CN112852907B - 一种头孢菌素c生产菌及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种头孢菌素C生产菌及其制备方法与应用。本发明提供一种制备头孢菌素C的方法，包括如下步骤：为在酵母菌中引入头孢菌素C合成途径，得到重组菌，发酵所述重组菌，得到头孢菌素。本发明利用能够以葡萄糖作为碳源的酿酒酵母菌作为研究对象，利用代谢工程、合成生物学等手段，在其中外源引入头孢菌素C合成途径，可以实现由葡萄糖合成头孢菌素C。因此本发明为CPC的合成开辟一条全新的途径。

Description

一种头孢菌素C生产菌及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及工程菌构建技术领域，具体涉及一种头孢菌素C生产菌及其制备方法与应用。

背景技术

头孢菌素C(cephalosporin C，CPC，结构见图1)化学式为C₁₆H₂₁N₃O₈S，其钠盐二水合物为单斜晶体。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，当水溶液pH2.5-8时稳定。对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、大肠杆菌有活性，但由于抗菌活力低，临床未广泛应用。目前主要作为制备7-氨基头孢烷酸(7-Aminocephalosporanic acid，7-ACA)和3-去乙酰基-7-氨基-头孢烯酸(Hydroxymethyl-7-Aminocephalosporanic acid，D-7-ACA)的中间体。

β-内酰胺类抗生素占据着全球抗生素市场一半以上的份额，目前市场上绝大部分的头孢类抗生素是由β-内酰胺类抗生素母核7-ADCA(7-Aminodesacetoxycephalosporanicacid，7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸)、D-7-ACA和7-ACA通过化学法合成，结构式如图2所示，其中7-ACA的全球年需求量在4000吨左右。

目前工业上使用顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)进行发酵生产CPC，顶头孢霉CPC生物合成机制及生物合成途径已经研究的较为清楚，参与头孢菌素C生物合成的基因包含两簇：1)早期基因簇由pcbAB-pcbC和cefD1-cefD2组成，其中pcbAB编码ACV三肽合成酶，磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)负责将合成的ACV三肽合成酶转变为有活性的状态，之后处于活性状态的三肽ACV合成酶负责将三个前体氨基酸L-α-氨基己二酸(L-α-aminoadipic acid，L-AAA)、L-半胱氨酸(L-Cysteine，L-Cys)和L-缬氨酸(L-Valine，L-Val)缩合成三肽ACV(δ-L-α-aminoadipyl-L-cysteinyl-D-valine)，然后pcbC编码的异青霉素N合酶(IPN Synthase)催化ACV环化形成异青霉素N(Isopenicillin N，IPN)；而后IPN在IPN差向异构酶系统(IPN Epimerase System)的催化下异构化形成青霉素N(PenicillinN)，在顶头孢霉中，编码IPN差向异构酶的基因为cefD1-cefD2；2)晚期基因簇由cefEF和cefG组成，其中cefEF基因在顶头孢霉中编码一个独特的双功能酶：脱乙酰氧头孢菌素C合成酶(扩环酶)(Deacetoxycephalosporin C Synthetase(expandase))和脱乙酰头孢菌素C合成酶(羟化酶)(Deacetylcephalosporin C Synthetase(hydroxylase))，分别顺次将青霉素N转化成脱乙酰氧头孢菌素C(Deacetoxycephalosporin C，DAOC)和脱乙酰头孢菌素C(Deacetylcephalosporin C，DAC)；最后一步由DAC生成CPC则是由cefG编码的DAC乙酰转移酶(Deacetylcephalosporin C Acetyltransferase，DAC-AT)催化。

上述过程主要发生在细胞质中，只有IPN异构化形成青霉素N的反应发生在过氧化物酶体中，因此在顶头孢霉CPC生物合成途径中还涉及到IPN和青霉素N的跨膜转运，增加了其代谢调控的难度。另一方面，在顶头孢霉中，催化IPN转化为青霉素N可能的途径IPN差向异构酶系统为：由cefD1编码的异青霉素N乙酰辅酶A合成酶(Acyl-CoA Synthetase)和由cefD2编码的异青霉素N-辅酶A差向异构酶(CoA Epimerase)和硫酯酶。相比于顶头孢霉，细菌来源如棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)、诺卡氏菌(Nocardia lactmdurms)的IPN差向异构酶更加稳定，其催化IPN转化为青霉素N的合成途径更为简单。

综上所述，通过发酵顶头孢霉生产CPC还存在以下几个问题：1)顶头孢霉的遗传操作方法难度较大，基础研究尚不充足；2)在顶头孢霉CPC的生物合成途径中，涉及到细胞质和过氧化物酶体两个场所，从利用及改造的角度考虑，增加了难度及复杂性。

酿酒酵母作为真核模式生物，已经通过代谢改造用于合成异丁醇等生物燃料及类胡萝卜素等天然产物，其优势主要表现在：1)其生理生化特性、发酵操作等都已具备十分充足的研究基础；2)作为第一个进行全基因组测序的真核微生物，已经建立了专门的酿酒酵母基因组数据库用于其生物信息学的检索(http://www.yeastgenome.org/)；3)作为理想的外源蛋白表达和代谢途径构建的宿主，与其相关的基因操作手段和载体工具比较丰富；4)生物安全性好，适用于药用化合物的微生物细胞工厂。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备头孢菌素C的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：为在酵母菌中引入头孢菌素C合成途径，得到重组菌，发酵所述重组菌，得到头孢菌素C；

所述引入头孢菌素C合成途径包括如下步骤(反应如下)：

1)引入ACV三肽合成酶或其突变体，和，磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶或其突变体，使所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶或其突变体能激活所述ACV三肽合成酶或其突变体催化所述酵母菌中的L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸合成ACV三肽；

2)引入异青霉素N合酶IPNS或其突变体，使该酶能催化所述ACV三肽合成异青霉素N；

3)引入异青霉素N差向异构酶IPNE或其突变体，使该酶能催化所述异青霉素N合成青霉素N；

4)引入脱乙酰氧头孢菌素C合成酶DAOCS或其突变体、脱乙酰头孢菌素C合成酶DAOCS或其突变体、脱乙酰头孢菌素C乙酰转移酶DAC-AT或其突变体，使这些酶能催化所述青霉素N合成头孢菌素C。

上述方法中，所述头孢菌素C合成途径为异源头孢菌素C合成途径；

或，所述ACV三肽合成酶来源于Symbiodinium microadriaticum(genbank号为A0A1Q9CLY8及提交日为2017年4月12日)或Streptomyces clavuligerus(genbank号Q01757及提交日为1996年10月1日)；

或，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶来源于Aspergillus nidulans(genbank号为G5EB87及提交日为2011年12月14日)；

或，所述异青霉素N合酶IPNS来源于Acremonium chrysogenum(genbank号为P05189及提交日为1987年8月13日)或Amycolatopsis lactamdurans(genbank号为P27744及提交日为1992年8月1日)或Flavobacterium sp.(genbank号为P16020及提交日为1990年4月1日)或Streptomyces jumonjinensis(genbank号为P18286及提交日为1990年11月1日)或Penicillium chrysogenum(genbank号为P08703及提交日为1988年1月1日)或Streptomyces cattleya(genbank号为Q53932及提交日为1996年12月1日)或Streptomycesclavuligerus(genbank号为P10621及提交日为1989年7月1日)或Lysobacter lactamgenus(genbank号为Q48739及提交日为1996年11月1日)或Streptomyces griseus(genbank号为Q9FAB9及提交日为2001年3月1日)或Streptomyces microflavus(genbank号为P12438及提交日为1989年10月1日)或Emericella nidulans(genbank号为P05326及提交日为1988年11月1日)；

或，所述异青霉素N差向异构酶IPNE来源于Streptomyces clavuligerus(genbank号为P18549及提交日为2007年1月23日)或Amycolatopsis lactamdurans(genbank号为Q03046及提交日为1993年7月1日)或Pseudomonas protegens(genbank号为A0A2C9EQN1及提交日为2017年12月20日)或Janthinobacterium sp.HH01(genbank号为L9PBH2及提交日为2013年4月3日)或Streptomyces reticuli(genbank号为A0A0U5HIE9及提交日为2016年3月16日)。

或，所述脱乙酰氧头孢菌素C合成酶扩环酶DAOCS和脱乙酰头孢菌素C合成酶羟化酶DAOCS均来源于Acremonium chrysogenum(genbank号为P11935及提交日为1989年10月1日)或Pochonia chlamydosporia 170(genbank号为A0A179FPR8及提交日为2016年9月7日)。

或，所述脱乙酰头孢菌素C乙酰转移酶DAC-AT来源于Acremonium chrysogenum(genbank号为P39058及提交日为1995年2月1日)或Talaromyces stipitatus(genbank号为B8MN38及提交日为2009年3月3日)或Rasamsonia emersonii(genbank号为A0A0F4YW05及提交日为2015年6月24日)或Byssochlamys spectabilis(genbank号为V5FBF8及提交日为2014年1月22日)或Acremonium chrysogenum(genbank号为A0A086T6E3及提交日为2014年10月29日)。

上述方法中，所述酵母菌含有L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸的合成途径；

或，所述酵母菌为酿酒酵母、啤酒酵母、葡萄汁酵母、汉逊酵母、球拟酵母、假丝酵母、毕赤酵母、红酵母或棉病针酵母。

上述方法中，所述在酵母菌中引入头孢菌素C合成途径的方法包括如下步骤：使所述酵母菌表达以下6种酶的外源基因，得到的引入该途径的重组菌：所述ACV三肽合成酶或其突变体、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶或其突变体、所述异青霉素N合酶IPNS或其突变体、所述异青霉素N差向异构酶IPNE或其突变体、所述脱乙酰氧头孢菌素C合成酶DAOCS或其突变体、所述脱乙酰头孢菌素C合成酶DAOCS或其突变体和所述脱乙酰头孢菌素C乙酰转移酶DAC-AT或其突变体；

所述酵母菌含有L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸的合成途径。

所述脱乙酰氧头孢菌素C合成酶扩环酶DAOCS或其突变体和所述脱乙酰头孢菌素C合成酶羟化酶DAOCS或其突变体融合表达。

上述方法中，所述使酵母菌表达以下6种酶的外源基因为将所述6种酶的外源基因均以质粒形式存在所述酵母菌中进行表达。

在本发明的实施例中，重组菌具体为将重组质粒pESC-G418-CPCCG和pESC-Hyg-SmABA导入酵母菌中得到重组菌。

上述中，各个酶的突变体为将各个酶的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由各个序列衍生的序列。

本发明对上述酶对应的外源基因的转化导入方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的基因转化方法进行转化即可。

上述方法中，发酵为以葡萄糖为原料，且葡萄糖在发酵培养体系中的质量百分含量为1％-5％。

本发明另一个目的是提供一种重组菌。

本发明提供的重组菌，按照包括如下步骤的方法制备：使酵母菌表达以下6种酶的外源基因得到的重组菌：ACV三肽合成酶或其突变体、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶或其突变体、异青霉素N合酶IPNS或其突变体、异青霉素N差向异构酶IPNE或其突变体、脱乙酰氧头孢菌素C合成酶DAOCS或其突变体、脱乙酰头孢菌素C合成酶DAOCS或其突变体和脱乙酰头孢菌素C乙酰转移酶DAC-AT或其突变体；

所述酵母菌含有L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸的合成途径。

上述重组菌中，

所述ACV三肽合成酶来源于Symbiodinium microadriaticum或Streptomycesclavuligerus；

或，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶来源于Aspergillus nidulans；

或，所述异青霉素N合酶IPNS来源于Acremonium chrysogenum或Amycolatopsislactamdurans或Flavobacterium sp.或Streptomyces jumonjinensis或Penicilliumchrysogenum或Streptomyces cattleya或Streptomyces clavuligerus或Lysobacterlactamgenus或Streptomyces griseus或Streptomyces microflavus或Emericellanidulans；

或，所述异青霉素N差向异构酶IPNE来源于Streptomyces clavuligerus或Amycolatopsis lactamdurans或Pseudomonas protegens或Janthinobacterium sp.HH01或Streptomyces reticuli；

或，所述脱乙酰氧头孢菌素C合成酶扩环酶DAOCS和脱乙酰头孢菌素C合成酶羟化酶DAOCS均来源于Acremoniumchrysogenum或Pochonia chlamydosporia 170；

或，所述脱乙酰头孢菌素C乙酰转移酶DAC-AT来源于Acremonium chrysogenum或Talaromyces stipitatus或Rasamsonia emersonii或Byssochlamys spectabilis或Acremonium chrysogenum；

或，所述酵母菌为酿酒酵母、啤酒酵母、葡萄汁酵母、汉逊酵母、球拟酵母、假丝酵母、毕赤酵母、红酵母或棉病针酵母。

本发明还提供了一种重组菌，其按照包括如下步骤的方法制备：使酵母菌表达ACV三肽合成酶或其突变体和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶或其突变体；所述酵母菌含有L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸的合成途径；所述ACV三肽合成酶来自Symbiodiniummicroadriaticum。

本发明还有一个目的是提供一种生产头孢菌素C的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：以葡萄糖为原料发酵第二个目的中的重组菌，得到头孢菌素C。

上述葡萄糖在发酵培养体系中的质量百分含量为1％-5％。

本发明对所述头孢菌素C生产菌的发酵培养条件没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规酿酒酵母菌属培养条件即可，如15～37℃，培养40～240小时收集得到头孢菌素C。本发明对所述培养基没有特殊的限定，优选DM07，所述DM07培养基包括蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、半乳糖10g/L和葡萄糖30g/L。

上述中，所述脱乙酰氧头孢菌素C合成酶扩环酶DAOCS和脱乙酰头孢菌素C合成酶羟化酶DAOCS均来自Acremonium chrysogenum，所述脱乙酰氧头孢菌素C合成酶扩环酶DAOCS和脱乙酰头孢菌素C合成酶羟化酶DAOCS融合表达；

或，所述脱乙酰氧头孢菌素C合成酶扩环酶DAOCS和脱乙酰头孢菌素C合成酶羟化酶DAOCS均来自Pochonia chlamydosporia 170，所述脱乙酰氧头孢菌素C合成酶扩环酶DAOCS和脱乙酰头孢菌素C合成酶羟化酶DAOCS融合表达。

本发明为将酵母菌中引入异源的头孢菌素C合成途径，该途径分为如下反应：能够代谢葡萄糖并产生三个前体氨基酸L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸，ACV合成酶负责将三个前体氨基酸L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸缩合成三肽ACV(δ-L-α-aminoadipyl-L-cysteinyl-D-valine)，然后异青霉素N合酶催化ACV环化形成异青霉素N，而后异青霉素N在异青霉素N差向异构酶的催化下异构化形成青霉素N，脱乙酰氧头孢菌素C合成酶(扩环酶)和脱乙酰头孢菌素C合成酶(羟化酶)，分别依次将青霉素N转化成脱乙酰氧头孢菌素C和脱乙酰头孢菌素C；最后脱乙酰头孢菌素C被脱乙酰头孢菌素C乙酰转移酶催化生成头孢菌素C。本发明提供的头孢菌素C生产菌能够以葡萄糖作为原料生产头孢菌素C，能够充分利用廉价且来源丰富的原料葡萄糖，通过微生物代谢，直接合成头孢菌素C产品。本发明利用能够以葡萄糖作为碳源的酿酒酵母菌作为研究对象，利用代谢工程、合成生物学等手段，在其中外源引入头孢菌素C合成途径，可以实现由葡萄糖合成头孢菌素C。因此本发明为CPC的合成开辟一条全新的途径。

附图说明

图1为头孢菌素C的结构式；

图2为β-内酰胺类抗生素母核的结构式；

图3为异源头孢菌素C合成途径；

图4为酿酒酵母在不同CPC浓度下的生长曲线图；

图5为ACV三肽合成的质粒pESC-Hyg-SmABA图谱；

图6为菌体破碎液中ACV三肽的质谱检测图；

图7为质粒pESC-G418-CPCCG图谱；

图8为发酵后样品液质联用检测图(A)及CPC标准曲线(B)；

图9为发酵样品细胞干重；

图10为细胞破碎液中CPC的浓度；

图11为DM07发酵培养基发酵液相图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中对头孢菌素C浓度的检测方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的检测方法即可。

在本发明的实施例中，ACV三肽和头孢菌素C浓度检测方法采用液相与质谱联用技术：

仪器：高效液相色谱仪

检测器：UV检测器

检测波长：254nm

色谱柱：ZORBAX Eclipse AAA Analytical 4.6×150mm,5-Micron

运行时间:25min

梯度洗脱：A流动相：甲醇(20mM的甲酸)

B流动相：水(20mM的甲酸)

0-20min：0-100％的A流动相，

20-25min：100％的B流动相。

流速：0.8mL/min

进样量：10uL

柱温箱温度：20℃

质谱收集范围：m/z＝100-900。

采用的标准品头孢菌素C购买于合肥博美生物科技有限责任公司，货号为TC9071。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种头孢菌素C生产菌及其生产头孢菌素C的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

下述实施例中携带目的基因的质粒均为质粒pET-24a-目的基因，即将目的基因克隆到质粒pET-24a上，由合成目的基因的公司提供。

酿酒酵母BY4741(来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号bio-82064)，已知本身存在合成L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸的代谢途径。

下述实施例中的部分引物见表1所示：

表1为引物序列表

实施例1、生产头孢菌素C(CPC)的重组酿酒酵母的制备

一、酿酒酵母的选择

为了选择合成CPC的底盘细胞，需要对合成菌株进行耐受性实验。考察了酿酒酵母菌BY4741在CPC浓度为0g/L、5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L时的生长情况。

将酿酒酵母BY4741单菌落接种到5mL的YPD培养基(蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L，余量为水)中，30℃，220rpm条件下培养24h得到活化菌液。再将活化菌液按照菌液体积比上培养基体积为1：100的比例接种到装有0.5mL装有含不同浓度CPC的YPD培养基(含有不同浓度CPC培养基由CPC加入到YPD培养基中组成，其中CPC浓度分别为0g/L、5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L)的96孔板中，在30℃，12000rpm条件下培养不同时间后测定菌株在紫外光600nm下的吸光值(OD600)。

结果如图4所示，即使在90g/L的CPC存在的条件下，酿酒酵母的生长几乎没有受到影响，因此选择酿酒酵母BY4741作为合成CPC的底盘细胞。

二、表达ACV三肽合成酶的重组质粒的制备及ACV三肽的获得

酿酒酵母BY4741本身存在合成L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸的代谢途径，以L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸为前体，ACV三肽合成酶负责将三个前体氨基酸L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸缩合成三肽ACV(δ-L-α-aminoadipyl-L-cysteinyl-D-valine)。因此ACV异源合成需要在酿酒酵母胞内导入ACV三肽的异源合成基因，具体如下：

1、表达ACV三肽合成酶的重组质粒的制备

表达ACV三肽合成酶的重组质粒pESC-Hyg-SmABA为将珊瑚共生体Symbiodiniummicroadriaticum来源的ACV三肽合成酶(genbank号A0A1Q9CLY8及提交日为2017年4月12日)的基因pcbAB与Aspergillus nidulans(构巢曲霉)来源磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)(genbank号G5EB87及提交日为2011年12月14日)基因npgA构建到质粒pESC-Hyg中，得到重组质粒pESC-Hyg-SmABA，其中GAL1,10启动子(半乳糖诱导型启动子)分别表达基因pcbAB和npgA，pcbAB用ADH1t终止子，npgA用CYC1t终止子，如图5所示。

重组质粒pESC-Hyg-SmABA的制备方法具体如下：

1)构建质粒pESC-Hyg

质粒pESC-Hyg为将抗性基因Hyg替换质粒pESC-Leu中的Leu基因，得到的质粒；具体方法如下：

以质粒pESC-Leu(购买于上海信裕生物科技有限公司，货号60908-2752)为模板，引物HYG-UP-F和HYG-UP-R扩增出基因片段HYG-UP，引物HYG-DOWN-F和HYG-DOWN-R扩增出基因片段HYG-DOWN。以携带在武汉金开瑞生物工程有限公司合成的基因Hyg(潮霉素抗性基因)的质粒pET-24a-Hyg为模板，引物HYG-F和HYG-R扩增出基因片段HYG，引物序列如表1所示。PCR方法为预变性96℃，5分钟；变性96℃，15秒；退火55℃，15秒；延伸72℃，时间根据片段长度设定；72℃，10分钟；变性到延伸设置30个循环。

将扩增出来的基因片段HYG-UP、HYG-DOWN和HYG通过重叠延伸的方法进行连接，得到PCR产物，上述重叠延伸采用的PCR程序为变性96℃，15秒；退火50℃，15秒；延伸72℃，时间根据片段长度设定；72℃，10分钟；变性到延伸设置30个循环。

以该PCR产物为模板，以引物HYG-UP-F和HYG-DOWN-R进行PCR，PCR方法为预变性96℃，5分钟；变性96℃，15秒；退火55℃，15秒；延伸72℃，时间根据片段长度设定；72℃，10分钟；变性到延伸设置30个循环，获得1809bp的基因片段UP-HYG-DOWN；(如序列1所示，其中第201bp到1609bp为HYG序列)

将UP-HYG-DOWN片段500ng与质粒pESC-Leu 500ng混合电转化到酿酒酵母BY4741中，将菌液均匀的涂布在Hyg抗性的YPD平板上，置于30℃恒温条件下培养至少48小时，待长出单菌落后进行测序验证获得质粒pESC-Hyg。

2)构建重组质粒pESC-Hyg-SmABA

在Uniprot数据库中搜索到Symbiodinium microadriaticum来源的pcbAB基因的氨基酸序列和Aspergillus nidulans来源的npgA基因的氨基酸序列进行针对酿酒酵母的密码子优化，之后通过基因合成的方式获得上述两个基因片段(武汉金开瑞生物工程有限公司合成基因)，最后通过重叠延伸及吉布森组装的方法将上述两个基因片段构建到质粒pESC-Hyg上；具体操作如下：

以携带基因pcbAB的质粒pET-24a-pcbAB为模板，引物PCBAB-F和PCBAB-R进行PCR扩增获得1925bp基因片段PCBAB(序列2第1960-3884位)；

以携带基因片段npgA的质粒pET-24a-npgA为模板，引物NPGA-F和NPGA-R进行PCR扩增获得1104bp基因片段NPGA(序列2第191-1294位)；

以质粒pESC-Hyg为模板，引物GAL1,10-PROMOTER-F和GAL1,10-PROMOTER-R进行PCR扩增获得665bp GAL1，10-PROMOTER(序列2第1295-1959位)；

上述PCR方法为预变性96℃，5分钟；变性96℃，15秒；退火55℃，15秒；延伸72℃，时间根据片段长度设定；72℃，10分钟；变性到延伸设置30个循环。

将上述3个片段PCBAB、NPGA、GAL1,10-PROMOTER通过重叠延伸的方法进行连接，得到PCR产物；上述重叠延伸采用的PCR程序为变性96℃，15秒；退火50℃，15秒；延伸72℃，时间根据片段长度设定；72℃，10分钟；变性到延伸设置30个循环。以该PCR产物为模板，以引物PCBAB-F和NPGA-R进行PCR，PCR方法为预变性96℃，5分钟；变性96℃，15秒；退火55℃，15秒；延伸72℃，时间根据片段长度设定；72℃，10分钟；变性到延伸设置30个循环；获得基因片段PCBAB-GAL1,10-PROMOTER-NPGA(如序列2所示)。

以pESC-Hyg为模板，引物VECTOR-F和VECTOR-R进行PCR，PCR方法为预变性96℃，5分钟；变性96℃，15秒；退火55℃，15秒；延伸72℃，时间根据片段长度设定；72℃，10分钟；变性到延伸设置30个循环，获得5645bp片段VECTOR；最后将基因片段PCBAB-GAL1,10-PROMOTER-NPGA和片段VECTOR按照摩尔比3：1进行混合，通过吉布森组装(ClonExpressTMII One Step Cloning Kit试剂盒购买于华蔚天津科技有限公司，货号为C112-02)进行连接，得到连接产物，再将连接产物电转化到酿酒酵母BY4741中，将菌液均匀的涂布在Hyg抗性的YPD平板上，置于30℃恒温条件下培养至少48小时，待长出单菌落后进行测序获得重组质粒pESC-Hyg-SmABA，该质粒表达pcbAB和npgA，且pcbAB基因的启动子为GAL1,10启动子(半乳糖诱导型启动子)，终止子为ADH1t；npgA基因的启动子为GAL1,10启动子(半乳糖诱导型启动子)，终止子为CYC1t。

2、表达ACV三肽的重组菌的制备

将上述1制备的重组质粒pESC-Hyg-SmABA电转化进酿酒酵母BY4741中，均匀的涂布在100ng/uL的潮霉素抗性的YPD平板上，30℃恒温培养24h后，将长出的单菌落转接到含5mL的100ng/uL的潮霉素抗性的液体YPD培养基中，30℃、220rpm条件下培养24h，之后按照体积比1：100的比例转接到含50mL的100ng/uL的潮霉素抗性的液体YPD培养基中，30℃、220rpm条件下进行发酵，时间为96h。

取发酵液1mL置于EP管中，4000rpm离心5min后，取发酵液上清液到新的EP管中待检测，向剩余的菌体中加入1mL的无菌水，移液枪吹打混匀后4000rpm离心5min，将上清液去掉保留菌泥，向EP管中加入200uL的无菌水和与菌泥等体积的玻璃珠，最大转速破碎30S，之后冰浴30S，共进行10min的破碎，最后4000rpm离心5min后收集酵母细胞破碎上清液待用。

将发酵液上清液和酵母细胞破碎上清液用LC-MS(液相质谱联用技术)检测，以ACV三肽(购买于广州艾基生物技术有限公司，货号IG080627)为标准品。

上述LC-MS的条件为：

高效液相色谱仪条件：

检测器：UV检测器

检测波长：254nm

色谱柱：ZORBAX Eclipse AAA Analytical 4.6×150mm,5-Micron

运行时间:25min.

梯度洗脱：A流动相：甲醇(20mM的甲酸)

B流动相：水(20mM的甲酸)

0-20min：0-100％的A流动相，

20-25min：100％的B流动相。

流速：0.8mL/min

进样量：10ul

柱温箱温度：20℃

质谱收集范围：m/z＝100-900。

ACV三肽标准品保留时间为10.6min出峰。

酵母细胞破碎上清液结果如图6所示，可以看出，在与标品的质谱峰(保留时间为10.6min)出峰一致有峰，表明有目标产物ACV三肽的合成。

上述结果表明，ACV三肽合成酶的基因pcbAB和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)基因npgA可以使酿酒酵母BY4741产生三肽ACV。

三、合成头孢菌素C重组菌的制备及应用

头孢菌素C异源合成途径包括6步反应(如图3所示)：

1)以L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸为前体，ACV三肽合成酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTase)负责将三个前体氨基酸L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸缩合成三肽ACV(δ-L-α-aminoadipyl-L-cysteinyl-D-valine)；

2)三肽ACV被异青霉素N合酶催化环化形成异青霉素N；

3)异青霉素N在异青霉素N差向异构酶的催化下异构化形成青霉素N；

4)脱乙酰氧头孢菌素C合成酶(扩环酶)和脱乙酰头孢菌素C合成酶(羟化酶)，分别依次将青霉素N转化成脱乙酰氧头孢菌素C和脱乙酰头孢菌素C；

5)最后脱乙酰头孢菌素C被脱乙酰头孢菌素C乙酰转移酶催化生成头孢菌素C。

1、重组质粒的构建

针对第2)-5)步剩余的头孢菌素C异源合成途径中剩余的基因，针对异青霉素N合酶IPNS选择来自顶头孢霉(Acremonium chrysogenum(Cephalosporium acremonium)(genbank号为P05189及提交日为1987年8月13日))的pcbC，将该基因针对酿酒酵母进行密码子优化后的序列为pcbCsc(序列3第756-1772位)，用启动子PGK1p和终止子ADH1t进行表达；

针对异青霉素N差向异构酶IPNE选择来自诺卡氏菌(Amycolatopsislactamdurans)的cefD(genbank号为Q03046及提交日为1993年7月1日)，将该基因针对酿酒酵母进行密码子优化后的序列为cefDsc(序列3第23711-3570位)，用启动子TEF1p和终止子CYC1t进行表达；

针对脱乙酰氧头孢菌素C合成酶(扩环酶)DAOCS(expandase)和脱乙酰头孢菌素C合成酶(羟化酶)DAOCS(hydroxylase)选择来自顶头孢霉(Acremonium chrysogenum(Cephalosporium acremonium)(genbank号为P11935及提交日为1989年10月1日))的cefEF，将该基因针对酿酒酵母进行密码子优化后的序列为cefEFsc(序列3第4691-5689位)，用启动子TDH3p和终止子TPI1t进行表达；

针对脱乙酰头孢菌素C乙酰转移酶DAC-AT选择来自顶头孢霉(Acremoniumchrysogenum(Cephalosporium acremonium)(genbank号为P39058及提交日为1995年2月1日)的cefG，将该基因针对酿酒酵母进行密码子优化后的序列为cefGsc(序列3第6929-8086位)，用启动子FBA1p和终止子TDH2t进行表达；

将上述基因片段通过重叠延伸和同源重组的方法进行连接最后构建成质粒pESC-G418-CPCCG，如图7所示。

重组质粒pESC-G418-CPCCG的制备方法如下：

1)构建质粒pESC-G418

质粒pESC-G418为将pESC-ura质粒中的ura基因替换为G418抗性基因(序列4第4415-5771位)得到的质粒，具体构建方法如下：

以质粒pESC-ura(购买于上海信裕生物科技有限公司,货号60908-2754)为模板,引物G418-UP-F和G418-UP-R扩增出200bp基因片段G418-UP,引物G418-DOWN-F和G418-DOWN-R扩增出200bp基因片段G418-DOWN。以含有G418抗性基因(基因合成于武汉金开瑞生物工程有限公司)的质粒pET-24a-G418为模板，引物G418-F和G418-R扩增出1357bp基因片段G418。

上述PCR方法为预变性96℃，5分钟；变性96℃，15秒；退火55℃，15秒；延伸72℃，时间根据片段长度设定；72℃，10分钟；变性到延伸设置30个循环。

获得上述基因片段后,将片段G418-UP、G418-DOWN和G418通过重叠延伸的方法进行连接,获得1757bp PCR产物UP-G418-DOWN。上述重叠延伸的PCR方法为变性96℃，15秒；退火50℃，15秒；延伸72℃，时间根据片段长度设定；72℃，10分钟；变性到延伸设置30个循环。以该PCR产物为模板，以引物G418-UP-F和G418-DOWN-R进行PCR，得到1757bp大量的基因片段UP-G418-DOWN(序列4第4215-5971)。

将上述基因片段UP-G418-DOWN(500ng)和质粒pESC-ura(500ng)按照摩尔比1：1的比例混合均匀后电转化进酿酒酵母BY4741中，将菌液均匀的涂布在G418(400ng/uL)抗性的YPD平板上，置于30℃下培养至长出单菌落，通过对长出的单菌落中的质粒进行提取，测序正确后获得质粒pESC-G418。

2)重组质粒pESC-G418-CPCCG的获得

以酿酒酵母BY4741基因组为模板，用引物PGK1P-F和PGK1P-R扩增出752bp基因片段PGK1P(序列3第1-752位)，用引物ADH1T-F和ADH1T-R扩增出160bp基因片段ADH1T(序列3第1779-1938位),用引物TEF1P-F和TEF1P-R扩增出432bp基因片段TEF1P(序列3第1939-2370位)，用引物CYC1T-F和CYC1T-R扩增出309bp基因片段CYC1T(序列3第3577-3885位)，用引物TDH3P-F和TDH3P-R扩增出802bp基因片段TDH3P(序列3第3886-4687位)，用引物TPI1T-F和TPI1T-R扩增出406bp基因片段TPI1T(序列3第5696-6101位)，用引物FBA1P-F和FBA1P-R扩增出824bp基因片段FBA1P(序列3第6102-6925位)，用引物TDH2T-F和TDH2T-R扩增出403bp基因片段TDH2T(序列3第8093-8495位)；

分别以携带武汉金开瑞生物工程有限公司合成的pcbCsc、cefDsc、cefEFsc、cefGsc基因的质粒pET24-pcbCsc、pET24-cefDsc、pET24-cefEFsc、pET24-cefGs为模板,分别用如下引物扩增：引物pcbCsc-F和pcbCsc-R扩增出1026bp基因片段pcbCsc,引物cefDsc-F和cefDsc-R扩增出1206bp基因片段cefDsc,引物cefEFsc-F和cefEFsc-R扩增出1008bp基因片段cefEFsc,引物cefGsc-F和cefGsc-R扩增出1167bp基因片段cefGsc；

以pESC-G418质粒为模板,引物G418-VECTOR-F和G418-VECTOR-R扩增出6286bp载体片段G418-VECTOR；

上述PCR方法为预变性96℃，5分钟；变性96℃，15秒；退火55℃，15秒；延伸72℃，时间根据片段长度设定；72℃，10分钟；变性到延伸设置30个循环。

通过跑胶和胶回收获得上述基因片段后,将片段PGK1P、pcbCsc和ADH1T通过重叠延伸的方法进行连接,获得片段PGK1P-pcbCsc-ADH1T；将片段TEF1P、cefDsc和CYC1T通过重叠延伸的方法进行连接,获得片段TEF1P-cefDsc-CYC1T,将片段TDH3P、cefEFsc和TPI1T通过重叠延伸的方法进行连接,获得片段TDH3P-cefEFsc-TPI 1T,将片段FBA1P、cefGsc和TDH2T通过重叠延伸的方法进行连接,获得片段FBA1P-cefGsc-TDH2T,上述各个重叠延伸采用的PCR方法为变性96℃，15秒；退火50℃，15秒；延伸72℃，时间根据片段长度设定；72℃，10分钟；变性到延伸设置30个循环。

再将片段PGK1P-pcbCsc-ADH1T和TEF1P通过重叠延伸的方法进行连接,获得片段PGK1P-pcbCsc-ADH1T-TEF1P；

将片段TEF1P-cefDsc-CYC1T和TDH3P通过重叠延伸的方法进行连接,获得片段TEF1P-cefDsc-CYC1T-TDH3P；

将片段TDH3P-cefEFsc-TPI1T和FBA1P通过重叠延伸的方法进行连接,获得片段TDH3P-cefEFsc-TPI1T-FBA1P；

将片段G418-VECTOR、PGK1P和TDH2T通过重叠延伸的方法进行连接,获得片段PGK1P-G418-VECTOR-TDH2T；

再将基因片段PGK1P-pcbCsc-ADH1T-TEF1P(序列3第1-2369位)、TEF1P-cefDsc-CYC1T-TDH3P(序列3第1939-4687位)、TDH3P-cefEFsc-TPI1T-FBA1P(序列3第3886-6925位)、FBA1P-cefGsc-TDH2T(序列3第6103-8495位)和PGK1P-G418-VECTOR-TDH2T(序列4)进行等质量混合，保证每个片段的质量在500ng以上，电转化进酿酒酵母BY4741中，将菌液均匀的涂布在G418(400ng/uL)抗性的YPD平板上，置于30℃下培养至长出单菌落，通过对长出的单菌落中的质粒进行提取，测序正确后获得质粒pESC-G418-CPCCG。

2、重组菌的构建

将重组质粒pESC-G418-CPCCG和pESC-Hyg-SmABA共电转化到酿酒酵母BY4741中，得到重组菌YM01。

重组菌YM01为使酿酒酵母BY4741表达如下基因：pcbC、cefD、cefEF、cefG、Symbiodinium microadriaticum pcbAB和npgA，且这些基因均以质粒的形式存在。

电转化过程为：将酿酒酵母BY4741菌在YPD平板上画线，置于30℃下培养至少24h待长出单菌落；将单菌落接种到40mL的YPD的锥形瓶中，30℃、170rpm条件下培养36h；将菌液按照菌液与新鲜YPD培养基的体积比为1：50的比例接种到装有50mL的YPD锥形瓶中，30℃、170rpm条件下培养至OD600为0.6；将菌液转移到50mL的离心管中，5000rpm、4℃条件下离心5min，弃上清液；用25mL冰冷的无菌水重悬，同上离心，弃上清液；再次用25mL冰冷的无菌水重悬，同上离心，弃上清液；用2mL冰冷的1M的山梨醇重悬，同上离心，弃上清液；用250uL冰冷的1M的山梨醇重悬，每管50uL进行分装；将质粒pESC-G418-CPCCG和pESC-Hyg-SmABA等摩尔比混合，质粒的量为500ng以上，取5uL的双质粒溶液与50uL的酿酒酵母BY4741感受态细胞混合，转入0.2cm冰预冷的电极杯中冰浴5min；在电压1.5KV,电容25uF，电阻为200Ω，电击时间5ms的条件下电转化；点击后立刻加入1mL的YPD液体培养基，30℃孵育1h；5000rpm离心5min，去除上清液，加入100uL的1M的山梨醇重悬细胞，全部涂布于含有G418和Hyg双抗性的YPD平板上，30℃培养24h以上待长出单菌落。

3、生产CPC

YYPD液体培养基配方：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、1％(质量百分含量)葡萄糖，1％(质量百分含量)半乳糖，余量为水。

DM培养基配方：YYPD液体培养基中额外添加3.6mM硫酸亚铁。

DM02培养基配方：在YYPD液体培养基中添加3.6mM硫酸亚铁、2g/L的L-缬氨酸(购买于北京普益华科技有限公司，产品目录号为V828207-100G)、2g/l的L-半胱氨酸(购买于天津市东丽区福迈康生物试剂批发部，产品目录号为BC-FZ336)、0.1g/l的L-氨基己二酸(购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，产品目录号为A100535-1g)，得到的培养基。

将上述2制备的重组菌YM01均匀的涂布在100ng/uL的潮霉素抗性和200ng/uL的G418抗性的YPD平板上，30℃恒温培养24h后，将长出的单菌落转接到含5mL的100ng/uL的潮霉素抗性和200ng/uL的G418抗性的液体YPD培养基中，30℃、220rpm条件下培养24h，之后按照体积比1：100的比例分别转接到50mL含100ng/uL的潮霉素抗性和200ng/uL的G418抗性的液体YYPD、DM和DM02培养基中，30℃、220rpm条件下进行发酵，时间为9天。

取两份4mL的发酵液4000rpm下离心5min后分别收集发酵上清液和菌体，将菌体用4mL的无菌水重悬后，4000rpm下离心5min后去上清液，将一份剩余的菌泥烘干后称量后即为细胞干重，另一份用200uL的无菌水重悬后置于1.5mL的EP管中，同时加入与菌泥等体积的玻璃珠(购买于北京普益华科技有限公司，产品目录号为G8080-10G)，将EP管置于迷你混合仪(购买于杭州米欧仪器有限公司，货号为MIX-25P)中，最大转速震荡破碎30S后，快速转移到冰上冰浴30S，共进行10min，最后4000rpm下离心5min后收集菌体上清液。

将发酵上清液和菌体上清液分别用LC-MS(高效液相与质谱联用技术)检测，检测方法同ACV三肽的检测方法。以CPC为标准品，标准品的保留时间为7.2min。

发酵上清液LC-MS的检测结果，重组菌YM01在YYPD、DM和DM02培养基中发酵后，发酵上清液中未能检测到CPC。

重组菌YM01在YYPD、DM和DM02培养基中发酵后菌体上清液LC-MS结果如图8A所示，均检测到了CPC。

制备CPC标准曲线(图8B)。

CPC产量P＝Y×0.2×10^-3÷M

计算的出的产量为P(ug/g DCW),用标准曲线计算的产量为Y(g/L),4mL酿酒酵母发酵液中菌体的干重为M(g)。

结果，重组菌YM01发酵后菌体上清液在DM培养基中发酵9天时CPC产量为1.4ug/gDCW；重组菌YM01发酵后菌体上清液在DM02培养基中发酵9天时CPC产量为1.5ug/g DCW；重组菌YM01发酵后菌体上清液在YYPD培养基中发酵9天时CPC产量最高为2ug/g DCW(ug是CPC的量；g表示细胞干重)。

因此，重组菌YM01在YYPD、DM和DM02培养基中发酵培养均可以产生CPC。

实施例2、重组菌YM01生产CPC的碳源优化

通过改变YYPD培养基中的碳源的量及种类来检测碳源对CPC合成产量的影响，设计了不同液体发酵培养基进行发酵。

DM04:同发酵培养基YYPD。

DM05：将YYPD培养基中的葡萄糖和半乳糖的质量分数替换为1.5％葡萄糖和1％半乳糖，其余组分不变，得到的培养基。

DM06：将YYPD培养基中的葡萄糖和半乳糖的质量分数替换为2％葡萄糖和1％半乳糖，其余组分不变，得到的培养基。

DM07：将YYPD培养基中的葡萄糖和半乳糖的质量分数替换为3％葡萄糖和1％半乳糖，其余组分不变，得到的培养基。

DM08：将YYPD培养基中的葡萄糖和半乳糖的质量分数替换为1％葡萄糖和2％半乳糖，其余组分不变，得到的培养基。

DM09：将YYPD培养基中的葡萄糖和半乳糖的质量分数替换为1％葡萄糖和3％半乳糖，其余组分不变，得到的培养基。

DM10：将YYPD培养基中的葡萄糖和半乳糖的质量分数替换为2％甘油和1％半乳糖，其余组分不变，得到的培养基。

DM11：将YYPD培养基中的葡萄糖和半乳糖的质量分数替换为3％甘油和1％半乳糖，其余组分不变，得到的培养基。

DM12：将YYPD培养基中的葡萄糖和半乳糖的质量分数替换为1％甘油和2％半乳糖，其余组分不变，得到的培养基。

DM13：将YYPD培养基中的葡萄糖和半乳糖的质量分数替换为1％甘油，3％半乳糖，其余组分不变，得到的培养基。

DM14：将YYPD培养基中的葡萄糖和半乳糖的质量分数替换为4％甘油，1％半乳糖，其余组分不变，得到的培养基。

DM15：将YYPD培养基中的葡萄糖和半乳糖的质量分数替换为5％甘油，1％半乳糖，其余组分不变，得到的培养基。

DM16：将YYPD培养基中的葡萄糖和半乳糖的质量分数替换为6％甘油，1％半乳糖，其余组分不变，得到的培养基。

将实施例1制备的重组菌YM01接种到按照体积比1：100的比例分别转接到50mL含100ng/uL的潮霉素抗性和200ng/uL的G418抗性的上述各个液体发酵培养基中，30℃、220rpm条件下进行发酵，时间为9天。

每个发酵培养基设置三个平行，9天发酵完成后对发酵样品参数进行检测。

1、测定发酵液中酿酒酵母的干重

取4mL的发酵液，4000rpm下离心5min后收集菌体，将菌体用4mL的无菌水重悬后，4000rpm下离心5min后去上清液，将剩余的菌泥烘干后，检测酿酒酵母的干重(4mL菌液的干燥菌泥).

结果如图9所示，横坐标数字代表相应的发酵培养基，4-16分别代表DM04至DM16；可以看出，与DM04培养基相比较，利用发酵培养基DM05、DM06、DM07、DM12和DM15发酵重组菌YM01能够明显增加菌株的生物量；发酵培养基DM10、DM11、DM13发酵重组菌YM01的生物量则明显降低。剩余发酵培养基的生物量变化不明显。

2、CPC产量检测

取4mL的发酵液4000rpm下离心5min后分别收集上清液和菌体，将菌体用4mL的无菌水重悬后，4000rpm下离心5min后去上清液，将剩余的菌泥用200uL的无菌水重悬后置于1.5mL的EP管中，同时加入与菌泥等体积的玻璃珠(购买于北京普益华科技有限公司，产品目录号为G8080-10G)，将EP管置于迷你混合仪(购买于杭州米欧仪器有限公司，货号为MIX-25P)中，最大转速震荡破碎30S后，快速转移到冰上冰浴30S，共进行10min，最后4000rpm下离心5min后收集上清液。

将上清液用LC-MS(条件同上)检测，以CPC为标准品(标曲为图8B)，产量计算方式同前。

检测结果如图10所示，横坐标数字代表相应的发酵培养基，4-16分别代表DM04至DM16；纵坐标是以细胞破碎液上清液中CPC的量除以发酵液的体积(4mL)所得的浓度，可以看出，提高葡萄糖的量能够显著增加CPC的产量，以甘油为碳源不能够合成CPC，半乳糖的增加会抑制CPC的合成；DM07发酵培养基发酵CPC的产量最高22.8mg/L。

CPC标准品液相检测图、YYPD和DM07发酵培养基中重组菌YM01发酵9天时细胞破碎液上清液的液相检测图如图11(CPC为CPC标准品的液相检测图，YYPD和DM07分别代表在YYPD和DM07发酵培养基中重组菌YM01发酵9天时细胞破碎液上清液的液相检测图)所示，可以看出，在保留时间2.9min均检测到CPC。

结合图9、图10和图11，并换算产量单位，可以得出结论，重组菌YM01在发酵培养基DM07中发酵9天时CPC的产量达到12.179mg/g DCW的CPC，与重组菌YM01在发酵培养基YYPD中发酵9天时CPC的产量2ug/g DCW相比提高了6089.5倍。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120>一种头孢菌素C生产菌及其制备方法与应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1809

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accataccac agcttttcaa agtgcaccat accacagctt ttcaattcaa ttcatcattt 240

tttttttatt cttttttttg atttcggttt ctttgaaatt tttttgattc ggtaatctcc 300

gaacagaagg aagaacgaag gaaggagcac agacttagat tggtatatat acgcatatgt 360

agtgttgaag aaacatgaaa ttgcccagta ttcttaaccc aactgcacag aacaaaaacc 420

tgcaggaaac gaagataaat cctcgagatg aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc 480

gagaagtttc tgatcgaaaa gttcgacagc gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc 540

gaagaatctc gtgctttcag cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat 600

agctgcgccg atggtttcta caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg 660

ctcccgattc cggaagtgct tgacattggg gaattcagcg agagcctgac ctattgcatc 720

tcccgccgtg cacagggtgt cacgttgcaa gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt 780

ctgcagccgg tcgcggaggc catggatgcg atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc 840

gggttcggcc cattcggacc gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata 900

tgcgcgattg ctgatcccca tgtgtatcac tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt 960

gcgtccgtcg cgcaggctct cgatgagctg atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc 1020

cggcacctcg tgcacgcgga tttcggctcc aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata 1080

acagcggtca ttgactggag cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac 1140

atcttcttct ggaggccgtg gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg 1200

aggcatccgg agcttgcagg atcgccgcgg ctccgggcgt atatgctccg cattggtctt 1260

gaccaactct atcagagctt ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg ggcgcagggt 1320

cgatgcgacg caatcgtccg atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc 1380

agaagcgcgg ccgtctggac cgatggctgt gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga 1440

cgccccagca ctcgtccgag ggcaaaggaa tagggatcca aaactgtatt ataagtaaat 1500

gcatgtatac taaactcaca aattagagct tcaatttaat tatatcagtt attaccctat 1560

gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcagga aaactgtatt 1620

ataagtaaat gcatgtatac taaactcaca aattagagct tcaatttaat tatatcagtt 1680

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<210> 4

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acatctcata tacacgttta taaaacttaa atagattgaa aatgtattaa agattcctca 120

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gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 1440

accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 1500

tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag 1560

tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc 1620

acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 1680

atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag 1740

aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac 1800

tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg 1860

agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc 1920

gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact 1980

ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg 2040

atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa 2100

tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt 2160

tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 2220

tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga 2280

acgaagcatc tgtgcttcat tttgtagaac aaaaatgcaa cgcgagagcg ctaatttttc 2340

aaacaaagaa tctgagctgc atttttacag aacagaaatg caacgcgaaa gcgctatttt 2400

accaacgaag aatctgtgct tcatttttgt aaaacaaaaa tgcaacgcga gagcgctaat 2460

ttttcaaaca aagaatctga gctgcatttt tacagaacag aaatgcaacg cgagagcgct 2520

attttaccaa caaagaatct atacttcttt tttgttctac aaaaatgcat cccgagagcg 2580

ctatttttct aacaaagcat cttagattac tttttttctc ctttgtgcgc tctataatgc 2640

agtctcttga taactttttg cactgtaggt ccgttaaggt tagaagaagg ctactttggt 2700

gtctattttc tcttccataa aaaaagcctg actccacttc ccgcgtttac tgattactag 2760

cgaagctgcg ggtgcatttt ttcaagataa aggcatcccc gattatattc tataccgatg 2820

tggattgcgc atactttgtg aacagaaagt gatagcgttg atgattcttc attggtcaga 2880

aaattatgaa cggtttcttc tattttgtct ctatatacta cgtataggaa atgtttacat 2940

tttcgtattg ttttcgattc actctatgaa tagttcttac tacaattttt ttgtctaaag 3000

agtaatacta gagataaaca taaaaaatgt agaggtcgag tttagatgca agttcaagga 3060

gcgaaaggtg gatgggtagg ttatataggg atatagcaca gagatatata gcaaagagat 3120

acttttgagc aatgtttgtg gaagcggtat tcgcaatatt ttagtagctc gttacagtcc 3180

ggtgcgtttt tggttttttg aaagtgcgtc ttcagagcgc ttttggtttt caaaagcgct 3240

ctgaagttcc tatactttct agagaatagg aacttcggaa taggaacttc aaagcgtttc 3300

cgaaaacgag cgcttccgaa aatgcaacgc gagctgcgca catacagctc actgttcacg 3360

tcgcacctat atctgcgtgt tgcctgtata tatatataca tgagaagaac ggcatagtgc 3420

gtgtttatgc ttaaatgcgt acttatatgc gtctatttat gtaggatgaa aggtagtcta 3480

gtacctcctg tgatattatc ccattccatg cggggtatcg tatgcttcct tcagcactac 3540

cctttagctg ttctatatgc tgccactcct caattggatt agtctcatcc ttcaatgcta 3600

tcatttcctt tgatattgga tcatactaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 3660

aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 3720

tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca 3780

gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 3840

cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatcga ctacgtcgta aggccgtttc 3900

tgacagagta aaattcttga gggaactttc accattatgg gaaatgcttc aagaaggtat 3960

tgacttaaac tccatcaaat ggtcaggtca ttgagtgttt tttatttgtt gtattttttt 4020

ttttttagag aaaatcctcc aatatcaaat taggaatcgt agtttcatga ttttctgtta 4080

cacctaactt tttgtgtggt gccctcctcc ttgtcaatat taatgttaaa gtgcaattct 4140

ttttccttat cacgttgagc cattagtatc aatttgctta cctgtattcc tttactatcc 4200

tcctttttct ccttcttgat aaatgtatgt agattgcgta tatagtttcg tctaccctat 4260

gaacatattc cattttgtaa tttcgtgtcg tttctattat gaatttcatt tataaagttt 4320

atgtacaaat atcataaaaa aagagaatct ttttaagcaa ggattttctt aacttcttcg 4380

gcgacagcat caccgacttc ggtggtactg ttgggacatg gaggcccaga ataccctcct 4440

tgacagtctt gacgtgcgca gctcaggggc atgatgtgac tgtcgcccgt acatttagcc 4500

catacatccc catgtataat catttgcatc catacatttt gatggccgca cggcgcgaag 4560

caaaaattac ggctcctcgc tgcagacctg cgagcaggga aacgctcccc tcacagacgc 4620

gttgaattgt ccccacgccg cgcccctgta gagaaatata aaaggttagg atttgccact 4680

gaggttcttc tttcatatac ttccttttaa aatcttgcta ggatacagtt ctcacatcac 4740

atccgaacat aaacaaccat gggtaaggaa aagactcacg tttcgaggcc gcgattaaat 4800

tccaacatgg atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca 4860

ggtgcgacaa tctatcgatt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat 4920

ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg 4980

gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta 5040

ctcaccactg cgatccccgg caaaacagca ttccaggtat tagaagaata tcctgattca 5100

ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt 5160

tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg 5220

aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa 5280

caagtctgga aagaaatgca taagcttttg ccattctcac cggattcagt cgtcactcat 5340

ggtgatttct cacttgataa ccttattttt gacgagggga aattaatagg ttgtattgat 5400

gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc 5460

ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct 5520

gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaatc agtactgaca 5580

ataaaaagat tcttgttttc aagaacttgt catttgtata gtttttttat attgtagttg 5640

ttctatttta atcaaatgtt agcgtgattt atattttttt tcgcctcgac atcatctgcc 5700

cagatgcgaa gttaagtgcg cagaaagtaa tatcatgcgt caatcgtatg tgaatgctgg 5760

tcgctatact gaactgcggt caagatattt cttgaatcag gcgccttaga ccgctcggcc 5820

aaacaaccaa ttacttgttg agaaatagag tataattatc ctataaatat aacgtttttg 5880

aacacacatg aacaaggaag tacaggacaa ttgattttga agagaatgtg gattttgatg 5940

taattgttgg gattccattt ttaataaggc aataatatta ggtatgtgga tatactagaa 6000

gttctcctcg accgtcgata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata 6060

ccgcatcagg aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa 6120

atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa 6180

tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac 6240

gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa 6300

ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct 6360

aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa 6420

gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc 6480

gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccat tcgccattca 6540

ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgatccagct gcattaatga atcggccaac 6600

gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 6660

tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcga cgcacagata ttataacatc tgcacaatag 6720

gcatttgcaa gaattactcg tgagtaagga aagagtgagg aactatcgca tacctgcatt 6780

taaagatgcc gatttgggcg cgaatccttt attttggctt caccctcata ctattatcag 6840

ggccagaaaa aggaagtgtt tccctccttc ttgaattgat gttaccctca taaagcacgt 6900

ggcctcttat cgagaaagaa attaccgtcg ctcgtgattt gtttgcaaaa agaacaaaac 6960

tgaaaaaacc cagacacgct cgacttcctg tcttcctatt gattgcagct tccaatttcg 7020

tcacacaaca aggtcctagc gacggctcac aggttttgta acaagcaatc gaaggttctg 7080

gaatggcggg aaagggttta gtaccacatg ctatgatgcc cactgtgatc tccagagcaa 7140

agttcgttcg atcgtactgt tactctctct ctttcaaaca gaattgtccg aatcgtgtga 7200

caacaacagc ctgttctcac acactctttt cttctaacca agggggtggt ttagtttagt 7260

agaacctcgt gaaacttaca tttacatata tataaacttg cataaattgg tcaatgcaag 7320

aaatacatat ttggtctttt ctaattcgta gtttttcaag ttcttagatg ctttcttttt 7380

ctctttttta cagatcatca aggaagtaat tatctacttt ttacaacaaa tataaaacac 7440

a 7441

Claims (10)

1.一种制备头孢菌素C的方法，包括如下步骤：在酵母菌中引入头孢菌素C合成途径，得到重组菌，发酵所述重组菌，得到头孢菌素C；

所述引入头孢菌素C合成途径包括如下步骤：

1）引入ACV三肽合成酶，和，磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，使所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶能激活所述ACV三肽合成酶催化所述酵母菌中的L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸合成ACV三肽；

2）引入异青霉素N合酶IPNS，使该酶能催化所述ACV三肽合成异青霉素N；

3）引入异青霉素N差向异构酶IPNE，使该酶能催化所述异青霉素N合成青霉素N；

4）引入脱乙酰氧头孢菌素C合成酶DAOCS、脱乙酰头孢菌素C合成酶DACS和脱乙酰头孢菌素C乙酰转移酶DAC-AT，使这些酶能催化所述青霉素N合成头孢菌素C；

所述发酵采用培养基中含有质量分数3%葡萄糖和质量分数1%半乳糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述头孢菌素C合成途径为异源头孢菌素C合成途径；

所述ACV三肽合成酶来源于Symbiodinium microadriaticum或Streptomycesclavuligerus；

或，所述异青霉素N差向异构酶IPNE来源于Streptomyces clavuligerus或Amycolatopsislactamdurans或Pseudomonas protegens或Janthinobacterium sp. HH01或Streptomyces reticuli。

3.根据根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶来源于Aspergillus nidulans；

或，所述异青霉素N合酶IPNS来源于Acremonium chrysogenum或Amycolatopsislactamdurans或Flavobacterium sp.或Streptomyces jumonjinensis或Penicillium chrysogenum或Streptomyces cattleya或Streptomyces clavuligerus或Lysobacter lactamgenus或Streptomyces griseus或Streptomyces microflavus或Emericella nidulans；

或，所述脱乙酰氧头孢菌素C合成酶扩环酶DAOCS和脱乙酰头孢菌素C合成酶羟化酶DACS均来源于Acremonium chrysogenum或Pochonia chlamydosporia 170。

或，所述脱乙酰头孢菌素C乙酰转移酶DAC-AT来源于Acremonium chrysogenum或Talaromyces stipitatus或Rasamsonia emersonii或Byssochlamys spectabilis或Acremonium chrysogenum。

4.根据根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述酵母菌含有L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸的合成途径；

或，所述酵母菌为酿酒酵母、啤酒酵母、葡萄汁酵母、汉逊酵母、球拟酵母、假丝酵母、毕赤酵母、红酵母或棉病针酵母。

5.根据根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述在酵母菌中引入头孢菌素C合成途径的方法包括如下步骤：使所述酵母菌表达7种酶的外源基因，得到的引入该途径的重组菌；

所述7种酶为所述ACV三肽合成酶、所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶、所述异青霉素N合酶IPNS、所述异青霉素N差向异构酶IPNE、所述脱乙酰氧头孢菌素C合成酶DAOCS、所述脱乙酰头孢菌素C合成酶DACS和所述脱乙酰头孢菌素C乙酰转移酶DAC-AT。

6.根据根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述使酵母菌表达7种酶的外源基因为将所述7种酶的外源基因均以质粒形式存在所述酵母菌中进行表达。

7.重组菌，按照如下方法制备：使酵母菌表达7种酶的外源基因得到的重组菌；

所述7种酶为ACV三肽合成酶、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶、异青霉素N合酶IPNS、异青霉素N差向异构酶IPNE、脱乙酰氧头孢菌素C合成酶DAOCS、脱乙酰头孢菌素C合成酶DACS和脱乙酰头孢菌素C乙酰转移酶DAC-AT；

所述酵母菌含有L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸的合成途径。

8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于：

所述ACV三肽合成酶来源于Symbiodinium microadriaticum或Streptomycesclavuligerus；

或，所述异青霉素N差向异构酶IPNE来源于Streptomyces clavuligerus或Amycolatopsislactamdurans或Pseudomonas protegens或Janthinobacterium sp. HH01或Streptomyces reticuli；

或，所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶来源于Aspergillus nidulans；

或，所述异青霉素N合酶IPNS来源于Acremonium chrysogenum或Amycolatopsislactamdurans或Flavobacterium sp.或Streptomyces jumonjinensis或Penicillium chrysogenum或Streptomyces cattleya或Streptomyces clavuligerus或Lysobacterlactamgenus或Streptomyces griseus或Streptomyces microflavus或Emericellanidulans；

或，所述脱乙酰氧头孢菌素C合成酶扩环酶DAOCS和脱乙酰头孢菌素C合成酶羟化酶DACS均来源于Acremonium chrysogenum或Pochonia chlamydosporia 170；

或，所述脱乙酰头孢菌素C乙酰转移酶DAC-AT来源于Acremonium chrysogenum或Talaromyces stipitatus或Rasamsonia emersonii或Byssochlamys spectabilis或Acremonium chrysogenum；

或，所述酵母菌为酿酒酵母、啤酒酵母、葡萄汁酵母、汉逊酵母、球拟酵母、假丝酵母、毕赤酵母、红酵母或棉病针酵母。

9.重组菌，按照如下方法制备：使酵母菌表达ACV三肽合成酶或其突变体和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶；所述酵母菌含有L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸的合成途径；所述ACV三肽合成酶来自Symbiodinium microadriaticum。

10.一种生产头孢菌素C的方法，包括如下步骤：以葡萄糖为原料发酵权利要求7或8所述的重组菌，得到头孢菌素C；

所述发酵采用培养基中含有质量分数3%葡萄糖和质量分数1%半乳糖。

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