CN113355342A

CN113355342A - 一种提高咖啡酸产量的生物制备方法

Info

Publication number: CN113355342A
Application number: CN202110654151.9A
Authority: CN
Inventors: 孙磊; 张红
Original assignee: Xuzhou Hegu Life Technology Co ltd
Current assignee: Xuzhou Hegu Life Technology Co ltd
Priority date: 2021-06-11
Filing date: 2021-06-11
Publication date: 2021-09-07

Abstract

本发明公开了一种提高咖啡酸产量的生物制备方法，涉及生物发酵技术领域。本发明包括构建大肠杆菌基因工程菌、菌体活化、制备种子液、发酵罐培养、诱导表达和生物转化。本发明将SEQ ID NO.1所示的羟化酶基因的核苷酸序列，以pET20b为载体，构建重组质粒pET‑C4H，转入到Escherichia coli Tuner(DE3)中，经过筛选得到带有羟化酶基因的大肠杆菌基因工程菌strC4H，诱导表达产生羟化酶，以4‑香豆酸底物，在羟化酶的作用下，4‑香豆酸转化为咖啡酸，提高了咖啡酸的产量，且生物方法制备高效、无污染。

Description

一种提高咖啡酸产量的生物制备方法

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，特别是涉及一种提高咖啡酸产量的生物制备方法。

背景技术

咖啡酸是是一种有机酸，分子式为C9H8O4，分子量180.15，是从浓水溶液得黄色结晶，从稀水溶液得一水合物。分解点223～225°(在194°软化)。微溶于冷水，易溶于热水及冷乙醇。可在化妆品中安全使用，有较广泛的抑菌和抗病毒活性。能吸收紫外线。低浓度即具抑制皮肤型发用染料的助剂，有利于增强色泽的强度。

目前，市场上销售的咖啡酸通常是从植物(单穗升麻根茎和烟草)中提取的，这一分离过程复杂、繁琐，污染环境，而且从植物中获得受限于原材料植物的获得。以酪氨酸为底物采用化学合成，存在大肠杆菌消耗酪氨酸，代谢副产物不好控制，对环境影响较大的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提高咖啡酸产量的生物制备方法，通过采用生物合成及通过大肠杆菌工程菌产生咖啡酸的方法，解决了现有的咖啡酸生产方法过程复杂、繁琐，污染环境，产量有限的问题。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明为一种提高咖啡酸产量的生物制备方法，包括以下步骤：

S1:构建大肠杆菌基因工程菌strC4H；(1)以羟化酶基因为模板，加入PCR引物对，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收，得到带有同源臂的基因片段P1；(2)载体pET20b以BamH1/EcoR1为酶切位点，37℃过夜酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收，得到酶切后的线性化载体M1；(3)利用同源重组技术，采用2uL的TAKARA infusion酶将(1)中的基因片段P1和(2)中的线性化载体M1进行连接，其中线性化载体M1和基因片段P1按照摩尔质量比1：2添加，总体系10uL，其余由无菌水补足体系，50℃，30min，得到连接产物M2；(4)将(3)中的连接产物M2转入到DH5A感受态菌株中，涂布含有50μg/mL氨苄霉素的LB平板，挑菌，37℃、220rpm过夜培养后提取质粒，经Bam HI/EcoR1双酶切验证筛选出正确的重组质粒，标记为pET-C4H；(5)将(4)中的重组质粒pET-C4H转入Escherichia coli Tuner(DE3)感受态菌株中，加入50μg/mL氯霉素和50μg/mL氨苄，筛选得到带有羟化酶基因的大肠杆菌基因工程菌，标记为strC4H；

S2：菌体活化；取S1中的大肠杆菌基因工程菌strC4H，二次摇瓶活化后，接种于平板培养基中，4℃保存；

S3：制备种子液；取S2中的平板培养基，挑取单菌落，摇瓶活化，置于50ml的种子培养基中培养12小时，获得种子液；所述种子培养基的配方为：每1000ml培养基，加入酵母粉5g，胰蛋白胨10g和氯化钠10g,余量为水，PH7.0；

S4：发酵罐培养；将S3中的种子液按照3％-5％的接种量接种于发酵罐内的发酵培养基中，边通气边搅拌，温度控制37℃，搅拌速度500rpm-800rpm，通气量(5V/V.min)，添加5％氢氧化钠控制pH至7.0；采用恒pH流加方法向发酵罐内添加补料培养基进行补料，以促进大肠杆菌基因工程菌strC4H的持续生长；所述发酵培养基的配方为：每1000ml培养基，加入甘油5g，酵母提取物7.5g，蛋白胨30g，氯化钠0.5g，柠檬酸2g，磷酸氢二钾14g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁1.2g和微量元素，余量为水，PH7.0；所述补料培养基的配方为：每1000ml培养基，加入甘油250g、酵母粉60g和蛋白胨60g，余量为水；其中微量元素包括七水硫酸亚铁2g、二水氯化钙13.5g、五水硫酸镁0.75g、六水氯化钴0.13g、七水硫酸锌0.75g、二水氯化铜0.16g和二水钼酸钠0.13g；

S5：诱导表达；在菌株发酵至比生长速率为0.1时，加入诱导剂，温度控制30℃，进行诱导表达产生羟化酶；

S6：生物转化；取1L发酵液，分批加入中底物4-香豆酸，反应10小时后，采用高效液相色谱法对发酵液中咖啡酸的含量进行检测。

进一步地，所述S1中的羟化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述S5中的羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述S1中的载体pET20b的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，所述S4中的诱导剂为20g/L乳糖。

进一步地，所述S1中的PCR引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；所述PCR引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

进一步地，所述S4中种子液的接种量为4％。

其中，羟化酶基因从南京金唯智生物科技有限公司购买获得；DH5A感受态菌株和Escherichia coli Tuner(DE3)感受态菌株均购买于南京擎科生物科技有限公司。

本发明具有以下有益效果：

本发明将SEQ ID NO.1所示的羟化酶基因的核苷酸序列，以pET20b为载体，构建重组质粒pET-C4H，转入到Escherichia coli Tuner(DE3)中，经过筛选得到带有羟化酶基因的大肠杆菌基因工程菌strC4H，诱导表达产生羟化酶，以4-香豆酸底物，在羟化酶的作用下，4-香豆酸转化为咖啡酸，提高了咖啡酸的产量，且生物方法制备高效、无污染。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为将4-香豆酸转化为咖啡酸的技术路线图；

图2为重组质粒pET-C4H图谱；

图3为发酵液中咖啡酸含量检测的色谱图；

图4为与图3对应的峰表。

具体实施方式

实施例1：带有羟化酶基因的大肠杆菌基因工程菌的构建

(1)以SEQ ID NO.1所示的羟化酶基因为模板，加入SEQ ID NO.4所示的上游引物和SEQ ID NO.5所示的下游引组成的PCR引物对，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收，得到带有同源臂的基因片段P1；

(2)SEQ ID NO.3所示的载体pET20b以BamH1/EcoR1为酶切位点，37℃过夜酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收，得到酶切后的线性化载体M1；

(3)利用同源重组技术，采用2uL的TAKARA infusion酶将(1)中的基因片段P1和(2)中的线性化载体M1进行连接，其中线性化载体M1和基因片段P1按照摩尔质量比1：2添加，总体系10uL，其余由无菌水补足体系，50℃，30min，得到连接产物M2；

(4)将(3)中的连接产物M2转入到DH5A感受态菌株中，涂布含有50μg/mL氨苄霉素的LB平板，挑菌，37℃、220rpm过夜培养后提取质粒，经Bam HI/EcoR1双酶切验证筛选出正确的重组质粒，标记为pET-C4H；

(5)将(4)中的重组质粒pET-C4H转入Escherichia coli Tuner(DE3)感受态菌株中，加入50μg/mL氯霉素和50μg/mL氨苄，筛选得到带有羟化酶基因的大肠杆菌基因工程菌，标记为strC4H。

实施例2：将大肠杆菌基因工程菌strC4H活化、培养、诱导表达

种子培养基的配方为：每1000ml培养基，加入酵母粉5g，胰蛋白胨10g和氯化钠10g,余量为水；

发酵培养基的配方为：每1000ml培养基，加入甘油5g，酵母提取物7.5g，蛋白胨30g，氯化钠0.5g，柠檬酸2g，磷酸氢二钾14g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁1.2g和微量元素,余量为水；其中微量元素包括七水硫酸亚铁2g、二水氯化钙13.5g、五水硫酸镁0.75g、六水氯化钴0.13g、七水硫酸锌0.75g、二水氯化铜0.16g和二水钼酸钠0.13g；

补料培养基的配方为：每1000ml培养基，加入甘油250g、酵母粉60g和蛋白胨60g，余量为水；

将大肠杆菌基因工程菌strC4H，二次摇瓶活化后，接种于平板培养基中，4℃保存；从平板培养基中挑取单菌落，摇瓶活化，置于50ml的种子培养基中培养12小时，获得种子液；所述种子培养基的配方为：每1000ml培养基，加入酵母粉5g，胰蛋白胨10g和氯化钠10g,余量为水，PH7.0；

种子液按照4％的接种量接种于发酵罐内的发酵培养基中，边通气边搅拌，温度控制37℃，搅拌速度500rpm-800rpm，通气量(5V/V.min)，添加5％氢氧化钠控制pH至7.0；采用恒pH流加方法向发酵罐内添加补料培养基进行补料，以促进大肠杆菌基因工程菌strC4H的持续生长；

在菌株发酵至比生长速率为0.1时，加入诱导剂为20g/L乳糖，温度控制30℃，进行诱导表达产生羟化酶；取1L发酵液，分批加入中底物4-香豆酸，反应10小时后，采用高效液相色谱法对发酵液中咖啡酸的含量进行检测。

色谱条件：甲醇水，C18柱，流速1ml/min

取发酵液稀释90倍，进样体积20ul，结合图3和图4可知，16.59S时为峰值，峰面积为12218178；

根据标曲方程：y＝110660907.05x-129389.327534734(x是峰面积，y是浓度)，R2＝0.999616553(R2是线性拟合常数)

带入标曲得咖啡酸浓度为10.00g/L。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京合谷生命生物科技有限公司

<120> 一种提高咖啡酸产量的生物制备方法

<130> 1

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1490

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

atgaaaccag aagatttccg cgccagtacc caacgtcctt tcaccgggga agagtatctg 60

aaaagcctgc aggatggtcg cgagatctat atctatggcg agcgagtgaa agacgtcacc 120

actcatccgg catttcgtaa tgcggcagcg tctgttgccc agctgtacga cgcactgcac 180

aaaccggaga tgcaggactc tctgtgttgg aacaccgaca ccggcagcgg cggctatacc 240

cataaattct tccgcgtggc gaaaagtgcc gacgacctgc gccagcaacg cgacgccatc 300

gctgagtggt cacgcctgag ctatggctgg atgggccgta ccccagacta caaagccgct 360

ttcggttgcg cactgggcgc gaatccgggc ttttacggtc agttcgagca gaacgcccgt 420

aactggtaca cccgtattca ggaaactggc ctgtacttta accacgggat tgttaaccca 480

ccgatcgatc gtcatttgcc gaccgataaa gtgaaagacg tttacatcaa gctggaaaaa 540

gagactgacg ccgggattat cgtcagcggt gcgaaagtgg ttgccaccaa ctcggcgctg 600

actcactaca acatgattgg cttcggcgat cctcgtgtga tgggcgaaaa cccggacttc 660

gcactgatgt tcgttgcgcc aatggatgcc gatggcgtga aattaatctc ccgcgcatct 720

tatgagatgg tcgcgggtgc taccggctcg ccatacgact acccgctctc cagccgcttc 780

gatgagaacg atgcgattct ggtgatggat aacgtgctga ttccatggga aaacgtgctg 840

atctaccgcg attttgatcg ctgccgtcgc tggacgatgg aaggcggttt tgccagtatg 900

tatccgctgc aagcctgtgt gcgcctggca gtgaaattag acttcattac ggcactgctg 960

aaaaaatcac tcgaatgtac cggcaccctg gagttccgtg gtgtgcaggc cgatctcggt 1020

gaagtggtag cgtggcgcaa caccttctgg gcattgagtg actcgatgtg ttcagaagca 1080

acgccgtggg tcaacggggc ttatttaccg gatcatgccg cactgcaaac ctatcgcgta 1140

ctggcaccaa tggcctacgc gaagatcaaa aacattatcg aacgcaacgt taccagtggc 1200

ctgatctatc tcgcttccag tgcccgtgac ctgaataatc cgcagatcga ccagtatctg 1260

gcgaagtatg tgcgcggttc gaacggtatg gatcacgtcc agcgcatcaa gatcgtcaaa 1320

ctgatgtggg atgctattgg cagcgaattt ggtggtcgtc acgaactgta tgaaatcaac 1380

tactccggta gccaggatga gattcgcgtg cagtgtctgc gccaggcaca aaactccggc 1440

aatatggaca agatgatggc gatggttgat cgctgcctgt cggaatacga 1490

<210> 2

<211> 520

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 2

Met Lys Pro Glu Asp Phe Arg Ala Ser Thr Gln Arg Pro Phe Thr Gly

1 5 10 15

Glu Glu Tyr Leu Lys Ser Leu Gln Asp Gly Arg Glu Ile Tyr Ile Tyr

20 25 30

Gly Glu Arg Val Lys Asp Val Thr Thr His Pro Ala Phe Arg Asn Ala

35 40 45

Ala Ala Ser Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Leu His Lys Pro Glu Met

50 55 60

Gln Asp Ser Leu Cys Trp Asn Thr Asp Thr Gly Ser Gly Gly Tyr Thr

65 70 75 80

His Lys Phe Phe Arg Val Ala Lys Ser Ala Asp Asp Leu Arg Gln Gln

85 90 95

Arg Asp Ala Ile Ala Glu Trp Ser Arg Leu Ser Tyr Gly Trp Met Gly

100 105 110

Arg Thr Pro Asp Tyr Lys Ala Ala Phe Gly Cys Ala Leu Gly Ala Asn

115 120 125

Pro Gly Phe Tyr Gly Gln Phe Glu Gln Asn Ala Arg Asn Trp Tyr Thr

130 135 140

Arg Ile Gln Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Asn His Gly Ile Val Asn Pro

145 150 155 160

Pro Ile Asp Arg His Leu Pro Thr Asp Lys Val Lys Asp Val Tyr Ile

165 170 175

Lys Leu Glu Lys Glu Thr Asp Ala Gly Ile Ile Val Ser Gly Ala Lys

180 185 190

Val Val Ala Thr Asn Ser Ala Leu Thr His Tyr Asn Met Ile Gly Phe

195 200 205

Gly Asp Pro Arg Val Met Gly Glu Asn Pro Asp Phe Ala Leu Met Phe

210 215 220

Val Ala Pro Met Asp Ala Asp Gly Val Lys Leu Ile Ser Arg Ala Ser

225 230 235 240

Tyr Glu Met Val Ala Gly Ala Thr Gly Ser Pro Tyr Asp Tyr Pro Leu

245 250 255

Ser Ser Arg Phe Asp Glu Asn Asp Ala Ile Leu Val Met Asp Asn Val

260 265 270

Leu Ile Pro Trp Glu Asn Val Leu Ile Tyr Arg Asp Phe Asp Arg Cys

275 280 285

Arg Arg Trp Thr Met Glu Gly Gly Phe Ala Ser Met Tyr Pro Leu Gln

290 295 300

Ala Cys Val Arg Leu Ala Val Lys Leu Asp Phe Ile Thr Ala Leu Leu

305 310 315 320

Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Gly Thr Leu Glu Phe Arg Gly Val Gln

325 330 335

Ala Asp Leu Gly Glu Val Val Ala Trp Arg Asn Thr Phe Trp Ala Leu

340 345 350

Ser Asp Ser Met Cys Ser Glu Ala Thr Pro Trp Val Asn Gly Ala Tyr

355 360 365

Leu Pro Asp His Ala Ala Leu Gln Thr Tyr Arg Val Leu Ala Pro Met

370 375 380

Ala Tyr Ala Lys Ile Lys Asn Ile Ile Glu Arg Asn Val Thr Ser Gly

385 390 395 400

Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Ser Ala Arg Asp Leu Asn Asn Pro Gln Ile

405 410 415

Asp Gln Tyr Leu Ala Lys Tyr Val Arg Gly Ser Asn Gly Met Asp His

420 425 430

Val Gln Arg Ile Lys Ile Val Lys Leu Met Trp Asp Ala Ile Gly Ser

435 440 445

Glu Phe Gly Gly Arg His Glu Leu Tyr Glu Ile Asn Tyr Ser Gly Ser

450 455 460

Gln Asp Glu Ile Arg Val Gln Cys Leu Arg Gln Ala Gln Asn Ser Gly

465 470 475 480

Asn Met Asp Lys Met Met Ala Met Val Asp Arg Cys Leu Ser Glu Tyr

485 490 495

Asp Gln Asp Gly Trp Thr Val Pro His Leu His Asn Asn Asp Asp Ile

500 505 510

Asn Met Leu Asp Lys Leu Leu Lys

515 520

<210> 3

<211> 3716

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacggagct cgaattcgga tccgaattaa ttccgatatc catggccatc gccggctggg 240

cagcgaggag cagcagacca gcagcagcgg tcggcagcag gtatttcata tgtatatctc 300

cttcttaaag ttaaacaaaa ttatttctag agggaaaccg ttgtggtctc cctatagtga 360

gtcgtattaa tttcgcggga tcgagatctc gggcagcgtt gggtcctggc cacgggtgcg 420

catgatcgtg ctcctgtcgt tgaggacccg gctaggctgg cggggttgcc ttactggtta 480

gcagaatgaa tcaccgatac gcgagcgaac gtgaagcgac tgctgctgca aaacgtctgc 540

gacctgagca acaacatgaa tggtcttcgg tttccgtgtt tcgtaaagtc tggaaacgcg 600

gaagtcagcg ccctgcacca ttatgttccg gatctgcatc gcaggatgct gctggctacc 660

ctgtggaaca cctacatctg tattaacgaa gcgctggcat tgaccctgag tgatttttct 720

ctggtcccgc cgcatccata ccgccagttg tttaccctca caacgttcca gtaaccgggc 780

atgttcatca tcagtaaccc gtatcgtgag catcctctct cgtttcatcg gtatcattac 840

ccccatgaac agaaatcccc cttacacgga ggcatcagtg accaaacagg aaaaaaccgc 900

ccttaacatg gcccgcttta tcagaagcca gacattaacg cttctggaga aactcaacga 960

gctggacgcg gatgaacagg cagacatctg tgaatcgctt cacgaccacg ctgatgagct 1020

ttaccgcagc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct 1080

cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg 1140

cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag 1200

cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat 1260

atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt 1320

ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 1380

ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 1440

tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 1500

tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 1560

gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 1620

ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 1680

tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 1740

agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 1800

atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 1860

acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 1920

actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 1980

tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt 2040

tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga 2100

tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca 2160

tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat 2220

caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg 2280

cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt 2340

agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag 2400

acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc 2460

gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag 2520

ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctgcaggca 2580

tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa 2640

ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga 2700

tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata 2760

attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca 2820

agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg 2880

ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg 2940

ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg 3000

cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag 3060

gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac 3120

tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca 3180

tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag 3240

tgccacctga aattgtaaac gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa 3300

tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat 3360

agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg 3420

tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac 3480

catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta 3540

aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag 3600

ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg 3660

taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcccat tcgcca 3716

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacggagctc gaattatgaa accagaagat ttccgcgc 38

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gaattaattc ggatcttatt tcagcagctt atccagcatg ttga 44

Claims

1.一种提高咖啡酸产量的生物制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：构建大肠杆菌基因工程菌strC4H；

(1)以羟化酶基因为模板，加入PCR引物对，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收，得到带有同源臂的基因片段P1；

(2)载体pET20b以BamH1/EcoR1为酶切位点，37℃过夜酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收，得到酶切后的线性化载体M1；

(5)将(4)中的重组质粒pET-C4H转入Escherichia coli Tuner(DE3)感受态菌株中，加入50μg/mL氯霉素和50μg/mL氨苄，筛选得到带有羟化酶基因的大肠杆菌基因工程菌，标记为strC4H；

S2：菌体活化；

取S1中的大肠杆菌基因工程菌strC4H，二次摇瓶活化后，接种于平板培养基中，4℃保存；

S3：制备种子液；

取S2中的平板培养基，挑取单菌落，摇瓶活化，置于50ml的种子培养基中培养12小时，获得种子液；所述种子培养基的配方为：每1000ml培养基，加入酵母粉5g，胰蛋白胨10g和氯化钠10g,余量为水，PH7.0；

S4：发酵罐培养；

将S3中的种子液按照3％-5％的接种量接种于发酵罐内的发酵培养基中，边通气边搅拌，温度控制37℃，搅拌速度500rpm-800rpm，通气量(5V/V.min)，添加5％氢氧化钠控制pH至7.0；采用恒pH流加方法向发酵罐内添加补料培养基进行补料，以促进大肠杆菌基因工程菌strC4H的持续生长；

所述发酵培养基的配方为：每1000ml培养基，加入甘油5g，酵母提取物7.5g，蛋白胨30g，氯化钠0.5g，柠檬酸2g，磷酸氢二钾14g，磷酸二氢钾5g，硫酸镁1.2g和微量元素，余量为水，PH7.0；其中微量元素包括七水硫酸亚铁2g、二水氯化钙13.5g、五水硫酸镁0.75g、六水氯化钴0.13g、七水硫酸锌0.75g、二水氯化铜0.16g和二水钼酸钠0.13g；

所述补料培养基的配方为：每1000ml培养基，加入甘油250g、酵母粉60g和蛋白胨60g，余量为水；

S5：诱导表达；

在菌株发酵至比生长速率为0.1时，加入诱导剂，温度控制30℃，进行诱导表达产生羟化酶；

S6：生物转化；

取1L发酵液，分批加入中底物4-香豆酸，反应10小时后，采用高效液相色谱法对发酵液中咖啡酸的含量进行检测。

2.根据权利要求1所述的一种提高咖啡酸产量的生物制备方法，其特征在于，所述S1中的羟化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述S5中的羟化酶的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的一种提高咖啡酸产量的生物制备方法，其特征在于，所述S1中的载体pET20b的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1-3任一项所述的一种提高咖啡酸产量的生物制备方法，其特征在于，所述S4中的诱导剂为20g/L乳糖。

5.根据权利要求4所述的一种提高咖啡酸产量的生物制备方法，其特征在于，所述S1中的PCR引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；所述PCR引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的一种提高咖啡酸产量的生物制备方法，其特征在于，所述S4中种子液的接种量为4％。