CN114702597B - 表达植物抗菌肽Ct-AMP1的工程菌构建与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表达植物抗菌肽Ct‑AMP1的工程菌构建与应用，所述植物抗菌肽Ct‑AMP1融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。其编码基因序列如SEQ ID No.2所示。本发明的蛋白对大肠杆菌杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌具有显著治疗调节作用。食品级枯草芽孢杆菌表达的阳离子多肽复合物通过静电结合直接的抑杀大肠杆菌杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌。修复由于细菌感染引起的肠道黏膜受损。

Description

表达植物抗菌肽Ct-AMP1的工程菌构建与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种食品级枯草芽孢杆菌(不含耐药基因)抑杀大肠杆菌杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌的植物抗菌肽 Ct-AMP1与枯草芽孢杆菌分泌肽融合蛋白、融合基因、表达载体及其基因工程菌。
背景技术
耐药菌引起的腹泻与感染日益严重，大肠杆菌杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌等各种细菌性疾病，以及动物寄生虫、真菌、病毒感染等长期以来是畜牧、禽蛋养殖中瓶颈限制问题，严重阻碍畜牧业的发展，每年由细菌性感染导致的直接经济损失高达数十亿元。目前畜牧养殖中，抗生素禁用以后，主要以中药和益生菌添加解决临床疾病预防问题，但中药材成本高，长期使用后在动物体内残留、并富集，直接影响了畜产品的品质和间接损害人类的健康，普通益生菌功效不足，因此亟待需要安全、新型抗生素替代品来控制疾病和促进动物健康生长。
目前，我国农业农村部印发《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》农办牧【2021】43号文件指出，转基因发酵制品生产菌株应不具有获得性耐药、不产生临床相关抗菌药物、无致病性/产毒能力、遗传修饰未引入/改变关注基因，且在发酵制品中未检出生产菌株重组DNA的生产菌株判定为无危害，发酵制品无生产菌株引起的风险。具有获得性耐药的生产菌株判定为具有危害。若发酵制品生产菌株携带获得性耐药基因，并在发酵制品中检测到耐药基因的完整DNA片段，则发酵制品对靶动物和暴露物种具有风险，不建议该菌株用于发酵制品的生产；若发酵制品中未检出生产菌株相关耐药基因DNA片段，则认为不具有风险。因此要求转基因菌株中，转入DNA片段不含耐药基因。
农业部2045号公告及后续补充公布的饲用微生物添加剂有15种。其中芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌是应用最多的微生物添加剂菌种。芽孢杆菌由于稳定性好、抗逆性强、复活率高，通过与病原菌竞争营养物质，抑制病原菌；提高机体的免疫机能，并提供营养物质等作用，调节消化道健康，增强动物体的免疫功能，达到促进目标动物的生长、提高饲料的转化率的目的。
植物防御素抗真菌肽1(Ct-AMP1)仅由69个氨基酸组成，Ct-AMP1是一种具有很强抗菌效果的多肽，多肽的序列中含有的大量的Cys。Ct-AMP1被用于食品抗菌中。在多肽合成中，大量的Cys会增加多肽合成纯化的难度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种食品级枯草芽孢杆菌分泌表达融合植物抗菌肽Ct-AMP1的工程菌，用于预防和治疗家畜细菌性腹泻。
本发明的技术方案为：植物抗菌肽Ct-AMP1融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如下所示：
MIQKRKRTDSFVQTCAYVHAVIVSLPITKTSANLCERASLTWTGNCGNTGHCDTQCR NWESAKHGACHKRGNWKCFCYFDCYGGACHYQFPSVKCFCKRQC(SEQ ID No.1)。
其中，MIQKRKRTDSFVQTCAYVHAVIVSLPITKTSA为分泌信号肽；
NLCERASLTWTGNCGNTGHCDTQCRNWESAKHGACHKRGNWKCFCYFDCYGGACHYQFPSVKCFCKRQC为植物抗菌肽Ct-AMP1。
本发明的融合蛋白通过SA氨基酸序列链接，能被枯草芽孢杆菌外周蛋白酶切割成独立的活性结构域，利用SA氨基酸柔性序列保护了抗菌肽Ct-AMP1的独立折叠， MIQKRKRTDSFVQTCAYVHAVIVSLPITKTSA氨基酸序列保障该融合蛋白能够有效的被分泌蛋白酶激酶切割识别。有效地保障了抗菌肽Ct-AMP1在肠黏膜层释放，抑杀肠道内病原微生物，调节免疫应答，同时，抗菌肽Ct-AMP1能够通过M细胞调节肠系膜淋巴结(P氏小结)内部的淋巴细胞。
本发明的另一方面是提供一种分离的编码植物抗菌肽Ct-AMP1融合蛋白的核酸，由于核苷酸密码子的简并性，可以有多种编码序列。
优选地，所述碱基序列如SEQ ID No.2所示，具体如下： ATGATCCAAAAACGTAAACGTACAGATTCTTTCGTTCAAACATGCGCTTACG TTCATGCTGTTATCGTTTCTCTTCCTATCACAAAAACATCTGCTAACCTTTGC GAACGTGCTTCTCTTACATGGACAGGCAACTGCGGCAACACAGGCCATTGCG ATACACAATGCCGTAACTGGGAATCTGCTAAACATGGCGCTTGCCATAAACG TGGCAACTGGAAATGCTTCTGCTACTTCGATTGCTACGGCGGCGCTTGCCAT TACCAATTCCCTTCTGTTAAATGCTTCTGCAAACGTCAATGC(SEQ ID No.2)
将真核基因克隆在原核生物中表达时，需将真核生物偏爱的密码子改为原核生物(枯草芽孢杆菌)偏爱的密码子，才能实现高效表达。本发明的植物抗菌肽Ct-AMP1融合蛋白的基因参照NCBI－gene bank数据库的基因序列。根据相应细胞的密码子偏好性对基因序列进行密码子优化，该融合基因能实现融合基因的高效表达，带有自动分割位点，通过自动分割位点的碱基片断连接抗菌肽AFP1蛋白，表达后的融合蛋白在肠道里被胰蛋白酶激酶切割成独立的活性结构域。
一种表达载体，含有编码植物抗菌肽Ct-AMP1的融合蛋白的碱基序列或SEQ IDNo.2 所示的碱基序列。
进一步地，所述的表达载体为质粒plasmid 2021，图谱如图3所示，DNA序列如SEQID No.4所示。该质粒能够去除在克隆过程中所使用的amp抗性基因片段。通过ECORⅠ，可实现酶切去除Amp基因。
表达上述所述植物抗菌肽Ct-AMP1的融合蛋白的基因工程菌，含有上述表达载体，从而使该工程菌能表达SEQ ID No.1所示氨基酸序列的融合蛋白。
进一步地，所述的基因工程菌为枯草芽孢杆菌BS168/WXP，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24234。该菌株为枯草芽孢杆菌BS168的改进表达分泌型菌株，该菌株将多余的蛋白水解酶基因敲除掉，有利于分泌蛋白的稳定性。其基因型为：nprE aprE epr bpr mpr::ble nprB::bsrΔvpr wprA::hyg cm::neoydcDE::Pxyl- ycdE；NeoR。
本发明的抗菌肽Ct-AMP1的融合蛋白或上述所述的基因工程菌在制备预防或/和治疗家畜细菌性腹泻药物上的应用。
进一步地，所述细菌性腹泻是指沙门氏菌或大肠杆菌杆菌等引起的腹泻。
1)以SEQ ID No.3所示的DNA片段为模板，以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列为引物，PCR扩增，得到融合基因扩增片段；
2)采用XholⅠ酶酶切载体质粒plasmid 2021与扩增片段，采用同源重组酶将酶切后的载体质粒与扩增片段连接；
3)将连接产物转化大肠杆菌杆菌获得阳性克隆子，提取质粒，测序验证后，得到所述融合基因的表达载体；
4)用EcoRⅠ酶切步骤3)得到的表达载体，酶切后的片段电泳分离，大片段用T4连接酶连接后得到无抗性基因残留的质粒与融合蛋白基因，然后电转枯草芽孢杆菌BS168/wxp；
所述质粒plasmid 2021的DNA序列如SEQ ID No.4所示，枯草芽孢杆菌BS168/wxp保藏编号为CGMCC No.24234。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的融合蛋白对大肠杆菌杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌具有显著治疗调节作用。枯草芽孢杆菌表达的复合物通过直接的抑杀大肠杆菌杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌。修复受损肠道黏膜。
融合基因在表达后在芽孢杆菌体外和肠道内自动分割为单独的活性蛋白。融合蛋白能够调节各类肠道细胞的细胞周期，加速修复与提高肠道免疫力。肠道黏膜层富集有大量的粒细胞与巨噬细胞，而肠系膜淋巴结富集有大量的免疫淋巴细胞，如NK cell、T cell、B cell、树突细胞等。融合蛋白在肠道黏膜和肠系膜淋巴结同时行使功能并发挥作用，既可以杀灭感染的细菌，也可以同时修复肠道，提高免疫力，实现多种益生功能。
附图说明
图1：为PCR片段电泳图片，重组质粒构建图片；通道0：marker DL5000；通道1：重组基因Ct-AMP1；
图2：通道1：重组质粒plasmid 2021/Ct-AMP1，通道2：重组质粒单酶切；通道3：marker DL10000，
图3：plasmid 2021质粒图谱
图4：质粒去抗性基因示意图
图5：为重组融合蛋白亲水性分析。
图6：为重组融合蛋白结构蛋白折叠构象图片。
图7：Ct-AMP1-BS168/WK对致病菌抑菌效果：A：对大肠杆菌抑菌圈抑制效果；B：对沙门氏菌ATCC58785抑菌效果；C：对金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25922抑制效果； D:对铜绿假单胞菌抑菌效果；E：对白色念珠球菌的抑制效应；
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
质粒plasmid 2021来自于pHT43,具有amp抗性，改造主要是在amp的两端引入ECORI酶切位点。在大肠杆菌克隆完成后可以通过ECOR I酶切，去掉氨苄抗性基因，从而在芽孢杆菌电转化后无抗性基因残留其中。质粒图谱见图3，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS168/wxp，于2022年1月4日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24234。
实施例1
植物抗菌肽Ct-AMP1融合蛋白，氨基酸序列如SEQID No.1，通过抗菌肽Ct-AMP1的融合基因的表达得到。
其中，MIQKRKRTDSFVQTCAYVHAVIVSLPITKT为分泌信号肽；
NLCERASLTWTGNCGNTGHCDTQCRNWESAKHGACHKRGNWKCFCYFDCYGGACHYQFPSVKCFCKRQC为植物抗菌肽Ct-AMP1。
本发明的融合蛋白通过SA氨基酸序列链接，能被枯草芽孢杆菌外周蛋白酶切割成独立的活性结构域，利用SA氨基酸柔性序列保护了抗菌肽Ct-AMP1的独立折叠， MIQKRKRTDSFVQTCAYVHAVIVSLPITKTSA氨基酸序列保障该融合蛋白能够有效的被分泌蛋白酶激酶切割识别。有效地保障了抗菌肽Ct-AMP1在肠黏膜层释放，抑杀肠道内病原微生物，调节免疫应答，同时，抗菌肽Ct-AMP1能够通过M细胞调节肠系膜淋巴结(P氏小结)内部的淋巴细胞。
实施例2编码植物抗菌肽Ct-AMP1融合蛋白的基因的合成，
编码植物抗菌肽Ct-AMP1融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2。
当将真核基因克隆在原核生物中表达时，需将真核生物偏爱的密码子改为原核生物(枯草芽孢杆菌)偏爱的密码子，才能实现高效表达。本发明根据相应细胞的密码子偏好性对基因序列进行密码子优化，设计得到核苷酸序列SEQ ID No.2，再根据该基因序列，人工合成基因。本实施例的融合基因以脱氧核糖核苷酸为底物，在DNA合成仪上合成目标序列的核苷酸片段。
由于遗传密码子兼并性原则，针对不同的原核生物，本发明的融合蛋白序列还可以由其他核酸密码子组合翻译出来。因此本实施例的融合基因序列并非唯一的融合蛋白编码基因。
施例3编码植物抗菌肽Ct-AMP1融合蛋白的基因表达载体的构建
为了与质粒载体连接，在编码序列上下游分别设计了同源臂序列和酶切位点。改进后的核苷酸序列如下所示：
GCGGTACCGAGCTCGCTCGAGATGATCCAAAAACGTAAACGTACAGATTCTTTCGT TCAAACATGCGCTTACGTTCATGCTGTTATCGTTTCTCTTCCTATCACAAAAACATCTGC TAACCTTTGCGAACGTGCTTCTCTTACATGGACAGGCAACTGCGGCAACACAGGCCATT GCGATACACAATGCCGTAACTGGGAATCTGCTAAACATGGCGCTTGCCATAAACGTGG CAACTGGAAATGCTTCTGCTACTTCGATTGCTACGGCGGCGCTTGCCATTACCAATTCCCTTCTGTTAAATGCTTCTGCAAACGTCAATGCTGACTCGAGGGGCTAGCCGCTGCA (SEQ ID No.3)
在DNA合成仪上合成改进后的核苷酸片段。
1)以SEQ ID No.3所示的DNA片段为模板，以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列为引物(上游引物：GCGGTACCGAGCTCGCTCGAG；下游引物：TGCAGCGGCTAGCCCCTCGAGTCA)，PCR扩增，得到融合基因扩增片段；
2)采用XholⅠ酶酶切载体质粒plasmid 2021与扩增片段，采用同源重组酶将酶切后的载体质粒与扩增片段连接；所述载体质粒plasmid 2021的DNA序列如SEQ ID No.4所示。
3)将连接产物转化大肠杆菌杆菌获得阳性克隆子，提取质粒，测序验证后，得到融合基因表达载体。
PCR扩增条件：
94℃1min
(94℃10s，52℃10s，68℃10s)5cycles
(94℃10s，68℃15s)30cycles
68℃1min
酶切体系：XholⅠ酶切Q buffer(购自Fermentals)1μL XholⅠ，10μL 2X Q buffer，9μL ddH2O 16℃10min。
实施例4表达植物抗菌肽Ct-AMP1融合蛋白的基因工程菌的构建
将实施例3得到的基因表达载体用EcoRⅠ酶切，酶切后的片段电泳分离，大片段用T4 连接酶连接后得到无抗性基因残留的质粒与融合蛋白基因，然后电转枯草芽孢杆菌BS168/wxp；草芽孢杆菌BS168/wxp保藏编号为CGMCC No.24234。
实验试剂：
GM:LB+0.5M山梨醇
ETM:0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油
RM：LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇
电转仪：新芝基因导入仪
电转具体方法如下：
1)新鲜平板挑枯草芽孢杆菌BS168/wxp单菌落(小一点为好)接种于5ml LB培养基中，过夜培养。
2)测量摇管内OD，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD在0.19-0.2之间。培养基为 50mlGM。37℃，200rpm培养至OD600＝1.0(大约3-4小时)左右。
3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm 8min 4℃离心收集菌体。
4)用40ml预冷的电转缓冲液ETM洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗3次。
5)将洗涤后的菌体重悬于等500μl的ETM中，每管分装60μl。
6)将60μl感受态细胞中加入1-6μl质粒，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯(1mm)中，电击一次。电转仪设置：2.0kv,25μF200Ω，1mm,电击1次.(持续时间4.5ms-5ms之间)
7)电击完毕立即加入1ml复苏培养基RM，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养。
实施例5：表达植物抗菌肽Ct-AMP1融合蛋白的基因工程菌的生产工艺
菌种转生产种子
培养基：
(1)LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸馏水1000ml，pH为7，(可溶性淀粉20g)琼脂20g。
(2)种子培养基：LB培养基+K2HPO4 0.8％，pH：7.0-7.5。
培养条件：
转速220转每分，温度37-39℃；
培养时间：8-12小时；
Figure BDA0003547841680000071
种子培养超过12小时，菌种形态变短，部分自融(抗菌肽低表达积累)，部分转芽孢，整体菌数下降，不利于接种。
液体发酵：
大罐发酵培养基1：LB培养基：工业蛋白胨10g，工业酵母膏5g，工业NaCl 10g，工业葡萄糖2-5g蒸馏水1000ml，pH为7。
大罐发酵培养基2：豆饼粉5.6％，玉米粉7.2％，K2HPO4 0.8％，(NH4)2SO4 0.4％，NH4Cl 0.13％，CaCl2 0.13％，MnSO4 0.2％，MgSO4 0.2％；
培养基1用于固体发酵所需液体菌种，发酵时间一般为12-16小时，根据菌体生长状态调节；
培养基2主要用于直接发酵，用于诱导芽孢形成，培养时间一般为24-36小时。
罐压：0.05MPa，通气量/培养量＝1:1.2～1:1.5(L/分钟：/L)。
实施例6：大肠杆菌杆菌抑菌实验
1.实验设计
实验目的
探究本发明构建的表达植物抗菌肽Ct-AMP1融合蛋白的基因工程菌是否具有抑菌效果，以实施例5制备得到的基因工程菌发酵液(Ct-AMP1原液)进行试验。
2.实验方法
96孔板布局设计
Figure BDA0003547841680000081
2.1阳性菌活化，将冻存大肠杆菌杆菌菌种按1％接种量接种到新鲜LB试管当中，培养 12h，使用LB无菌操作下稀释菌液至OD600值0.8之间，备用；
2.2按96孔板布局设计，进行加样，配置200ul体系；
2.3阳性菌液10ul上样需要加菌的孔槽中；
2.4加样完成后，37℃静置培养，连续测量96孔板0h、3h、18h的OD600值，以扣除空白后的数值作为记录；
2.5抑菌效果判定标准：以阴性对照孔OD600值为参照，高于此值的孔槽为促进抑菌生长，低于此值的孔槽为抑菌细菌生长，具有抑菌活性。
3.实验结果：
表：MIC：18h OD600读数
Figure BDA0003547841680000082
从图7中(A)看出，本发明构建的基因工程菌分泌表达的融合抗菌肽蛋白溶液，稀释2 倍能100％的抑制大肠杆菌。稀释16倍仍然有30％的抑菌效率。
实施例7：沙门氏菌抑菌实验
1.实验设计
实验目的
探究Ct-AMP1枯草芽孢杆菌对沙门氏菌是否具有抑菌效果。
2.实验方法
96孔板布局设计
Figure BDA0003547841680000083
Figure BDA0003547841680000091
2.1阳性菌活化，将冻存沙门氏菌杆菌菌种按1％接种量接种到新鲜LB试管当中，培养 12h，使用LB无菌操作下稀释菌液至OD600值0.8之间，备用；
2.2按96孔板布局设计，进行加样，配置200ul体系；
2.3阳性菌液10ul上样需要加菌的孔槽中；
2.4加样完成后，37℃静置培养，连续测量96孔板0h、3h、18h的OD600值，以扣除空白后的数值作为记录；
2.5抑菌效果判定标准：以阴性对照孔OD600值为参照，高于此值的孔槽为促进抑菌生长，低于此值的孔槽为抑菌细菌生长，具有抑菌活性。
3.实验结果：
表：MIC：18h OD600读数
Figure BDA0003547841680000092
从图7中(B)可以看出，本发明构建的基因工程菌分泌表达的融合抗菌肽蛋白溶液，稀释8倍能100％的抑制沙门氏菌。
实施例8：对金黄色葡萄球菌抑菌实验
1.实验设计
实验目的
探究Ct-AMP1枯草芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌是否具有抑菌效果。
2.实验方法
96孔板布局设计
Figure BDA0003547841680000093
Figure BDA0003547841680000101
2.1阳性菌活化，将冻存金黄色葡萄球菌杆菌菌种按1％接种量接种到新鲜LB试管当中，培养12h，使用LB无菌操作下稀释菌液至OD600值0.8之间，备用；
2.2按96孔板布局设计，进行加样，配置200ul体系；
2.3阳性菌液10ul上样需要加菌的孔槽中；
2.4加样完成后，37℃静置培养，连续测量96孔板0h、3h、18h的OD600值，以扣除空白后的数值作为记录；
2.5抑菌效果判定标准：以阴性对照孔OD600值为参照，高于此值的孔槽为促进抑菌生长，低于此值的孔槽为抑菌细菌生长，具有抑菌活性。
3.实验结果：
表：MIC：18h OD600读数
Figure BDA0003547841680000102
从图7中(C)可以看出，本发明构建的基因工程菌分泌表达的融合抗菌肽蛋白溶液，稀释8倍能100％的抑制金黄色葡萄球菌。稀释16倍仍然有50％的抑菌效率。
实施例9：对白色念珠菌抑菌实验
1.实验设计
实验目的
探究Ct-AMP1枯草芽孢杆菌对白色念珠菌是否具有抑菌效果。
2.实验方法
96孔板布局设计
Figure BDA0003547841680000103
Figure BDA0003547841680000111
2.1阳性菌活化，将冻存白色念珠菌杆菌菌种按1％接种量接种到新鲜LB试管当中，培养 12h，使用LB无菌操作下稀释菌液至OD600值0.8之间，备用；
2.2按96孔板布局设计，进行加样，配置200ul体系；
2.3阳性菌液10ul上样需要加菌的孔槽中；
2.4加样完成后，37℃静置培养，连续测量96孔板0h、3h、18h的OD600值，以扣除空白后的数值作为记录；
2.5抑菌效果判定标准：以阴性对照孔OD600值为参照，高于此值的孔槽为促进抑菌生长，低于此值的孔槽为抑菌细菌生长，具有抑菌活性。
3.实验结果：
表：MIC：18h OD600读数
Figure BDA0003547841680000112
从图7中(D)可以看出，本发明构建的基因工程菌分泌表达的融合抗菌肽蛋白溶液，表达上清原液能100％的抑制白色念珠菌。稀释4-8倍仍然有30％的抑菌效率。
实施例10：对铜绿假单胞菌抑菌实验
1.实验设计
实验目的
探究Ct-AMP1枯草芽孢杆菌对铜绿假单胞菌是否具有抑菌效果。
2.实验方法
96孔板布局设计
Figure BDA0003547841680000121
2.1阳性菌活化，将冻存铜绿假单胞菌杆菌菌种按1％接种量接种到新鲜LB试管当中，培养12h，使用LB无菌操作下稀释菌液至OD600值0.8之间，备用；
2.2按96孔板布局设计，进行加样，配置200ul体系；
2.3阳性菌液10ul上样需要加菌的孔槽中；
2.4加样完成后，37℃静置培养，连续测量96孔板0h、3h、18h的OD600值，以扣除空白后的数值作为记录；
2.5抑菌效果判定标准：以阴性对照孔OD600值为参照，高于此值的孔槽为促进抑菌生长，低于此值的孔槽为抑菌细菌生长，具有抑菌活性。
3.实验结果：
表：MIC：18h OD600读数
Figure BDA0003547841680000122
从图7(E)可以看出，本发明构建的基因工程菌分泌表达的融合抗菌肽蛋白溶液，表达上清原液稀释8倍能100％的抑制铜绿假单胞菌。
实施例11：动物实验
猪场实验：
1.1试验方案
1)猪群处理：选取断奶仔猪330头分为试验组和对照组，试验组150头，对照组180头。试验组将重组抗菌肽Ct-AMP1枯草芽孢杆菌按千分之一添加日粮中。对照组按常规饲喂。
2)耗料参数：
每头仔猪重组抗菌肽枯草芽孢杆菌Ct-AMP1肽用量：饲料采食量的千分之一添加，含量为1000亿cfu/g。
3)在试验期间所有猪按正常的免疫程序进行疫苗接种，并按常规方式进行管理。试验阶段从35日龄至64日龄，共30天
1.2供试材料
重组抗菌肽Ct-AMP1枯草芽孢杆菌200kg。
1.3试验目的
1)仔猪生长速度的对比。
2)仔猪死亡率的对比。
3)仔猪腹泻率的对比。
实验组：口服0.1％重组抗菌肽Ct-AMP1枯草芽孢杆菌30天；
对照组：常规日粮与抗生素添加组30天。
生长情况
Figure BDA0003547841680000131
其它观察：1.腹泻减少；粪便成型，臭味降低；2.治疗成本降低
实施例14：
禽(鸡)动物实验：
本发明的重组抗菌肽Ct-AMP1枯草芽孢杆菌在瑞丰鸡场应用试验
试验目的：观察饲喂产品对产蛋鸡肠道的影响
试验方法：针对同一鸡舍的产蛋鸡进行拌料饲喂，分为试验组和对照组，试验组为30000羽，对照组为30000羽，试验组添加本发明的重组抗菌肽Ct-AMP1枯草芽孢杆菌，添加量为每吨饲料添加重组枯草芽孢杆菌Ct-AMP1 300克，按正常日粮和饲喂程序，对照组不添加重组抗菌肽Ct-AMP1枯草芽孢杆菌，按同一正常日粮和饲喂程序。每天观察二次，时间为早晚各一次，全程基础日粮和其它饲养管理、饲养环境、饲养员、免疫保健实验组与对照组相同。
试验材料：选择350日龄同一养殖场的产蛋鸡，共计60000羽，其他营养条件相同。
试验时间为40天
试验结果1：
本次试验结果如下面表格
组别 粪便形状 产蛋率 蛋壳颜色与厚度
试验组 粪便成型，干燥 92.1％ 显著增加，颜色变深
对照组 稀便，少量血便 85.5％ 无变化，偏白
试验结果显示：在试验的开始时都存在一样的稀便，试验组在第六天粪便就开始好转，在试验结束时粪便基本上没有稀便，而对照组在试验结束时反而更严重了。试验组和对照组在试验前产蛋率都在85-87％，在试验第10天直到结束时采食量上也发生了变化，试验组在第10天时采食量就在下降，试验前的为120克每天，试验结束时为119克每天。对照组不但没有下降，反而有所上升，从试验前的119克每天，试验结束时为122克每天。对照组饲料损耗增加。实验组效益增加7-8％。
实验结果2：
重组抗菌肽Ct-AMP1枯草芽孢杆菌对肠道微生物菌群调节作用验证：用大肠杆菌杆菌、沙门氏菌、梭菌专用平板检测两组肠道中梭菌含量发现实验组肠道大肠杆菌杆菌、沙门氏菌、梭菌含量显著低于对照组；对其他益生菌群有辅助增殖的效应。结果如图5所示：能有效抑制肠道大肠杆菌杆菌、沙门氏菌、梭菌，提升益生菌含量。
本次试验证实；重组抗菌肽Ct-AMP1枯草芽孢杆菌在鸡场应用能给鸡场带来极好的综合效益，重组抗菌肽Ct-AMP1枯草芽孢杆菌鸡场应用具有广阔发展前景，也为其它鸡场使用提供了强有力的依据。
主要功效：
抑制沙门氏菌大肠杆菌杆菌等有害菌的增值数量。
(1)雏禽：能减少沙门氏杆菌、大肠杆菌杆菌等病原性微生物，降低腹泻率，提高日增重及饲料消化率，降低料肉比。
(2)蛋禽：可提高产蛋率，延长产蛋高峰期，提高蛋壳厚度及质量，颜色加深，大幅度降低破蛋率，减少饲料便及粪便含水率。
(3)种禽：降低沙门氏杆菌感染率，提高蛋壳质量及孵化率，减少弱雏。
序列表
<110> 魏于清
<120> 表达植物抗菌肽Ct-AMP1的工程菌构建与应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ile Gln Lys Arg Lys Arg Thr Asp Ser Phe Val Gln Thr Cys Ala
1 5 10 15
Tyr Val His Ala Val Ile Val Ser Leu Pro Ile Thr Lys Thr Ser Ala
20 25 30
Asn Leu Cys Glu Arg Ala Ser Leu Thr Trp Thr Gly Asn Cys Gly Asn
35 40 45
Thr Gly His Cys Asp Thr Gln Cys Arg Asn Trp Glu Ser Ala Lys His
50 55 60
Gly Ala Cys His Lys Arg Gly Asn Trp Lys Cys Phe Cys Tyr Phe Asp
65 70 75 80
Cys Tyr Gly Gly Ala Cys His Tyr Gln Phe Pro Ser Val Lys Cys Phe
85 90 95
Cys Lys Arg Gln Cys
100
<210> 2
<211> 303
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgatccaaa aacgtaaacg tacagattct ttcgttcaaa catgcgctta cgttcatgct 60
gttatcgttt ctcttcctat cacaaaaaca tctgctaacc tttgcgaacg tgcttctctt 120
acatggacag gcaactgcgg caacacaggc cattgcgata cacaatgccg taactgggaa 180
tctgctaaac atggcgcttg ccataaacgt ggcaactgga aatgcttctg ctacttcgat 240
tgctacggcg gcgcttgcca ttaccaattc ccttctgtta aatgcttctg caaacgtcaa 300
tgc 303
<210> 3
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcggtaccga gctcgctcga gatgatccaa aaacgtaaac gtacagattc tttcgttcaa 60
acatgcgctt acgttcatgc tgttatcgtt tctcttccta tcacaaaaac atctgctaac 120
ctttgcgaac gtgcttctct tacatggaca ggcaactgcg gcaacacagg ccattgcgat 180
acacaatgcc gtaactggga atctgctaaa catggcgctt gccataaacg tggcaactgg 240
aaatgcttct gctacttcga ttgctacggc ggcgcttgcc attaccaatt cccttctgtt 300
aaatgcttct gcaaacgtca atgctgactc gaggggctag ccgctgca 348
<210> 4
<211> 4718
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ccttaaggaa cgtacagacg 420
gcttaaaagc ctttaaaaac gtttttaagg ggtttgtaga caaggtaaag gataaaacag 480
cacaattcca agaaaaacac gatttagaac ctaaaaagaa cgaatttgaa ctaactcata 540
accgagaggt aaaaaaagaa cgaagtcgag atcagggaat gagtttataa aataaaaaaa 600
gcacctgaaa aggtgtcttt ttttgatggt tttgaacttg ttctttctta tcttgataca 660
tatagaaata acgtcatttt tattttagtt gctgaaaggt gcgttgaagt gttggtatgt 720
atgtgtttta aagtattgaa aacccttaaa attggtacga tgacctctaa taattgttaa 780
tcatgttggt tacgtattta ttaacttctc ctagtattag taattatcat ggctgtcatg 840
gcgcattaac ggaataaagg gtgtgcttaa atcgggccat tttgcgtaat aagaaaaagg 900
attaattatg agcgaattga attaataata aggtaataga tttacattag aaaatgaaag 960
gggattttat gcgtgagaat gttacagtct atcccggcat tgccagtcgg ggatattaaa 1020
aagagtatag gtttttattg ggataaagta ggtttcactt tggttcacca tgaagatgga 1080
ttcgcagttc taatgtgtaa tgaggttcgg attcatctat gggaggcaag tgatgaaggc 1140
tggcgcctcg tagtaatgat tcaccggttt gtacaggtgc ggagtcgttt attgctggta 1200
ctgctagttg ccgcattgaa gtagagggaa ttgatgaatt atatcaacat attaagcctt 1260
tgggcatttt gcaccccaat acatcattaa aagatcagtg gtgggatgaa cgagactttg 1320
cagtaattga tcccgacaac aatttgatta gcttttttca acaaataaaa agctaaaatc 1380
tattattaat ctgttcagca atcgggcgcg attgctgaat aaaagatacg agagacctct 1440
cttgtatctt ttttattttg agtggttttg tccgttacac tagaaaaccg aaagacaata 1500
aaaattttat tcttgctgag tctggctttc ggtaagctag acaaaacgga caaaataaaa 1560
attggcaagg gtttaaaggt ggagattttt tgagtgatct tctcaaaaaa tactacctgt 1620
cccttgctga tttttaaacg agcacgagag caaaaccccc ctttgctgag gtggcagagg 1680
gcaggttttt ttgtttcttt tttctcgtaa aaaaaagaaa ggtcttaaag gttttatggt 1740
tttggtcggc actgccgcgc ctcgcagagc acacacttta tgaatataaa gtatagtgtg 1800
ttatacttta cttggaagtg gttgccggaa agagcgaaaa tgcctcacat ttgtgccacc 1860
taaaaaggag cgatttacat atgagttatg cagtttgtag aatgcaaaaa gtgaaatcag 1920
ctggactaaa aggcatgcaa tttcataatc aaagagagcg aaaaagtaga acgaatgatg 1980
atattgacca tgagcgaaca cgtgaaaatt atgatttgaa aaatgataaa aatattgatt 2040
acaacgaacg tgtcaaagaa attattgaat cacaaaaaac aggtacaaga aaaacgagga 2100
aagatgctgt tcttgtaaat gagttgctag taacatctga ccgagatttt tttgagcaac 2160
tggatcctga taggtggtat gttttcgctt gaacttttaa atacagccat tgaacatacg 2220
gttgatttaa taactgacaa acatcaccct cttgctaaag cggccaagga cgctgccgcc 2280
ggggctgttt gcgtttttgc cgtgatttcg tgtatcattg gtttacttat ttttttgcca 2340
aagctgtaat ggctgaaaat tcttacattt attttacatt tttagaaatg ggcgtgaaaa 2400
aaagcgcgcg attatgtaaa atataaagtg atagcggtac cgagctcgct cgaggggcta 2460
gccgctgcag ttgaattcaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 2520
ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 2580
gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 2640
gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 2700
tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 2760
gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 2820
ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 2880
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 2940
acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 3000
tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 3060
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 3120
ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 3180
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 3240
actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 3300
gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc 3360
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac 3420
caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 3480
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 3540
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 3600
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 3660
ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 3720
tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag 3780
tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca 3840
gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc 3900
tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 3960
tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag 4020
ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt 4080
tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat 4140
ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt 4200
gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc 4260
ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat 4320
cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 4380
ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 4440
ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg 4500
gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 4560
ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 4620
gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt 4680
aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtc 4718
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcggtaccga gctcgctcga g 21
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgcagcggct agcccctcga gtca 24

Claims (7)

1.植物抗菌肽Ct-AMP1融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.编码权利要求1所述融合蛋白的核酸。
3. 根据权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述核酸的碱基序列如SEQ ID No.2所示。
4.一种表达载体，含有权利要求2或3所述的核酸。
5.表达植物抗菌肽Ct-AMP1融合蛋白的基因工程菌，含有权利要求4所述的表达载体。
6.权利要求1所述的植物抗菌肽Ct-AMP1融合蛋白或权利要求5所述的基因工程菌在制备预防或/和治疗家畜细菌性腹泻药物上的应用，所述细菌性腹泻是指沙门氏菌或大肠杆菌引起的腹泻。
7.表达植物抗菌肽Ct-AMP1融合蛋白的基因工程菌的构建方法，步骤如下：
1）以SEQ ID No.3所示的DNA片段为模板，以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列为引物，PCR扩增，得到融合基因扩增片段；
2）采用Xhol Ⅰ酶酶切载体质粒plasmid 2021与扩增片段，采用同源重组酶将酶切后的载体质粒与扩增片段连接；
3）将连接产物转化大肠杆菌获得阳性克隆子，提取质粒，测序验证后，得到所述融合基因的表达载体；
4）用EcoRⅠ酶切步骤3）得到的表达载体，酶切后的片段电泳分离，大片段用T4连接酶连接后得到无抗性基因残留的质粒与融合蛋白基因，然后电转枯草芽孢杆菌BS168/wxp；
所述质粒plasmid 2021的DNA序列如SEQ ID No.4所示，枯草芽孢杆菌BS168/wxp保藏编号为CGMCC No.24234。
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CN111440247A (zh) * 2020-04-20 2020-07-24 广西南宁三思百乐生物科技有限公司 抑杀沙门氏菌、产气荚膜梭菌的抗菌肽融合蛋白及其应用

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