CN108588100B

CN108588100B - 一种抑制素b双基因片段联合表达载体及其应用

Info

Publication number: CN108588100B
Application number: CN201810440671.8A
Authority: CN
Inventors: 吴英松; 李明; 陈殷; 万勇; 陈少琅
Original assignee: Guangzhou Darui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Darui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-05-09
Filing date: 2018-05-09
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2038-05-09
Also published as: CN108588100A

Abstract

本发明公开了一种重组基因，其含有表达抑制素B的alpha亚基的TGF‑β基因序列和beta B亚基的TGF‑β基因序列；以及表达上述重组基因的载体；又及含有上述载体的细菌；还公开了上述载体的构建方法。本发明通过同源重组方法，将α亚基和βB亚基的TGF‑β片段同时连接到PET21a表达载体上，两个亚基中间没有出现任何酶切位点，表达的重组蛋白可同时与α亚基和βB亚基的抗体产生免疫学反应。

Description

一种抑制素B双基因片段联合表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种同时表达抑制素B的alpha亚基和betaB亚基的TGF-β基因片段的载体及其构建方法和应用。

背景技术

抑制素B对生殖具有经典内分泌、自分泌和旁分泌作用，在人类配子发生中具有重要调节作用。在男性，抑制素B是抑制素主要的生理活性形式，主要由睾丸Sertoli细胞直接分泌，是比FSH更有价值的反映睾丸生精功能的指标。在女性，抑制素B主要于卵泡早期在FSH刺激下，由颗粒细胞分泌，由于不受GnRH、雌激素、雄激素等诸多因素影响，直接反映卵泡的发育情况，因而在评价卵巢储备功能及反应性时具有很高的临床诊断价值。

抑制素B属于转化生长因子β(TRANSFORMING GROWTH FACTOR-β,TGF-β)超家族，由α亚基和βB亚基借二硫键组成二聚体蛋白。成熟的抑制素B是α亚基和βB亚基去除了肽链N端，由羧基端的TGF-β部分通过二硫键形成异二聚体。但是，INH天然纯品非常难以获得。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种重组载体，其能表达一种重组蛋白，该重组蛋白可同时与抑制素B的α亚基和βB亚基的抗体产生免疫学反应。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

作为本发明的第一个方面，本发明提供一种重组基因，所述重组基因含有表达抑制素B的alpha亚基的TGF-β基因序列和beta B亚基的TGF-β基因序列。其中，抑制素B优选来源于人。

优选地，所述alpha(即α)亚基的TGF-β基因序列和beta(即β)B亚基的TGF-β基因序列中间没有酶切位点。由此，alpha亚基的TGF-β基因序列和beta B亚基的TGF-β基因序列连接在一起，不会被内切酶剪切开，两个TGF-β基因序列表达的氨基酸序列是连接在一起的，可以同时与抑制素B的α亚基和βB亚基的抗体产生免疫学反应。

优选地，所述alpha亚基的TGF-β基因序列和beta B亚基的TGF-β基因序列中间没有冗余的核苷酸序列。

优选地，所述重组基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，或者所述重组基因表达的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

作为本发明的第二个方面，本发明提供一种抑制素B双基因片段联合表达载体，所述载体能表达上述的重组基因。

作为本发明的第三个方面，本发明提供一种细菌，所述细菌含有上述的载体。其中，细菌优选但不限于大肠杆菌，只要该载体能在该种细菌中稳定地复制，并表达alpha亚基的TGF-β基因序列和beta B亚基的TGF-β基因序列即可。

作为本发明的第四个方面，本发明提供上述的载体的构建方法，包括如下步骤：

1)根据原核表达密码子偏好性原则，对抑制素B的alpha亚基和beta B亚基的ORF进行密码子优化，然后化学合成；

2)通过PCR扩增出步骤1)合成的alpha亚基和beta B亚基的TGF-βDNA片段，电泳后回收；

3)将步骤2)回收的DNA片段与经BAMHI、XHOI双酶切处理的载体连接，得到所述载体。其中，在一个实施例中的载体为alpha-beta B TGF-β-pet21a(+)，其序列如SEQ IDNO.7所示；TGF-βDNA片段优化后的碱基序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

优选地，PCR扩增alpha亚基的TGF-β片段，在其5’端引入21bp载体碱基，3’端引入16bp beta B亚基的TGF-β片段的碱基，PCR扩增的引物的碱基序列为：Promotor alphaAB-F:5’---cagcaaatgggtcgcggatccTGCCACCGTGTGGCGCTG---3’(SEQ ID NO.8)；

其中，cagcaaatgggtcgcggatcc是pet21a(+)载体碱基；Promotor表示启动子；Promotor alphaB-R：5’-ATTGCTGACGGCAGCAAATGCACGCGCAGTGCTG-3’(SEQ ID NO.9)；

其中，ATTGCTGACGGCAGCA是beta B亚基的TGF-β片段的碱基，扩增程序如下：98℃变性30s，68℃延伸30s，26个循环；

PCR扩增beta B亚基的TGF-β片段，在其5’端引入4bp alpha亚基的TGF-β片段，3’端引入21bp载体碱基，引物的碱基序列为：

Promotor betaB-F：5’---CATTTGCTGCCGTCAGCAATTCTT---3’(SEQ ID NO.10)，其中，CATT是alpha亚基的TGF-β片段，

Promotor betaB-R：5’---gtggtggtggtggtgctcgagGCAACCGCATTCCTCCACA---3’

(SEQ ID NO.11)。

其中，gtggtggtggtggtgctcgag是pet21a(+)载体碱基，扩增程序如下：98℃变性30s，68℃延伸30s，26个循环。

优选地，所述载体为pET21a(+)载体。

作为本发明的第五个方面，本发明提供一种重组蛋白的制备方法，，包括如下步骤：

1)取上述的细菌，在相应的培养基中培养，诱导表达，得菌液，离心，得菌体；

2)取步骤1)所得菌体，超声裂解，离心，得沉淀，沉淀变性溶解，分离纯化，得到所述重组蛋白。其中细菌优选大肠杆菌，培养优选在含有100ug/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中振摇培养，培养温度为37℃；诱导表达使用的诱导剂为IPTG，诱导剂的浓度为0.1-1mM诱导温度为16-37℃，诱导时间为3-6小时；沉淀变性溶解采用4-8M尿素；分离纯化采用Ni亲和层析法。

作为本发明的第六个方面，本发明提供上述的重组基因、载体或细菌在制备用于评价男性睾丸生精功能的试剂盒或用于评价女性卵巢储备功能及反应性的试剂盒中的应用。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明通过同源重组方法，将人抑制素B的α亚基和βB亚基的TGF-β片段同时连接到PET21a表达载体上，两个亚基中间没有出现任何酶切位点，表达的重组蛋白可同时与α亚基和βB亚基的抗体产生免疫学反应。

附图说明

图1为重组alpha-beta B TGF-β-PET 21a(+)载体双酶切后琼脂糖凝胶电泳检测图，其中，Marker为Takara公司的DL5000,条带1：重组载体；2：BamH I/XhoI双酶切重组载体得到的载体和本发明重组蛋白(627bp)；

图2为本发明重组蛋白的诱导表达结果，其中Marker为Takara公司的ProteinPremix Marker(low),条带1：诱导前总蛋白；条带2：诱导后总蛋白；

图3为本发明重组蛋白的可溶性鉴定结果，其中，Marker为Takara公司的ProteinPremix Marker(low),条带1：诱导后超声破碎上清；条带2：诱导后超声破碎沉淀；

图4为本发明重组蛋白包涵体溶解结果，其中，Marker为Takara公司的ProteinPremix Marker(low),条带1:8M尿素溶解上清；

图5为本发明重组蛋白SDS-PAGE电泳图，其中，Marker为Takara公司的ProteinPremix Marker(low),条带1：第一次洗脱；条带2：第二次洗脱条带；3：第三次洗脱；条带4：上样前；条带5：流穿液；

图6为本发明重组蛋白的western-blot检测结果，其中，Marker为Takara公司的Protein Premix Marker(low),条带1：一抗为激活素B；条带2:一抗为抑制素alpha亚基抗体；

图7为不同IPTG浓度的筛选结果，其中，Marker为Takara公司的Protein PremixMarker(low),1、2、3条带分别代表marker、诱导前、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L 0.5mmol/L、0.6mmol/L 0.7mmol/L、0.8mmol/L IPTG浓度；

图8为不同诱导温度的筛选结果，其中，Marker为Takara公司的Protein PremixMarker(low),1、2、3条带分别代表Marker，25℃，37℃；

图9为不同诱导时间的筛选结果，其中，Marker为Takara公司的Protein PremixMarker(low),1、2、3条带分别代表2小时，3小时，4小时。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实验材料

本申请中的pET21a(+)载体质粒、大肠杆菌BL21(DE3)、胶回收试剂盒、同源重组试剂盒、限制性内切酶BAMHI、XHOI、LB液体培养基、IPTG、聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂盒均为市售产品。

实施例1重组alpha-beta B TGF-β-PET 21a(+)BL21(DE3)工程菌的构建

1、目标基因片段的制备

抑制素alpha亚基和抑制素beta B亚基TGF-β片段基因同源重组载体的构建方法：

根据gene bank查找的结果,目标基因片段如SEQ ID NO.5和6所示，其优化后的碱基序列如下所示：

Alpha亚基TGF-β(315bp)：

TGCCACCGTGTGGCGCTGAACATCAGCTTTCAAGAGCTGGGTTGGGAACGTTGGATCGTTTACCCGCCGAGCTTCATTTTTCACTATTGCCACGGTGGCTGCGGTCTGCACATTCCGCCGAACCTGAGCCTGCCGGTTCCGGGTGCGCCGCCGACCCCGGCGCAGCCGTATAGCCTGCTGCCGGGTGCGCAACCGTGCTGCGCGGCGCTGCCGGGTACCATGCGTCCGCTGCACGTGCGTACCACCAGCGACGGTGGCTACAGCTTTAAGTATGAAACCGTTCCGAACCTGCTGACCCAGCACTGCGCGTGCATT(SEQ ID NO.2)

Beta B亚基TGF-β(312bp)：

TGCTGCCGTCAGCAATTCTTTATCGACTTTCGTCTGATTGGCTGGAACGATTGGATCATTGCGCCGACCGGTTACTATGGCAACTACTGCGAAGGTAGCTGCCCGGCGTATCTGGCGGGTGTGCCGGGCAGCGCGAGCAGCTTCCACACCGCGGTTGTGAACCAATACCGTATGCGTGGTCTGAACCCGGGCACCGTTAACAGCTGCTGCATCCCGACCAAGCTGAGCACCATGAGCATGCTGTACTTTGACGATGAATATAACATCGTGAAACGTGATGTTCCGAACATGATTGTGGAGGAATGCGGTTGC(SEQ ID NO.3)

然后由基因合成公司人工合成上述序列。

2、构建重组表达载体

根据alpha亚基的TGF-β片段，在其5’端引入21bp载体碱基，3’端引入16bp beta B亚基的TGF-β片段的碱基，PCR扩增的引物为：

Promotor alphaAB-F:5’---cagcaaatgggtcgcggatccTGCCACCGTGTGGCGCTG---3’(SEQ ID NO.8)；

其中，cagcaaatgggtcgcggatcc是pet21a(+)载体碱基；

Promotor alphaB-R：5’-ATTGCTGACGGCAGCAAATGCACGCGCAGTGCTG-3’(SEQ IDNO.9)；

其中，ATTGCTGACGGCAGCA是beta B亚基的TGF-β片段的碱基；扩增程序如下：98℃变性30s，68℃延伸30s，26个循环；

根据beta B亚基的TGF-β片段，在其5’端引入4bp alpha亚基的TGF-β片段，3’端引入21bp载体碱基，引物为：

Promotor betaB-F：5’---CATTTGCTGCCGTCAGCAATTCTT---3’(SEQ ID NO.10)

其中，CATT是alpha亚基的TGF-β片段，

Promotor betaB-R：5’---gtggtggtggtggtgctcgagGCAACCGCATTCCTCCACA---3’(SEQ ID NO.11)。

PCR后进行电泳切胶回收。

用BAMHI、XHOI酶切pet21a(+)载体，胶回收纯化。

将Alpha亚基TGF-β和Beta亚基的TGF-βPCR回收产物同时用诺维赞公司clonexpress试剂连接到预先酶切好的pet21a(+)载体。

检测：取构建得到的重组alpha-beta B TGF-β-PET 21a(+)载体，限制性内切酶BAMHI、XHOI双酶切后琼脂糖凝胶电泳检测。

检测电泳结果如图1所示，条带1为重组pET21a(+)载体，条带2为酶切的pET21a(+)载体和alpha-beta B TGF-β片段(627bp，如SEQ ID NO.1所示)，说明构建的重组alpha-beta B TGF-β-PET 21a(+)载体含有大小为627bp的基因片段。

3、工程菌的制备

将重组质粒alpha-beta B TGF-β-PET 21a(+)转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃过夜培养。因PET21a(+)载体携带氨苄青霉素抗性选择，故在LB培养基平板(含氨苄青霉素)能生长的细菌即为携带重组pET21a(+)载体的工程菌。挑取单菌落，即为含有步骤2所述质粒的工程菌。

实施例2本发明重组抑制素alpha-beta B TGF-β蛋白的制备

1、大肠杆菌阳性转化子的诱导培养

挑取转化有质粒的单菌落，接入20mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min,摇床过夜培养；

次日，取培养过夜的菌液2ml,接种于10ml(1:50)含氨苄青霉素选择性LB液体培养基中，37℃，220rpm/min振摇培养至光密度OD600＝0.4-0.6时，加入浓度为1mol/L的IPTG溶液40ul于菌液中，使IPTG终浓度为0.4mM/L，37℃，180rpm/min振摇培养4小时。

2、鉴定：

(1)取1ml诱导前后菌液，离心分离，菌体沉淀用1ml PBS(pH＝8.0)重悬，加入1/5体积的5×SDS上样缓冲液，煮沸加热10min，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用SDS-PAGE蛋白凝胶染色脱色试剂染色脱色后观察结果。结果如图2所示，条带1为诱导前总蛋白；条带2IPTG诱导后总蛋白表达谱，诱导前在26KD处几乎无条带，诱导后在26KD条带极明显，说明诱导前目标蛋白几乎无表达，诱导后目标蛋白有表达。

(2)可溶性鉴定：取诱导后菌液，离心分离，菌体沉淀重悬于PBS中，然后在-80℃低温冰箱中放置30min，冰中解冻，反复3次。在冰浴上用超声破碎仪破菌，超声5sec,间隔5秒，共45min，4℃，12000rpm，离心10min，取上清(为溶液A)，沉淀用PBS溶解(为溶液B)。进行SDS-PAGE电泳，SDS-PAGE蛋白凝胶染色脱色试剂，比较分析重组蛋白质的溶解性。如果诱导表达的蛋白质位于A溶液中，则为可溶性蛋白；如果是在B溶液中，则为非可溶蛋白。

实验结果如图3所示，条带1诱导后溶液A；条带2诱导后溶液B，说明该蛋白在B溶液中存在，为包涵体。将超声离心后的沉淀按1g菌重加入10ml PBS重悬，吹散至颗粒状，倒入烧杯，放在磁力搅拌器上搅拌，再缓慢向其中加入终浓度为8M的尿素，搅拌约2h后，8000rpm，20min，离心，分离上清和沉淀，SDS-PAGE电泳鉴定。结果如图4所示，条带1为离心后上清，条带2为沉淀，说明该包涵体溶于含8M尿素的PBS溶液。

3、重组抑制素alpha-beta B TGF-β蛋白纯化

(1)配制1L含氨苄青霉素LB液体培养基，进行大量诱导表达，菌液4℃，12000rpm，离心10min，收集沉淀菌体。称量菌体重量，按照PBS/菌体＝10ml/g的标准，用PBS进行重悬，洗涤沉淀3次。将沉淀称重，按照PBS/菌体＝10ml/g的标准加入PBS进行重悬，对菌体在冰上进行超声破碎。条件：功率30％，工作5秒，间隔5秒，每一次处理45min。

(2)超声后离心，4℃，12000rpm，离心20min，收集沉淀。

(3)包涵体的溶解将超声离心后的沉淀按1g菌重加入10ml PBS重悬，吹散至颗粒状，倒入烧杯，放在磁力搅拌器上搅拌，再缓慢向其中加入终浓度为8M的尿素，搅拌约2h后，8000rpm，20min，离心，分离上清和沉淀。然后用0.45um滤膜过滤上清。

(4)使用金斯瑞公司的Ni-charged磁珠进行纯化包涵体溶解液的纯化。摇动装有磁珠的小瓶，彻底重悬磁珠。将1ml磁珠转移到干净的15ml离心管中。将管放在磁性分离架上以收集珠子。取出并丢弃上清液。将10ml PBS加入管中，倒置多次以混匀。使用磁力架收集珠子并丢弃上清液。重复此步骤两次。将5ml尿素溶解后的蛋白上清加入管中，轻轻倒置管混合。在室温下搅拌(在振荡器上)孵育管60分钟。使用磁力架收集磁珠，收集上清液，如图5所示，得到分子量为26Kd的纯化重组蛋白。

4、western-blot鉴定：取步骤2纯化得到的蛋白，用激活素B抗体和抑制素alpha亚基抗体进行western-blot检测。用12％分离胶进行SDS-PAGE电泳后，将蛋白转移到PVDF膜上，5％BSA溶液中4℃过夜封闭。次日洗膜3次。加入特异性一抗1:5000，孵育2小时，洗膜3次。加入山羊抗鼠(HRP标记)二抗1:10000，孵育1小时，化学发光试剂检测结果。本发明重组蛋白western-blot检测结果如图6所示。本发明重组蛋白能够与激活素B抗体和抑制素alpha亚基抗体发生抗原抗体反应。

实验结果说明，本发明表达得到了重组抑制素alpha-beta B TGF-β蛋白。天然抑制素B是alpha亚基beta亚基经过一系列蛋白酶酶切后，N端的TGF-β片段通过二硫键连接的异二聚体蛋白。该蛋白在血清中含量较低，而且在提纯过程中会发生二硫键断裂形成单体。本发明将编码单体抑制素alpha亚基和单体抑制素beta亚基TGF-β片段的两个独立的蛋白基因，采用同源重组的技术，同时连接到PET21a表达载体上，两个亚基中间没有出现任何酶切位点，表达得到同时具有alpha亚基和beta亚基TGF-β片段功能的一个完整蛋白，解决了天然蛋白二聚体降解成为单体，丢失生物活性的问题。

实施例3本发明重组蛋白表达条件的筛选

如实施例1所示，在大肠杆菌常规诱导表达条件下，目标蛋白以包涵体的形式表达，因此按照如下方法对重组蛋白的表达条件进行优化。

实验方法：

挑取实施例1制备的阳性克隆接种于氨苄青霉素(终浓度为100ug/ml)的5ml液体LB培养基中37℃，220rpm培养过夜。

1)不同IPTG浓度的筛选

将过夜培养菌液以1:100转接于含氨苄青霉素10ml液体LB中，37℃，220rpm培养至OD600＝0.4-0.6时，加入1mol/L IPTG，，使IPTG终浓度为0.1mmol/L、0.2mmol/L，0.3mmol/L、0.4mmol/L 0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L 37℃，180rpm/min诱导3～4h。

2)不同诱导温度的筛选

将过夜培养菌液以1:100转接于含氨苄青霉素10ml液体LB中，37℃，220rpm培养至OD600＝0.4-0.6时，加入1mol/L IPTG，使IPTG终浓度为0.4mmol/L、25，37℃，180rpm/min诱导3～4h。

3)不同诱导时间的筛选

将过夜培养菌液以1:100转接于含氨苄青霉素10ml液体LB中，37℃，220rpm培养至OD600＝0.4-0.6时，加入1mol/L IPTG，使IPTG终浓度为0.4mmol/L、37℃，180rpm/min开始诱导，分别于2，3，4h小时取样。

检测：取诱导后菌液，离心分离，菌体沉淀重悬于PBS中，然后在-80℃低温冰箱中放置30min，冰中解冻，反复3次。在冰浴上用超声破碎仪破菌，超声5sec,间隔5秒，共45min，4℃，12000rpm，离心10min，取上清和沉淀进行SDS电泳，SDS-PAGE蛋白凝胶染色脱色试剂染色。

实验结果：如图7所示，IPTG浓度为0.4mmol/L时，包涵体蛋白表达量最高；如图8所示，温度在37℃时，包涵体蛋白表达量最高；如图9所示诱导时间为4h时，包涵体蛋白表达量最高。

综上，本发明通过基因重组的方法，构建了重组蛋白的目的基因片段、重组质粒、工程菌，重组表达得到了抑制素alpha-beta B TGF-β蛋白。该蛋白可与抑制素alpha亚基和beta亚基反应，在抑制素B检测试剂开发具有良好的应用前景。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州市达瑞生物技术股份有限公司

<120> 一种抑制素B双基因片段联合表达载体及其应用

<130> 2018

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 627

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcaaccgcat tcctccacaa tcatgttcgg aacatcacgt ttcacgatgt tatattcatc 60

gtcaaagtac agcatgctca tggtgctcag cttggtcggg atgcagcagc tgttaacggt 120

gcccgggttc agaccacgca tacggtattg gttcacaacc gcggtgtgga agctgctcgc 180

gctgcccggc acacccgcca gatacgccgg gcagctacct tcgcagtagt tgccatagta 240

accggtcggc gcaatgatcc aatcgttcca gccaatcaga cgaaagtcga taaagaattg 300

ctgacggcag caaatgcacg cgcagtgctg ggtcagcagg ttcggaacgg tttcatactt 360

aaagctgtag ccaccgtcgc tggtggtacg cacgtgcagc ggacgcatgg tacccggcag 420

cgccgcgcag cacggttgcg cacccggcag caggctatac ggctgcgccg gggtcggcgg 480

cgcacccgga accggcaggc tcaggttcgg cggaatgtgc agaccgcagc caccgtggca 540

atagtgaaaa atgaagctcg gcgggtaaac gatccaacgt tcccaaccca gctcttgaaa 600

gctgatgttc agcgccacac ggtggca 627

<210> 2

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgccaccgtg tggcgctgaa catcagcttt caagagctgg gttgggaacg ttggatcgtt 60

tacccgccga gcttcatttt tcactattgc cacggtggct gcggtctgca cattccgccg 120

aacctgagcc tgccggttcc gggtgcgccg ccgaccccgg cgcagccgta tagcctgctg 180

ccgggtgcgc aaccgtgctg cgcggcgctg ccgggtacca tgcgtccgct gcacgtgcgt 240

accaccagcg acggtggcta cagctttaag tatgaaaccg ttccgaacct gctgacccag 300

cactgcgcgt gcatt 315

<210> 3

<211> 312

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgctgccgtc agcaattctt tatcgacttt cgtctgattg gctggaacga ttggatcatt 60

gcgccgaccg gttactatgg caactactgc gaaggtagct gcccggcgta tctggcgggt 120

gtgccgggca gcgcgagcag cttccacacc gcggttgtga accaataccg tatgcgtggt 180

ctgaacccgg gcaccgttaa cagctgctgc atcccgacca agctgagcac catgagcatg 240

ctgtactttg acgatgaata taacatcgtg aaacgtgatg ttccgaacat gattgtggag 300

gaatgcggtt gc 312

<210> 4

<211> 209

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Cys His Arg Val Ala Leu Asn Ile Ser Phe Gln Glu Leu Gly Trp Glu

1 5 10 15

Arg Trp Ile Val Tyr Pro Pro Ser Phe Ile Phe His Tyr Cys His Gly

20 25 30

Gly Cys Gly Leu His Ile Pro Pro Asn Leu Ser Leu Pro Val Pro Gly

35 40 45

Ala Pro Pro Thr Pro Ala Gln Pro Tyr Ser Leu Leu Pro Gly Ala Gln

50 55 60

Pro Cys Cys Ala Ala Leu Pro Gly Thr Met Arg Pro Leu His Val Arg

65 70 75 80

Thr Thr Ser Asp Gly Gly Tyr Ser Phe Lys Tyr Glu Thr Val Pro Asn

85 90 95

Leu Leu Thr Gln His Cys Ala Cys Ile Cys Cys Arg Gln Gln Phe Phe

100 105 110

Ile Asp Phe Arg Leu Ile Gly Trp Asn Asp Trp Ile Ile Ala Pro Thr

115 120 125

Gly Tyr Tyr Gly Asn Tyr Cys Glu Gly Ser Cys Pro Ala Tyr Leu Ala

130 135 140

Gly Val Pro Gly Ser Ala Ser Ser Phe His Thr Ala Val Val Asn Gln

145 150 155 160

Tyr Arg Met Arg Gly Leu Asn Pro Gly Thr Val Asn Ser Cys Cys Ile

165 170 175

Pro Thr Lys Leu Ser Thr Met Ser Met Leu Tyr Phe Asp Asp Glu Tyr

180 185 190

Asn Ile Val Lys Arg Asp Val Pro Asn Met Ile Val Glu Glu Cys Gly

195 200 205

Cys

<210> 5

<211> 315

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

aatgcacgcg cagtgctggg tcagcaggtt cggaacggtt tcatacttaa agctgtagcc 60

accgtcgctg gtggtacgca cgtgcagcgg acgcatggta cccggcagcg ccgcgcagca 120

cggttgcgca cccggcagca ggctatacgg ctgcgccggg gtcggcggcg cacccggaac 180

cggcaggctc aggttcggcg gaatgtgcag accgcagcca ccgtggcaat agtgaaaaat 240

gaagctcggc gggtaaacga tccaacgttc ccaacccagc tcttgaaagc tgatgttcag 300

cgccacacgg tggca 315

<210> 6

<211> 312

<212> DNA

<213> 智人

<400> 6

gcaaccgcat tcctccacaa tcatgttcgg aacatcacgt ttcacgatgt tatattcatc 60

gtcaaagtac agcatgctca tggtgctcag cttggtcggg atgcagcagc tgttaacggt 120

gcccgggttc agaccacgca tacggtattg gttcacaacc gcggtgtgga agctgctcgc 180

gctgcccggc acacccgcca gatacgccgg gcagctacct tcgcagtagt tgccatagta 240

accggtcggc gcaatgatcc aatcgttcca gccaatcaga cgaaagtcga taaagaattg 300

ctgacggcag ca 312

<210> 7

<211> 6036

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gaggcaaccg cattcctcca 180

caatcatgtt cggaacatca cgtttcacga tgttatattc atcgtcaaag tacagcatgc 240

tcatggtgct cagcttggtc gggatgcagc agctgttaac ggtgcccggg ttcagaccac 300

gcatacggta ttggttcaca accgcggtgt ggaagctgct cgcgctgccc ggcacacccg 360

ccagatacgc cgggcagcta ccttcgcagt agttgccata gtaaccggtc ggcgcaatga 420

tccaatcgtt ccagccaatc agacgaaagt cgataaagaa ttgctgacgg cagcaaatgc 480

acgcgcagtg ctgggtcagc aggttcggaa cggtttcata cttaaagctg tagccaccgt 540

cgctggtggt acgcacgtgc agcggacgca tggtacccgg cagcgccgcg cagcacggtt 600

gcgcacccgg cagcaggcta tacggctgcg ccggggtcgg cggcgcaccc ggaaccggca 660

ggctcaggtt cggcggaatg tgcagaccgc agccaccgtg gcaatagtga aaaatgaagc 720

tcggcgggta aacgatccaa cgttcccaac ccagctcttg aaagctgatg ttcagcgcca 780

cacggtggca ggatccgcga cccatttgct gtccaccagt catgctagcc atatgtatat 840

ctccttctta aagttaaaca aaattatttc tagaggggaa ttgttatccg ctcacaattc 900

ccctatagtg agtcgtatta atttcgcggg atcgagatct cgatcctcta cgccggacgc 960

atcgtggccg gcatcaccgg cgccacaggt gcggttgctg gcgcctatat cgccgacatc 1020

accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga gcgcttgttt cggcgtgggt 1080

atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca tctccttgca tgcaccattc 1140

cttgcggcgg cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg gctgcttcct aatgcaggag 1200

tcgcataagg gagagcgtcg agatcccgga caccatcgaa tggcgcaaaa cctttcgcgg 1260

tatggcatga tagcgcccgg aagagagtca attcagggtg gtgaatgtga aaccagtaac 1320

gttatacgat gtcgcagagt atgccggtgt ctcttatcag accgtttccc gcgtggtgaa 1380

ccaggccagc cacgtttctg cgaaaacgcg ggaaaaagtg gaagcggcga tggcggagct 1440

gaattacatt cccaaccgcg tggcacaaca actggcgggc aaacagtcgt tgctgattgg 1500

cgttgccacc tccagtctgg ccctgcacgc gccgtcgcaa attgtcgcgg cgattaaatc 1560

tcgcgccgat caactgggtg ccagcgtggt ggtgtcgatg gtagaacgaa gcggcgtcga 1620

agcctgtaaa gcggcggtgc acaatcttct cgcgcaacgc gtcagtgggc tgatcattaa 1680

ctatccgctg gatgaccagg atgccattgc tgtggaagct gcctgcacta atgttccggc 1740

gttatttctt gatgtctctg accagacacc catcaacagt attattttct cccatgaaga 1800

cggtacgcga ctgggcgtgg agcatctggt cgcattgggt caccagcaaa tcgcgctgtt 1860

agcgggccca ttaagttctg tctcggcgcg tctgcgtctg gctggctggc ataaatatct 1920

cactcgcaat caaattcagc cgatagcgga acgggaaggc gactggagtg ccatgtccgg 1980

ttttcaacaa accatgcaaa tgctgaatga gggcatcgtt cccactgcga tgctggttgc 2040

caacgatcag atggcgctgg gcgcaatgcg cgccattacc gagtccgggc tgcgcgttgg 2100

tgcggatatc tcggtagtgg gatacgacga taccgaagac agctcatgtt atatcccgcc 2160

gttaaccacc atcaaacagg attttcgcct gctggggcaa accagcgtgg accgcttgct 2220

gcaactctct cagggccagg cggtgaaggg caatcagctg ttgcccgtct cactggtgaa 2280

aagaaaaacc accctggcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc 2340

attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa 2400

ttaatgtaag ttagctcact cattaggcac cgggatctcg accgatgccc ttgagagcct 2460

tcaacccagt cagctccttc cggtgggcgc ggggcatgac tatcgtcgcc gcacttatga 2520

ctgtcttctt tatcatgcaa ctcgtaggac aggtgccggc agcgctctgg gtcattttcg 2580

gcgaggaccg ctttcgctgg agcgcgacga tgatcggcct gtcgcttgcg gtattcggaa 2640

tcttgcacgc cctcgctcaa gccttcgtca ctggtcccgc caccaaacgt ttcggcgaga 2700

agcaggccat tatcgccggc atggcggccc cacgggtgcg catgatcgtg ctcctgtcgt 2760

tgaggacccg gctaggctgg cggggttgcc ttactggtta gcagaatgaa tcaccgatac 2820

gcgagcgaac gtgaagcgac tgctgctgca aaacgtctgc gacctgagca acaacatgaa 2880

tggtcttcgg tttccgtgtt tcgtaaagtc tggaaacgcg gaagtcagcg ccctgcacca 2940

ttatgttccg gatctgcatc gcaggatgct gctggctacc ctgtggaaca cctacatctg 3000

tattaacgaa gcgctggcat tgaccctgag tgatttttct ctggtcccgc cgcatccata 3060

ccgccagttg tttaccctca caacgttcca gtaaccgggc atgttcatca tcagtaaccc 3120

gtatcgtgag catcctctct cgtttcatcg gtatcattac ccccatgaac agaaatcccc 3180

cttacacgga ggcatcagtg accaaacagg aaaaaaccgc ccttaacatg gcccgcttta 3240

tcagaagcca gacattaacg cttctggaga aactcaacga gctggacgcg gatgaacagg 3300

cagacatctg tgaatcgctt cacgaccacg ctgatgagct ttaccgcagc tgcctcgcgc 3360

gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt 3420

gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg 3480

ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa 3540

ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atatgcggtg tgaaataccg 3600

cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 3660

tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 3720

cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 3780

aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 3840

gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 3900

agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 3960

cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 4020

cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 4080

ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 4140

gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 4200

tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 4260

acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 4320

tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 4380

attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 4440

gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 4500

ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 4560

taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 4620

ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 4680

ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 4740

gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 4800

ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 4860

gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctgcaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 4920

tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 4980

atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 5040

gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 5100

tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 5160

atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 5220

agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 5280

ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 5340

tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 5400

aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 5460

tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 5520

aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga aattgtaaac 5580

gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa 5640

taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt 5700

gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg 5760

cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt 5820

ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga 5880

gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg 5940

ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg 6000

cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcccat tcgcca 6036

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cagcaaatgg gtcgcggatc ctgccaccgt gtggcgctg 39

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

attgctgacg gcagcaaatg cacgcgcagt gctg 34

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

catttgctgc cgtcagcaat tctt 24

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtggtggtgg tggtgctcga ggcaaccgca ttcctccaca 40

Claims

1.一种重组基因，其特征在于，所述重组基因含有表达抑制素B的alpha亚基的TGF-β基因序列和beta B 亚基的TGF-β基因序列；

所述alpha亚基的TGF-β基因序列和beta B 亚基的TGF-β基因序列中间没有酶切位点；

所述alpha亚基的TGF-β基因序列和beta B 亚基的TGF-β基因序列中间没有冗余的核苷酸序列；

所述重组基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，或者所述重组基因表达的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.一种抑制素B双基因片段联合表达载体，其特征在于，所述载体能表达权利要求1所述的重组基因。

3.一种细菌，其特征在于，所述细菌含有权利要求2所述的载体。

4.根据权利要求2所述的载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)根据原核表达密码子偏好性原则，对抑制素B的 alpha 亚基和beta B 亚基的ORF进行密码子优化，然后化学合成；

2)通过PCR扩增出步骤 1) 合成的alpha亚基和beta B 亚基的TGF-β DNA片段，电泳后回收；

3)将步骤 2)回收的DNA片段与经BAMHI、XHOI双酶切处理的载体连接，得到所述载体。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述载体为pET21a(+)载体。

6.一种重组蛋白，其特征在于，制备方法包括如下步骤：

1) 取权利要求3所述的细菌，在相应的培养基中培养，诱导表达，得菌液，离心，得菌体；

2) 取步骤1）所得菌体，超声裂解，离心，得沉淀，沉淀变性溶解，分离纯化，得到所述重组蛋白。

7.权利要求1的重组基因、权利要求2的载体或权利要求3的细菌在制备用于评价男性睾丸生精功能的试剂盒或用于评价女性卵巢储备功能及反应性的试剂盒中的应用。