CN113943720A

CN113943720A - 一种绿盲蝽GRK基因、其dsRNA及其合成方法和应用

Info

Publication number: CN113943720A
Application number: CN202111296674.7A
Authority: CN
Inventors: 谭永安; 肖留斌; 乔恒; 赵静; 姜义平; 张杰钰
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-11-03
Filing date: 2021-11-03
Publication date: 2022-01-18

Abstract

本发明公开了一种绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明还公开了编码所述的绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶的基因及其获取方法和应用。本发明还公开了绿盲蝽GRK基因的dsRNA及其应用。本发明合成的GRK基因的dsRNA对绿盲蝽有显著的致死效果，有效控制绿盲蝽的种群数量，为害虫防治提供了新的途径。同时，利用大肠杆菌合成dsRNA，可以在短时间大规模的合成产物，改变了试剂盒不能大量合成dsRNA的缺点。同时该发明成本低廉，适用范围广泛，操作简单，可以重复使用，不受限制。

Description

一种绿盲蝽GRK基因、其dsRNA及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及农业害虫防治技术领域，具体涉及一种绿盲蝽GRK基因、其dsRNA及其dsRNA的高效合成方法和应用。

背景技术

绿盲蝽Apolygus lucorum(Hemiptera：Miridae)属半翅目盲蝽科，是棉花、蔬菜、果树等多种农作物上的重要害虫。近年来，由于我国农业产业结构调整等原因，绿盲蝽在多种作物上为害趋势加重，加之长期依赖化学农药防治，致使绿盲蝽的抗药性日渐增强，对我国农业造成巨大的经济损失。目前农业生产上的绿盲蝽防控面临严峻挑战，急待开拓减少化学农药使用的新型无公害防控手段。

RNA干扰(RNAi)是由外源双链RNA(Double-stranded RNA，dsRNA)介导引起的目的基因mRNA沉默的现象。1998年，首次报道了注射外源dsRNA可造成秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans内源性mRNA的沉默的现象，RNAi迅速成为热点研究。由于其具有高效、特异性强等优点，被广泛应用于昆虫基因的功能研究，并显示出其在病虫害防治方面的巨大潜力。在半翅目昆虫中的研究中，可通过基于表皮蛋白基因CP19的dsRNA注射来有效的控制蚜虫。

G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors，GPCR)是一类七次跨膜的蛋白家族，在传递20-羟基蜕皮酮(20E)的信号，以调控昆虫的变态发育中发挥着重要作用。G蛋白偶联受体激酶(G Protein-Coupled Receptor Kinase，GRK)是一类重要的膜蛋白，可受20E磷酸化，磷酸化后的GRK与β-抑制蛋白(β-arrestins)结合后发生脱敏反应，导致G蛋白不能与GRK结合，从而影响昆虫的正常发育。

因此，通过获得绿盲蝽GRK基因设计dsRNA，利用RNAi技术抑制GRK基因的表达，导致其不能正常发育最终死亡，这可能是未来的新型防治绿盲蝽的方法。但目前合成dsRNA的主要手段是T7试剂盒，成本高，合成量低，不能大规模生产。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶。

本发明还要解决的技术问题是提供了编码所述的绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶的基因及其获取方法。

本发明还要解决的技术问题是利用大肠杆菌进行体内合成绿盲蝽GRK基因dsRNA，成本低，效率高，可以达到靶标dsRNA的大规模的合成。

本发明最后要解决的技术问题是提供了该dsRNA在防治绿盲蝽中的应用。

技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供一种绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

编码所述的绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明内容还包括所述的绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶的基因的获取方法，包括以下步骤：

1)设计并合成上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4；

2)提取绿盲蝽总RNA并反转录获取cDNA模板；

3)利用步骤1)合成的上下游引物和步骤2)获取的cDNA模板，通过RCR反应获得绿盲蝽GRK基因序列。

本发明内容还包括绿盲蝽GRK基因的dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明内容还包括所述的dsRNA的高效合成方法，包括以下步骤：

1)PCR扩增目的基因片段：在绿盲蝽GRK基因的dsRNA核苷酸序列的两端加上与L4440载体的同源序列，设计并合成上游引物如SEQ ID NO.6所示和下游引物如SEQ IDNO.7所示，以GRK基因的cDNA序列为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物，纯化PCR产物得到目的基因片段；

2)重组菌株的构建：用同源重组酶连接步骤1)纯化后的目的基因片段与线性化L4440载体得到重组载体并进行表达得到重组菌株；

3)诱导表达：将步骤2)得到的重组菌株诱导表达得到菌体；

4)dsRNA的提取和纯化：提取菌体的总RNA，加入RNase A和DNaes I去除单链RNA和基因组DNA，得到PCR产物；加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇溶液，振荡，离心取上清；加入乙醇，充分混匀，静置，离心弃上清；用乙醇洗涤，离心收集沉淀；干燥后，用无核酸酶水溶解，获得纯化后的dsRNA。

其中，所述L4440载体序列为SEQ ID NO.8所示。

其中，所述步骤3)诱导培养基为LB液体培养基，菌液和诱导培养基按1∶50～1∶100的比例接种。

其中，步骤4)所述RNaseA的终浓度为1～10μg/mL，所述DNaes I的终浓度为0.1～1μg/μL。

本发明绿盲蝽GRK基因的dsRNA的高效合成方法，具体包括以下步骤：

a、PCR扩增目的基因片段：利用CE Design软件，在dsRNA核苷酸序列的两端加上与L4440的同源序列，设计包含Nhe I酶切位点的上游引物SEQ ID NO.5和包含Pst I酶切位点的下游引物SEQ ID NO.6；以GRK基因的cDNA序列为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物，并通过1％琼脂糖凝胶电泳分析；利用DNA胶回收试剂盒进行胶回收纯化，得到纯化后的PCR产物。

b、载体线性化：利用两个限制性内切酶进行L4440载体的双酶切，获得线性化的L4440载体；通过1％琼脂糖凝胶电泳分析，并利用DNA胶回收试剂盒进行胶回收纯化，得到纯化后的产物。

c、表达载体构建：利用同源重组酶连接纯化后的目的基因片段与线性化L4440载体；将重组连接产物转入感受态细胞E.coli DH5α中，涂布于LB固体平板上，在37℃培养箱中，先正置10min后倒置过夜培养12～14h；挑取阳性单菌落进行菌液PCR检测，琼脂糖凝胶电泳分析；将含有目的基因片段的单菌落测序分析，检测重组载体序列的准确性；将鉴定正确的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃过夜孵育24h；利用质粒DNA提取试剂盒提取L4440重组质粒，琼脂糖凝胶电泳检测；将重组质粒转化到表达型菌株E.coli HT115中，涂板，37℃培养箱中过夜培养12-14h；挑取阳性单菌落进行PCR检测，琼脂糖凝胶跑胶验证，等比例1∶1加入50％甘油保存菌种。

d、诱导表达：将含有表达载体的E.coli HT115菌液按1∶100的比例接种于LB液体培养基中，在摇床37℃，200rpm下培养；当OD₆₀₀＝0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，在37℃下诱导表达4～5h；培养结束后，离心去除上清培养基，获得诱导菌体沉淀，加入0.5mg/mL溶菌酶至收集了菌体的离心管中，涡旋使菌体充分悬浮。

e、dsRNA的提取和纯化：利用Trizol法提取菌体的总RNA；加入终浓度为1μg/mLRNaseA和0.1μg/μL DNaesI，在37℃下反应30min，去除单链RNA和基因组DNA，得到PCR产物；加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液，振荡100s以上，离心取上清；加入3倍体积上清的95％乙醇，充分混匀，静置，离心弃上清；用75％乙醇洗涤2次，离心收集沉淀；干燥后，用无核酸酶水溶解，获得纯化后的dsRNA；琼脂糖凝胶电泳检测及分光光度计测定浓度，-80℃保存。

其中，步骤c所述的LB固体培养基成分为10g/L氯化钠，10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物、12g/L琼脂粉和10μg/mL氨苄青霉素；LB液体培养基成分为10g/L氯化钠，10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物和100μg/mL氨苄青霉素。

其中，步骤d所述的LB液体培养基成分为10g/L氯化钠，10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物、100μg/mL氨苄青霉素和12.5μg/mL四环素。

本发明内容还包括所述的绿盲蝽GRK基因的dsRNA在防治绿盲蝽中的应用。

其中，所述应用是通过显微注射仪将dsRNA注射进绿盲蝽体内抑制绿盲蝽GRK基因的表达，从而影响绿盲蝽的生长发育来实现的。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：本发明合成的GRK基因的dsRNA对绿盲蝽有显著的致死效果，有效控制绿盲蝽的种群数量，为害虫防治提供了新的途径。同时，利用大肠杆菌合成dsRNA，可以在短时间大规模的合成产物，改变了试剂盒不能大量合成dsRNA的缺点。同时该发明成本低廉，适用范围广泛，操作简单，可以重复使用，不受限制。

附图说明

图1、利用qPCR技术分别检测GRK基因和内参基因β-actin的相对表达量；

图2、若虫注射dsGRK后，若虫出现畸形图片；

图3、处理组(注射dsGRK)与对照组(注射ddH₂O、dsGFP)相比，绿盲蝽的死亡率显著升高。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1

绿盲蝽GRK基因序列的获取，通过下列步骤：

1、基于绿盲蝽转录组数据，利用Primer Premier5.0软件设计克隆引物，引物序列如下：

上游引物SEQ ID NO.3：ATGGCAGATTTGGAGGCTGT

下游引物SEQ ID NO.4：TCAGTTTCCATTGGTCGTTC

引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2、利用Trizol法提取绿盲蝽总RNA并反转录获取cDNA模板：

选取生长发育健康的4龄绿盲蝽若虫作为样本，5头为一生物学重复，置于液氮中速冻。利用电动研磨器进行研磨，并依照TRIzol Reagent(TIANGEN，北京)进行提取总RNA；按照反转录试剂盒HiScript III RT SuperMix(Vazyme，南京)合成第一链cDNA，作为PCR反应的模板。

3、RCR反应获得绿盲蝽GRK基因序列：

利用步骤1合成的上下游引物和步骤2获取的cDNA模板，通过RCR反应获得绿盲蝽GRK基因序列，反应体系如下：

PCR反应条件为：94℃30s；98℃10s，65℃30s，72℃1min，循环35次；72℃2min。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收，利用DNA胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化后的PCR产物；并连接至T/Ablunt vector载体(Vazyme，南京)上，转入感受态细胞E.coli DH5α中，涂布于LB固体平板上，在37℃培养箱中，先正置10min后倒置过夜培养12～14h；挑取阳性单菌落进行菌液PCR检测，琼脂糖凝胶电泳分析；将验证正确的菌液送至杰李(上海)生物技术公司测序。

测序得到的绿盲蝽GRK基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

4、绿盲蝽GRK基因氨基酸序列分析：

通过ExPASy在线软件对测序获得的GRK基因进行翻译，预测GRK基因编码701个氨基酸，分子量为80.241kD，等电点为6.56。SMART在线预测GRK2蛋白包含4个结构域：G蛋白信号调节区、丝氨酸/苏氨酸激酶结构域、丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶的伸展部分和PH结构域，编码GRK的氨基酸序列为SED ID NO.2所示。

实施例2绿盲蝽GRK基因的dsRNA的高效合成

选取绿盲蝽GRK基因的核苷酸序列中的一段作为制备dsRNA，其核苷酸序列为SEQID NO.5所示。

1、绿盲蝽GRK基因的dsRNA引物的设计

利用CE Design软件，在目的基因片段两端加上与L4440的同源序列，设计的PCR扩增引物，上游引物包含Pst I酶切位点，下游引物Nhe I酶切位点，序列如下：

上游引物GRK-dsRNA-F：SEQ ID NO.6

tccaccggttccatggctagcGGTTTGGAGAAGTTTACGGCTG

下游引物GRK-dsRNA-F：SEQ ID NO.7

cttgatatcgaattcctgcagATGAGAAGGAGTCGGGAAGCTC

小写字母为与L4440载体上的同源序列，下划线部分代表酶切位点；引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2、PCR扩增目的片段

以GRK基因的cDNA序列为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物。

PCR反应体系为：

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收，利用DNA胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化后的PCR产物。

3、L4440载体线性化：

利用两个限制性内切酶Pst I和Nhe I进行L4440载体的双酶切，获得线性化的L4440载体。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：在37℃下，反应30min。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收，利用DNA胶回收试剂盒进行纯化，得到纯化后的L4440线性化载体，L4440载体序列为SEQ ID NO.8所示。

4、表达载体构建：

利用同源重组酶连接纯化后的目的基因片段与线性化L4440载体；将重组连接产物转入感受态细胞E.coli DH5α中，涂布于LB固体平板上，在37℃培养箱中，先正置10min后倒置过夜培养12～14h；挑取阳性单菌落进行菌液PCR检测，琼脂糖凝胶电泳分析；将含有目的基因片段的单菌落测序分析，检测重组载体序列的准确性；将鉴定正确的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃过夜孵育24h；利用质粒DNA提取试剂盒提取L4440重组质粒，琼脂糖凝胶电泳检测；将重组质粒转化到表达型菌株E.coli HT115(DE3)(WEIDI，上海)中，涂板，37℃培养箱中过夜培养12～14h；挑取阳性单菌落进行PCR检测，琼脂糖凝胶跑胶验证，等比例加入50％甘油保存菌种。

其中，LB固体培养基成分为10g/L氯化钠，10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物、12g/L琼脂粉和10μg/mL氨苄青霉素；LB液体培养基成分为10g/L氯化钠，10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物和100μg/mL氨苄青霉素。

5、诱导表达：

将含有表达载体的E.coli HT115菌液按1∶100的比例接种于LB液体培养基中，在摇床37℃，200rpm下培养；当OD₆₀₀＝0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，在37℃下诱导表达4～5h；培养结束后，离心去除上清培养基，获得诱导菌体沉淀，加入0.5mg/mL溶菌酶至收集了菌体的离心管中，涡旋使菌体充分悬浮。

其中，LB液体培养基成分为10g/L氯化钠，10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物、100μg/mL氨苄青霉素和12.5μg/mL四环素。

6、dsRNA的提取和纯化：

利用Trizol提取菌体的总RNA；加入终浓度为1μg/mL RNase A和0.1μg/μL DNaesI，在PCR仪中37℃反应30min，去除单链RNA和基因组DNA，得到PCR产物；加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)溶液，振荡100s以上，离心取上清；加入3倍体积上清的95％乙醇，充分混匀，静置，离心弃上清；用75％乙醇洗涤2次，离心收集沉淀；干燥后，用无核酸酶水溶解，获得纯化后的dsGRK琼脂糖凝胶电泳检测及分光光度计测定浓度，-80℃保存。

实施例3绿盲蝽GRK基因的dsRNA的致死效果

1、dsRNA的注射

选取30头生长健康、龄期相同的3龄绿盲蝽若虫，利用显微注射将500ng dsGRK注射至胸足的基节窝，设置3个生物学重复，作为处理组；选取相同的若虫注射500ng dsGFP及选取相同的若虫不处理组，设置3个生物学重复，作为对照组。

2、绿盲蝽GRK基因的沉默检测

利用qPCR技术分别检测GRK基因和内参基因β-actin的相对表达量，采用2^-ΔΔCt法计算绿盲蝽GRK基因的沉默检测。反应体系(20μL)：SYBR Green Master Mix(YEASEN，上海)10μL，上下游引物(10pmol/L)各0.4μL，cDNA模板2μL，RNase-free H₂O 7.2μL。反应程序：95℃5min；95℃10s，60℃40s，循环40次；95℃15s，60℃60s，95℃15s形成溶解曲线。每个样品设置3个生物学重复及3个技术重复。

引物序列如下：

上游引物GRK-qPCR-F：SEQ ID NO.8

tccaccggttccatggctagcGGTTTGGAGAAGTTTACGGCTG

下游引物GRK-qPCR-F：SEQ ID NO.9

cttgatatcgaattcctgcagATGAGAAGGAGTCGGGAAGCTC

图1表明，处理组(注射dsGRK)与对照组(注射ddH₂O、dsGFP)相比，绿盲蝽GRK基因的表达量显著降低，结果表明了注射GRK基因的dsRNA对该基因具有明显的沉默效应。

3、注射dsRNA对绿盲蝽若虫生长发育的影响

处理组若虫注射dsGRK后，若虫出现畸形，不能进行正常的生长发育，如图2所示。图3表明，处理组(注射dsGRK)与对照组(注射ddH₂O、dsGFP)相比，绿盲蝽的死亡率显著升高，达到50％以上。结果表明GRK基因在绿盲蝽的生长发育过程中起到重要作用。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种绿盲蝽GRK基因、其dsRNA及其合成方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2106

<212> DNA

<213> 绿盲蝽GRK基因(Apolygus lucorum)

<400> 1

atggcagatt tggaggctgt gctggcggat gtcagctacc ttatggccat ggagaagtca 60

aaatgcactc cagcggccag agccagcaag aaaatcgtac ttccggaccc aagtgtcagg 120

agcgtgatgc acaaatacct cgaaaagaag aacgaagtga atttcgataa aatattcaac 180

caagttctgg gattccttct cttcaaggac tactgcgaga acgtgtccga agaacccgtt 240

cctcaactga aattctacga agagattaag gaatacgaga aactcgacaa tccggaggac 300

aggaggaagt cggctcgcca aatctacgac aagtttatca tgaaggagct tctcgcccac 360

gcacacgaat accctcgaga cgccgtcgca catgtacaga aatatctcat gaaaaacgaa 420

gttccagtta atcttttcga gccttacatt caagaaatat tcaatcactt gcgaggagaa 480

ccatttagaa aatttttaga aagtgataaa tacacgcgtt tttgccaatg gaaaaattta 540

gaattaaata tacagctgac aatgaacgac ttcagcgtcc atcggatcat cgggcgcgga 600

gggtttggag aagtttacgg ctgccggaag gccgacactg gcaaaatgta cgccatgaaa 660

tgcctcgata agaagaggat caagatgaag cagggggaaa cgctggcact caacgaaagg 720

atcatgcttt ctctagtcag tacgggggtg gactgtccgt tcatagtttg tatgacttac 780

gccttccaca cgccagacaa gctatgcttc atcctcgatc ttatgaatgg aggagacctt 840

cactatcacc tcagccagca cggagtcttc aatgagatcg aaatgaagtt ttacgccgct 900

gaagtgattc ttgggctgga acacatgcac agacggtaca tcgtgtatcg agacctcaag 960

cctgccaaca tcctcctaga cgagcatgga cacgtcagga tatccgacct tgggctcgcc 1020

tgtgatttct ccaagaagaa acctcatgcc agcgttggta ctcacggcta catggcgcct 1080

gaggtcttga gcaagggcac tgcctacgat tccagcgccg actggttctc ctttgggtgc 1140

atgctctaca agcttctcaa ggggcactcg cctttcaggc aacataaaac cagagacaaa 1200

cacgaaattg accgaatgac cctcacaatg aatgtcgagc ttcccgactc cttctcatcg 1260

gaattgagag acctcctaga acggcttctc atgagggaca tcgacaagag gctgggctgc 1320

tgtggaaaag gctctgacga agtgaaggaa caccctttct tcgagggtct agattggcag 1380

caggtctacg ttcaaaagta tccacctccg ctgatcccac ctcgaggaga agttaatgca 1440

gctgatgcct ttgatattgg ttcgttcgac gaagaagata ccaaagggat taagttgacc 1500

gacgcggacc aggatctcta caagaacttc cctctggtca tttctgagag gtggcagagc 1560

gaagtggcgg aaacagtatt cgaaaccatc aaccaagaag ctgaccgaac ggagcagaaa 1620

cggaaagcta agcagaaaca gcgatttgac tgtgatgaaa aagagtcgga ttgcattctt 1680

cacgggtata ttaagaagct gggtggaccg tttgcgtcag cttggcagac tcgctacgca 1740

aagttgtacc ccaaccgtct cgagctgcac cccgagtccg gctcaaccaa acctgatttg 1800

gttttcatgg atcaggtcga agaagttcct caggatcttg tcactgtgaa gggtgagcag 1860

tgcataaaca tcaaaacccg agatgccaaa atcgtcttaa ccaattccga tgacattggt 1920

ctgaaagagt ggctccagtc cctgcgatcg actcataaaa actccctaga actgctcggt 1980

aacatggcca agaaagcagg taagatctac gggacgacag agggcggagg cggcggtggc 2040

ggagggctga acaagggcgc acccgaacga gtcatcgccg ctccccgaac gaccaatgga 2100

aactga 2106

<210> 2

<211> 701

<212> PRT

<213> 绿盲蝽GRK(Apolygus lucorum)

<400> 2

Met Ala Asp Leu Glu Ala Val Leu Ala Asp Val Ser Tyr Leu Met Ala

1 5 10 15

Met Glu Lys Ser Lys Cys Thr Pro Ala Ala Arg Ala Ser Lys Lys Ile

20 25 30

Val Leu Pro Asp Pro Ser Val Arg Ser Val Met His Lys Tyr Leu Glu

35 40 45

Lys Lys Asn Glu Val Asn Phe Asp Lys Ile Phe Asn Gln Val Leu Gly

50 55 60

Phe Leu Leu Phe Lys Asp Tyr Cys Glu Asn Val Ser Glu Glu Pro Val

65 70 75 80

Pro Gln Leu Lys Phe Tyr Glu Glu Ile Lys Glu Tyr Glu Lys Leu Asp

85 90 95

Asn Pro Glu Asp Arg Arg Lys Ser Ala Arg Gln Ile Tyr Asp Lys Phe

100 105 110

Ile Met Lys Glu Leu Leu Ala His Ala His Glu Tyr Pro Arg Asp Ala

115 120 125

Val Ala His Val Gln Lys Tyr Leu Met Lys Asn Glu Val Pro Val Asn

130 135 140

Leu Phe Glu Pro Tyr Ile Gln Glu Ile Phe Asn His Leu Arg Gly Glu

145 150 155 160

Pro Phe Arg Lys Phe Leu Glu Ser Asp Lys Tyr Thr Arg Phe Cys Gln

165 170 175

Trp Lys Asn Leu Glu Leu Asn Ile Gln Leu Thr Met Asn Asp Phe Ser

180 185 190

Val His Arg Ile Ile Gly Arg Gly Gly Phe Gly Glu Val Tyr Gly Cys

195 200 205

Arg Lys Ala Asp Thr Gly Lys Met Tyr Ala Met Lys Cys Leu Asp Lys

210 215 220

Lys Arg Ile Lys Met Lys Gln Gly Glu Thr Leu Ala Leu Asn Glu Arg

225 230 235 240

Ile Met Leu Ser Leu Val Ser Thr Gly Val Asp Cys Pro Phe Ile Val

245 250 255

Cys Met Thr Tyr Ala Phe His Thr Pro Asp Lys Leu Cys Phe Ile Leu

260 265 270

Asp Leu Met Asn Gly Gly Asp Leu His Tyr His Leu Ser Gln His Gly

275 280 285

Val Phe Asn Glu Ile Glu Met Lys Phe Tyr Ala Ala Glu Val Ile Leu

290 295 300

Gly Leu Glu His Met His Arg Arg Tyr Ile Val Tyr Arg Asp Leu Lys

305 310 315 320

Pro Ala Asn Ile Leu Leu Asp Glu His Gly His Val Arg Ile Ser Asp

325 330 335

Leu Gly Leu Ala Cys Asp Phe Ser Lys Lys Lys Pro His Ala Ser Val

340 345 350

Gly Thr His Gly Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu Ser Lys Gly Thr Ala

355 360 365

Tyr Asp Ser Ser Ala Asp Trp Phe Ser Phe Gly Cys Met Leu Tyr Lys

370 375 380

Leu Leu Lys Gly His Ser Pro Phe Arg Gln His Lys Thr Lys Asp Lys

385 390 395 400

His Glu Ile Asp Arg Met Thr Leu Thr Met Asn Val Glu Leu Pro Asp

405 410 415

Ser Phe Ser Ser Glu Leu Arg Asp Leu Leu Glu Arg Leu Leu Met Arg

420 425 430

Asp Ile Asp Lys Arg Leu Gly Cys Cys Gly Lys Gly Ser Asp Glu Val

435 440 445

Lys Glu His Pro Phe Phe Glu Gly Leu Asp Trp Gln Gln Val Tyr Val

450 455 460

Gln Lys Tyr Pro Pro Pro Leu Ile Pro Pro Arg Gly Glu Val Asn Ala

465 470 475 480

Ala Asp Ala Phe Asp Ile Gly Ser Phe Asp Glu Glu Asp Thr Lys Gly

485 490 495

Ile Lys Leu Thr Asp Ala Asp Gln Asp Leu Tyr Lys Asn Phe Pro Leu

500 505 510

Val Ile Ser Glu Arg Trp Gln Ser Glu Val Ala Glu Thr Val Phe Glu

515 520 525

Thr Ile Asn Gln Glu Ala Asp Arg Thr Glu Gln Lys Arg Lys Ala Lys

530 535 540

Gln Lys Gln Arg Phe Asp Cys Asp Glu Lys Glu Ser Asp Cys Ile Leu

545 550 555 560

His Gly Tyr Ile Lys Lys Leu Gly Gly Pro Phe Ala Ser Ala Trp Gln

565 570 575

Thr Arg Tyr Ala Lys Leu Tyr Pro Asn Arg Leu Glu Leu His Pro Glu

580 585 590

Ser Gly Ser Thr Lys Pro Asp Leu Val Phe Met Asp Gln Val Glu Glu

595 600 605

Val Pro Gln Asp Leu Val Thr Val Lys Gly Glu Gln Cys Ile Asn Ile

610 615 620

Lys Thr Arg Asp Ala Lys Ile Val Leu Thr Asn Ser Asp Asp Ile Gly

625 630 635 640

Leu Lys Glu Trp Leu Gln Ser Leu Arg Ser Thr His Lys Asn Ser Leu

645 650 655

Glu Leu Leu Gly Asn Met Ala Lys Lys Ala Gly Lys Ile Tyr Gly Thr

660 665 670

Thr Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Asn Lys Gly Ala Pro

675 680 685

Glu Arg Val Ile Ala Ala Pro Arg Thr Thr Asn Gly Asn

690 695 700

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggcagatt tggaggctgt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcagtttcca ttggtcgttc 20

<210> 5

<211> 657

<212> DNA

<213> 绿盲蝽GRK基因的dsRNA(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtttggaga agtttacggc tgccggaagg ccgacactgg caaaatgtac gccatgaaat 60

gcctcgataa gaagaggatc aagatgaagc agggggaaac gctggcactc aacgaaagga 120

tcatgctttc tctagtcagt acgggggtgg actgtccgtt catagtttgt atgacttacg 180

ccttccacac gccagacaag ctatgcttca tcctcgatct tatgaatgga ggagaccttc 240

actatcacct cagccagcac ggagtcttca atgagatcga aatgaagttt tacgccgctg 300

aagtgattct tgggctggaa cacatgcaca gacggtacat cgtgtatcga gacctcaagc 360

ctgccaacat cctcctagac gagcatggac acgtcaggat atccgacctt gggctcgcct 420

gtgatttctc caagaagaaa cctcatgcca gcgttggtac tcacggctac atggcgcctg 480

aggtcttgag caagggcact gcctacgatt ccagcgccga ctggttctcc tttgggtgca 540

tgctctacaa gcttctcaag gggcactcgc ctttcaggca acataaaacc agagacaaac 600

acgaaattga ccgaatgacc ctcacaatga atgtcgagct tcccgactcc ttctcat 657

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tccaccggtt ccatggctag cggtttggag aagtttacgg ctg 43

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cttgatatcg aattcctgca gatgagaagg agtcgggaag ctc 43

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggaggtacca ccatgtaccc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggagccac cgatccatac 20

<210> 10

<211> 2790

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 60

gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 120

gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 180

gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 240

acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 300

tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 360

ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt 420

catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat 480

ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag 540

caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct 600

ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt 660

tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg 720

cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca 780

aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt 840

tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat 900

gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac 960

cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 1020

aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt 1080

tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt 1140

tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa 1200

gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt 1260

atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa 1320

taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctaa attgtaagcg ttaatatttt 1380

gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat 1440

cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt 1500

ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt 1560

ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag 1620

gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg 1680

aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc 1740

gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc 1800

gctacagggc gcgtcccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt 1860

gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag 1920

ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgagcgcgc 1980

gtaatacgac tcactatagg gcgaattggg taccgggccc cccctcgagg tcgacggtat 2040

cgataagctt gatatcgaat tcctgcagcc cgggggatcc acgcgtcacg tggctagcca 2100

tggaaccggt ggatccacta gttctagagc ggccgccacc gcggtggagc tcgaattcat 2160

cgatgatatc agatctgccg gtctccctat agtgagtcgt attaatttcg ataagccagg 2220

ttgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 2280

ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 2340

tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 2400

tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 2460

gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 2520

ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 2580

tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 2640

agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 2700

atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 2760

acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 2790

Claims

1.一种绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.编码权利要求1所述的绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.权利要求2所述的绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶的基因的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）设计并合成上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4；

2）提取绿盲蝽总RNA并反转录获取cDNA模板；

3）利用步骤1）合成的上下游引物和步骤2）获取的cDNA模板，通过RCR反应获得绿盲蝽GRK基因序列。

4.绿盲蝽GRK基因的dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.权利要求4所述的dsRNA的高效合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）PCR扩增目的基因片段：在绿盲蝽GRK基因的dsRNA核苷酸序列的两端加上与L4440载体的同源序列，设计并合成上游引物如SEQ ID NO.6所示和下游引物如SEQ ID NO.7所示，以GRK基因的cDNA序列为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物，纯化PCR产物得到目的基因片段；

2）重组菌株的构建：用同源重组酶连接步骤1）纯化后的目的基因片段与线性化L4440载体得到重组载体并进行表达得到重组菌株；

3）诱导表达：将步骤2）得到的重组菌株诱导表达得到菌体；

4）dsRNA的提取和纯化：提取菌体的总RNA，加入RNase A和DNaesⅠ去除单链RNA和基因组DNA，得到PCR产物；加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇溶液，振荡，离心取上清；加入乙醇，充分混匀，静置，离心弃上清；用乙醇洗涤，离心收集沉淀；干燥后，用无核酸酶水溶解，获得纯化后的dsRNA。

6.根据权利要求5所述的dsRNA的高效合成方法，其特征在于，步骤1）所述L4440载体序列为SEQ ID NO.8所示。

7.根据权利要求5所述的dsRNA的高效合成方法，其特征在于，步骤3）所述诱导培养基为LB液体培养基，菌液和诱导培养基按1：50~1：100的比例接种。

8.根据权利要求5所述的dsRNA的高效合成方法，其特征在于，步骤4）中所述RNase A的终浓度为1~10 μg/mL，所述DNaesⅠ的终浓度为 0.1~1 μg/μL 。

9.权利要求4所述的绿盲蝽GRK基因的dsRNA在防治绿盲蝽中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用是通过显微注射仪将dsRNA注射进绿盲蝽体内抑制绿盲蝽GRK基因的表达。