多采用在真核细胞里表达，这将大大增加疫苗的生产成本。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒的制备方法。本发明方法将IBDV强毒株的VP2蛋白编码基因插到基因VII型新城疫(NDV)致弱重组病毒mFDHN3的P基因和M基因之间获得能有效表达IBDV vp2蛋白的感染性克隆质粒。将此质粒与辅助质粒合并转染BHK-21细胞能拯救出表达IBDV vp2蛋白的重组病毒。

本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的重组病毒。

本发明的再一目的在于提供上述重组病毒在制备NDV/IBD二联活毒疫苗中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒的制备方法，包括如下制备步骤：

(1)提取IBDV的总RNA，通过RT-PCR获得IBDV的VP2基因片段；

(2)以pBR322-mFDHN3载体为模板，分别用引物mFDHN3-F1/mFDHN3-SmaI-R1和mFDHN3-SmaI-F2/mFDHN3-R2通过PCR扩增得到F1和F2基因片段；

(3)用SmaI酶切pBR322-mFDHN3载体，得到F4基因片段；

(4)将VP2基因片段与F1、F2和F4基因片段进行同源重组，得到重组质粒pBR322-mFDHN3-VP2；

(5)将重组质粒pBR322-mFDHN3-VP2转染BHK-21细胞，得到表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒mFDHN3-VP2；

各引物序列分别如下：

mFDHN3-F1：

5’-CTACCCGTATTTTTTCTTAAGGTGTTGAAGCATGGATTCGC-3’；

mFDHN3-SmaI-R1：

5’-CAGCCACACGACCCCATCCACCCGGGACAACACAGGCACAGC-3’；

mFDHN3-SmaI-F2：

5’-CTTGGTGTTGCTTGAACTCACCCGGGTGACACGACTGCGAGATATGTTG-3’；

mFDHN3-R2：

5’-CCAGACAACAGCCCTCTCTC-3’。

进一步地，步骤(1)中通过RT-PCR获得IBDV的VP2基因片段的方法具体为：

1)将模板RNA与RT引物及去RNA酶水混合，得到模板RNA/引物混合液；

2)将模板RNA/引物混合液与缓冲液、dNTP、RNase抑制剂和反转录酶的混合液进行反应，得到RT产物；

3)以RT产物为模板，用引物VP2-F/VP2-R进行PCR扩增，得到VP2基因片段；

各引物序列分别如下：

VP2-F：5’-TTAAGAAAAAATACGGGTAGAAGCCACCATGACAAACCTGCAAGATC-3’；

VP2-R：5’-GAGAGAGGGCTGTTGTCTGGAATTCTTACCTTATGGCCCGGATTATG-3’；

所述VP2基因片段的长度为1356bp，其序列见SEQ ID NO:15。

进一步地，步骤1)中所述RT引物为随机引物(如6碱基随机引物Random 6primer#3801)或现有常用的IBDV特异性引物。

进一步地，步骤(2)中所述pBR322-mFDHN3载体通过如下方法制备得到：

步骤1：将质粒pBR322-DHN3采用SmaI酶切，得到酶切后的质粒；

步骤2：采用引物change-F1-F、change-F1-R和change-F2-F、change-F2-R以质粒pBR322-DHN3为模板扩增目的片段，得到PCR扩增产物；

步骤3：将酶切后的质粒和PCR扩增产物在重组酶的作用下同源重组，获得pBR322-mFDHN3载体质粒；

各引物序列分别如下：

change-F1-F：

CACCCCCAGCCACACGACCCCATCCACCCGGGACAACACAGGCACAGCTCGGCCAG；

change-F1-R：

CTATAAGGCGCCCCTGTCTCCCTCCTCCGGACGTGGATACAGACCCTTG；

change-F2-F：

GAGGGAGACAGGGGCGCCTTATAGGTGCTGTTATTGGCAGTGTAGC；

change-F2-R：

CTTGGTGTTGCTTGAACTCACCCGGGTGACACGACTGCGAGATATGTTG。

其中，质粒pBR322-DHN3为人工重组得到的DHN3全基因组表达质粒(具体见201910893553.7，一种全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法)。

进一步地，步骤(2)中所述F1基因片段长度为1471bp，其序列见SEQ ID NO:16；所述F2基因片段长度为4815bp，其序列见SEQ ID NO:17。

进一步地，步骤(3)中所述F4基因片段长度为13399bp，其序列见SEQ ID NO:18。

进一步地，步骤(5)中所述将重组质粒pBR322-mFDHN3-VP2转染BHK-21细胞采用重组质粒pBR322-mFDHN3-VP2与辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P、pXJ40-L和pXJ40-DE3的合并转染。其中pXJ40-NP、pXJ40-P、pXJ40-L和pXJ40-DE3的目标片段分别为NP基因、P基因、L基因和DE基因，载体为pXJ40，为现有公知的基因片段及载体质粒。

一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒，通过上述方法制备得到。

上述重组病毒在制备NDV/IBD二联活毒疫苗中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

由于VP2蛋白是通过病毒感染宿主而产生因此能维持其正常的蛋白构像从而具有良好的抗原性。而载体选用的是基因VII型NDV致弱病毒，该病毒已被证明对VII型NDV攻毒能产生100％的保护，且达到了较好的终止接毒后排毒的效果，是优质的NDV疫苗候选株(202010499879.4，一种NDVVII突变型感染性克隆病毒DHN3-mF及其制备方法和疫苗)。因此用它作载体表达IBDV vp2的重组病毒可进一步开发成NDV/IBD二联活毒疫苗。该疫苗无论单独应用还是与其它疫苗如灭活疫苗，亚单位疫苗联合使用都将提供一种新的预防病毒感染方法，促进对鸡传染性法氏囊病，新城疫病以及其它感染性疾病的有效控制。此外，该重组病毒仅含IBD的VP2表达基因，不涵盖IBDV的其它基因，因此该疫苗可用于开发DIVA(Differentiating Infected from Vaccinated Animals)策略以区分接种疫苗的鸡群和被自然感染IBDV的鸡群。由于该方法简单快速且重复性好，疫苗研发单位可随时将该感染性克隆质粒上的IBDVvp2序列替换成流行毒株序列，用相同的拯救方法获得针对流行毒株的重组病毒，因此具有极大的可开发潜力。

附图说明

图1为实施例中所得VP2基因PCR片段的凝胶电泳鉴定结果图；

图2为实施例中所得F1基因和F2基因PCR片段的凝胶电泳鉴定结果图；

图3为实施例中所得F4基因PCR片段的凝胶电泳鉴定结果图；

图4为实施例中将重组产物转化进DH5α感受态细菌所得菌落PCR片段的凝胶电泳鉴定结果图；

图5为实施例中将重组产物转化进DH5α感受态细菌所得阳性菌落提取质粒DNA的EcoRI酶切鉴定结果图；

图6为实施例中所得pBR322-mFDHN3-VP2重组质粒的质粒示意图；

图7为实施例中所得P1代mFDHN3-VP2病毒感染BHK-21细胞结果图；

图8为实施例中鉴定重组病毒RT-PCR产物琼脂电泳图；

图9为实施例中鉴定重组病毒的P5、P10代鸡胚尿囊液中RNA的RT-PCR产物琼脂电泳图；

图10为实施例中WB(Western Blot)检测mFDHN3-VP2病毒中VP2蛋白结果图；

图11为实施例中WB检测mFDHN3-VP2病毒中NDV蛋白结果图；

图12为实施例中病毒感染后的器官病变结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

主要仪器设备：电热恒温培养箱HZ-100(一恒科学仪器有限公司，中国上海)；三孔电热恒温水槽DK-8D(一恒科学仪器有限公司,中国上海)；海尔BCD-579WE冰箱(海尔，中国上海)；CO2恒温培养箱Forma 371(Thermo公司，美国)；超净工作台SW-CJ-2FD(苏州安泰空气技术有限公司，中国江苏)；生物安全柜1300SERIES A2(Thermo公司，美国)；倒置光学显微镜(Nikon公司，日本)；高速离心机Centrifuge 5804R(Eppendorf公司，德国)；移液器Research plus(Eppendorf公司，德国)；PCR仪C1000 Touch(Bio-Rad公司，美国)；电泳仪PowerPac Basic(Bio-Rad公司，美国)；垂直电泳槽MiniProtean Tetra(Bio-Rad公司，美国)；凝胶成像系统2500(R)(Tanon公司，中国上海)；超纯水仪Milli-Q(Millipore公司，美国)；超低温冰箱Forma 994(Thermo公司，美国)；核酸蛋白分析仪Nano Drop 2000(Thermo公司，美国)；生化培养箱LRH-250(一恒科学仪器有限公司，中国上海)；分析天平BSA224S(Sartorius公司，德国)；涡旋振荡器(Thermo公司，美国)；Azure Biosystems C600多功能分子成像系统(Azure Biosystems公司，美国)。

主要试剂和材料：TIAN prep Mini Plasmid Kit(DP103-03)购自天根生化科技(北京)有限公司；Gel Extraction Kit(D2500-02)购自OMEGA；M-MLVRT(2641A)购自TAKARA；RRI(2313A)购自TAKARA；Agarose(E0301)购自TSINGK；0.25％Trypsin-EDTA(25200-056)，DMEM basic(C11995500BT)购自Gibco；Lipofectamine LTX and PlusReagent(15338-100)购自Invitrogen；FBS(10099-141C)购自Gibco；Premix-Taq(RR902A)购自TAKARA；Pen Strep penicillin Streptomycin(15140-122)购自Gibco；Prime STARGXL(R050)购自TAKARA；BtgZ1(R0703S)，常用限制性内切酶购自TAKARA；ClonExpressMultis One Step Cloning Kit(C113)购自南京诺维赞生物制品有限公司；Trizol 15596-026购自Invitrogen；氯仿，异丙醇，无水乙醇等生化试剂购自宁波萃英化学技术有限公司；10xSDS-PAGE电泳液购自碧云天；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)购自碧云天；0.22μm NC膜(3米/卷)购自PALL公司；IRDye 680RD Goat anti-Mouse(926-68070)购自CST，TBS缓冲液购自博士德生物公司；IBDV-VP2单抗(自制)。pBR322-mFDHN3，pXJ40-NP，pXJ40-P，pX J40-L，pXJ40-DE3均为华农(肇庆)生物产业技术研究院有限公司提供，传染性法氏囊病病毒抗体检测试剂盒购自IDEXX公司。

以下实施例中所用引物序列如下表1所示：

表1.引物序列对应表

实施例1

1.构建表达IBDV强毒株VP2基因的新城疫病毒重组质粒pBR322-mFDHN3-VP2

(1)RT-PCR获得IBDV的VP2基因片段：

从感染IBDV的法氏囊组织细胞提取总RNA。总RNA用TRIzol(Invitrogen)提取。RT(reverse-transcription)用PrimeScriptTM RT Master Mix(Takara)试剂盒，RT引物为随机引物(Random 6primer#3801)也可用IBDV特异性引物。在Microtube管中配制如下表2所述的模板RNA/引物混合液。

表2.RNA/引物混合液

试剂名称	使用量
		模板RNA	100ng
随机引物(25μM)	2μl
		RNase free H<sub>2</sub>O	至20μL

将所得模板RNA/引物变性溶液70℃10分钟后迅速在冰上冷却2-3min得到模板RNA/引物变性溶液。然后在Microtube管中配制如表3所述的反转录反应液。

表3.反转录反应液

试剂名称	使用量
		模板RNA/引物变性溶液	20μl
5XM-MLVBuffer	8μl
		dNTP Mixture(各10mM)	8μl
RNase Inhibitor(40U/μl)	5μl
		RTaseM-MLV(RNase H-)(200U/μl)	1μl

将所得反转录反应液置于37℃，反应1小时，得到RT产物。

用2μL RT产物为模板，用引物VP2-F/VP2-R扩增1个长度为1356bp的VP2基因PCR片段。所得VP2基因PCR片段的凝胶电泳鉴定结果图如图1所示(M：DNA Marker；1：VP2 PCR片段)。VP2基因的序列见SEQ ID NO:15。

(2)以pBR322-mFDHN3载体为模板，分别用引物mFDHN3-F1/mFDHN3-SmaI-R1，和mFDHN3-SmaI-F2/mFDHN3-R2扩增长度为1471bp的F1，和长度为4815bp的F2 PCR片段。

PCR反应液的配制如表4：

表4.PCR反应液

PCR反应条件：98℃，30s；98℃10s，60℃15s，35循环；68℃10s/kb；68℃5min。

将PCR产物在1％的Agarose胶上进行电泳分离。分别切取大小约为1471bp的F1片段，和4815bp的F2片段并用Gel Extraction Kit(D2500-02)进行纯化后备用。所得F1基因和F2基因PCR片段的凝胶电泳鉴定结果图如图2所示(M：DNA Marker；1-2：F2 PCR片段(4815bp)；3：F1 PCR片段(1471bp))。F1和F2基因的序列分别见SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17。

其中，pBR322-mFDHN3载体通过如下方法制备得到：

步骤1：将质粒pBR322-DHN3(201910893553.7，一种全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法)采用SmaI酶切，得到酶切后的质粒；

步骤2：采用引物change-F1-F、change-F1-R和change-F2-F、change-F2-R以质粒pBR322-DHN3为模板扩增目的片段，得到PCR扩增产物；

步骤3：将酶切后的质粒和PCR扩增产物在重组酶的作用下同源重组，获得pBR322-mFDHN3载体质粒。

pBR322-mFDHN3的完整制备及产物验证见“202010499879.4，一种NDVVII突变型感染性克隆病毒DHN3-mF及其制备方法和疫苗”。

(3)用SmaI酶切pBR322-mFDHN3载体，并通过胶纯化大小约为13399bp的DNA片段F4。F4基因PCR片段的凝胶电泳鉴定结果图如图3所示(M：DNA Marker；1-3：pBR322-FDHN3SmaI酶切后DNA片段)。F4基因序列见SEQ ID NO:18。

(4)将上述4个片段按如下表5比例进行同源重组(重组试剂盒购自南京诺维赞ClonExpressMultis One Step Cloning Kit，C113)。

表5.同源重组反应液

试剂	用量
		F1片段	30ng
F2片段	97ng
		VP2片段	30ng
F4片段	200ng
		5xCE MultiS Buffer	4μl
Exnase MultiS	2μl
		ddH<sub>2</sub>O	up to 20μl

将同源重组反应液在冰上制备好后置37℃反应30分钟，得到重组产物。

(5)将重组产物转化进DH5α感受态细菌。

(a)在冰上解冻DH5α感受态细胞，取10μl重组物加入到50μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。

(b)42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min。

(c)加入1ml SOC培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)。

(d)将AMP⁺的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热。

(e)取100μl的细菌液用无菌涂板棒轻轻涂在含有AMP⁺抗性的平板上。

(f)37℃培养箱中倒置培养12-16h。

(6)用菌落PCR法筛选阳性菌落，以及用EcoRI酶切进行质粒鉴定。

用引物VP2-R/mFDHN3-Smal-R1进行菌落PCR，菌落PCR反应体系如表6，PCR反应条件：95℃，3min；95℃，30s，56℃，30s，30循环；72℃1min/kb；72℃，5min。正确产物为2858bp。我们共筛选了8个菌落，其中5个菌落产生了正确的PCR产物。菌落PCR片段的凝胶电泳鉴定结果图如图4所示(M：DNA Marker；1-8菌落PCR片段)。

表6.PCR反应体系

VP2-R	10pmol
		mFDHN3-Smal-R1	10pmol
cDNA模板	2μL
		Premix Taq	10μL
ddH<sub>2</sub>O	至20μL

取上述阳性菌落3个分别进行扩增培养，20小时后提取质粒DNA。分别用EcoRI将这些质粒DNA按表7体系进行酶切。

表7.酶切体系

试剂	用量
		Buffer	2μl
质粒DNA	400ng
		EcoRI	1μl
ddH<sub>2</sub>O	至20μl

正确的质粒用EcoRI酶切后应分别产生1个大小为8924bp，5676bp，3795bp，1364bp和1252bp的DNA片段。

将酶切产物在1％的Agarose胶上进行电泳分离确认能产生上述5个片段的质粒。最后将质粒进行测序验证。

我们用EcoRI酶切2个质粒均产生了正确的5个片段(如图5所示(M：DNA Marker；1～2用EcoRI酶切后的DNA片段))。将质粒1测序验证，结果证明该质粒含完整的IBDVvp2序列。该序列与NCBI序列号为EU595672.1的毒株相同。将该质粒命名为pBR322-mFDHN3-VP2，并置-20度保存。所得pBR322-mFDHN3-VP2重组质粒的质粒示意图如图6所示。

2.转染BHK-21细胞 拯救病毒

(1)将BHK-21细胞培养于30mm瓶皿，24h之内用Lipofectamine LTX DNATransfection Reagents转染试剂，并严格按试剂盒指导方法进行转染。

(2)转染试剂配制如下：

A液：Opti-MEM Medium 150μl，Lipofectamine LTX Reagent 15μl，静置5min；

B液：Opti-MEM DNA 175μl，pBR322-mFDHN3-VP2 4μg，pXJ40-NP 2.5μg，pXJ40-P1.25μg，pXJ40-L 1.25μg，pXJ40-DE3 3μg，PLUS Reagent 3.5μl，吹打混匀，静置5min。

取A液B液各150μl混合均匀，静置20min。取250μl混合液用于转染细胞。

(3)4天后将上述转染细胞(包括培养液)置-80度冻存。

(4)将该冻存细胞反复冻融3次，4度10000/rpm离心5分钟。

(5)取200μl上清液接种9～11日龄的SPF鸡胚，4d后收获鸡胚尿囊液(P1代mFDHN3-VP2)。检测HA效价后用HA≥6log₂的鸡胚尿囊液感染BHK-21细胞。48h后可见大量细胞死亡。结果如图7所示(A：mFDHN3-VP2尿囊液感染后的BHK-21细胞；B：mFDHN3(采用pBR322-mFDHN3转染)尿囊液感染后的BHK-21细胞；C未加病毒液感染的阴性对照细胞)。

3.鉴定重组病毒

(1)RT-PCR：提取感染mFDHN3-VP2尿囊液的BHK-21细胞总RNA进行RT-PCR。RNA提取和RT方法如前所述。PCR：分别用引物F-F/F-R；VP2-R/mFDHN3-Smal-R1进行下述表8体系PCR。

表8.PCR体系

PCR反应条件：95℃，3min；95℃，30s，56℃，30s，30循环；72℃1min/kb；72℃，5min。

分别取10μl PCR产物跑胶，结果如图8所示：1为阴性对照(未加引物)；2加引物F-R/F-F的PCR产物(913bp)；3加引物VP2-R/FDHN3-Smal-R1的PCR产物(2858bp)；结果显示样品产生了正确大小的PCR产物，提示上述细胞含被拯救出的病毒。

(2)扩增病毒：

用上述mFDHN3-VP2 P1代病毒200μl继续接种SPF鸡胚，并连续传代10次，收获各代鸡胚尿囊液于-80℃保存。

(3)RT-PCR和测序验证mFDHN3-VP2重组病毒的稳定性：

分别从重组毒mFDHN3-VP2的P5、P10代鸡胚尿囊液中提取RNA并用其进行RT-PCR。方法和前述一致。结果如图9所示(M：DNA Marker；1和3：mFDHN3-VP2病毒第5代鸡胚尿囊液；2和4：mFDHN3-VP2病毒第10代鸡胚尿囊液)，2组样本均产生了正确大小的PCR产物。将其分别送去测序，结果证实均为正确的DNA序列，无突变产生，提示该重组病毒是相对稳定的。样本1和2的引物为M-F/P-R；正确产物应为1985bp；样本3和4的引物为F-F/F-R；正确产物应为931bp。

4.WB证实mFDHN3-VP2病毒含IBDVvp2蛋白

分别用SPF鸡胚尿囊液感染BHK-21细胞(阴性对照)，IBDV鸡胚尿囊液感染BHK-21细胞(阳性对照)和mFDHN3-VP2尿囊液感染BHK-21细胞。24h后分别收取细胞总蛋白，然后经12％SDS PAGE电泳分离，后用抗VP2单抗进行WB(Western Blot)检测。结果如图10所示(M：蛋白Marker；1：阴性对照；2：感染IBDV；3-4：感染mFDHN3-VP2)。结果显示从感染IBDV和感染mFDHN3-VP2的细胞裂解液中均能检测出分子量约为40kDa的VP2蛋白，并且其表达水平相当。

5.WB证实mFDHN3-VP2病毒含NDV病毒蛋白

用SPF鸡胚尿囊液感染BHK-21细胞(阴性对照)，用mFDHN3鸡胚尿囊液感染BHK-21细胞(2，阳性对照)和用mFDHN3-VP2尿囊液感染BHK-21细胞(3和4)，24h后分别收获细胞总蛋白。经12％SDS PAGE蛋白胶电泳分离后用抗NDV病毒血清进行WB(Western Blot)检测。结果如图11所示(M:蛋白Marker；1：阴性对照；2：感染mFDHN3的阳性对照；3和4：感染mFDHN3-VP2样本)，显示从感染mFDHN3和感染mFDHN3-VP2的样本中均能检测出分子量约为55kDa的NDV病毒蛋白，并且其表达水平相似。

WB详细方法如下：

检测IBDV-VP2：将BHK-21细胞置6孔培养皿培养至90％，PBS洗两遍。每孔分别加入2ml 0.1％trypsin-DMEM孵育液，用100μl IBDV鸡胚尿囊液、100μl mFDHN3-VP2鸡胚尿囊液分别感染BHK-21细胞。阴性对照加100μlSPF鸡胚尿囊液。24h后收集细胞，加入300μl的2×SDS裂解液和30μl的1MDTT，95℃沸水裂解10min后，12000×g离心10min，取上清10μl进行12％SDS-PAGE(Bio-Rad)。后将蛋白电转移到NC膜上(Ameresco)。5％脱脂乳封闭过夜，TBST(0.05％Tween20)洗涤四次，每次5min。加入1﹕1000倍稀释的IBDV-VP2单抗室温孵育1h。TBST洗涤四次，每次5min。加1﹕10000倍TBST稀释的二抗IRDye680RDGoatanti-Mouse(926-68070)，室温孵育1h。TBST洗涤四次，每次5min。用AzureBiosystemsC600多功能分子成像系统成像。

检测NDV：除阳性对照为mFDHN3和单抗用1﹕1000稀释的NDV阳性血清外其它与上述检测IBDV-VP2一致。

动物实验

将病毒mFDHN3和病毒mFDHN3-VP2分别在SPF鸡胚中扩繁10代，收获第十代鸡胚尿囊液备用。

1)测定病毒的TCID50(细胞半致死量)确定病毒滴度

将BHK细胞于96孔板培养至90％满，弃去孔中培养基，用PBS清洗2次。将上述尿囊液用0.1％trypsin-DMEM孵育液进行倍比稀释，稀释度为10^-1～10^-10。将不同稀释度的病毒液以100μL的剂量感染细胞，每个稀释度做三个平行实验。用倒置显微镜连续观察5-7天，为减少误差，每个病毒样品重复测定三次。使用Reed-Muench法计算TCID₅₀。结果见下表9，2株病毒尿囊液中病毒含量基本相同，TCID50均在10^8.4左右。

2)测定病毒的EID50(胚胎半致死量)

取新鲜健康的9～11日龄SPF鸡胚用于实验。用生理盐水将上述尿囊液作倍比稀释，稀释度为10^-1～10^-10。选取10^-5～10^-10稀释度进行实验，每个稀释度接种5枚SPF鸡胚，每枚接种100μl病毒液。每日照胚三次，弃去24h内死胚，连续观察6～7d。使用Reed-Muench法计算鸡胚半数致死量。结果见下表9，其结果显示mFDHN3-VP2比mFDHN3毒株尿囊液EID50略低一些。

3)测定MDT(鸡胚平均致死时间)

取新鲜健康9-11日龄SPF鸡胚用于实验。用生理盐水将上述待检病毒尿囊液倍比稀释，稀释度为10^-1～10^-10。取10^-5～10^-10稀释度用于实验，每个稀释度接种5枚SPF鸡胚，每枚接种100μl病毒液。每日照胚三次，弃去24h内死胚，连续观察6～7d。使用Reed-Muench法计算鸡胚平均致死时间。结果见下表9，其结果显示，mFDHN3-VP2毒的鸡胚平均致死时间与mFDHN3毒的鸡胚平均致死时间相接近。

表9.毒力测试结果

4)用红细胞凝集(HA)实验检测感染鸡胚尿囊液中的病毒效价

取洁净96孔板，用排枪将每孔加入25μl生理盐水。取待检鸡胚尿囊液25μl加到第1孔中，吹打混匀。再从第1孔中取25μl加入第二孔中吹打混匀，再从第2孔中取出25μl加入第3孔中吹打混匀，按此作对倍稀释。弃去第11空中的25μl混匀液。每孔加1％鸡新鲜红细胞。20分钟后观察血凝结果。为减少实验误差，每个病毒样品测三次。结果发现，感染mFDHN3的鸡胚尿囊液显示了最高的HA效价，其值为2⁹，而感染mFDHN3-VP2的鸡胚尿囊液中的HA效价略低，为2⁸。

5)鉴定病毒感染后的器官病变

取一周龄SPF雏鸡分3组，每组10只，分别饲养于隔离器中。用上述mFDHN3-VP2，或mFDHN3尿囊液以10⁶EID50剂量经点眼滴鼻途径接种各组雏鸡。阴性对照组(NC)雏鸡用生理盐水点眼滴鼻。接毒后观察各组动物的临床表现和死亡情况，共观察21天。

接毒后分别在第7天满时取各组鸡3只，分别进行剖检观察。重点观察肝脏，心脏，肾脏，法氏囊，气管和腺胃等器官的病理变化。结果如图12所示(A：mFDHN3-VP2；B：mFDHN3；C：生理盐水对照组；a心脏、b肝脏、c肾脏、d法氏囊)，显示接种mFDHN3-VP2，或mFDHN3尿囊液10⁶EID50均不造成肉眼可见的器官病变。

6)攻毒保护实验

取一周龄SPF雏鸡分6组，每组14只，分别饲养于隔离器中养殖。第1、2组用mFDHN3-VP2，以10⁶EID50剂量经点眼滴鼻途径接种各组雏鸡。第3、4组作为阴性对照组(NC)雏鸡用生理盐水，第5组为IBDV疫苗阳性对照组，(用威力克商品化疫苗，按厂家推荐剂量和方法进行皮下注射接种)。第6组为NDV阳性对照组(mFDHN3尿囊液以10⁶EID50剂量经点眼滴鼻途径接种)。免疫后第21天对第1、3、6组雏鸡用NDV(DHN3)强毒株以点眼滴鼻方式按照10⁵EID₅₀剂量进行攻毒连续观察8天。免疫后第28天对第2、4、5组雏鸡用IBDV(CVCCAV7)强毒株以点眼滴鼻方式按照50MID/羽剂量进行攻毒。攻毒后观察记录各组动物的临床表现和死亡情况，共观察5天。

临床表现：攻DHN3强毒株后，生理盐水组雏鸡3天后均出现嗜睡，精神萎靡，排黄绿色稀粪等症状，并开始出现死亡，至第6天鸡只全部死亡。NDV体外排毒结果见表12。攻IBDVCVCCAV7强毒株后，生理盐水组雏鸡第2天均出现嗜睡，精神萎靡，缩头等症状，第3天死亡一只，至第5天死亡3只，剖检结果显示IBDV攻毒生理盐水对照组鸡均出现脾脏肿大出血，法氏囊严重萎缩，囊重比与脾重比结果见表13。但接种mFDHN3免疫的鸡攻DHN3强毒株后均表现良好，食欲旺盛，排便正常；接种mFDHN3-VP2免疫的鸡只无论攻DHN3强毒株组还是攻IBDVCVCCAV7强毒株组均表现出精神良好、羽毛柔顺、食欲旺盛。接种威力克后攻IBDV CVCCAV7强毒株鸡只也未见异常表现。

抗体检测：免疫后第7d，14d，21d分别从mFDHN3-VP2组，威力克组，mFDHN3组以及生理盐水对照组雏鸡采血，制备血清。a：使用mFDHN3病毒作为抗原用红细胞凝集抑制(HI)方法检测上述血清中的抗NDV病毒抗体效价。结果显示免疫mFDHN3组和免疫mFDHN3-VP2组的NDV抗体从第1周为6log₂左右上升到第3周的8log₂左右，而生理盐水对照组和威力克组均仅检测到低于2的本底抗NDV抗体。详细结果如下表10所示；b：按IDXX公司IBDV抗体ELISA检测试剂盒说明书进行血清中抗IBDV抗体的检测，结果显示mFDHN3-VP2组和威力克组在免疫后第三周均检测出抗IBDV抗体，并在第4周抗体达到较高水平。而生理盐水对照组和mFDHN3组均仅检测到本底抗IBDV抗体。详细结果如下表11所示。

表10.攻毒保护实验HI检测

表11.IBDV抗体水平(S/P值)

注：样品的S/P值小于或等于0.2.判为阴性。样品的S/P值大于0.2.判为阳性；S/P平均值±标准差，n＝3。S/P值＝(样品平均值-阴性对照平均值)/(阳性对照平均值-阴性对照平均值)

喉头，泄殖腔排毒检测：攻毒DHN3后第3d，5d和7d分别采喉头和泄殖腔拭子。将拭子放于含1000单位青霉素和1000单位链霉素的1mL PBS中，然后以8000rpm室温离心5min，收获上清液。分别用100μl上清液接种9～12日龄SPF鸡胚(一式三份)确定样本中是否有病毒排放。结果如表12所示，接种10⁶EID50计量的rDHN-mF-VP2或rDHN-mF活毒均能100％有效阻断NDV排放。

表12.攻毒DHN3强毒后NDV体外排毒情况

注：NA表示因雏鸡死亡无法检测。

测定法氏囊和脾与体重的比值：攻毒IBDV后第5d分别剖检各组鸡只，结果显示生理盐水对照组鸡出现体重瘦小，脾脏肿大出血，法氏囊严重萎缩，与其他组结果相比差异性极显著；而威力克组和mFDHN3-VP2组体重、脾脏和法氏囊与未攻毒的生理盐水对照组相比差异性不明显，结果见表13。

表13.IBDV攻毒后法氏囊和脾重量以及与体重的比值

注：差异性比较各组分别与对照组进行比较。P值＜0.01差异极显著****，0.05＞p值＞0.01差异显著**，p值＞0.05无显著差异

结论

我们通过RT-PCR从传染性法氏囊病毒IBDV感染的组织细胞获得PCR产物。该PCR产物经测序鉴定为IBDV LYZS株的VP2基因。将该PCR片段通过DNA同源重组的方法插进新城疫基因VII型mFDHN3弱毒株的M和P基因之间，构建了一株感染性cDNA克隆pBR322-mFDHN3-VP2。将该感染性克隆与辅助质粒pXJ40-NP，pXJ40-P，pXJ40-L和pXJ40-DE3共转染BHK-21细胞，成功获得一株稳定的，能高效表达IBDVvp2和NDV抗原蛋白的重组病毒mFDHN3-VP2。该病毒保留了mFDHN3原有的弱毒特征同时又能有效表达IBDVvp2抗原蛋白。用mFDHN3-VP2接种一周龄SPF雏鸡能产生有效的抗NDV和抗IBDV抗体，其HI效价与生理盐水对照组比较均有显著性差异。初步的攻毒保护性实验结果显示对NDV VII强毒攻毒的保护为100％，对IBDV强毒的攻毒保护与威力克(目前被市场广泛引用的疫苗)效果相当。因此该重组病毒有望进一步开发成抗IBDV和抗NDV的二联疫苗，为控制鸡传染性法氏囊病和新城疫提供新的防御手段。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司

<120> 一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒及制备与应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

ttaagaaaaa atacgggtag aagccaccat gacaaacctg caagatc 47

<210> 2

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gagagagggc tgttgtctgg aattcttacc ttatggcccg gattatg 47

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ctacccgtat tttttcttaa ggtgttgaag catggattcg c 41

<210> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

cagccacacg accccatcca cccgggacaa cacaggcaca gc 42

<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cttggtgttg cttgaactca cccgggtgac acgactgcga gatatgttg 49

<210> 6

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<213> 人工序列()

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ccagacaaca gccctctctc 20

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<212> DNA

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<400> 7

cacccccagc cacacgaccc catccacccg ggacaacaca ggcacagctc ggccag 56

<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

ctataaggcg cccctgtctc cctcctccgg acgtggatac agacccttg 49

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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gagggagaca ggggcgcctt ataggtgctg ttattggcag tgtagc 46

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

cttggtgttg cttgaactca cccgggtgac acgactgcga gatatgttg 49

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

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gtagtccata ttgccaccag 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

gatccatctc gactgcttgt ag 22

<210> 13

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<212> DNA

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caacaagatc tccgttgttc 20

<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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caagctagat gcagccaag 19

<210> 15

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60

ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctgg agaagcacac tctcaggtca 120

gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180

cctggattcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240

aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagttacaa ctactgcagg 300

ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacacttc ctggtggcgt ttatgcacta 360

aacggcacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420

tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aaattgggaa cgtcctagta 480

ggggaagggg tcaccgtcct cagcttaccc acatcatatg atcttgggta tgtgaggctt 540

ggtgacccca ttcccgcaat agggcttgac ccaaaaatgg tagccacatg tgacagcagt 600

gacaggccca gagtctacac cataactgca gccgatgatt accaattctc atcacagtac 660

caaccaggtg gggtaacaat cacactgttc tcagccaaca ttgatgccat cacaagcctc 720

agcgttgggg gagagctcgt gtttcaaaca agcgtccacg gccttgtact gggcgccacc 780

atctacctca taggctttga tgggacagcg gtaatcacca gggctgtggc cgcaaacaat 840

gggctgacga ccggcaccga caaccttttg ccattcaatc ttgtgattcc aacaaacgag 900

ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tggtggtcag 960

gcaggggatc agatgtcatg gtccgcaaga gggagcctag cagtgacgat ccatggtggc 1020

aactatccag gggccctccg tcccgtcacg ctagtggcct acgaaagagt ggcaacagga 1080

tccgtcgtta cggtcgctgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140

aagaacctgg ttacagaata cggccgattt gacccaggag ccatgaacta cacaaaattg 1200

atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtct ggccaacaag ggagtacact 1260

gactttcgtg aatacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320

gcattcggct tcaaagacat aatccgggcc ataagg 1356

<210> 16

<211> 1471

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

ctacccgtat tttttcttaa ggtgttgaag catggattcg caaggggggg ctcccggggg 60

attccgtgtg atgctgaagc gacaggagcc tgctatgagt tgtgacggcc atcaaccatt 120

cagcgcaagg cgcttgatct tcctgatctc ttcaattgac ttggctgcat ctagcttgct 180

caggagctta gccgaggagc ttggatgcat cgggcgtgag gtgattaatg cgcggacagt 240

gtccttctcc actcccatgt caggcccgct tgcggtggca gacttaatca attcagaagg 300

gtgctgcact ggttgtgaga gtttattgag cgtcatttca ccctcttgtg tcacgtaagg 360

agatgggtct ccggggcccg aaactaggac tgggtgggat cgggctactg cccggagatc 420

acttaaagat gaaatgttgg cacaaccagg gtccagaatt ttcatcatac ctaagttagc 480

ttccatgatc gcaacagatg tcttgagctg ttggatttca gatcgtatca taggaataga 540

ggatgtctgt ttcaagacca gatccagctg atgatcaact ttacttacct tctgagataa 600

tgcctccatc atagacatca tcgcctgcgc aaagtcggca ggtagctgga cacgatccac 660

aggtacagga atattgtctt ggctctgccc tgactggggc gcatgagggg ttgcaccagc 720

tgatggttgt gactccttcc gttgtccatg atatgctgtg ttctcgtcta tgccccggtt 780

tccagagacg gccttgacct ggtgctgtgg tcttccctgg ttgcttccat ggctcgactg 840

gttcccgtgt tgttgggccg gagattggtg atgcccttct tggggacccg accatgggcc 900

ctttttagca ttagacgatt tattgcttaa tttgtcgagc atggacagaa gggagttgct 960

tgctccggtt ttgagctgtg tgtcgctggt ctcgcttgcg gcctgggtgg agggcggttc 1020

ggtgggtgtg gtcggtgggt tgttgtgtgg ggttgcctgc tcaggtgtgg atggctgttt 1080

ttctgttctg tcttgttggt cggggacgtc ctgactggcg tgtggctggg cactcccgtg 1140

cttctcccgt gctgtgcttg gagctttggt cttgccctgc gggatcgcac ttcttccgac 1200

ggtctcggct gatttgccct gggccgtaat tatgctatca atgacagtcc cactggtctc 1260

aagtatgtca tctatctccg catctgtaaa ggtagccatc ttcaccctaa ctcaccgggt 1320

agaagggaga acagagagct tggtgacccg tcctggtctc tggatgtctc tcttctaccc 1380

gtattttttt ctaatacctt ggactctggg aggattgttg actggccgag ctgtgcctgt 1440

gttgtcccgg gtggatgggg tcgtgtggct g 1471

<210> 17

<211> 4815

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

cttggtgttg cttgaactca cccgggtgac acgactgcga gatatgttgt caaatactgc 60

agatacgggg ttaagcctcg cttgttcatc atcaagcatc gtcccgaaga cccctcgtag 120

agtatgattc ctatagaaga ttaagggata tggatcggta tagaccccag tgatgcatga 180

gttggggcac cttgctgatg cctggcaagg gacactacct ggccgagtga aagcattaaa 240

catgtaagga ctatggagtg tagccgtttt gttacttact gtcatgggat acaataaggc 300

aggggagaaa tatgaagacc ctcgttgata caagaagtga gatgtcccta ctgtgaggat 360

tctgccttcg gctcccatga gtgtgattgt attaggtgga atagtcagca ccgggtcctt 420

acccagggat gttgacactt tgatagatag gatagcttgc tgtacgcgct ttccaccaaa 480

tcgcccaggt ttatatgagg acttagccat ccgaatttgg taatcttgtt tatcggggca 540

tgtgttatta tggcgcttgt atattacata tttcccttct tgtgcgatgt cactgggtga 600

attaggtttg agccctccgt aaactgggaa ccatacacgg ccgtcaataa aagaccctcc 660

tcccaccccc gggtaatttg ccacccaatc cttaaataag accgtggtgt ctaagtcttt 720

ctcatggtat tgaccgtcaa atcctagcct tccgtgcacc attgatgtgg gggcaactga 780

cttgtaatcc tcctcttcag tccctgtgac cttagagcac agcatatcac aacctaaagg 840

ggttgcactc acactgcaag acttccgatt ttgagtgtca tctaaattga tggagcgcag 900

agtagaaaag aataccctcc ctgttgcaga tgtccgaagc acaccaagtg ctaggtattg 960

atgtgagtgt gagtgatctc tgcaaccaga tagtatcaca ttgtgagtat aacaataatg 1020

ggtggtgccc atgtcaaatg agggtatccg agtgcaacca gatcctgtag taggtgccgg 1080

gatgaaattc aagtgttctt gatatgcaga aggataaaat gatgcgacat tactaatgtc 1140

gtccactatg agttctttgc ctatcccccc gatataatct gggtcatgaa cgggcgcacc 1200

gcatccgcta ctgttctcag ccccgttaat ttgataagaa agagaggtta ttgcattcat 1260

aattacagat tcggtgttta atagtgccag cggggattca agagctacct gcttgtatat 1320

cttatctatc acatcttggc ttgaactgag taaagacgta accttatctt ctgtcttgga 1380

gatcacagtc gatatgcctg cgaggtcgtg tggcgtactg gcctccatgc tgtatgccag 1440

ggcagccgca gagatagcta gaatcattac cattaaaaat aagactgcga tccggaaaac 1500

taagcgccat gtgttctttg cttctctttc ttcattctcc agcatgactc tgttaaccac 1560

gcggtccatg attgactctt gttgttggtg gtgtggtaga acggatgttg tgaagcctaa 1620

ttttcaattg aagggtggct cctctgaccg ttctacccgt gtattgctct ttggttgctt 1680

gttcccagta attttttctt aagtctccta cttgacaggt tatcggaatt gacacacggg 1740

ctgccgttgg gtgtccgtcc acttcctatt tgcattcatg ctctcatggt ggctctcatc 1800

tgatcgaggg tattgttccc aagccataac agggtctttt gttgtgcctt ctgcttgtac 1860

atcaggtaac acgctaaaac cagactaagt gcaccgaaaa ttagggaaat gacagttaga 1920

acaatatagg taatgagagc ggatgtgcta gttagtctga cgttgacttt ttctagtttg 1980

ctgttgcttt ctgccaactt gtccaaggca ttgctgatcg aattattgac gtttccaagt 2040

tcagttgata tatcaagatt gcctgtcacg atgacctgag aatctaatat tgagatgttc 2100

ttttgataag ttgcatcaaa ttccccactg agcctcagag ttatgccgtc taatgataag 2160

acattgcacg agtgtctatc tatcagggat acagcttctc cataattttg cgatatgatg 2220

ccaggagggt ctgtacatct gcatgttgtt atcttacaat tagcaataac tgagccccta 2280

agggccatat acggcgtagt gagtgcgcct tcagtctttg aatacatgca ggctgatgtg 2340

ttgccactta aacaggaata aatacctgga gacatgggga atgtcactat tctagtacaa 2400

tataaatcca gatcggactc tatacagtat gaggtgtcaa gctcttctat cacagaaccg 2460

acttgtgtca ctactttcgg gaccagtgct gaggcatatc ctttggttgt acttacagat 2520

aaggtctcca gataggtggc acgcatatta tttaagttcc cgactgaggg cagattaact 2580

tgtatgccca agagttgagt atgtgagtca tacagtatag ggtaaccagt gatcaggccg 2640

ctaccaatta atgagctgag ttgattgttt cctataccta acttagttaa taagtagtcc 2700

atattgccac cagctaaatt atagagcgcc tggatggtta gctgagttaa tgcaggggag 2760

gtgatctgtg gcccgaatac tgtagttagc tcagttaggt ataggttgag ttctacaccg 2820

acctgttgtg tgatttttat gcagtctaat tctcgcgccg tgttattaaa ctggtcattg 2880

acaaactgtt gcatcttccc aactgccact gataattgtg ataatccgtc ggtgacttca 2940

tgcacagctt cattggtcgc agcaatgctc tccttaagcc ggaggatgtt ggcagcattc 3000

tgtttggctt gtattagggc cgcagctgct gttatctgtg ccgctgttgc aaccccgaga 3060

gctacactgc caataacagc acctataagg cgcccctgtc tccctcctcc ggacgtggat 3120

acagaccctt ggatcttgcg aatggagtcg ccaagaggag tgagcagagt agtcagtgtt 3180

ctgttatatg cctccaatgg ggctcttgca catgcctcct tatctctggg catattcggg 3240

agcaacttga ctatgattga ccctgtctga gacgaggtat atacattgac tgccttatct 3300

cctgttatta caattcctgc agctgcaagg ggcctgccgt caagagaact tgtcagacgg 3360

atgcagttca atatcagcat aattcgagtg attagcatta gaggtgctgg gatcctggta 3420

gaaggtttgg agcccatgct gtgtcctgag tgtgccggtc ggggtccaga ctcttctacc 3480

cgtgtttttt ctaatttgct ggacaggtga actaactaca agcagtcgag atggatcatt 3540

atctggtgtc atgatgattc gggaaagcag gtgaactgca gtcttaggga tgtaacctat 3600

tttctgaaag gattgtattt agcaatggca tgcttcttct ctatcttagt ggaggttacc 3660

tcatgatcgg cggtcactgc aacagcacgc tgagtgccgg cttgaatgat gactttcacg 3720

ctccgcaggt gcgcggtctg gctccagagt atcttggcaa cctggggaga ggcatttgct 3780

ataggatagc aggctgtccc actgctagag aagaaaggag caagtagctt agtccgtgca 3840

cctctcgcct tcacaagcac agagggtccg agcacatcac tgagcccaac agatagattg 3900

agtctcctta tcttttcctc tatcttgtca aatgtcactt tctttcctct cttatctaca 3960

gtggacataa gtccgatatg cagaaaaaga ttcgcatagt acccgctatc ggacttagaa 4020

agggatttga ctaacgggct cttcggatcc acgtccacat caatagtgac attgagcgca 4080

agattgtaca ggctcgagcc agacactttc aatactgtag ttgggatcct gtagacatcc 4140

cttctcggca ccacagtcaa ggagacaaaa ttcactttat actctagggt tccgctccca 4200

gggatctttt cgggcgcctt cacatgcttc actgcattca ctgatgagta ccgatttgac 4260

acaaccatac aattttgcag cactcgaggt gcctgcacta ctgagaagac tattctctca 4320

gtgttagttg cactcttctt gcaggttacc accatagtga ggcaggctct cgccagctca 4380

acaagatctc cgttgttcgg gacactccct aagcagagca ttgcggaaga gagtagctca 4440

tgcctgggat tgtcattgat cacaccgaca gtggctcctt cattcccaac ttgaaagatg 4500

aacccgtagg tggtgataaa taccgagtct tccttactgt ctgtccacga atcaagatgc 4560

tggatcctgt attgtggagt gatttgtttc ttcccgtctc ctgtatcttg taagataatc 4620

ggaaatgcta ataggctact ggaaggaagg gcagaatcaa agtacagccc gattgtcctg 4680

gatgagtcca ttttggttca atcgaggcac tttgattcta cccgtgtttt ttcttaatct 4740

ctaatgctgc tagattggtt gcagttgtgc gatcatgcga gggattgggg atggtgagag 4800

agggctgttg tctgg 4815

<210> 18

<211> 13399

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

gggtggatgg ggtcgtgtgg ctgggggtgg gggagagggt gggggggagc ttttgttggg 60

ggggtcgtgc ggggttgtgg gtcggggggt gtgggggggt tttgggggag gggtttggtg 120

tggtcctatg gaggcaggct gggagtagtc gatcagtacc cccagtcagt gtcgttgtct 180

tgggatgccc caggggtcgg gggaggctct agatgagtgg tgctctgtgc aggattaggc 240

gattcccgca tgctgttcgc cactgttctc ataaaatcca ggaattgggt ctccccatcc 300

ccagcatctg gttgcccttg cggcttgttc gatccaccct gtggagttcg ggggccttcg 360

tcactgagcc cggtgaggac tcctgcttgt tgagtaggaa tgtccatgct gccgatttct 420

tcagatactc gttgggcagc agctgccagg cctctccttg ctgctggggt tagttttaac 480

tcagcagcca tgtcttcatt gatactactt ccctgagcct gagcatactc tactccaagt 540

cgccagaatg atgtgctcat aaagtccctg gcaaattggt acttgccagt tcccttatct 600

aagactgatg ccatgcccat ggcaaaagaa taaagttgtg catattcggc tggcgcaaag 660

ctcatctggt cactgtcacc taacaatgtc atgtatggtg cattttcacc tttcatccga 720

tataaacgca tgagctgttt cattttttgg atatcacctg tgaggctgct gagtgcgaga 780

gctgacgtct tggtattgat tccatatttg agtgttagga aaaacgcagt aagcccggta 840

tttctgatgt atgagtctac atccccgacc aaattgtaat atgtagagct cccacctgct 900

gtattacggc ccctcttgag ctcactaacc aggaaaatac ggactgccag agaatgtctg 960

attatgagtt gaattgcact cctgcataca ggatgaagga tgtacttctt ctggactcta 1020

ccctgctgca tatacttatt tattcttctt gtttctgact catctgctgt ctcatatgca 1080

gtcatggcct ttgctaccgt gacccatact tggacttgga cagataggat cctttccaga 1140

gtgtcagtga tatcttctgg tgcatcatct tcaaccccag ccgtgacaaa cggagtaccg 1200

ttgctgcatg cccgagggag agaccctgca attaccatga atctctgtgc tctctcctcg 1260

gacactccac tcctattgtt gaactggggc acattattag caaaaccatc gatctcaaga 1320

acagctagtg tggcctcgtt ctgttttcct gcaagggcaa catggtttct catcacctga 1380

gaatgggagc ataagaggga tataagagca ccttgcctga gtggtttgtt ggcatcctca 1440

ctaacggcaa tccgaagaca gaataccgca aagttccatc tatcctctgg atcatcactg 1500

tttagggtaa atactgggac ctcaactttt aaggtgctcc ctttctctcc ccctccatgg 1560

gctccgttag ggcgggtctg ggcagcaagg agctgctcgt attcgtcaaa aacagacgac 1620

atatcggtag aaggttccct caggttcaag cttcgatctc gcgttcgggg ttcacacctt 1680

ctacccgtac gatctcgatt gcttcttcgc cttttatcgt acctcacgga ttctctgttt 1740

ggtgggtcgg catggcatct ccacctcctc gcggtccgac ctgggcatcc gaaggaggac 1800

gtcgtccact cggatggcta agggagagct cggatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg 1860

aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc ataacccctt ggggcctcta 1920

aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag gaggaactat atccggatcg agctagcgcg 1980

ctatatgcgt tgatgcaatt tctatgcgca cccgttctcg gagcactgtc cgaccgcttt 2040

ggccgccgcc cagtcctgct cgcttcgcta cttggagcca ctatcgacta cgcgatcatg 2100

gcgaccacac ccgtcctgtg gatcctctac gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc 2160

gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc gccgacatca ccgatgggga agatcgggct 2220

cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc 2280

gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac 2340

ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga 2400

ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact 2460

atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca 2520

gcgctctggg tcattttcgg cgaggaccgc tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg 2580

tcgcttgcgg tattcggaat cttgcacgcc ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc 2640

accaaacgtt tcggcgagaa gcaggccatt atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc 2700

tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc tggatggcct tccccattat gattcttctc 2760

gcttccggcg gcatcgggat gcccgcgttg caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac 2820

gaccatcagg gacagcttca aggatcgctc gcggctctta ccagcctaac ttcgatcact 2880

ggaccgctga tcgtcacggc gatttatgcc gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca 2940

tggattgtag gcgccgccct ataccttgtc tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg 3000

agccgggcca cctcgacctg aatggaagcc ggcggcacct cgctaacgga ttcaccactc 3060

caagaattgg agccaatcaa ttcttgcgga gaactgtgaa tgcgcaaacc aacccttggc 3120

agaacatatc catcgcgtcc gccatctcca gcagccgcac gcggcgcatc tcgggcagcg 3180

ttgggtcctg gccacgggtg cgcatgatcg tgctcctgtc gttgaggacc cggctaggct 3240

ggcggggttg ccttactggt tagcagaatg aatcaccgat acgcgagcga acgtgaagcg 3300

actgctgctg caaaacgtct gcgacctgag caacaacatg aatggtcttc ggtttccgtg 3360

tttcgtaaag tctggaaacg cggaagtcag cgccctgcac cattatgttc cggatctgca 3420

tcgcaggatg ctgctggcta ccctgtggaa cacctacatc tgtattaacg aagcgctggc 3480

attgaccctg agtgattttt ctctggtccc gccgcatcca taccgccagt tgtttaccct 3540

cacaacgttc cagtaaccgg gcatgttcat catcagtaac ccgtatcgtg agcatcctct 3600

ctcgtttcat cggtatcatt acccccatga acagaaatcc cccttacacg gaggcatcag 3660

tgaccaaaca ggaaaaaacc gcccttaaca tggcccgctt tatcagaagc cagacattaa 3720

cgcttctgga gaaactcaac gagctggacg cggatgaaca ggcagacatc tgtgaatcgc 3780

ttcacgacca cgctgatgag ctttaccgca gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg 3840

aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg 3900

ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca 3960

tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca 4020

gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 4080

ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 4140

gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 4200

ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 4260

ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 4320

acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 4380

tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 4440

ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 4500

ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 4560

ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 4620

actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 4680

gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc 4740

tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 4800

caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 4860

atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 4920

acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 4980

ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 5040

ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 5100

tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 5160

tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 5220

gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 5280

tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 5340

tgttgccatt gctgcaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 5400

ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 5460

tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 5520

ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 5580

gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 5640

ttgcccggcg tcaacacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 5700

cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 5760

ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 5820

ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 5880

gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 5940

ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 6000

gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt 6060

aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctt caagaattct catgtttgac 6120

agcttatcat cgataagcgc ggccgctcca ttaatacgac tcactatagg accaaacaga 6180

gatttggtga atgacatagc tgtgattaga gacgactttg cgcatttttg cttaaagtta 6240

actaactgaa tccgaatacg agttccaaag agtcagaatt taactttttt ctaatctggt 6300

ataatcaagt caatgaggga gtcatcagtt aagaagataa ctgattggtg tacgattgcc 6360

tttaagagtc attattactg taatatccct tggcagcatt acctatagtt ttcatgtaga 6420

atttttgttg agcgcgagtc aagtacaata acgaagtacc tgtgaacatt tctttgagct 6480

tagtaatacc taggaccgct ttcaggtatt taggacaggt actgtgcttc aggtatgtcc 6540

ttaatgggat gaggtcctct agggaaatcg cacctctgag tactaagctg attacatcac 6600

ctattttatt gatgtctttg gctctgagac ccaatattgt gacttccaag atctgtttgg 6660

tgcactgctt aagtgatgtt ctctttttac cgtctgtgga tagattgtaa ggagttaata 6720

agaacactgt gtcggcgagg tcaccctcag cctccatgta aatcacggac cggatgactg 6780

tgtcaatgtg gctggcaatg atcagagttg tctgggtcgt atttgttagt gtgctcacca 6840

aactttctgc acaaaatgga cggacgggct gtcccccggc ttcaattagt gcagcatcaa 6900

tgttttcact taagagcctc attagcttcg gtaaagggct ggataggaga tctgttacac 6960

gacgctgctg tgaggtaaat agcttagtca atgtgatttc atctgattta gatagaagtg 7020

taccgtgtcg ttgtattaga gcttttgcca tccttaccac ttcgtgcacg aaagtgggcc 7080

cgcctaagca gcccataacg aatatcaggt aacactccat atcccctcta caggcgtagc 7140

cattggaaag tatgtatcct ttcgtggaac atggagtgaa taaattcatg agtaagtgga 7200

agtagtaccc cattgcatac agtaccttga tgatcactac cccgccctct ctcacagaat 7260

gcatggcaat cagggataaa ttagtagcca gttgatctaa taagctttga ctggaccctg 7320

gaggaatctc aatgtcacaa tgtagtaatg atacagacct gtagggtact acagatgtga 7380

tatatccaac tgccttatct gaggtcagat cactttcttc tgcattctct ctccataatg 7440

gatagaactc ctggacatat ccatctttac atggcacttc cgcttgtaga ttcctataaa 7500

cgaccgagtt tagaaactgt gttggtgtag gtccgaaatg ccgctgtgga gggttcatct 7560

cattcgagaa aagtgtattg taatagatgg tctcatgtgg tatatgcaat tcaagaagac 7620

tcatgatggc tccgcttcct tccgctaagt ataaagagtt cccatgtctt gcacacctaa 7680

cctcagatat ggatagaaga tgagacgcct tataccaaga agatgaagca gtccctactc 7740

ctctgaacaa gtatcgtact aggtaatctt cccttgggtt cggtagtgtg tgctcgaagc 7800

aaatcttact cagtgtaaac gcgtcgtacc ttgctggggc actcagatcc agctcttgta 7860

tgaaagatgc gggttgtcgg gtaaacgggt ctttcactcg agcaccaatg tcccgtactg 7920

ggcgaagctc aagcagtgac tcctgaggga acaacaacga caagatagta tctctgtcct 7980

ctcgttctct gatcaaatta aggctcttcc tagacatgta gtatagattg gctgggaacg 8040

tgattatgtt gggagacatg atagaactca attgttcgga cctaagcaac ggttttacag 8100

catccgacaa tagatactca gtgagtattg agcatttctc ttctgctgat aggcccctta 8160

tttttgggat ttctcttgtt gtagcaaaga gcactgtgta caagcagcat aaccgggaaa 8220

ttagttgaag catcttctca ttcaggttat catctaagac agatggaaac agcagatcat 8280

acttactccc tgcatataaa cctgagacca cgcgtcgagt gcaggagact aacaatttcg 8340

cagacacctc gacaaagtct atatctgcaa gctggtgtga cccgtcatga ttaattagac 8400

ctactgcatt caaccttgag tgaatgaggg ggtgggatat cgtggctgca atattggaga 8460

gtaggatccc tggcatgttc ttatataagt cattcatgta taggacgatg ttgtttagac 8520

cccttaccct cagatagtag agttgataag cacagtcgag gagcacttcg agtgctgcat 8580

actcaaacag gcggaccaca tctgagttct gtgcctcact aatccaattc cgtgtgttgt 8640

catacactat tatagcatca ttctttatag aagtatcttc atcataagaa accacagatt 8700

ggccaatcaa tttcccgcta gatatcgaaa gaatgttcat tagctccagc gtgggatatg 8760

attccaagtt aagctcataa ctcttgaata tagctaagtc aagtctcgca aaatccctct 8820

ctgatatagg gctaggatca tacatgaact tatttgaggt taccatcctt aattccggta 8880

ccagtccgag gagctcgaaa ggaactgcga caggcgcttc tcggatacag cagctaaatt 8940

tactgtggag gtgtaatgtg atctcatcgt atgttctggt tgttgtcatt gggaagagtg 9000

actcaattag agataaaccc aagagcataa tttgctggta aaccacgttt ccctctttga 9060

ccccttcttc ggtgaacagc ctttgagaat cattggatat gtgaatgtaa ggcgacactc 9120

tgtagagaga tgcaggggta aatgtcatct gggttatgcc atcatccaat ctatgttgga 9180

gattcccagc tgtgggcagg ggtgacaata gccgaagata ctctgagctt atgttgcatc 9240

gagaccttgc aatattaaga gcagcagtcc agttcacttc attgtcccca taagcccaga 9300

ttaacacgga tgatgccctt agtgctgctt tcacatgtgg tgacatatgg gctattttcg 9360

caagtgaggc ggctcttctc tcttgagtct tcgacccgag atatggcact ctcatcgggg 9420

gatttttgct ggtgtcatca gtcaactcta tattgcttgg aagatggaac caagtaaact 9480

gctcatctcc gctgtcacat tttgtgcacc ctccactgac gctgagaatc tctccctcca 9540

caagttctat ggtatcgggg ttggatacac ccagtatttt cctgccccct gtcaggggtg 9600

accagcttct gttccgagca taatctgcta gcgtcagcga gcacatatta gaagaaacta 9660

atgggtggtt ggatctagtg gataagaaaa tatcatccct gaacaacatt gcatgcatgc 9720

ttgagtaatt gattatccgc atcagtcttt tgataccgag gggcctccta gtcagtgcaa 9780

tcttaatcac agtgttcgtt gtgtcaacaa gcccttgaat ttgctttctc ctacccacag 9840

agcttgcttc catgatagca tgtgcgacac gtgggtgaat cacttcttga ttgagtaaga 9900

attcagccaa tgctttctct tctgcctcat tgtcctctgt atgtaccccg gataataaag 9960

ggtttgaaca tgtctcaaat aggactttct gtgtatgttt cttgaggaca atatttgggc 10020

ttgcaacagt ctcaaaatta aaagagtatg ggtcgttgca taggctggcc caatctccat 10080

tgccaggtgg cctggttaag atgttagtca tgatgctggg actcaacaac cccactgctt 10140

ctagtcgctt gacctctgca aaggcagtgg tccctgggtc gccaatattc cttgtgtaga 10200

gccttgagta ttgaaggtta ctcagtcccc ccagttgggc aggggttaac acgtatgagt 10260

gtacgaaaga gatatcctca atccaggact ggttggaatc tgactgtgag ctgtgagtaa 10320

tagaaaactc tgaatcaaaa tatgtctgca cgcaactcat taggtagttc aaatagtaac 10380

agaagtcctt aggaagccca ttctcacata gtcgtgctac agtggatgca atgttggcac 10440

aggacattac agtgttttcg ctaaggtcac ctgatattag caccaattta gatgaatttt 10500

tgaggacctg actgagtatt gctccatctt tgaatattcg tttgctgtat atgaagaatg 10560

tgtctgatct aatggtttca cgatccttca ggttatggcc aatcagatga ttgacatgaa 10620

tcaattcctt gaagaaatta tcactagcct gatgcaactg cgtcaatacc atatccgggg 10680

aatcatctga tctcacctct ctcgttacag ctattacttg attgtcacct tgtaccatgc 10740

aggcaactcg acaatgagat cttgctgcgg caagttggat tgcagcaatt gagatcatcg 10800

tccatagctt ctgacagagt ccctcaatgc cccctctagc actgacaata tatatatcat 10860

catttgggac tcttgataga tcacagtcgg tcgggtcact tggaggattg aaaggatccc 10920

ctacaaacat tgtagtgtcc atcagcctaa gatgaatcca ctcaaagaaa tgaggtaggc 10980

ccatcagctg attgatggca tgggcgaata gtttgactgt ctgatatctc cagttaagac 11040

aatacttttg taggtcagtc gtgataaagg tggcaactct tctacgattc ttgctcttgg 11100

gatcatgatt gcggtttgag gaaaccctct ctttgcagtc agcgatacgt ttcttattgc 11160

tgttaaagga cagttgactc attgctaaca tactctttgt caaggatatg ctatcttgaa 11220

tgaccccatt tccctggaag aaaggtgcaa tctggtcagc tagaattcct tctgccatta 11280

cctggcaatt ccttagtttc tttgttaatt tagcaaaaat ccgtccattc actttcacct 11340

ctttctcttt gagtgagtac gatactgcca cactgtcatc tcttaggtac tcgagggttg 11400

tcaggtattc catttcttta tatggatcaa aatcatttga ttctaagaac tctatcagga 11460

ggcggttagt tgaagttgcc tcctttatct gtttcttctg gtcctcagag agtaggttcc 11520

gcctaaatga ggcgagccag ttatcactag gatgtgcgat tgccttgtct tttaggaaca 11580

tgcttagatt ggtaacaggg tcataatcta tacatggctc aaattcaaga gcggataaac 11640

tcttgtactc cctcaacatg acatcatgtg agatctctgc tgaatcagca tgtagctgcc 11700

caatgatatt tccatatatt gtatctactt tgacgcgtgg ccacacacct gagttctttt 11760

ttctgtatcc attgatgatt gttcctttaa agaaagataa tacctggagg atcatatcaa 11820

agtctaccat ctttggtgcg cacatctggc tcctgactgc tcttgctgca ctacgagact 11880

caagcaatgg atgaccccac aaacgcagca agcacaacat ctcagctgct tggttctgtt 11940

ctaatccaga gaatacagtg gcaatagcgt gagttactgc ttccgctata ttattgggga 12000

gaagttcgat taacgtgttt ttgagctcct gtaggttaaa tgcaaagaaa tctcctgcaa 12060

atgtacctga tggctcaagc agctgaacgg caccgtatgc aaatccctcc attaatgcta 12120

caacatcata gacttgatta cctaagtcct ttgccagagc atctactaac cgcagaatat 12180

catcaatttt ctcggatagg ttcctgagat gtgctgctgt agaagatatt atattgacca 12240

tgtccctgcc ttccatcata tccgcataca tcaatacaag ttcctgggtg agacatgtga 12300

acttgttctc gtctgtgtgt gtcacaatga caagctcagg agtaataaag acatggccta 12360

tcttatgatt taatgttact aacttgttga ctgcagacct tgtccttgct gctacaatca 12420

gatgcctttg gacttgtttt atatggagcc acgcgaactt ggctctggac cattttgagt 12480

gaaaccagaa tgccggatct gtacggatgc tgttgaattc ctctgatcgt gggacattat 12540

tagacagaga tgaccctagc aatttcttct caacttgcac gcacagcttt gtgaacaggt 12600

ctccatatct tgtgttgtga atctggatct tcttttcaat cttccggaat ttgttagttg 12660

aatcagggac ctcaatacta gccagttctt ctaaacacct gggatggagc actccagtca 12720

tcttggaatt gtggttgaga gtctggtgca ccgcccgccc aagttttatc attctctctg 12780

tgtcaggagt ggctgactcc agtattctct tccattgcct gctgataatg agatgatcaa 12840

agtcgcattc atcaggaagc ggtagcccgg ttaatttcca gtagtataac aatttgtgct 12900

tgaccaatgg agaggataaa tgtgactctg gtaggatgat ctggtgctct gccctctcag 12960

gaccggagcc cgccatgtcc tacccgtgtt ctctcttgtt ggttattttc ccttatatgt 13020

caatgcttct tgtgtttttt cttaataaag tgacagtgag cgagactcag aacaatcatg 13080

tcagcattgt cggattgcgg ttgcccaaca acacgggatc ctgatttatg ctaatgttca 13140

gcttgactct aagcattatg ggagatgatt ggcgcaatgt cgtcctccca accatcctat 13200

gattggctca atcggccaag tctagcttct taaactctat catctttgag gatctcaact 13260

agcaagggaa cgatcctaaa ttccccgaat agggtattgg atatttctgc gatactaaga 13320

caataaactt tattagtctt gacaacttta aaacatgtcg atgtcgtgta tgctgccttg 13380

gtgttgcttg aactcaccc 13399

Claims (9)

1.一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒的制备方法，其特征在于包括如下制备步骤：

(1)提取IBDV的总RNA，通过RT-PCR获得IBDV的VP2基因片段；

(2)以pBR322-mFDHN3载体为模板，分别用引物mFDHN3-F1/mFDHN3-SmaI-R1和mFDHN3-SmaI-F2/mFDHN3-R2通过PCR扩增得到F1和F2基因片段；

(3)用SmaI酶切pBR322-mFDHN3载体，得到F4基因片段；

(4)将VP2基因片段与F1、F2和F4基因片段进行同源重组，得到重组质粒pBR322-mFDHN3-VP2；

(5)将重组质粒pBR322-mFDHN3-VP2转染BHK-21细胞，得到表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒mFDHN3-VP2；

各引物序列分别如下：

mFDHN3-F1：

5’-CTACCCGTATTTTTTCTTAAGGTGTTGAAGCATGGATTCGC-3’；

mFDHN3-SmaI-R1：

5’-CAGCCACACGACCCCATCCACCCGGGACAACACAGGCACAGC-3’；

mFDHN3-SmaI-F2：

5’-CTTGGTGTTGCTTGAACTCACCCGGGTGACACGACTGCGAGATATGTTG-3’；

mFDHN3-R2：

5’-CCAGACAACAGCCCTCTCTC-3’。

2.根据权利要求1所述的一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中通过RT-PCR获得IBDV的VP2基因片段的方法具体为：

1)将模板RNA与RT引物及去RNA酶水混合，得到模板RNA/引物混合液；

2)将模板RNA/引物混合液与缓冲液、dNTP、RNase抑制剂和反转录酶的混合液进行反应，得到RT产物；

3)以RT产物为模板，用引物VP2-F/VP2-R进行PCR扩增，得到VP2基因片段；

各引物序列分别如下：

VP2-F：5’-TTAAGAAAAAATACGGGTAGAAGCCACCATGACAAACCTGCAAGATC-3’；

VP2-R：5’-GAGAGAGGGCTGTTGTCTGGAATTCTTACCTTATGGCCCGGATTATG-3’；

所述VP2基因片段的长度为1356bp，其序列见SEQ ID NO:15。

3.根据权利要求1所述的一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述RT引物为随机引物或IBDV特异性引物。

4.根据权利要求1所述的一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述pBR322-mFDHN3载体通过如下方法制备得到：

步骤1：将质粒pBR322-DHN3采用SmaI酶切，得到酶切后的质粒；

步骤2：采用引物change-F1-F、change-F1-R和change-F2-F、change-F2-R，以质粒pBR322-DHN3为模板扩增目的片段，得到PCR扩增产物；

步骤3：将酶切后的质粒和PCR扩增产物在重组酶的作用下同源重组，获得pBR322-mFDHN3载体质粒；

各引物序列分别如下：

change-F1-F：

CACCCCCAGCCACACGACCCCATCCACCCGGGACAACACAGGCACAGCTCGGCCAG；

change-F1-R：

CTATAAGGCGCCCCTGTCTCCCTCCTCCGGACGTGGATACAGACCCTTG；

change-F2-F：

GAGGGAGACAGGGGCGCCTTATAGGTGCTGTTATTGGCAGTGTAGC；

change-F2-R：

CTTGGTGTTGCTTGAACTCACCCGGGTGACACGACTGCGAGATATGTTG；

其中，质粒pBR322-DHN3为人工重组得到的DHN3全基因组表达质粒。

5.根据权利要求1所述的一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述F1基因片段长度为1471bp，其序列见SEQ ID NO:16；所述F2基因片段长度为4815bp，其序列见SEQ ID NO:17。

6.根据权利要求1所述的一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述F4基因片段长度为13399bp，其序列见SEQ ID NO:18。

7.根据权利要求1所述的一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述将重组质粒pBR322-mFDHN3-VP2转染BHK-21细胞采用重组质粒pBR322-mFDHN3-VP2与辅助质粒pXJ40-NP、pXJ40-P、pXJ40-L和pXJ40-DE3的合并转染；其中pXJ40-NP、pXJ40-P、pXJ40-L和pXJ40-DE3的目标片段分别为NP基因、P基因、L基因和DE基因，载体为pXJ40。

8.一种表达传染性法氏囊病毒VP2抗原的重组病毒，其特征在于：通过权利要求1～7任一项所述的方法制备得到。

9.权利要求8所述的重组病毒在制备NDV/IBD二联活毒疫苗中的应用。

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