CN112592876A - 一种产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株及其构建方法 - Google Patents

一种产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产5‑氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株，其与作为出发菌的巴氏葡萄球菌相比，5‑氨基乙酰丙酸的产量提高。本发明还提供产5‑氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株的构建方法，以及其在制备5‑氨基乙酰丙酸中的应用。本发明构建的产5‑氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株生产5‑氨基乙酰丙酸的产量最高达到96.84mg/L，具有较大的经济价值。

Description

一种产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株及其构建 方法
技术领域
本发明涉及一种产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株及其构建方法，属于生物技术和代谢工程领域。
背景技术
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是生物体合成叶绿素、血红素和维生素B12等四吡咯类化合物的必需前体，对植物光合作用和细胞能量代谢具有重要作用。5-氨基乙酰丙酸可广泛用于农业和医药领域。在农业领域，5-氨基乙酰丙酸作为新型的植物生长调节剂、绿色除草剂和无毒杀虫剂等发挥着重要作用。在临床医学中，5-氨基乙酰丙酸作为一种疗效极高、副作用极小的光动力学药物，应用于多种癌症的诊断和治疗。
目前5-氨基乙酰丙酸的生产仍依赖于化学合成，不但成本高、产率低，而且污染环境，大大限制了5-氨基乙酰丙酸的可持续生产。随着现代生物技术的快速发展，越来越多的高附加值化合物开始利用微生物发酵技术实现经济、高效、可持续的发展模式。微生物发酵生产5-氨基乙酰丙酸具有原材料低廉、产品生物活性高和环保可持续等优势，已成为5-氨基乙酰丙酸生产发展的必然趋势。
目前能够生物合成5-氨基乙酰丙酸的微生物主要有类球红细菌、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和芽孢杆菌，鲜有报道利用其它微生物生物合成5-氨基乙酰丙酸。随着人民不断追求绿色、安全的生活品质，5-氨基乙酰丙酸的应用市场份额必然不断扩大，因此5-氨基乙酰丙酸的生产亟需源头自主创新。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是如何构建新型的5-氨基乙酰丙酸生产工程菌株，具体是如何对巴氏葡萄球菌中进行遗传改造生产5-氨基乙酰丙酸。
为解决本发明的技术问题，本发明提供一种产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株，所述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株通过提高作为出发菌的巴氏葡萄球菌中的谷氨酰tRNA还原酶/谷氨酰-1-半醛氨基转移酶/异柠檬酸脱氢酶/磷酸果糖激酶中任一种的表达量或含量或活性得到，其与作为出发菌的巴氏葡萄球菌相比，5-氨基乙酰丙酸的产量提高。
所述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株，按下文的构建方法得到。
本发明提供产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株的构建方法，包括A1或A2：
A1提高作为出发菌的巴氏葡萄球菌中谷氨酰tRNA还原酶/谷氨酰-1-半醛氨基转移酶/异柠檬酸脱氢酶/磷酸果糖激酶中任一种的编码基因的表达量；
A2在作为出发菌的所述巴氏葡萄球菌中导入谷氨酰tRNA还原酶/谷氨酰-1-半醛氨基转移酶/异柠檬酸脱氢酶/磷酸果糖激酶中任一种的编码基因。
上述导入可通过同源重组实现。
上述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株或上述构建方法中，所述出发菌为PK8，所述PK8为巴氏葡萄球菌，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.16178。
上述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株或上述构建方法中，所述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株通过重组载体将含有谷氨酰tRNA还原酶/谷氨酰-1-半醛氨基转移酶/异柠檬酸脱氢酶/磷酸果糖激酶中任一种的编码基因的重组表达载体导入所述出发菌中实现。
上述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株或上述构建方法中，所重组载体含有DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列为将赖谷氨酰tRNA还原酶/谷氨酰-1-半醛氨基转移酶/异柠檬酸脱氢酶/磷酸果糖激酶中任一的编码基因无缝克隆连接到pALC的限制性核酸内切酶XbaI识别位点和PstI识别位点之间得到的序列。
上述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株或上述构建方法中，所述谷氨酰tRNA还原酶为氨基酸序列是序列表中序列7的蛋白质。
上述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株或上述构建方法中，所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶为氨基酸序列是序列表中序列8或序列9的蛋白质。
上述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株或上述构建方法中，所述异柠檬酸脱氢酶为氨基酸序列是序列表中序列10的蛋白质。
上述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株或上述构建方法中，所述磷酸果糖激酶为氨基酸序列是序列表中序列11的蛋白质。
上述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株或上述构建方法中，所述谷氨酰tRNA还原酶的编码基因为f1-f2中的任一种DNA分子：
f1编码链的编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或基因组DNA；
f2在严格条件下与f1限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酰tRNA还原酶的cDNA分子或基因组DNA。
上述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株或上述构建方法中，所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因为g1-g2与h1-h2中的任一种DNA分子：
g1编码链的编码序列是序列表中序列3的cDNA分子或基因组DNA；
g2在严格条件下与g1限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的cDNA分子或基因组DNA；
h1编码链的编码序列是序列表中序列4的cDNA分子或基因组DNA；
h2在严格条件下与h1限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的cDNA分子或基因组DNA。
上述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株或上述构建方法中，所述异柠檬酸脱氢酶的编码基因为i1-i2中的任一种DNA分子：
i1编码链的编码序列是序列表中序列5的cDNA分子或基因组DNA；
i2在严格条件下与i1限定的DNA分子杂交且编码所述柠檬酸脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA。
上述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株或上述构建方法中，所述磷酸果糖激酶的编码基因为j1-j2中的任一种DNA分子：
j1编码链的编码序列是序列表中序列6的cDNA分子或基因组DNA；
j2在严格条件下与j1限定的DNA分子杂交且编码所述磷酸果糖激酶的cDNA分子或基因组DNA。
上述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。
上述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株或上述构建方法中，所述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株为SP-A、SP-L1、SP-L2、SP-icd或SP-pfk中的任一。
本发明还提供上述重组载体或在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.16178的巴氏葡萄球菌PK8。
本发明还提供一种制备感受态巴氏葡萄球菌的方法，包括菌体培养至OD600为0.2时加入终浓度为15μg/mL的青霉素。
本发明还提供上述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株或上述出发菌或上述构建方法或上述重组载体或上述制备感受态巴氏葡萄球菌的方法在制备5-氨基乙酰丙酸中的应用，以及上述构建方法在制备5-氨基乙酰丙酸中的应用。
本发明还提供一种制备5-氨基乙酰丙酸的方法，包括发酵上述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株，得到5-氨基乙酰丙酸。
本发明选用巴氏葡萄球菌PK8作为生产5-氨基乙酰丙酸的宿主，通过改进其感受态的制备工艺，使遗传改造巴氏葡萄球菌成为可能。这是目前报道中首次实现巴氏葡萄球菌遗传操作的。本发明通过表达巴氏葡萄球菌PK8的一系列基因，使巴氏葡萄球菌生产5-氨基乙酰丙酸的产量最高达到96.84mg/L，为巴氏葡萄球菌和其他新型菌株的利用提供了重要的研究基础。
生物材料保藏说明
生物材料的的分类命名：巴氏葡萄球菌
生物材料的的拉丁文学名：Staphylococcuspasteuri
生物材料的菌株编号：PK8
保藏单位全称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年7月30日
保藏编号：CGMCC No.16178
附图说明
图1为巴氏葡萄球菌生物合成5-氨基乙酰丙酸代谢流程简图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1、材料、试剂
下述实施例中，DNA Maker、细菌基因组DNA提取试剂盒、快速质粒小提试剂盒(离心柱型)及普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；PCR所用的Tap酶类购自北京聚合美生物科技有限公司，高保真酶Tks Gflex DNA Polymerase购自Takara公司；限制性内切酶类购自Takara公司。
下述实施例中，pH 4.6的乙酸钠缓冲液的具体配制方法可为：量取5.7mL冰乙酸，称取8.2g无水乙酸钠，加水定容至100mL，存于4℃备用。
下述实施例中，Ehrlich’s试剂的具体配制方法可为：称取1g对-二甲氨基苯甲醛，加入30mL冰乙酸，然后加入8mL高氯酸(70％)，用冰乙酸定容至50mL，现配现用或暂存于4℃。
下述实施例中，巴氏葡萄球菌PK8是从马齿苋体内分离出的一株内生菌，在专利“一株巴氏葡萄球菌突变株及其在制备5-氨基乙酰丙酸中的应用”(公告号：CN109706100B)中公开，PK8已于2018年7月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，分类命名为巴氏葡萄球菌Staphylococcuspasteuri，保藏编号为：CGMCC No.16178。
下述实施例中，金黄色葡萄球菌RN4220由第三军医大学饶贤才教授馈赠，记载于非专利文献“袁吉振，杨杰，袁文常，胡珍，尚伟龙，张霞，朱军民，胡启文，周人杰.金黄色葡萄球菌agr基因敲除及其对膜泡毒力影响.第三军医大学学报”，经饶贤才教授同意后，公众可以从中国农业大学获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中，pALC-GFP(原名PSgfp)质粒由中国科学技术大学孙宝林教授馈赠，记载于专利文献“一种新型的金黄色葡萄球菌荧光标记系统”(公开号：CN104531737A)，经孙宝林教授同意后，公众可以从中国农业大学获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中，pALC质粒是利用New England Biolabs(NEB)公司的Q5定点突变试剂盒，无痕去除pALC-GFP质粒上的GFP序列，得到含有S10启动子的组成型高拷贝过表达质粒，pALC质粒的序列见序列表序列1。
下述实施例中，发酵培养基LBG配制方法为：2.5gNaCl，10g胰蛋白胨，10g酵母提取物和10g葡萄糖溶解于水中，定容至1L，pH自然，121℃灭菌15min(其中葡萄糖单独灭菌)。
下述实施例中，如无特殊说明，各核苷酸序列的首位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。下述实施例中，各引物按照无缝克隆原理进行引物设计，因巴氏葡萄球菌的GC含量很低，在设计引时特异性片段需加长至40bp以上。引物合成和测序由华大基因公司完成，具体序列如下：
hemA-F：gtagacgaataaggggatcctctagATGCATTTTATTGCAATAAGCATAAATCATCGAACTGCTAATGTAGCAC(小写字母处序列为与质粒的同源序列用于无缝克隆连接)；
hemA-R：tttgctttttaaaagcttgcatgccTTATTCAAAACTAAAAATTCGACGTGCTGAAATTTCCTTAGCT(小写字母处序列为与质粒的同源序列用于无缝克隆连接)；
hemL1-F：gtagacgaataaggggatcctctagATGGGATATGAAAAATCAATAAAAGCAATGGAAATTGCTG(小写字母处序列为与质粒的同源序列用于无缝克隆连接)；
hemL1-R：tttgctttttaaaagcttgcatgccTTATTTTACAATACGACTTAATGAATTATCAAATGCTTGTATTG(小写字母处序列为与质粒的同源序列用于无缝克隆连接)；
hemL2-F：gtagacgaataaggggatcctctagATGAACTTTACTGAAAGTGAACGACTTCAGGAATTATCG(小写字母处序列为与质粒的同源序列用于无缝克隆连接)；
hemL2-R：tttgctttttaaaagcttgcatgccTTATTTCATTTGACTAAACGCATAATCAGCTGCTTTAAGTG(小写字母处序列为与质粒的同源序列用于无缝克隆连接)；
icd-F：gtagacgaataaggggatcctctagATGACAGCAGAAAAAATTACTCAAACTAAAGATGGA(小写字母处序列为与质粒的同源序列用于无缝克隆连接)；
icd-R：tttgctttttaaaagcttgcatgccGTGACATTTATTTTAAGTTTTTGATTAATTCGTCAGCAAACTCAG(小写字母处序列为与质粒的同源序列用于无缝克隆连接)；
pfk-F：gtagacgaataaggggatcctctagATGATATATACAGTTACTTTTAATCCATCCATTGACTATGTCATGTTTGTAG(小写字母处序列为与质粒的同源序列用于无缝克隆连接)；
pfk-R：tttgctttttaaaagcttgcatgccTCACTCCCCATCAAGTACAGAAATCGTAACTTGTGATTTGATATTTTCTATTGCA(小写字母处序列为与质粒的同源序列用于无缝克隆连接)；
ALC-F:gcgctgtgtaagatagttttcgtgg；
ALC-R:aactgggcagtgtcttaaaaaatcg。
2、方法
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的部分实验方法的详细步骤如下：
I、巴氏葡萄球菌PK8基因组的提取：PK8菌体二次活化接种后培养至OD600为1，12000rpm离心2min收集适量菌泥，加入300μl 40U/mL溶葡萄球菌霉素，37℃200rpm摇浴45min后离心去上清，再以普通细菌基因组提取试剂盒进行巴氏葡萄球菌PK8基因组的提取。
II、PCR扩增巴氏葡萄球菌PK8的基因：用广谱型高保真酶Tks Gflex DNAPolymerase
PCR扩增体系见表1：
表1
Figure BDA0002848575360000061
Figure BDA0002848575360000071
PCR反应程序：94℃预变性1分钟；98℃10秒，Tm-5℃15秒，68℃30s/kb，共30个循环；68℃延伸5分钟。
PCR产物的回收：用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收各基因片段。
III、过表达质粒构建方法
pALC质粒(质粒序列见序列表序列1)用XbaI和PstI双酶切，并胶回收后获得pALC质粒片段。酶切体系见表2。
表2
试剂 用量
10×M buffer 10μl
pALC质粒 xμl
XbaI 5μl
PstI 5μl
ddH<sub>2</sub>O Up to 100μl
无缝克隆连接：利用EZ-S一步法无缝克隆试剂盒(北京康润诚业生物科技有限公司)，具体连接体系见表3：
表3
试剂 用量
2×OneStep Cloning Mix 5μl
pALC质粒片段 xμl
各基因片段 yμl
ddH<sub>2</sub>O Up to 10μl
连接产物全部转化入DH5a感受态。
菌落PCR初步验证，和测序进一步验证构建质粒的正确性。
选择构建正确的质粒，电击转化入中间宿主金黄色葡萄球菌RN4220的感受态，再从RN4220菌株中提取该质粒。
IV、构建工程菌株
巴氏葡萄球菌感受态的制备：
(1)取出-80℃保存的巴氏葡萄球菌菌种，用无菌接种环划线于新鲜的BHI无抗固体培养基上进行活化。
(2)从划线平板上挑取单克隆至BHI液体培养基37℃，220rpm过夜培养。
(3)按1％接种量接种至新鲜配置并经过滤除菌的BHI培养基中，37℃，220rpm培养约2h，至OD600吸光值为0.2，加入终浓度为15μg/mL的青霉素，继续培养至OD600吸光值为0.3。
巴氏葡萄球菌按常规葡萄球菌感受态制备及电击转化方法并不能得到转化子，这也是当前限制新型葡萄球菌菌种甚至其他新型微生物进行遗传改造的阻遏所在。据此，发明人在巴氏葡萄球菌PK8感受态制备时添加不同种类、不同浓度的细胞壁弱化剂，同时优化电击转化条件。如下表4所示，在制备巴氏葡萄球菌感受态时添加终浓度为15μg/mL的青霉素，配合25kv电击电压，可实现对巴氏葡萄球菌PK8的遗传操作。其中，操作关键点是在菌体培养至OD600为0.2时加入终浓度为15μg/mL的青霉素，再继续培养菌体至OD600为0.3左右时收菌。这是目前的报道中首次实现了对巴氏葡萄球菌的转化，且转化效率基本满足对其遗传操作的要求。
表4
Figure BDA0002848575360000081
注：该结果为至少重复三次实验统计结果。
(4)在无菌条件下将上述培养物转移到-80℃预冷的100mL离心管中，冰上放置10min使其停止生长。
(5)将离心管配平后在5000rpm，4℃的条件下离心15min收集细胞(离心机提前预冷)。
(6)尽量弃净上清(可将离心管倒置于无菌吸水纸以尽量除去残留的少量培养液)。用l-2mL预冷的0.5M蔗糖重悬菌体，再补齐体积至50mL，轻轻颠倒混匀，冰上静置15min。
(7)5000rpm 4℃的条件离心15min收集细胞。再用l-2mL预冷的0.5M蔗糖重悬菌体，补齐体积至25mL，轻轻颠倒混匀。
(8)冰上静置30min，再5000rpm，4℃离心5min收集细胞，弃去上清，用预冷的0.5M庶糖重悬(每50mL初始菌液用1mL)。
(9)用-80℃预冷的蓝枪头迅速将细胞分装到-80℃预冷的1.5mL的EP管(100μl/支)。
巴氏葡萄球菌的质粒电击转化：
(1)将提取并鉴定好的质粒、电击杯、BHI过滤除菌培养基置于冰上预冷。
(2)用移液枪体积加入10μl质粒于100μl感受态细胞中，冰上静置30min。
(3)设置电转仪的电压为2.5kV，将加入质粒的感受态细胞转移至电极杯中，迅速用电转仪进行电击。
(4)电击后迅速加入600μl BHI无抗培养基，冰上静置l0 min后再将菌液从电击杯转移到EP管中，37℃200rpm培养2h进行复苏。
(5)复壮后离心浓缩全部涂布于终浓度为5μg/mL氯霉素(Cm)抗性的BHI固体培养基平板上，于37℃恒温倒置培养24h至出现合适大小的菌落。
V、巴氏葡萄球菌工程菌株的验证：
从抗性平板上挑单克隆于试管，37℃200rpm过夜培养后提取质粒，随后用ALC-F和ALC-R引物PCR验证。
VI、巴氏葡萄球菌工程菌株的发酵培养：
挑取工程菌株单菌落接种于含4mL LBG培养基的试管中，37℃200rpm培养过夜，获得种子液，按1％接种量接种至含有50mL发酵培养基LBG的150mL锥形瓶中，37℃200rpm培养，每隔12h取样测菌体生物量和5-氨基乙酰丙酸产量。
VII、5-氨基乙酰丙酸产量的测定：
取稀释至适宜倍数的发酵液上清400μl，加入200μl pH 4.6的乙酸钠缓冲液，立即加入100μl乙酰丙酮，充分混匀后沸水浴条件下缩合10min，自然冷却至室温，加入700μl新鲜配置的Ehrlish’s试剂显色，充分混匀后静置20min。用分光光度计在554nm下进行测定。注意，比色应在半小时内完成。
5-氨基乙酰丙酸产量计算方法与本实验的“一株巴氏葡萄球菌突变株及其在制备5-氨基乙酰丙酸中的应用”专利中所述一致。
实施例1
本发明首次利用巴氏葡萄球菌作为宿主，并对其进行遗传改造用于生产5-氨基乙酰丙酸。巴氏葡萄球菌PK8是本实验室前期从世界卫生组织认证的药食两用植物马齿苋体内分离出的一株内生菌，现保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.16178，保藏日期：2018年7月30日，分类命名：巴氏葡萄球菌Staphylococcus pasteuri。巴氏葡萄球菌PK8天然高产5-氨基乙酰丙酸(天然菌株产量约58mg/L)，经全基因组测序注释，确证其存在5-氨基乙酰丙酸合成的C5途径，而且有趣的是，其存在两个谷氨酰-1-半醛氨基转移酶，其基因分别命名为hemL1、hemL2，此特性在其他微生物中鲜有报道。图1所示的巴氏葡萄球菌中5-氨基乙酰丙酸的生物合成途径，据此发明人构建产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株，具体方法如下：
一、产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株的构建
1、过表达巴氏葡萄球菌自身的谷氨酰tRNA还原酶基因hemA
以巴氏葡萄球菌PK8的基因组(提取方法参见上文I)为模板根据无缝克隆原理设计引物hemA-F和hemA-R，利用高保真酶Tks Gflex DNA Polymerase PCR扩增基因hemA(1347bp，核苷酸序列如序列表序列2所示；其编码的氨基酸序列为序列表序列7)(扩增方法参见上文II)，构建过表达质粒pALC-hemA，得到的过表达质粒pALC-hemA是用基因hemA无缝克隆连接到pALC的限制性核酸内切酶XbaI识别位点和PstI识别位点之间，得到基因hemA的过表达载体，将测序正确的过表达质粒pALC-hemA电击转入中间宿主金黄色葡萄球菌RN4220(过表达质粒构建方法参见上文III)。从阳性RN4220中提取过表达载体pALC-hemA，电击转化进入巴氏葡萄球菌PK8感受态(构建工程菌株的方法参见上文IV)并验证(巴氏葡萄球菌工程菌株的验证方法参见上文V)，即得工程菌株SP-A。
2、过表达巴氏葡萄球菌自身的谷氨酰-1-半醛氨基转移酶基因hemL1
以巴氏葡萄球菌PK8的基因组(提取方法参见上文I)为模板，根据无缝克隆原理设计引物hemL1-F和hemL1-R，利用高保真酶Tks Gflex DNA Polymerase PCR扩增基因hemL1(1287bp，核苷酸序列如序列表序列3所示；其编码的氨基酸序列为序列表序列8)(扩增方法参见上文II)，构建过表达质粒pALC-hemL1，得到的过表达质粒pALC-hemL1是用基因hemL1无缝克隆连接到pALC的限制性核酸内切酶XbaI识别位点和PstI识别位点，得到基因hemL1的过表达载体，将测序正确的过表达质粒pALC-hemL1电击转入中间宿主金黄色葡萄球菌RN4220(过表达质粒构建方法参见上文III)。从阳性RN4220中提取过表达载体pALC-hemL1，电击转化进入巴氏葡萄球菌PK8感受态(构建工程菌株的方法参见上文IV)并验证(巴氏葡萄球菌工程菌株的验证方法参见上文V)，即得工程菌株SP-L1。
3、过表达巴氏葡萄球菌自身的谷氨酰-1-半醛氨基转移酶基因hemL2
以巴氏葡萄球菌PK8的基因组(提取方法参见上文I)为模板，根据无缝克隆原理设计引物hemL2-F和hemL2-R，利用高保真酶Tks Gflex DNA Polymerase PCR扩增基因hemL2(1290bp，核苷酸序列如序列表序列4所示；其编码的氨基酸序列为序列表序列9)(扩增方法参见上文II)，构建过表达质粒pALC-hemL2，得到的过表达质粒pALC-hemL2是用基因hemL2无缝克隆连接到pALC的限制性核酸内切酶XbaI识别位点和PstI识别位点，得到基因hemL2的过表达载体，将测序正确的过表达质粒pALC-hemL2电击转入中间宿主金黄色葡萄球菌RN4220(过表达质粒构建方法参见上文III)。从阳性RN4220中提取过表达载体pALC-hemL2，电击转化进入巴氏葡萄球菌PK8感受态(构建工程菌株的方法参见上文IV)并验证(巴氏葡萄球菌工程菌株的验证方法参见上文V)，即得工程菌株SP-L2。
4、过表达巴氏葡萄球菌自身的异柠檬酸脱氢酶基因icd
以巴氏葡萄球菌PK8的基因组(提取方法参见上文I)为模板，根据无缝克隆原理设计引物icd-F和icd-R，利用高保真酶Tks Gflex DNA Polymerase PCR扩增基因icd(1269bp，核苷酸序列如序列表序列5所示；其编码的氨基酸序列为序列表序列10)(扩增方法参见上文II)，构建过表达质粒pALC-icd，得到的过表达质粒pALC-icd是用基因icd无缝克隆连接到pALC的限制性核酸内切酶XbaI识别位点和PstI识别位点，得到基因icd的过表达载体，将测序正确的过表达质粒pALC-icd电击转入中间宿主金黄色葡萄球菌RN4220(过表达质粒构建方法参见上文III)。从阳性RN4220中提取过表达载体pALC-icd，电击转化进入巴氏葡萄球菌PK8感受态(构建工程菌株的方法参见上文IV)并验证(巴氏葡萄球菌工程菌株的验证方法参见上文V)，即得工程菌株SP-icd。
5、过表达巴氏葡萄球菌自身的磷酸果糖激酶基因pfk
以巴氏葡萄球菌PK8的基因组(提取方法参见上文I)为模板，根据无缝克隆原理设计引物pfk-F和pfk-R，利用高保真酶Tks Gflex DNA Polymerase PCR扩增基因pfk(921bp，核苷酸序列如序列表序列6所示；其编码的氨基酸序列为序列表序列11)(扩增方法参见上文II)，构建过表达质粒pALC-pfk，得到的过表达质粒pALC-pfk是用基因pfk无缝克隆连接到pALC的限制性核酸内切酶XbaI识别位点和PstI识别位点，得到基因pfk的过表达载体，将测序正确的过表达质粒pALC-pfk电击转入中间宿主金黄色葡萄球菌RN4220(过表达质粒构建方法参见上文III)。从阳性RN4220中提取过表达载体pALC-pfk，电击转化进入巴氏葡萄球菌PK8感受态(构建工程菌株的方法参见上文IV)并验证(巴氏葡萄球菌工程菌株的验证方法参见上文V)，即得工程菌株SP-pfk。
二、产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株的发酵产量
采用步骤1-5得到的巴氏葡萄球菌工程菌SP-A、SP-L1、SP-L2、SP-icd和SP-pfk分别进行发酵培养，按1％的接种量转接至30％装液量的发酵培养基中，具体发酵培养方法参见上文VI，以野生型巴氏葡萄球菌PK8为对照，共设置3个重复。检测发酵48h后5-氨基乙酰丙酸产量(5-氨基乙酰丙酸产量的测定方法参见上文VII)。
发酵结果显示菌株SP-A发酵48h后5-氨基乙酰丙酸产量最高，可达96.84mg/L。
SP-L1和SP-L2工程菌株在发酵第24-48时，菌体颜色逐渐变红，这说明更多的5-氨基乙酰丙酸流向了血红素的合成，另一方面血红素过多而造成的细胞压力影响了细胞的正常生长，导致5-氨基乙酰丙酸的产量降低。但是我们相信，通过后期阻断或弱化5-氨基乙酰丙酸向血红素的转变，5-氨基乙酰丙酸的会实现更好的积累。
菌株SP-pfk在发酵第12h时颜色明显变红，而过表达hemA和hemL1、hemL2的菌株在48h时菌液才变成这么深的红色，说明了pfk基因的过表达加速了细胞的生长和5-氨基乙酰丙酸的产生，这与之前研究中pfk基因的过表达加速葡萄糖的消耗等报道相符合。
菌株SP-icd的生物量与对照相比有显著提升，在发酵第48h时OD600提升近1倍，但是5-氨基乙酰丙酸的产量却显著下降，下降80％左右，这可能是因为较多的能量代谢转化到了菌体的合成，造成5-氨基乙酰丙酸的合成供应不足的结果。
本发明选用巴氏葡萄球菌PK8作为生产5-氨基乙酰丙酸的宿主，通过改进其感受态的制备工艺，使遗传改造巴氏葡萄球菌成为可能。这是目前报道中首次实现巴氏葡萄球菌遗传操作的。本发明通过表达巴氏葡萄球菌PK8的一系列基因，使巴氏葡萄球菌生产5-氨基乙酰丙酸的产量最高达到96.84mg/L，为巴氏葡萄球菌和其他新型菌株的利用提供了重要的研究基础。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株及其构建方法
<130> GNCSY203006
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5948
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cccgttctta tgactaatta 420
tatagaataa ttttcaatga taataataaa atgattcaag gtacgaattt acaataaaga 480
aggaaataaa aaatatctcg aaaatagttg aactgactaa gtatataaag taaaatataa 540
aagtatgtgt tagacagata gaaaaattat gtgaaaagcc ttgatttatc gatgtttttc 600
gtgtaatata aataacgttg gactttaaga aaagcgatga agcgaaaggt tactgacaca 660
cccggccgct ttgccatggc gctgtgtaag atagttttcg tggagaagtc tatcactaaa 720
tgtagacgaa taaggggatc ctctagagtc aattcggctt acgcgtcgac tagggaggtt 780
ttaaacctgc aggcatgcaa gcttttaaaa agcaaatatg agccaaataa atatattcta 840
attctacaaa caaaaatttg agcaaattca gtgtcgattt tttaagacac tgcccagtta 900
catgcaaatt aaaattttca tgatttttta tagttcctaa cagggttaaa atttgtataa 960
cgaaagtata atgtttatat aacgttagta taataaagca ttttaacatt atacttttga 1020
taatcgttta tcgtcgtcat cacaataact tttaaaatac tcgtgcataa ttcacgctga 1080
cctcccaata actacatggt gttatcggga ggtcagctgt tagcacttat attttgttat 1140
tgttcttcct cgatttcgtc tatcattttg tgattaattt ctcttttttc ttgttctgtt 1200
aagtcataaa gttcactagc taaatactct ttttgtttcc aaatataaaa aatttgatag 1260
atatattacg gttggatcaa tttcttttaa gtaatctaaa tccccatttt ttaatttctt 1320
tttagcctct ttaaataatc ctgaataaac taatacctgt ttacctttaa gtgatttata 1380
aaatgcatca aagacttttt gatttattta ttaaataatc actatcttta ccagaatact 1440
tagccatttc atataattct ttattattat tttgtcttat tttttgaact tgaacttgtg 1500
ttatttctga aatgcccgtt acatcacgcc ataaatctaa ccattcttgt tggctaatat 1560
aatatctttt atctgtgaaa tacgatttat ttactgcaat taacacatga aaatgaggat 1620
tataatcatc tcttttttta ttatatgtaa tctctaactt acgaacatat ccctttataa 1680
cactacctac tttttttctc tttataagtt ttctaaaaga attattataa cgttttattt 1740
cattttctaa ttcatcactc attacattag gtgtagtcaa agttaaaaag ataaactcct 1800
ttttctcttg ctgcttaata tattgcatca tcaaagataa acccaatgca tcttttctag 1860
cttttctcca agcacagaca ggacaaaatc gatttttaca agaattagct ttatataatt 1920
tctgtttttc taaagtttta tcagctacaa aagacagaaa tgtattgcaa tcttcaacta 1980
aatccatttg attctctcca atatgacgtt taataaattt ctgaaatact tgatttcttt 2040
gttttttctc agtatacttt tccatgttat aacacataaa aacaacttag ttttcacaaa 2100
ctatgacaat aaaaaaagtt gctttttccc ctttctatgt atgtttttta ctagtcattt 2160
aaaacgatac attaataggt acgaaaaagc aacttttttt gcgcttaaaa ccagtcatac 2220
caataactta agggtaacta gcctcgccgg caatagttac ccttattatc aagataagaa 2280
agaaaaggat ttttcgctac gctcaaatcc tttaaaaaaa cacaaaagac cacatttttt 2340
aatgtggtct ttattcttca actaaagcac ccattagttc aacaaacgaa aattggataa 2400
agtgggatat ttttaaaata tatatttatg ttacagtaat attgactttt aaaaaaggat 2460
tgattctaat gaagaaagca gacaagtaag cctcctaaat tcactttaga taaaaattta 2520
ggaggcatat caaatgaact ttaataaaat tgatttagac aattggaaga gaaaagagat 2580
atttaatcat tatttgaacc aacaaacgac ttttagtata accacagaaa ttgatattag 2640
tgttttatac cgaaacataa aacaagaagg atataaattt taccctgcat ttattttctt 2700
agtgacaagg gtgataaact caaatacagc ttttagaact ggttacaata gcgacggaga 2760
gttaggttat tgggataagt tagagccact ttatacaatt tttgatggtg tatctaaaac 2820
attctctggt atttggactc ctgtaaagaa tgacttcaaa gagttttatg atttatacct 2880
ttctgatgta gagaaatata atggttcggg gaaattgttt cccaaaacac ctatacctga 2940
aaatgctttt tctctttcta ttattccatg gacttcattt actgggttta acttaaatat 3000
caataataat agtaattacc ttctacccat tattacagca ggaaaattca ttaataaagg 3060
taattcaata tatttaccgc tatctttaca ggtacatcat tctgtttgtg atggttatca 3120
tgcaggattg tttatgaact ctattcagga attgtcagat aggcctaatg actggctttt 3180
ataatatgag ataatgccga ctgtactttt tacagtcggt tttctaatgt cactaacctg 3240
ccccgttagt tgaagaaggt ttttatatta cagctccaga tccatatcct tctttttctg 3300
aaccgacttc tcctttttcg cttctttatt ccaattgctt tattgacgtt gagcctcgga 3360
acccttaaca atcccaaaac ttgtcgaatg gtcggcttaa tagctcacgc tatgccgaca 3420
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tgcgtggtct aatttttatt tttaataacc ttgatagcaa aaaatgccat tccaatacaa 3540
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ctttatcaca agaaatattt aaattttaaa tgcctttatt ttgaatttta aggggcattt 3660
taaagattta ggggtaaatc atatagtttt atgcctaaaa acctacagaa gcttggcgta 3720
atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat 3780
acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt 3840
aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta 3900
atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc 3960
gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 4020
ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 4080
aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 4140
ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 4200
aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 4260
gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 4320
tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 4380
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gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 4500
cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 4560
cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 4620
agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 4680
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agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 4980
gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 5040
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tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc 5220
acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 5280
atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag 5340
aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac 5400
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gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact 5580
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cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc 5940
ctttcgtc 5948
<210> 2
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcatttta ttgcaataag cataaatcat cgaactgcta atgtagcact aagagagcaa 60
gttgctttta gagatgatgc cttacgatta gcccatgaag atttatatga aactaaagcc 120
atcttagaaa acgtcatctt atctacatgt aatcgtaccg aagtatacgc cgttgttgat 180
caaattcata ccggacgtta ttacgttcaa agatttttag cacgtaaatt tggatttgaa 240
gtagatgaca ttaaagacat gtcagaagtc aaagtggggg acgaagctgt agaacatcta 300
ttgcgcgtca cttctggttt agattccatt gtacttggag aaacacaaat acttgggcaa 360
atgcgcgacg catttttctt agctcaagaa acgggtacaa ctggtactat ctttaatcat 420
ttatttaaac aggcaattac ttttgctaaa agagcacata gtgaaacaga tattgcagat 480
aatgcagtta gtgtttcata tgctgcagtt gaattagcta aaaaggtatt cggaaaacta 540
aaatataaac aagctgtcat tattggtgca ggggaaatga gtgaattatc actcttaaat 600
ctgttagggt caggtattac aaatataaca attgttaata gaacagtagg taaagctaaa 660
gtattagctg aaaaacatca agttaaattt gattcactag atgcattacc agttttatta 720
caacaagctg atattgtaat tagttctaca agttcagagt cgtatattat tactaatgat 780
ttagttgaat ctatagctaa tcaacgaaaa ttagacgctt tattattagt tgatattgca 840
gttccaagag atattgagcc tggtattgat gcaatcaaca atatatttaa ttacgatgtt 900
gatgacttga aaggtttggt tgatgcgaat ttaagagagc gtcaattagc agcacaaaca 960
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gttgtaccag tcattagagc tttacgtgaa aaagcaatga atattcaatc tgaaacaatg 1080
gatagtattg atagaaaatt accagattta tcagagagag aaagaaagat tatttctaaa 1140
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agtagtgata agaaaagtaa cgaaaaatta gagctctttc aaagcatttt tgacatagaa 1260
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<210> 3
<211> 1287
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgggatatg aaaaatcaat aaaagcaatg gaaattgctg aagatttaat gcctggcggt 60
gtaaatagtc cagtgcgtgc ttttaaatct gtggatacac ctgcaatttt tatggatcat 120
gcagaaggtt cgaaaatata tgatattgac ggtaatgaat acattgatta tgttttaagt 180
tggggaccgc ttattttagg tcataaaaat aaacaagtta tcgaaaatct tcacaaagca 240
gtagataacg gcactagttt tggtgcttct acactacaag aaaataaact agctcaattg 300
gttattgata gagtaccttc tattgagaaa gttaggatgg tatcttcagg tacggaagct 360
acattagata cattaagatt agcgcgcggt tatactggac gcaataaaat tgttaaattt 420
gaaggttgtt atcacggtca tagtgactca ttattaatta aggctggatc tggagtagca 480
acattaggtt tacccgattc accaggtgta ccagaaggta ttgcaaaaaa taccattact 540
gtaccatata atgatttaga ttcattacgt ctagcatttg aaaaatatgg ggatgatatt 600
tctggagtta tagttgaacc agttgctggt aatatgggtg tagttcctcc cgtagaaggc 660
tttttacaag gattaagaga tattactaat gaatatggtt cattgttaat atttgatgaa 720
gttatgactg gttttagagt tggttataac tgtgcgcagg gctattttgg agtgacacca 780
gatttaactt gtttaggtaa agttataggt ggaggtttac ctgtcggagc gtttggtggt 840
aaaaaagaga tcatggatca catcgcacca gtaggaaata tttatcaagc aggtacttta 900
tcaggtaatc cattagcaat gacaagtggt tatgaaacac taagtcaatt aacacctgaa 960
tcatatgact attttaatga actaggagat ttacttgaaa aagggcttaa agaagtcttt 1020
gctaagcatc aggtacctat aacagtaaat agagctggat caatgatagg ttatttctta 1080
aatgaaggtc ctgtgactaa ttttgaacaa gccaataaaa gtgatttgaa attatttagt 1140
gagatgtata gagaaatggc aaaagaaggt gtattcctgc caccatctca atttgaaggg 1200
actttcttat caacagcaca tactaaagaa gatattgaaa aaacaataca agcatttgat 1260
aattcattaa gtcgtattgt aaaataa 1287
<210> 4
<211> 1290
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaacttta ctgaaagtga acgacttcag gaattatcga atgaatatat tttaggtggc 60
gtaaactctc catctcgttc ttataaagca gttggtggtg gagcaccagt agtaatgaaa 120
gaaggtaaag gggcttattt atatgatgta gatggcaaca aatttataga ctatttacaa 180
gcatatggtc ctatcattac tggtcacgcg catcctcaca ttacaaaagc aattcaagaa 240
caagctgcta aaggtgtatt atatggaaca cctactgaat tagaaattga atttagtaag 300
aaattgcgag aggccattcc ttctcttgaa aaaattagat ttgtaaactc tggtactgaa 360
gctgttatga ctactataag agttgcacgt gcctatacta aacgtaataa aatcattaaa 420
tttgccggtt catatcatgg acattcggat ttagtactag ttgccgctgg tagtggtcct 480
tcacaacttg gctcccctga ttctgcaggt gtcccagaaa gcgttgctaa agaagtgatt 540
actgtaccat ttaacgatat tgaatcatac aaagaggcaa ttaatcactg gggtgacgac 600
gttgctgccg ttttagtaga gcctatagta ggtaactttg gtatggtaat gccagaacca 660
ggatttttag aagaagttaa tcgtattact aacgaaaaca atagtttagt catttatgat 720
gaagtcatta cagcgttcag atttcattat ggtgctgctc aagacttact tggtgtcatc 780
cctgatttaa ctgcttttgg taaaattgta ggtggtggtt taccaatcgg aggttatggc 840
ggccgacaag atataatgga acatgtagcg ccacttgggc cagcttatca agcaggtact 900
atggctggta acccattatc aatgaaagca ggtattgctt tacttgaagt tttagaacaa 960
gacggtgttt atgagaaatt agataaacta gggaaacgat tagaagacgg tctattacaa 1020
ttaattgaaa aacatcaaat caccgcaaca attaatcgta tatacggttc tctcacattg 1080
tactttactg atgaaaagat tacccattat gaacaagtag agaattctga tggtgaggct 1140
tttgcaaaat tctttaaatt aatgcttaat caaggtatta atttagctcc ttctaaattc 1200
gaagcttggt tcttaactac agaacatact gaagaagaca ttgatcaaac acttaaagca 1260
gctgattatg cgtttagtca aatgaaataa 1290
<210> 5
<211> 1269
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgacagcag aaaaaattac tcaaactaaa gatggattaa atgtaccaaa cgaaccaatc 60
attcctttca ttatcggtga cggaattgga ccagatattt ggaaagcagc aagtcgtgtt 120
atcgatgctg cagttgaaaa agcttataat ggtgaaaaac gtatcgaatg gaaagaagtt 180
ttagctggac aaaaagcata tgacaatact ggtgaatggt taccacaaga aactttagac 240
acaattaaag aatatctaat tgctgttaaa gggccattaa ctacaccaat tggtggcggt 300
attcgttcat taaatgtagc attaagacaa gaattagatt tattcacttg cttacgtcct 360
gtacgttggt tccaaggtgt accgtcacca gttaaacgtc ctcaagacgt agatatggtt 420
attttccgtg aaaatactga agatatctat gcaggtattg aattcaaaga aggtacgcct 480
gaagttaaaa aagtgataga tttcttacaa gatgaaatgg gagcaactaa tattcgattc 540
cctgaaactt caggtattgg tattaaacca gtttctaaag aaggtactga aagattggtt 600
agagctgcta tccaatacgc aatcgataac aatcgtaaag cagtaacttt agttcacaaa 660
ggtaacatta tgaaatttac tgaaggttca tttaaacaat ggggttacga tttagctcat 720
aatgaatttg ctgatcaagt attcacttgg caacaatatg atgaaattgt agaaaaagaa 780
ggtaaagatg ctgcgaatga agctcaatca aaagctgaac aagaaggtaa aattattgtt 840
aaagactcaa tcgctgatat cttcttacaa caaatcttaa ctcgtccatc tgaacatgaa 900
gttgttgcta caatgaattt aaatggtgac tatatttcag atgcgttagc tgcccaagtt 960
ggaggaattg gtattgcacc aggtgcaaat atcaactacg aaacaggtca tgctatcttt 1020
gaagctactc acggaacagc gcctaaatat gctggtttaa acaaagtaaa tccatcttct 1080
gaactattaa gttcagtatt aatgttagaa catttaggat ggcaagaagc tgctgataaa 1140
attacagact ctattgaagc aacaattgct tctaaaattg ttacttatga cttcgctcgt 1200
ctaatggatg gtgcgactga agtatcaact tctgagtttg ctgacgaatt aatcaaaaac 1260
ttaaaataa 1269
<210> 6
<211> 921
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgatatata cagttacttt taatccatcc attgactatg tcatgtttgt agatgacttt 60
aagatagatg gtttaaatcg cgctcaagat acaaataaat ttgccggtgg taaaggtatt 120
aatgtttcta gagtgctaaa gactttgggt gttgattcta cagcattagg atttgctggt 180
ggattcccag gagattttat agctcaaaca ttaaaagata gtgatattca cacagatttt 240
gtgcaagtag atgaagatac gcgtatcaat gttaaattga aaacaggtca agaaacagaa 300
gtgaatgcac aaggtcctaa tgtgactgat gcacaatttc aatcattatt aaatcaaatt 360
aaagaaacga cagacaatga tactgttatc gtcgctggta gtgtaccaaa gagtattccg 420
agtgatgctt atgcgcagat tgctaagatt acaaaacaaa caggtgcgca attagtcgtt 480
gatgctgaaa aagatttagt tgaatcagtg ttagaatatc agccactatt tattaaacct 540
aataaagatg aattagaagt tatgtttaat acatcagtta aaagtgatga agatgttatt 600
aaatatgcta aacaaatctt agataaaggt gcacaatcag tcattgtgtc attaggtgga 660
gatggtgcaa tttatgtgga tcgtcaacaa agtattaaag ctgtaaatcc aaaaggcaaa 720
gtgattaata cagttggctc aggtgatagt acggtagcag gtatggtcgc agggttagct 780
actggtttat ctgtgcaaga tgcatttaaa caagcagtag catcaggaac tgctactgca 840
tttgatgcag atttagcgac aaaagatgca atagaaaata tcaaatcaca agttacgatt 900
tctgtacttg atggggagtg a 921
<210> 7
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met His Phe Ile Ala Ile Ser Ile Asn His Arg Thr Ala Asn Val Ala
1 5 10 15
Leu Arg Glu Gln Val Ala Phe Arg Asp Asp Ala Leu Arg Leu Ala His
20 25 30
Glu Asp Leu Tyr Glu Thr Lys Ala Ile Leu Glu Asn Val Ile Leu Ser
35 40 45
Thr Cys Asn Arg Thr Glu Val Tyr Ala Val Val Asp Gln Ile His Thr
50 55 60
Gly Arg Tyr Tyr Val Gln Arg Phe Leu Ala Arg Lys Phe Gly Phe Glu
65 70 75 80
Val Asp Asp Ile Lys Asp Met Ser Glu Val Lys Val Gly Asp Glu Ala
85 90 95
Val Glu His Leu Leu Arg Val Thr Ser Gly Leu Asp Ser Ile Val Leu
100 105 110
Gly Glu Thr Gln Ile Leu Gly Gln Met Arg Asp Ala Phe Phe Leu Ala
115 120 125
Gln Glu Thr Gly Thr Thr Gly Thr Ile Phe Asn His Leu Phe Lys Gln
130 135 140
Ala Ile Thr Phe Ala Lys Arg Ala His Ser Glu Thr Asp Ile Ala Asp
145 150 155 160
Asn Ala Val Ser Val Ser Tyr Ala Ala Val Glu Leu Ala Lys Lys Val
165 170 175
Phe Gly Lys Leu Lys Tyr Lys Gln Ala Val Ile Ile Gly Ala Gly Glu
180 185 190
Met Ser Glu Leu Ser Leu Leu Asn Leu Leu Gly Ser Gly Ile Thr Asn
195 200 205
Ile Thr Ile Val Asn Arg Thr Val Gly Lys Ala Lys Val Leu Ala Glu
210 215 220
Lys His Gln Val Lys Phe Asp Ser Leu Asp Ala Leu Pro Val Leu Leu
225 230 235 240
Gln Gln Ala Asp Ile Val Ile Ser Ser Thr Ser Ser Glu Ser Tyr Ile
245 250 255
Ile Thr Asn Asp Leu Val Glu Ser Ile Ala Asn Gln Arg Lys Leu Asp
260 265 270
Ala Leu Leu Leu Val Asp Ile Ala Val Pro Arg Asp Ile Glu Pro Gly
275 280 285
Ile Asp Ala Ile Asn Asn Ile Phe Asn Tyr Asp Val Asp Asp Leu Lys
290 295 300
Gly Leu Val Asp Ala Asn Leu Arg Glu Arg Gln Leu Ala Ala Gln Thr
305 310 315 320
Ile Ala Asp Gln Ile Pro Ser Glu Ile Asp Thr His Asn Asp Trp Val
325 330 335
Asn Met Leu Gly Val Val Pro Val Ile Arg Ala Leu Arg Glu Lys Ala
340 345 350
Met Asn Ile Gln Ser Glu Thr Met Asp Ser Ile Asp Arg Lys Leu Pro
355 360 365
Asp Leu Ser Glu Arg Glu Arg Lys Ile Ile Ser Lys His Thr Lys Ser
370 375 380
Ile Ile Asn Gln Met Leu Lys Asp Pro Ile Lys Gln Ala Lys Glu Leu
385 390 395 400
Ser Ser Asp Lys Lys Ser Asn Glu Lys Leu Glu Leu Phe Gln Ser Ile
405 410 415
Phe Asp Ile Glu Ala Asp Asn Pro Tyr Glu Gln Ala Arg Gln His Lys
420 425 430
Glu Asn Lys Ala Lys Glu Ile Ser Ala Arg Arg Ile Phe Ser Phe Glu
435 440 445
<210> 8
<211> 428
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Gly Tyr Glu Lys Ser Ile Lys Ala Met Glu Ile Ala Glu Asp Leu
1 5 10 15
Met Pro Gly Gly Val Asn Ser Pro Val Arg Ala Phe Lys Ser Val Asp
20 25 30
Thr Pro Ala Ile Phe Met Asp His Ala Glu Gly Ser Lys Ile Tyr Asp
35 40 45
Ile Asp Gly Asn Glu Tyr Ile Asp Tyr Val Leu Ser Trp Gly Pro Leu
50 55 60
Ile Leu Gly His Lys Asn Lys Gln Val Ile Glu Asn Leu His Lys Ala
65 70 75 80
Val Asp Asn Gly Thr Ser Phe Gly Ala Ser Thr Leu Gln Glu Asn Lys
85 90 95
Leu Ala Gln Leu Val Ile Asp Arg Val Pro Ser Ile Glu Lys Val Arg
100 105 110
Met Val Ser Ser Gly Thr Glu Ala Thr Leu Asp Thr Leu Arg Leu Ala
115 120 125
Arg Gly Tyr Thr Gly Arg Asn Lys Ile Val Lys Phe Glu Gly Cys Tyr
130 135 140
His Gly His Ser Asp Ser Leu Leu Ile Lys Ala Gly Ser Gly Val Ala
145 150 155 160
Thr Leu Gly Leu Pro Asp Ser Pro Gly Val Pro Glu Gly Ile Ala Lys
165 170 175
Asn Thr Ile Thr Val Pro Tyr Asn Asp Leu Asp Ser Leu Arg Leu Ala
180 185 190
Phe Glu Lys Tyr Gly Asp Asp Ile Ser Gly Val Ile Val Glu Pro Val
195 200 205
Ala Gly Asn Met Gly Val Val Pro Pro Val Glu Gly Phe Leu Gln Gly
210 215 220
Leu Arg Asp Ile Thr Asn Glu Tyr Gly Ser Leu Leu Ile Phe Asp Glu
225 230 235 240
Val Met Thr Gly Phe Arg Val Gly Tyr Asn Cys Ala Gln Gly Tyr Phe
245 250 255
Gly Val Thr Pro Asp Leu Thr Cys Leu Gly Lys Val Ile Gly Gly Gly
260 265 270
Leu Pro Val Gly Ala Phe Gly Gly Lys Lys Glu Ile Met Asp His Ile
275 280 285
Ala Pro Val Gly Asn Ile Tyr Gln Ala Gly Thr Leu Ser Gly Asn Pro
290 295 300
Leu Ala Met Thr Ser Gly Tyr Glu Thr Leu Ser Gln Leu Thr Pro Glu
305 310 315 320
Ser Tyr Asp Tyr Phe Asn Glu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Lys Gly Leu
325 330 335
Lys Glu Val Phe Ala Lys His Gln Val Pro Ile Thr Val Asn Arg Ala
340 345 350
Gly Ser Met Ile Gly Tyr Phe Leu Asn Glu Gly Pro Val Thr Asn Phe
355 360 365
Glu Gln Ala Asn Lys Ser Asp Leu Lys Leu Phe Ser Glu Met Tyr Arg
370 375 380
Glu Met Ala Lys Glu Gly Val Phe Leu Pro Pro Ser Gln Phe Glu Gly
385 390 395 400
Thr Phe Leu Ser Thr Ala His Thr Lys Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile
405 410 415
Gln Ala Phe Asp Asn Ser Leu Ser Arg Ile Val Lys
420 425
<210> 9
<211> 429
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Asn Phe Thr Glu Ser Glu Arg Leu Gln Glu Leu Ser Asn Glu Tyr
1 5 10 15
Ile Leu Gly Gly Val Asn Ser Pro Ser Arg Ser Tyr Lys Ala Val Gly
20 25 30
Gly Gly Ala Pro Val Val Met Lys Glu Gly Lys Gly Ala Tyr Leu Tyr
35 40 45
Asp Val Asp Gly Asn Lys Phe Ile Asp Tyr Leu Gln Ala Tyr Gly Pro
50 55 60
Ile Ile Thr Gly His Ala His Pro His Ile Thr Lys Ala Ile Gln Glu
65 70 75 80
Gln Ala Ala Lys Gly Val Leu Tyr Gly Thr Pro Thr Glu Leu Glu Ile
85 90 95
Glu Phe Ser Lys Lys Leu Arg Glu Ala Ile Pro Ser Leu Glu Lys Ile
100 105 110
Arg Phe Val Asn Ser Gly Thr Glu Ala Val Met Thr Thr Ile Arg Val
115 120 125
Ala Arg Ala Tyr Thr Lys Arg Asn Lys Ile Ile Lys Phe Ala Gly Ser
130 135 140
Tyr His Gly His Ser Asp Leu Val Leu Val Ala Ala Gly Ser Gly Pro
145 150 155 160
Ser Gln Leu Gly Ser Pro Asp Ser Ala Gly Val Pro Glu Ser Val Ala
165 170 175
Lys Glu Val Ile Thr Val Pro Phe Asn Asp Ile Glu Ser Tyr Lys Glu
180 185 190
Ala Ile Asn His Trp Gly Asp Asp Val Ala Ala Val Leu Val Glu Pro
195 200 205
Ile Val Gly Asn Phe Gly Met Val Met Pro Glu Pro Gly Phe Leu Glu
210 215 220
Glu Val Asn Arg Ile Thr Asn Glu Asn Asn Ser Leu Val Ile Tyr Asp
225 230 235 240
Glu Val Ile Thr Ala Phe Arg Phe His Tyr Gly Ala Ala Gln Asp Leu
245 250 255
Leu Gly Val Ile Pro Asp Leu Thr Ala Phe Gly Lys Ile Val Gly Gly
260 265 270
Gly Leu Pro Ile Gly Gly Tyr Gly Gly Arg Gln Asp Ile Met Glu His
275 280 285
Val Ala Pro Leu Gly Pro Ala Tyr Gln Ala Gly Thr Met Ala Gly Asn
290 295 300
Pro Leu Ser Met Lys Ala Gly Ile Ala Leu Leu Glu Val Leu Glu Gln
305 310 315 320
Asp Gly Val Tyr Glu Lys Leu Asp Lys Leu Gly Lys Arg Leu Glu Asp
325 330 335
Gly Leu Leu Gln Leu Ile Glu Lys His Gln Ile Thr Ala Thr Ile Asn
340 345 350
Arg Ile Tyr Gly Ser Leu Thr Leu Tyr Phe Thr Asp Glu Lys Ile Thr
355 360 365
His Tyr Glu Gln Val Glu Asn Ser Asp Gly Glu Ala Phe Ala Lys Phe
370 375 380
Phe Lys Leu Met Leu Asn Gln Gly Ile Asn Leu Ala Pro Ser Lys Phe
385 390 395 400
Glu Ala Trp Phe Leu Thr Thr Glu His Thr Glu Glu Asp Ile Asp Gln
405 410 415
Thr Leu Lys Ala Ala Asp Tyr Ala Phe Ser Gln Met Lys
420 425
<210> 10
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Thr Ala Glu Lys Ile Thr Gln Thr Lys Asp Gly Leu Asn Val Pro
1 5 10 15
Asn Glu Pro Ile Ile Pro Phe Ile Ile Gly Asp Gly Ile Gly Pro Asp
20 25 30
Ile Trp Lys Ala Ala Ser Arg Val Ile Asp Ala Ala Val Glu Lys Ala
35 40 45
Tyr Asn Gly Glu Lys Arg Ile Glu Trp Lys Glu Val Leu Ala Gly Gln
50 55 60
Lys Ala Tyr Asp Asn Thr Gly Glu Trp Leu Pro Gln Glu Thr Leu Asp
65 70 75 80
Thr Ile Lys Glu Tyr Leu Ile Ala Val Lys Gly Pro Leu Thr Thr Pro
85 90 95
Ile Gly Gly Gly Ile Arg Ser Leu Asn Val Ala Leu Arg Gln Glu Leu
100 105 110
Asp Leu Phe Thr Cys Leu Arg Pro Val Arg Trp Phe Gln Gly Val Pro
115 120 125
Ser Pro Val Lys Arg Pro Gln Asp Val Asp Met Val Ile Phe Arg Glu
130 135 140
Asn Thr Glu Asp Ile Tyr Ala Gly Ile Glu Phe Lys Glu Gly Thr Pro
145 150 155 160
Glu Val Lys Lys Val Ile Asp Phe Leu Gln Asp Glu Met Gly Ala Thr
165 170 175
Asn Ile Arg Phe Pro Glu Thr Ser Gly Ile Gly Ile Lys Pro Val Ser
180 185 190
Lys Glu Gly Thr Glu Arg Leu Val Arg Ala Ala Ile Gln Tyr Ala Ile
195 200 205
Asp Asn Asn Arg Lys Ala Val Thr Leu Val His Lys Gly Asn Ile Met
210 215 220
Lys Phe Thr Glu Gly Ser Phe Lys Gln Trp Gly Tyr Asp Leu Ala His
225 230 235 240
Asn Glu Phe Ala Asp Gln Val Phe Thr Trp Gln Gln Tyr Asp Glu Ile
245 250 255
Val Glu Lys Glu Gly Lys Asp Ala Ala Asn Glu Ala Gln Ser Lys Ala
260 265 270
Glu Gln Glu Gly Lys Ile Ile Val Lys Asp Ser Ile Ala Asp Ile Phe
275 280 285
Leu Gln Gln Ile Leu Thr Arg Pro Ser Glu His Glu Val Val Ala Thr
290 295 300
Met Asn Leu Asn Gly Asp Tyr Ile Ser Asp Ala Leu Ala Ala Gln Val
305 310 315 320
Gly Gly Ile Gly Ile Ala Pro Gly Ala Asn Ile Asn Tyr Glu Thr Gly
325 330 335
His Ala Ile Phe Glu Ala Thr His Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Ala Gly
340 345 350
Leu Asn Lys Val Asn Pro Ser Ser Glu Leu Leu Ser Ser Val Leu Met
355 360 365
Leu Glu His Leu Gly Trp Gln Glu Ala Ala Asp Lys Ile Thr Asp Ser
370 375 380
Ile Glu Ala Thr Ile Ala Ser Lys Ile Val Thr Tyr Asp Phe Ala Arg
385 390 395 400
Leu Met Asp Gly Ala Thr Glu Val Ser Thr Ser Glu Phe Ala Asp Glu
405 410 415
Leu Ile Lys Asn Leu Lys
420
<210> 11
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Ile Tyr Thr Val Thr Phe Asn Pro Ser Ile Asp Tyr Val Met Phe
1 5 10 15
Val Asp Asp Phe Lys Ile Asp Gly Leu Asn Arg Ala Gln Asp Thr Asn
20 25 30
Lys Phe Ala Gly Gly Lys Gly Ile Asn Val Ser Arg Val Leu Lys Thr
35 40 45
Leu Gly Val Asp Ser Thr Ala Leu Gly Phe Ala Gly Gly Phe Pro Gly
50 55 60
Asp Phe Ile Ala Gln Thr Leu Lys Asp Ser Asp Ile His Thr Asp Phe
65 70 75 80
Val Gln Val Asp Glu Asp Thr Arg Ile Asn Val Lys Leu Lys Thr Gly
85 90 95
Gln Glu Thr Glu Val Asn Ala Gln Gly Pro Asn Val Thr Asp Ala Gln
100 105 110
Phe Gln Ser Leu Leu Asn Gln Ile Lys Glu Thr Thr Asp Asn Asp Thr
115 120 125
Val Ile Val Ala Gly Ser Val Pro Lys Ser Ile Pro Ser Asp Ala Tyr
130 135 140
Ala Gln Ile Ala Lys Ile Thr Lys Gln Thr Gly Ala Gln Leu Val Val
145 150 155 160
Asp Ala Glu Lys Asp Leu Val Glu Ser Val Leu Glu Tyr Gln Pro Leu
165 170 175
Phe Ile Lys Pro Asn Lys Asp Glu Leu Glu Val Met Phe Asn Thr Ser
180 185 190
Val Lys Ser Asp Glu Asp Val Ile Lys Tyr Ala Lys Gln Ile Leu Asp
195 200 205
Lys Gly Ala Gln Ser Val Ile Val Ser Leu Gly Gly Asp Gly Ala Ile
210 215 220
Tyr Val Asp Arg Gln Gln Ser Ile Lys Ala Val Asn Pro Lys Gly Lys
225 230 235 240
Val Ile Asn Thr Val Gly Ser Gly Asp Ser Thr Val Ala Gly Met Val
245 250 255
Ala Gly Leu Ala Thr Gly Leu Ser Val Gln Asp Ala Phe Lys Gln Ala
260 265 270
Val Ala Ser Gly Thr Ala Thr Ala Phe Asp Ala Asp Leu Ala Thr Lys
275 280 285
Asp Ala Ile Glu Asn Ile Lys Ser Gln Val Thr Ile Ser Val Leu Asp
290 295 300
Gly Glu
305

Claims (10)

1.一种产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株，其特征在于：所述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株通过提高作为出发菌的巴氏葡萄球菌中的谷氨酰tRNA还原酶/谷氨酰-1-半醛氨基转移酶/异柠檬酸脱氢酶/磷酸果糖激酶中任一种的表达量或含量或活性得到，其与作为出发菌的巴氏葡萄球菌相比，5-氨基乙酰丙酸的产量提高。
2.根据权利要求1所述的产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株，其特征在于：所述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株按照权利要求3-7中任一所述的方法构建。
3.产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株的构建方法，其特征在于：包括A1或A2：
A1提高作为出发菌的巴氏葡萄球菌中谷氨酰tRNA还原酶/谷氨酰-1-半醛氨基转移酶/异柠檬酸脱氢酶/磷酸果糖激酶中任一种的编码基因的表达量；
A2在作为出发菌的所述巴氏葡萄球菌中导入谷氨酰tRNA还原酶/谷氨酰-1-半醛氨基转移酶/异柠檬酸脱氢酶/磷酸果糖激酶中任一种的编码基因。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述出发菌为PK8，所述PK8在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.16178。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株通过重组载体将含有谷氨酰tRNA还原酶/谷氨酰-1-半醛氨基转移酶/异柠檬酸脱氢酶/磷酸果糖激酶中任一种的编码基因的重组表达载体导入所述出发菌中实现。
6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：所述谷氨酰tRNA还原酶为氨基酸序列是序列表中序列7的蛋白质；
所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶为氨基酸序列是序列表中序列8或序列9的蛋白质；
所述异柠檬酸脱氢酶为氨基酸序列是序列表中序列10的蛋白质；
所述磷酸果糖激酶为氨基酸序列是序列表中序列11的蛋白质。
7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于：所述谷氨酰tRNA还原酶的编码基因为f1-f2中的任一种DNA分子：
f1编码链的编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或基因组DNA；
f2在严格条件下与f1限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酰tRNA还原酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的编码基因为g1-g2与h1-h2中的任一种DNA分子：
g1编码链的编码序列是序列表中序列3的cDNA分子或基因组DNA；
g2在严格条件下与g1限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的cDNA分子或基因组DNA；
h1编码链的编码序列是序列表中序列4的cDNA分子或基因组DNA；
h2在严格条件下与h1限定的DNA分子杂交且编码所述谷氨酰-1-半醛氨基转移酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述异柠檬酸脱氢酶的编码基因为i1-i2中的任一种DNA分子：
i1编码链的编码序列是序列表中序列5的cDNA分子或基因组DNA；
i2在严格条件下与i1限定的DNA分子杂交且编码所述柠檬酸脱氢酶的cDNA分子或基因组DNA；
所述磷酸果糖激酶的编码基因为j1-j2中的任一种DNA分子：
j1编码链的编码序列是序列表中序列6的cDNA分子或基因组DNA；
j2在严格条件下与j1限定的DNA分子杂交且编码所述磷酸果糖激酶的cDNA分子或基因组DNA。
8.权利要求5中所述重组载体。
9.一种制备感受态巴氏葡萄球菌的方法，其特征在于，包括菌体培养至OD600为0.2时加入终浓度为15μg/mL的青霉素。
10.权利要求1或2所述的产5-氨基乙酰丙酸的巴氏葡萄球菌工程菌株或权利要求3或4中所述的出发菌或权利要求3-7中任一所述的方法或权利要求5中所述重组载体或权利要求9所述制备感受态巴氏葡萄球菌的方法在制备5-氨基乙酰丙酸中的应用。
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